11胃癌における胃癌における COX-2COX-2 遺伝子の異常メチル遺伝子の異常メチル化と化と

ヒストンの脱アセチルヒストンの脱アセチル化化

Aberrant methylation and histone deacetylation ofAberrant methylation and histone deacetylation ofcyclooxygenase 2 in gastric cancer.cyclooxygenase 2 in gastric cancer.

内科学第一講座内科学第一講座

菊地 剛史菊地 剛史

International Journal of CancerInternational Journal of Cancer 2002, 97: 272-277 2002, 97: 272-277

22研究の背景研究の背景

COX-2COX-2 遺伝子は胃癌の約遺伝子は胃癌の約８０％８０％において発現上昇が報告さにおいて発現上昇が報告されており、癌化に重要な役割を果たしていると考えられるれており、癌化に重要な役割を果たしていると考えられる

NSAIDsNSAIDs やや COX-2COX-2 選択的阻害薬により、胃癌の発生が 選択的阻害薬により、胃癌の発生が 40 % 40 % 減少する報告もあり、細胞株においてアポトーシスの誘導が減少する報告もあり、細胞株においてアポトーシスの誘導がおきることから、過剰発現が発癌に関与している可能性が示唆おきることから、過剰発現が発癌に関与している可能性が示唆されるされる

COX-2COX-2発現上昇発現上昇

E-cadherinE-cadherin発現低下発現低下

MMP-2MMP-2活性上昇活性上昇

PGEPGE22

上昇上昇

増殖因子増殖因子発現誘導発現誘導

血管新生因子血管新生因子発現誘導発現誘導

細胞細胞増殖増殖

浸潤能浸潤能獲得獲得

33

MAPKMAPK

転写活性化転写活性化

COX-2 COX-2 遺伝子の発現制御機構遺伝子の発現制御機構EGF -REGF -R

RAS

COX-2 COX-2 の遺伝子発現はの遺伝子発現は growth factor growth factor など など oncogenic oncogenic な な signal signal により正に、により正に、 p53 p53 などの などの anti-oncogenic anti-oncogenic な な signal signal により負に制により負に制御されている御されている

p53p53

転写抑制転写抑制

COX-2COX-2

44研究の目的研究の目的

COX-2COX-2 遺伝子の発現制御は不明な部分が多く、その解明は発遺伝子の発現制御は不明な部分が多く、その解明は発癌機序の解明につながるものとして期待される癌機序の解明につながるものとして期待される

COX-2COX-2 遺伝子の上流領域に位置する遺伝子の上流領域に位置する CpGCpG アイランドにおアイランドにおける、ける、 COX-2COX-2 遺伝子の発現制御と異常遺伝子の発現制御と異常 CpGCpG メチル化につメチル化について検討を行ったいて検討を行った

メチル化による遺伝子発現抑制において関連が指摘されているメチル化による遺伝子発現抑制において関連が指摘されているヒストンの脱アセチル化について検討を加え、胃癌におけるヒストンの脱アセチル化について検討を加え、胃癌におけるCOX-2COX-2 遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構について遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構について明らかにする明らかにする

55COBRA COBRA （（ COCOmbined mbined BBisulfite isulfite RRestriction estriction AAnalysis nalysis ） 法の概略） 法の概略

TCACAGAGTCACAGAG CCGGGG

TUAUAGAGTUAUAGAGCCGGGG

sodium bisulfitesodium bisulfite

5m5m

PCRPCR

TTATAGAGTTATAGAGCCGGGG

Restriction&Restriction&electrophoresiselectrophoresis

0% 50% 100%

Methylation

GCA C

GTAC

bisulfite&bisulfite&PCRPCR

Afa I siteAfa I site

5m5m

今回の検討で用いた COBRA 法は、 DNA を Bisulfite で処理することにより、メチル化しているシトシンはシトシンのまま、メチル化していないシトシンはウラシルに変換される。Bisulfite 処理した DNA を PCR 後、メチル化アレルのみを切断する制限酵素で切断することにより、メチル化を定量的に検出出来る。

66

100 bp100 bpExon 1Exon 1

CpGCpG

23+164 bp23+164 bpAfaIAfaI

胃癌細胞株における 胃癌細胞株における COX-2 COX-2 遺伝子の異常メチル遺伝子の異常メチル化化

COBRA 法により検出されたメチル化アレルを M で、非メチル化アレルを U

で示している。 Afa I , Tai I いずれの制限酵素処理においても、 MKN28 、 KatoIII についてメチル化を認め、胃癌細胞株 8 株中 2 株 （ 25% ）において異常メチル化を検出した。 RKO は Positive control として用いた。

COBRACOBRA TaiITaiI 23+50+114 bp23+50+114 bp

MK

N4

MK

N4

55 MK

N7

MK

N7

44 MK

N2

MK

N2

88 Kat

oII

Kat

oII

IIAZ

52A

Z52

11 NU

GC

NU

GC

33MK

NM

KN

77 RK

OR

KO

UUMM

（％）（％）<1<1 <1<1 <1<1 <1<1 <1<1 100100 3232 8686

JRS

JRS

TT

<1<1

UUMMMM

MK

N4

MK

N4

55 MK

N7

MK

N7

44 MK

N2

MK

N2

88 Kat

oII

Kat

oII

IIAZ

52A

Z52

11 NU

GC

NU

GC

33MK

NM

KN

77 RK

OR

KO

<1<1 <1<1 <1<1 <1<1 <1<1 100100 3434 8686 （％）（％）<1<1

JRS

JRS

TT

AfaIAfaI TaiITaiI

77Bisulfite-SequenceBisulfite-Sequence

胃癌細胞株における 胃癌細胞株における COX-2 COX-2 遺伝子の異常メチル遺伝子の異常メチル化化

Unmethylated CpGUnmethylated CpGMethylated CpGMethylated CpG

　 Bisulfite – Sequence の結果を示す。 COBRA 法、 Bisulfite-SSCP 法によりメチル化を検出した MKN28,KatoIII において、メチル化はプロモーター領域全体に密におこっていることが明らかとなった。

MKN 7MKN 7

MKN 45MKN 45

MKN 28MKN 28

KATO IIIKATO III

CpGCpGAA A/TA/T

CpGCpGAA A/TA/T

A : A : Afa I Afa I 認識認識 CpGCpG

T : T : Tai I Tai I 認識認識 CpGCpG

88

MK

N4

MK

N4

55 MK

N7

MK

N7

44 MK

N2

MK

N2

88 Kat

oII

Kat

oII

IIAZ

52A

Z52

11 NU

GC

NU

GC

33MK

NM

KN

77COX-2COX-2

GAPDHGAPDH

異常メチル化を呈した MKN28 , KatoIII においては遺伝子の発現を認めず、メチル化と発現低下が相関することが明らかとなった。

RT-PCRRT-PCR

胃癌細胞株における 胃癌細胞株における COX-2 COX-2 遺伝子の発現遺伝子の発現

99

COBRACOBRA

NN TT NN TT NN TT NN TT NN TT NN TT

00 3737 00 4646 0000 0000 00 404000 00 (%)(%)

Y-

Y-

11 Y-1

Y-1

66N11

2N

112

N11

4N

114

N11

5N

115

N12

N12

44

UUMM

胃癌手術摘出標本におけるメチル化の検出胃癌手術摘出標本におけるメチル化の検出

　 93 例中 11 例（ 12 ％）においてメチル化が認められる一方、正常胃組織についてはメチル化を認めなかった。

手術摘出標本手術摘出標本 9393 例中例中メチル化メチル化 1111 例例（（ 1212 ％）％）正常胃組織正常胃組織 1818 例中例中メチル化メチル化 00 例例

N : Normal tissueN : Normal tissue

T : Tumor tissueT : Tumor tissue

1010

胃癌胃癌異常メチル化（＋）異常メチル化（＋）

正常胃粘膜正常胃粘膜 胃癌 胃癌 異常メチル化（ー）異常メチル化（ー）

胃癌 胃癌 異常メチル化（ー）異常メチル化（ー）

免疫染色による 免疫染色による COX-2 COX-2 遺伝子の発現の検討遺伝子の発現の検討

抗 COX-2 モノクローナル抗体を用いて、発現の検討を免疫染色により行った。検討では、 27 例に対し行い、 19 例においては発現を認め、 8 例において発現を認めなかった 。発現を認めなかった 8 例中 6 例は DNA の異常メチル化を認め、異常メチル化と発現低下に相関を認めた。

手術摘出標本手術摘出標本 2727 例中例中発現陽性 発現陽性 1919 例 例 （（ 70%70% ））発現陰性発現陰性 88 例 例 （（ 30%30% ））

発現陰性発現陰性 88 例例中中メチル化 メチル化 66 例例

1111ChChromatin romatin IImmunommunopprecipitation recipitation （ （ ChIPChIP ））クロマチン免疫沈降法の概略クロマチン免疫沈降法の概略

DNA メチル化による COX-2 遺伝子発現抑制の分子機構に関して、クロマチンレベルで解析する目的で、クロマチン免疫沈降法により、ヒストンのアセチル化の状態を解析した。抗アセチル化ヒストン H3 抗体を用いて免疫沈降を行って得られた DNA を用いて PCR を行い、アセチル化の程度を定量した。

Ac Ac

Ac Ac

Transcriptionfactor

M M

MM M

M

M

M

Immunoprecipitation byImmunoprecipitation byAnti-Ac histone H3Anti-Ac histone H3

AcAc

AcAcAcAc

AcAc

Purify DNAPurify DNA

PCRPCR

Target geneTarget gene

AcAc

AcAc

AcAc

AcAcDNADNA

Acetylation Acetylation +

DNADNAHDAC

MeCP2M M M M

M M M M

？？ヒストンのヒストンのアセチル化状態アセチル化状態

の変化の変化

ヒストンヒストンアセチルアセチル

化化

ヒストンヒストン脱アセチル化脱アセチル化

1212半定量 半定量 PCR PCR による胃癌細胞株におけるによる胃癌細胞株におけるクロマチン免疫沈降法の結果クロマチン免疫沈降法の結果

00

0.50.5

11

1.51.5

22

2.52.5

33

MK

N28

MK

N28

MK

N45

MK

N45

MK

N74

MK

N74

MK

N7

MK

N7

AZ

521

AZ

521

JRS

TJR

ST

NU

GC

3N

UG

C3

Kat

oIII

Kat

oIII

CO

X-2

/GA

PDH

CO

X-2

/GA

PDH

Anti Anti Ac-H3Ac-H3

MK

N2

MK

N2

88MK

N4

MK

N4

55 MK

N7

MK

N7

44

InputInput

GAPDHGAPDH

COX-2COX-2

COX-2COX-2

JRS

JRS

TTAZ

52A

Z52

11 MK

NM

KN

77 NU

GC

3N

UG

C3

Kat

oIII

Kat

oIII

No AbNo Ab COX-2COX-2

ExpressionExpression

MethylationMethylation

+ + + + ++

+

Input は免疫沈降を行う前の DNA 、 No Ab は免疫沈降の際に抗体を使用しない場合のコントロールとして用いた . 。メチル化を認め、発現の低下を認めた MKN28 , KATOIII においてアセチル化ヒストンに付着した DNA が認めないことから、ヒストンの脱アセチル化が起きていることが明らかとなった。

+

1313胃癌細胞株における脱メチル化剤、胃癌細胞株における脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤による遺伝子再発現の検ヒストン脱アセチル化阻害剤による遺伝子再発現の検

討討脱メチル化剤（脱メチル化剤（ 5-Aza-dC 5-Aza-dC ））

　 RT-PCR により脱メチル化剤 5-Aza-dC 並びに、ヒストン脱アセチル化阻害剤 TSA 投与時における COX-2 遺伝子の再発現の検討を 行った。 異常メチル化を呈した胃癌細胞株 MKN28 に対する 5-Aza-dC の投与は濃度依存的に遺伝子の再発現を認めた。一方、 TSA のみの投与では再発現を認めなかった。 5-Aza-dC との組み合わせのTSA の追加投与により 5-Aza-dC 単独投与より、発現の増強が認められた。

MK

N45

MK

N45

1 101 10

MKN28MKN28

0.1 0.1

GAPDHGAPDH

COX-2COX-2

(-)(-) MK

N45

MK

N45

Aza

-dC

Aza

-dC

TS

AT

SA

Aza

+T

SA

Aza

+T

SA

MKN28MKN28

GAPDHGAPDH

COX-2COX-2

ヒストン脱アセチル化阻害剤（ヒストン脱アセチル化阻害剤（ TSATSA ））

5-Aza-dC : 0.15-Aza-dC : 0.1MM

（（ M M ）） MK

N28

MK

N28

1414

MK

N45

MK

N45

MK

N28

MK

N28

Aza

-dC

Aza

-dC

TS

AT

SA

Aza

+T

SA

Aza

+T

SA

COX-2COX-2

GAPDHGAPDH

MKN28MKN28

ExpressionExpression

MethylationMethylation +

+ + +

+

Anti Anti Ac-H3Ac-H3

MKN28MKN28

MK

N45

MK

N45

MK

N28

MK

N28

Aza

-dC

Aza

-dC

TS

AT

SA

Aza

+T

SA

Aza

+T

SA

00

0.20.2

0.40.4

0.60.6

0.80.8

11

1.21.2

CO

X-2

/GA

PD

HC

OX

-2/G

AP

DH

胃癌細胞株における脱メチル化剤、ヒストン脱アセチ胃癌細胞株における脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化ル化

阻害剤によるヒストンのアセチル化の検討阻害剤によるヒストンのアセチル化の検討

COX-2COX-2

COX-2COX-2

TSA の投与でヒストンの再アセチル化が確認されたが、 5-Aza-dC 投与のみでは遺伝子の再発現を認めるもののヒストンの再アセチル化は弱く、遺伝子の発現には DNA の異常メチル化が優位に関与するものと考えられた。

InputInput

No AbNo Ab

1515ま と めま と め

胃癌細胞株 胃癌細胞株 88 例中例中 22 例例 (25%)(25%) 、胃癌症例、胃癌症例 9393 例中例中 1111 例例(12%)(12%) にに COX-2COX-2 遺伝子の異常メチル化を認めた。遺伝子の異常メチル化を認めた。

クロマチン免疫沈降法により、 クロマチン免疫沈降法により、 COX-2COX-2 の遺伝子のプロモーの遺伝子のプロモーターがメチル化している例では、ヒストンの脱アセチル化ターがメチル化している例では、ヒストンの脱アセチル化を認めた。を認めた。

以上の結果から、 以上の結果から、 COX-2COX-2 遺伝子の発現調節におい遺伝子の発現調節において、て、プロモーターのメチル化とヒストンアセチル化が重プロモーターのメチル化とヒストンアセチル化が重要であると考えられた。要であると考えられた。

COX-2COX-2 遺伝子の異常メチル化と遺伝子発現の抑制はよく遺伝子の異常メチル化と遺伝子発現の抑制はよく相関していた。相関していた。

1616

遺伝子の発現抑制

Ac Ac

Ac Ac 異常な遺伝子のメチル化

TranscriptionTranscriptionfactorfactor Spreading of methylationSpreading of methylation

: CH3

M M

MM M

M

M

M

M M

MM M

M

M

M

MeCP2

ヒストンの脱アセチル化クロマチンの凝縮

脱メチル化ヒストンのアセチル化

MeCP2M M M M

M M M M

遺伝子が発現している状態

異常メチル化とヒストン構造の変化による遺伝子発現異常メチル化とヒストン構造の変化による遺伝子発現抑制抑制

通常遺伝子のプロモーター領域はメチル化されておらず、転写因子がアクセスしやすいようにクロマチンは開いた構造になっている。（上段）メチル化が起きると、 MeCP2 などのメチル CpG 結合タンパクが DNA に結合し（中段右側）、ヒストン脱アセチル化酵素をリクルートする。その結果クロマチンは閉じた状態になり、遺伝子の発現は抑制される。（下段）

1717胃癌における異常メチル化の発癌への関与胃癌における異常メチル化の発癌への関与Methylation profile in gastric cancerMethylation profile in gastric cancer

Distinct methylation pattern and micrDistinct methylation pattern and microsatellite instability in sporadic gastric osatellite instability in sporadic gastric cancer. cancer. Int J Cancer. 1999 Int J Cancer. 1999

MK

N2

MK

N2

88 Kat

oII

Kat

oII

II

UUMMCOX-2COX-2

E-cadE-cad

p57p57

CIMP:CIMP:CCpG pG iisland sland mmethylator ethylator pphehe

notypenotype

MK

N4

MK

N4

55MK

NM

KN

77

UUMM

UUMM

UUMM

UUMM

UUMM

CIMP in gastric cancer cell linesCIMP in gastric cancer cell lines

CIMPCIMP （＋）（＋） CIMPCIMP （－）（－）

左図に示したように、胃癌の一部はゲノムワイドなメチル化の異常が癌化に関与すると考えられる。そのような腫瘍においては、 p16INK4A 、 E-cadherin 、 hMLH1 のメチル化が高頻度で認められる ( Su

zuki et al, Int. J. Cancer, 1999) 。右側に CIMP+ 細胞株、 MKN28 、 Kato III および CIMP － 細胞株 MK

N7 、 MKN45 における各種遺伝子のメチル化検出例を示す。

methylatedmethylatedunmethylatedunmethylated

CaseCase

GeneGene

1818COX-2 COX-2 の発現と癌関連遺伝子異常の関連の発現と癌関連遺伝子異常の関連

APCAPC

CIMP + CIMP +

CIMP CIMP －－

一部の一部の CIMP+ CIMP+ 腫瘍では、腫瘍では、 COX-2 COX-2 は異常メチル化により発現ぜず、は異常メチル化により発現ぜず、COX-2 COX-2 非依存性の発癌経路をたどる。このような腫瘍にはメチル化非依存性の発癌経路をたどる。このような腫瘍にはメチル化阻害剤が有効と考えられる阻害剤が有効と考えられる ..

K-rasK-ras p53p53

?COX-2COX-2 阻害剤阻害剤

COX-2COX-2

E-CADE-CAD p16p16

Pro-apototic gePro-apototic genene ？？Methylation

メチル化阻害剤メチル化阻害剤

COX-2COX-2