ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК

ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК

Н.Н.Колесников

Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск

2013

История открытия и развития исследований по микроРНК

Функция микроРНК – контроль и регуляция экспрессии белок кодирующих генов

• МикроРНК – негативный регулятор экпрессии генов на посттранкрипционном уровне

• Один белок кодирующий ген может регулироваться десятками разных микроРНК

• Одна микроРНК может регулировать работу более сотни разных генов

• МикроРНК как онкогены и супрессоры опухолей

Циркулирующие микроРНК в плазме/сыворотке крови в составе экзосом, микровезикул и других комплексов

• Стабильность• Селективная секреция• Регуляция процессов

в микроокружении и в отдаленных тканях

• Иммунномодуляция• Потенциальные

маркеры ранней неинвазивной диагностики рака.

Выбранные миРНКмиР-21 – хронологически первая идентифицированная миРНК. Является сильным онкогеном. Её экспрессия увеличивается в большинстве солидных опухолей. Увеличивает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток.миР-221, миР-222 – онкогенные миРНК, индуцирующие ангиогенез и пролиферацию раковых клеток.миР-155 – продемонстрировано участие этой миРНК в инициации как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов, а также в развитии иммунной системы в целом. Некоторые работы свидетельствуют об участии миР155 в онкогенезе различной этиологии.миР-205 – супрессор опухолевого роста, показано, что в случае некоторых видов опухолей миР205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли.

Признаки раковой клетки:

Автономия ростовых сигнальных путей : Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к пролиферации без внешних стимулов.Невосприимчивость к антиростовым сигналам:Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых стоп-сигналов для того, чтобы пролиферировать.Избегание апоптоза:Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза.Стабильный ангиогенез:Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых кровеносных сосудов.Неограниченный потенциал репликации:ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться неограниченное число раз.Инвазия в другие ткани и метастазирование:Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы, колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и пространством.

ОНКОМИР. МикроРНК в канцерогенезе

• Общие цели:• - изучение роли микроРНК в молекулярных механизмах в норме и при

нарушениях нормальной физиологии клеток, лежащих в основе разных патологических состояний.

• - установление диагностической значимости профилей микроРНК ассоциированных с онкологическими заболеваниями.

• - создание новых методов диагностики, контроля лечения и прогноза онкологических заболеваний человека.

• - разработка подходов создания комбинированной диагностики онкологических патологий с использованием платформ микроРНК и соматических мутаций.

• Задача №1. Определить вариацию уровней экспрессии микроРНК в разных гистопатологических типах опухолей щитовидной и молочной желез, головного мозга сравнительно с условно нормальными клетками.

• Задача №2. Установить диагностические значения в норме и при патологии.• Задача №3. Отличать состояния «рак» и «отсутствие рака»• Задача №4. Выявить маркеры, связанные с риском злокачественной

трансформации

Методический подход определения уровня экспрессии микроРНК в раковых клетках vs прилежащих нормальных клеток у одного

пациента.

2^(-ddCt)

miR-155 0,933033

miR-205 1,310393

miR-21 1

miR-221 0,521233

miR-222 0,473029

Условная норма

опухоль

miR-155

miR-205

miR-21

miR-221

miR-222

U6

Опухоль vs Норма

Схема детекции миРНК с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени

7

Разработка подходов и создание прообраза

диагностической панели на основе микроРНК. • ПРИМЕНЕНИЕдиагностической панели на основе микроРНК

• Ранняя диагностика • Определение

гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию

• Контроль эффекта терапевтического воздействия (химио и радиотерапия)

• Прогностическое значение выживаемости

• Потенциальная терапия

Пациент А

Пациент Б

Пациент В

Пациент Г

Диагноз

Фолликулярнаяаденома

Папиллярныйрак

Условная норма

Панель миРНК

Общие миРНК Специфические миРНКmiR-21 miR-221 miR-222 miR-323 miR-224 miR-181b miR-146b miR-200a miR-31

Другой типопухоли

МикроРНК в диагностике и прогнозе

• Опухоли головного мозга

• Рак щитовидной железы

• Рак молочных желез

Распределение образцов РЩЖ на основе анамнеза4%

(7)

1%(2)2%

(3)

33%(61)

42%(77)

18%(33)

Опухолеподобные поражения

Фолликулярная аденома

Папиллярная карцинома

Медулярная\ карцинома

Анапластический рак

Фолликулярная карцинома

Распределение образцов РМЖ на основе анамнеза

79%(61)

21%(16) Фиброаденома

Инвазивный протоковый рак

Распределение образцов опухолей головного мозга на основе анамнеза

7%(5)

3%(2)

6%(4)

2%(1)

10%(7)

37%(26)

21%(15)

14%(10)

Глиобластома

Астроцитомы

Менингиома

Метастаз карциномы

Эпендимома

Невринома

Медуллобластома

Прочие

Всего - 183Всего - 77

Всего - 70

МикроРНК при папиллярном раке и коллоидном узле щитовидной железы

10

МикроРНК при фолликулярной аденоме и фолликулярном раке

11

Глиомы

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

миР-21 миР-221 миР-222 миР-155 миР-205 миР-126 миР-451

Диффузная астроцитома

Анапластическая астроцитома


, 0.25- /0.75-Медиана квантиль квантиль

Изменен

иеуров

нямиРН

Мир-21 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

миР-21

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Менингиома ГМ

Диффузная астроцитома ГМ

Анапластическая астроцитомаГМГлиобластома ГМ

ОПП ЩЖ

Фолликулярная аденома ЩЖ

Фолликулярная карцинома ЩЖ

Папиллярная карцинома ЩЖ

Протоковая карцинома МЖ


Изменени

еуров

нямиРН

К


миР-205

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К

МикроРНК в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

миР-221

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00



Анапластическая астроцитомаГМ

Глиобластома ГМ

ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К

миР-222

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К

миР-155

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К

миР-205

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К

При объединении классов «аденома» и «ОПП» точность метода

C4.5 была значительно увеличена.

Матрица несоответствий

Заболевание чувствительность специфичностьобщая

точность

ОПП/аденома карцинома

ОПП/аденома

0.975 0.962 0.970

ОПП/аденома 39 1

карцинома

0.962 0.975 0.970карцинома

1 25

Общая ошибка 0.030

Общая ошибка при кроссвалидации 0.133

РЕЗЮМЕ. МикроРНК в диагностике опухолейСоздан прообраз платформы на основе микроРНК для диагностики онкологических заболеваний, что позволит:

• Дифференцировать доброкачественные опухоли от злокачественных новообразований

• Контролировать эффект терапевтического воздействия (лучевая и химиотерапия)

• Выявлять различные патоморфологические типы опухолей

• Разработать алгоритмы ранней диагностики онкологических заболеваний

• ПРИМЕНЕНИЕ• Ранняя диагностика• Определение гистотипа

опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию

• Контроль эффекта терапевтического воздействия (химио и радиотерапия)

• Прогностическое значение выживаемости

• Потенциальная терапия

Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний человека на основе молекулярных маркеров - микроРНК и соматических мутаций

УЧАСТНИКИ ПРОЕКТА:

• Титов Сергей Евгеньевич - Вектор-Бест, ИМКБ СО РАН, • Веряскина Юлия Андреевна - ИМКБ СО РАН• Ахмерова Лариса Григорьевна - ИМКБ СО РАН• Иванов Михаил Константинович – Вектор-Бест• Жимулев Игорь Федорович - ИМКБ СО РАН• Гуляева Людмила Федоровна - ИМББ СО РАМН• Деменков Павел Сергеевич - ИЦиГ СО РАН• Шевченко Сергей Петрович - МБУЗ № 1• Карпинская Елена Владимировна - МБУЗ № 1• Козлов Вадим Викторович - НООД• Войцицский Владимир Евгеньевич - НООД• Сидоров Сергей Васильевич - МБУЗ № 1• Ступак Вячеслав Владимирович - ФГБУ НИИТО• Лехнер Андрей Вячеславович - ФГБУ НИИТО• Садовой Михаил Анатольевич - ФГБУ НИИТО

• При поддержке фирмы БИОРАД Сибирское отделение

Анти-МиР- терапия

Nanoparticle-based therapy in an in vivo

microRNA-155 (miR-155)-dependentmouse model of lymphoma (Babar et al.,PNAS,June 8, 2012)

Регрессия лимфомы

после доставки уникальных наночастиц с анти-миР-155 в лимфоциты

• Благодарю за внимание.

dual function: as oncogene or tumor-suppressor

Гипотезы 1+2

Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний

человека на основе молекулярных маркеров - микроРНК и соматических мутаций в онкогенах

• Н.Н. Колесников, • С.Е. Титов, • Е.В. Карпинская, • C.П. Шевченко,• Ю.А. Веряскина, • Л.Г. Ахмерова,• М.К. Иванов , • Л.Ф. Гуляева , • В.В. Ступак, • А.В. Лехнер, • М.А. Садовой , • В.В.Козлов,• С.В.Сидоров,• И.Ф.Жимулев

• ИМКБ СО РАН, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН;

• ЗАО «Вектор-Бест»;• Городская клиническая

больница №1 г.Новосибирска;

• ИМББ СО РАН, Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАН;

• Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития РФ

• Новосибирский онкологический диспансер

Операционный материал Опухолевые и нормальные ткани были получены от 183 пациентов с различными типами новообразований щитовидной железы:

Всего - 183

1.1.1.Фолликулярная аденома ФА 77

1.2.1. Фолликулярная карцинома ФК 7

1.2.2. Папиллярная карцинома ПК 61

1.2.3. Медуллярная карцинома МК 3

1.2.4. Анапластическая карцинома АК 2

7. Опухолеподобные поражения ОПП 33

Основные классы опухолей и опухолеподобных заболеваний щитовидной железы.

(в соответствии с международной гистологической классификацией

ВОЗ 2-го пересмотра (1988 гг.).

Распределение образцов РЩЖ на основе анамнеза4%

(7)

1%(2)2%

(3)

33%(61)

42%(77)

18%(33)

Опухолеподобные поражения



Медулярная\ карцинома

Анапластический рак

Фолликулярная карцинома

микроРНК в опухолях молочной железымикроРНК для диагностики рака

молочной железы

Эффект лучевой (А) и химиотерапии (Б) на профильэкспрессии микроРНК при инвазивномраке молочных желез.

изменение профиля экспрессии микроРНК в раковых клетках по сравнению с нормой.

А Б

Распределение образцов РМЖ на основе анамнеза

79%(61)

21%(16) Фиброаденома

Инвазивный протоковый рак

Фиброаденома 16

Инвазивный протоковый рак 61

Всего 77

-20

-10

0

10

20

30

40

50

миР-21 миР-221 миР-222 миР-155 миР-205

Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль

Изм

енен

ие

уров

ня

ми

РН

К п

ри п

атол

оги

и п

о от

нош

ени

ю к

кон

трол

ю



Веряскина и др.,2012, Колесников и др., 2013

Опухоли головного мозга проанализированные по 7 миРНК в зависимости от их гистотипа (Колесников и др.,2013)

Гистоструктура Число случаев

% Степень злокачественности (Grade)*

Глиобластома 10 14.3 IV

Астроцитомы 15 21.4

пилоцитарная (1) I

диффузная (4) II

анапластическая (10) III

Эпендимома 1 1.4 I

Медуллобластома 2 2.8 IV

Менингиома 26 37.1 I

Невринома 4 5.7 I

Метастазкарциномы

7 10.0

Прочие 5 7.1

Всего 70 100

Распределение образцов опухолей головного мозга на основе анамнеза

7%(5)

3%(2)

6%(4)

2%(1)

10%(7)

37%(26)

21%(15)

14%(10)


Астроцитомы

Менингиома

Метастаз карциномы

Эпендимома

Невринома

Медуллобластома

Прочие

МикроРНК как биомаркеры. Анализ операционного материала с предоставленным гистологическим заключением

• МикроРНК в опухолях ЩЖ

• МикроРНК в опухолях МЖ

• МикроРНК в опухолях головного мозга

• Проанализировано:• ЩЖ – 183 образца,• МЖ – 77 образцов,• ОГМ – 70 образцов• Всего - 330

Главные признаки раковой клетки.

• Автономия ростовых сигнальных путей : • Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки

продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к пролиферации без внешних стимулов.

• Невосприимчивость к антиростовым сигналам:• Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых

стоп-сигналов для того, чтобы пролиферировать.• Избегание апоптоза:• Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза

( программированной клеточной смерти) и увеличиваются в числе.

• Стабильный ангиогенез:• Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых

кровеносных сосудов• Неограниченный потенциал репликации:• ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться

неограниченное число раз.• Инвазия в другие ткани и метастазирование:• Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы,

колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и пространством.

• 4 Дополнения к признакам раковой клетки: • + дерегуляция энергетики клетки• + избегание воздействия иммунной системы • + хромосомные нарушения и нестабильность ДНК • + воспалительные процессы

Cell, January, 2000, March, 2011, Douglas Hanahan and Robert Weinberg.

Попарное сравнение двух групп образцов с помощью U- критерия-Манна Уитни

U

p

Размер выборки

Узлы Рак

Группа 1: Узлы/Группа

2: Рак

миР-21 59,5 0,000258 15 26

миР-221 22 0,000003 15 26

миР-222 31 0,00001 15 26

миР-155 125,5 0,438922 13 23

миР-205 167 0,680952 14 26

-20

-10

0

10

20

30

40

миР-21 миР-221 миР-222 миР-155 миР-205

ОПП



Изменение уровня экспрессии пяти микроРНК в разных гитопатологических типах опухолей ЩЖ


миР-221

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00



Анапластическая астроцитомаГМ

Глиобластома ГМ

ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К


миР-222

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К


миР-155

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К


миР-205

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00




ОПП ЩЖ






Изменени

еуров

нямиРН

К

ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК

Documents