第四章 分子生物学常用技术第四章 分子生物学常用技术

ⅠⅠ.. 核酸分子杂交（核酸分子杂交（ DNA/DNA or DNA/RNADNA/DNA or DNA/RNA ）技）技术术

核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在 19681968 年由华盛顿卡内基年由华盛顿卡内基学院（学院（ Cavnegie Institute of WashingtonCavnegie Institute of Washington ）的）的 Roy Roy BrittenBritten 及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链的特定核苷酸序列的单链 DNADNA 或或 RNARNA ，当它们混合在一，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

11 、萨瑟恩、萨瑟恩 DNADNA 印迹杂交印迹杂交

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNADNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNADNA或 或 RNARNA 探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的 DNADNA 片段，这种实片段，这种实验方法叫做验方法叫做 DNADNA 印迹杂交技术。由于它是由印迹杂交技术。由于它是由 E.SouthernE.Southern 于于 19197575 年首先设计出来的，故又叫年首先设计出来的，故又叫 Southern DNA Southern DNA 印迹转移技术。印迹转移技术。

（ a ）

（ b ）

（ c ）

（ d ）

（ e ）

基因组 DNA

DNA 限制片段

硝酸纤维素滤膜

同探针同源杂交的基因 DNA 片段

X 光底片

Southern Southern 凝胶转移杂凝胶转移杂

交技术交技术

Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之 XX 光显像图片光显像图片 水稻（水稻（ Oryza sativa LOryza sativa L.).) 的叶绿体的叶绿体 DNADNA 分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶 BglBglⅡⅡ(A-C)(A-C) 、、 BamHⅠBamHⅠ （（ D-FD-F ）、）、 EcoRⅠEcoRⅠ （（ G-IG-I ）、和）、和 HindⅢHindⅢ （（ J-LJ-L ））消化，加样在含有消化，加样在含有 EtBrEtBr 染料的染料的 1%1% 的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同然后同 3232PP 标记的玉米标记的玉米 psbApsbA 探针作探针作 SouthernSouthern 杂交。杂交。 XX 光底片中显现光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的的阳性条带 ，表明含有水稻的 psbApsbA 基因序列。基因序列。

22 、诺赛恩、诺赛恩 RNARNA 印迹技术印迹技术（（ Northern blottinNorthern blottingg ）） 19791979 年，年， J.C.AlwineJ.C.Alwine 等人发展而来，是将等人发展而来，是将 RNARNA 分子从电泳分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩 DNADNA 印迹印迹杂交技术十分类似，所以叫做杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩诺赛恩 RNARNA 印迹技术（印迹技术（ Northern Northern blottingblotting ）。）。

而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，，然后然后同放射性同位素同放射性同位素 125125II 标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（ Western blottingWestern blotting ）。）。

33 、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（斑点印迹杂交（ dot blottingdot blotting ）和狭线印迹杂交）和狭线印迹杂交（（ slot blotting slot blotting ）是在）是在 SouthernSouthern 印迹杂交的基础印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（上发展的量种类式的快速检测特定核酸（ DNADNA 和和 RNRNAA ）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。

检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术

44 、菌落杂交、菌落杂交

核酸杂交常用几种膜的性能比较

Ⅱ. 蛋白质蛋白质 /DNA/DNA 、蛋白质、蛋白质 /RNA/RNA 杂交技术杂交技术

11 、凝胶阻滞实验（、凝胶阻滞实验（ Gel retardation assaGel retardation assayy ）） 又叫又叫 DNADNA 迁移率变动实验（迁移率变动实验（ DNA mobility shift assaDNA mobility shift assayy ），是在），是在 8080 年代初期出现的用于在体外研究年代初期出现的用于在体外研究 DNADNA 与蛋白质型与蛋白质型胡作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，胡作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定也是当前被选作分离纯化特定 DNADNA 结合蛋白质的一种典型的实结合蛋白质的一种典型的实验方法。 验方法。

凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的 DNADNA 由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质 BB 结合，于是在凝结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带

AA CCBB

放射自显放射自显影影

** **

** **

凝胶电泳凝胶电泳

放射性标记的放射性标记的 DNDNAA 细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物

蛋白质与蛋白质与 DNADNA 结结合合

** ** ** **** **

BB DNA-DNA- 蛋白质结蛋白质结合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓

慢慢

滞后带表明滞后带表明 DNADNA 与与蛋白质结合蛋白质结合

(a)(a) (b)(b) (c)(c)

在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争 DNADNA 与探针与探针 DNADNA 之间的竞争作用之间的竞争作用（（ aa ）没有加入竞争）没有加入竞争 DNADNA 的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针 DNADNA 与特异蛋白质结合，与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（出现阻滞条带；（ bb ）加入的超量竞争）加入的超量竞争 DNADNA 与探针与探针 DNADNA 竞争结合同一种蛋白质，竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（阻滞条带消失；（ cc ）竞争）竞争 DNADNA 与探针与探针 DNADNA 分别结合不同的蛋白质，出现同分别结合不同的蛋白质，出现同（（ aa ）一样的阻滞条带。）一样的阻滞条带。

**

** ** ** ** ** ****** **

蛋白质与未蛋白质与未标记的竞争标记的竞争DNADNA 结合结合

凝胶电泳凝胶电泳

放射自显影放射自显影

蛋白质与标蛋白质与标记的探针记的探针 DNDNAA 结合结合

** **

** **

** **

** **

** **

22 、、 DNaseDNaseⅠ足迹实验（ footprinting assay ） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的是一类用于检测与特定蛋白质结合的 DNADNA 序列的序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定特定 DNADNA 片段之间的结合区域。如果使用较大的片段之间的结合区域。如果使用较大的 DNADNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争 DDNANA 序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。 苷酸序列的特异性。

3232pp

1 5 1 5 10 10

**

1 4 8 1 4 8 10 10

**

加入蛋白质加入蛋白质 XX

加入加入 DNaseDNaseII 凝胶电泳凝胶电泳放射自显影放射自显影

11

55

1010

A BA B

足迹足迹

(a)(a)

(c)(c)

(b)(b)

DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验

33、甲基化干扰实验（、甲基化干扰实验（ methyltion interference assaymethyltion interference assay ））

根据根据 DMSDMS （硫酸二甲酯）能够使（硫酸二甲酯）能够使 GG残基甲基化，而六氢吡啶残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的又能够特异切割甲基化的 GG残基这一原理，设计出了另一种残基这一原理，设计出了另一种研究研究 DNADNA 与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶这种技术可以检测靶 DNADNA 中特异中特异 GG残基的优先甲基化对而后残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNADNA 与蛋白质之间相互作用的模式。与蛋白质之间相互作用的模式。

DMSDMS 化学干扰的主要局限性时，它只能使化学干扰的主要局限性时，它只能使 GG残基甲基化。尽残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中鉴定足迹区段中 DNADNA 与蛋白质相互作用的精确位置。与蛋白质相互作用的精确位置。

具体操作如下页图所示。具体操作如下页图所示。

GG

GGGG

GG

GGGG

mm

ⅠGG

GGGGⅢ

mm

GG

GGGGmm

Ⅱ

GG

GGGGmm

ⅡGG

GGGG

mm

ⅠGG

GGGGⅢ

mm

DNADNA

局部甲基化局部甲基化

与蛋白质提取物混合与蛋白质提取物混合

与蛋白质结合与蛋白质结合 不与蛋白质结合不与蛋白质结合 与蛋白质结合与蛋白质结合凝胶电泳 与蛋白质结合的与蛋白质结合的 DNADNA 带带

含有含有Ⅰ和Ⅲ两种类型两种类型 DNADNA片段片段不能与蛋白质结合的不能与蛋白质结合的 DNADNA

带含有全部三种类型带含有全部三种类型 DNADNA片段片段

切除所有结合与不切除所有结合与不结合蛋白质的结合蛋白质的 DNADNA带，并用六氢吡啶带，并用六氢吡啶切割甲基化的切割甲基化的 GG 残残基基

结合带 非结合带结合带 非结合带缺失的缺失的 DNADNA 带表带表明相应明相应 GG 残基的残基的重要意义，它得重要意义，它得到结合蛋白质的到结合蛋白质的保护保护

甲基化干扰实验甲基化干扰实验

44 、体内足迹实验、体内足迹实验

G GG G×

G GG G× me

G GG G

G GG G

Me MeMe Me

完整的细胞完整的细胞 裸露的裸露的 DNADNA

DMSDMS

分离 DNA 并用六氢吡啶切

割

凝胶分析凝胶分析

PCRPCR 扩增扩增

受保护的受保护的 GG 残基残基

应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验

5 、 Southwestern 杂交

6、 Northwestern 杂交

Ⅲ.PCR 技术

1 、基因扩增原理条件

(c)(c)

(b)(b)引物引物 22

5’5’ 3’3’

3’3’

3’3’

5’5’

5’5’((d)d)

新引物新引物

5’5’ 3’3’

靶靶 DNADNA 的扩增的扩增

(a)(a)5’5’ 3’3’

引物引物 113’ 3’ 5’5’

3’3’ 5’5’

引物引物 22 互补链互补链 引物引物 11 互补链互补链

单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链

55’’ 33’’3’3’ 5’5’

引物引物 11 互补链互补链引物引物 22 互补链互补链

目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）

聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图

(e)(e)

(f)(f)

(g)(g)

温度温度（（℃）℃）

时间（时间（ miminn ））

9494

7272

6060

9494℃℃ 变性变性（（ 1min1min ））

60 60 ℃℃ 退火退火（（ 1min1min ））

72 72 ℃℃ 延伸延伸（（ 1.5mi1.5minn ））

循环循环 1 1 循环循环 2 2 循环循环 33

PCRPCR 反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由 DNADNA 变性、变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是反应参数是 94℃94℃变性变性 1min1min ， ， 60 ℃60 ℃退火退火 1min1min ， ， 72 ℃72 ℃延伸延伸 1.5min1.5min 。如此周而复始，重复进行，直。如此周而复始，重复进行，直

至扩增产物的数量满足实验需求为止。至扩增产物的数量满足实验需求为止。

Parameter Concentration

TemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+ oncentrationEnzymeTotal volume

10 attomoles(~1× 106 molecules)8.4（10mM Tris-Hcl）200 μ M(each one)100 g/ml (optional)0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M)>0.5mM< 10mM1 unit25—100μ l

Reaction Condition for a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR Assay

Typical PCR Thermal ProfileTypical PCR Thermal Profile

Program94℃

(first step)37—60℃

(second step)72℃

(third step)Reps

Cycle1Cycle2—30Cycle31*

1min1min1min

1min1min1min

1min1min

10min

1×29×1×

*This cycle is normally included in a PCR assay in order to *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full lengthachieve its full length

Enzyme Microbial Source Thermotolerance

KlenowSequenaseTaqBstEPfuTthUlTma

Escherichia coliT7 bacteriophageThermus aquaticusBacillus stearothermophilusPyrococcus furiosusThermus thermmophilusTeratoga maritima

NoNoYesYesYesYesYes

Some DNA Polymerases Used in PCRSome DNA Polymerases Used in PCR

Characteristics Description

OriginMolecular weightOptimal temperatureActivityStabilityFidelityMg2+ concentrationExonuclease activityTransferase activity

Thermus aquaticus strain YT194 kd72--80℃150 nucleotides/sec/molecule>50% at 95℃ for 40 min1.1× 10-4 substitutions per cycle>0.5mM<10mM5’ to 3’only5’ adenosines

Characteristics of Taq PolymeraseCharacteristics of Taq Polymerase

5’5’3’3’

3’3’5’5’

靶靶 DNADNA 片片段段

引物引物AA 5’ 5’5’ 5’

引物引物A’A’3’3’ 3’3’

PCRPCR PCRPCR

PCRPCR3’ 3’3’ 3’5’5’ 5’5’

PCRPCR引物引物 BB引物引物

CC

5’ 5’5’ 5’3’3’ 3’3’

混合混合 ,, 变性变性 ,, 退火退火

5’5’

3’3’

5’5’

3’3’

3’3’

5’5’

3’3’

5’5’++

DNADNA 聚合酶聚合酶5’5’3’3’

3’3’5’5’

5’5’3’3’

3’3’5’5’

用引物用引物 BB 和和 CC 作作 PCRPCR

PCRPCR 定点诱变定点诱变

22 、、 PCRPCR 用于基因突变用于基因突变

3、 PCR 用于融合基因的克隆

Ⅳ. 体外转录与体外翻译

1 、体外转录系统

Ⅴ. 基因瞬间表达与稳定表达

2 、常用的体外翻译系统

小麦胚、兔网织红血球

下节课讲