1

Сканирующая зондовая микроскопия

Методы создания сенсорных слоев для наномеханических

кантилеверных систем

Содержание лекции

1. Принцип работы наномеханических кантилеверных систем (НКС)2. Режимы работы НКС3. Виды сенсорных покрытий 4. Химическая модификация с целью сенсибилизации поверхности датчика.5.Примеры сенсорных покрытий.

Актуальность использования НКС

•Миниатюризация аналитического прибора

•Минимальное время анализа

•Высокая селективность

•Малый объем пробы для анализа

Создание рецепторных слоев, в которых предсказуемым образом формируются межмолекулярные взаимодействия при детектирование анализируемых веществ

Режимы измеренийИзмерение отклонения кантилевера Измерение сдвига

резонансной частоты

Поверхностное натяжение тонких пленок

Масса микрообъектов

лазерфотодиод

кантилевер

Кантилевер с прикрепленной частицей Диасорб-60-С16 массой 78,6±3,9 нг

-0,4

0

0,4

0,8

1,2

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Время, с

Ма

сса

со

рб

ир

ов

ан

ых п

ар

ов

, н

г Десорбция частицей толуола

Десорбция частицей этанола

Чистый кантилевер в парах толуола

Константы десорбции паров органических веществ с поверхности частицы Диасорб-60-С16

Сорбат

Константа десорбции,

1/с

Характерное время

десорбции, с

Толуол

0.0158±0.0005

63±2

Этанол

0.0312±0.0011

32±6

Кинетические кривые процессов десорбции паров толуола и этанола частицей массой 78,6±3,9 нг

Зависимость массы поглощенных паров толуола от массы частицы

0

1

2

3

4

5

6

7

0 50 100 150 200Масса частицы сорбента, нг

Ма

сс

а п

огл

ощ

ен

ны

х п

ар

ов

, н

г

Резонансный режим

• Частота резонатора составила 328,5 МГц. • Присоединение одного цептограмма массы (1 цептограмм (цг) = 10–24 –24 кг)

соответствует уменьшению частоты резонатора на Δf = 0,104 МГц (то есть чувствительность резонатора равна 0,104 МГц/цг).

Измерение массы атома золота: схема установки

Измерение массы атома золота: использование нанотрубки в качестве измерительного

элемента

Устройство атомного сенсора массы

Nature Nanotechnology 3, 533 - 537 (2008)

Измерение массы атома золота: результаты

Режим измерения статического изгиба

zl

Et

a

f ∆−

=2

2

)1(3 ν• f – сила, действующая между соседними молекулами,•a – расстояние между молекулами• l и t – длина и толщина прямоугольного кантилевера, • ν и E – коэффициент Пуассона и модуль Юнга материала кантилевера, • Δz – величина отклонения кантилевера.

Межмолекулярные взаимодействия в монослое

Отталкивание

Притяжение

При взаимодействии с анализируемым веществом в слое между молекулами могут возникнуть:

Исследование свойств монослоев низкомолекулярных веществ

1998 г. – проведен контроль самоорганизации алканотиолов на позолоченной поверхности кантилевера [R. Berger et al, J. Appl. Phys., A, 66, 55 (1998)]

-4,50E-02

-4,00E-02

-3,50E-02

-3,00E-02

-2,50E-02

-2,00E-02

-1,50E-02

-1,00E-02

-5,00E-03

0,00E+00

5,00E-03

0 2 4 6 8 10 12 14

Время протекания процесса, ч

По

вер

хн

остн

ое н

атя

жен

ие,Н

/м

Кинетика сорбции тиофенола (10-2M)Кинетика сорбции гексилтиола (10-2M)

Хемосорбция 4-аминотиофенола 0,001M концентрации из метанола

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 2 4 6 8 10 12 14

Время протекания процесса, ч

По

ве

рх

но

стн

ое

на

тяж

ен

ие

, Н

/м

Хемосорбция 4-аминотиофенола из МеОН Хемосорбция тиофенола и гексантиола из МеОН

N

S

HH

H

H

H H

H

Электронный нос на основе НКС датчиков

На каждый кантилевер нанесен полимер, способный по разному взаимодействовать тем или иным газом.

Монослои тиолов на золоте

CH3(CH2)nSH + Aum => СН3(СН2)nS (Au3+) • Aum-3+1/2H2

Химическая реакция тиолов с поверхностью золота:

Стадии самоорганизация молекул тиола на золоте:

Низкомолекулярные слои на золоте

SHO

N

NN Cu

Cl

Cl

10

Au

CH3OH

10

N

N

N

O S Au

CuCl

Cl

Бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)-дисульфид (Лиганд I)

4’-(12-меркаптододеканилокси)-[2,2,’;6’,2’’]-терпиридин (Лиганд II)

N

N

S S

NN

S

N

Au

S

N

AuAu

NN

S

N

Au

S

N

AuAu

NN

Au

CH3OH

Для модификации использовались растворы с концентрацией 10-3 моль/л

Ионоселективные датчики

2000 г. - первый ионоселективный датчик Сs+ на основе кантилевера [H.-F. Ji et al, Chem. Commun., 457 (2000)]

Основной объект исследования:1. молекулы сурфактанта бис-4-(2-

пиридилметиленаминофинил)дисульфида (лиганда), способные образовывать хелатный комплекс с ионами тяжелых двухвалентных металлов: Co2+, Ni2+, Cu2+

2. водные растворы солей: MX2·6H2O (M – Co, Cu, Ni; X – ClO4) (концентрация 10-3М).

0

0,1

0,2

0,3

0 50 100 150 200 250

t, мин

σ,

Н/м

Межмолекулярные силы в монослоях

Возникновение π-π взаимодействий между

сопряженными ароматическими системами

приводит к притяжению молекул в слое

1 - Лиганд I 2 - Лиганд II

1

2

f/a,

Координационные полиэдры лиганда I

I - квадрат II – неплоская III – тетраэдр

Формы координационных полиэдров хелатных комплексов кобальта никеля и меди с лигандом I:

Изменение конформации полиэдра

Влияние структуры координационного полиэдра

Никель

Медь

Кобальт

Замещение хлора на гистидин в лигандной оболочке

SO Au

N

NN Cu

Cl

Cl

10

L-Histidine HCl H2O

CH3OH N

N

N

O S Au

CuCl

N

N

COOHNH2

10

N

N

N

O S Au

CuCl

NH

N

COOHNH2

Cl

10

-HCl

*[S. L. Gao, S. Chen, H. Liu, R. Hou, and Q. Ji, Russian Journal of General Chemistry, Vol. 74, No. 3, 2004, pp. 371375]

Замещение хлора на гистидин происходит через образование интермедиата*

Изменение структуры лигандной оболочки металлокомплекса

f/a,

N

N

N

O S Au

CuCl

NH

N

COOHNH2

Cl

10

Пример нанесения функциональных групп на поверхность

кантилеверного датчика

OH OHOH

SiSiSi+ N CH2 CH2 Si CH2 CH2 CH2 NH2

CH2

CH2 CH2

CH2

OHOO

SiCH2N CH2 CH2 NH2

(CH2)2

(CH2)2

OH

HO

SiSiSi

Au + HS CH2 CH2 COOH Au S CH2 CH2 COOH

COO- COO-COO-COO-COO-COO-

NH2 NH2 NH2 NH2NH2 NH2NH2NH2

Адсорбции полиэлектролитов на отрицательно заряженной поверхности

?

Диффузия макромолекул к поверхности

Конформационные изменения

R1

Образование точек зацепления

Адсорбция 4-ВП на модифицированную золотую поверхность

Изгиб

I

I

II

II

Формирование латеральных напряжений в слое

Изменение резонансной частоты колебаний кварцевого кристалла за счет прироста массы

I – Образование точек зацепления

R1

II – Конформационные изменения

f/a,

Гибридизация молекул ДНКJ. Fritz et al., Science 288, 316 (2000);

Два кантилевера модифицированы различными олигонуклеотидами:

I. БуферII. Гибридизация

на 1-ом кантилевере

III. Гибридизация на 2-ом кантилевере

АптамерыАптамер – олигонуклеотид, который проявляет специфическое связывание с молекулой-"мишенью". Обычно аптамеры находят методом выборки из случайного массива последовательностей. Природные аптамеры встречаются в РНК-переключателях.

Сенсорные слои на основе аптамеров

SH- 3’-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3’ (длина линкера: ~1,1 нм)

SH- 3’-(CH2)24-GGT TGG TGT GGT TGG-3’ (длина линкера: ~3,9 нм)

~3,5 нм

Измерения в потоке•С(тромбина) = 5 мг/мл,

•Объем анализируемого раствора – 250 мкл

•Скорость 20 мкл/мин

•Связывание аптамера с тромбином осуществлялось в буфере0,1M Трис, 0,14М NaCl, 0,02М MgCl2, 0,02М KCl (pH = 7.4)

Связывание аптамер-тромбин

Формирование латеральных напряжений в слое

Изменение резонансной частоты колебаний кварцевого кристалла за

счет прироста массы

1

2

3

1

2

Данные формирования латеральных напряжений и изменения резонансной частоты колебаний кварцевого кристала при адсорбции тромбина на слои: 1 – аптамер с 6 метиленовыми группами, 2 – аптамер с 24 метиленовыми группами и 3 – полиаденин.

f/a,

Межмолекулярные взаимодействия в слое, содержащем аптамер с 24

метиленовыми группами

Возможный механизм межмолекулярных взаимодействий в слое с аптамером,

содержащим 6 метиленовых групп

Аптамер, связываясь с тромбином меняет свою конформацию

Иммобилизация белков на поверхность кремния и золота

OH OHOH

SiSiSi+ N CH2 CH2 Si CH2 CH2 CH2 NH2

CH2

CH2 CH2

CH2

OHOO

SiCH2N CH2 CH2 NH2

(CH2)2

(CH2)2

OH

HO

SiSiSi

Au + HS NH2 Au S NH2

NH2OHC(CH2)3CHO

H2ON CH(CH2)3CHO

N CH(CH2)3CHOH2N-белок

БуферN CH(CH2)3CH N белок

N CH(CH2)3CHOH2NC(CH2OH)3

Буфер

N CH(CH2)3CH NC(CH2OH)3

a)

б)

в)р

Иммобилизация белков на поверхность золота

Иммобилизация фрагментов антител

Модификация кантилевера с помощью микрокапель

• sciFLEXARRAYER SX• Nozzle PDC 70, non-coated• Drop volume: ~ 320 pl• Humidity: ~35%• Temperature: 21°C

Анализ онкомаркеров с помощью НКС

Wu, Ram H. Datar, Karolyn M. Hansen, Thomas Thundat, Richard J. Cote & Arun MajumdarNature Biotechnology 19, 856 - 860 (2001)

Процесс сорбции антител на поверхность, содержащую морфин

-0,03

-0,025

-0,02

-0,015

-0,01

-0,005

0

0,005

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Время протекания процесса, мин

По

вер

хн

остн

ое н

атя

жен

ие,

Н/м Степени

разбавления исходной сыворотки

крови иммунизированного

кролика

500 150 50

Процесс сорбции антител на поверхность, содержащую морфин

Процесс диссоциации иммунных комплексов под действием морфина

Процесс диссоциации иммунных комплексов с рецепторной поверхности под действием морфина

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0 30 60 90

Концентрация морфина, мг/мл

Макси

ма

ль

ны

е

по

ве

рхн

остн

ые с

ил

ы,

Н/м

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Время протекания процесса, мин

По

вер

хно

стн

ое

нат

яж

ени

е, Н

/м

Р я д 3

Р я д 1

Р я д 2

1 0 л и н е й н ы й ф и л ь т р ( Р я д 1 )

7 л и н е й н ы й ф и л ь т р ( Р я д 3 )

8 л и н е й н ы й ф и л ь т р ( Р я д 2 )

3 мкг/мл10 мкг/мл100 мкг/мл

-0,0002

0,0098

0,0198

0 3 6 9 12 15

Увеличенная область

Зависимость максимальной силы изгиба от концентрации морфина

Агрегация белков как причина

нейродегенеративных заболеваний 1997 г. - за обоснование концепции инфекционных-прионных белков С. Прусинеру вручена Нобелевская премия

Существуют мнения что до 50 % всех заболеваний человека связаныс нарушениями конформационного строения биополимеров [M.T. Fisher PNAS, 103, 36, p. 13265, (2006)]

Неправильная укладка лизоцима приводит к амилоидозу Остегтага

(а) Структура молекулы лизоцима (Hen Egg-White Lysozyme) PDB ID: 1GXV [M. Refaee et al. J.Mol.Biol. 327, 857, (2003)]

(б) Предполагаемый механизм агрегации белка лизоцима [L.C. Serpell et al , Cell. Mol. Life Sci., 53, 871, (1997)]

Исследование агрегации лизоцима

-0,065

-0,05

-0,035

-0,02

-0,005

0,01

0,025

0,04

0 2 4 6 8 10 12 14

Время протекания процесса, ч

Пов

ерхн

остн

ое н

атяж

ени

е,Н

/м

а

г

бв

Зависимость от времени поверхностного натяжения пленки лизоцима, находящейся на золотой (г) и кремниевой (а) поверхности кантилевера, помещенной в глициновый буфер pH = 3.0

Направление изгиба кантилевера

Скорость агрегации при экспоненциальной аппроксимации, ч-1.

Характерное время агрегации при экспоненциальной аппроксимации, ч.

Поверхность кремния

В сторону монослоя 0,167 ± 0,002 6,00 ± 0,10

Золотая поверхность

В сторону монослоя 0,73 ± 0,01 1,37 ± 0,01

Ковалентная иммобилизация лизоцима на поверхности кантилевера

Кантилеверные микрочипы

Непрерывная контроль лекарств в режиме реального времени

Экстренный биохимический анализ у постели больного

Перспективы применения