Индуцированные

плюрипотентные стволовые клетки человека в

регенеративной

медицине

С.Л. КиселевНИЦ

«Курчатовский

институт»

МОСКВАМОСКВА

20112011

Регенерация

тканей-

процесс

давно известный

человечеству

Первое

успешное

применение

клеток

1819 г. Англия, Дж. Бланделл1832 г. Ст. ПетербургАкушер

Андрей

Вольф

Первой

обоснованной

клеточной

трансплантацией

у

человека

следует

считать переливание

AB0-совместимой

крови, впервые

выполненное

в

1907 году

R. Ottenberg.

«Мы

должны

преуспеть

в

создании

искусственной

живой

материи, либо

найти

объяснение

почему

это

невозможно… Поведение

наших

клеток, как

и

наше

поведение

и

инстинкты, запрограммировано наследственным

аппаратом. Мы

подчиняемся

законам

наших

клеток,

которые

живут

двойной

жизнью: в

мире

химии

и

мире

смысла».

Человеческий

организм

состоит

из 100 триллионов

клеток

> 100 000 000 000 000

•

Белков•

Нуклеиновых

кислот•

Жиров

•

Солей•

И др.

Клетки

маленькиеПрокариоты

1-10 мкм

Эукариоты

10-100 мкм

••

БольшинствоБольшинство

клетокклеток

организмаорганизма

имеютимеют болееболее

короткийкороткий

жизненныйжизненный

циклцикл, , чемчем

весьвесь

организморганизм••

ПрактическиПрактически

всевсе

тканиткани

восстанавливаютсявосстанавливаются

вв

течениетечение

жизнижизни••

ВВ

течениетечение

жизнижизни

организмаорганизма

большинствобольшинство

тканейтканей

((кожакожа, , кишечниккишечник, , кроветворнаякроветворная системасистема) ) продуцируютпродуцируют

такоетакое

количествоколичество

клетокклеток, , суммарныйсуммарный

весвес

которыхкоторых

вово

многомного разраз

превышаетпревышает

весвес

организмаорганизма

ОбеспечениеОбеспечение

целостностицелостности организмаорганизма

Возобновление

специализированных клеток

происходит

за

счет

стволовых

Специализированная

клетка

Клетка

предшественник

Стволовая

клетка

-

Клетки, способные

к

самообновлению-

Клетки, способные

давать

начало

многим

другим

типам

клеток

Valentin

Hacker (1864 -1927)1892

А.А. Максимов(1874-1928)

1908

Кто

первый

придумал

термин«стволОвая

клетка»

Типы

стволовых

клеток

Тотипотентные (полностью,

лат) - зигота

Плюрипотентные (много, греч.)

–

эмбриональные

стволовые

клетки

Мультипотентные (много, лат.)

дифференцировка

в

ткани

внутри

зародышевых

слоев

СК

крови, костного

мозга, волоса, кожи, кишечника

и

тд.

Предшественники дифференцировка

в

определенные

клетки

в

пределах

определенной

ткани

Первые

экспериментальные доказательства

существования

стволовых

клетокA direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.

Till, J. E., & McCulloch, E. A.

Radiation Res.

14, 213-222 (1961)

Cytological demonstration of the clonal

nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells.

Becker, A. J., McCulloch, E. A. & Till, J. E.

Nature

197, 452-454 (1963)

ЭдвардЭдвард

ДональдДональд

ТомасТомас

University

of

Minnesota, USA

Трансплантация

стволовых

клеток костного

мозга

больным

лейкозом

1968 г.

Роберт

Эдвардс

крестный

отец4 миллионов

человек

Нобелевская

премия

по

медицине

2010

1978 г. первый

ребенок

из

пробирки

Банк

замороженных

бластоцист(в

мире

более

10 млн)

В мае 2010 г. в

США

родился

ребенок, который

был

«зачат»

в

1990 г.

-

Первое

применение

ЭСК

человека

Основное

свойство: оставаясь

нормальными

(не

трансформированными), могут

неограниченно

долго

размножаться

в

культуре

с

сохранением

основного

свойства-

плюрипотентности

Эмбриональные

стволовые

клетки плюрипотентны-

участвуют

в

формировании

всех

тканей

организма

гепатоцитынейронымышцыкровьБета-клетки

Технология

генетического

нок-аута с

использованием

ЭСК

Гомологичная рекомбинация

в

ЭСК

exon1 exon2 exon3

генexon1 exon3

exon1 exon2 exon3

exon1 exon3

Нобелевская

премия

2007 г.

Типы

стволовых

клеток

Тотипотентные (полностью,

лат) - зигота

Плюрипотентные (много, греч.)

–

эмбриональные

стволовые

клетки

Мультипотентные (много, лат.)

дифференцировка

в

ткани

внутри

зародышевых

слоев

Пуповинная

кровь, клетки

костного

мозга

и

тд.

Предшественники дифференцировка

в

определенные

клетки

в

пределах

определенной

ткани

Репрограммировать?

Технологии

«репрограммирования»

«клонирование» слияниеиндукция

Jaenisch at al., 2008

В

ооцитах

или

ЭСК

есть

факторы, которые

позволяют

репрограммирование

Гены-господа, гены-рабы

Pax6 -

eyeless

Глаз

вырастетна

ноге

если

заставить

там

работать транскрипционный

фактор

Pax6

Типы

стволовых

клеток

Тотипотентные (полностью,

лат) - зигота

Плюрипотентные (много, греч.)

–

эмбриональные

стволовые

клетки

Мультипотентные (много, лат.)

дифференцировка

в

ткани

внутри

зародышевых

слоев

Пуповинная

кровь, клетки

костного

мозга

и

тд.

Предшественники дифференцировка

в

определенные

клетки

в

пределах

определенной

ткани

Репрограммировать?

Гены

господа

плюрипотнетности

Генетическое

репрограммирование: индуцированные

плюрипотентные

стволовые

клетки

Соматические

клетки

взрослого

организма

15-30 дней

Стволовые

клетки

с индуцированной

плюрипотентностью =

эмбриональным

стволовым

клеткам

Гены

«включатели»

в

вирусных

векторах

(«коктейль

Яманаки»)

Репрограммирование

эндотелиальных клеток

пупочной

вены

человека

(HUVEC)

легко доступны, могут быть сохранены длительное время (банкирование) могут быть изначально получены в количествах, достаточных дляиспользованияотсутствие воздействия внешней среды

дни

--

5

--

0

--

6

--

20 -

25

pMX(KOSM)

Шутова

и

др

2009Lagarkova

et al 2010

CD90

GATA-6

Экто-

Энто-

Мезо-

Индуцированные

плюрипотентные клетки-

новая

надежда?

Ссылок

в

PubMed

на

iPS

2006 2008 2010

150

8

3200

150

Без

использования

вирусовС

использованием

белковС

использованием

РНКС

использованием

малых

молекулМеньшим

числом

транскрипционных

факторов

Эффективность

получения

до

1-3%

С

использованием

клеток

человека:Фибробласты

кожиКератиноциты

кожиВолосяных

фолликулКровиЭндотелия

сосудовНейроныГепатоцитыФибробласты

жира

Из

любых

клеток

мышки

Одинаковы?

2009

Основные

проблемы

трансфузиологии

-Плюрипотентные

клетки

могут

давать

начало

клеткам

крови-Стабильные

клеточные

линии

могут

быть

хорошо

проверены

на

наличие

инфекционных

агентов-Стабильные

клеточные

линии

могут

быть

точно

охарактеризованы

по

иммунологическим

параметрам-Стабильные

клеточные

линии

могут

быть

даже

получены

персонально

-Зрелые

эритроциты

безопасны

при

трансплантации

-для

удовлетворения

потребности

в

донорах

в

РФ

необходимо

иметь

28 доноров

на

1000 чел. населения, в

настоящее

время

около

13 доноров.

Затраты

на

1 донора

1000 руб. Программа

2008-11 гг. по

привлечению доноров

стоит

16 млрд. руб.

-риск

инфицирования

доноров-иммунологическая

несовместимость

Потребность

в

эритроидной

массе

1,8 млн. литров

ежегодно

= 32 млрд. рублей

Причины

привлекательности источника

и

конечного

продукта

ЭСК

Эмбриоидные

тельца

21

д. CD34+

14-16дн

Иммуномагнитная

селекция

CD34+

Культивированиеex vivo

Фенотипическийанализ

NOG мыши

Анализ

клоногенных

предшественников

в

метилцеллюлозе

8-21 день

ксенотрансплантация

CFU-GMCFU-E

Этапы

направленной

дифференцировки плюрипотентных

клеток

человека

в

компонеты

крови

Дифференцировка

эритроидных

клеток

из плюрипотентных

стволовых

клеток

человека. BFU-E (burst forming units erythroid), 12 дней

после

диссоциации

эмбриоидных

телец, выделяются

капилляром

из

метилцеллюлозы

и

переводятся

в

жидкую

среду

для

дифференцировки

и

дальнейшей

пролиферации

SCF-10 нг/млFLT-3, 10 нг/млIL-3, -5 нг/млIL-6, -2 нг/млErythropoetin

5U/мл,Thrombopoietin

5 нг/млHorse serum

5%Среда

X-VIVO15 transferrin, 10μg/ml insulin, 1мкг/млFeSO4

5 дней 10 дней 21 день

Фотографии

в

светлом

поле. Видны

красные

клетки. Эритробласты

Предварительный

иммуногистохимический

и

OT-ПЦР

анализ

выявил

экспрессию

гликофорина

А

и

ζ-

и ε- ,глобинов, но«взрослого»

β-глобина

нет. Клетки

ядерные. Не

происходит

энуклеации. Требуется

дальнейшая

работа

по

поиску

условий

энуклеации

и

экспансии

эритроцитов.

диссоциация

метилцеллюлоза

Ростовые

факторы:

•

Universal

Gas-Vortex

Gradientless

Bioreactor

-

More uniform-

Approx. 80% efficiency

Проблемы

экспансия

исходных

клеток

и эритроидных

предшественников

Взятие

образца

кожии

культивированиефибробластов

Введение

фактороврепрограммирования

Дифференцировка

Получение

iPSC

Дифференцировка

в

патологическую

ткань

Поиск

лекарстваИзучение

патологии

Коррекция

гена

Заместительная

терапия

Пациент-специфические

клетки

с индуцированной

плюрипотентностью

для

изучения

и

терапии

заболеваний

Болезнь

Паркинсона

–

iPSCs

from 3

patients -

mutation in LRRK2 6055G>A (G2019S)

Болезнь

Хантингтона

– iPSCs from 3 patients –

CAG tandem repeat expansion in IT-15

Макулодистрофия

Штатгардта

–

iPSCs from 3

sibling patients

Диабет

–

iPSCs from 2 patients (insulin gene mutations)Несовершенный

остеогенез

–

patients

selection (Col1A mutations)

Пациент-специфичные

iPSC

Parkinson’s disease iPS

Hungtington

disease iPS

Поиск

мутаций, ассоциированных

с заболеванием

Gene Number of coding exons

Number of known different mutations

Method of screening for mutations

Found mutations

ABCA41

75%50 > 600 ABCA4

microarray1No known mutations1

ELOVL420%

6 3 mutations in 6th

exonDirect sequencing

No mutations in coding exons

1 –

Mutations screening in ABCA4 gene was conducted by Dr. Rando Allikmets’s

group.

PROM15%

26 6 mutations in 5 exons

Direct sequencing

No known mutations

CNGB32 cases

18 2 mutations Not studied Not studied

Благодарность за

предоставленные

материалы:

Р. ДеевуМ. Лагарьковой