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Glucose sensorGlucose sensor

화공생명공학화공생명공학 20041213 20041213 이택이택


Table of contentsAbout

About

About

4 About

5 About

OBJECT

THEORY

METHOD

DATA & ANALYSIS

DISCUSSION


OBJECTAbout

GLUCOSE SENSOR

1 About OBJECT


-Cyclic voltammetry 와 Chronoamperometry 의

기본 개념을 이해하고 이를 이용한 기초적인 전기화학 실험을 수행한 다음 , 대표적인 바이오 센서(bio sensor) 인 당센서 (glucose sensor)

glucose oxidase(GOD) 를 이용하여 제작하고 ,

이렇게 제작한 gluecose sensor 를 사용하여 전기

화학적으로 glucose 를 측정한다 .

1

About OBJECT

AboutOBJECT Introduction.Concept.


THEORYAbout

THEORY

2 About THEORY


AboutTHEORY

2 About THEORY

1.Cyclic voltammetry ( 순환 전압 전류법 ,CV)

- 시간에 비례하여 전위를 변화시킬 때에 흐르는

전류를 전류 - 전위 곡선으로 기록하는 방법을 전위 주사법 (potential sweep method)

이라고 하는데 , 이것을 계속 반복해서 전위 주사하는 경우를 Cyclic voltammetry 라고 부른다( 그림 1.Cyclic

voltammetry의 퍼텐셜 프로그램 )


AboutTHEORY

2 About THEORY

- 정지 용액에서 정지 전극을 사용하여 가역적인 단순한 전극 반응에 CV 를 적용한 경우 .

( 그 림 2. 가 역 전 극 반 응 에 대 한 cyclic voltagram)

2. 순환 전압 전류 곡선의 형태


AboutTHEORY

2 About THEORY

2. 순환 전압 전류 곡선의 형태

- 전류 피크가 생기는 것은 과전압 증대와 수반하여 반응량 증가로 전류가 크게 되는 효과와 시간 경과에 수반하여 전극 근방의 반응물량 감소로 전류가 작게 되는 효과에 의한다고 설명된다 . 즉 전위를 anode 쪽으로 주사하면 , 과전압 증대에 따라 R 의 산화속도는 증대하면서 전류는 커진다 . 전류의 증대는 극표면에 있어서 R 의 감소를 가져다 주어 마침내 0 이 되고 , 전류는 확산 지배로 된다 . 반대의 경우도 이와 같다 .


AboutTHEORY

2 About THEORY

3.chronoamperometry

-amperometry( 전류측정법 ) 는 그 명칭에 나타나듯이 전류의 측정에 기초하고 있다 . 작용전극의 전위를 일정케하여 전류와 시간 관계를 측정하는 방법을 전위 스텝법 또는 chrono amperometry 라 하고 , 전극 반응의 연구에 많이 이용된다 .

( 그림 3. 실제 chrono amperometry I-t 곡선 )


AboutTHEORY

2 About THEORY

4. 한계전류 (limiting current)

- 농도분극이 극심하게 일어나면 전극 근처에는 반응물의 농도가 0 에 접근하여 과전위가 증가하더라도 전류세기는 일정한 값 이상으로 증가하지 못 하는 상황에 도달한다 . 이 때 흐르는 전류의 세기를 한계 전류라 한다 .

- 용액을 저어 줄 때와 저어 주지 않을 때는 위와 같은 그림으로 한계 전류가 나타난다 .

( 그림 4. convection 유무에 따른 I-t 곡선 )


AboutTHEORY

2 About THEORY

5.3 전극 셀

- 실험 장치에서는 연구의 대상인 전극 ( 작업 전극 working electrode) 과 이의 상대 전극 ( 상대전극 counter electrode)사이에 전류가 흐른다 . 작업 전극의 전위에 따라서 전류의 세기를 측정하기 위하여 , 별도의 기준전극을 작업 전극 가까이 두고 이 기준 전극에 대한 작업 전극의 전위를 읽고 그 값을 원하는 값과 비교하여 원하는 값과 일치하도록 상대전극과 작업적극 사이를 흐르는 전류를 빠르게 조절한다 . 이것은 보통 자동화된 장치 ( 일정 전위기 :potentiostat)를 써서 간편하게 할 수 있는데 , 이것을 3전극 셀 이라고 한다 .


AboutTHEORY

2 About THEORY

6.3 전극 셀

( 그림 6. 3 전극 셀 실험의 개념도 )


AboutTHEORY

2 About THEORY

7.Glucose Oxidase(GOD)

-Glucose oxidase 는 산소를 전자 수용체로 사용하여 , β-D-glucose+H2O +O2 →D+ 글루코노락톤 +H2O2 의 반응을 촉매하는 효소이다 . 이 변화에 의해 과산화수소가 생성된다 .

( 그림 7. 실험에 사용되는 reaction scheme)


AboutTHEORY

2 About THEORY

8.Enzyme Kinetcis

-Michaelis 와 Menten 은 효 모 의 가역반응에 의한 수크로스의 가수 분해 속도를 여러 가지 효소 농도 및 기질 농도에 대해 측정해서 다음과 같은 결과를 얻었다 .


AboutTHEORY

2 About THEORY

- 이를 변형하면 다음과 같은 식을 얻을 수 있다 .

이 식을 Michaelis-Menten equation 이라 한다 .

- 이 식의 양변을 역수로 취하면 다음 식을 얻을 수 있다 .

8.Enzyme Kinetcis


AboutTHEORY

2 About THEORY

- 따라서 1/v 를 1/[S] 에 대하여 플로팅한 것을 Lineweaver-Burk plot 이라 한다 .

8.Enzyme Kinetcis

( 그림 8. Lineweaver-Burk plot)


AboutTHEORY

2 About THEORY

9.Biochip

- 바이오칩은 DNA, 단백질 등 생물의 몸 안에 있는 다양한 성분을 이용해 칩을 만든 것으로 , 생화학반응에 참여하는 생체분자들은 인접한 분자들과 산화 - 환원 상태가 다르다 .

( 그림 9.Biochip platform)


AboutTHEORY

2 About THEORY

이것을 구동력으로 생체분자 사이에 전자를 전달하면서 미세한 전류를 일정한 방향으로 흘려 보낸다 . 각각의 구성성분을 배열한 후 , 전기나 빛으로 자극하면 상태 구분이 가능한 전기적 응답신호를 보낸다 . 이것이 컴퓨터의 전자소자와 같은 역할을 수행하는 생물전자소자인 바이오칩이다 .

9.Biochip

( 그림 10. DNA Chip 을 이용한 암조직의 검출 )


METHODAbout

HOW TO USE

3 About METHOD


About

3

1.CYCLIC VOLTAMMETRYMETHOD(1)working electrode 의 polishing

방법

1. 0.3 μm 의 alumina powder 를 2 차 증류수에 분산하여 polishing pad 에 뿌 리 고 , polishing pad 에 glassy carbon working electrode 를 평행하게 3~4 분 정도 돌리면서 갈아준다 .

2. working electrode 를 EtOH 와 2 차 증류수로 씻어준다 .

3. working electrode 를 EtOH 50% 와 2 차 증 류 수 50% 를 넣 은 튜 브 에 넣어주고 sonication 시켜준다 .(2~3분 )

4. N2 gas 로 말려준다 .

About METHOD


About

3

METHOD

(2) Couple 의 Cyclic voltammetry1. 1.0 mM , 0.1 M KNO3 solution 5mL 를

Electrochmical cell 에 넣고 electrode 를 그림 1 과 같이 배치시킨다 .( 산소를 제거할 필요가 있는 실험에서는 Ar gas 를 purging 할 수 있다 .)2.Cyclic voltammetry program 을 컴퓨터상에서 실행시킨다 .3.Cyclic voltammetry 의 potential 범위 , scan rate, current rage 를 선택한다 .(scan rate 는 각 각 10mV/s, 20mV/s, 50mV/s, 100mV/s, 200mV/s 에서 실험한다 .)

1.CYCLIC VOLTAMMETRY

About METHOD


About

3

METHOD

4. 프 로 그 램 시 작 과 동 시 에 Cyclic voltammetry 기기를 sweep 한다 .( 이 실 험 은 환 원 부 터 실 행 되 므 로 negative scan 을 실행하여 준다 .)5.Cyclic voltammetry 을 얻는다 .


About METHOD


About

3

2.chronoamperometryMETHOD

1. 1.0 mM , 0.1 M KNO3 solution 2mL를 Electrochmical cell 에 넣고 electrode를 그림 7 과 같이 배치시킨다 .( 산소를 제거할 필요가 있는 실험에서는 Ar gas 를 purging 할 수 있다 .)2. 위 의 용 액 을 이 용 하 여 일 정 한 전 압 (환원전위 ) 을 걸어준 후 바탕 용액만 있을 때 용액을 저어주지 않을 때 용액을 저어 주었을 때의 i - t 그래프를 비교해본다 .

About METHOD


About

3

3.GLUCOSE SENSORMETHOD

1. 백금 작업 전극 (Pt working electrode) 을 polishing 한다 .2. Polishing 한 백금 전극 표면에 GOD 1 μL 를 loading 한다 .3. GOD 가 완전히 마른 후 GOD 를 전극 표면에 고정시키기 위해 Nafion 1μL 를 loading 한다 .4. 이렇게 준비된 작업 전극을 상대 전극 (Pt counter electrode), 기준 전극 (Ag/AgCl reference electrode) 과 함께 potentiostat 에 연결하고 0.1 M, pH 7.0 phosphate buffer 5mL 에 담근다 . 이 때 용액은 magnetic stirrer 를 이용하여 계속 저어준다 .

About METHOD


About

3

METHOD

5. GOD 에 의헤 glucose 가 산화되면서 생성되는 H2O2 를 측정하기 위해 0.6 V(vs. Ag/AgCl) 의 산화전압을 걸어준다 .6. Background 가 안정되면 0.25 M 의 glucose 를 micro-syringe 를 이용해서 20μL 씩 주입한다 .(1 mM 씩 증가한다 .)

3.GLUCOSE SENSOR

About METHOD


DATAAbout

DATA & ANALYSIS

4 About DATA


Contents

4 About DATA

DATA 1.CYCLIC VOLTAMMETRY

(1) 10mV/s 의 전압을 가했을 때의 전류 변화


Contents

4 About DATA


- 그림을 보면 , 환원 peak 와 산화 peak 가 이론적인 실험 결과에 비하여 조금 밀려서 나타난 것을 확인할 수 있다 . - 이것은 작업 전극이 가지고 있는 자체적인 resistance effect 와 실험 과정에서의 작업 전극 표면을 닦아주는 polishing 이 충분히 이루어지지 못 했기 때문이라고 볼 수 있다 . polishing 이 제대로 이루어지지 않으면 , 전극 표면에서의 resistance effect 가 증가하게 된다 .


Contents

4 About DATA


- 위의 그래프에서 중요한 변수는 환원 peak에서의 전압 (Epa) 과 전류 ,(Ipa) 산화 peak 에서의 전압 (Epc) 과 전류 (Ipc) 의 크기이다 . 이 값들을 이용해서 Formal reduction potential(EO'), 반응에 참여한 전자의 수 등을 알 수 있다 .

-Formal reduction potential (EO') = (Epa + Epc) / 2


Contents

4 About DATA


- 또 전달된 전자의 숫자는 가역적인 peak 에서 두 peak potential 사이의 차이에 의해서 알 수 있는데 , 이는 다음과 같다 . Ev = Epa - Epc = 0.059 / n

- 실제로 Epa(0.291V) 와 Epc(0.203V)의 값을 넣어보면 , 퍼텐셜 차이 Ev 는 0.088이 나온다 .이 값은 우리의 예상 퍼텐셜 차이인 0.059 와 차이를 보인다 .


Contents

4 About DATA


- 또한 가역적인 system 안에서의 peak current 는 Randles-Sevick equation을 이용해 scan rate 의 관계를 알 수 있다 .

Ip = peak current , An = electron stoichiometryA = electrode area , cm2

D = diffusion coefficient, cm2/sv = scan rate, V/s 위 의 식 을 이 용 하 여 , (scan rate)1/2 와 peak current 의 관 계 를 알 수 있 다 . 이것들의 관계는 아래 에서 언급하였다 .


Contents

4 About DATA


(2) 20mV/s 의 전압을 가했을 때의 전류 변화


Contents

4 About DATA


(3)50mV/s 의 전압을 가했을 때의 전류 변화


Contents

4 About DATA


(4)100mV 의 전압을 가했을 때의 전류 변화


Contents

4 About DATA


(5)200mV 의 전압을 가했을 때의 전류 변화


Contents

4 About DATA


(6) 위의 CV 들을 한꺼번에 겹쳐놓았을 때의 그림 비교


Contents

4 About DATA


- 위의 그래프들을 한꺼번에 겹쳐 놓았다 . 이를 보면 , scan rate 가 증가함에 따라서 최대 전압과 전류가 증가하는 양상을 확인할 수 있다 . 이것은 scan rate 가 증가하면서 전극에서 전자 교환을 하는 이온의 수가 증가함에 따라서 이를 방해하는 전자 교환 이온 외의 생성물들이 증가하면서 peak 이 밀려나는 것이다 .


Contents

4 About DATA


(7)CV 시 Peak 에서 나타난 전압 및 전류값들

Epa(V) Epc(V) Ipa(A) Ipc(A)

10 mV/s 0.291V 0.203V-5.117e^-6A

4.747e^-6A

20 mV/s 0.294V 0.199V-7.044e^-6A

6.304e^-6A

50 mV/s 0.303V 0.191V -1.100e^-5A

8.845e^-6A

100 mV/s 0.309V 0.180V-1.498e^-5A

1.131e^-5A

200 mV/s 0.322V 0.173V-2.026e^-5A

1.336e^-5A


Contents

4 About DATA


(8) 환원 최대 전압 (Ipa) 과 scan rate 의 관계

(scan rate)^1/2 에 따른 각 각의 peak current 를 plot 하게 되면 , 다음과 같이 peak current 가 linear 하게 증가함을 알 수 있다 .


Contents

4 About DATA

DATA 2.chronoamperometry

(1) convection 이 없는 경우의 시간 대 전류 변화


Contents

4 About DATA


-convection 이 없는 경우 , 급격한 전압의 증가로 인한 전극 표면 근처의 농도 변화에 대해서 보면 , 전압이 급격하게 줄어드는 것은 mass transfer 에 limit 이 걸려서 급격히 감소하는 것을 확인 할 수 있다 . 이때의 limit 을 한계전류라고 하는데 , convection이 없는 경우 , 한계 전류가 굉장히 작은 양으로 측정되는 것을 확인할 수 있다 .


Contents

4 About DATA


(2) convection 이 있는 경우의 시간 대 전류 변화


Contents

4 About DATA


-convection 이 있는 경우 , stirrer 에 의해서 가라앉거나 닿지 않은 반응물들이 전극 표면에 닿아서 , diffusion 만 있을 때보다 더 많은 활성을 갖게 된다 . 이것은 mass transfer 가 convection 이 없는 경우보다 더 크고 , 한계전류도 큰 것을 확인할 수 있다 . 이로 인하여 한계 전류는 convection 이 없는 경우보다 더 큰 것을 알 수 있다


Contents

4 About DATA


(3) convection 이 없는 경우와 convection 이 있는 경우의 시간 대 전류 변화 비교


Contents

4 About DATA

DATA 3.GLUCOSE SENSOR

(1) 전형적인 glucose 실험 결과


Contents

4 About DATA

DATA

-Chronoamperometry 가 시작된 후 back ground 가 안정되면서 0.25M 의 glucose를 2mM 씩 8 회 첨가하였다 . - 전체적인 그래프를 보면 , glucose 가 첨가되면 , GOD 에 의해 glucose 가 산화되면서 생성되는 H2O2 를 측정한 전류가 증가하게 된다 . 그래서 아래의 그림에서 보는 것과 같은 선형적인 형태를 띠게 되는 것이다 .

3.GLUCOSE SENSOR


Contents

4 About DATA

DATA

- 위의 그래프에서 , H2O2 산화에 의해 흐른 전류의 평균치와 넣어준 glucose 의 농도를 이용하여 data table 을 만들어보고 , calibration curve 를 그려보면 , 아래와 같다 .

3.GLUCOSE SENSOR

농 도(mM)

전 류(μA)

0 0.3532

2 0.5285

4 0.7559

6 0.9002

8 1.0501

10 1.2360

12 1.3575

14 1.4402

16 1.5151


Contents

4 About DATA

DATA 3.GLUCOSE SENSOR

- 효소 반응에 의해 생성된 기질을 전기 화학 반응으로 측정한 전류는 반응 속도와 같다 . 그러므로 Michaelis-Menten kinetics 를 이용하여 , Lineweaver-Burk plot 을 그려보고 Michaelis constant(Km) 을 구해본다 .


Contents

4 About DATA

DATA

- 위의 그래프에서 x=0 일 때 y 값은 1/Vmax 이다 . 이 값은 0.544 이다 . 이 값의 역수를 취하면 , Vmax 의 값은 1.838μA 이다 . 그리고 , 위의 그림과 Lineweaver-Burk equation 을 보면 , 1차 함수의 기울기의 값은 Lineweaver-Burk equation 의 Km/Vm 의 값이다 . 여기서 우리는 Vmax 의 값을 구했으므로 Michaelis constant(KM) 을 구할 수 있다 . 역시 이 값도 구해주면 . 5.173mM 가 나온다 .

3.GLUCOSE SENSOR


DISCUSSIONAbout

DISCUSSION & CONCLUSION

5 About DISCUSSION


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Contents

5 About DISCUSSION

DISCUSSION

-CV 실험에서는 scan rate 에 따른 peak 이 이론보다 많이 밀려서 결과가 나왔다 . 이상적인 조건에서 실험을 수행하였을 경우 , peak 이 밀려서 나타나면 안 된다 . 그런데도 peak 이 밀려서 나타난 것은 , 실험 조작 미숙과 실험 그 자체가 갖는 한계 때문일 것이다 .




Contents

5

DISCUSSION

- 두번째 , chronoamperometry 실험은 실험 자체도 비교적 단순하고 , polishing 과 같은 조금 까다로운 작업도 없었기에 비교적 무난하게 진행할 수 있었다 . 실제로 나온 convection 과 no convection 의 차이 역시 극명하게 나타나서 , 비교 분석하기도 수월하였다 .

About DISCUSSION

2.chronoamperometry



Contents

5

DISCUSSION

-glucose sensor 실험은 가장 까다로운 실험이었다 . GOD 의 보존 상태가 양호하지 않아서 , 활성도가 떨어지는 것을 예상되었고 , 게다가 , 실험 중 발생한 noise 도 많았고 , 그래프의 해석 또한 임의적인 실험이었다 .

About DISCUSSION

3.GLUCOSE SENSOR


Thank you.

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