1

ŽIVOT EUKARIOTSKE IRNK U CITOPLAZMI

Informaciona RNK (iRNK) učestvuje u realizaciji genetičke informacije kao posrednik između

gena i proteina. Njen prekursor, pre-iRNK, još tokom transkripcije podleže specifičnom načinu

obrade: dodavanju 5’-kape, splajsovanju, editovanju i poliadenilaciji 3’-kraja. Nastala zrela iRNK

transportuje se kroz nukleusne pore u citoplazmu, gde kao veran „otisak“ genetičke informacije

predstavlja matricu za sintezu polipeptida i nakon toga podleže degradaciji.

Mnogi tekstovi o ekspresiji eukariotskih gena život iRNK opisuju na ovako suvoparan i,

realno, pojednostavljen način. Takav opis ne govori ništa o veoma intrigantnom i interesantnom

životu koji vodi jedna iRNK, a koji je pun "problema", "promena", čak i naglih "preokreta".

Informaciona RNK, zapravo, pored obrade i translacije, podleže proveri kvaliteta, transportuje

se do određene lokacije u ćeliji, može promeniti unutarćelijsku lokaciju, stupati u blisku vezi sa

drugim iRNK koje kodiraju funkcionalno povezane proteine, čuvati se kao rezerva za buduće

korišćenje, a njen poli(A) rep može da se skraćuje i produžava, itd. (slika 1). Originalno se

smatralo da ovako interesantan život vode određene, retke grupe iRNK i da je on, uglavnom,

ograničen na visoko-specijalizovane ćelije eukariota, kao što su oocite i neuroni. Novija

istraživanja ukazuju da većina iRNK u svim tipovima ćelija vodi sličan način života.

Kompletan "životni" ciklus iRNK od "rođenja" u jedru do "smrti" u citoplazmi, koji

uključuje transkripciju, obradu pre-iRNK, transport iRNK iz nukleusa u citoplazmu, proveru

kvaliteta, ćelijsku lokalizaciju, translaciju, stabilnost i degradaciju iRNK označava se kao

metabolizam iRNK. Informaciona RNK se u svakom trenutku svog života nalazi u kompleksu

sa faktorima (proteinima i malim nekodirajućim RNK) formirajući funkcionalnu jedinicu označenu

kao informaciona ribonukleoproteinska čestica (eng. informational ribonucleoprotein

particle, iRNP).

Kao rezultat odgovora na specifične signale ili usled poremećaja u procesu translacije

iRNK stupa u interakciju sa proteinima koji reprimiraju translaciju i formira mikroskopski vidljive

citoplazmatične granule RNK, koje obuhvataju P tela i granule stresa. P tela su mesta

nakupljanja translaciono utišanih iRNP asociranih sa proteinima za translacionu represiju,

skladištenje ili degradaciju iRNK. Granule stresa su mesta gde se povlače iRNK reprimirane

tokom globalnog reprogramiranja translacije u uslovima ćelijskog stresa. Oba tipa granula

sadrže karakteristične proteine, označene kao proteini konzervisanog jezgra granula, dok

sastav ostalih proteina varira u odgovoru na različite signale i u zavisnosti od kolekcija iRNK

koje se nalaze u njima. Granule RNK obezbeđuju kompartmentizaciju funkcija

citoplazmatičnih iRNK, ali i regulisanu ekspresiju gena na nivou translacije i degradacije iRNK.

2

Slika 1. Dinamične interakcije faktora informacionih ribonukleoproteinskih čestica (iRNP) sa informacionom RNK (iRNK) odražavaju u potpunosti njenu prethodnu istoriju i određuju dalju

sudbinu. iRNK sa RNK-vezivnim proteinima (RBP) i malim nekodirajućim RNK formira zrelu iRNP koja napušta nukleus kroz nukleusne pore i stiže u citoplazmu, gde podleže kontroli kvaliteta, a zatim može biti translatirana, translaciono utišana i uskladištena, lokalizovana u određenom delu citoplazme ili degradovana. Tokom splajsovanja nastale granice egzon-egzon obeležavaju se vezivanjem proteina EJC, koji u citoplazmi stimulišu translaciju regrutovanjem male subjedinice ribozoma, dok pozicionirani u 3'-netranslatirajućem regionu (UTR) pokreću degradaciju iRNK posredovanu prevremenim stop-kodonom (NMD). RBP vezani za 3'-UTR mogu reprimirati inicijaciju translacije i usmeriti transportovanje iRNK na određenu lokaciju u ćeliji, gde će biti translatirana. Neke iRNK, nakon transporta u citoplazmu podležu translacionom utišavanju usled skraćivanja poli(A) repa. Nakon prijema odgovarajućeg signala, translacija takve iRNK stimuliše se citoplazmatičnom poliadenilacijom za koju je neophodna aktivnost proteina koji se vezuje za citoplazmatični element za poliadenilaciju (CPEB).

3

1. FAKTORI IRNP ODREĐUJU SUDBINU IRNK

Faktori iRNP obuhvataju RNK-vezivne proteine (eng. RNA binding proteins, RBP) i male

nekodirajuće RNK (slika 2). Oni regulišu sve korake u metabolizmu iRNK i obezbeđuju njihovu

međusobnu povezanost i koordinaciju, formirajući složenu regulatornu mrežu. Kroz dinamičnu

asocijaciju sa određenom iRNK, RBP utiču na njenu strukturu i interakcije sa drugim molekulima

služeći kao senzori za ćelijske signale, i, posledično, imaju esencijalnu ulogu u svim koracima

njenog metabolizma (slika 2). Male nekodirajuće RNK učestvuju u regulaciji stabilnosti i

translacije zrelih iRNK, kao i u epigenetičkoj regulaciji (slika 2). Neki od faktora su stabilno

vezani za iRNK, dok se drugi dinamično smenjuju. Promena faktora vezanih za iRNK naziva se

remodelovanje ili „presvlačenje“ iRNP. Jedinstvena kombinacija faktora koja „prati“ određenu

iRNK i njihove relativne pozicije duž transkripta odražavaju njenu nukleusnu i citoplazmatičnu

„istoriju“ i skoro u potpunosti određuju njenu dalju „sudbinu“.

Slika 2. Metabolizam iRNK i faktori iRNP. Metabolizam iRNK obuvata transkripciju, obradu pre-iRNK, transport iRNK iz nukleusa u citoplazmu, proveru kvaliteta, stabilnost, ćelijsku lokalizaciju, translaciju i degradaciju iRNK. Faktori iRNP – RNK-vezivni proteini i male nekodirajuće RNK, imaju ključnu ulogu u svim koracima metabolizma iRNK i koordinišu različite nivoe post-transkripcione regulacije ekspresije gena.

1.1. RNK-vezivni proteini

RBP su regulatorni proteini sa ključnom ulogom u post-transkripcionoj regulaciji ekspresije

gena. Odlikuje ih domenska struktura sa modularnom organizacijom (slike 3 i 4). RNK-vezivnim

domenima (eng. RNA binding domens, RBD) RBP uspostavljaju direktne interakacije sa ciljnim

molekulima RNK prepoznajući specifičnu sekvencu ili strukturu RNK. Pomoćni domeni RBP

stupaju u interakcije sa drugim proteinima, mogu primiti signale i podleći post-translacionim

modifikacijama koje modulišu funkciju RBP, a neki imaju i katalitičke funkcije (helikaznu,

endonukleaznu, dezaminaznu, kinaznu, itd.).

4

Slika 3. RNK-vezivni domeni (RBD) i modularna organizacija RNK-vezivnih proteina (RBP). Različiti RBD i pomoćni domeni prikazani su kao obojeni četvorougaonici. Od RBD predstavljeni su RRM - motiv za prepoznavanje RNK, KH - K homologni domen, dsRBD - vezivni domen za dvolančanu RNK i ZnF — RNK-vezivni cinkani prsti. PABP - protein koji se vezuje za poli(A) rep; PTB - protein koji se vezuje za polipirimidinski niz; R/S - domen bogat Arg i Ser; SF1 - faktor splajsovanja 1; TTP - tristetraprolin; U2AF - pomoćni faktor U2, ADARB1 - adenozin dezaminaza koj deluje na RNK B1.

Poznato je oko 40 vrsta RBD, obično dugačkih od 60 do 100 aminokiselina (slika 3). Oni

prepoznaju nizove od dva do šest nukleotida ili specifičnu strukturu u ciljnoj RNK. Više od 50%

RBP ima motiv za prepoznavanje RNK (eng. RNA recognition motif, RRM) koji vezuje

specifičnu sekvencu jednolančane RNK. K homologni domen (eng. K homology domain, KH)

prepoznaje jednolančane RNK i DNK, a ime je dobio po tome što je originalno identifikovan u

proteinu K heterogene nukleusne iRNP (hnRNP K). Vezivni domen za dvolančanu RNK (eng.

double stranded RNA-binding domain, dsRBD) prepoznaje strukturu dvolančane RNK. Primeri

još nekih RBD su domen PAZ (eng. Piwi/Argonaute/Zwille domain), boks RGG (Arg-Gly-Gly),

boks DEAD/DEAH i RNK-vezivni cinkani prsti (eng. RNA binding zinc finger, ZnF) (slika 3).

Izuzetna specifičnost RBP za nalaženje ciljnog molekula RNK u ćelijskom medijumu

obezbeđena je ne samo specifičnošću pojedinačnih RBD, već i modularnom organizacijom ovih

proteina. Modularna organizacija RBP podrazumeva specifičnu kombinaciju i raspored većeg

broja identičnih, ili ređe, različitih RBD koji pojedinačno uspostavljaju slabe interakcije sa RNK,

a zajedno deluju kooperativno. Na ovaj način modularna organizacija RBP omogućava

stvaranje najrazličitijih i jedinstvenih površina za prepoznavanje i vezivanje specifičnih RNK

5

(slika 3), ali i esencijalno zadržavanje fleksibilnosti tokom dinamične interkacije RBP i ciljnih

RNK kroz asembliranje i deasmbliranje vezivnih površina RBP. Tako, modularna organizacija

RBP obezbeđuje prepoznavanje dužeg niza nukleotida u molekulu RNK nego što bi to bilo

moguće samo jednim od domena (slika 4a, levo), prepoznavanje sekvenci koje su u RNK

odvojene dužim nizom nukleotida (slika 4a, sredina) ili prepozbnavanje sekvenci koje se nalaze

u različitim molekulima RNK (slika 4a, desno). Modularna struktura je, takođe, idealna za

prepoznavanje slabo konzervsanih sekvenci RNK, kakva su mesta splajsovanja ili sekvence za

obradu 3-kraja pre-iRNK.

Slika 4. Modularna organizacija RNK-vezivnih proteinia (RBP). Organizacijom većeg broja RNK-vezivnih domena (RBD) u jednom RBP i njihovim kooperativnim delovanjem formira se jedinstvena površina za prepoznavanje i vezivanje specifične RNK. a) Kombinovanje većeg broja RBD u cilju prepoznavanja duže sekvence RNK (levo), sekvence RNK odvojene velikim brojem nukleotida (sredina), ili sekvence koje pripadaju različitim molekulima RNK (desno). d) Kombinovanje RBD sa enzimskim domenima u cilju definisanja specifičnosti supstrata i/ili autoregulacije. RBP su predstavljeni u obliku elipsa sa RNK-vezivnom površinom obojenom u svetlo-plavo, dok je odgovarajuće mesto prepoznavanja u RNK predstavljeno crvenim pravougaonicima. Pojedinačni domeni su obojeni različitim bojama.

Sposobnosti RBP da specifično prepoznaju ciljnu RNK značajno doprinosi niz

aminokiselina između dva RBD, označen kao veznik (eng. linker). Dužina i rigidnost veznika

ima značajne efekte na afinitet RBP za RNK i utiče na njegovu sposobnost da vežu jednu ili

nekoliko ciljnih RNK. Duži veznici obično nemaju definisanu strukturu i dozvoljavaju da dva

razdvojena RBD mogu prepoznavati različite grupe ciljnih RNK (slika 4a, sredina). Nakon

vezivanja RBP za ciljnu RNK, takav linker obično stiče definisanu strukturu koja pozicionira RBD

jedan u odnosu na drugi, a nekada uspostavlja i direktne interakcije sa RNK. Kraći linkeri

omogućavaju da se dva RBD vežu za kontinuirani niz nukleotida u ciljnoj RNK (slika 4a, levo).

Pomoćni domeni RBP, a nekada i RBD, uspostavljaju interakcije sa drugim proteinima.

Ovi domeni često podležu post-translacionim modifikacijama omogućavajući da RBP služe kao

senzori ili adapteri koji povezuju signale iz vanćelijske sredine sa različitim unutarćelijskim

putevima. Post-translacione modifikacije mogu modifikovati lokaciju i sposobnost RBP da se

veže za ciljnu RNK.

Kombinacija RBD sa pomoćnim domenima koji imaju katalitičku funkciju obezbeđuje

specifično prepoznavanje supstrata i autoregulaciju katalitičke aktivnosti. Na slici 4d prikazan je

6

primer u kome je katalitički domen inaktiviran kroz interkaciju sa RBD. U prisustvu supstrata

RNK, RBD se vezuju za RNK oslobađajući enzimski domen koji postaje katalitički aktivan.

Primeri ovakvih proteina su proteinska kinaza R (PKR) i adenozin dezaminaza koja deluje na

RNK B1 (ADARB1). Oba proteina sadrže po dva vezivna domena za dvolanačnu RNK. Kod

ADARB1 oni se kombinuju sa dezaminaznim domenom, dok su kod PKR u kombinaciji sa

kinaznim. Kada se ovi proteini vežu za dsRNK, dezaminazni domen ADARB1 katalizuje

konverziju A u I u RNK, dok kinazni domen katalizuje fosforilaciju ciljnog proteina, što pokreće

veliki broj nizvodnih događaja. Kod ovih proteina vezivanje RBD za dsRNK i reprimiranje

enzimskog domena od strane RBD su međusobno isključivi događaji.

Tokom evolucije, modularnim organizovanjem ograničenog broja RBD nastala je familija

RBP koja se odlikuje izuzetnim funkcionalnim diverzitetom u pogledu interakcija i regulatornih

događaja u kojima učestvuju. Bioinformatičkim pretraživanjem genoma na sekvence koje

kodiraju poznate RBD ustanovljeno je da RBP predstavljaju najbrojniju familiju proteina kod

eukariota. Kod kvasca 5-8% gena kodira proteine sa pretpostavljenom funkcijom RBP, kod C.

elegans i D. melanogaster približno 2% genoma kodira takve proteine, dok je procena da

genom čoveka kodira preko 500 takvih proteina. Repertoar RBP kodiran nekim genomom dalje

se povećava alternativnom obradom njihovih pre-iRNK, kao i regulisanom ekspresijom

karakterističnom za tip ćelije i fazu razvića. Zadivljujući funkcionalni diverzitet RBP omogućava

eukariotskim ćelijama da ih koriste u gotovo beskonačnom broju kombinacija stvarajući

jedinstevnu RNP za svaku RNK. Smatra se da je ogroman diverzitet RBP kod eukariota vezan

za povećanje broja introna i razvoj visoko-specifičnih post-transkripcionih procesa tokom

evolucije. Na primer, i kod kičemnjaka i kod biljaka usložnjavanje alternativnog splajsovanja

tokom evolucije uslovilo je i potrebu za odgovarajućim povećanjem broja RBP.

Iako su u ovom poglavlju fokus RBP koji asociraju sa pre-iRNK i iRNK, treba naglasiti da

mnogi RBP stupaju u interakciju sa drugim vrstama molekula RNK obavljajući važne funkcije u

ćeliji.

1.2. "Garderoba" i USER kod iRNK

RBP stupaju u specifičnu i dinamičnu interakciju sa kodirajućim, nekodirajućim i

netranslatirajućim regionima iRNK što im omogućava ili da ostanu stabilno vezani za molekule

RNK tokom njihovog puta od sinteze do degradacije, ili da se pridružuju i napuštaju iRNK na

način koji je prostorno i vremenski regulisan. Neki proteini se vezuju za iRNK celom njenom

dužinom uglavnom nezavisno od sekvence RNK, neki se vezuju za specifične regione u iRNK

nezavisno od sekvence, dok se najveći broj vezuje za specifičnu strukturu ili specifične

sekvence određenih iRNK. Kao što je prethodno navedeno, specifičnost i afinitet nekog RBP za

određenu iRNK posredovan je kombinacijom, rasporedom i kooperativnim delovanjem RBD, a

dalje može biti modifikovan pomoćnim domenima RBP. Kao rezultat ovakvih interakcija, ćelija je

sposobna da stvori ogroman broj iRNP čije su kompozicije i aranžmani u pogledu komponenti

jedinstveni za svaku iRNK, i koje mogu podleći daljem remodelovanju tokom životnog ciklusa

iRNK.

7

Nekoliko faktora iRNP vezuje se za dve strukture zajedničke za skoro sve iRNK:

5’-kapu, koja se nalazi na 5’-kraju transkripata koji prepisuje RNK polimeraza II, i poli(A) rep na

3’-kraju, kojeg među iRNK ne sadrže samo histonske iRNK. Takvi faktori su CBC20/80, eIF4E,

PABPN1 i PABPC1. CBC20/80 (eng. cap binding complex 20/80) je jedarni proteinski kompleks

koji vezuje 5’-kapu (slika 1). Predstavlja heterodimer sastavljen iz subjedinca od 20 i 80 kDa.

Pridružuje se pre-iRNK neposredno nakon formiranja 5’-kape tokom transkripcije. Pomaže

splajsovanje pre-iRNK, a u citoplazmi kroz interakcije sa eukariotskim inicijacionim faktorom

translacije 4G (eIF4G) može inicirati pionirsku rundu translacije. CBC20/80 u citoplazmi biva

zamenjen sa eIF4E. Eukariotski inicijacioni faktor translacije 4E (eIF4E) (slike 4 i 7) je glavni

citoplazmatični protein koji vezuje 5’-kapu i uspostavlja interakcije sa eIF4G. eIF4E predstavlja

ciljni molekul za mnoge inhibitore translacije, označene kao eIF4E vezivni proteini (eng.

4E-binding proteins ili 4E inhibitory proteins, 4E-BP), a koji narušavaju interakcije između eIF4E

i eIF4G. PABP (eng. poly(A)-binding protein) je protein koji se vezuje za poli(A) rep. U ćelijama

sisara nukleusna forma označena je kao PABPN1, a citoplamatična kao PABPC1 (slika 1).

PABPC1 služi kao platforma za vezivanje različitih proteina uključenih u inicijaciju i regulaciju

translacije i degradaciju iRNK.

Neki faktori iRNP uspostavljaju interakcije sa iRNK celom njenom dužinom, koje

uglavnom ne zavise od sekvence RNK. Primer su proteini Y-boksa, familija multifunkcionalnih

proteina koji se vezuju za nukleinske kiseline (RNK, jednolančanu i dvolančanu DNK). Proteini

Y-boksa učestvuju u regulaciji većeg broja koraka metabolizma iRNK, uključujući tranksripciju,

stabilnost i translaciju. Ime su dobili po svojoj osobini da se vezuju za promotorski element

Y-boks, čime pozitivno ili negativno regulišu transkripciju velikog broja gena. U somatskim

ćelijama, zajedno sa PABPC1, proteini Y-boksa predstavljaju glavne komponente

citoplazmatičnih iRNP. Vezuju se za „telo“ iRNK i učestvuju u njenom pakovanju koje moduliše

translacionu aktivnost na dozno-zavisan način: niska koncentracija ovih proteina aktivira

translaciju, dok je visoka inhibira. U oocitama žabe, neki proteini familije Y-boksa predstavljaju

glavne komponente translaciono utišanih maternalnih iRNP, koje će se aktivirati u kasnijim

fazama razvića.

Neki faktori iRNP vezuju se za specifične pozicije u iRNK nezavisno od sekvence. Na

primer, proteini EJC (eng. exon junction complex) vezuju se preferencijalno za splajsovane

iRNK oko 20 do 50 nukleotida uzvodno od granica egzon-egzon, i to neposredno nakon

splajsovanja (slika 1). Kompleks EJC sadrži najmanje 10 proteina i molekulaske je težine ~335

kDa. Ovaj kompleks pomaže splajsozomu da prepozna egzone (kao deo kompleksa za

prepoznavanje egzona) i stimuliše transport iRNP iz nukleusa u citoplazmu kroz interakciju sa

eksporterom iRNP. Većina komponenti EJC napušta iRNK tokom ili neposredno nakon njenog

transporta u citoplazmu, dok neke komponente ostaju vezane za iRNK i bivaju otklonjene tokom

pionirske runde translacije. Lokacija proteina EJC na iRNK je značajna za njenu dalju sudbinu.

EJC smeštani u otvorenom okviru čitanja mogu pozitivno uticati na efikasnost translacije

stimulišući regrutovanje 40S subjednice ribozoma. Kada se nalaze u 3’-netranslatirajućem

regionu pokreću brzu razgradnju iRNK preko mehanizma degradacije posredovanog

prevremenim stop kodonom (NMD), gde ključnu ulogu ima protein Upf3, koji je sastavni deo

EJC. Proteini EJC su primer za dinamičnu asocijaciju RBP sa iRNK tokom više koraka u njenom

8

životu (splajsovanju, eksportu u citoplazmu, translaciji i kontroli kvaliteta), što ukazuje da je

visoko-organizovano asembliranje iRNP značajno za vremenski i prostorno koordinisanu

ekspresiju gena.

Najveći broj faktora iRNP prepoznaje i vezuje specifičnu sekvence iRNK koje se

nazivaju netranslatirajući elementi za regulaciju (eng. untranslated sequence elements for

regulation, USER). USER se uglavnom nalaze u 3’-UTR-u, dok su neke prisutne u 5’-UTR-u i

kodirajućim regionima. Pojedinačne iRNK mogu sadržati veći broj ovih elemenata i njihova

kombinacija u nekoj iRNK označava se kao „USER kod“. On određuje potencijalni sastav

faktora koji se vezuju za iRNK, a time i sudbinu iRNK. Najveći broj faktora iRNP stupa u

interakciju sa elementima USER u 3'-UTR-u, ukazujući na važnost ovog regiona u regulaciji

ekspresije gena i objašnjavajući ujedno zašto eukariotske iRNK imaju izuzetno dugačke i

alternativne 3'-UTR. Dakle, pored toga što nosi informaciju neophodnu za sintezu proteina,

iRNK sadrži i regulatorne elemente čija je uloga da selektuju odgovarajući grupu faktora, kako bi

se postigla odgovarajuća prostorna i vremenska regulacija translacije.

Proteini heterogene nukleusne iRNP (hn iRNP) i proteini familje SR prepoznaju kratke

konsenzusne sekvence u iRNK. Proteini hn iRNP se grubo definišu kao proteini heterogenih

nukleusnih RNK (koje uključuju pre-iRNK i druge nukleusne iRNK) koji nisu stabilne

komponente drugih ribonukleoproteinskih čestica, kao na primer snRNP ili snoRNP. Neki

proteini hnRNP prate iRNK u citoplazmu, dok drugi bivaju zadržani u nukleusu.

Proteini SR pripadaju familiji strukturno sličnih, uglavnom, nukleusnih proteina koji se

vezuju za iRNK. Sadrže RNK-vezivne domene i domene bogate serinskim i argininskim

ostacima, označene kao domeni RS, preko kojih stupaju u interakciju sa drugim proteinima ili

RNK. Serinski ostaci u ovim domenima podležu dinamičnoj fosforilaciji, čime se reguliše

aktivnost ovih proteina. Neki proteini SR prate iRNK u citoplazmu, dok drugi ostaju u jedru.

Mnogi proteini SR imaju ključnu ulogu u splajsovanju i regulaciji alternativnog splajsovanja

pre-iRNK. Takođe, proteini SR mogu stimulisati translaciju ili pokrenuti degradaciju neispravnih

iRNK, slično proteinima EJC.

Neki od proteina koji se vezuju za iRNK imaju aktivnost RNK helikaza, koje učestvuju u

svim koracima metabolizma iRNK. RNK helikaze koje pripadaju familiji proteina DEAD boks i

srodnoj familiji proteina DExD boks hidrolizuju ATP i oslobođenu energiju koriste za

narušavanje sekundarne strukture RNK i/ili da otklone proteine vezane za RNK (rearanžiranje

interakcija RNK-RNK ili RNK-protein).

Proteini TIA-1 (eng. T-intracellular antigen-1) i TIAR (eng. TIA1 cytotoxic granule-

associated RNA binding protein-like 1) pored većeg broja domena RRM, poseduju domen bogat

glicinom. TIA-1 prepoznaje specifične bipartitne sekvence u molekulu RNK, dok TIAR

prepoznaje i vezuje strukture ukosnice. Domen bogat glicinom nalazi se na C-kraju ovih

proteina, hidrofoban je i prilikom odgovora ćelije na stres posreduje u regulisanoj reverzibilnoj

agregaciji proteina formirajući granule stresa. Sličan je domenu karakterističnom za prionske

proteine.

9

MikroRNK (miRNK) su mali regulatorni molekuli RNK dužine 21 do 23 nukleotida,

nastaju obradom jednolančanog prekursora RNK u obliku ukosnice ribonukleazama Drosha i

Dicer, i stupaju u interakciju sa proteinima familije Argonaut. Kod životinja mikroRNK se

uglavnom neperfektno bazno sparuju sa ciljnim mestima, uglavnom, u 3’-UTR-u iRNK. U

kombinaciji sa utišavajućim kompleksom RISC (eng. RNA induced silencing complex), čije su

glavne komponente proteini Argonaut, miRNK negativno regulišu translaciju i/ili destabilizuju

ciljne iRNK. Međutim, neke miRNK mogu stimulisati translaciju.

2. KONCEPT OPERONA RNK

Otkriće da se isti proteini vezuju za veći broj iRNK koje kodiraju funkcionalno povezane proteine

ukazalo je na mogućnost zajedničke regulacije monocistronskih eukariotskih iRNK, što je dovelo

do razvoja koncepta operona RNK ili post-transkripcionih operona. Koncept operona RNK

predviđa jednostavan princip organizacije i dinamike funkcionalno povezanih monocistronskih

iRNK na post-traskripcionom nivou i objašnjava kako se ostvaruje koordinisana sinteza većeg

broja funkcionalno povezanih proteina (npr. proteina koji učestvuju u istom metabolitičkom putu

ili formiranju istog makromolekulskog kompleksa) i to u skladu sa potrebama ćelije. Slično kao

što prokarioti koriste policistronske iRNK kodirane operonima DNK1 da bi koordinisale sintezu

funkcionalno povezanih proteina, eukariotske ćelije koriste operone RNK da bi koordinisale

sintezu funkcionalno povezanih proteina sa monocistronskih iRNK.

Prema konceptu operona RNK koordinisana regulacija funkcionalno povezanih iRNK

ostvaruje se većim brojem RBP koji se vezuju za regulatorne elemente zajedničke za taj set

molekula iRNK usklađujći njihovu obradu (pre svega splajsovanje), transport iz nukleusa u

citoplazmu, i lokaciju, stabilnost i translaciju u citoplazmi. Dakle, osnovu za formiranje i

funkcionisanje operona RNK čine faktori iRNP-ova, pre svega RBP, kao i metaboliti, a njihov

potencijalni sastav određeni su „USER kodom“ iRNK (slika 5a).

Veći broj proteina i miRNK mogu regulisati jednu iRNK vezujući se kooperativno ili

kompetitivno za više od jednog elementa USER, ali jedan protein ili jedna miRNK mogu vezivati

isti element USER prisutan u većem broj ciljnih molekula iRNK (slika 5b). Kao i kod regulacije

inicijacije transkripcije transkripcionim regulatorima, i u ovom slučaju koristi se princip

kombinatorne kontrole2 tako da faktori vezani za molekule iRNK deluju kombinatorno, fino

1 Operon DNK – set funkcionalno povezanih gena i regulatornih elemenata koji kontrolišu njihovu

zajedničku ekspresiju. Geni jednog operona transkribuju se kao jedan transkript sa zajedničkog promotora, dajući policistronsku iRNK.

2 Kombinatorna kontrola – regulacija ekspresije gena koju zajedno ostvaruje veći broj regulatornih

proteina, pri čemu različite kombinacije regulatornih proteina ostvaruju različite efekte na ekpresiju jednog gena. Ovaj tip regulacije podrazumeva da jedan gen može biti regulisan većim brojem regulatornih proteina i da jedan regulatorni protein može da učestvuje u regulaciji ekspresije većeg broja gena.

10

modulišući regulaciju svake od njih, što ćeliji omogućava da sintezom odgovarajućih proteina

veoma brzo odgovori na signale koje prima.

Slika 5. Koordinisana regulacija grupa molekula iRNK od transkripcije do translacije. a) Operon RNK - transkripcioni faktori (G1-Gn), aktiviraju transkripciju grupe gena. Tokom transkripcije za rastuće iRNK vezuje se regulatorni protein (R). Nastale iRNK se splajsuju i transportuju u citoplazmu. U citoplazmi protein vezan za iRNK, zajedno sa miRNK, utiču na stabilnost i lokaciju transkripata, aktiviraju ili reprimiraju njihovu translaciju ili ih regrutuju na ribozome ili u granule RNK. organizacijom u operon RNK reguliše se lokacija, stabilnost i translacija grupe molekula iRNK, obezbeđujući koordinisanu regulaciju ekspresije funkcionalno povezanih proteina. b) Jedna iRNK može biti član većeg broja operona RNK – četri prikazane iRNK (1, 2, 3 i 4) sadrže različite kombinacije elemenata USER i mogu se različitim kombinovanjem grupisati u tri operona RNK (RNP-2-3-4, RNP-2-3 i RNP-1-2-3). Formiranje svakog operona je određeno vezivanjem proteina (R1, R2 i R3) za specifične elemente USER, što vodi koordinisanoj regulaciji iRNK u ovkiru svakog operona RNK i opštoj koordinaciji sva tri operona.

Zahvaljujući prisustvu većeg broja elementa USER i kombinatornom vezivanju faktora za

neku iRNK, svaka iRNK može se pridružiti većem broju operona RNK (slika 5b). Imajući u vidu

da su eukariotski proteini multifunkcionalni, mogućnost da svaka iRNK može biti član većeg

11

broja operona RNK obezbeđuje da molekuli jedne vrste iRNK budu nezavisno regulisani u

različitim grupama sa drugim iRNK, kako bi proteini sintetisani sa njih ostvarili odgovarajuće

funkcije (slika 5b). U ovakvoj situaciji, može se reći da je genetička informacija pre predstavljena

velikim brojem kopija raznih vrsta iRNK, a ne samim genima, i da može biti kombinovana na

većem broju nivoa i regulisana u vidu različitih operona RNK simultano ili sekvencijalno. U

poređenju sa operonima DNK bakterija koji kodiraju policistronske transkripte koji uvek sadrže

veći broj istih okvira čitanja, eukariotski operoni RNK predstvaljaju organizovane kolekcije

pojedinačnih monocistronskih iRNK, koje mogu biti član većeg broja operona RNK i koristiti

svoju nezavisnost da bi odgovorile na potrebe ćelije još većom brzinom. Iz ovog razloga

fleksibilnost eukariotskih operona RNK je veća u odnosu na prokariotske operone DNK.

Slično operonima DNK, operoni RNK mogu biti aktivirani ili reprimirani metabolitima, s

tim da se u slučaju operona RNK efekat metabolita ostvaruje preko kovalentnih modifikacija,

najčešće fosforilacije, proteina vezanih za RNK. Tako, individualni faktori iRNP-ova služe kao

senzori ili adapteri koji omogućavaju iRNK da se suoči sa brojnim unutar- i vanćelijskim

signalima, koji određuju njihovu lokaciju, translaciju i stabilnost. Mogućnost da pojedinačne

iRNK mogu vezivati veliki broj faktora omogućava im da odgovore na ogroman broj signala,

čime se njihova ekspresija fino reguliše u skladu sa promenljivim uslovima. Promenljivi uslovi

mogu, takođe, menjati i nivo senzora/adaptera, kao i njihove osobine koje im omogućavaju da

se vežu za iRNK, transformišući tako subpopulacije iRNP-ova za koje se vezuju. Sve zajedno

za rezultat ima veoma razrađen matriks regulatonih mreža, jednake ako ne i veće složenosti

u odnosu na onaj koji kontroliše inicijaciju transkripcije, što značajno povećava regulatornu

plastičnost neočekivano malog broja gena u genomima eukariota.

3. KADA I KAKO SE IRNP UDRUŽUJE SA TRANSLACIONIM APARATOM?

3.1. Pionirska runda translacije

Prva velika promena u sastavu faktora vezanih za iRNK dešava se tokom transporta iRNP iz

nukleusa u citoplazmu, kada dolazi do „presvlačenja“ nukleusne iRNP i nastanka

citoplazmatične iRNP. Mnoge komponente citoplazmatične iRNP regrutuju se još u nukleusu

tokom transkripcije i obrade pre-iRNK. Primeri takvih faktora su proteini SR, EJC, neki proteini

hnRNP, faktori za lokalizaciju iRNP.

Nakon transporta iz nukleusa u citoplazmu, za transkripte gena kućepazitelja (eng.

housekeeping genes) odmah se vezuju ribozomi i oni podležu pionirskoj rundi translacije i ulaze

u pool translaciono aktivnih iRNP. naime, neposredno nakon transporta u citoplazmu za 5’-kape

iRNP je, uglavnom, vezan kompleks CBC20/80, dok su za poli(A) rep vezani i PABPN1 i

PABPC1. Kod upravo transportovanih iRNP koji ulaze u pool translaciono aktivnih iRNP,

CBC20/80 može poslužiti kao inicijacioni faktor translacije uspostavljajući interakciju sa eIF4G.

Translacija takve iRNP stimulisana je kroz formiranje kružne strukture i vezivanje male

ribozomske subjedinice (40S) koja nosi ternarni kompleks, sastavljen od eIF2, GTP-a i

inicijatorske tRNK (tRNKiMet). Kada se identifikuje start kodon, pridružuje se velika subjednica

ribozoma (60S), formira se 80S ribozom i počinje „pionirska runda“ translacije. Tokom

12

pionirske runde translacije dešava se druga velika promena u sastavu iRNP. Prolazak iRNK

kroz uzani prostor između dve subjedinice ribozoma „ljušti“ preostale faktore iRNP stečene u

nukleusu, kao što su, na primer, proteini EJC. U nekom trenutku, CBC20/80 i PABPN1

zamenjuju se u potpunosti sa eIF4E i PABPC1, redom. Informacione RNP dalje formiraju

poliribozome i podležu ponovljenim ciklusima translacije, kako bi se sintetisala određena

količina nekog polipeptida. One mogu biti distribuirane kroz celu citoplazmu ili smeštene u

određenim delovima citoplazme, zajedno sa drugim iRNP koje kodiraju funkcionalno povezane

proteine, formirajući operone RNK.

Veliki broj iRNK ne podleže translaciji odmah po dospeću u citoplazmu, već biva

translaciono utišan. One bivaju transportovane do odgovarajućeg mesta u citoplazmi i/ili

čekaju neki signal koji će im „reći“ da je upravo došlo vreme za njihovu translaciju, na koji način

se postiže regulisana i koordinisana sinteza proteina usklađena sa trenutnim potrebama ćelije.

Smatra se da translaciono utišane iRNP podležu pionirskoj rundi translacije tek kada postanu

translaciono aktivne.

3.2. Translacija zavisna od 5-kape

Incijacija translacije kod eukariota je veoma složeni proces koji zahteva koordinisanu akciju oko

30 proteina, pored ribozomskih proteina. Ona se razlikuje između iRNK koje sadrže 5-kapu i

relativnog malog broja iRNK bez 5-kape.

Inicijacija translacije iRNK sa 5-kapom počinje interakcijom eukariotskog inicijacionog

faktora 4F (eIF4F) i 5-kape. Kompleks eIF4F sastoji se od tri proteina: eIF4E, eIF4A i eIF4G

(slika 6a). Protein eIF4E je glavni citoplazmatični protein koji prepoznaje i vezuje 5-kapu.

Protein eIF4A je ATP-zavisna RNK helikaza koja narušava sekundarne strukture u 5-UTR

iRNK, koje bi u protivnom inhibirale translaciju. Protein eIF4G je adaptorni protein koji

uspostavlja tri tipa interakcija neophodnih za inicijaciju translacije. 1) U kompleksu eIF4F, eIF4G

uspostavlja interakciju sa eIF4E. 2) eIF4G stupa u interakciju sa PABP. Sposobnost eIF4G da

uspostavlja interakcije sa proteinom vezanim za 5-kapu i poli(A) rep dovodi dva kraja iRNK u

neposrednu blizinu, što cirkularizuje iRNK i stabilizuje kompleks. U kružnoj strukturi iRNP 5- i

3-krajevi iRNK povezani su preko mreže interakcija između proteina koji se vezuju za poli(A)

rep, eIF4G, i eIF4E vezanog za 5-kapu (slika 6a). Kružna struktura iRNK olakšava kontrolu

translacije pomoću regulatornih elemenata smeštenih u 3-UTR, povećava afinitet eIF4E za

5-kapu, promoviše efikasnu reinicijaciju translacije, i štiti oba kraja transkripta od mašinerija za

degradaciju iRNK. 3) eIFG kroz interakciju sa eIF3 regrutuje 40S subjedinicu ribozoma za koju

je vezan ternarni kompleks.

Nakon vezivanja male subjedinice ribozoma sa ternarnim kompeksom, inicira se

skeniranje 5'-kraja iRNK u smeru 5’3’ sve dok inicijatorska tRNK ne prepozna start kodon

AUG. Prepoznavanje start kodona inicira pridruživanje ribozomske subjedinice 60S i

asembliranje ribozoma 80S. Sledi hidroliza GTP-a iz ternarnog kompleksa, nakon čega

inicijatorska tRNK ostaje u P mestu ribozoma vezana za start kodon, a kompleks napušta

eIF2-GDP. Faza inicijacije se time završava, a ribozom 80S dalje dešifruje kodone iz iRNK

vršeći elongaciju rastućeg polipetida dok ne stigne do stop kodona.

13

Slika 6. Incijacija transalcije zavisna od 5-kape i unutrašnjeg mesta vezivanja ribozoma (IRES). a)

eIF4E vezuje 5-kapu i preko adaptornog molekula eIF4G (tamno zeleno) stupa u interkacija sa eIF3 vezanim za malu subjedinicu ribozoma. eIF4A (svetlo plavo) je RNK helikaza koja narušava sekundarnu

strukturu u 5-netranslatirajućem regionu (UTR) iRNK. Interkacijama eIF4G i PABPC, vezanim za poli-A rep, dolazi do cirkularizacije iRNK. b) Elemente IRES uzvodno od start kodona prepoznaju i vezuju ITAF (eng. IRES trans-acting factors) i proteolitički fragment izoforme I proteina eIF4G (eIF4GI) (ili udaljeni homolog eIF4G - p97/DAP5/NAT1).

Za iRNK sa ispravnom fazom okvira čitanja, terminaciju translacije promoviše

pozicioniranje stop kodona (UAG) u A mesto ribozoma. Događaji terminacije translacije

katalizovani su eukariotskim faktorima oslobađanja 1 i 3 (eRF1 i eRF3), i dodatno pojačani

interakcijom eRF3 sa PABPC1. Stop kodon biva prepoznat od strane faktora oslobađanja eRF1.

Interakcija eRF1 sa eRF3, kao i interkacija eRF3 i PABPC stimulišu terminaciju translacije.

Pokreće se hidroliza sintetisanog polipeptida, oslobađanje ribozoma, i recirkliranje ribozoma na

5-kraj iste iRNK.

3.3. Translacija zavisna od IRES

Inicijacija translacije 3 do 10% ćelijskih iRNK je nezavisna od 5-kape. Većina takvih iRNK u

5-UTR ili u kodirajućem regionu sadrži unutrašnje mesto vezivanja ribozoma (eng. internal

ribosome-entry site, IRES), čija je funkcija da direktno regrutuje malu subjedinicu ribozoma

(slika 6b). IRES-zavisnu incijaciju translacije uglavnom koriste virusne RNK, kod kojih je

originalno i opisana. Ćelijske iRNK čija je translacija nezavisna od 5-kape imaju duge 5-UTR

sa visokim sadržajem GC, koji su podložni formiranju sekundarnih struktura. Takvi struktuisani

regioni predstavljaju IRES (slika 6b).

U normalnim fiziološkim uslovima, koji favorizuju translaciju zavisnu od 5-kape, IRES su

neefikasne u inicijaciji translacije. Međutim, kada se kompromituje translacije zavisna od

5-kape, IRES efikasno iniciraju translaciju jer ne zavise od prisustva ili integriteta nekoliko

prethodno opisanih kanonskih faktora inicijacije translacije, pre svega eIF4E. Na primer, prilikom

odgovora ćelije na stres, kada dolazi do globalnog reprogramiranja translacije, translacija iRNK

sa 5-kapom se zaustavlja dok sekvence IRES dozvoljavaju selektivnu translaciju specifičnih

iRNK. Većina ćelijskih iRNK čija se translacija incira sa IRES kodira proteine važne za procese

koji zahtevaju čvrstu regulaciju ekspresije gena: rast, proliferacija i diferencijacija ćelije,

regulacija apoptoze i odgovor na stres.

14

Tačan molekularani mehanizam kojim IRES usmeravaju translaciju ćelijskih iRNK nije u

potpunosti poznat. Efikasna translacija zavisna od IRES zahteva pomoćne faktore ITAF (eng.

IRES trans-acting factors) (slika 6b). Smatra se da ITAF imaju funkciju RNK šaperona,

RNK-vezivnih proteina koji pomažu ispravno struktuisanje RNK. Nekoliko proteina ITAF

učestvuje u translaciji zavisnoj od IRES, ali zahtev za ovim proteinima nije apsolutan i izgleda

da je specifičan za pojednine IRES. Činjenica da različiti elementi IRES zahtevaju različite ITAF

mogla bi objasniti IRES-zavisnu translaciju specifičnu za tip ćelije, i ukazuje da različiti putevi u

ćeliji mogu precizno kontrolisati ovaj tip translacije kroz modulaciju aktivnosti ili količine

određenih ITAF. Elementi IRES ili direktno regrutuju malu subjedinicu ribozoma, slično

prokariotskom mestu vezivanja ribozoma (RBS), ili direktno vezuju eIF4G, imitirajući 5'-kapu,

koji zatim regrutuje malu subjedinicu ribozoma. U oba slučaja mala subjednica ribozoma

regrutuje se u blizini unutrašnjeg start kodona i počinje elongacija translacije. Interesantno je da

elementi IRES za inicijaciju translacije mogu koristiti fragment eIF4G nastao proteolitičkim

cepanjem izoforme I ovog proteina (eIF4GI) (slika 6a), što je jedna od strategija da se reprimira

translacija zavisna od 5-kape.

4. REGULACIJA TRANSLACIJE

Regulacija translacije obezbeđuje sintezu proteina usklađenu sa potrebama ćelije i važna je za

brojne biološke procese. U stresnim uslovima za ćeliju, kao deo integralnog odgovora ćelije na

stres globalnom regulacijom translacije modifikuje se efikasnost translacije većine iRNK u ćeliji.

U drugim procesima, kao sto su formiranje plana građe (eng. pattern formation) i detrminacija

pola tokom embrionalnog razvića ili plastičnost neurona, reguliše se translacija specifičnih

iRNK. Globalno reprimiranje translacije ostvaruje se uglavnom fosforilacijom ili proteolizom

kanonskih faktora inicijacije translacije, dok se utišavanje translacije specifičnih iRNK ostvaruje

pomoću RBP ili RNK interferencijom. U oba slučaja regulacija se ostvaruju na nivou incijacije

translacije, jer je svaki biološki proces efikasnije kontrolisati na početku nego u kasnijim fazama,

što bi u slučaju translacije moglo dovesti do nagomilavanja aberantnih proteina. Translaciona

represija, globalna ili specifična, je često reverzibilna i to se postiže otklanjanjem represora sa

iRNK ili remodelovanjem represorskog kompleksa.

4.1. Translaciono regulacija specifičnih iRNK

Translaciono utišavanje specifičnih iRNK ostvaruje se sa miRNK putem RNK

interferencije ili specifičnim RBP, koji prepoznaju specifične regulatorne elemente u

transkriptima, najčešće smeštene u 3-UTR-u. Regulisana aktivacija većine specifično utišanih

iRNK postiže se u određenom vremenu i/ili na određenom mestu u ćeliji ili embrionu.

MikroRNK utišavaju ekspresiju velike frakcije eukariotskog transkriptoma koji kodira

proteine, regulišući široki spektar bioloških procesa: razviće, rast ćelije, deobu i diferencijaciju,

programiranu ćelijsku smrt, odgovor na stres. Procenjuje se da je do 60% iRNK čoveka

regulisano jednom ili većim brojem miRNK. Efekat miRNK na ciljnu iRNK određen je njihovim

stepenom komplementarnosti: 1) ukoliko se miRNK perfektno spari sa iRNK indukuje se

degradacija transkripta endonukleolitičkim sečenjem; 2) ukoliko je sparivanje miRNK i iRNK

15

neperfektno dolazi do translacione represije i/ili destabilizacije iRNK. Najveći broj miRNK

životinja je samo delimično komplementaran svojim ciljnim transkriptima.

RBP se vezuju za regulatorne elemente USER na 5- i 3-krajevima iRNK i pokreću

reprimiranje translacije. Vezivanje specifičnih proteina za 5-UTR blokira ribozom tokom

pretraživanja start kodona. U češće korišćenoj strategiji, RBP se vezuju za regulatorne

elemente u 3-UTR-u i regrutuju proteine koji interferiraju sa funkcijom eIF4E, ključnim faktorom

inicijacije translacije zavisne od 5-kape. RBP se često kooperativno vezuju za regulatorne

sekvence u 3-UTR-u, što im dozvoljava kombinatornu kontrolu, sličnu kooperativnom vezivanju

transkripcionih faktora za promotor ili pojačivač.

Proteini koji interferiraju sa funkcijom eIF4E su alternativni proteini koji direktno vezuju

5-kapu, sprečavajući eIF4E da se veže za istu, ili proteini koji direktno vezuju eIF4E. Proteini

koji direktno vezuju eIF4E inhibiraju njegovu interkaciju sa eIF4G ili 5-kapom nazivaju se 4E-

vezivni proteini (4E-BP). Zarobljavanjem dostupnog eIF4E, 4E-BP regulišu koncentraciju

aktivnog eIF4E, što vodi preferncijalnoj inhibiciju translacije onih iRNK koje zahtevaju visok nivo

eIF4E. 4E-BP koji se regrutuju na iRNK preko RBP vezanih za određene regulatorne elemente

u 3’-UTR-u deluju samo na one iRNK koje sadrže takve elemente. Druga klasa proteina 4E-BP

vezuje se direktno za eIF4E, a ne za iRNP, i ona ima globalniji efekat na translaciju (videti kod

golobalne regularcije translacije putem mTOR).

Molekularni mehanizmi kojima RPB ostvaruju reprimiranje translacije specifičnih iRNK

su: kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za eIF4G, kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za

5-kapu i citoplazmatično skraćivanje poli(A) repa. Kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za

eIF4G podrazumeva regrutovanje određenog 4E-BP na ciljnu RNK kroz interkacije sa

specifičnim RPB (npr. proteinom familije PUF) vezanim za regulatorni element u 3-UTR (slika

7a). 4E-BP stupa u interkaciju sa eIF4E vezanim za 5-kapu, usled čega eIF4E ne može da

uspostvi interkciju sa eIF4G. Formiranje eIF4F kompleksa je na ovaj način inhibirano, a time i

dalja incijacija translacije. Aktivacija translacije ovako utišanih iRNK može se postići

fosforilacijom 4E-BP zavisnom od unutarćelijskih puteva prenosa signala. Fosforilacija 4E-BP

smanjuje njegov afinitet za eIF4E.

Kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za 5-kapu ostvaruje se regrutovanjem

alternativnog proteina koji vezuje 5-kapu ali nema sposobnost vezivanja eIF4G (npr., eIF4E2,

poznat i kao 4E-HP) (slika 7b). 4E-HP se regrutuje na ciljnu iRNK pomoću RBP (npr. bicoid -

BCD) vezanog za 3-UTR, što sprečava regrutovanje eIF4E i dalju incijaciju translacije. Nije

poznato da li je i na koji način ovaj tip represije reverzibilan. Ovaj mehanizam se u kombinaciju

sa lokalizovanom translacijom koristi za reprimiranje translacije nekih maternalnih iRNK (eng.

„stored“ mRNAs). Naime, oocite višećelijskih životinja akumuliraju i čuvaju sve iRNK neophodne

za rano razviće. Takve iRNK se ne translatiraju dok se oocita ne oplodi spermatozoidom ili dok

se ne završi nekoliko deoba u ranom embrionalnom razviću. Regulisana trasnlacija maternalnih

iRNK u ranom embrionu D. melanogaster odgovorna je za uspostvaljanje anterio-posteriorne

ose ranog embrona i adultne mušice. Na primer, bcd (bicoid) iRNK se transkrbuje maternalno u

pomoćnim ćelijama i transportuje se u oocitu tokom kasne oogeneze. Bicoid iRNK je u ranom

embrionu distribuirana tako da postoji strmi anterio-posteriorni gradijent, što vodi anteriono-

16

posteriornoj distribuciji proteina BCD, koji se sa nje sintetiše. Translacija cad (caudal) iRNK,

koja je ravnomerno distribuirana u ranom embrionu, reprimira se regrutovanjem 4E-BP pomoću

BCD vezanog za njen 3-UTR, što rezultuje u posteriornoj lokalizaciji CAD proteina. Kaskada

sličnih događaja rezultuje u daljem formiranju plana tela.

Slika 7. Mehanizmi translacione represije specifičnih iRNK posredovani RNK–vezivnim proteinima. a) Kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za eIF4G – eIF4E-vezivni protein (4EBP) regrutuje se na ciljnu iRNK posredstvom RBP (u ovom primeru PUF) i vezuje se za eIF4E onemogućavajući njegovu interakciju sa eIF4G. Reverzija trasnlacione represije može se ostvariti fosforilacijom 4E-BP (žuti krugovi) kao

odgovor na unutraćelijsku signlizaciju. b) Kompetitivna inhibicija vezivanja eIF4E za 5-kapu –alternativni

protein (4EHP ili eIF4E2) koji direktno vezuje 5-kapu ali ne može vezati eIF4G regrutuje se na ciljnu iRNK posredstvom RBP (u ovom primeru BCD) vezanog za BBD element (Bicoid binding domain). c) Translaciono utišavanje nekih iRNK posredovano je skraćivanjem poli(A) repa i regrutovanjem 4E-BP (u ovomprimeru maskina) pomoću proteina CPEB vezanog za CPE na 3'-kraju iRNK. Nakon prijema odgovarajućeg signala, fosforilacija proteina CPEB posreduje u disocijaciji maskina i vezivanju proteinske mašinerije (CPSF i PAP) za citoplazmatičnu poliadnilaciju. Za produženi poli(A) rep vezuju se PABP, uspostavlaju se interakcije sa eIF4G vezanim za eIF4E čime su stvoreni uslovi za uspešnu inicijaciju translacije.

Regulatorni elementi u 3-UTR-u nekih iRNK mogu posredovati u regulaciji translacije

promenom dužine poli(A) repa u citoplazmi. Translaciono utišavanje dešava se skraćivanjem

poli(A) repa, dok aktivacija translacije sledi nakon citoplazmatične poliadenilacije. Promena

dužine poli(A) repa je kritičan korak u ekspresiji nekih gena u visoko-specijalizovanim ćelijama,

kao što su oocite i neuroni. Kod nezrelih oocita žabe, translaciono utišavanje velikog broja

maternalnih iRNK postiže se skraćivanjem poli(A) repa u citoplazmi, od inicijalne dužine od 200

do 250 adeninskih ostataka stečenih u jedru do dužine od 20 do 40 ostataka. Za tako kratke

poli(A) repove može se vezati samo nekoliko proteina PABPC1, što je nedovoljno za stabilnu

interakciju sa eIF4G i inicijaciju translacije (slika 7c). U tačno određnom trenutku tokom

sazrevanja oocite ili nakon njene oplodnje, kao odgovor na odgovarajući signal, dolazi do

citoplazmatične poliadenilacije kada se dodaje približno 150 adeninskih ostataka na kratak

poli(A) rep ovih iRNK, čime se stimuliše njihova translacija.

17

Dve sekvence u 3-UTR iRNK neophodne su za citoplazmatičnu poliadenilaciju: poli(A)

signal (5’-AAUAAA-3’), neophodan i za poliadenilaciju u jedru, i jedna ili više kopija uzvodnih

elemenata za citoplazmatičnu poliadenilaciju (eng. cytoplasmatic polyadenilation element,

CPE) (slika 7c). Elemente CPE propoznaje i vezuje protein CPEB (eng. CPE-binding protein)

(slika 7c). U odsustvu stimulatornog signala, protein CPEB vezan za element CPE stupa u

interakciju sa proteinom maskinom. Maskin pripada grupi 4E-BP i kompetira sa eIF4G za

vezivanje za eIF4E (slika 7c), tako da interakcija maskina i eIF4E inhibira inicijaciju translacije.

Kada se oocita indukuje da završi mejozu, fosforiliše se specifičan serinski ostatak proteina

CPEB, što vodi do disocijacije maskina i kooperativnog vezivanja citoplazmatične forme

specifičnog faktora za kidanje i poliadenilaciju (eng. cleavage and polyadenilation specificity

factor, CPSF) za poli(A) signal i poli(A) polimeraze (slika 7c). Kada poli(A) polimeraza doda

adeninske ostatke, PABPC1 se vezuju za produženi poli(A) rep, vodeći do stabilne interakcije

sa eIF4G vezanog za eIF4E, koji dalje stupa u intrakciju sa eIF3 regrutujući 40S subjedinicu

ribozoma (slika 7c). U slučaju sazrevanja oocite Xenopusa proteinska kinaza koja fosforiliše

serinski ostatak proteina CPEB aktivira se kao odgovor na hormon progesteron. Na taj način

vreme sinteze proteina sa uskladištenih iRNK regulisano je i koordinisano spoljašnjim signalom.

Postoje dokazi da slični mehanizmi kontrole translacije imaju ulogu sinaptičkoj

plastičnosti vezanoj za učenje i memoriju. U centralnom nervnom sistemu, aksoni hiljade i više

neurona uspostavljaju sinapse sa dendritima jednog postsinaptičkog neurona. Kada se jedan od

ovih aksona stimuliše, postsinaptički neuron „pamti“ koja je od hiljade sinapsi bila stimulisana.

Sledeći put kada se ta sinapsa stimuliše jačina odgovora postsinaptičkog neurona se razlikuje u

odnosu na prvi put. Ova razlika u odgovoru je velikim delom rezultat aktivacije translacije iRNK

uskladištenih u regionu sinapse, što vodi lokalnoj sintezi proteina koji povećavaju veličinu i

menjaju neurofiziološke karakteristike te sinapse, dok ostale ostaju nepromenjene. Otkriće da je

protein CPEB prisutan u dendritima neurona dovelo je do hipoteze da citoplazmatična

poliadenilacija stimuliše translaciju specifičnih iRNK uskladištenih u postsinapsama, na sličan

način kao u oocitama. U ovom slučaju, sinaptička aktivnost, a ne hormon, je signal koji indukuje

fosforilaciju proteina CPEB i dalju aktivaciju translacije.

4.2. Unutarćelijski transport iRNK i lokalizovana translacija

Prostorna regulacija translacije postiže se unutarćelijskim transportom iRNK do tačno određenih

mesta u ćeliji i njihovom lokalizovanom translacijom. Ona ćeliji obezbeđuje fleksibilnost u

određivanju tačnog mesta i vremena sinteze proteina u odsustvu de novo transkripcije. Sinteza i

akumulacija proteina u diskretnim mestima u citoplazmi je od značaja imajući u vidu da mnogi

procesi zavise od lokacije određenih proteina u specifičnim strukturama ili regionima ćelije.

Pored toga, ona obezbeđuje mehanizam za brzu i lokalizovanu aktivnost proteina u odgovoru

ćelije na spoljašnje signale. Unutarćelijski transport i lokalizovana translacija iRNK su široko

zastupljeni fenomeni, konzervisani od kvasaca do čoveka. Važni su za mnoge biološke procese:

određivanje sudbine ćelije, kretanje i morfologiju ćelija, i funkcionalnu polarizaciju ćelija posebno

uočljivu u velikim ćelijama kao što su oocite i neuroni.

Unutarćelijski transport i lokalizacija iRNK do tačno određenog mesta u ćeliji ostvaruje

se aktivanim i usmerenim transportom specifičnih iRNK pomoću motornih proteina i

18

polarizovanog citoskeleta, usidravanjem i lokalnom zaštitom od degradacije. Proces je povezan

sa preciznom kontrolom translacije (reprimiranjem), tako da se lokalizovane iRNK translatiraju

isključivo na njihovim krajnjim odredištma u ćeliji u skladu sa signalom koji ćelija primi.

Informacione RNK koje se transportuju do određenog mesta u ćeliji nose „kod“ za

lokalizaciju, sastavljen iz regulatornih sekvenci (USER) koje se, uglavnom, nalaze u 3-UTR.

„Kod“ za lokalizaciju prepoznaju i vezuju određeni RBP formirajući sa iRNK kompleks označen

L-RNP (eng. localizing ribonucleoprotein complex). Faktori L-RNP, zajedno sa drugim

proteinima, "daju" instrukcije citoskeletu i translacionom aparatu o mestu do kojeg će se

transportovati određena iRNP i kada će biti translaciono aktivirana. Neki od faktora L-RNP

stupaju u direktnu ili indirektnu interakciju sa specifičnim komponentama citoskeleta, uključujući

i motorne proteine koji pomeraju „teret“ duž citoskeleta. Putevi prenosa signala kroz ćeliju mogu

modifikovati transport L-RNP i/ili translacione faktore u određenom prostoru citoplazme, kako bi

se postigla vremenski i prostorno regulisana sinteza proteina u skladu sa potrebama ćelije.

Neke L-RNP putuju do svog mesta kao pojedinačne, dok se druge transpotuju kao strukture sa

višim nivoom organizacije. Takvi "paketi" u neuronima sadrže oko 30 L-RNP, imaju prečnik oko

1 μm i predstavljaju transportne ili neuronalne granule. Translaciona represija lokalizovanih

iRNK postiže se represorima, od kojih se neki pridružuju iRNK još u nukleusu. Aktivnost faktora

za lokalizaciju iRNK i represiju translacije mora biti koordinisano regulisana kako bi se postigla

odgovarajuća koordinacija ovih procesa. Lokalizacija i translaciona represija L-RNP može biti

regulisana jedanim faktorom ili kroz interakciju većeg broja faktora.

Slika 8. Dinamika kootranslacionog formiranja subjedinica proteinskog kompleksa kodiranog

grupom kolokalizovanih iRNK. iRNK peprisane sa gena α, β, γ, δ i , koji su rasuti u genomu eukariota, formiraju RNK operon. Njihova lokalizacija, stabilnost i translacija su koordinisano regulisane u citoplazmi, kako bi se efikasno formirao određeni makromolekulski kompleks.

19

Funkcionalno povezane iRNK su kolokalizovane (slika 8). Za njihove regulatorne

sekvence se, između ostalih, vezuju identični faktori kako bi se formirao odgovarajući operon

RNK. Kolokalizacija iRNK koje kodiraju komponente jednog makromolekulskog kompleksa ima

brojne prednosti. Translacija i degradacija kolokalizovanih iRNK podložne su zajedničkoj

regulaciji, dok je formiranje makromolekulaskog kompleksa olakšano sintezom njegovih

komponenti u međusobnoj fizičkoj blizini. Visoka lokalna koncentracija rastućih polipeptida

može čak da promoviše i njihovu kotranslacionu interakciju i brže formiranje kompleksa (slika

8), što daje dodatnu prednost u sprečavanju alternativnih puteva savijanja proteina i isključuje

neželjene interakcije sa kompetirajućim komponentama ćelije. Na ovaj način ćelija može brzo

da odgovori na signale iz okoline koordinisanom inicijacijom translacije mnogo članova

multiproteinskog kompleksa na istom mestu i u isto vreme.

Mnoge iRNK u somatskim ćelijama imaju asimetričnu lokalizaciju. Jedan od dobro

okarakterisanih primera je iRNK za β-aktin, koja lokalizuje u mestima polimerizacije aktina.

Lokalna translacija iRNK za β-aktin omogućava sintezu novih monomera aktina baš na mestima

gde su oni potrebni (slika 9). Sinteza proteina kompleksa Arp2/3, koji je odgovoran za nukleaciju

grananja aktinskih filamenata, se, takođe, odvija na mestima polimerizacije aktina (slika 9). U

kultivisanim mioblastima iRNK za β-aktin lokalizuje u leading edge ćelije, gde novosintetisani

β-aktin polimeriše u aktinsku citoskeletnu mrežu koja gura ćelijsku membranu napred,

omogućavajući kretanje ćelije (slika 9).

Slika 9. Lokalizovana sinteza aktina i proteinskog kompleksa Arp2/3 omogućava kretanje ćelije. Koordinisana lokalizacija i translaciona represija iRNK za β-aktin postiže se vezivanjem faktora ZBP1 za zipkod u njenom 3'-kraju. Nakon prijema određenog signala Src kinaza fosforiliše ZBP1, što vodi translacionoj derepresiji — fosforilisani ZBP1 disocira sa iRNK, regrutuju se ribozomi i počinje sinteza aktina.

20

Koordinisana lokalizacija i translaciona represija iRNK za β-aktin postiže se

vezivanjem faktora ZBP1 (eng. zipcode binding protein 1) za regulatorni element za lokalizaciju

u 3-UTR, nazvan zipkod (slika 9). ZBP1 se još tokom transkripcije vezuje za zipkod i ima

funkciju faktora za lokalizaciju i translacionog represora. Kompleks formiran u jedru transportuje

se u citoplazmu, gde asemblira sa molekularnim motorima i dalje se kao L-RNP transportuje

duž citoskeleta do leading edge ćelije. Na tom mestu, aktivnost ZBP1 regulisana je

membranskom kinazom Src. Fosforilacija serinskog ostatka na poziciji 396 ZBP1 dovodi do

translacione derepresije iRNK za β-aktin — fosforilisani ZBP1 disocira sa iRNK, regrutuju se

ribozomi i počinje sinteza aktina. U ovom primeru aktivnost za lokalizaciju i translacionu

represiju iRNK sadržana je u jednom faktoru — ZBP1 vezivanjem za zipkod iRNK za β-aktin

reguliše njenu lokalizaciju i reprimira translaciju, a njegovom fosforilacijom aktivira se translacija

iRNK.

Regulisana translacija lokalizovanih iRNK je kod metazoa ključna za funkcionisanje

visoko-polarizovanih ćelija, kao što su oocite, ćelije ranih embriona i neuroni. Ona doprinosi

formiranju plana tela i funkcionisanju neurona. Jedna desetina nasumično izabranih iRNK iz

oocite Drosophila lokalizuje u anteriornom polu, dok skoro 400 različitih iRNK lokalizuje u

dendritima neurona sisara. U oocitama D. melanogaster lokalizovana trasnlacija doprinosi

uspostvaljanju ose i plana građe budućeg embriona i odrasle mušice. Tokom oogeneze, iRNK

odgovorne za određivanje ose embriona - oskar, bicoid, gurken iRNK, transportuju se do

specifičnog mesta u oociti, gde se usidravaju i lokalno translatiraju, što obezbeđuje prostornu

restrikciju njihovih proteina. Na primer, oskar iRNK se trasnportuje do posterionog pola,

trasnslatira se u Oskar protein i indukuje formiranje polnih ćelija. Izgleda da oskar protein

započinje nukleaciju polnih granula, RNP kompleksa koji sadrže RNK i proteine esencijalne za

formiranje i funkciju polnih ćelija. Lokalizacija specifičnih iRNK u različitim delovima zrelih

neurona je važan mehanizam kojim ćelija može brzo promeni koncentraciju određenih proteina

u delovima koji su udaljeni od tela neurona. Informacione RNK se selektivno transportuju do

nervnih završetaka u reverzibilnom translaciono reprimiranom stanju, a nakon odgovarajuće

indukcije aktivira se lokalna translacija. Dva procesa koja u neuronima uključuju lokalizovanu

translaciju su rast aksona (tokom razvića ili tokom regeneracije aksona zrelih neurona nakon

povrede) i sinaptička plastičnost, vezana i za učenje i memoriju.