zika, chikungunya, dengue e febre amarela: protocolos para ... · contra-coloração e selagem....
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Zika, Chikungunya, Dengue e Febre Amarela: Protocolos para
Imuno-Histoquímica
Luiz Claudio Ferreira
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História
• Origem: Albert H. Coons e seus colaboradores na década de 40, com a imunofluorescência;
• Introdução de marcadores enzimáticos: a primeira enzima a ser utilizada foi a peroxidase de rábano, seguida por fosfatase alcalina, a glicose-oxidase e a beta-D-galactosidase;
• No início os anos 90 os sistemas de detecção sensíveis começaram a ser aplicados em anatomia patológica.
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Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
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Imuno-Histoquímica no Diagnóstico de Arboviroses
Na ocorrência do óbito por suspeita de infecção por arbovirose, destaca-se a importância da realização do diagnóstico histopatológico (presuntivo) seguido de pesquisa de antígenos virais por imuno-histoquímica (confirmatório), visto que lesões anatomopatológicas determinam as alterações relativas aos óbitos por cada doença.
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Imuno-Histoquímica
Utiliza de anticorpos para detecção de antígenos em amostras teciduais ou celulares (imunocitoquímica), reunindo conhecimentos próprios da imunologia, histologia e química.
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Fonte: INI/Fiocruz
Fonte: Shi Z, Stack M S. An Update on Immunohistochemistry in Translational Cancer Research. Cancer Transl Med 2015;1:115-22
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Imuno-Histoquímica
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Etapas da Reação de Imuno-Histoquímica
Desparafinização e Hidratação
Recuperação Antigênica
Bloqueio de Proteínas Endógenas
Incubação com o Anticorpo Primário
Incubação com o Sistema de Amplificação (ou Anticorpo Secundário)
Revelação
Contra-coloração e Selagem.
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Desparafinização
• Com o objetivo de retirar a parafina impregnada no tecido: colocar as lâminas na estufa a 60ºC por 30 min, para aderência dos cortes e passar em 3 banhos de xilol para a retirada da parafina.
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Hidratação
• Para reidratar o tecido: passar as lâminas em três banhos graduais no álcool etílico absoluto (100%), 95% e 70% e depois transferindo para a água.
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Efeito da Fixação nas Proteínas
Função do Pré-Tratamento
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Recuperação Antigênica
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Recuperação Antigênica para Zika
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Diluição do Tampão de EDTA (pH 8,0)
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Recuperação Antigênica Por Pressão 110ºC por 15 min
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Recuperação Antigênica para Chikungunya
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Diluição do Tampão de EDTA (pH 8,0)
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Recuperação Antigênica Por Pressão 110ºC por 15 min
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Recuperação Antigênica para Dengue
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Diluição do Tampão de Citrato (pH 6,0) 1:10
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Recuperação Antigênica Por Pressão 110ºC por 15 min
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Dupla Recuperação Antigênica para Febre Amarela
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Diluição do Tampão de EDTA (pH 6,0) 1:10
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Recuperação Antigênica Por Pressão 95ºC por 30 min
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Diluição da Proteinase K 1:200
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Recuperação Antigênica Por Digestão Enzimática durante 15 min
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Bloqueio de Ligações Inespecíficas
• Para bloquear a fosfatase: incubar o tecido com 100uL de solução bloqueadora de background (Background Punisher) por 10 minutos;
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Incubação com o Anticorpo • Para a ligação antígeno-anticorpo: Colocar 100uL
do anticorpo primário diluído e incubar overnight em câmara úmida de 2ºC a 8ºC;
DILUIÇÕES:
Zika-
1:2000
Chikungunya-
1:10.000
Dengue -
1:2000
Febre Amarela -
1:40.000
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Amplificação com Kit AP
• Sistemas de detecção de polímero AP
• Lavar as lâminas 2 vezes com solução TBS.
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Amplificação com Kit
• Colocar 100uL do polímero AP-Polymer e incubar o tecido por 15 minutos;
• Lavar as lâminas 2 vezes com solução TBS.
OBS: Caso o anticorpo primário seja produzido em coelho, omita a etapa de incubação
com o anticorpo prob e deixe o tecido ficar incubando apenas com o polímero por 30
minutos.
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Revelação • Colocar 100uL do cromógeno (FAST RED) e deixar as
lâminas incubando por 20 minutos a temperatura ambiente;
• Lavar as lâminas 2 vezes com água destilada.
NOTA: Preparo da solução – Colocar 01 pílula do cromógeno para cada 5 mL da
solução tampão específica. O volume final a ser preparado irá depender do número de
lâminas utilizadas na reação.
Fast
Red
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Contra Coloração
• Colocar as lâminas num suporte para coloração e imergir as mesmas em hematoxilina modificada de Mayer por 2 minutos retirar excesso em água destilada e colocar por 1 minuto no lítio blu, lavar por 5 minutos em agua destilda.
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Selagem
• Deixe o tecido secar em estufa a 60ºC por 5 minutos;
• Montar as lâminas utilizando meio de montagem aquoso.
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Resultado Febre Amarela
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Resultado Chikungunya
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Resultado Dengue
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Preparo de pellets de cultura usando HistoGel
MsC Luiz Claudio Ferreira
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Jun
2015
• Zika virus
• Antibody
against Zika
virus
Sept 2015
Dec 2015
Mouse
antibody to
Zika virus Provided by the
Division of
Vector-Borne
Diseases, Fort
Collins, CO
Zika Virus – IDPB Diagnostic Activities – Outbreak Investigation
Zika virus
culture - Vero
E6 Kidney cells
Cynthia Goldsmith
• Immunohistochemical
assay
• RT-PCR -FFPE
Jan 2016
Jan, 10 – CDC Atlanta to
Brazil MOH
First link – Zika virus,
microcephaly and
pregnancy loss
Julu Bhatnagar
Luciana Flannery
Anti-Zika NS1
3C2
Monoclonal
antibody
Sept 2016
Zika virus non-
structural protein 1
(3C2) Jason M. Goldstein, Ph.D. -
Immuno-Diagnostic
Development (IDD) Team,
Division of Scientific
Resources
Dominique Rollin
2017
4 cases from
Brazil
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Objetivo
• Preparar pellets de cultura viral, bacteriana ou fúngica usando HistoGel como material de ligação com o intuito de facilitar o processamento da amostra.
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Procedimento
• Adicionar a cultura fixada em formol em tubos de 50mL identificados;
• Centrifugar o tubo a pelo menos 3.000rpm por 10 minutos;
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Procedimento
• Remover a formalina do tubo utilizando um pipeta e descarta-la corretamente;
• Adicionar álcool etílico 70% suficiente para cobrir o pellet de cultura e misturar batendo suavemente com os dedos;
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Procedimento
• Centrifugar o tubo a pelo menos 3.000rpm por 10 minutos;
• Identificar uma lâmina de vidro limpa com 2” e 3”;
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Procedimento
• Colocar tecido normal bem picado na lâmina com o mesmo volume do pellet de cultura a ser processado;
• Adicionar gotas de álcool 70% do tecido picado, conforme necessário para mantê-lo úmido;
Álcool
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Procedimento
• Remover o tubo da centrífuga e retirar quase todo o álcool com uma pipeta, descartando-o no recipiente adequado;
• Remover o pellet de cultura do tubo com uma pipeta descartável ou com uma espátula de aço (dependendo da viscosidade da amostra) e coloque em cima do tecido normal picado na lâmina;
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Procedimento
• Picar ainda mais o tecido normal misturado com a cultura até que as partes do tecido sejam de 1mm3;
• Para um tubo de 50mL, adicione HistoGel liquefeito suficiente para suspender o volume de tecido/cultura. Se o volume da mistura for maior que 4mm3 então terá que ser aliquotado entre vários tubos com HistoGel.
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Procedimento
• Adicionar a mistura tecido/cultura cuidadosamente ao centro do HistoGel aliquotado usando uma espátula de aço limpa com as extremidades estreitas;
• Centrifugar o tubo a pelo menos 3.000rpm por 10 minutos;
• Imprimir cassetes histológicos com número de identificação da amostra e preencha o registro;
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Procedimento
• Colocar o tubo da mistura de HistoGel centrifugado em um recipiente com gelo por no mínimo 15 minutos;
• Cortar um único pedaço de papel para lentes em 6 pedaços;
• Retire o gel do tubo usando uma espátula de aço limpa com as extremidades estreitas e envolva-o em um papel de lente quadrada e coloque em um cassete apropriado;
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Procedimento
• Colocar o cassete num frasco de com álcool 70% e encaminhe ao processamento histológico;
• Retornar o HistoGel de estoque para a geladeira ou armazenar em temperatura ambiente coberto em papel alumínio;
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BLOCOS DE CULTIVO CELULAR
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Dengue monoclonal antibody validation
Dengue 1 and 2 infected cells Dengue 3 and 4 infected cells
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Teste de reação cruzada Dengue x Chikungunya
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