yük. lis . Öğr . zehra sezer prof. dr. a. Şenol ertÜrkoĞlu
DESCRIPTION
Yük. Lis . Öğr . ZEHRA SEZER Prof. Dr. A. ŞENOL ERTÜRKOĞLU. GİRİŞ. ENDOMERİYUM MENSTRUEL DÖNGÜ DESİDUA DESİDUALİZASYON İMPLANTASYON FOXO1. GİRİŞ. İnsan endometriyum ; menstruel döngü endometriyumun desidualizasyonu embriyo gömülme. -yeniden yapılandırma - hücre yenilenmesi - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Yük. Lis. Öğr. ZEHRA SEZER
Prof. Dr. A. ŞENOL ERTÜRKOĞLU
ENDOMERİYUMMENSTRUEL DÖNGÜDESİDUADESİDUALİZASYONİMPLANTASYONFOXO1
GİRİŞ
• İnsan endometriyum ; menstruel döngü
endometriyumun desidualizasyonu embriyo gömülme
-yeniden yapılandırma
- hücre yenilenmesi -Ekstrasellüler matriksin (ECM) yeniden modellenmesi (Nakano M ve ark, 2001; Noguchi Y ve ark, 2003)
GİRİŞ
GİRİŞ
endometrial stromanın morfolojik ve biyokimyasal dönüşümünün gerçekleşmesidir.
Stromal fibroblast hücreleri faklılaşır ve yuvarlak salgı hücrelerine dönüşür.
prolaktin (PRL) insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein
(IGFBP-1)
Desidualizasyon
(Gellersen B ve ark, 2003)
büyüme faktörlerine, çevresel ve hormonal tetikçilere cevap olarak bağışıklıkta kritik aracı
hücresel farklılaşma – gelişme – metabolizma - apoptozis
Görevleri :
GİRİŞ
FOXO (forkhead box O) proteini ; transkripsiyon faktörlerinden ‘forkhead box’ (FOX) ailesinin bir alt
sınıfına aittir. (Accili D ve ark, 2004)
Habeş maymunları ile yapılan en son çalışmalara göre endometriyumda FOXO1 mRNA seviyesi ; (Kim ve ark, 2003)
menstrüel döngünün geç proliferasyon fazında
orta sekresyon faz boyunca
gebe endometriyumunda en yüksek
GİRİŞ
AMAÇ
I. İnsan desidua ve endometriyumunda FOXO1 ifadesini araştırmaktır.
konuyla ilişkili çok az çalışma vardır.
II. Ayrıca bu çalışmada endometriyal stromal hücrelerde (ESC)
hCG ( insan koryonik gonadotropin ), progesteron ( P; 4-pregnene-3,20-dione ) östrojen ( E; 17 beta-estradiol ), cAMP ( siklik adenozin monofosfat )
etkenlerinin FOXO1 düzeyine etkileri incelenmiştir.
III. İn vitro desidualizasyonda FOXO1 ifadesi araştırılmıştır.
MATERYAL &METOD1. DOKU ÖRNEKLERİ :• 32-45 yaş arasındaki (ort. 36 yaşında) => 39 hasta• servikal intraepitelyal neoplazi (CIN) ve uterus miyoması için
histerektomi geçiren• Noyes ve arkadaşlarının histolojik kriterlerine ( Noyes RW ve ark ,1950 ) ve en
son menstruel periyoda göre sınıflandırılmıştır.• 4 gruba ayrılmıştır ; Proliferasyon fazında 12 örnek Erken - sekresyon fazında 7 örnek Orta - sekresyon fazında 10 örnek Geç - sekresyon fazında 10 örnek• Desidua; gebeliğin ilk trimester döneminin sonlarında bulunan
hastalardan elde edildi.
MATERYAL &METOD• Doku örnekleri ; İkisi => PCR ve Western blot analizi yapılmak üzere sıvı nitrojende hızlı bir
şekilde donduruldu. Birisi => histolojik teşhis ve IHC boyaması için rutin histolojik yöntemlerle
takip edilip parafine gömüldü.
2. RNA İZOLASYONU VE RT-qPCR -> FOXO1 mRNA miktarı incelendi.
3. İMMUNOHİSTOKİMYA BOYAMASI - > FOXO1 için 1:50 seyreltide primer antikor kullanıldı.
4. PROTEİN İZOLASYONU ve WESTERN BLOT ANALİZİ• GAPDH, Western blot and RT-qPCR analizi için kontrol olarak seçildi.• GAPDH geni bir housekeeping gendir.
MATERYAL &METOD
5. İNSAN ENDOMETRİYAL STROMAL HÜCRELERİN PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ
• Desidua tepkimesinin düzenleyici mekanizmasını araştırmak için HES hücrelerin primer kültürü yapılmıştır.
• Her bir biyopsiden alınan HESC kültürleri 6 gruba ayrıldı; cAMP (8-Br-cAMP: 0.5 m M ) P (P: 10 –6 M ) hCG (hCG: 10 IU/ml) cAMP + P (8-Br-cAMP: 0.5 m M , P:10 –6 M ) E + P (E: 10 –8 M , P: 10 –6 M ) Kontrol ( stromal hücreler - rutin mediumda 24 ve 48 saat )
MATERYAL &METOD
6. İN VİTRO DESİDUA TEPKİMESİ
• HES hücrelerin in vitro desidua tepkimesini uyarmak için 8-Br-cAMP (0.5 m M ) kullanıldı.
• Kültür ortamında desidua tepkimesi, farklılaşma işaretleyicisi olarak PRL ifadesi kullanılarak değerlendirildi .
• PRL kemilüminesans tarafından ölçüldü.
7. İSTATİSTİKSEL ANALİZ YAPILDI
p < 0,05 => anlamlı olarak kabul edildi.
BULGULAR
a b c
d e f
İnsan Endometriyum ve Desiduasında FOXO1 İmmunolokalizasyonu
a proliferasyon fazı epitel hücrelerin sitoplazmasında zayıf boyama
b-c-d sekresyon fazı hücrelerin çekirdek ve sitoplazmasında kuvvetli boyama
e-f ilk trimester stromal hücrelerin sitoplazması & epitel hücrelerin sitoplazma + çekirdeğinde kuvvetli FOXO1 boyama
İlk Trimester ve Menstruel Döngü Boyunca İnsan Endometriyumunda FOXO1 İmmunohistokimyasal
Yoğunluk
Menstruel Döngünün Farklı Fazlarındaki İnsan Endometriyumunda ve İlk Trimesterdeki Desiduada FOXO1 mRNA
İfadesi
P<0.05 MS vs P & ES => anlamlıFT vs P-ES-MS-LS => anlamlı
Menstruel Döngünün Farklı Fazlarındaki İnsan Endometriyumunda ve İlk Trimesterdeki Desiduada FOXO1 Protein İfadesi
P < 0.05MS - LS vs P- ES => anlamlıFS vs P-ES-MS-LS => anlamlı
HESC’de cAMP, P, P+E, cAMP+P ve hCG‘nin FOXO1 düzeyine etkileri
Hücre İçindeki FOXO1 Protein Yerleşiminin cAMP ve P Tarafından Düzenlenmesi
HESC’de Desidualizasyon Boyunca 8-Br-cAMP FOXO1 Protein İfadesini Düzenlemesi
TARTIŞMA ve SONUÇ
• Bu çalışma,menstrüel siklus boyunca endometriyum ve erken gebelik desiduasında FOXO1 mRNA – protein ifadesi ile FOXO1 hücresel yerleşiminin ilk detaylı araştırmasıdır.HES hücrelerinin çekirdeğinde FOXO1 in vitro ifadesinin cAMP tarafından düzenlendiğini ,cAMP varlığında P’un HES hücrelerinin çekirdek ve sitoplazmasın- da FOXO1 ifadesini uyardığını,cAMP uygulanan in vitro desidualizasyon boyunca FOXO1 ifade edildiğini göstermiştir.
Sitoplazmik FOXO1 ifadesinin hücre çoğalması ile ilişkili olduğu daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir.
Desidua hücre sitoplazmasında artan FOXO1 ifadesinin gözlenmesi, ilk trimester boyunca stromal hücre çoğalmasında FOXO1‘in potansiyel bir rolü olduğunu destekler.
TARTIŞMA ve SONUÇ
Tümör nekrozis ailesinden olan Fas-ligand promoter FOXO1 bağlanma bölgesine sahiptir.
Çekirdekteki FOXO1 ifadesi apoptozis ile ilişkilidir.
Endometriyal hücre apoptozun gömülme ile ilişkili olduğu iyi bilinmektedir.
TARTIŞMA ve SONUÇ
• Desidualizasyon ile ilgili genlerin çoğu geç-sekresyon fazında yüksek derecede ifade edilir.
• Bu sorumlu genlerden bazıları: urocortin (Torricelli M ve ark , 2007)
İnterleukin-15 (IL-15) (Okada S ve ark , 2000 )
HOXA10 (homeobox A10) ( Vitiello D ve ark , 2008 )
Lösemi inhibe edici faktör ( Kimber SJ ve ark , 2005)
TARTIŞMA ve SONUÇ
FOXO1, stromal hücre desidualizasyonun
ilerlemesine katkıda bulunması için
bu genler ile iş birliğinde olabilir.
• cAMP’nin çekirdekte FOXO1 mRNA ve protein ifadesini tetiklediği görülmüştür.
• P, E ve hCG hormonlarının FOXO1 ifadesinde uyarıcı olmaması şaşırtıcıdır.
• 8-Br-cAMP tarafından uyarılan FOXO1 ifadesi P uygulaması ile artmış ve FOXO1’in çekirdekten sitoplazmaya geçişi görülmüştür.
• FOXO1’in en yüksek ifadesinin ilk trimesterdeki desidual hücre sitoplazmasında olması bu görüşü güçlendirmektedir.
TARTIŞMA ve SONUÇ