wyklad 10
TRANSCRIPT
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Kwasy nukleinowe1. Polikondensaty zbudowane z nukleotydów2. Dwa rodzaje: DNA i RNA3. Trzy formy RNA: mRNA, tRNA i rRNA4. DNA i mRNA są nośnikami informacji genetycznej5. Cząsteczki labilne; ulegają denaturacji przy ogrzewaniu;
RNA podatne na hydrolizę alkaliczną
Struktura ogólna nukleotydu
Zasady purynowe i pirymidynowe występujące w DNA i/lub RNA
Wiązania fosfodiestrowew DNA lub RNA
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych
Struktury przestrzenne RNA: z lewej – mRNA; z prawej - a) tRNA; b) rybozym hammerhead; c) Intron z mRNA
Model Watsona-Cricka struktury DNA
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Kierunek przepływu informacji genetycznej
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Możliwości zastosowania kwasów nukleinowych jako leków
1.Wprowadzenie stosunkowo krótkiego fragmentu kwasu nukleinowego w celu zablokowania ekspresji konkretnego genu.
strategia antysensu
Zadaniem wprowadzonego preparatu (RNA lub DNA) jest hybrydyzacjado specyficznego odcinka mRNA będącego celem molekularnym, zablokowanie jego ekspresji i/lub indukcja procesu unieczynnienia. Preparaty otrzymywane na drodze syntezy chemicznej (ON) lub biologicznej i są na ogół zmodyfikowane.
2.Wprowadzenie kwasu nukleinowego jako kompletnego genu w celu wywołania jego ekspresji.
terapia genowa (somatyczna, mitochondrialna)DNA-szczepionki
Substancja czynna w formie plazmidu DNA zawierającego kompletną sekwencję genu kodującego biologicznie czynne białko. Preparaty otrzymywane na drodze biosyntezy.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii
Porównanie rodzajów strategii antysensowych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii
Strategie antysensowe – preparaty ON otrzymywane na drodze syntezy
Miejsca chemicznej modyfikacji oligorybonukleotydów
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
ODMTrO
O
Z ZOHO
O
ZODMTrO
OP
R'O NR'' R'''
ODMTrO Z
OP
OO
O
ZO
[S]
OO Z
O
ODMTrO Z
OPO S-
Strategie antysensowe – preparaty ON otrzymywane na drodze syntezy
Z –zasada azotowaDMTr – 4,4’-dimetoksytrytyl
Sekwencja reakcji: 1. Przyłączanie 3’-fosforoamidynowych pochodnychnukleozydów z grupą 5’OH ochronioną grupą DMTr do wolnejgrupy 5’OH nośnika lub poprzedniego nukleotydu.2. Pozostające wolne grupy 5’OH blokuje się poprzez acetylację.3. Po zsyntezowaniu łańcucha ON - sulfuryzacja
Produkt końcowy: mieszanina ON o długości n (produkt dominujący), n-1, n-2, itd..
Schemat syntezy ON na nośniku stałym
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Zalety WadyI generacja Oporność na działanie nukleaz Generowanie chiralności
Aktywacja RNazy H Wiązanie z białkami/toksycznośćII generacja Mniejsza toksyczność Brak aktywacji RNazy H
Brak problemów stereochemicznychGapmery ON chimeryczne (środek PS, na końcach
OMe lub MOE)III generacjaPNA Niewielka toksyczność Brak indukcji RNazy H
Problemy z rozpuszczalnościąLNA Duża odporność na działanie nukleaz
Wysokie powinowactwo do mRNA
Pożądane cechy ON:
- długość 17 – 21 nukleotydów- sekwencja komplementarna do specyficznejsekwencji celu molekularnego
- unikanie sekwencji: tworzących niepożądanestruktury II-rzędowe, tworzących G-kwartety,motywów CpG
- odporność na działanie nukleaz- zdolność do indukowania działania RNazy H- brak efektów ubocznych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii
Strategie antysensowe – peptydowe kwasy nukleinowe
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii
Strategie antysensowe – rybozymy i deoksyrybozymy
Modele struktur II-rzędowych rybozymu „hammerhead” i deoksyrybozymu
Model struktury przestrzennej rybozymu „hammerhead”
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Antysensowe oligonukleotydy zaaprobowane do badań klinicznych
Produkt Firma Target (mRNA) Choroba Typ StatusVitravene (Fomivirsen)
ISIS Pharmaceuticals CMV IE2 CMV retinopatia
PS DNA
Akcept.
Affinitac (ISIS 3521) ISIS PKC- Nowotwór
PS DNA
Faza III
Genasense Genta Bcl2 Nowotwór PS DNA
Faza III
Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS ICAM-1
Łuszczyca, Choroba Crohna, Wrzodziejące zapalenie jelit
PS DNA
Faza II/III
ISIS 14803 ISIS antywirusowy Żóltaczka zakaźna typu C
PS DNA Faza II
ISIS 2503 ISIS H-ras Nowotwór PS DNA Faza II
MG98 Methylgene DNA metylotransferaza Nowotwory lite
PS DNA Faza II
EPI-2010 EpiGenesis Pharmaceuticals
Receptor adenozyny A1 Astma
PS DNA Faza II
GTI 2040 Lorus Therapeutics
Reduktaza rybonukleotydowa (R2) Nowotwór
PS DNA Faza II
ISIS 104838 ISIS TNF
Reumatoidalne zapalenie stawów, Łuszczyca
II gener. Faza II
Avi4126 AVI BioPharma c-myc Nowotwory,
III gener.
Faza I/II
Gem231 Hybridon PKA RI Nowotwory lite II gener.
Faza I/II
Gem92 Hybridon HIV gag AIDS II gener. Faza I
GTI 2051 Lorus Therapeutics
Reduktaza rybonukleotydowa (R1) Nowotwory
PS DNA Faza I
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Terapia genowa
Rodzaje terapii genowej: somatyczna, mitochondrialna
Substytucja – wprowadzenie genu, którego brak w organizmie chorym, a występuje w zdrowym Addycja – wprowadzany gen nie występuje także w organizmie zdrowym
Techniki somatycznej terapii genowej
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Stany patologiczne/chorobowe, które mogą być leczone terapią genową
Defekty genetyczne Choroby nabyte
Niedobory metaboliczne
Deficyt enzymów cyklu mocznikowegoFenyloketonuriaChoroba Gauchera
Hemoglobinopatie
Anemia sierpowataThalasemia
Zaburzenia krzepliwości krwi
Hemofilia A i B
Choroby płuc
Zwłóknienie torbielowate (mukowiscydoza)Deficyt alfa-1 antytrypsyny
Choroby układu sercowo-naczyniowego
Rodzinna hipercholesterolemia
Choroby infekcyjne
AIDSWirusowe zapalenia wątroby typu B i C
Choroby neurologiczne
Choroba Parkinsona
Choroba Alzheimera i inne neurodegradacyjne
Choroby układu sercowo-naczyniowego
ArteriosklerozaChoroby naczyń obwodowychChoroba wieńcowa
Nowotwory
różne typy
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Terapia genowa nowotworów
1. Odwrócenie fenotypu nowotworowego poprzez kontrolę ekspresji onkogenówlub wstawienie genów supesorowych
Zahamowanie ekspresji uszkodzonych genów tworzących szlak mutacyjny lub zastąpieniezmutowanego genu jego prawidłowo działającym odpowiednikiem. Stosowanie technologii siRNA
2. Poprawę odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza przez uczynienie komóreknowotworowych bardziej immunogennymi
TIL- T-cell infiltrating lymphocytes (limfocyty naciekające nowotwór). Wprowadzanie genów kodujących antygeny nowotworu (czerniak, gen HLA-B7). Geny kodujące cytokiny
3. Zniszczenie komórek nowotworowych za pomocą wprowadzenia genów kodującychbiałka aktywujące proleki przeciwnowotworowe
4. Ochrona zdrowych tkanek narażonych na działanie czynników cytotoksycznych,chemoterapii lub radioterapii
Komórki szpiku – geny kodujące białka MDR
5. Wpływ na proces angiogenezy guzaGeny kodujące czynniki antyangiogenne, w tym przeciwciała anty VEGF, FGF
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych
Problem wprowadzenia DNA do tkanek (komórek)
- DNA jest dużą cząsteczką o charakterze polianionowym, bardzo słabo przechodzącą przez błony biologiczne;
-„nagie” DNA jest podatne na działanie nukleaz
-DNA tworzy struktury supehelikalne
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
• Wirusowe:
- retrowirusy- lentiwirusy- adenowirusy- wirusy opryszczki - wirusy towarzyszące adenowirusom AAV
• Niewirusowe:
- „nagi” DNA
- liposomy kationowe
- związki polikationowe
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Nośniki niewirusowe
• Składają się z syntetycznych związków chemicznych lub wysoko oczyszczonych substancji pochodzenia naturalnego;
• nie ma tu ryzyka aktywacji onkogenów;
• mniejsza wydajność transferu związana z ujemnym ładunkiem plazmidowego DNA i jego wielkością – potrzebna kondensacja w cząsteczkach nośnika.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Nośniki liposomowe
• Lipidy i liposomy – cząsteczki amfifilowe tworzą biwarstwęlipidową zbudowaną z lipidów kationowych i neutralnych, zwróconych do siebie częściami hydrofobowymi;
• do wnętrza wprowadzany jest skondensowany DNA;
• nośnik wprowadzany do komórek na drodzeendocytozy.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Somatyczna terapia genowa – nośniki polikationowe
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Wektory wirusowe
• Wykorzystanie naturalnej zdolności wirusów do wprowadzania DNA lub RNA do komórek ssaczych;
• konstruowane za pomocą metod inżynierii genetycznej/biologii molekularnej;
• plazmidowy wektor i komórki pakujące;• całość lub część genów jest usuwana –geny odpowiadające za
replikację i kodujące białka otoczki wirusa;• na ich miejsce wprowadzany jest gen terapeutyczny zwany transgenem.
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowychETAPY PROCESU PRODUKCYJNEGO EFEKTY Fermentacja okresowa E. coli
Zmniejszenie objętości
Usunięcie:
Fragmenty błon komórkowych, białka, genomowe DNA Osad
RNA Białka Endotoksyny
Białka
Genomowe DNA RNA Endotoksyny „open circle” plazmid
Oddzielenie komórek
(separator)
Liza alkaliczna
(NaOH/SDS) Strącanie octanem potasu
Oczyszczanie – klarowanie
(filtracja/wirowanie)
Chromatografia
anionowymienna
Strącanie
izopropanolem
Filtracja na żelu/
Chromatografia faz odwróconych
Nadanie postaci leku
Ogólny schematprocesu produkcyjnegootrzymywania terapeutycznego plazmidowego DNA
ETAPY PROCESU PRODUKCYJNEGO EFEKTY Fermentacja okresowa E. coli
Zmniejszenie objętości
Usunięcie:
Fragmenty błon komórkowych, białka, genomowe DNA Osad
RNA Białka Endotoksyny
Białka
Genomowe DNA RNA Endotoksyny „open circle” plazmid
Oddzielenie komórek
(separator)
Liza alkaliczna
(NaOH/SDS) Strącanie octanem potasu
Oczyszczanie – klarowanie
(filtracja/wirowanie)
Chromatografia
anionowymienna
Strącanie
izopropanolem
Filtracja na żelu/
Chromatografia faz odwróconych
Nadanie postaci leku
Ogólny schematprocesu produkcyjnegootrzymywania terapeutycznego plazmidowego DNA
Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Terapeutyczne plazmidowe DNA; typowe specyfikacje procedury zwalniającej
Test Specyfikacja
Wygląd przejrzysty, bezbarwny roztwór
Wielkość, miejsce cięcia zgodność z mapą plazmidu (elektroforezarestrykcyjnego w żelu agarozowym, analiza restrykcyjna)
Kolisty plazmid DNA (forma CCC) >95% (elektroforeza w żelu agar., HPLC)
DNA, E. coli <0,02 µg/µg plazmidowego DNA (Southern blot)
Białko niewykrywalne (oznaczenie metodą BCA)
RNA niewykrywalne (elektroforeza w żelu agar.)
Endotoksyna <0,1 EU/µg plazmidowego DNA (LAL)
Sterylność brak wzrostu po 14 dniach (USP)
Specyficzna aktywność Odpowiada standardowi referencyjnemu