western blot
TRANSCRIPT
Western blotMA. ELISA CARRIÓN B.
VIVIANA LLIGUICOTA
NANCY RIERA
VANESSA LLERENA
ISRAEL RIVERA
KARLA TENESACA
JOSÉ DAVID TERÁN.
- técnica analítica- usada para detectar una
proteína específica en un extracto crudo
- mediante el uso de anticuerpos.
Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune (INMUNOGLOBULINAS capaces de detectar
proteínas ajenas(ANTÍGENOS) y unirse específicamente a ellas
Western blot
- COMIENZA CON UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA- EN GEL DE POLIACRILAMIDA - PARA SEPARAR LAS PROTEÍNAS DE LA MUESTRA
- LAS PROTEÍNAS YA SEPARADAS- SON TRANSFERIDAS A UNA MEMBRANA
DE NITROCELULOSA- LAS UNE CON FIRMEZA
- UNA VEZ QUE LAS PROTEÍNAS FUERON SEPARADAS EL GEL - SE RECUBRE CON UNA HOJA DE NITROCELULOSA
- SE CUBRE CON UNA CAPA GRUESA DE TOALLAS DE PAPEL - SE COMPRIME CON UNA PLACA PESADA.
EL LÍQUIDO EN EL GEL SE TRANSFIERE A TRAVÉS DE LA NITROCELULOSA.
otra posibilidad:- EMPLEAR LA ELECTROTRANSFERENCIA APLICAR UNA
CORRIENTE ELÉCTRICA - Y LA UTILIZACIÓN DE UN TAMPÓN DE TRANSFERENCIA
PARA LLEVAR LAS PROTEÍNAS DESDE EL GEL A LA MEMBRANA.
- SE APILAN EN FORMA DE SÁNDWICH LOS SIGUIENTES
ELEMENTOS:
- ESPONJA, - PAPELES EMPAPADOS CON BUFFER DE
TRANSFERENCIA, - GEL,
- MEMBRANA, - PAPELES EMPAPADOS CON BUFFER Y
ESPONJA,
Y LUEGO SE LE APLICA UNA CORRIENTE ELÉCTRICA A TODO EL MONTAJE PARA QUE LAS PROTEÍNAS CORRAN AL POLO
POSITIVO Y SE ATRAPEN EN LA MEMBRANA.
LOGRADA LA TRANSFERENCIA
DE LA BANDA DE PROTEÍNAS A LA MEMBRANA DE
NITROCELULOSA
POR ALGUNO DE LOS DOS TIPOS DE TRANSFERENCIA
TINCIÓN CON ALGÚN COLORANTE COMO EL PANCEAU S QUE ES FÁCIL DE
REMOVER.
LOS SITIOS DE ADSORCIÓN DE LA NITROCELULOSA
NO OCUPADOS POR PROTEÍNAS
SE BLOQUEAN CON UNA PROTEÍNA NO ESPECÍFICA COMO
LA CASEÍNA
PREVENIR LA ADSORCIÓN NO
ESPECÍFICA DE LOS ANTICUERPOS QUE
LUEGO SE INCORPORAN.
ELECTROBLOTTING
Proteínas
Transferidas
Desde la Gel
Al
Membrana Duración
30 minutos
Procedimiento
apilando papel de filtro
En una esponja plana
Con Butte de transferencia
el gel, la membrana en
contacto directo con el
gel.
más papel de filtro y
finalmente una esponja
plana
La electrofores
is
8-10 V/cm (de
separación entre
electrodos)
Velocidad de transferencia
inversa al tamaño de la proteína
Refrigerar y recircular el
buffer
Luego de la transferencia
se puede
Analizarla o conservarla en frio (2-8 )
geles sometidos
a una corriente elevada
sistema más extendido
es el 'Semi-Dry blotting'
que se coloca una pila
formada por papel, gel, la membrana y más papel, con buffer.
entre dos electrodos
planos entre los
Rapidez Transferencia en pocos minutos
VENTAJAS
Variantes de la electroforesis
TIPOSSegún el tipo de detección de las proteínas.
Directo Indirecto
DirectoEl anticuerpo primario
se une al antígeno de la membrana
reacciona con el sustrato
originando una señal detectable
el anticuerpo primariodebe ir marcado con una enzima
Indirecto
El anticuerpo primario sin
marcar
reacciona con el
antígeno.
anticuerpo secundario marcado
se une al primario
reacciona con el
sustrato.
MEMBRANAS EN LA UTILIZACION DE WETR BLOG
• ventajas sobre el emplearlas dentro del gel
pueden incubarse fácilmente con
anticuerpos para la detección de
proteínas específicas
Son más rápidas de teñir y desteñir
Se detectan cantidades menores
de proteínas se concentran en la
superficie
Las membranas más fáciles de manipular
que el gel
Una membrana que se emplea es la
NITROCELULOSA
cuando se requieren soportes más
robustos Reutilizar NYLON
bloquean con mas dificultad.
Las membranas de PVDF
gran capacidad de unión a proteínas y
gran resistencia mecánica más
utilizada.
las membranas son hidrofóbicas
requieren un tratamiento previo
con metanol antes de
sumergirlas en soluciones acuosas
1. INMOVILIZACIÓN DE PROTEÍNAS SOBRE LA MEMBRANA, GENERALMENTE MEDIANTE ELECTRO-
TRANSFERENCIA.
2. Bloqueo o saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no
específica de anticuerpos.
- Riesgo de backround
- Proteínas no específicas
3. Incubación del 'blot' con anticuerpos primarios contra la/s proteína/s de interés.
- Unión
- Respuesta inmune
- Incubación en disolución
- 30 min a una noche entera
4. INCUBACIÓN DEL ¨BLOT¨ CON ANTICUERPOS SECUNDARIOS, O REACTIVOS QUE ACTÚAN DE LIGANDO PARA EL ANTICUERPO PRIMARIO UNIDO A ENZIMAS U OTROS MARCADORES.
5. SISTEMA DE REVELADO DELAS BANDAS DE PROTEÍNAS MARCADAS CON EL COMPLEJO DE ANTICUERPOS.
ELECCIÓN DEL SISTEMA DE RELEVADO
6. LAVADO DE MEMBRANA
Western Blot
Se usa principalmente para determinar la presencia o ausencia de una proteína concreta en una muestra, los niveles y tamaño de este.
Enfermedades inflamatorias
Aplicación
Prueba del
VIH
Enfermedades infecto
contagiosas
Enfermedades de citoquinas en modelos
experimentales
Factores de crecimiento
Proteínas de
secreción
Técnicas relacionada
s
Detección en el propio gel
(“UnBlot® In-Gel Detection”) Far-Western
Blot Detection
Permite la detección de proteínas que no se transfieren con eficiencia desde el gel a la membrana
• Evita las perdidas de proteínas durante el proprio paso de transferencia
Su utilización es para la búsqueda de interacciones entre proteínas.
Utiliza una proteína marcada en lugar de un anticuerpo como sonda en la membrana
Western Blot
Ventajas
Desventajas
Sensibilidad:• Detecta un mínimo de
0,1ng de proteína de una muestra
Alto costo:• Costo individual de
anticuerpos marcados, analistas y equipos de laboratorio
Especificidad:• Detección del tamaño
de la proteína• Especificidad antígeno –
anticuerpo• Detector selectivo de
una proteína
Cuestiones Técnicas:• Requiere de
precisión • Un pequeño error
del reactivo es desastroso
Procedimiento
• Electroforesis en gel de poliacrilamida para separar las proteínas de la muestra
Se realizará un SDS-PAGE en un gel 7%.
Ejemplo Western Blot
10 muestras conteniendo 1 µl de diluciones 1/2 de suero de ratón, partiendo desde una dilución 1/10.
Retirar el gel entre los vidrios con cuidado
y realizar un lavado con TBS.
En un tupper colocar el transfer buffer 1 x frío con metanol
colocar el cassette
esponjas
el papel de filtro.
Activar la membrana con metanolincubar 15 segundos
5 lavados con agua destilada.
Colocar en el tupper preparado
Armar el cassette
Controlar que no queden burbujas entre los
elementos colocados ,el aire impide la transferencia.
Cerrar el cassette y colocarlo en la cuba con más transfer buffer y el
refrigerante.
.
Correr a 37 mA durante 30 minutos en agitación.
Teñir las membranas con rojo ponceau por
30 segundos
Lavar el colorante con H2Od hasta ver las bandas
Dejar en solución de bloqueo (5% de leche
en polvo) 30 min a temperatura ambiente.
Realizar 2 lavados de 30 segundos con TBS.
Incubar las membranas con 5 ml del anticuerpo marcado con biotina ,durante 45 minutos a 37°C en agitación. Realizar 3 lavados de 3 minutos con TBS-T. Incubar las membranas con streptoavidina-peroxidasa durante 20 minutos a 37°C con agitación.
SOLUCIÓN 1: SOLUCIÓN 2 : 100 µL DE LUMINOL 6,1 µL DE H2O2 44 µL DE ÁCIDO P-CUMÁRICO 1ML DE TRIS-HCL 1M PH 8.5 1 ML DE TRIS- HCL 1M PH 8.5
LLEVAR A VOLUMEN FINAL 10 ML COM H2O
Para revelar mediante quimioluminiscencia(luz) se prepara dos soluciones en
tubos diferentes correctamente rotulados.
En obscuridad:
Unir ambas soluciones y colocar la membrana
asegurando que el líquido cubra perfectamente toda la
membrana.
Incubar durante 3 minutos.
Retirar la membrana y colocarla dentro del
cassette.
Colocar la placa fotográfica y revelar.
La calle 1 corresponde al control positivo
RESULTADO:
Se observa que para la proteína indicada con la flecha, el resultado fue positivo
por lo tanto es proteína está presente en la célula HeLa.
CONCLUSIONES Western Blot es una técnica analítica usada para detectar una proteína específica en un extracto
crudo, mediante el
uso de anticuerpos
Las proteínas ya separadas
son transferidas a una membrana
de nitrocelulosa
El procedimiento comienza con electroforética
en gel de poliacrilamida para separar las proteínas
de la muestra ,en
nuestro ejemplo el
resultado fue positivo
Gracias