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Webinar
Nuevos desarrollos
tecnológicos para el
Screening por LCMS Mayor productividad y confianza en el screening
Agilent Webinar
April 19, 2013
Jaume C. Morales
Agilent Technologies
Especialista de Producto
19 Abril de 2013
11:00h AM
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
Agilent Webinar
April 19, 2013
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
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April 19, 2013
Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
OBJETIVOS
Técnica analítica para detectar la presencia o ausencia de sustancias generalmente a nivel de trazas o bajos niveles de concentración.
Los recientes desarrollos de la espectrometría de masas permiten que el análisis de contaminantes a nivel de trazas resulte una tarea menos laboriosa, más exacta y de mayor confianza.
La legislación europea establece regulaciones para métodos analíticos basados en espectrometría de masas como herramienta de detección reconociendo su potencial de sensibilidad y confianza.
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April 19, 2013
Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
TENDENCIAS
Las entidades reguladoras establecen el listado de compuestos a controlar así como sus límites máximos.
Sin embargo, éstas listas van incrementando por razón de los contaminantes emergentes, nuevos estudios así como por los límites más exigentes.
Esta mayor exigencia en número de sustancias a tener en cuenta y mayor sensibilidad obliga a buscar herramientas que permitan un mayor rendimiento.
Hoy en día coexisten principalmente dos enfoques atendiendo a la técnica de espectrometría de masas:
Análisis Dirigido - Análisis No Dirigido
Estos dos enfoques pueden ser únicos o complementarios y cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes.
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April 19, 2013
Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
REQUISITOS
Cuando el objetivo es buscar el MAYOR RENDIMIENTO de la técnica de screening, es importante tener en cuenta diferentes factores :
• Preparación de Muestra. Lo más simple y mayor recuperación posible.
• Cromatografía. Rapidez, rendimiento y robustez.
• Espectrometría de Masas. Sensibilidad, confianza y reproducibilidad.
• Software de tratamiento de datos. Rápido, inteligente y sencillo.
• Review. Claro, interactivo y sencillo.
• Reporting. Disponibilidad de Plantillas ajustadas al tipo de informe.
Todos éstos factores son importantes, todos SUMAN
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April 19, 2013
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
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¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC? El poder de separación de elevadas velocidades lineales
Cromatogramas con escala de tiempo alineada a primer y último pico I.D. & I.M - Waldbronn 5/2009
Columna: ZORBAX SB-C18 2.1 x 100mm 1.8 µm
Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 a 40ºC Cromatogr. A: 0.5mL/min en 3.0min // B: 0.833mL/min en 1.8min
Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens).
P máx. grad. A= 590bars. B= 905 bars
A 0.5mL/m gr.. 3.0min
K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
FxTg = 0.5x3 = 0.833x1.8 = 1.5
B 0.833mL/m
gr. 1.8min
3min Si el producto de Flujo x Tgrad se mantiene
constante el poder de separación no variará (utlizando la misma columna y sin variar los %
solvente orgánico)
1.8min
↑Flujo: Reduce tiempo análisis y mejora
capacidad de separación en gradientes
A 0.5mL/m gr.. 3.0min
B 0.833mL/m
gr. 1.8min Columnas UHPLC permiten subir el flujo para:
- Reducir tiempos (manteniendo Rs)
- Aumentar resolución (sin sacrificar tiempo)
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• No perder eficacia al aumentar el flujo.
¿Qué se Requiere para Trabajar a Velocidades
Lineales Elevadas? +
EFI
CA
CIA
-
S.T.M.: Sub Two Microns
UHPLC
HEPT = A+ B/u + C u
4.6mm d.i.
UHPLC permite velocidades elevadas sin pérdida de rendimiento
• Poder trabajar a flujos y presiones elevadas.
∆P = f (η .u .L / dp2)
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UHPLC – Agilent Infinity Series
600 bar
1200 bar
Máxima Presión
(Resolución) RESOLUCION
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Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC
www.agilent.com/chem/1200
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200
400
600
800
1000
1200
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1290 Infinity
1290 Infinity UPHLC: Compatible con
cualquier HPLC y UHPLC del mercado
bar
ml/min
Standard LC
Vendor A 1.7µm columns
Agilent RRLC 1.8µm columns
Vendor B 1.9µm columns
Vendor C
Vendor D
1290 Infinity le permitirá la máxima reducción de sus tiempos de
análisis y/o aumento de la resolución de sus aplicaciones
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1200
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1290 Infinity – ¿Qué aporta al mundo del UHPLC?
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1290 Infinity NO solo es un equipo capaz de proporcionar
unos rangos mayores de Flujo y de Presión…
1290 Infinity es un equipo INNOVADOR
1290 Infinity incorpora grandes avances en todos sus
módulos, que una vez más, marca la diferencia tecnológica.
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1290 Infinity Bomba Binaria: nuevo diseño La siguiente generación en Tecnología de Bombas UHPLC
Mezclador
“Jet Weaver“
µ-Desgasificador
Válvula de
Purga
automática
Canal
B Canal
A
Válvula de selección
de 4 disolventes
Gradientes binarios
Pistones de
Carburo de
Silicio
Bombas
de alta
resolución
Alta velocidad y resolución
1200 bar @ 2.0 mL/min
1000bar @ 3.5ml/min
800 bar @ 5.0 mL/min
Volumen muerto: 10 µl / 45 µl
Amortiguador electrónico de pulsos
Procesador de doble núcleo
dedicado al control de pulsos
Motores de 300 picolitros
por paso (0.0003µL)
Largos intervalos de mantenimiento
Corrección Automática Fugas
> 150 Litros de disolvente
Automatismo
Purga automática
4 Motores de alta
precisión:
independientes
para cada pistón
Intercambiador
de calor
multicapa
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Precision Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 3 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 8 Peak 9
% RSD RT 0.016 0.0077 0.0052 0.0058 0.0058 0.0054 0.0059 0.0057 0.0080
% RSD Area
0.5 µl 0.40 0.39 0.43 0.47 0.40 0.46 0.44 0.52 0.56
Page 15
RT RSD = 0.005% !!!
Phenone Standard, 10 Consecutive Runs
2.1 x 50mm RRHD SB C18, 1.8µm
1.2ml/min, 0.5ul, 40C
80Hz, 245/10nm, REF 360/80nm
5 - 95% ACN in 0.5min
1290 Infinity UHPLC:
Precisión del Tiempo de Retención
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Agilent 1290 Infinity
El más Versátil UHPLC:
Binario o Cuaternario
• Cualquier tipo de columnas:
UHPLC, LC, Solid Core, Monolitics,…
• Columnas de 1 a 8 mm d.i..
• Longitudes hasta 25cm x1.8µm.
• UHPLC, HPLC, UFLC…
• ….
• ..
•.
Infinitas Posibilidades !!
Agilent 1290 Infinity UHPLC Poder de separación por unidad de tiempo. Ejemplo Repetibilidad en condiciones extremas
Columna: ZORBAX UHPLC SB-C18 2.1 x 50mm 1.8 µm Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 en 30 segundos 2.4mL/min a 80ºC P.máx. Grad.= 1060 bars
Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens)
min 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
mAU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tiempos RSD% : 0.01 – 0.03%
Áreas RSD% : 0.03 - 0.4% (6 inyecciones de 1µL)
I.D. & I.M - Waldbronn 5/2009
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0901.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0902.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0903.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0904.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0905.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (1290 INFINITY\DAY3_B___ 2009-05-28 16-23-46\002-0906.D)
Pk Wd = 0.004-0.005min
1.5 seg.
0.4min
Condiciones Extremas: • Muy elevada velocidad
(eq. 12mL/min en col. 4.6mm d.i.)
• Elevada presión: 1060bars
• Elevada temperatura: 80ºC
• Pequeño vol. inyec.: 1µL
• Gradiente muy rápido: 30s.
• Picos solapados
• ….
*RSD en tiempos para picos K’>0
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Muestra de tranquilizantes
Columna: Porosa superficial
Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um
Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar Gradiente 2-92% ACN en 0.4min
T= 80 °C
0.095sec PW
0.140secPW
Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de
separación con todo tipo y marcas de columnas
Columnas Superficialmente Porosas:
permiten muy elevadas velocidades lineales
con elevada resolución y menor presión
0.5 s
Núcleo
Sólido
1.7um
} 0.5µm
2.7µm
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Agilent 1290 Infinity UHPLC Poder de separación con todo tipo de diámetros y flujos. Ejemplo Gradiente Agua/Metanol
Columna: ZORBAX RRHH (600bars) SB-C18 4.6 x 50mm 1.8 µm
Gradiente: MeOH/H2O 30/70 a 100/0 en 1.71min
3.5mL/min a 80ºC Presión. máx grad.: 590bars
Inyección: 5µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens)
I.D. & I.M - Waldbronn 5/2009
min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
mAU
0
20
40
60
80
100
120
140
T0
1
2
3
4
5
6
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0501.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0502.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0503.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0601.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0602.D)
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0603.D)
min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
mAU
0
100
200
300
400
500
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0501.D)
T0
1
2
3 4 5
6
PMP1, PMP1B, Pressure
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0502.D)
PMP1, PMP1B, Pressure
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0503.D)
PMP1, PMP1B, Pressure
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0601.D)
PMP1, PMP1B, Pressure
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0602.D)
PMP1, PMP1B, Pressure
DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,40 (002-0603.D)
PMP1, PMP1B, PressureTiempos RSD% : 0.01 – 0.05% Áreas RSD% : 0.10 - 0.34% (6 inyecciones de 5µL)
6 perfiles
presión
1ª iny. serie
1.4min
U.F.L.C.
con columnas de
d.i. 4.6mm
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800
1000
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0 1 2 3 4 5
Agilent 1290 Infinity UHPLC: Rango
Potencia con Columnas TP 2.1mm d.i.x 1.8um
50 x 2.1 mm
100 x 2.1 mm
150 x 2.1 mm
250 x 2.1 mm
STM = Sub-2um SP = Superficially Porous
TP = Totally Porous
H2O/ACN, 40 °C
bar
ml/min
0.45 mL/min 40ºC
50 x2.1mm
x 1.8µm
40ºC
ZORBAX RRHT SB-C18
2.1 x 50mm x 1.8µm
H2O/ACN
2.4ml/min
T=95 °C
560bar RRLC
50 x2.1mm
x 1.8µm
95ºC
1290 infinity permite usar columnas 250mm x 1.8µm
250mm
40ºC
10 -50
100x2.1mm
40ºC
1290 Infinity Bomba Cuaternaria
Diversas innovaciones que permiten el alto rendimiento
4-channel
Degasser
MCGV (Multi-
Channel-Gradient-
Valve) Inlet-Weaver Pump Head
Multi-Purpose-
Valve
Switchable Jet
Weaver Mixer
In-line Filter
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April 19, 2013
Rango de Potencia de la Bomba Cuaternaria
1290 Infinity
2.0 5.0 10.0
250
800
1200
p [bar]
[ml/min]
= Bomba binaria
Adicional
Bomba Cuaternaria
(HPLC semi-preparativa)
600
1000
1.0
Bomba
Cuaternaria
Agilent 1290 Infinity
• 1200 bars: 0-2mL/min
• 800 bars: 5mL/min
• 5-10mL/min hasta 250 bars
Bomba Cuaternaria
Competidor
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April 19, 2013
Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una
bomba cuaternaria con mezclado a baja presión:
1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados.
La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290
Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!!
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April 19, 2013
La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290
Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!!
Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una bomba
cuaternaria con mezclado a baja presión:
1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados.
2. Disponer de una bomba inteligente – Amortiguación Activa – con una
bomba de alta resolución (~300 pL por paso del motor)
3. Nuevo mezclador InletWeaver basado en la super-eficiente tecnología Jet
Weaver:
La Bomba Cuaternaria 1290 Infinity ofrece la mayor exactitud y precisión en
todo tipo de aplicaciones.
Premezcla el eluyente
antes de entrar en el
cabezal de bombeo
Mezclador opcional
situado después del
cabezal de bombeo (sólo para condiciones
muy críticas- p.e. TFA)
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April 19, 2013
min 2 4 6 8 10 12
mAU
0
20
40
60
80
100
120
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
Peak1 Peak2 Peak3 Peak4 Peak5 Peak6 Peak7 Peak8 Peak9
SD data Especificación SD < 0.01min
0,002min
0,0003min
SD = 0,001min
1290 Infinity Cuaternaria–Análisis Gradientes
Precisión Composición
1/5
1/10
1/20
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April 19, 2013
El mayor desarrollo tecnológico en la serie 1290 es que apenas hay diferencias en la
calidad y robustez de la mezcla entre ambas bombas.
La principal diferencia entre ambas, por el propio diseño de un cabezal o dos, es el
Volumen muerto interno.
Esto hace que la única limitación de una bomba 1290 cuaternaria sean análisis de
gradiente Ultra-rápido :
P.e. Gradiente de 0-100% en 3 min. High throughput (Farma, Clinical,…)
Serie 1290 Infinity. Binaria - Cuaternaria
Idoneidad del tipo de bomba
BINARIA CUATERNARIA
Precisión de Flujo ≤0.07 % RSD ≤0.07 % RSD
Exactitud de Flujo ±1 % or ± 10 μL/min ±1 % or ± 10 μL/min
Precisión de Composición <0.15 % RSD, or 0.01
min
<0.15 % RSD, or 0.02 min
Exactitud de Composición ±0.35 % absolute ±0.40 % absolute
Precio - - 77% BIN
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April 19, 2013
Agilent 1290 Infinity
UHPLC/MS
La mejor capacidad de
separación para mejorar
sus resultados en
LC/MS
Una buena
separación
ayuda a
minimizar la
“supresión”
de
Ionización
en LC/MS
30:70 agua/metanol, 0.2 % ácido acético
Inte
nsity
, cps
Difenhidramina
m/z 256.17
Ketoprofeno
m/z 255.10
Time, min
0.0
6.0e4
1.2e5
1.8e5
2.4e5
3.0e5
3.6e5
4.2e5
4.8e5
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40
Difenhidramina
m/z 256.17
0.0
6.0e4
1.2e5
1.8e5
2.4e5
3.0e5
3.6e5
4.2e5
4.8e5
Inte
nsity
, cps
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Time, min
Ketoprofeno
m/z 255.10
5:95 agua/metanol, 0.2 % ácido acético
1/7 respuesta (-85%)
Una buena cromatografía
puede mejorar
considerablemente la
sensibilidad y robustez de
los resultados por LC/MS
La Importancia de una Buena Separación incluso con LC/MS Altamente Selectivos
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April 19, 2013
1290 Infinity UHPLC + 6460 QQQ Jet Stream Productividad: Análisis 250 Pesticidas en 8 min - Dynamic MRM.
Columna 100x2,1mm x 1.8µm Zorbax Eclipse Plus C18
500ppt, dynamic MRM Retention Time Window = 12 sec
Peak widths ~ 1 second
Zorbax Eclipse Plus C18
2.1 x 100mm (1.8μm)
April 19, 2013 Agilent Webinar
1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: Fast UHPLC
“Screening” 250 Pesticidas en 90 segundos.
April 19, 2013 Agilent Webinar
Fenpyroximate E Mass [M+H]+ = 422.20806 Resolution = 38636 -0.25ppm
1290/6540 90seg análisis 250 pesticidas (125pg on-column)
MS con masa exacta
1-naphthol Mass [M+H]+ = 145.06489 Resolution = 24909 0.06 ppm
Spinosad A Mass [M+H]+ = 732.4687
Resolution = 47094 -0.77ppm
90s
LC/MS-TOF(/QTOF): “Screening” de cualquier compuesto ionizado
6540-QTOF
Resolución
espectral: 25-47K
2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C18
1.2 mL/min, 60 ºC
1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: 10 ppb Pesticidas
en Pimiento Rojo en 90 segundos
April 19, 2013 Agilent Webinar
2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C18
1.2 mL/min, 60 ºC
1
Counts vs. Acquisition Time (sec) 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88
1a
1b
3a 4a
4b
2a
2b
3b
Name RT Mass Mass (Tgt) Diff (Tgt, ppm) Score (Tgt)
1a tricyclazole 0.652 189.036175 189.036068 0.57 98.10
1b propazine 0.929 229.109356 229.109423 -0.29 97.50
2a diethofencarb 0.953 267.146937 267.147058 -0.45 85.49
2b cyprodinil 0.936 225.126620 225.126598 0.10 98.82
3a cyproconazole 0.925 291.114106 291.113840 0.91 97.92
3b paclobutrazol 0.923 293.129448 293.129490 -0.14 96.74
4a tetraconazole 0.972 371.021290 371.021530 -0.65 99.45
4b azoxystrobin 0.957 403.116637 403.116821 -0.45 99.19
50 pg on-column
Exactitud m/z (promed. abs. ) : 0.45ppm
90s
90s
4 seg.
10 ppb’s
10 ppb’s
36
Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC
www.agilent.com/chem/1200
April 19, 2013 Agilent Webinar
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
Agilent Webinar
April 19, 2013
La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos enfoques :
• Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar.
• Más sensible (*)
• El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la velocidad del MS.
• Sin capacidad de determinar NO esperados.
• Sin capacidad de análisis retrospectivo.
• NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS.
• El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado).
• La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución.
• La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o librerías de los posibles compuestos a identificar
• Menos sensible (*)
Dos enfoques de Screening
38
(*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF
Agilent Webinar
April 19, 2013
Dos enfoques de Screening, COMPLEMENTARIOS
• El barrido o screening nos permite confeccionar un listado de los compuestos que
estan presentes por técnicas de IDENTIFICACIÓN.
• La Cuantificación y confirmación posterior de SÓLO aquellos compuestos que
dieron positivo permite obtener unos resultados más sensibles, reproducibles y
robustos.
40
Screening Confirmación Cuantificación
Agilent Webinar
April 19, 2013
Screening Cuantificción
Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC
Agilent LC/TOF/QTOF
El TOF/QTOF
detecta todo
aquello que se
ionice en la fuente
Los compuestos
se identifican por
masa exacta
Agilent Webinar
April 19, 2013
Cuantificción
Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC
Agilent LC/TOF/QTOF
Confirmación Cuantificación
1290 Infinity UHPLC
Agilent 6400 LC/QQQ
El TOF/QTOF
detecta todo
aquello que se
ionice en la fuente
Los compuestos
se identifican por
masa exacta
Screening
Agilent Webinar
April 19, 2013
Nuevas herramientas
• El objetivo del desarrollo de estas nuevas herramientas es
dotar de mayor confianza a los resultados.
• El Screening puede abordarse desde dos enfoques
complementarios, “Dirigido” y “NO Dirigido” y Agilent ha
desarrollado herramientas para ambos.
• La mayor confianza viene determinada por una mayor
capacidad de confirmación de positivos y negativos.
43
Agilent Webinar
April 19, 2013
Nuevas herramientas
• El enfoque Dirigido basa la confirmación en la respuesta relativa de una 2a o 3a MRM que en demasiadas ocasiones la matriz desvirtúa por interferencias o en técnicas de atrapado lentas que deterioran la cuantificación.
Requiere una herramienta alternativa de mayor confianza en la confirmación : tMRM
• El enfoque NO Dirigido basa la confirmación en la masa exacta y perfil isotópico pero en muchas ocasiones NO es suficiente pues existen compuestos isobáricos que dan la misma ID.
Requiere una herramienta alternativa de mayor confianza en la confirmación : All Ions
44
Agilent Webinar
April 19, 2013
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
Agilent Webinar
April 19, 2013
DMRM y tMRM
aplicaciones
Screening Dirigido
46
Mayor confianza en la confirmación
Agilent Webinar
April 19, 2013
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Nº de Transiciones Concurrentes =
Rt
Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.
Tiempo de Ciclo
MRM dinámico
Agilent Webinar
April 19, 2013
Time >>>
Abundance >
>>
Concurrent
Compounds
MRM dinámico - Simulación
Agilent Webinar
April 19, 2013
¿Para qué sirve el triggered MRM? Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting
49
Enfoque de barrido:
Barrido de la huella del compuesto
Estrategia tMRM:
Foco en las características (fragmentos)
del compuesto
Dos posibles escenarios:
- Confirmación de positivos con información adicional
(confirmación espectral)
- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz
Mayor confianza en la confirmación
Agilent Webinar
April 19, 2013
50
Triggered MRM (tMRM) Analysis
Threshold
MRM Secundarias
“Triggered”
MRMs Primarias (bajo threshold)
Triggered MRM (sobre threshold)
Compound Precursor Product
Analyte 1 334.0 145.0
Analyte 1 334.0 117.0
Compound Precursor Product
Analyte 1 334.0 145.0
Analyte 1 334.0 117.0
Analyte 1 334.0 132.1
Analyte 1 334.0 105.1
Analyte 1 334.0 91.1
Analyte 1 334.0 76.0
Analyte 1 334.0 119.0
Mayor confianza en la confirmación
Agilent Webinar
April 19, 2013
tMRM Scanning
51
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
tMRM Scan < 50ms
Acquisition Time (seconds)
tMRM Scans
Compatible con UHPLC
buen perfil cromatográfico +
buena cuantificación
Trigger
tMRM
Mayor confianza en la confirmación
Agilent Webinar
April 19, 2013
0 .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0
_Trap Product Ion Scan = 200ms
Acquisition Time (seconds)
Scanning por Atrapado
52
Trigger
Full Scan
Full Scan
Full Scan
Full Scan
Requiere analisis más largos con
picos más anchos
Perfil de pico pobre,
cuantificación no
reproducible
Agilent Webinar
April 19, 2013
53
Triggered MRM (tMRM) Analysis
Threshold
MRM Secundarias
“Triggered”
MRMs Primarias (bajo threshold)
Triggered MRM (sobre threshold)
Compound Precursor Product
Analyte 1 334.0 145.0
Analyte 1 334.0 117.0
Compound Precursor Product
Analyte 1 334.0 145.0
Analyte 1 334.0 117.0
Analyte 1 334.0 132.1
Analyte 1 334.0 105.1
Analyte 1 334.0 91.1
Analyte 1 334.0 76.0
Analyte 1 334.0 119.0
Mayor confianza en la confirmación
Agilent Webinar
April 19, 2013
54
tMRM Product Ion Spectrum
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
334.2 171.1
145.0
132.1
117.0
105.1 91.1 76.0
tMRM Product Ion
Spectrum
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80
76.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100
91.1
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120
105.1
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120
117.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 100 140
132.1
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120
119.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 100 140 180
145.0 x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0 100 140 180
147.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120 140 160 180
171.1
334 > 76 334 > 91 334 > 105 334 > 117 334 > 119
334 > 132 334 > 145 334 > 147 334 > 171
Agilent Webinar
April 19, 2013
tMRM Library Searching
Tebufenpyrad Standard 50 ppb
Library match score: 96.75
Agilent Webinar
April 19, 2013
La Solución Analítica Ideal
para compuestos conocidos
tMRM
Cualitativo Coste
Efectivo Cuantitativo
POINT
POINT
POINT
POINT
POINT
POINT
Fast Cycle Time
Single Instrument
Accurate
Sensitive
High Throughput
Short Run Time
Product Ion Spectrum
Library Searching
Confirmation
Page 56
Mayor confianza en la confirmación
Agilent Webinar
April 19, 2013
Funciones tMRM
Funciones de Triggering en MH Acquisition
Permiten centrar los tMRM en el centro del pico
57
Agilent Webinar
April 19, 2013
Acephate as example
• Entrance delay 0
• Trigger delay 0
• Trigger Window 0.5
• Threshold 500
• Repeat 3
59
Agilent Webinar
April 19, 2013
Acephate as example
• Entrance delay 3
• Trigger delay 0
• Trigger Window 0.5
• Threshold 500
• Repeat 3
60
Agilent Webinar
April 19, 2013
Acephate as example
• Entrance delay 2
• Trigger delay 2
• Trigger Window 0.5
• Threshold 500
• Repeat 3
62
Agilent Webinar
April 19, 2013
Acephate as example
• Entrance delay 2
• Trigger delay 1
• Trigger Window 0.5
• Threshold 500
• Repeat 5
63
Agilent Webinar
April 19, 2013
Nuevos parámetros de tMRM
También el Optimizer puede usar tMRM para detectar todas las
transiciones de un compuesto
64
Agilent Webinar
April 19, 2013
Nuevos parámetros de tMRM
Funciones Triggering en MH Qual
Fácil navegación de compuesto a compuesto
67
Agilent Webinar
April 19, 2013
tMRM
• Ejemplo de aplicación – uso del tMRM
• Comparación con el dMRM
• Ejemplos con matrices reales
68
Agilent Webinar
April 19, 2013
Parámetros de método
UHPLC method
MS method
Electrospray ionization
Triggered MRM: 2 MRM primarias más 8 MRM adicionales de confirmación
Dynamic MRM: 2 MRM por compuesto
71
UHPLC column Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD
2.1 x 150 mm, 1.8 µm @ 30°C
Mobile phase A: 5 mM NH4 formate + 0.1% formic acid
B: 5 mM NH4 formate + 0.1% formic acid in methanol
Gradient
program
Min % B
0 5
0.5 5
3.0 40
17 100
19 100
19.1 5
Stop time 22 min
Flow rate 0.40 ml/min
Injection volume 3 µl
Agilent Webinar
April 19, 2013
0
20
40
60
80
100
120
< 0.1 0.1 to 0.25 0.25 to 0.5 0.5 to 1 >1
Nu
mber
of
pest
icid
es
Limit of quantitation in µg/kg
Solvent
Lemon extract
Validación del método – Límites de cuantificación
73
Agilent Webinar
April 19, 2013
Rendimiento cuantitativo - Oxamyl
75
Curva de calibración dMRM Curva de calibración tMRM
Agilent Webinar
April 19, 2013
y = 0.9987x
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000
Calib
rati
on s
lopes
Trig
gere
d M
RM
Calibration slopes Dynamic MRM
Rendimiento cuantitativo - Comparación
76
Pendientes de la curva de calibración para todos los pesticidas en el método
Agilent Webinar
April 19, 2013
Muestra real– Napropamida en extracto de limón
77
Acquisition Time (min)
12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 13 13.1 13.2 13.3
Counts
4 x10
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
Napropamid: Lemon spike 1 µg/kg.d: +ESI MRM: 272.2 -> 58.1 , 272.2 -> 171.1
Ratio = 65.3 (100.9 %)
Cromatograma MRM de las 2 transiciones primarias a 1µg/kg
Agilent Webinar
April 19, 2013
+ MRM (14.865-15.031 min, 13 scans) (334.2 -> * …
Mass-to-Charge (m/z)
50 100 150 200 250 300
C o u n t s
3 x10
-1.4
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2 117.0
117.0
147.1
145.0 91.1
76.0
57.1 334.2
Lib Match Score=55.9
Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de
gengibre
78
Reference spectrum
Acquisition Time (min)
14.6 14.8 15 15.2 15.4
C o u n t s
5 x10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
334.2 -> 117.0 , 334.2 -> 145.0
Ratio = 46.9 (209.9 %)
Agilent Webinar
April 19, 2013
Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de
gengibre
79
Reference spectrum
Agilent Webinar
April 19, 2013
Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de
camamilla
80
Reference spectrum
Acquisition Time (min)
9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 10
Co
un
ts 4x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0
Ratio = 40.3 (204.3 %)
Agilent Webinar
April 19, 2013
Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de
camamilla
81
Reference spectrum
Acquisition Time (min)
9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8
Co
un
ts 4x10
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0
Ratio = 19.8 (100.6 %)
Agilent Webinar
April 19, 2013
Library match score
Pesticide Matrix Target compound Matrix interference
Dichlovos Lemon 94.5 % 78.1 %
Thifensulfuron-methyl Green Tea 96.6 % 71.5 %
Tebufenpyrad Ginger 99.8 % 55.9 %
Tebuthiuron Chamomile 97.8 % 58.0 %
Imazalil Chamomile 99.8 % 58.1 %
Terbutylazin Chamomile 99.6 % 82.1 %
Muestras reales– ejemplos por interferencia de
matriz
Agilent Webinar
April 19, 2013
Compounds at a glance Eficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados
83
Agilent Webinar
April 19, 2013
Resumen del tMRM
84
• El Triggered MRM epermite confirmación espectral a niveles de LOQ
• Mismo rendimiento cuantitativo que los métodos MRM tradicionales
• Integration única con las nuevas triggered MRM databases y librerías
• La comprobación automática con la librería de espectros permite una eficaz
revisión de los resultados y “etiquetado” de los casos sospechosos.
• Utilizando una sola transión primaria en tMRM, nos permite afrontar un método
con mayor número de compuestos en multiresiduo.
Innovation Tour
19 de abril de 2013
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
Agilent Webinar
April 19, 2013
Fundamentos de
All Ions y aplicaciones
Screening NO dirigido
87
Mayor confianza en la confirmación
en Alta Resolución
Agilent Webinar
April 19, 2013
All Ions MS/MS AIM para mayor confianza en la identificación
La mejor solución del mercado para screening en alimentación, medio ambiente y forensica/toxicología
• Exclusivo de Agilent:
– Librerías de espectros MS/MS de masa exacta para identificar los fragmentos
– Coelution score para confirmar que los fragmentos pertenecen al ión precursor
• Re-procesado de los datos para desconocidos sin re-adquisición
Análisis retrospectivo
• Rápida incorporación de desconocidos a la librería de MS/MS para incluir en el screening
• Rápida creación del método cuantitativo para screening
multiresiduos
88
Agilent Webinar
April 19, 2013
Conforme a los requisitos de screening SANCO 12495
– Al menos 2 iones producto
– Confirmación final con un compuesto referencia
Agilent ofrece un flujo de trabajo totalmente desarrollado en All Ions MS/MS para la confirmación del compuesto y la creación del método cuantitativo.
Para TOF y QTOF
Características:
– Fácil y simple método de Adquisición (Full Scan)
– Identificación dirigida del compuesto usando las librerías Agilent de espectros MS/MS
– Confirmación cromatográfica de los iones producto (coelution score)
– Rápida creación del método Quant. Automáticamente selecciona dos iones producto de alta calidad para cada compuesto, eliminando la tediosa tarea de crearlo manualmente.
El usuario dispone de forma rápida y segura de hacer la cuantificación dirigida de sus compuetos
All Ions MS/MS – Screening Superior
89
Agilent Webinar
April 19, 2013
Canal Baja energía
All Ions MS/MS – Screening Superior
90
Agilent Webinar
April 19, 2013
Adquisición en doble canal de Energía (TOF /QTOF) :
Ión Molecular :
Masa Exacta
Perfil Isotópico
Fragmentación
No Fragmentación
MS
MS/MS
Sucesión Energía Baja/Alta
espectro a espectro
Max. 50 spectros / segundo
Fragmentos : Espectro MS/MS Masa Exacta
Canal Alta energía
Cuantificación del
compuesto
encontrado con
información adicional
de fragmentos
Flujo de trabajo de All Ions MS/MS Dirigido
Adquisición PCDL Qual Quant
MassHunter Acquisition
Voltage
Alto/bajo
de Fragmentor
en TOF y Q-TOF
Librería de
pesticidas
(~450-500
compuestos con
espectros)
Librería Forensics
/Tox (2720
compuestos con
espectros)
Energía de Colisión
Alta/Baja
en Q-TOF
“Find by Formula”
en MS canal baja Ɛ
“EICs” de los
fragmentos en el canal
MS de alta Ɛ
Correlaciona
fragmentos cualificados
con el compuesto
Busca
Extracción
Cualifica y confirma
fragmentos
Exporta
Alinea EIC’s de los
fragmentos con EIC del
ión padre
Targets
m/z, especies
iónicas
Quant
Report
Qual
Report
91
Agilent Webinar
April 19, 2013
Características de All Ions MS/MS :
Facil creación del método de Adq.
En el método de MassHunter Acquisition tan sólo hay que
especificar dos canales de diferente energía. Un “low channel”
(e.g. sin Collision Energy) y un “high channel” (e.g. CE = 20).
No hay necesidad de entrar parámetros para cada compuesto
como en un QQQ. ¡Mucho más fácil y rápido!
92
Al crear un
Experiment # nos
permite crear
canales de baja y
alta energía para
Frag y CE
Agilent Webinar
April 19, 2013
Ejemplo: Trazodone All Ions MS/MS
93
Espectro de baja Energía
Espectro de alta Energía
Agilent Webinar
April 19, 2013
Características de All Ions MS/MS : Targeted
Identification Using Agilent’s PCDLs
Personal Compound Database and Libraries (PCDLs) contiene
espectros MS/MS de masa exacta. All Ions MS/MS utiliza los
product ions del espectro para confirmar la identificación de los
iones padre — Resultado : ¡menor nº de falsos positivos!
.
Aplicación PCD PCDL
Forensics / Tox 7360 compuestos Más espectros para 2720
compuestos
Pesticides 1609 compuestos Más espectros para 500
compuestos
Veterinary Drugs ~1000 compuestos Más espectros para ~500
compuestos
Metabolomics METLIN rev. B.05.00
(~50,000 compuestos)
METLIN rev. B.05.00 (Más
espectros para ~9000
compuestos)
94
Agilent Webinar
April 19, 2013
Características de All Ions MS/MS : Confirmación Cromatográfica de los Product Ions
95
Solapamiento de los
cromatogramas de Baja
y Alta Energía
Curvas de Coelución
Los iones Precursor y
Producto coinciden
exactamente en sus
máximos.
Agilent Webinar
April 19, 2013
All Ions MS/MS in Qualitative Analysis rev. B.06.00
New panel allows easy setup of All Ions MS/MS:
96
Minimum Coelution
score
Turn on All Ions MS/MS
using the current
Formula Source PCDL
Agilent Webinar
April 19, 2013
New Compound Details View in Qual rev. B.06.00
97
Nuevas
ventanas que
muestran toda
la información
compuesto a
compuesto
Todos los
datos
pertenecientes
a un único
compuesto se
visualizan fácil
y rápidamente
Agilent Webinar
April 19, 2013
Compound results .cef file Quant method
- Accurate mass
EICs for quantifier
and qualifier
- Relative responses
- Retention times
Adduct patternReference pattern library
Import and Build Qual/Quan Method from Qual
98
MH Qual
MH Quant
Agilent Webinar
April 19, 2013
Rapid Quant Method Setup by Importing the .CEF
File from Qual
99
Precursor ions with
different fragmentor
voltages are used as
qualifiers
Agilent Webinar
April 19, 2013
Rapid Quant Method Setup by Importing the .CEF
File from Qual
100
Quant
methods with
hundreds of
compounds
can be set up
in minutes!
There is no
need to type
in the
compound
names—they
are already in
the PCDL.
Agilent Webinar
April 19, 2013
Agenda 1. Screening : Objetivos, Tendencias y Requisitos
2. UHPLC. El primer paso para el alto rendimiento ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC?
Posibilidades de la gama 1200 Infinity
Innovaciones Tecnológicas del 1290 Infinity UHPLC
3. Enfoques para el screening por LCMS
4. Herramientas para LCQQQ Screening DMRM y tMRM para mayor rendimiento y confianza
5. Herramientas para LC TOF/QTOF Screening All Ions para el Screening en alta resolución
El poder del análisis retrospectivo
6. LCMS Application Kits
Agilent Webinar
April 19, 2013
Simplify Your Startup
102
LC/MS Application
Kits
Method
Standards
On Site Training
LC Column
Databases and
Libraries
Agilent Webinar
April 19, 2013
LC/MS Application
Kits
Method
Standards
On Site Training
LC Column
tMRM Database
tMRM LC/MS Application Kits Targeted Screening with QQQ
103
Pesticides
-Test Mix: 253 compounds
-DB: 700+ compounds
-Library: 250+ compounds
Veterinary Drugs
-Test Mix: 146 compounds
-DB: 600+ compounds
-Library: 100+ compounds
Forensic Toxicology
-Test Mix: 139 compounds
-DB: 2500+ compounds
-Library: 100+ compounds
Agilent Webinar
April 19, 2013
Accurate Mass LC/MS Application Kits Untargeted Screening with TOF or QTOF
LC/MS Application
Kits
Method
Standards
On Site Training
LC Column
Accurate Mass
MS/MS Library
104
Pesticides
-Test Mix: 253 compounds
-DB: 1600+ compounds
-Library: 700+ compounds
Veterinary Drugs
-Test Mix: 146 compounds
-DB: 1000+ compounds
-Library: 600+ compounds
Forensic Toxicology
-Test Mix: 139 compounds
-DB: 7500+ compounds
-Library: 2700+ compounds
Agilent Webinar
April 19, 2013
107
Webinar
Nuevos desarrollos
tecnológicos para el
Screening por LCMS Mayor productividad y confianza en el screening
Agilent Webinar
April 19, 2013
Jaume C. Morales
Agilent Technologies
Especialista de Producto
19 Abril de 2013
11:00h AM