portal.szspraha1.czportal.szspraha1.cz/szs/portal.nsf/0/1f64730db385b295c... · web viewpříprava...

Příprava polyklonálních protilátek proti proteinu Human

Adiponectin

Absolventská práce

Eva Bače

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola

Praha 1, Alšovo nábřeží 6

Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant

Vedoucí práce: Mgr. Daria Strouhalová, PhD.

Datum odevzdání práce: 16.4.2011

Datum obhajoby: 20. - 22.6. 2011

Praha 2011

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny

jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů

informací.

Praha 5. dubna 2011

Děkuji Mgr. Darii Strouhalové, PhD. za odborné vedení a velkou pomoc při sepisování

absolventské práce. Dále děkuji Ing. Lence Veselé za pomoc s digitalizací laboratorních

výsledků a Michaele Grmolcové za technickou podporu. Děkuji také za vstřícný přístup a

možnost tuto absolventskou práci zpracovat v rámci společnosti BioVendor – Laboratorní

medicína a.s.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována ve Středisku vědeckých

informací Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo

nábřeží 6.

ABSTRAKT

Bače Eva

Příprava polyklonálních protilátek proti proteinu Human Adiponectin

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6


Absolventská práce, Praha: VOŠ a SZŠ, 2011, 79 stran

Nedávno objevený protein, lidský Adiponectin, je složen z 244 aminokyselin, je fyziologicky

aktivní a specificky exprimovaný tukovými buňkami. V krevním séru byl nalezen

Adiponectin ve formě homotrimerů, které tvoří jeho vyšší formy, komplexy. Adiponectin

působí prostřednictvím dvou receptorů, AdipoR1 (hojně exprimovaný v kosterních svalech) a

AdipoR2 (exprimovaný převážně v játrech). Hladiny Adiponectinu exprimované tukovou

tkání jsou nepřímo úměrné stupni obezity. Nízké hladiny Adiponectinu jsou spojovány

s inzulinovou rezistencí a onemocnění Diabetes Mellitus typ 2, s ischemickou chorobou

srdeční, s aterosklerózou a potenciálně i s nádorovým onemocněním. Imunizací podle

imunizačního schématu byla připravena králičí a ovčí polyklonální protilátka proti proteinu

Human Adiponectin. Následně byla zvířatům odebrána krev, ze které byly purifikovány

polyklonální protilátky metodou afinitní purifikace. Funkčnost králičí a ovčí polyklonální

protilátky byla ověřena pomocí metod jako je nepřímá ELISA, Western blot v redukčním

a neredukčním prostředí a metodou imunohistochemie.

Klíčová slova: Lidský Adiponektin, Obezita, Metabolický syndrom, Diabetes Mellitus typ 2,

Polyklonální protilátka, Western blot

ABSTRACT

Bače Eva

The Preparation of Polyclonal Antibodies against the Human Adiponectin Protein

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6


Absolventská práce, Praha: VOŠ a SZŠ, 2011, 79 stran

The Human Adiponectin is a recently discovered 244 aminoacid protein, which is

physiologically active and specifically and highly expressed in adipose cells. Adiponectin

forms homotrimers, which are the building blocks for higher order complexes found

circulating in human serum. Adiponectin acts through two receptors, AdipoR1 (abundantly

expressed in skeletal muscle) and AdipoR2 (predominantly expressed in the liver). Adipose

tissue-expressed Adiponectin levels are inversely related to the degree of adiposity. Low

serum Adiponectin levels are associated with insulin sensitivity and type 2 Diabetes, coronary

artery disease, Atherosclerosis and potentionally even cancers. The rabbit and sheep

polyclonal antibodies against the Human Adiponectin protein were performed according to

the immunization schedule. The animals blood was collected and purified by the afinity

purification method to obtain polyclonal antibodies. The functionality of rabbit and sheep

polyclonal antibodies was verified by using methods like an indirect ELISA, Western blot

in reduced and non-reduced conditions and Immunohistochemistry.

Klíčová slova: Human Adiponectin, Obesity, Metabolic syndrome, Type 2 Diabetes,

Polyclonal antibody, Western blot

6

OBSAH

1.1 Charakteristika a výskyt Adiponectinu...........................................................................101.1.1 Úloha Adiponectinu v organismu.............................................................................121.1.2 Adiponectin a receptory AdipoR1 a AdipoR2..........................................................131.1.3 Adiponectin a T-Cadherin........................................................................................131.1.4 Adiponectin a inzulin...............................................................................................131.1.5 Adiponectin a inzulinová rezistence a Diabetes mellitus.........................................131.1.6 Adiponectin a kardiovaskulární komplikace obezity...............................................141.1.7 Adiponectin a hypoxie.............................................................................................151.1.8 Adiponectin a zánět..................................................................................................151.1.9 Adiponectin a oběhový systém................................................................................161.1.10 Adiponectin a metabolický syndrom......................................................................171.1.11 Adiponectin a dyslipidemie....................................................................................171.1.12 Adiponectin a polycystický ovariální syndrom .....................................................171.1.13 Adiponectin a onemocnění jater.............................................................................181.1.14 Adiponectin a metabolismus kostí.........................................................................191.1.15 Adiponectin a nádorová onemocnění.....................................................................19

1.2 Laboratorní diagnostika .................................................................................................211.2.1 Imunitní odpověď.....................................................................................................211.2.2 Imunoglobuliny........................................................................................................221.2.3 Imunizace zvířat.......................................................................................................251.2.4 Purifikace protilátek.................................................................................................261.2.5 Elektroforéza............................................................................................................271.2.6 Western blot..............................................................................................................291.2.7 ELISA......................................................................................................................311.2.8 Imunohistochemie....................................................................................................32

2. MATERIÁL A METODIKA.................................................................................................342.1 Imunizace........................................................................................................................34

2.1.1 Příprava antigenu.....................................................................................................352.1.2 Vlastní imunizace zvířat...........................................................................................352.1.3 Odběr krve................................................................................................................36

2.2 Zpracování krve..............................................................................................................372.3 Testování imunních sér...................................................................................................37

2.3.1 Vazba desek pro test nepřímá ELISA - vazba antigenu na desku............................382.3.2 Metoda nepřímá ELISA pro testování imunních sér................................................40

2.4 Purifikace polyklonálních protilátek...............................................................................422.5 Zpracování protilátek......................................................................................................42

2.5.1 Stanovení koncentrace bílkoviny (proteinu, protilátky) metodou BCA..................422.5.2 Nepřímá ELISA pro testování vypurifikovaných polyklonálních protilátek...........44

2.6 Elektroforéza (ELFO).....................................................................................................452.6.1 Příprava polyakrylamidových gelů pro ELFO.........................................................452.6.2 Příprava vzorků........................................................................................................482.6.3 Vlastní elektroforéza................................................................................................492.6.4 Barvení gelu.............................................................................................................522.7.1 Transfer proteinů z polyakrylamidového gelu na PVDF membránu.......................532.7.2 Barvení proužků se standardy amidočerní...............................................................552.7.3 Imunodetekce membrán s navázaným proteinem....................................................56

3. SOUHRN, VÝSLEDKY.......................................................................................................594. DISKUSE..............................................................................................................................69

7

5. ZÁVĚR.................................................................................................................................736. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ZDROJŮ INFORMACÍ........................................747. PŘÍLOHY.............................................................................................................................79

8

1. ÚVOD

Obezita a s ní spojená chronická a zhoubná onemocnění, která se vyskytují stále častěji, jsou

v současné době jedním z hlavních problémů řešených v lidské populaci. Z výsledků

výzkumu vědců vyplývá, že obezita je spojena s arteriální hypertenzí, koronární

aterosklerózou, se zánětlivými stavy, inzulinovou rezistencí a metabolickým syndromem, DM

typ 2 (Diabetes Mellitus typ 2) a i se zvýšeným výskytem nádorových onemocnění.

Pro kategorizaci obezity se používá buď výpočet Body Mass Index (BMI) nebo pro zjištění

abdominální obezity měření poměru obvodu pasu a boků tzv. Waist-to-Hip Ratio (WHR).

Obezita je podle WHR definována hodnotou 0,9 a více a podle BMI je obezita definována

jako BMI větší než 30 kg/m2 , zatímco nadváha jako BMI větší než 25 kg/m2 [16]. Tuková

tkáň byla dříve považována pouze jako zásobárna energie organismu, ale polovině v 90. let

20. století byla prokázána její další funkce a to, že produkuje hormony. Proto se v současné

době tuková tkáň považuje za endokrinní orgán.

Tuková tkáň se dělí na bílou tukovou tkáň a hnědou tukovou tkáň. Bílá tuková tkáň se dále

dělí na:

a) subkutální tukovou tkáň - ukládají se sem přebytečné kalorie pro použití v případě

potřeby organismu

b) viscerální tukovou tkáň - slouží k zásobování vnitřních orgánů energií

Rozdíly mezi oběma typy tukové tkáně jsou:

a) v mobilizaci lipidů - adipocyty syntetizují lipidy

b) produkci adipokinů (hormonů tukové tkáně) - syntetizují a uchovávají protizánětlivé

a zánětlivé cytokiny

c) diferenciaci adipocytů (buněk tukové tkáně)

Oba typy tukových tkání hrají důležitou roli v metabolismu celého organismu [13].

Většinu hormonů tukové tkáně produkuje bílá tuková tkáň, hnědá tuková tkáň je méně

metabolicky aktivní [16].

První objevený hormon tukové tkáně se nazývá Leptin a je řazen mezi cytokiny. Reguluje

příjem potravy. Leptin se váže na buňky přes specifické receptory, a tak ovlivňuje aktivitu

buněk. U zdravé populace se koncentrace Leptinu v séru pohybuje v rozmezí 4 – 16 ng/ml,

u obézních jedinců se tato hladina signifikantně zvyšuje, zatímco u hladovějících nebo

podvyživených jedinců hladina Leptinu velmi klesá, často ji není ani možno detekovat [16].

Další hormony tukové tkáně, které bývají spojovány s obezitou a tedy i metabolismem

glukózy, jsou např. Resistin, Chemerin, Visfatin, Omentin [32].

Jedním z nejdůležitějších adipokinů, který reguluje metabolismus glukózy a metabolismus

tuků je Adiponectin.

1.1 Charakteristika a výskyt AdiponectinuLidský Adiponectin je protein, který lze v literatuře najít i pod názvy Acrp30, GBP28

(Gelatine binding protein 28 kDa) nebo AdipoQ. Tento protein produkují adipocyty bílé

tukové tkáně a v menší míře i adipocyty hnědé tukové tkáně [16, 21]. V krvi zdravého člověka

se Adiponectin vyskytuje v rozmezí 0,5 – 30 μg/ml [16, 21] a podílí se 0,01% na zastoupení

všech proteinů v plasmě [30]. Existují rozdíly mezi hladinami adipokinů, a tedy

i Adiponectinu, u mužů a u žen – vysvětlením je rozdílné procento tělesného tuku mužů

(cca 25%) a žen (cca 30%) [16]. Na rozdíl od Leptinu zde platí opačná závislost. U obézních

jedinců se vzhledem k jedincům s normální hmotností u obézních jedinců se hladiny

Adiponectinu signifikantně snižují.

Gen kódující Adiponectin je lokalizován na chromozomu 3q27. Mutace tohoto genu vede

např. k. hypoadiponectinemii (snížená koncentrace Adiponectinu v séru).

Gen lidského Adiponectinu se sestává ze tří exonů a jednoho intronu. Adiponectin jako

protein tvoří globulární a fibrilární formu. Fyziologicky aktivní molekula Adiponectinu

obsahuje posttranslační modifikace jako hydroxylace, glykosylace a sialyzace, které jsou

zodpovědné za stabilitu molekuly a sekreci Adiponectinu z buňky [33, 34].

Protein Adiponectin je tvořen celkem 244 aminokyselinami a rozlišují se zde části viz Obr.1:

N-terminální hypervariabilní oblast (včetně signální sekvence), kolagenní doména

a C- terminální doména, která je homologní s C1q složkou komplementu [16, 21].

Obr. 1 Strukturální oblasti proteinu Human Adiponectin; modifikováno dle [34]

K expresi Adiponectinu dochází ve střední fázi adipogeneze (proces vzniku a dozrávání

adipocytů). V lidské plasmě se Adiponectin vyskytuje ve více formách. V krvi byl

Adiponectin prokázán ve formě trimeru (90 kDa) a hexametru (180 kDa) [10, 21], zatímco

monomerní forma Adiponectinu (30 kDa) nebyla za nativních podmínek nikdy detekována

[38]. Forma monomerní, trimerní a hexamerní bývá v literatuře též označována jako LMW

(Low Molecular Weight) Adiponectin. Dalšími formami prokázanými v krvi jsou HMW

(High Molecular Weight), což jsou multimery Adiponectinu s teoretickou molekulovou

hmotností více než 400 kDa viz Obr. 2 [25, 30]. Jednotlivé formy Adiponectinu jsou tvořeny

monomerními jednotkami Adiponectinu spojené pomocí disulfidických můstků. [16, 10, 21].

Různé formy Adiponectinu mohou mít různou biologickou aktivitu. Jako biologicky

nejaktivnější bývají považovány zejména hexametry a multimery [20, 21, 34].

Obr. 2 Schématické znázornění forem (multimerů) Adiponectinu a vazbu disulfidických

můstků; modifikováno dle [34]

1.1.1 Úloha Adiponectinu v organismu

Adiponectin se v organismu podílí na mnoha biochemických reakcích a biologických

procesech, které mohou být vzájemně propojeny.

Snížená hladina Adiponectinu v těle (Hypoadiponectinemie) se může spolupodílet na rozvoji

závažných onemocnění jako např. DM typ 2, hypertenze, ateroskleróza (viz Obr. 3). Naopak

vysoké hladiny Adiponectinu v krvi mohou být spolu s jinými biochemickými markery

důležitým signálem pro renální selhání, protože ledviny hrají hlavní roli metabolismu

a vylučování Adiponectinu [7, 21].

Obr. 3 Onemocnění způsobená hypoadiponectinémií (DM, Diabetes Mellitus; Hypertension,

arteriální hypertenze; Aterosclerosis, ateroskleróza; Cardiac Dysfunction, srdeční selhání;

NASH, nealkoholická steatohepatitis; Cancers, rakovina); modifikováno dle [24]

1.1.2 Adiponectin a receptory AdipoR1 a AdipoR2

Adiponectin působí přes vazbu na specifické receptory AdipoR1 a AdipoR2 popsané už v roce

2003 [21]. Oba tyto receptory jsou produkovány bílou i hnědou tukovou tkání, ale byly

detekovány také např. v hypothalamu [10, 21, 42]. Oba receptory jak AdipoR1, tak AdipoR2,

obsahují sedm transmembránových domén s intracelulární N-terminální doménou

a extracelulární doménou. Tyto receptory se účastní metabolismu lipidů včetně oxidace

mastných kyselin [26]. Receptor AdipoR1 je receptor specifický pro globulární formu

Adiponectinu a ve velkém množství se exprimuje v kosterním svalstvu [31]. Receptor

AdipoR2 se exprimuje v játrech a váže se s fibrilární i globulární formou Adiponectinu [10,

21, 42].

1.1.3 Adiponectin a T-Cadherin

Byla prokázána vazba oligomerních a fibrilárních forem Adiponectinu na molekulu

T - Cadherinu (protein, který se vyskytuje na různých typech buněk ), hlavně ve svalech nebo

myokardu [10].

1.1.4 Adiponectin a inzulinSekrece Adiponectinu je regulována hlavně inzulínem, TNFα (Tumor Necrosis Factor α)

a katecholaminy. Inzulín stimuluje sekreci Adiponectinu, zatímco TNFα významně jeho

sekreci potlačuje, a katecholaminy navozují inzulínovou rezistenci. TNFα koreluje s BMI

a hyperinzulinemií (zvýšená hladina inzulinu na počátku DM typ 2) [32].

Další faktory, které inhibují produkci Adiponectinu jsou IL-6 (Interleukin-6), glukokortikoidy

a ET-1 (Endothelin-1) [21]. IL-6 indukuje zánět nejen v endotelu a buňkách jater, ale také

v tukové tkáni [13]. Hladina IL-6 se zvyšuje: u obézních jedinců, při inzulinové rezistenci

a při chronickém zánětu u DM typu 2 [32].

1.1.5 Adiponectin a inzulinová rezistence a Diabetes mellitus

Inzulinová rezistence je definována jako stav, kdy β buňky slinivky břišní produkují

nedostatečné množství inzulinu, a tím je snížena funkce inzulinu v organismu. Je postižen

metabolismus odbourávání glukózy, metabolismus tuků a proteinů a taktéž diferenciace a růst

buněk, včetně endotelu [4]. Porucha funkce β buněk může způsobovat i např. lipotoxickou

apoptózu způsobenou ceramidy - adiponectin zde působí protektivně proti akumulaci

ceramidů [14]. Inzulinová rezistence může být podmíněna geneticky nebo získána během

života [4].

Hladiny Adiponectinu v krevním oběhu pozitivně korelují s inzulinovou senzitivitou.

Adiponectin stimuluje aktivaci AMPK (Adenosin monofosfát proteinkináza), ta stimuluje

fosforylaci acetyl CoA karboxylázu, a tím oxidaci volných mastných kyselin, a taktéž

stimulaci metabolismu glukózy a laktátu včetně redukce enzymů tvořených při

glukoneogenezi v játrech. Výsledkem je redukce hladiny glukózy [6, 36]. Vysoké koncentrace

Adiponectinu mohou pravděpodobně souviset se sníženým rizikem vzniku inzulinové

rezistence.

Do současné doby není známo, která z izoforem Adiponectinu je zodpovědná za rozvoj

inzulinové rezistence. Touto otázkou se zabývala několik studií jako např. multicentrická

studie obézních žen, která popisuje podávání nízkokalorické diety obézním ženám a měření

zastoupení nízko (trimery), středně (hexamery) a vysokomolekulárního (oligomery)

Adiponectinu u těchto žen před dietou, v průběhu a po dietě. Tato studie prokázala pouze

změnu zastoupení nízkomolekulárních forem Adiponectinu asi o 16,3 % (oproti stavu před

dietou). V zastoupení středně a vysokomolekulárních forem Adiponectinu nebyla zjištěna

žádná změna [30].

U osob s DM typ 2. byla popsána snížená exprese Adiponectinu v tukové tkáni (asi o 45%)

vzhledem ke zdravým jedincům [36]. V krvi osob s DM typ 2 byly rovněž prokázány nižší

koncentrace Adiponectinu na rozdíl od osob, které tímto onemocnění netrpí [6].

1.1.6 Adiponectin a kardiovaskulární komplikace obezity

Významným je rovněž vztah mezi Adiponectinem a PAI-1 (inhibitor aktivátoru

plasminogenu) a TNFα. PAI-1 je distribuován z mnoha regionů: játra, bílá tuková tkáň

a vaskulární endotel a v kombinaci s inzulinem a triglyceridy tlumí expresi Adiponectinu

v adipocytech bílé tukové tkáně. Výsledkem může být obezita s kardiovaskulárními

komplikacemi metabolického syndromu viz Obr. 4. TNFα se podílí na regulaci exprese PAI-1

a tím nepřímo na regulaci hladin Adiponectinu [27].

Obr. 4 Dysfunkční tuková tkáň při obezitě. FFA, volné mastné kyseliny; IL-6, Interleukin - 6;

MCP-1, Monocyte chemoattractant protein; PAI-1, inhibitor aktivátoru plasminogenu;

TNFα, Tumor necrosis factor α; modifikováno dle [18]

1.1.7 Adiponectin a hypoxie

Důležitým faktorem působícím tukovou tkáň je zásobování kyslíkem. V případě hypoxie,

tj. nedostatečné zásobování tukové tkáně kyslíkem, dochází ke změnám, které významně

ovlivňují metabolické pochody v organismu. Při normálním zásobování kyslíkem produkují

mitochondrie ATP (Adenosin trifosfát) a jeho syntéza je dokončena v cytosolu buňky. Pokud

dochází k hypoxii, funkce mitochondrií je snížena, a zvyšuje se glykolytická aktivita buňky.

Buňka se ale snaží kompenzovat inhibici mitochondrií. Výsledkem je zvýšená produkce

laktátu, to vede ke snížení pH v buňce (tkáni). Zvýšená koncentrace laktátu je rovněž

i indikátorem tkáňové hypoxie. Hlavním mediátorem inhibice mitochondrií je transkripční

faktor HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor Alpha), který se vyskytuje pouze v jádře buňky.

Množství HIF-1α je v normálních podmínkách rychle degradováno v proteozomu, ale při

hypoxii se jeho hladiny významně zvyšují [41]. Ve stavu hypoxie může v tukové tkáni

vzniknout zánět spolupůsobením prozánětlivých cytokinů TNFα a IL-6 a IL-8 (Interleukin-8)

[13].

1.1.8 Adiponectin a zánět

Prozánětlivé cytokiny (TNFα a IL-6 a IL-8) nejsou produkovány přímo adipocyty,

ale dostávají se do tukové tkáně spolu s makrofágy v procesu vzniku zánětu [13], kdy

vznikající nekrotické buňky podporují zvýšenou infiltraci makrofágů do tukové tkáně [41].

V tukové tkáni se vyskytují dva typy makrofágů: tkáňové (alternativně aktivované)

a zánětlivé. Ve viscerální tukové tkáni se vyskytuje vyšší počet makrofágů než v subkutální

tukové tkáni [13]. Při zánětu se také zvyšuje exprese adhezivní molekuly VCAM-1 (Vascular

Cell Adhesion Molecule - 1), ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule - 1) a molekuly

E - selectin. Makrofágy exprimují receptory MSRA (Macrophage Scavenger Receptor type

A), které modifikují lipoproteiny a mění adipocyty na tzv. pěnové buňky. Pěnové buňky

formují aterosklerotický plak. V případě odloučení části nebo celého aterosklerotického plaku

hrozí komplikace trombózy [19]. Adipocyty mohou zvětšit svůj obsah až na 0,7 – 0,8 μg

lipidů. Velké adipocyty jsou lipolytické a více rezistentnější k inzulinu a produkují více

zánětlivých cytokinů, ale méně Adiponectinu [13]. Adiponectin inhibuje vznik pěnových

buněk, protože reguluje akumulaci lipidů, inhibuje produkci MSRA, snižuje katalýzu

esterifikovaného cholesterolu a podporuje sekreci protizánětlivých cytokinů např. IL-10

(Interleukin-10) a tkáňového inhibitoru metaloproteázy-1, a tím pomáhá stabilizovat

aterosklerotický plak proti ruptuře [21, 24].

Inhibice produkce Adiponectinu je často spojována s výskytem chronického zánětu

u obézních.

1.1.9 Adiponectin a oběhový systém

Zánět se rovněž podílí na rozvoji angiogeneze a u obézních jedinců může vést až ke koronární

ateroskleróze. Glomerulární forma Adiponectinu potlačuje migraci koronárních arteriálních

endoteliálních buněk indukovaných endoteliálním růstovým faktorem [10]. Další látky

ovlivňující angiogenezi, mimo Adiponectin, jsou: angiotensinogen, lipoproteinová lipáza,

adipsin, IL-6, prostaglandin, TNFα a oxid dusný [11].

Byla prokázána korelace hladin Adiponectinu v plasmě s mikrovaskulárními komplikacemi

u diabetiků a také zvýšené hladiny Adiponectinu v moči diabetiků s nefropatií způsobenou

mikrovaskulárními komplikacemi [10].

Adiponectin přímo ovlivňuje i kardiomyocyty (buňky srdečního svalu) a to tak, že působí

antiapoptoticky (brání buněčné smrti), a tím je chrání [10]. Při infarktu myokardu je

redukována exprese receptoru AdipoR1 (viz kap. 1.1.2), a tím je omezena vazba

Adiponectinu. Ve stavu po infarktu Adiponectin redukuje rozsah apoptózy a produkci TNFα,

a tím redukuje hypertrofii a tvorbu fibrózní tkáně v myokardu [21].

Hladina vysokomolekulární formy Adiponectinu v krvi dává vyšší vypovídací schopnost

v prognostice faktoru pro selhání srdce, než stanovení množství celkového Adiponectinu

v krvi [21].

1.1.10 Adiponectin a metabolický syndrom

Metabolický syndrom je stav, který je charakterizován obezitou spojenou s hypertenzí,

dyslipemií, glukózovou intolerancí a inzulínovou rezistencí [13]. Vlivem působení všech výše

zmíněných faktorů současně vede k rozvoji DM typu 2 a kardiovaskulárních onemocnění [4,

13].

Podle definice WHO (Word Health Organization) z roku 1999 pro diagnózu metabolického

syndromu musí být splněna následující kritéria: WHR > 0,90 cm u mužů a >0,85 cm u žen,

množství triglyceridů v séru ≥ 1,7 mmol/l nebo koncentrace HDL (High Density Lipoprotein)

˂ 0,9 mmol/l u mužů a ˂ 1,0 mmol/l u žen, exkreci albuminu v moči >20 ng/min (30 mg/g

kreatininu) a krevní tlak ≥ 140/90 mmHg [4, 39]. V roce 2005 byla tato kritéria upravena IDF

(International Diabetes Federation) novou definicí, která zohledňuje tyto parametry pro různé

etnické skupiny [4].

S metabolickým syndromem je dále spojován polycystický ovariální syndrom a nealkoholická

steatóza jater. Snížené množství Adiponectinu pravděpodobně hraje důležitou roli při vzniku

metabolického syndromu [36].

Incidence metabolického syndromu se zvyšuje s věkem – výskyt metabolického syndromu lze

očekávat u osob nad 50 let věku. Postihuje více než 40% populace v USA a kolem 30%

populace v Evropě [4].

1.1.11 Adiponectin a dyslipidemie

Inhibice lipolýzy v tukové tkáni, která je vyvolaná inzulinovou rezistencí, vede k vyššímu

výskytu volných mastných kyselin v plasmě a následně i v játrech [4].

Adiponectin se podílí na metabolismu HDL (High Density Lipoprotein) a LDL (Low Density

Lipoprotein) tak, že snížení hladiny Adiponectinu vede k akumulaci lipidů, ale také ke

zvýšení aktivity jaterní lipázy, která redukuje HDL na LDL [21].

1.1.12 Adiponectin a polycystický ovariální syndrom

Polycystický ovariální syndrom je běžná endokrinní abnormalita žen ve fertilním věku.

Z dostupných informací lze říci, že může být způsobena anovulací (nepřítomnost ovulace)

nebo oligoovulací (ovulace v delších časových intervalech než je obvyklé),

hyperandrogenismem (zvýšená hladina mužských pohlavních hormonů - androgenů)

klinickým nebo biologickým a polycystickou ovariální morfologií [4].

Zdá se, že inzulinová rezistence a kompenzační hyperinzulinemie hrají v této problematice

významnou úlohu, stejně tak jako obezita [40]. Některé studie naznačují, že u žen

s inzulinovou rezistencí a polycystickým ovariálním syndromem je snížená koncentrace

Adiponectinu v krvi [40]. Další studie uvádí snížení koncentrace Adiponectinu u žen

s polycystickým ovariálním syndromem, ve srovnání s ženami bez této diagnózy s různě

vysokým BMI [40]. U žen s polycystickým ovariálním syndromem, s ohledem na věk a BMI,

lze předpokládat riziko metabolického syndromu dvakrát vyšší než je u běžné populace [4].

1.1.13 Adiponectin a onemocnění jater

Dlouhodobá konzumace alkoholu vede ke steatóze jater, která je považována za první stádium

poškození jater a je charakterizována akumulací triglyceridů v hepatocytech (buňky jater).

Dalším stádiem poškození jater je vznik steatohepatitidy, která se projeví hepatomegalií

(zvětšení jater) a infiltrací leukocytů (neutrofilů, monocytů/makrofágů, T a B lymfocytů) do

jater. Až u 50 % pacientů s touto diagnózou, dochází k fibrózním změnám v játrech, a to

působením prozánětlivých cytokinů a kolagenu I. a III. Následně dochází k cirhóze jater, kdy

je funkce jater výrazně snížena a kdy hepatocyty nejsou schopny regenerace. Výsledkem je

totální selhání jater, které může vést buď úmrtí pacienta nebo k transplantaci jater.

Podobný průběh onemocnění nastává po nákaze hepatitidou typu C [23], často se vznikem

hepatocelulárního karcinomu v posledním stádiu onemocnění.

Funkce Adiponectinu v játrech není zatím úplně objasněna. Ví se ale, že působení etanolu

tlumí expresi Adiponectinu, a tím se zvyšuje produkce TNFα Kupferovými buňkami

stimulovanými lipopolysacharidy v játrech. Dlouhodobé působení alkoholu na Kupferovy

bunňky vede ke zvýšení jejich senzitivity k endotoxinům [23]. Poklesu exprese Adiponectinu

v tukové tkáni napomáhá také hyperhomocysteinemie (vysoké hodnoty homocysteinu v krvi)

vznikající působením etanolu [42].

Aplikace fyziologicky vysokých dávek Adiponectinu myším, které byly vystaveny

dlouhodobé expozici etanolu, prokázaly snížení exprese TNFα v játrech, včetně poklesu

steatóz. Protizánětlivý účinek Adiponectinu byl zjištěn u globulární i fibrilární formy

Adiponectinu [23].

Kromě alkoholické steatózy existuje i nealkoholická steatóza s podobnou patologií.

Zvýšenou prevalenci pro nealkoholickou steatózu představuje metabolický syndrom.

U 98 % pacientů s nealkoholickou steatózou došlo ke zvýšení lipolýzy, zvýšení hladiny

volných mastných kyselin v krevním oběhu a inhibici glukózy pocházející z glukoneogeneze.

Zvýšené koncentrace glukózy a inzulinu v krvi vedou k syntéze mastných kyselin, ale zároveň

tlumí odbourávání mastných kyselin β oxidací. Tento proces vede k rozvoji jaterní steatózy.

Mechanismus dalších reakcí – zvýšení TNFα a pokles Adiponectinu – je stejný jako

u alkoholické steatózy jater [4].

1.1.14 Adiponectin a metabolismus kostí

Kostní remodelaci mimo výživy a fyzické zátěže ovlivňují také adipokiny produkované

tukovou tkání. Z klinických studií vyplývá, že Adiponectin má jednoznačně negativní

osteotropní efekt. Jeho působením dochází ke zrychlené remodelaci kostí a výsledkem je

snížená kostní densita. Bylo prokázáno, že deficit Adiponectinu ovlivňuje remodelaci kostí

jak u rostoucího oraganismu, tak i v dospělosti. Tento negativní účinek Adiponectinu na

kostní metabolismus vysvětluje nízký výskyt osteoporózy a fraktur u obézních

a nedostatečného nárůstu kostní hmoty u dívek s mentální anorexií [43].

Adiponectin má vliv i na klouby. Zde působí jako prozánětlivý faktor a může způsobovat

degradaci matrix kloubu, tím že selektivně indukuje IL-6 a metaloproteázu-1, které jsou

dvěma hlavními mediátory onemocnění revmatoidní artritidy. Ve sledování hladin

Adiponectinu v synoviální tekutině u zdravých pacientů a pacientů s revmatoidní artritidou

byla prokázána vyšší hladina Adiponectinu u pacientů s revmatoidní artritidou.

Z tohoto pohledu jsou vysoké koncentrace Adiponectinu v krvi rizikovým faktorem pro lidské

kosti a rozvoj degenerativních onemocnění kloubů [12].

1.1.15 Adiponectin a nádorová onemocnění

Klinické studie naznačují vztah mezi rizikem vzniku karcinomu prsu, endometria, prostaty,

ledvin a kolorektálního karcinomu s hladinami Adiponectinu v plasmě. Snížené hladiny

Adiponectinu v plasmě obézních jedinců zvyšují riziko nádoru, taktéž výskyt metabolického

syndromu u obézních koreluje se vznikem nádoru více než pouze obezita [18].

Klíčovou roli při vzniku nádoru hraje dysfunkční tuková tkáň, která indukuje zánět a ten

se podílí na rozvoji rakoviny [18]. Mechanismus, kterým se Adiponectin může podílet

na karcinogenezi je spojen s metabolismem inzulinu. Nízké hladiny Adiponectinu způsobují

inzulinovou rezistenci, a tím zvýšené hladiny inzulinu, které zvyšují hladiny IGF-1 (Insulin-

like Growth Factor 1) [28]. IGF- 1 taktéž může inhibovat apoptózu a tím podporovat

proliferaci buněk v mnoha tkáních a tak pomáhat v rozvoji kacinogeneze [18, 28]. Zatímco

vysoké hladiny Adiponectinu (globulární a zejména fibrilární forma Adiponectinu) ovlivňují

chování nádorových buněk tak, že inhibují nádorový růst. Fibrilární forma Adiponectinu

rovněž podporuje inhibici buněčného růstu při podání Doxorubicinu, a tím umožňuje snížit

podávanou dávku tohoto léku, a tak snížit riziko výskytu systémové toxicity po jeho podání

[16]. Adiponectin také inhibuje TNFα, tím se podílí na změně působení TNFα na proliferaci

nádorových buněk a angiogenezi. Adiponectin je také důležitým negativním regulátorem

hematopoeze a imunitního systému [28].

Byla prokázána spojitost mezi hodnotou WHR a velikostí adenomu tlustého střeva:

WHR ≥ 1 cm je asociován s vysokým rizikovým faktorem pro velký adenom, zatímco

WHR ˂ 1 cm souvisí s adenomy menších velikostí [28].

U onemocnění kolorektálním karcinomem jsou měřeny vysoké hladiny IL-6, TNFα a CRP

(C reaktivní protein), které korelují s větší velikostí tumoru. Bylo prokázáno, že nízké hladiny

Adiponectinu u pacientů s nemetastazujícím kolorektálním karcinomem nepřímo souvisí

s růstem nádorů a mohou predikovat recidivu onemocnění [28].

Studie zabývající se vlivem obezity na vznik karcinomu prostaty přináší rozporuplné

výsledky, které lze interpretovat tvrzením, že obezita snižuje riziko vzniku neagresivního

karcinomu prostaty, ale naproti tomu může zvyšovat riziko agresivního karcinomu prostaty

[16].

Pro všechny typy nádorů se zvyšuje poměr relativního rizika úmrtí ve vztahu k BMI [21].

Role Adiponectinu v etiologii nádorů nebyla ještě zcela objasněna. Porozumění pochopení

patofyziologie vztahu mezi metabolickým syndromem a nádorovými onemocněními může

vést k novým postupům prevence a léčby nádorů.

1.2 Laboratorní diagnostika

1.2.1 Imunitní odpověď

Velmi důležitá pro mnoho imunologických laboratorních metod je schopnost imunitní

odpovědi organismu po vstupu vnějšího činitele, imunogenu (bakterie, viry, proteiny atd.).

Součástí imunitní odpovědi stimulované imunogenem, je tvorba specifických protilátek. Pro

laboratorní diagnostiku se používají specifické protilátky připravené imunizací zvířat (ovce,

kozy, králíci, krysy a myši).

Na vzniku specifických protilátek v těle se podílí buňky prezentující antigen (APC, Antigen

Presenting Cells), T lymfocyty a B lymfocyty. APC navážou imunogen a zpracují jej na

fragmenty, které pak předloží jako komplexy společně s molekulami hlavního

histokompatibilního komplexu třídy II. (MHC, Major Histocompatibility Complex class II.)

prekurzorům pomocných T buněk (Th, T helper cells) [15]. Aktivované Th buňky po

rozpoznání obou předložených struktur vylučují faktory, pomocí kterých řídí činnost ostatních

lymfocytů. Jedním z těchto faktorů je Il-2 (Interleukin-2), který aktivuje prekurzory

cytotoxických buněk (Tc, Cytotoxic T cells). Funkce Tc buněk je rozpoznat imunogeny na

cílových buňkách a podílet se na likvidaci imunogenu. Th buňky také poskytují diferenciační

signály a podporují růst B lymfocytů. B lymfocyty se přemění na plazmatické buňky, které

vytváří protilátky (imunoglobuliny).

Vnějším činitelem je imunogen – molekula navozující imunitní odpověď. Termín antigen

vyjadřuje schopnost molekuly navodit tvorbu protilátek a reaguje s protilátkami. Důležitou

charakteristikou imunogenu je jeho imunogenicita tj. schopnost vyvolat imunitní odpověď,

která je závislá na stavu, biologických a genetických vlastnostech příjemce. Čím je molekula

více rozmanitá a složitá a má vyšší molekulovou hmotnost, tím je více imunogenní. Z celé

makromolekuly se však pouze malá část účastní reakce s protilátkou. Tyto aktivní oblasti jsou

nazývány epitopy a může jimi být kterákoli oblast povrchu molekuly (imunogenu), jejíž

struktura je obnažená a přístupná. Na molekule imunogenu může existovat i více epitopů.

Struktura epitopu je důležitá pro vazbu a specifitu protilátky.

Za nejúčinnější imunogeny jsou považovány proteiny. Imunogenem může být také

nízkomolekulární sloučenina – Hapten, která není přímo imunogenní, ale stane se

imunogenem až po vazbě na proteinový nosič.

Po vpravení imunogenu do organismu dojde k reakci organismu (imunitní odpovědi), což je

řetězec reakcí, jejichž výsledkem je tvorba protilátek (imunoglobulinů) [37].

1.2.2 Imunoglobuliny

Imunoglobuliny (protilátky) tvoří přibližně 20% celkových proteinů séra. Protilátky jsou

heterogenní molekuly a lze je dobře určit elektroforeticky. Jejich základními

charakteristickými vlastnostmi jsou specifita pro daný antigen a rozmanitost specifit

umožňující reakci se širokou škálou antigenních struktur. Imunoglobuliny jsou glykoproteiny

tvořené polypeptidy a cukry. Polypeptidický řetězec, který je součástí protilátky, nese většinu

jejích biologických vlastností. Polypeptidický řetězec obsahuje variabilní část na N konci

svého řetězce, zbytek molekuly je konstantní částí. Základní jednotka imunoglobulinu se

nazývá monomer a obsahuje 4 polypeptidové řetězce, z nichž 2 řetězce jsou označovány jako

lehké neboli L (nižší molekulová hmotnost) a 2 řetězce jsou označovány jako těžké neboli H

(asi 2x vyšší molekulová hmotnost než je molekulová hmotnost lehkého řetězce) viz. Obr. 3.

Imunoglobuliny složené z více monomerů se nazývají polymery (dimer, trimer atd.) a jsou

vázány disulfidovými vazbami, které jsou nezbytné pro trojrozměrné uspořádání. V rámci

prostorového uspořádání imunoglobulinu se zde vyskytuje oblast citlivá k působení enzymu

nebo chemických činidel viz Obr. 3. Tuto oblast nazýváme otočná, sklopná oblast („Hinge“).

Intramolekulární disulfidové můstky vytváří na řetězcích globulární oblasti. Molekula

imunoglobulinu obsahuje také vazebné místo, které je tvořeno malým počtem aminokyselin,

na toto místo se pak váže antigen viz Obr. 3 [37].

Obr. 5 Zjednodušený model molekuly imunoglobulinu IgG demonstrující čtyřřetězcovou

strukturu. Označení C přísluší konstantním oblastem označení V přísluší variabilním

oblastem. Místa štěpení molekuly působením pepsinu a papainu jsou vyznačeny

vlnovkami, disulfidické můstky interřetězcové a intrařetězcové jsou vyznačeny

symbolem -S-S-; modifikováno dle [37]

Imunoglobuliny se dělí na 5 základních tříd [37]:

a) třída IgG - tvoří asi 75 % celkových imunoglobulinů v lidském séru. Třída IgG se

skládá z podtříd IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4. Vzájemný poměr zastoupení zmíněných

podtříd IgG je dán geneticky. V séru se IgG vyskytuje jako monomer.

b) třída IgM – představuje asi 10 % celkových imunoglobulinů v lidském séru. IgM je

protilátkou časné imunitní odpovědi na většinu antigenů, protože je hlavním

imunoglobulinem přítomným na povrchu B lymfocytů. V séru se nachází převážně

jako pentamer.

c) Třída IgD – v lidském séru je přítomno asi 0,2 % z celkového množství

imunoglobulinů. Spolu s IgM je hlavním povrchovým imunoglobulinem přítomným

na B lymfocytech. Jeho základní funkce zatím nebyla zcela objasněna. Předpokládá

se, že se podílí na diferenciaci B lymfocytů. V séru se nachází jako monomer.

d) Třída IgA – její podíl je asi 15 % z celkových imunoglobulinů v lidském séru.

Základní funkcí IgA je zabránit vstupu viru do buněk hostitele, a tak působit jako

důležitý obranný mechanismus proti lokálním infekcím. IgA je součástí slizničního

imunitního systému a vyskytuje se zejména ve slinách, bronchiálním sekretu, nosní

mukózní tkáni, slizničních sekretech tenkého střeva, vaginálním sekretu s prostatické

tekutině. V séru se nachází jako monomer.

e) Třída IgE – na celkovém množství sérových imunoglobulinů se podílí pouze 0,004 %.

Je zodpovědná za alergické reakce a rovněž hraje významnou úlohu v obraně

organismu proti parazitárním infekcím. V séru se vyskytuje jako monomer.

Podle typu se protilátky mohou také dělit na polyklonální protilátky a monoklonální

protilátky.

Polyklonální protilátky

Antigeny mohou být velké a komplexní molekuly a každá jednotlivá protilátka se může vázat

jen na malou, specifickou část (epitop) antigenu. Účinná imunitní odpověď vyvolává produkci

mnoha různých protilátek (produkovaných mnoha různými B lymfocyty) proti stejnému

antigenu. Odtud termín „polyklon“ – slovo „poly“ znamená mnoho a slovo „klon“ znamená

větvení nebo pučení. Skupina buněk, která má původ v jedné „mateřské buňce“ se nazývá

klon. Protilátky produkované při polyklonální imunitní odpovědi se nazývají polyklonální

protilátky. Na rozdíl od monoklonálních protilátek, které jsou identické a reagují proti

jednomu epitopu, jsou polyklonální protilátky heterogennější, reagují s více epitopy jednoho

antigenu [37].

Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátky jsou protilátky, které reagují pouze s jedním epitopem antigenu. Jsou

považovány za specifičtější. Monoklonální protilátka lze připravit metodou hybridizace.

Principem metody je spojení (fúze) buněk produkujících protilátky (B lymfocyty)

od imunizovaného zvířete, nejčastěji myši s linií nádorových buněk, které nesmí produkovat

vlastní imunoglobuliny. Produkt takové buněčné fúze nazýváme hybridom, který má vlastnost

B lymfocytu (produkuje protilátku proti danému epitopu) a vlastnost nádorové buňky

(schopnost růstu a množit se). Hybridom produkuje chemicky, fyzikálně i imunologicky

homogenní protilátky – monoklonální protilátky [37].

1.2.3 Imunizace zvířat

Imunizace je postup, pomocí kterého se v organismu určitého jedince vyvolává stav imunity.

Uskutečňuje se buď v přirozených podmínkách nebo během jeho života anebo záměrným

podáváním antigenů (oslabené nebo usmrcené mikroorganismy, proteiny atd.) – tzv. očkování.

Očkování může být aktivní (do organismu se vpraví antigen a organismus si sám vytváří

specifické protilátky a výkonné lymfocyty), anebo pasivní (do organismu se podají specifické

protilátky případně lymfocyty, které vznikly v jiném jedinci). Aktivní imunizace se provádí

za účelem ochrany před určitým infekčním onemocněním (prevence) nebo za účelem přípravy

specifických protilátek např. pro laboratorní použití, zatímco pasivní imunizace je obvykle

léčebný zásah do již probíhajícího onemocnění [8]. Pro účinek imunogenu je rovněž důležitá

dávka (množství) a způsob jeho podání. Možné způsoby imunizace jsou: intradermální (do

kůže), subkutální (do podkoží), intramuskulární (do svalu) nebo intravenózní (do žíly).

Pro intenzivnější imunitní odpověď se antigen míchán s tzv. adjuvans. Adjuvans prodlužuje

retenci imunogenu v organismu, zvětšuje jeho účinnost a stimuluje přísun makrofágů

a lymfocytů do místa aplikace. Imunizace zvířat se provádí v pravidelných intervalech, které

jsou popsány v imunizačních schématech. Imunizační schéma je přizpůsobeno druhu zvířete,

velikosti zvířete. Rovněž je přizpůsobená dávka aplikovaného antigenu a množství adjuvans.

Pro zvýšení imunitní odpovědí se v těchto imunizačních schématech imunizuje v několika

aplikacích, a to většinou subkutálně. Jako adjuvans se pro první aplikaci nejčastěji používá

kompletní Freundovo adjuvans, které obsahuje emulzi oleje a vody s přítomností usmrcených

mykobakterií, v jejichž buněčných stěnách byla prokázána složka s adjuvantními strukturami

MDP (muramyl dipeptid). Pro následné aplikace se pak používá inkompletní Freundovo

adjuvans – o stejném složení jako má kompletní Freundovo adjuvans, vyjma usmrcených

mykobakterií. Po proběhnutí celého imunizačního cyklu se na závěr zvířeti odebere krev, ze

které se získá antisérum (proti antigenu, kterým bylo imunizováno).

V průběhu imunizace po aplikaci první dávky antigenu dochází v organismu k rychlému

vzestupu produkce protilátek. Následnými imunizacemi se tato vysoká hladina protilátek ještě

dále zvyšuje. Vysoké hladiny protilátek přetrvávají v krvi i několik měsíců viz Obr. 6 [37].

Obr.6 Primární a sekundární imunitní odpověď dle [37]

1.2.4 Purifikace protilátek

Dalším krokem při získání polyklonální protilátky je proces purifikace.

Purifikace může být:

a) nespecifická - tj. purifikují se všechny imunoglobuliny ze séra pomocí proteinu G nebo

proteinu A vázaných na nosič – vlastností obou proteinů je schopnost vázat Fc fragment

protilátky. Výsledkem purifikace je směs protilátek, které jsou nespecifické vůči proteinu,

kterým bylo imunizováno.

b) specifická – kdy se protilátky purifikují pomocí specifického ligandu (proteinu použitého

k imunizaci) navázaného na nosič. Výsledkem je specifická protilátka proti danému proteinu.

U obou typů purifikace se protilátky vážou na protein reverzibilně. V procesu purifikace se

využívá se různé síly vazby mezi ligandem navázaným na nosič a protilátkou při různém pH.

Při neutrálním (nebo slabě zásaditém) pH se protilátka váže na ligand a při pH nízkém (tj. asi

pH 1) se ruší vazba mezi ligandem a protilátkou. V praxi se nejdříve při neutrálním (slabě

zásaditém) pH vyvážou protilátky ze séra na ligand (protein) navázaný na nosič. Následně

dojde k promytí nosiče s ligandem roztokem s neutrálním pH, tím se odstraní zbytky séra. Po

promytí za použití roztoku se s nízkým pH dojde k eluci a následnému záchytu

vypurifikovaných protilátek. Vypurifikovaná protilátka je dále testována dalšími

biochemickými metodami [2]. Pro skladování protilátky je vhodná koncentrace asi 1 mg/ml

v pufru s neutrálním pH. Protilátku lze dlouhodobě skladovat zmrazenou, opakovaným

zmrazením může dojít k denaturaci protilátek [9].

Funkčnost takto připravené polyklonální protilátky je třeba ověřit pomocí dalších

laboratorních metod jako je elektroforéza, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA),

Western blot nebo Imunohistochemie (IHC).

1.2.5 Elektroforéza

Pro ověření identity proteinů (i protilátek) se používá metoda zvaná SDS-PAGE elektroforéza.

Je to elektroforéza s využitím polyakrylamidového gelu s obsahem SDS (sodium dodecyl

sulfát). Polyakrylamidový gel se vytvoří polymerací dvou hlavních složek: akrylamidu

a N,N – methylenbisakrylamidu. Jako katalyzátor reakce se přidává peroxodisulfát amonný

(NH4)2S2O8 a N,N,N′,N′-tetramethylethylendiamin (TEMED). Dle vzájemného poměru

akrylamidu a N,N – methylenbisakrylamidu vzniká gel s póry o definované velikosti, proto je

určující pro rychlost průchodu proteinu gelem: procentuální zastoupení akrylamidu v gelu,

vzájemný poměr akrylamidu a a N,N – methylenbisakrylamidu, použitý elektroforetický pufr

a velikost proteinu. [29].

Funkcí SDS je denaturace proteinů a schopnost obalit protein, který tím získá negativní náboj.

Konečný náboj proteinu po vazbě s SDS je vždy negativní. Vazba SDS na proteinový řetězec

je 1,4 g SDS na 1,0 g proteinu [29]. Molekuly proteinů se pak pohybují v gelu na základě

velikosti ve směru elektrického gradientu. Proteiny o malé molekulové hmotnosti se pohybují

rychleji než proteiny s velkou molekulovou hmotností [2].

Elektroforeticky rozdělené proteiny v gelu je možné následně vizualizovat pomocí barvení

např. stříbrem, Amidočerň, Comassie Blue.

Pro přípravu a provedení elektroforézy se používá řada modifikací, jednou z nejčastěji

využívaných modifikací je modifikace podle Laemmliho [3]. SDS-PAGE se standardně

provádí ve vertikální elektroforetické vaně se speciálním zdrojem viz. Obr. 8 a Obr. 9.

Obr.8 Aparatura pro vertikální elektroforézu (zleva: stojan na nalévání gelu, rám k

upevnění skel, plastový hřebínek, skla pro vertikální elektroforézu, pomůcka k

aplikaci vzorku, upínací rám s elektrodami, elektroforetická vana); modifikováno

dle [35]

Obr.9 Obrázek způsobu nanášení vzorku na gel umístěný v aparatuře vertikální

elektroforézy; modifikováno dle [1]

1.2.6 Western blot

Metoda Western blot se používá pro detekci proteinů rozdělených pomocí elektroforézy

v polyakrylamidovém gelu a následně přenesených na speciální membránu pomocí

elektroforetického transferu. V této metodě se používá speciální membrána vyrobená

z nitrocelulózy nebo PVDF (polyvinyl difluorid). Nitrocelulózová membrána má vysokou

vazebnou kapacitu (249 μg/cm2) a malé póry, proto se hodí pro analýzu proteinů o malé

velikosti. Nitrocelulózová membrána může být do blotovacího pufru položena suchá,

po provedení Western blotu barvena mnoha z barvících postupů pro proteiny. Nelze ji použít

v kombinaci s organickými činidly. PVDF membrána má sice vazebnou kapacitu nižší

(172 μg/cm2), ale je mechanicky odolnější a vhodná pro imunobloty s imunodetekcí (detekce

protilátkou). Před vložením do blotovacího pufru je nezbytné PVDF membránu smočit

v methanolu.

Gel s elektroforeticky rozdělenými proteiny se položí na speciální membránu a následně se

vsune do blotovací cely. Za působení elektrického napětí a speciálního pufru dojde k přenosu

proteinu z gelu na membránu (membrána je otiskem gelu). Pro efektivní transfer v rámci 1-3

hodin by mělo být aplikováno 5-10 V/cm-1 [9]. Z polyakrylamidového gelu se působením

blotovacího roztoku a napětí proteiny uvolní, zbaví zbytků z gelu (SDS, glycin) a adsorbují na

membránu. Součástí blotovacího pufru pro PVDF membrány bývá také metanol, jehož

úkolem je rozvolnit komplex protein-SDS, a tím zvýšit afinitu vazby proteinu na membránu.

Za stejným účelem lze do blotovacího roztoku přidat SDS, který sníží vazebnou afinitu

proteinu k membráně, ale zvýší jeho mobilitu, a tím zvýší jeho migraci [3].

V praxi se používají dva typy Western blotu: mokrý a polosuchý. Mokrý blot tzv. “tank

blotting“ je časově náročnější, proto je třeba jej chladit a také se spotřebovává více

blotovacího pufru. Výhodou tohoto blotu je, že nedochází k rozpadu proteinů vlivem tepla,

proto je vhodnější jeho použití pro termolabilní proteiny. Polosuchý blot tzv. „semidry

blotting“ naopak chlazení nevyžaduje, má malou spotřebu blotovacího pufru a jeho provedení

je rychlejší [2].

Vzhledem k časové úspoře se častěji používá polosuchý blot, jehož schématické uspořádání je

znázorněno na Obr. 10.

Obr. 10 Schéma uspořádání polosuchého blotu: mezi katodu a anodu je umístěn gel

s membránou, na který je z obou stran přiložen filtrační papír navlhčený blotovacím

pufrem; modifikováno dle [9]

Detekce Western blotu je možná barvícími postupy pro barvení proteinů (např. Amidočerň,

Comassie Blue, koloidní zlato) nebo imunodetekcí. [3]. Pro imunodetekci se používá buď

jednokroková detekce tzn. protein na membráně je detekován přímo značenou protilátkou

a následně substrátem anebo dvoukroková (viz Obr. 11), kdy je použito primární protilátky,

sekundární značené protilátky a substrátu. Mezi jednotlivými kroky se membrána promývá

promývacím roztokem pro odstranění nespecifických vazeb. Dvoukroková detekce je

považována za citlivější a specifičtější [3].

Obr. 11 Princip dvoukrokové imunodetekce metodou Western blot antigenu protilátkou

(zahrnuje proces blokování, aplikace primární protilátky a následně sekundární

protilátky, detekce vhodným substrátem); modifikováno dle [5]

1.2.7 ELISA

Tuto metodu je možné použít v různém uspořádání (kompetitivní, sandwich), ale pro zjištění

základní interakce mezi proteinem a specifickou protilátkou proti tomuto proteinu je vhodný

systém sendvičové detekce (titrace protilátek) - nepřímá ELISA. Antigen (protein) vázaný na

pevnou fázi, což je speciální polystyrenová destička s hydrofilními vazebnými místy pro

kvalitní navázání biomolekul [22].

Na navázaný antigen se váže specifická protilátka, na kterou se po promytí naváže enzymem

značená sekundární protilátka (konjugát), která je vlastně protilátkou proti primární protilátce.

Takto vzniklý komplex je detekován vazbou substrátu na enzymem značenou protilátku za

vzniku barevného zabarvení roztoku. Celá reakce se ukončí přidáním stop roztoku. Intenzita

zbarvení roztoku se měří spektrofotometricky. Intenzita zbarvení vyjadřuje míru funkčnosti

protilátky.

Mezi jednotlivými kroky provedení nepřímé ELISA se pro eliminaci nespecifických vazeb

používají blokovací a promývací roztoky, které mohou obsahovat bovinní sérový albumin

(BSA) nebo sérum novorozených telat (NBCS) anebo detergenty jako např. Tween 20 [22].

1.2.8 Imunohistochemie

Imunohistochemie je metoda, při které jsou detekovány antigeny (proteiny) v tkáních za

pomocí specifických protilátek, které se vážou na cílový protein v tkáni a následně jsou

detekovány detekčním systémem obsahujícím sekundární protilátku. Následně dojde

k vizualizaci vzniklého komplexu např. fluorescenčně nebo enzymaticky za použití vhodného

substrátu.

Vzorky tkání, ve kterých se prokazuje přítomnost a distribuce proteinu, jsou buď nativní –

(vzorky se před přípravou řezů zmrazí) nebo denaturované (vzorky jsou uchovávány buď ve

formalínu nebo jsou zality v parafínu). Při přípravě denaturovaných vzorků prochází tkáň při

přípravě procesy, které ovlivňují kvalitu proteinů obsažených v tkáních – může dojít k jejich

denaturaci [17].

Tato metoda je často využívána v diagnostice nádorů.

Cíl práce

V době progresivního rozvoje řady disciplín lékařského a biologického výzkumu je nutno

rozvíjet metody, které tato odvětví potřebují a používají. Řada těchto metod je postavena na

využití zvířecích protilátek. Využití protilátek umožňuje zvýšit citlivost a specifitu řady

metod.

Jednou z civilizačních chorob současné doby je obezita spojená s dalšími negativními faktory

jako např. hypertenze, Diabetes Mellitus Typu 2. Proto se současný výzkum soustředí na

hledání genů (a následně proteinů), které jsou za tento problém zodpovědné. Jedním z těchto

proteinů je i Human Adiponectin. Studium hladin tohoto proteinu v krvi je v současné době ve

středu zájmu vědců. Intenzivní snahou je vyvinout metodu pro stanovení hladin Adiponectinu

v krvi. Jednou z vhodných metod je např. ELISA. Pro vývoj metody ELISA

(imunodiagnostická metoda) je nezbytné připravit kvalitní funkční protilátku. Funkční

protilátky bude možno následně využít v laboratorní diagnostice.

Cílem práce je:

1. připravit polyklonální protilátky (králičí a ovčí) proti proteinu Human Adiponectin.

Zvířata (králíci, ovce) budou imunizována proteinem Human Adiponectin podle

standardního imunizačního schématu s následným získáním imunních sér. Ze

získaných imunních sér budou izolovány polyklonální protilátky

2. Testování funkčnosti připravených polyklonálních protilátek pomocí laboratorních

metod jako je Western blot a IHC.

2. MATERIÁL A METODIKA

2.1 ImunizaceImunizace králíků byla provedena v akreditovaném zařízení pro chov laboratorních zvířat

firmy BioVendor – Laboratorní medicína, a.s. podle zákona 246/ 1992 Sb., na ochranu zvířat

proti týrání, ve znění pozdějších předpisů.

Imunizace ovcí byla provedena ve spolupráci s firmou Zooservis.

Pro proces přípravy imunního séra není podstatné plemeno ani pohlaví zvířete. Je dáván důraz

hlavně na odpovídající velikost a výborný zdravotní stav zvířete.

Zvířatům (králíkům i ovcím) byl před první aplikací antigenu proveden tzv. předimunizační

odběr (cca 2 - 5 ml) krve . Sérum z této krve se dál používalo jako kontrolní odběr (negativní

kontrola).

Jako imunizační antigen se použil recombinant Human Adiponectin (HEK) RD172023100 –

jedná se rekombinantní protein, který byl připraven v buněčné linii HEK293 (human

embryonic kidney cell cultures), to znamená eukaryotní expresí.

Chemikálie a pomůcky:

Inkompletní Freundovo adjuvans (ICFA) - Sigma

Kompletní Freundovo adjuvans (CFA) – Sigma

Imunizační antigen - recombinant Human Adiponectin (HEK) RD172023100 – dodán

v lyofilizované formě (BioVendor – Laboratorní medicína a.s.)

Aqua pro injectione infusia (Ardeapharma a.s.)

Betadine

50% etanol

Buničina

Tuby o objemu 50 ml

Injekční stříkačky pro aplikaci inzulínu

Injekční stříkačky o objemu 2 ml

Injekční jehly o průměru 0,45 mm a 0,9 mm

Kovové spojky

33

2.1.1 Příprava antigenu

Těsně před imunizací se potřebné množství imunizačního antigenu (antigen byl lyofilizovaný)

rozpustilo v injekční vodě na koncentraci 1 mg/ml. Vzniklá směs se smíchala s adjuvans

v poměru 1:1 viz. postup níže.

Postup:

1. Adjuvans se před použitím důkladně promíchalo.

2. Do injekční stříkačky o objemu 2 ml se pomocí injekční jehly, v případě první

imunizace natáhlo CFA adjuvans (množství potřebné na 1 králíka/ovci), v případě

dalších imunizací ICFA adjuvans (množství potřebné na 1 králíka/ovci) viz.

imunizační protokol.

3. Pomocí injekční jehly se do téže injekční stříkačky natáhlo příslušné množství

rozpuštěného antigenu.

4. Odstranila se injekční jehla a na stříkačku se nasadila kovová spojka. Pomocí spojky

se připojila další stříkačka (používaná pro aplikaci inzulínu) - na hrot druhé stříkačky

(2 ml) se nasadila tenkým koncem kovová spojka a širokým koncem se spojila

s hrotem stříkačky s podávanou látkou.

5. Střídavým stlačováním pístů obou stříkaček se směs promíchala až vznikla stabilní

emulze. Směs se ponechala ve stříkačce pro aplikaci inzulínu, odstranila se kovová

spojka a nasadila injekční jehla o průměru 0,45 mm.

6. Směs tak byla připravena k aplikaci dle imunizačního schématu.

2.1.2 Vlastní imunizace zvířatVšechny aplikace antigenu byly provedeny subkutálně (s.c.) dle imunizačního schématu

uvedeného níže. Dávky antigenu byly zvoleny s ohledem na velikost a druh zvířete.

Postup:

1. Před imunizací se zvířatům odebralo 2 ml (u králíků) nebo 5 ml (u ovcí) krve dle

postupu viz. kapitola 2.1.3. Získané sérum se při dalších testech používalo jako

negativní kontrola.

2. Následně se rozpuštěný antigen smíchal s kompletním Freundovým adjuvans – CFA

v poměru 1:1.

3. Místo vpichu se dezinfikovalo 50% etanolem.

34

4. Imunizace se provedla injekční soupravou pro aplikaci inzulínu s tenkou ostrou jehlou

o průměru 0,45 mm a tenkou stříkačkou o objemu 1 ml. Směs antigenu s CFA

se aplikovala do hřbetu králíka/ovce rovnoměrně do 2 míst (2 vpichy).

5. Po několika dnech se kolem míst vpichů může vytvořit zánětlivé ložisko, proto se tato

místa kontrolovala a ošetřovala přípravkem Betadine.

6. Další aplikace antigenu se prováděly rovněž subkutálně (s.c.). Rozpuštěný antigen

se smíchal s inkompletním Freundovým adjuvans – ICFA v poměru 1:1.

7. Dále se postupovalo viz body č. 2, 3, 4 tohoto postupu.

8. Poslední den imunizačního schématu se provedl odběr krve.

Imunizační schémata

Imunizační schéma pro imunizaci králíků

0. den Odběr kontrolní odběr 2 ml krve

1. den s.c. 200 µg antigenu + CFA

21. den s.c. 200 µg antigenu + ICFA



52. den Odběr 50 ml krve

Imunizační schéma pro imunizaci ovcí

0. den Odběr kontrolní odběr 5 ml krve

1. den s.c. 1000 µg antigenu + CFA




52. den Odběr 500 ml krve

2.1.3 Odběr krve

Kontrolní odběry krve se provedly v případě králíka z ušního boltce - z středové ušní žíly (cca

2 ml), v případě ovce z vena jugularis (cca 5 ml). Produkční odběry krve se rovněž provedly u

králíka z ušního boltce a v případě ovce z vena jugularis.

Postup:

1. Místo odběru se dezinfikovalo 50% etanolem.

35

2. Vpich se provedl injekční jehlou o průměru 0,9 mm v protisměru toku krve v žíle.

3. Krev se odebírala do připravené označené zkumavky (tuba o objemu 50 ml) a podobu

odběru se kontrolovala intenzita vytékající krve a zapíchnutí jehly.

4. Po skončení odběru se krvácení zastavilo stisknutím žíly těsně před místem vpichu,

vytáhla se jehla, přiložila buničina a místo se opět dezinfikovalo 50% etanolem.

5. Zvířeti se zajistil dostatečný přísun tekutin.

2.2 Zpracování krve

Chemikálie a pomůcky:

Termostat s teplotou 37°C

Centrifuga U-320R BOECO

Tuby o objemu 50 ml

Postup:

1. Odebraná krev v tubách se nechala 20 minut srážet (v termostatu při 37 oC).

2. Ze sražené krve se odseparoval krevní koláč.

3. Tuby se sérem se ponechaly přes noc při 4 oC.

4. Následující den se vzorky centrifugovaly při 4000 otáčkách/při 4 oC - po dobu

20 minut.

5. Sérum se slilo do nové tuby a znovu se centrifugovalo při 4000 otáčkách/při 4 oC –

po dobu 20 minut.

6. Sérum se slilo do nové označené tuby.

7. Séra se uchovávala pro následné testy při - 20 °C.

2.3 Testování imunních sérPro testování imunních sér (jak králičích, tak ovčích) se používá metoda nepřímá ELISA.

V testu se využívá speciálně připravená destička s potaženým antigenem, který byl použit

k imunizaci. Imunní sérum (které obsahuje polyklonální protilátky) se pak následně ředí

v několika řadách (tzv. trojkové ředění) a aplikuje se na desku. Následně, po promytí,

se použije speciální konjugát (určený podle typu testovaného séra/protilátky) např. anti-králičí

nebo anti-ovčí a následně detekční roztok (což je látka, která se zbarví podle množství

a kvality protilátky v séru). Čím intenzivnější zabarvení, tím více protilátky. Celá reakce

se zastaví roztokem s kyselým pH (použití kyseliny sírové). Spolu se vzorkem imunního séra

se testuje i sérum z preimunního odběru. Intenzita zbarvení jednotlivých vzorků se následně

36

měří spektrofotometricky.

2.3.1 Vazba desek pro test nepřímá ELISA - vazba antigenu na desku

Chemikálie a pomůcky

Antigen recombinant Human Adiponectin (HEK), RD172023100 (BioVendor – Laboratorní

medicína a.s.), c=1 mg/ml (koncentrace stanovena metodou BCA viz. kap.2.5.1.)

Vazný roztok

Promývací roztok

Ředící a blokovací roztok

Mikrotitrační polystyrenové desky HIGH BINDING (Costar)

Sada pipet + multikanálová pipeta+špičky

Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5 ml)

Sada plastových zkumavek (13ml)

Gumové rukavice

Vaničky na reagencie (60 ml)

Promývačka mikrotitračních desek (Columbus Washer fy TECAN Austria G.m.b.H.)


Laboratorní míchačka

pH metr

Ředící a blokovací roztok (TBS-Tween-Želatina)

Navážka na 1000 ml:

Tris-base (Fluka) 30,286 g

NaCl (Lach-Ner) 43,850 g

Tween 20 (Riedel-de Haen) 2,500 g

HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH = 7,2

(asi > 20 ml)

Rybí želatina – prášková (Sigma) 1,0 g

Thimerosal (Sigma) 0,2 g

Deionizovaná voda asi 1000 ml

Postup:

Tris-base a NaCl se rozpustily v 950 ml destilované vody a přídavkem HCl se upravilo pH na

hodnotu 7,2. Přidal se Tween 20 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 1000 ml.

37

Roztok se důkladně promíchal.

Za stálého míchání se přidala navážka želatiny a nechala se míchat až do úplného rozpuštění.

Následně se doplnil objem deionizovanou vodou na celkový objem 1000 ml, přidal se

Thimerosal a roztok důkladně se promíchal na míchačce.

Vazný roztok (0,1 M hydrogenuhličitanový roztok)


NaHCO3 (Sigma) 8,2 g

Deionizovaná voda 1000 ml

Postup:

Navážka NaHCO3 se rozpustila v 900 ml deionizované vody a doplnila deionizovanou vodou

na objem 1000 ml a promíchala se na míchačce.

Promývací roztok (TBS-Tween)




Tween 20 (Riedel-de Haen) 2,500 g

HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH = 7,2

(asi > 20 ml)


Postup:

Tris-base a NaCl se rozpustily v 950 ml destilované vody a přídavkem HCl se upravilo pH na

hodnotu 7,2. Přidal se Tween 20 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 1000 ml.

Roztok se důkladně promíchal.

Postup metody vazby antigenu na desku:

1. Do 10 ml Vazného roztoku se za stálého míchání na míchačce přikapával 0,25 ml

rozpuštěného antigenu (c=1 mg/ml) tak, aby nedošlo ke sražení antigenu.

2. Roztok se nechal míchat alespoň 20 minut.

3. Roztok rozmíchaného antigenu se vlil do vaničky na reagencie a pomocí

multikanálové pipety se naneslo do každé jamky mikrotitrační desky 100 μl roztoku

antigenu.

38

4. Deska se přikryla víčkem a nechala se inkubovat přes noc při 4°C

5. Další den se deska 1x promyla Promývacím roztokem na promývačce.

6. Deska se zablokovala přidáním Ředícího a blokovacího roztoku – pomocí

multikanálové pipety se do každé jamky naneslo 300 μl Ředícího a blokovacího

roztoku.

7. Deska se nechala inkubovat 30 minut při pokojové teplotě.

8. Deska se 3x promyla Promývacím roztokem na promývačce.

9. Deska se nechala uschnout při laboratorní teplotě.

10. Následující den se deska zatavila do popsaného aluminiového sáčku.

Takto připravené desky se skladovaly při laboratorní teplotě a byly připraveny k následnému

testování imunních sér i vypurifikovaných protilátek.

2.3.2 Metoda nepřímá ELISA pro testování imunních sér


Králičí imunní sérum a preimunní sérum

Ovčí imunní sérum a preimunní sérum

Mikrotitrační polystyrenová deska potažená příslušným antigenem (recombinant Human

Adiponectin (HEK) RD172023100)

Promývací roztok (viz. kap. 2.3.1)

Ředící a blokovací roztok (viz. kap. 2.3.1)

Zastavovací roztok

Konjugát: Anti Rabbit - HRP (DAKO) pro stanovení titru králičích protilátek

Anti Goat/Sheep – HRP (DAKO) pro stanovení titru kozích/ovčích

protilátek

Substrát: TMB Peroxidase Substrate (Seramun)

Sada pipet + multikanálová pipeta + špičky



Gumové rukavice




Analyzátor mikrotitračních desek (MRX II Dynex Technologies)

39

Zastavovací roztok (0,2 M H2SO4 )


H2SO4 96% (Lach-Ner) 11,1 ml


Postup:

Odměřené množství 11,1 ml H2SO4 se přidalo k 950 ml deionizované vody. Objem se doplnil

deionizovanou vodou do celkového objemu 1000 ml a roztok se promíchal na míchačce.

Postup provedení metody Nepřímá ELISA

1. Vzorky imunních sér (jak ovčích, tak králičích) se předředily ve zkumavce v poměru

1:100 v Ředícím a blokovacím roztoku (10 l séra + 990 Ředícího a blokovacího

roztoku). Stejně se předředila i séra z kontrolních odběrů.

2. Na mikrotitrační desku (s navázaným antigenem) s potřebným množstvím stripů –

1 vzorek = 1 strip - se kromě řady A napipetovalo 100 l/jamka Ředícího

a blokovacího roztoku.

3. Do jamek A se napipetovaly předředěné vzorky 1:100 imunních a preimunních sér

v objemu 150 l/jamka.

4. Vzorek se naředil přenesením 50 l z řady A ke 100 l Ředícího a blokovacího

roztoku v řadě B, 5x se promíchal pipetou, odtud se přenesl opět 50 l do řady C,

5x se promíchal a takto se postupovalo až do řady G; posledních 50 l z řady G se jen

odebralo a dál již nepoužilo (tzv. trojkové ředění).

5. V řadě H zůstalo jen 100l Ředícího a blokovacího roztoku jako blank.

6. Deska se inkubovala 1h při pokojové teplotě.

7. Připravilo se potřebné množství adekvátního konjugátu - Anti Rabbit - HRP v ředění

1:2 000 pro stripy s králičími séry, Anti Sheep/goat - HRP v ředění 1:2 000 pro stripy

s ovčími séry. Konjugáty se ředily Ředícím a blokovacím roztoku (na 1 strip 1ml

roztoku konjugátu).

8. Deska se 3x promyla Promývacím roztokem.

9. Do všech jamek se napipetovalo 100 l konjugátu/jamka.

10. Deska se inkubovala 1h při pokojové teplotě.

11. Deska se 3x promyla Promývacím roztokem.

12. Do všech jamek se napipetovalo 100 l substrátu/jamka.

13. Deska se ponechala 10min. inkubovat (desku je třeba ochránit před světlem).

40

14. Po 10 min. inkubace se reakce zastavila přidáním Zastavovacího roztoku

100 l/jamku.

15. Deska se měřila na analyzátoru spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm.

2.4 Purifikace polyklonálních protilátekPurifikace polyklonálních protilátek imunního séra se provedla tzv. afinitní purifikací tzn.,

že se použila kolona naplněná nosičem s navázaným proteinem (imunizačním antigenem).

Po purifikaci imunního séra se získala králičí (ovčí) polyklonální protilátka, která byla použita

k dalším testům.

Postup přípravy kolony, stejně jako postup izolace protilátky jsou majetkem společnosti

Biovendor – Laboratorní medicína a.s.

2.5 Zpracování protilátek

2.5.1 Stanovení koncentrace bílkoviny (proteinu, protilátky) metodou BCAKe stanovení celkové koncentrace bílkoviny se využívá metody BCA. Jedná se

o kolorimetrickou detekci a kvantifikaci, která je založená na principu redukce iontů

dvojmocné mědi Cu2+ na jednomocnou Cu+. Jednomocná měď vytváří s kyselinou

bicinchoninovou (BCA) v alkalickém prostředí (při pH=10) stabilní ve vodě rozpustný

modrofialový komplex. Absorbance barevného komplexu, která je úměrná koncentraci

bílkoviny, se měří spektrofotometricky za použití interferenčního filtru o vlnové délce

562 nm. Koncentrace měřeného vzorku se odečítá z křivky vytvořené ze standardů o známé

koncentraci, které jsou naředěny ve stejném pufru jako měřený vzorek. Standardy jsou

připraveny z bovinního sérového albuminu a jejich koncentrace je v rozsahu v rozsahu

0,1 až 1,0 mg/ml. V případě, že je koncentrace měřeného vzorku vyšší než 1 mg/ml, je

potřeba vzorek naředit, a zopakovat měření.


Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)

PBS pufr (0,1M; pH 7,2)


Temperovaná třepačka na mikrotitrační desky (Thermostar - ASYS Hitech)

Analyzátor mikrotitračních desek s interferenčním filtrem 562 nm

Mikrotitrační deska: Typ P, polystyrenová s plochým dnem (Gama)

41



Špičky pro pipety


Gumové rukavice

PBS pufr (0,1M; pH 7,2)


Na2HPO4 (Fluka) 56,80 g

NaH2PO4 (Sigma) 12,00 g



Postup:

Navážka Na2HPO4 se rozpustila za stálého míchání asi v 950 ml destilované vody. Po úplném

rozpuštění se přidala další navážka NaH2PO4 a nechala se dokonale se rozpustit. Dále byla

přidána navážka NaCl a objem byl doplněn deionizovanou vodou na celkový objem 1000 ml.

Postup provedení metody BCA:

Stanovení koncentrace protilátky se provedlo dle návodu výrobce přiloženého ke kitu firmy

Thermo Scientific. Jako standardy byly použity roztoky bovinního sérového albuminu (BSA),

které se připravily ředěním zásobního roztoku bovinního sérového albuminu o koncentraci

2000 g/ml (součást kitu) dle následujícího schématu:

Č. standardu Diluent Zásobní roztok (BSA) Finální koncentrace

1 250 l 250 l 1,0 mg/ml

2 300 l 200 l 0,8 mg/ml

3 350 l 150 l 0,6 mg/ml

4 400 l 100 l 0,4 mg/ml

5 450 l 50 l 0,2 mg/ml

6 475 l 25 l 0,1 mg/ml

7 500 l 0 l 0 mg/ml = Blank

Jako diluent se použil PBS (0,1M; pH 7,2). Z výsledků absorbance standardů se sestavila

kalibrační křivka, ze které byly podle dosažené absorbance odečteny koncentrace měřených

vzorků bílkovin (proteinů, protilátek).

42

2.5.2 Nepřímá ELISA pro testování vypurifikovaných polyklonálních protilátek

Vypurifikované polyklonální králičí a ovčí protilátky se rovněž testovaly v metodě Nepřímá

ELISA, stejně jako imunní séra. Pro stanovení titru připravené specifické králičí a ovčí

protilátky proti proteinu Human Adiponectin byla provedena nepřímá ELISA.


Králičí polyklonální protilátka proti Human Adiponectin

Ovčí polyklonální protilátka proti Human Adiponectin

Mikrotitrační polystyrenová deska potažená příslušným antigenem (recombinant Human

Adiponectin (HEK) RD172023100)



Zastavovací roztok (viz. kap. 2.3.2)

Konjugát: Anti Rabbit - HRP (DAKO) pro stanovení titru králičích protilátek

Anti Goat/Sheep - HRP (DAKO) pro stanovení titru kozích/ovčích

protilátek

Substrát: TMB Peroxidase Substrate (Seramun)

Sada pipet + multikanálová pipeta + špičky



Gumové rukavice




Analyzátor mikrotitračních desek (MRX II Dynex Technologies)

Postup provedení metody Nepřímá ELISA:

Vzorky musí být čiré – zákal může způsobit zkreslení metody. Pokud se ve vzorku objevil

zákal nebo sraženina bylo nutné vzorek v mikrozkumavce typu Eppendorf předem odstředit

v centrifuze při 15 000 otáčkách/při 4 oC - po dobu 20 minut.

1. Vypurifikovaná protilátka se na počátku testování předředila v Ředícím a blokovacím

roztoku na koncentraci 0,1 μg/ml na základě stanovené koncentrace metodou BCA

(viz. kap. 2.5.1).

43

2. Na mikrotitrační desku (s navázaným antigenem) s potřebným množstvím stripů –

1 vzorek = 1 strip - se kromě řady A napipetovalo 100 l/jamka Ředícího

a blokovacího roztoku.

3. Do jamek A se napipetovaly předředěné vzorky protilátek v objemu 150 l/jamka.

4. Vzorek se naředil přenesením 50 l z řady A ke 100 l Ředícího a blokovacího

roztoku v řadě B, 5x se promíchal pipetou, odtud se přenesl opět 50 l do řady C,

5x se promíchal a takto se postupovalo až do řady G; posledních 50 l z řady G se jen

odebralo a dál již nepoužilo (tzv. trojkové ředění).

5. Další postup se shodoval s postupem testování imunních sér v metodě Nepřímá ELISA

– viz. kap.2.3.2. Postup dle bodů č. 5 – 15 v kapitole 2.3.2.

2.6 Elektroforéza (ELFO)Je metoda, která se používá k rozdělení proteinů v elektickém poli podle molekulové

velikosti. Podle velikosti proteinu se volí koncentrace gelu. Elektroforéza se použila:

1. Pro stanovení a optimalizaci antigenu pro protein Human Adiponectin se použil

12% gel a nanášel se antigen v množství 1,25; 2,5 a 5 μg/dráhu v redukčním

a neredukčním prostředí.

2. Testovaly se připravené protilátky a jejich schopnost reagovat s antigenem Human

Adiponectin a s nativním Human Adiponectinem, který se prokazoval v lidském séru.

Zde sloužila elektroforéza k separaci proteinů a následně se gel použil pro detekci

v metodě Western blot. Pro tyto elektroforézy se použil 8% gel pro neredukční

prostředí a 12% gel pro redukční prostředí.

2.6.1 Příprava polyakrylamidových gelů pro ELFO

Gely pro elektroforézu se skládají ze 2 častí - gelu separačního a gelu zaostřovacího. Byl

použit 4% zaostřovací gel, pro separaci pak separační gely 8% a 12% zvolené na základě

molekulové hmotnosti vzorku a v závislosti na redukčním/neredukčním prostředí.


40% Acrylamide solution (Bio-Rad)

2% Bis-Acrylamide solution (Bio-Rad)

10% Roztok SDS

Deionizovaná voda

Roztok Tris 1,5 M; pH 8,8

Roztok Tris 0,8 M; pH 6,8

44

pH metr



Láhve o objemu 1000 ml

Sada pipet + špičky

Gumové rukavice

10% Roztok SDS


SDS (Sigma) 10 g


Postup:

SDS se rozpustil v 80 ml deionizované vody, mírně se zahřál. Následně byl objem doplněn

deionizovanou vodou na objem 100 ml. Roztok se důkladně promíchal na míchačce.

Roztok 1,5 M Tris (pH 8,8)


Tris–base (Fluka) 9,1 g

HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH=8,8

(asi 0,97 ml)


Postup:

Tris se rozpustil v 50 ml deionizované vody. Přídavkem HCl bylo upraveno pH na hodnotu

8,8 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 100 ml. Roztok se důkladně promíchal

na míchačce.

Roztok 0,8 M Tris (pH 6,8)



HCl (Riedel-de Haen) pro dosažení pH=6,8


Postup:

45

Tris se rozpustil v 50 ml deionizované vody. Přídavkem HCl bylo upraveno pH na hodnotu

6,8 a roztok se doplnil deionizovanou vodou na objem 100 ml. Roztok se důkladně promíchal

na míchačce.

Zaostřovací gel (4% gel)

Na 100 ml gelu:

40% Acrylamide solution 9,6 ml

2% Bis-Acrylamide solution 5,2 ml

Roztok Tris 0,8 M; pH 6,8 25 ml

10% Roztok SDS 1 ml

Deionizovaná voda 58,4 ml

Postup:

Všechny složky gelu se smíchaly a rozplnily do plastových zkumavek po 4 ml. Zkumavky

s gely se uchovávaly při -20 oC.

Separační gel (8% gel)

Na 100 ml gelu:

40% Acrylamide solution 19,5 ml

2% Bis-Acrylamide solution 10,7 ml


10% Roztok SDS 1 ml


Postup:



Separační gel (12% gel)

Na 100 ml gelu:

40% Acrylamide solution 29 ml

2% Bis-Acrylamide solution 16 ml


10% Roztok SDS 1 ml


Postup:

46



2.6.2 Příprava vzorků


Vzorkový pufr – neredukující

Vzorkový pufr – redukující

Roztok bromfenolové modři

Proteinový standard – (Bio-Rad kat. č. 161-0304)

Antigen recombinant Human Adiponectin (HEK), RD172023100 (BioVendor – Laboratorní

medicína a.s.), c=1 mg/ml (koncentrace stanovena metodou BCA viz. kap.2.5.1.)

Stříkačkový filtr 0,8 m a injekční stříkačky

Mikrozkumavky typu Eppendorf (1,5ml)


Gumové rukavice

Roztok bromfenolové modři


Bromfenolová modř (Bio Basic) 100 mg


Postup:

Bromfenolová modř se rozpustila ve 100 ml deionizované vody. Rozmíchala se na míchačce

a zfiltrovala přes filtr o velikosti pórů < 0.8 μm.

Vzorkový pufr – neredukující

Navážka na 10 ml:

Roztok 0,8 M Tris 2,4 ml

10% Roztok SDS 2,0 ml

Glycerol (Lach-Ner) 1,0 ml

Roztok bromfenolové modři 0,1 ml


Postup:

Všechny složky se rozpustily a rozmíchaly na míchačce.

47

Vzorkový pufr – redukující

Navážka na 10 ml:

Roztok 0,8 M Tris 2,4 ml

10% Roztok SDS 2,0 ml

Glycerol (Lach-Ner) 1,0 ml

Roztok bromfenolové modři 0,1 ml

2-merkaptoetanol (Sigma) 0,5 ml


Postup:


Postup přípravy vzorků pro elektroforézu

Vzorky se připravily smícháním se Vzorkovým pufrem (redukčním nebo neredukčním)

v mikrozkumavkách typu Eppendorf a to tak, aby byl minimální poměr vzorku a Vzorkového

pufru 1:1 a byly zachovány zvolené konečné koncentrace proteinu Human Adiponectin.

1) Vzorky v redukčním pufru se zahřály až k varu ve vodní lázni a vařily se po dobu 4 minut.

Zahřátí se provedlo těsně před nanesením vzorku na gel. Směs vzorku s pufrem se po uvaření

hned ochladila v nádobce s ledem a okamžitě se nanesla podvrstvením do startovacích jamek

připraveného (zpolymerovaného gelu). Spolu se vzorky se připravoval a nanášel i komerčně

dodávaný Proteinový standard, který se nejdříve naředil v poměru 1:20 (1 l Proteinového

standardu + 19 l Vzorkového pufru – redukujícího). Po povaření 4 minuty se na gel nanášelo

6 l této směsi.

2) Vzorky, které se míchaly se Vzorkovým pufrem - neredukujícím se nezahřívaly, ale směs

se přímo nanesla podvrstvením do startovacích jamek zpolymerovaného gelu. Opět

se používal i Proteinový standard, který se nanášel spolu s neredukovanými vzorky. Standard

se i v tomto případě používal jako redukovaný (vařil se) viz. výše.

2.6.3 Vlastní elektroforéza

ELFO elektrodový pufr

Roztok persíranu amonného

TEMED (Fluka)

Isobutanol (Lachema) = a-butylalkohol p.a.

Souprava Mini PROTEAN 3System (Bio-Rad)

48

Zdroj napětí


Gumové rukavice

Vzorky k testování (viz. kap. 2.6.2)

Roztok persíranu amonného

Navážka na 1 ml:

Persíran amonný (Bio-Rad) 100 mg


Postup:

Persíran amonný se rozpustil v 0,9 ml deionizované vody. Rozmíchal se pipetou. Roztok byl

připraven těsně před použitím.

ELFO elektrodový pufr



Glycin (Lach-Ner) 14,40 g

SDS (Sigma) 1,0 g


Postup:

Všechny složky se postupně rozpustily v 800 ml deionizované vody. Roztok se doplnil

deionizovanou vodou do objemu 1000 ml.

Provedení vlastní elektroforézy (pro gel 10 cm x 6,5 cm)

1. Připravila se 1 zkumavka zásobního roztoku separačního gelu příslušné hustoty

(8% nebo 12%) a 1 zkumavka zásobního roztoku zaostřovacího gelu (4%) - nechaly

se rozmrazit.

2. Sestavila se skla ze soupravy Mini PROTEAN 3System Bio-Rad a umístnila

se do nalévací vany.

3. Sestavila se elektroforetická souprava Mini PROTEAN 3System Bio-Rad

pro provedení elektroforézy, dle návodu výrobce.

4. K rozmraženému zásobnímu roztoku separačního gelu se přímo do zkumavky přidalo

40 μl roztoku persíranu amonného a 4 μl TEMED.

5. Po promíchání se separační gel nalil mezi sestavená skla umístěná v nalévací vaně -

49

asi 2 cm pod horní okraj.

6. Roztok gelu se opatrně rychle převrstvil isobutanolem nasyceným vodou v poměru 1:1

(připravuje se těsně před použitím)

7. Gel se nechal zpolymerovat při laboratorní teplotě po dobu asi 30 minut.

8. Převrstvený roztok se slil a hranice gelu se omyly destilovanou vodou (pomocí pipety)

9. K rozmraženému zásobnímu roztoku zaostřovacího gelu se přímo do zkumavky

přidalo 40 μl roztoku persíranu amonného a 4 μl TEMED.

10. Po promíchání se zaostřovací gel nalil na vrstvu zpolymerovaného separačního gelu –

nalil se až po horní okraj skel.

11. Rychle se do gelu zasunul hřebínek s potřebným množstvím drah (bez vytvoření

bublin).

12. Zaostřovací gel se také nechal zpolymerovat při laboratorní teplotě po dobu asi 30

minut.

13. Ze zpolymerovaného gelu se vyjmul hřebínek.

14. Do ELFO vany Mini PROTEAN 3System Bio-Rad se nalil ELFO elektrodový pufr

(používá se vždy čerstvý) tak, aby byly ponořeny elektrody, skla i okraj gelu - ELFO

pufr musel být i v jamkách gelu.

15. Za pomocí pipety se špičkou se opatrně promyly jamky přelitým pufrem – opatrným

opakovaným nasátím a vysátím.

16. Podvrstvením se nanesly vzorky a proteinový standard – objem vzorku závisí na

velikosti jamek (typu použitého hřebínku – 10 μl v případě deseti-jamkového hřebínku

a 5 μl v případě patnácti-jamkového hřebínku).

17. Sled vzorků na gelu se zaznamenal.

18. Souprava Mini PROTEAN 3System Bio-Rad se připojila ke zdroji napětí (napětí se

nastavilo na 100 V).

19. Elektroforéza se spustila a kontrolovalo se, zda gelem prochází proud – modrá barva

(vzorek) migroval ke spodní hranici gelu.

20. Poté, co modrá barva prošla zaostřovacím gelem (cca 10 min), zvýšilo se napětí na

200 V.

21. Elektroforéza se ukončila poté, co modrá barva doputovala asi 2 mm od spodního

okraje gelu (cca za 30 minut).

22. Zdroj se vypnul.

23. Skla se vyjmuly z vany pro elektroforézu.

50

24. Pomocí špachtle se opatrně odstranilo krycí sklo a odstranil se i zaostřovací gel.

25. Vlastní separační gel se opatrně přenesl ze skla do vaničky pro barvení gelů.

2.6.4 Barvení geluBarvící roztok

Odbarvovací roztok

Třepačka pro třepání gelů

Vaničky pro barvení gelů

Gel Logic 1500 Imaging Systém (Carestream Health, Inc.)

Gel, který se barvil


Gumové rukavice

Barvící roztok Navážka na 1000 ml:

Etanol denaturovaný (Lihovar Kojetín) 450 ml

Kyselina octová (Lach-Ner) 100 ml

Coomassie Blue R-250 (Sigma) 0,5 g


Postup:


Odbarvovací roztok Navážka na 1000 ml:

Etanol denaturovaný (Lihovar Kojetín) 250 ml

Kyselina octová (Lach-Ner) 100 ml


Postup:


Postup při barvení gelu:

1. Gel, který se měl barvit, se vložil do vaničky pro barvení gelů.

51

2. Gel ve vaničce se zalil Barvícím roztokem a nechal se pomalu třepat na třepačce

30 - 45 minut.

3. Poté se Barvící roztok opatrně slil.

4. Ke gelu do vaničky se přilil Odbarvovací roztok (Odbarvovací roztok se během

odbarvování několikrát, podle potřeby, vyměnil) a nechal se pomalu třepat na třepačce

2 – 4 hodiny podle barvy bandů na gelu (bandy proteinů byly modré a pozadí

bezbarvé ).

5. Odbarvený gel se vyfotil na přístroji Gel Logic 1500 Imaging System (Carestream

Health, Inc.).

2.7 Western blot (WB)Pomocí připravených polyklonálních protilátek se Human Adiponectin prokazoval

v nativním materiálu (lidském séru). Pro tento průkaz se použilo lidské sérum od dárce –

parametry: muž, věk 28, BMI = 23, nekuřák, bez zdravotních potíží, které se ředilo

ve Vzorkovém pufru redukčním a to 1:10, 1:50 a 1:100 a také ve Vzorkovém pufru

neredukčním opět v ředění 1:10, 1:50 a 1:100. Pro detekci v redukčním prostředí se použil

12% polyakrylamidový gel, na který se nanášely vzorky předředěného lidského séra v objemu

6 µl spolu s vybranou koncentrací proteinu Human Adiponectin (0,05 μg/dráhu)

a proteinového standardu (příprava vzorku viz. kap. 2.6.2).

Taktéž se připravovaly vzorky v neredukčním prostředí, tzn. tři ředění lidského séra, protein

Human Adiponectin (0,05 μg/dráhu) a proteinový standard (příprava vzorku viz. kap. 2.6.2)

a tyto byly naneseny na 8% gel.

Byla provedena elektroforéza viz. kap. 2.6.3.

2.7.1 Transfer proteinů z polyakrylamidového gelu na PVDF membránu


Separační gel (8% nebo 12%) se vzorky (v redukčním a neredukčním pufru), které byly

rozděleny za použití metody elektroforéza.

Blotovací roztok

Metanol (Lach-Ner)



PVDF Membrána pro Western blot – (Millipore)

52

Zdroj napětí

Souprava pro blotování (Bio Rad)



Buničina

Filtrační papír

Gumové rukavice

Vaničky pro barvení blotů

Pinzeta

Blotovací roztok pro polosuchý blot



Glycin (Lach-Ner) 7,20 g

SDS (Sigma) 0,50 g

Metanol (Lach-Ner) 200 ml


Postup:

Všechny složky se postupně rozpustily v 750 ml deionizované vody, přidal se metanol

a roztok se doplnil do objemu 1000 ml deionizovanou vodou. Pufr se vždy připravoval

čerstvý.

Postup pro vlastní provedení blotování na membránu:

1. PVDF membrána se ustřihla na velikost gelu a před použitím smáčela v metanolu

(asi 10 sekund) a následně v Ředícím a blokovacím pufru.

2. Ihned po ukončení elektroforézy se gel vyjmul z elektroforetické aparatury, odřízl se

a odstranil zaostřovací gel.

3. Označil (odříznul) se pravý dolní roh separačního gelu.

4. Na podložku se položila ta část blotovacího zařízení, která obsahuje katodu = záporný

pól.

5. Na katodu se položilo asi 10 vrstev filtračního papíru nasyceného Blotovacím pufrem.

6. Položila se další vrstva - silný chromatografický papír nasycený Blotovacím pufrem.

53

7. Položil se gel (uříznutým rohem - vlevo dole).

8. Na gel se položila nasycená PVDF membrána (viz. bod 1 tohoto protokolu).

9. Odstranily se bublinky - vzduch mezi gelem a membránou !

10. Membrána se opět pokryla silným chromatografickým papírem nasyceným

Blotovacím pufrem.

11. Následně se položilo dalších 10 vrstev filtračního papíru nasyceného Blotovacím

pufrem.

12. Nakonec se položila část blokovacího zařízení, kde se nachází anoda = kladný pól.

13. Blotovací zařízení se připojilo ke zdroji napětí a zvolil se výkon 500 mA.

14. Blotování probíhalo po dobu 30 min.

15. Po ukončení blotování se označil roh membrány (ustřižením) – stejný, který byl

ustřižen i na gelu.

16. Po ukončení blotování se provedla kontrola provedení metody – odstřihl se proužek

membrány se standardem (opět odstřižením označen roh tohoto proužku).

17. Kontrolní barvení membrány – proužku se standardem – se provádělo separátně

od membrány se vzorky (postup viz. kap. 2.7.2.)

18. Membrána se vzorky se blokovala - vložila do vaničky a zalila se Ředícím

a blokovacím roztoku. Blokování probíhalo přes noc; při 4 O C.

19. Další den se membrána promyla 2x po 5 minutách v Promývacím roztoku

20. Takto připravená membrána se ihned imunochemicky detekovala.

2.7.2 Barvení proužků se standardy amidočerní

Amidočerní se barvil proužek (s proteinovým standardem), který se ustřihl z membrány

pro provedení blotování.


Roztok amidočerni

Roztok 5% kyseliny octové



54

Gumové rukavice

Deionizovaná voda


Pinzeta

5% Roztok kyseliny octové


Kyselina octová (BAKER) 5 ml


Postup:

Kyselina octová se rozpustila v 95 ml deionizované vody. Roztok se dobře promíchal.

Roztok amidočerni

Navážka na 50 ml:

5% Kyselina octová 50 ml

Amidočerň (Fluka) 0,125 g

Postup:

Amidočerň se navážila a rozpustila v 50 ml 5% kyseliny octové. Roztok se dobře promíchal.

Postup pro barvení proužku se standardem amidočerní:

1. Proužek membrány se vložil do vaničky a barvil se po dobu 30 min. v roztoku

amidočerni za třepání na třepačce.

2. Odbarvení se následně provádělo v Odbarvovacím roztoku tak dlouho, až zůstaly

zřetelné pouze bandy standardu.

2.7.3 Imunodetekce membrán s navázaným proteinem




PBS pufr (0,1M; pH 7,2) (viz. kap. 2.5.1)

Králičí polyklonální protilátka proti lidskému Adiponectinu

Ovčí polyklonální protilátka proti lidskému Adiponectinu

Konjugát: Anti Rabbit - HRP (DAKO)

55

Anti Goat/Sheep - HRP (DAKO)

Substrátový roztok DAB


Gel Logic 1500 Imaging Systém (Carestream Health, Inc.)



Gumové rukavice

Deionizovaná voda


Pinzeta

Substrátový roztok DAB (3,3-diaminobenzidin)

Navážka na 10 ml:

DAB (Sigma) 8 mg

PBS pufr 10 ml

30% Peroxid vodíku (Lach-Ner) 10 μl

Postup:

Navážený DAB se rozpustil v 10 ml PBS pufru. Těsně před použitím se přidal peroxid

vodíku.

Postup detekce:

1. Protilátky se naředily v Ředícím a blokovacím roztoku na koncentraci 1 μg/ml

(na 1 membránu se počítá s objemem 10 ml) v plastových zkumavkách (zkumavky

se popsaly).

2. Promytá membrána se vložila do vaničky s roztokem protilátky a umístila na třepačku.

3. Membrány se v roztocích protilátek třepaly dobu 1 hodiny.

4. Poté se odstranil z vaničky roztok s protilátkou a na membránu se nalilo 10 ml

Promývacího roztoku. V něm se membrána ponechala po dobu 3-5 minut a zároveň

se třepala na třepačce.

5. Promývací roztok se z vaničky slil a postup se opakoval celkem 5x.

6. Připravil se roztok konjugátu – Anti Rabbit - HRP i Anti Goat/Sheep - HRP

konjugát se dle doporučení výrobce naředil v Ředícím a blokovacím roztoku v poměru

56

1:2 000 (na 1 membránu bylo potřeba 10 ml naředěného konjugátu).

7. Roztok konjugátu se vlil do vaničky s membránou a promíchal.

8. Vanička s membránou se nechala třepat po dobu 1 hodiny.

9. Roztok konjugátu se odstranil.

10. Opakovalo se promytí membrány viz. bod 4. a 5. tohoto postupu.

11. Těsně před použitím se připravil Substrátový roztok DAB viz. výše a roztok se nalil

namembránu ve vaničce.

12. Vyčkalo se až se na membráně objevily bandy.

13. Vyvolávání se ukončilo namočením membrány do deionizované vody.

14. Membrána po vyjmutí z vaničky s deionizovanou vodou se nechala volně vyschnout

na filtračním papíru.

15. Vysušené detekované membrány se sestavily společně s proužkem standardů, který

se barvil amidočerní, a převedly se do elektronické podoby vyfocením na přístroji Gel

Logic 1500 Imaging Systém (Carestream Health, Inc.)

2.8 Imunohistochemie (IHC)Vyizolované králičí protilátky se rovněž testovaly v imunohistochemicky. Testování bylo

provedeno ve spolupráci s Oddělením patologie nemocnice Sv. Zdislavy v Mostišti,

zastoupeným primářem MUDr. Václavem Vagundou, PhD., který testování přímo provedl.

Vzhledem k tomu, že nebyl dostupný detekční systém pro ovčí protilátky, testovala se pouze

králičí polyklonální protilátka.

Králičí polyklonální protilátky se testovaly na řezech ze vzorků pocházejících z lidského

benigního lipomu. Použil se formol-parafinový materiál. Antigeny se revitalizovaly

v citrátovém pufru (vařeno 20 min. při 93°C). Řezy byly blokovány roztokem Protein Block,

Serum Free (DAKO) 5 – 10 minut při pokojové teplotě.

Pro detekci se použila koncentrace polyklonální králičí protilátky 6 g/ml, inkubace přes noc

při 4°C a detekční systém Alkalická fosfatáza – Fuchsin (EnVision Kit, DAKO).

Připravené vzorky byly odečítány mikroskopicky a následně převedeny do elektronické

podoby za použití fotoaparátu Canon S70.

57

3. SOUHRN, VÝSLEDKY

Obr. 12 Srovnání absorbance králičího imunního a neimunního séra

Tabulka 1 Data pro Obr. 12

58

Obr. 13 Srovnání absorbance ovčího imunního a neimunního séra


59

Obr. 14 Závislost absorbance na koncentraci králičí polyklonální protilátky


Koncentrace protilátkyAbsorbance

protilátky1004,238503,683251,92812,50,8466,250,3213,1250,1231,5630,052blank0,024

Obr. 15 Závislost absorbance na koncentraci ovčí polyklonální protilátky


60

Koncentrace protilátkyAbsorbance

protilátky1002,718501,308250,5212,50,1946,250,0833,1250,0491,5630,031blank0,035

Obr. 16 recombinant Human Adiponectin 12% SDS-PAGE ELFO:

Dráha 1: recomb. Antigen 5 µg/dráhu, redukční

Dráha 2: recomb. Antigen 2,5 µg/dráhu, redukční


proteinový standard (Bio-Rad)

Dráha 4: recomb. Antigen 1,25 µg/dráhu, neredukční


Dráha 6: recomb. Antigen 5 µg/dráhu, neredukční

61

Obr. 17 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (neredukční

podmínky), detekce králičí polyklonální protilátkou:



Dráha 2: lidské sérum v ředění 1:100, neredukční



62

Obr. 18 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (redukční

podmínky), detekce králičí polyklonální protilátkou:



Dráha 2: lidské sérum v ředění 1:100, redukční



63

Obr. 19 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (neredukční

podmínky), detekce ovčí polyklonální protilátkou:






64

Obr. 20 Průkaz Human Adiponectin v lidském séru metodou Western blot (redukční

podmínky), detekce ovčí polyklonální protilátkou:






65

Obr. 21 Lidský benigní lipom – formol-parafinový materiál, detekční systém Alkalická

fosfatáza - Fuchsin (EnVision Kit, DAKO), (zvětšeno 20x)

66

4. DISKUSENa počátku se rozpustil lyofilizovaný antigen Human Adiponectin (HEK) v deionizované

vodě. V roztoku rozpuštěného antigenu se stanovila koncentrace bílkoviny metodou BCA

komerčně dodávaným kitem firmy Thermo Scientific. Koncentrace se stanovila za pomocí

standardní křivky, která se sestavila z absorbancí jednotlivých standardů BSA, naředěných

v deionizované vodě podle návodu výrobce. Výsledná koncentrace Human Adiponectin

(HEK) byla stanovena 0,114 mg/ml viz. Příloha 1. Tato koncentrace se používala jako

výchozí pro ostatní testy.

S výše uvedeným rozpuštěným antigenem se imunizovala zvířata (králík, ovce). Nejdříve se

odebral preimunní odběr krve, následně se zvířata imunizovala dle imunizačních schémat. Na

závěr imunizačních schémat se provedl produkční odběr krve. Odebraná krev se zpracovala

na sérum. Sérum z preimunního odběru i produkčního odběru se následně testovalo paralelně

vedle sebe na přítomnost specifických protilátek proti Human Adiponectin.

Ze získaných výsledků (viz Obr. 12 a Tabulka 1, Obr. 13 a Tabulka 2) je jasné, že při

základním ředění (100x) vykazovalo, jak králičí, tak ovčí preimunní sérum velmi nízkou

absorbanci (v případě králíka < 0,100 a v případě ovce < 0,300), zatímco imunní sérum

(králičí i ovčí) i při ředění více než 700 000x ještě stále vykazovalo absorbanci vyšší než

1,000. Z měření absorbancí jednotlivých ředění preimunních a imunních sér obou typů zvířat

je znát, že imunitní odpověď zvířat na aplikovaný antigen (Human Adiponectin) byla

adekvátní a získané imunní sérum obsahuje polyklonální protilátky proti Human Adiponectin

(HEK).

Z imunních sér se izolovaly pomocí specificky navázané kolony (s Human Adiponectin

(HEK)) specifické polyklonální protilátky. Pro další testování bylo třeba stanovit koncentraci

protilátek. Opět se použila metoda BCA s komerčně dodávaným kitem firmy Thermo

Scientific. Výsledná koncentrace králičí protilátky Human Adiponectin (HEK) byla stanovena

0,380 mg/ml viz. Příloha 2. Výsledná koncentrace ovčí protilátky Human Adiponectin (HEK)

byla stanovena 0,419 mg/ml viz. Příloha 2. Obě koncentrace se používaly jako výchozí pro

další testy.

Obě vypurifikované protilátky se naředily z výše zmíněných koncentrací tak, aby konečná

koncentrace byla 0,1 µg/ml. Takto naředěné protilátky se dále testovaly v metodě Nepřímá

ELISA, kde byly ještě dále postupně ředěny (viz. Obr. 14 a Tabulka 3, Obr. 15 a Tabulka 4).

Protilátky i při vysokých ředěních vykazovaly významný rozdíl v absorbancích ředěných

protilátek a blanku. V případě králičí protilátky při koncentraci protilátky 6,25 ng/ml byla

67

absorbance > 0,300 vzhledem k blanku, jehož absorbance byla 0,024. U ovčí protilátky byla

absorbance > 0,500 vzhledem k blanku, kde byla absorbance 0,035. I když na první pohled se

zdá, že králičí protilátka je lepší (citlivější), tzn., že při vyšším ředění vykazuje vyšší

absorbanci než ovčí protilátka, nemusí tomu tak být. Důvodem je použití různých typů

konjugátů v metodě Nepřímá ELISA (králík/anti-králičí konjugát; ovce /anti-ovčí konjugát),

které mohou být rozdílně citlivé k protilátkám. Proto nelze kvalitu obou protilátek (od

různých druhů zvířat) srovnávat. Výsledná kvalita protilátky a vhodnost pro použití v dalších

metodách je nutno vždy otestovat.

Rekombinantní protein Human Adiponectin (HEK) se testoval v metodě Elektroforéza (viz.

Obr. 16). Důvody byly dva:

1) snaha o optimalizaci koncentrace tohoto proteinu pro následnou metodu Western blot

2) zjištění zastoupení jednotlivých forem Adiponectinu v rekombinantním proteinu

Pro testování se použil 12% polyakrylamidový gel a protein o různých koncentracích

v redukčním a neredukčním pufru. Na gel byl nanesen redukovaný Adiponectin o koncentraci

1,25 μg/dráhu, 2,5 a μg/dráhu, 5 μg/dráhu a neredukovaný Adiponectin o koncentraci

1,25 μg/dráhu, 2,5 a μg/dráhu, 5 μg/dráhu. Redukovaný Adiponectin o všech třech

koncentracích vykazoval band mezi hmotnostními markery o velikosti 31 - 45 kDa účinkem

redukčního pufru a zahřátím vzorku došlo k rozrušení disulfidických můstků a a rozpadu na

monomerní jednotky Adiponectinu. Neredukovaný Adiponectin vykazoval ve všech ředěních

několik bandů (od sebe ne dobře odlišitelných) v molekulové velikosti mezi hmotnostními

markery 66 – 97 kDa, jedná se s největší pravděpodobností o dimer a trimer Adiponectinu.

Rovněž se v neredukovaném Adiponectinu, ve všech ředěních, vyskytují bandy

s molekulovou hmotností vyšší než 97 kDa, jedná se pravděpodobně o formy Adiponectinu

větší než je forma trimeru. V literatuře se uvádí rozdílná molekulová hmotnost pro různé

formy Adiponectinu (pro monomer 30 kDa, dimer 60 kDa, trimer 90 kDa …), než která byla

zjištěna na provedených gelech. Důvodem může být to, že v literatuře se používá predikovaná

(teoreticky spočítaná dle počtu aminokyselin) molekulová hmotnost, která může být rozdílná

od prakticky zjištěné molekulové hmotnosti. Rovněž v metodě Elektroforéza použitý

Adiponectin byl připraven kultivací v tkáňové kultuře linie HEK293. Jedná se o eukaryotní

tkáňovou linii, a proto získaný Adiponectin obsahuje posttranslační modifikace typu

hydroxylace, glykosilace, sialyzace. Tyto posttranslační modifikace mohou vést k změně

rychlosti průchodu proteinu (Adiponectinu) gelem.

Funkčnost získaných protilátek se testovala i v metodě Western blot. Detekoval se

68

Adiponectin přítomný v lidském séru. Použilo se lidské sérum v ředění 1:10, 1:50 a 1:100.

V redukčním prostředí se použil 12% gel a v neredukčním prostředí 8% gel. Koncentrace

polyakrylamidového gelu se zvolila dle optimalizace rekombinantního Human Adiponectinu

v elektroforéze. Ke vzorkům sér na oba typy gelů se rovněž přidal jako pozitivní kontrola pro

ověření správnosti provedení metody recombinant Human Adiponectin o koncentraci

0,05 μg/dráhu a proteinový standard pro zjištění molekulové velikosti detekovaných bandů.

Připravily se celkem dva 12% gely a dva 8% gely. Oba typy gelů se následně blotovaly a

získané membrány s navázaným proteinem se detekovaly připravenými polyklonálními

protilátkami o koncentraci 1µg/ml. Každou polyklonální protilátkou se detekoval, jak

Adiponectin na 12% gelu (redukčním), tak na 8% gelu (neredukčním).

V neredukčním prostředí byly králičí protilátkou (viz. Obr. 17) na membráně detekovány (ve

všech třech ředěních séra) nejasně definované bandy o velikosti nad 45 kDa, tzn. že nelze

přesně určit molekulovou hmotnost a může se jednat o komplexy různých forem

Adiponectinu, které se vyskytují v lidském séru [25, 30]. Rekombinantní protein Human

Adiponectin vykazoval band o velikosti 31 – 45 kDa, což odpovídá monomerní formě. Aby se

potvrdilo, že vysokomolekulární komplexy prokázané v lidském séru, jsou komplexy

Adiponectinu, byla provedena detekce králičí protilátkou v redukčním prostředí (viz Obr. 18).

V redukčním prostředí (došlo k rozrušení disulfidických můstků) byl prokázán band ve všech

ředěních lidského séra o molekulové hmotnosti v rozmezí 31 – 45 kDa. Band o stejné

molekulové velikosti byl prokázán i ve standardu rekombinantního Adiponectinu. Z výsledků

se dá usuzovat, že králičí polyklonální protilátka detekuje lidský Adiponectin v séru, jak

v redukčním, tak neredukčním prostředí. Nejasně definované bandy prokázané v lidském séru

(v neredukčním prostředí) mohou být označeny jako komplexy vyšších forem Adiponectinu.

Zároveň v nativním materiálu (lidském séru) v neredukčním prostředí nebyla detekována

monomerní forma (na rozdíl od rekombinantního proteinu), což naznačuje shodu s výsledky

dalších autorů, že se v krvi nevyskytuje monomerní forma Adiponectinu [38].

V testování ovčí polyklonální protilátka v metodě Western blot bylo dosaženo podobných

výsledků (viz. Obr. 19 a Obr. 20).

V případě srovnávání výsledků blotů, které byly detekovány oběma typy protilátek, stejně

jako v případě metody Nepřímá ELISA, se musí zohlednit to, že byly použity dva různé

konjugáty, takže intenzita bandu na membráně Western blotu nemusí odpovídat kvalitě

protilátky.

Pro další potvrzení funkčnosti protilátek se použila pouze králičí protilátka (detekční systém

69

pro ovčí protilátku nebyl k dispozici) pro detekci v metodě IHC. Byly pozitivně detekovány

adipocyty pocházející z lidského benigního lipomu (viz. Obr. 21).

Vzhledem k výše zmíněným výsledkům lze usuzovat, že králičí polyklonální protilátka a ovčí

polyklonální protilátka jsou funkční a lze je použít pro průkaz Adiponectinu v dalších

laboratorních metodách.

70

5. ZÁVĚR

Výsledkem této práce byla příprava dvou typů polyklonálních protilátek, které byly úspěšně

testovány v metodě Western blot a imunohistochemii. Dle získaných výsledků je možno oba

typy protilátek považovat za specifické protilátky proti Human Adiponectin, které rozlišují

tento protein i v nativních materiálech (lidské sérum, lidská tkáň) a v budoucnu je možné

jejich úspěšné použití v laboratorní diagnostice.

71

6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ZDROJŮ INFORMACÍ

[1] BRUCE, Albert; JOHNSON, Alexander; LEWIS, Julian a kol. Molecular Biology

of the Cell, 4th edition. New York: Garland Science, 2002. ISBN 10: 0-8153-3218-

1.

[2] DOONAN, Shawn Methods in Molecular Biology Vol 59: Protein Purification

Protocols. New Jersey: Humana Press Inc., 1996. ISBN 0-89603-336-8.

[3] DUNBAR, B.S. Protein Blotting. Oxford: Oxford University Press, 1996. ISBN 0-19-

963437-8.

[4] DUVNJAK, L.; DUVNJAK, M. The Metabolic Syndrome – an Ongoing Story. J.

Physiol. Pharmacol., 2009, roč. 60(7), s. 19-24, ISSN 0867-5910.

[5] Elec-intro.com [online] Shenzen: Elec-intro.com [cit.11-04-05] Dostupné z www:

http://www.elec-intro.com/western-blots

[6] ESTEVE, E.; RICART, W.; FERNÁNDEZ-REAL, J.M. Adipocytokines and Insulin

Resistance. Diabetes Care, 2009, roč. 32(2), s. S362-S367, ISSN 1935-5548.

[7] EYNATTEN, M.; LIU, D.; HOCK, C. a kol. Urinary Adiponectin Excretion A Novel

Marker for Vascular Damage in Type 2 Diabetes. Diabetes, 2009, roč. 58, s. 2093-

2099, ISSN 1939-327X.

[8] FERENČÍK, Miroslav; ROVENSKÝ, Jozef; NYULASSY, Štefan IMUNOLÓGIA

Základné termíny a definície. Bratislava:Tlač FABER, 1999. ISBN 80-88908-38-8.

[9] FRANKS, Felix Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization.

New Jersey: Humana Press Inc., 1993. ISBN0-89603-230-2.

[10] GOLDSTEIN, B.J.; SCALIA, R.G.; MA, X.L. Protective vascular and myocardial

effects of adiponectin. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med., 2009, roč. 6(1), s. 27-35,

ISSN 1759-5002.

[11] GOMES, F.; TELO, D.F.; SOUZA, H.P. A kol. Obesity and Coronary Artery Disease:

Role of Vascular Inflammation. Arq. Bras. Cardiol., 2010, roč. 94(2), s. 255-261, ISSN

1678-4170.

72

http://www.elec-intro.com/western-blots

[12] GOMEZ, R.; LAGO, F.; GOMEZ-REINO, J. a kol. Adipokines in the skeleton:

influence on cartilage function and joint degenerative diseases. J. Mol. Endocrinol.,

2009, roč. 43, s. 11-18, ISSN 0952-5041.

[13] GUSTAFSON, B. Adipose Tissue, Inflammation and Atherosclerosis. J. Atheroscl.

Thromb., 2009, roč. 17(4), s. 332-341, ISSN 1880-3873.

[14] HOLLAND, W.L.; SCHERER, P.E. PAQRs: A Counteracting Force to Ceramides?

Mol. Pharmacol., 2009, roč. 75 (4), s. 740-7743, ISSN 1521-0111.

[15] HOŘEJŠÍ, Václav; BARTŮŇKOVÁ, Jiřina Základy Imunologie. Praha: Triton, 1998.

ISBN 80-85875-73-X.

[16] HOUSA, D.; HALUZÍK, M.; VERNEROVÁ, Z. a kol. Obezita, adipocytokiny a

karcinom prostaty. Urolog. Pro Praxi, 2007, roč. 1, s. 10-14, ISSN 1213-1768.

[17] JUNQUEIRA, L. Carlos; CARNEIRO, José; KELLEY, Robert O. Základy histologie.

Z angl. orig. přel. Richard Jelínek Jihlava: Tisk EKON Jihlava, 1999, ISBN 80-85787-

37-7.

[18] KRUIJSDIJK, R.C.M.; WALL, E.; VISSEREN, F.L.J. Obesity and Cancer: The role

of Dysfunctional Adipose Tissue. Cancer. Epidemiol. Biomarkers. Prev., 2009, roč. 18,

s. 2569-2578, ISSN 1055-9965.

[19] LIBBY, P.; OKAMOTO, Y.; ROCHA, V.Z. a kol. Inflammation and Atherosclerosis:

Transition From Theory to Practice. Circ. J., 2010, roč. 74, s. 213-220, ISSN 1347-

4820.

[20] LIU, D.; SCHUSTER, T.; BAUMANN, M. a kol. Comparison of Immunoassays for

the Selective Measurement of Human High-Molecular Weight Adiponectin. Clin.

Chemistry, 2009, roč. 55(3), s. 568-572, ISSN 0009-9147.

[21] MAIA-FERNANDEZ, T.; RONCON-ALBUQUERQUE JR., R.; LEITE-MOREIRA,

A. Cardiovascular Actions of Adiponectin: Pathophysiologic Implications. Rev. Port.

Cardiol., 2008, roč. 27(11), s. 1431-1450, ISSN .0870-2551.

73

[22] MANČAL, Petr Metody enzymové imunoanalýzy. Ústav sér a očkovacích látek o.p.

Praha; WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Rapid Viral

Diagnosis. Praha: Sevac, 1987, ISSN (nemá).

[23] MANDAL, P.; PRITCHARD, M.T.; NAGY, L.E. Anti-inflammatory pathways and

alcoholic liver disease: Role of an adiponectin/interleukin-10/heme oxygenase-1

pathway. World. J. Gastroenterol., 2010, roč. 16(11), s. 1330-1336, ISSN 1007-9327.

[24] MATSUZAWA, Y. Establishment of a concept of visceral fat syndrome and discovery

of adiponectin. Proc. Jpn. Acad., 2010, roč. 86(B), s. 131-141, ISSN 0021-4280.

[25] NAKANO, Y.; TAJIMA, S.; YOSHIMI, A. a kol. A novel enzyme-linked

immunosorbent assay specific for high-molecular-weight adiponectin. J. Lipid

Research, 2006, roč. 47, s. 1572-1582, ISSN 1539-7262.

[26] O΄LEARY, V.B.; JORETT, A.E.; MARCHETTI, CH.M. a kol. Enhanced adiponectin

multimer ratio and skeletal muscle adiponectin receptor expression following exercise

training and diet in older insulin-resistant adults. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.,

2007, roč. 293, s. E421-E427, ISSN 0193-1849.

[27] OLLER DO NASCIMENTO, C.M.; RIBEIRO, E.B.; OYAMA, L.M. Metabolism and

secretory function of white adipose tissue: effect of dietary fat.. An. Acad. Bras. Cienc.,

2009, roč. 81(3), s. 453-466, ISSN 0001-3765.

[28] PAIS, R.; SILAGHI, H.; SILAGHI, A.C. a kol. Metabolic syndrome and risc of

subsequent colorectal cancer. World. J. Gastroenterol., 2009, roč. 15(41), s. 5141-

5148, ISSN 1007-9327.

[29] PAZOUREK, J.: Skripta: Elektroforetické analytické metody. 2.6.2003, s.10-14

[cit.11-02-22] Dostupné z www:

<http://faf.vfu.cz/export/sites/faf/struktura-fakulty/sekce_ustavy/

ustav_chemickych_leciv/vyuka/analyticka-chemie/elforeza.pdf>

[30] POLAK, J.; KOVACOVA, Z.; HOLST, C. a kol. Total adiponectin and adiponectin

multimeric complexes in relation to weight loss-induced improvements in insulin

sensitivity in obese women: the NUGENOB study. Eur. J. Endocrinol., 2008, roč. 158,

74

http://faf.vfu.cz/export/sites/faf/struktura-fakulty/sekce_ustavy/ustav_chemickych_leciv/vyuka/analyticka-chemie/elforeza.pdf

http://faf.vfu.cz/export/sites/faf/struktura-fakulty/sekce_ustavy/ustav_chemickych_leciv/vyuka/analyticka-chemie/elforeza.pdf

s. 533-541, ISSN 0804-4643.

[31] PUNYADEERA, CH.; ZORENC, A.H.G.; KOOPMAN, R. a kol. The effects of

exercise and adipose tissue lipolysis on plasma adiponectin concentration and

adiponectin receptor expression in human sceletal muscle.. Eur. J. Endocrinol., 2005,

roč. 152, s. 427-436, ISSN 0804-4643.

[32] RABE, K.; LEHRKE, M.; PARHOFER, K.G. a kol. Adipokines and Insuline

Resistance. Mol. Med., 2008, roč. 14(11-12), s. 741-751, ISSN 1528-3658.

[33] RAHMOUNI, K.; SIGMUND, C.D. Id3, E47 and SREBP-1c: Fat Factors Controlling

Adiponectin Expression.. Circ. Res., 2008, roč. 103(6), s. 565-567, ISSN 0009-7330..

[34] RICHARDS, A.A.; STEPHENS, T.; CHARLTON, H.K. a kol. Adiponectin

Multimerization Is Dependent on Conserved Lysines in the Collagenous Domain:

Evidence for Regulation of Multimerization by Alterations in Posttranslational

Modifications. Mol. Endocrinol., 2006, roč. 20(7), s. 1673-1687, ISSN 0021-972X.

[35] State University of New York [online] New York: State University of New York

Oswego [cit.11-04-05] Dostupné z www:

http://www.oswego.edu/academics/colleges_and_departments/departments/

interdisciplinary/maspec.html

[36] STEJSKAL, D.; RŮŽIČKA, V.; ADAMOVSKÁ, S. a kol. Adiponectin Concentrations

as a Criterion of Metabolic Control in Persons with Type 2 Diabetes Mellitus?.

Biomed. Papers., 2003, roč. 147(2), s. 167-172, ISSN 1804-7521.

[37] STITES, Daniel P.; TERR, Abba I. Základní a klinická imunologie. Z angl. orig. přel.

Karel Barnet a kol. Praha: Victoria Publishing, 1994, ISBN 80-85605-37-6.

[38] ŠKOP, V.; KONTROVÁ, K.; ZÍDKOVÁ, J. a kol. Adipocytokiny – nedávno objevené

hormony tukové tkáně. Chem. Listy, 2009, roč. 103, s. 187-192, ISSN 1213-7103.

[39] TEPLAN, V. Metabolický syndrom v nefrologii. Med. pro praxi, 2010, roč. 7(5), s.

209-215, ISSN 1803-5310.

[40] TOULIS, K.A.; GOULIS, D.G.; FARMAKIOTIS, D. a kol. Adiponectin levels in

75

http://www.oswego.edu/academics/colleges_and_departments/departments/interdisciplinary/maspec.html

http://www.oswego.edu/academics/colleges_and_departments/departments/interdisciplinary/maspec.html

women with polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Hum.

Reprod. Update., 2009, roč. 15, s. 297-307, ISSN 1460-2369.

[41] YE, J. Emerging Role of Adipose Tissue Hypoxia in Obesity and Insulin Resistance.

Int. J. Obes. (Lond), 2009, roč. 33(1), s. 54-66, ISSN 1476-5497.

[42] YOU, M.; ROGERS, CH.Q. Adiponectin: A Key Adipokine in Alcoholic Fatty Liver.

Exp. Biol. Med., 2009, roč. 234, s. 850-859, ISSN 1535-3699.

[43] ŽOFKOVÁ, I. Vztah hormonů tukové tkáně a ghrelinu ke kostnímu metabolismu.

Vnitř. Lék., 2009, roč. 55(6), s. 560-56č, ISSN 0042-773X.

76

7. PŘÍLOHY

Příloha 1: Protokol o provedení metody BCA

Stanovení koncentrace antigenuHuman Adiponectin (HEK)

Standardní křivka

Lineární regrese y = k * x + qx y1 y2 y y teor

počet nstandard (mg/ml) Abs1 Abs2 prům Abs prům Abs k = 1,2159983

1 0,0 0,092 0,084 0,088 0,1352 0,1 0,245 0,250 0,248 0,256 q = 0,13477223 0,2 0,411 0,398 0,405 0,378 R = 0,99703484 0,4 0,648 0,692 0,670 0,6215 0,6 0,859 0,871 0,865 0,864 R2 = 0,99407856 0,8 1,095 1,160 1,128 1,1087 1,0 1,308 1,313 1,311 1,351 St.lin.regr.= 0,0384021

77

Výpočet koncentrace vzorků:

vzorek Abs1 Abs2prům Abs

koncentrace (mg/ml) ředění

výsledná koncentrace

(mg/ml)Adiponectin 0,272 0,274 0,273 0,114 1 0,114

Příloha 2: Protokol o provedení metody BCA

Stanovení koncentrace protilátek

Název vzorku: králičí a ovčí protilátka proti proteinu Human Adiponectin (HEK)

Standardní křivka:

Lineární regrese y = k * x + qx y1 y2 y y teor

počet nstandard (mg/ml) Abs1 Abs2 prům Abs

prům Abs k = 0,9796075

1 0,0 0,077 0,071 0,074 0,1032 0,1 0,206 0,194 0,200 0,201 q = 0,10260243 0,2 0,314 0,302 0,308 0,299 R = 0,9984734 0,4 0,516 0,513 0,515 0,4945 0,6 0,732 0,698 0,715 0,690 R2 = 0,99694836 0,8 0,886 0,883 0,885 0,8867 1,0 1,062 1,056 1,059 1,082 St.lin.regr.= 0,0221769

78

Výpočet koncentrace vzorků:

vzorek Abs1 Abs2prům Abs

koncentrace (mg/ml) ředění

výsledná koncentrace

(mg/ml)ovčí protilátka 0,501 0,526 0,5135 0,419 1 0,419králičí protilátka 0,472 0,475 0,4735 0,379 1 0,380

79

portal.szspraha1.czportal.szspraha1.cz/szs/portal.nsf/0/1f64730db385b295c... · web viewpříprava...

Documents