UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Aleš ŠPES

VPLIV MAŠČOBNIH KISLIN NA BIOSINTEZO INHIBITORJA ESTERAZE SBR0501 PRI SEVU Streptomyces sp. K343-1

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij

EFFECT OF FATTY ACIDS ON BIOSYNTHESIS OF ESTERASE INHIBITOR SBR0501 IN Streptomyces sp. K343-1

GRADUATION THESIS

University studies

Ljubljana, 2006

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 II

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija živilske tehnologije. Opravljeno je bilo na Katedri za biotehnologijo Oddelka za živilstvo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Študijska komisija Oddelka za živilstvo je za mentorja diplomske naloge imenovala prof. dr. Petra Rasporja, za somentorja doc. dr. Hrvoja Petkovića in za recenzentko prof. dr. Veroniko Abram. Mentor: prof. dr. Peter Raspor Somentor: doc. dr. Hrvoje Petković Recenzentka: prof. dr. Veronika Abram

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Član: prof. dr. Peter RASPOR Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Član: doc. dr. Hrvoje PETKOVIĆ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Član: prof. dr. Veronika ABRAM Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Datum zagovora:

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Aleš Špes

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dn DK UDC 579.66 : 579.2 : 577.15(043)=863 KG Streptomyces sp. K343-1 / sekundarni metaboliti / biomasa / linolna kislina /

polimiksin B / 2-bromoheksadekanojska kislina / 2-deoksiglukoza / inhibitor esteraze / SBR0501 / donos SBR0501

AV ŠPES Aleš SA RASPOR, Peter (mentor), PETKOVIĆ, Hrvoje (somentor),

ABRAM Veronika (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2006 IN VPLIV MAŠČOBNIH KISLIN NA BIOSINTEZO INHIBITORJA ESTERAZE

SBR0501 PRI SEVU Streptomyces sp. K343-1 TD Diplomsko delo (univerzitetni študij) OP XII, 54 str., 11 pregl., 28 sl., 7 pril., 59 vir. IJ sl JI sl/en AI Za povečanje donosa industrijsko pomembnih spojin lahko izbiramo med različnimi

pristopi. Optimizacija gojišč, selekcija sevov in uporaba genskega inženiringa so le nekateri od možnih načinov za izboljševanje donosov. V diplomskem delu smo izbrali metodo selekcije. Selekcionirali smo izolate seva Streptomyces sp. K343-1 odporne na povečane koncentracije linolne kisline, ki daje prekurzorje za spojino SBR0501, toksičnih analogov linolne, izolate odporne na antibiotik polimiksin B, ki imajo spremenjene lastnosti celične membrane in izolate odporne na 2-deoksiglukozo, ki imajo deregurilan metabolizem linolne kisline. Ovrednotili smo produkcijski potencial izoliranih sevov. Končni donos SBR0501 smo določali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Rezultati kažejo, da se je končni donos SBR0501 v produkcijskem gojišču povečal pri sevih, ki so bili predhodno izpostavljeni povečanim koncentracijam linolne kisline in polimiksina B. Vendar donos ne narašča linearno z odpornostjo. V povprečju so imeli izolati odporni na linolno kislino povečano produkcijo spojine SBR0501 za 15 %, izolati odporni na polimiksin B pa za 52 %. Tudi koncentracije analoga linolne kisline 2-bromoheksadekanojske kisline pri naših poskusih so pozitivno vplivale na končni donos spojine SBR0501, saj so imeli izolati odporni na 5 μM koncentracije 2-bromoheksadekanojske kisline v povprečju povečano produkcijo za 29 %.Pozitiven vpliv na donos ciljne spojine pa smo opazili tudi pri sevih odpornih na 2-deoksiglukozo. Izolati so imeli povečano produkcijo za 70 %. Na podlagi naših rezultatov lahko zaključimo, da lahko s selekcijo sevov dvignemo donos sekundarnega metabolita, spojine SBR0501.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 IV

KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dn DC UDC 579.66 : 579.2 : 577.15(043)=863 CX Streptomyces sp. K343-1 / secondary metabolites / biomass / linoleic acid /

polymyxin B / 2-bromohexadecanoic acid / 2-deoxyglucose / esterase inhibitor / SBR0501 / yield SBR0501

AU ŠPES Aleš AA RASPOR, Peter (supervisor)/ PETKOVIĆ, Hrvoje (co-advisor),

ABRAM Veronika (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and

Technology PY 2006 TI EFFECT OF FATTY ACIDS ON BIOSYNTHESIS OF ESTERASE INHIBITOR

SBR0501 IN Streptomyces sp. K343-1 DT Graduation Thesis NO XII, 54 p., 11 tab., 28 fig., 7 ann., 59 ref. LA sl AL sl/en AB For the overproduction of industrial compounds we can choose from many different

approaches. Media design and process optimization, screening and genetic alternations are just a few of the successfully applied technologies. In this work we have selected strains of Streptomyces sp. K343-1 by exposing them to increased concentrations of linoleic acid, which gives precursors for SBR0501, an esterase inhibitor. We have also selected strains by exposing them to increased concentrations of a toxic analogue of linoleic acid the antibiotic polymyxin B, which might alter membrane structure, and also to increased concentrations of 2-deoxyglucose (DOG), which gives rise to glucose-de-repressed strains. We have evaluated the production potential of the selected strains. Concentrations of secondary metabolite were measured with HPLC. Our results indicate increased production of SBR0501 in strains that were exposed to higher concentrations of linoleic acid and polymyxin B. However yields were not in linear correlation with the concentrations of these two compounds. On average strains that were resistant to linoleic acid produced 15 % more SBR0501 and strains resistant to polymyxin B produced 52 % more SBR0501. Resistance to a 5 μM concentration of 2-bromohexadecanoic acid in our tests improved production of SBR0501 by 29 %. The biggest improvement in SBR0501 production was achieved with resistance to 2-deoxyglucose as DOG resistant strains produced 70 % more SBR0501. Based on HPLC results we can conclude that with strain selection we can improve yields of the secondary metabolite SBR0501.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 V

KAZALO VSEBINE

str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ....................................III

KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)...............................................................IV

KAZALO VSEBINE ........................................................................................................ V

KAZALO PREGLEDNIC ...........................................................................................VIII

KAZALO SLIK ...............................................................................................................IX

KAZALO PRILOG .......................................................................................................... X

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ..........................................................................................XI

SLOVARČEK................................................................................................................ XII

1 UVOD ......................................................................................................................... 1

1.1 NAMEN DELA ................................................................................................... 1 1.2 DELOVNE HIPOTEZE ...................................................................................... 1

2 PREGLED OBJAV ................................................................................................... 3 2.1 SEKUNDARNI METABOLITI.......................................................................... 3

2.1.1 Sekundarni metaboliti pri različnih skupinah organizmov.............................. 4 2.1.2 Delitev sekundarnih metabolitov glede na biosintezo..................................... 5

2.2 AKTINOMICETE............................................................................................... 9 2.2.1 Aktinomicete ................................................................................................... 9 2.2.2 Taksonomija streptomicet................................................................................ 9 2.2.3 Morfologija in življenjski cikel ....................................................................... 9 2.2.4 Genom ........................................................................................................... 10 2.2.5 Ekologija in metabolizem.............................................................................. 10

2.3 RAZGRADNJA MAŠČOBNIH KISLIN – β-OKSIDACIJA ........................... 11 2.3.1 Reakcije β-oksidacije .................................................................................... 11 2.3.2 β-oksidacija nenasičenih maščobnih kislin ................................................... 12

2.4 DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA PRODUKCIJO SEKUNDARNIH METABOLITOV .............................................................................................. 13

2.5 IZBOLJŠAVA DELOVNEGA ORGANIZMA ................................................ 14 2.5.1 Povečanje produkcije sekundarnih metabolitov............................................ 15

2.5.1.1 Selekcija ................................................................................................ 15 2.5.1.2 Mutageneza............................................................................................ 16 2.5.1.3 Rekombinacija ....................................................................................... 17 2.5.1.4 Katabolična represija ............................................................................. 18 2.5.1.5 Toksični metabolitični analogi .............................................................. 19

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 VI

2.6 PRISTOPI ZA IZBOLJŠANJE DONOSA SPOJINE SBR0501 ....................... 19 2.6.1 Odpornost na povečane koncentracije linolne kisline ................................... 19

2.6.1.1 Peroksidacija.......................................................................................... 20 2.6.2 Odpornost na povečane koncentracije 2-bromoheksadekanojske kisline ..... 21

2.6.2.1 Delovanje α-bromomaščobnih kislin kot model delovanja................... 21 2.6.3 Odpornost na povečane koncentracije polimiksina B ................................... 21

2.6.3.1 Toksičnost polimiksina B ...................................................................... 22 2.6.4 Odpornost na 2-deoksiglukozo...................................................................... 22

3 MATERIALI IN METODE ................................................................................... 23 3.1 DELOVNI POSTOPKI ..................................................................................... 23 3.2 MATERIALI ..................................................................................................... 27

3.2.1 Izolati ............................................................................................................. 27 3.2.2 Gojišča........................................................................................................... 27

3.2.2.1 Trdno minimalno gojišče....................................................................... 27 3.2.2.2 Trdno sporulacijsko gojišče................................................................... 27 3.2.2.3 Vegetativno gojišče ............................................................................... 28 3.2.2.4 Produkcijsko gojišče.............................................................................. 28

3.2.3 Raztopine in pufri .......................................................................................... 28 3.2.3.1 Priprava 1 M NaH2PO4×H2O : K2HPO4 pufra (5:7) ............................. 28 3.2.3.2 Priprava založne raztopine emulgatorja (5 g/100 ml) ........................... 28 3.2.3.3 Priprava mobilne faze za HPLC ............................................................ 29 3.2.3.4 Priprava založne raztopine polimiksina B (1 mg/ml)............................ 29 3.2.3.5 Priprava založne raztopine 2-bromoheksadekanojske kisline (1 mM).. 29 3.2.3.6 Priprava založne raztopine 2-DOG (2 mM) .......................................... 29

3.2.4 Oprema .......................................................................................................... 30 3.2.5 Steklovina in potrošni material...................................................................... 30

3.3 METODE DELA ............................................................................................... 31 3.3.1 Priprava gojišč ............................................................................................... 31

3.3.1.1 Trdno selekcijsko gojišče ...................................................................... 31 3.3.1.2 Trdno sporulacijsko gojišče................................................................... 31 3.3.1.3 Vegetativno gojišče za pripravo cepiva................................................. 31 3.3.1.4 Tekoče produkcijsko gojišče ................................................................. 31

3.3.2 Potek dela ...................................................................................................... 32 3.3.3 Priprava vzorcev za analizo........................................................................... 32 3.3.4 Kvantitativno ovrednotenje količine inhibitorjev s tekočinsko kromatografijo

visoke ločljivosti............................................................................................ 32

4 REZULTATI............................................................................................................ 33

4.1.1 Vpliv emulgatorja .......................................................................................... 33 4.1.2 Kultivacija na selekcijskem gojišču z linolno kislino ................................... 34 4.1.3 Rezultati tekočinske kromatografije visoke ločljivosti ................................. 35 4.1.4 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na linolno kislino in vpliv na donos

SBR0501........................................................................................................ 35 4.1.5 Kultivacija na selekcijskem gojišču z 2-bromoheksadekanojsko kislino...... 38 4.1.6 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na 2-bromoheksadekanojsko kislino in

vpliv na donos SBR0501 ............................................................................... 38

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 VII

4.1.7 Kultivacija na selekcijskem gojišču s polimiksinom B................................. 40 4.1.8 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na polimiksin B in vpliv na donos

SBR0501........................................................................................................ 41 4.1.9 Kultivacija na selekcijskem gojišču z DOG.................................................. 42 4.1.10 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na 2-deoksiglukozo in vpliv na donos

SBR0501.................................................................................................... 43

5 RAZPRAVA IN SKLEPI........................................................................................ 44 5.1 RAZPRAVA...................................................................................................... 44

5.1.1 Vpliv zaščite sporulacijskega gojišča ............................................................ 44 5.1.2 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na linolno kislino,

2-bromoheksadekanojsko kislino, polimiksin B in 2-deoksiglukozo ter vpliv na donos SBR0501 ........................................................................................ 44

5.2 SKLEPI.............................................................................................................. 47

6 POVZETEK............................................................................................................. 48

7 VIRI .......................................................................................................................... 49

ZAHVALA PRILOGE

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 VIII

KAZALO PREGLEDNIC

str.

Preglednica 1: Značilnosti primarnega in sekundarnega metabolizma (Hütter, 1986) ....... 3

Preglednica 2: Vloga sekundarnih metabolitov (Döhren in Gräfe, 1997)........................... 4

Preglednica 3 : Vrste mutagenih sredstev in njihovo delovanje (Parekh in sod., 2000) ... 17

Preglednica 4: Maščobno kislinska sestava sojinega olja (O'Brien, 1998) ....................... 19

Preglednica 5: Sestava trdnega minimalnega gojišča NMMB (Hodgson, 1982) .............. 27

Preglednica 6: Sestava trdnega sporulacijskega gojišča - modificirano ISP4 gojišče (Atlas,

1993).......................................................................................................................... 27

Preglednica 7: Sestava vegetativnega gojišča - modificirano obogateno gojišče z

glicerolom (Atlas, 1993)............................................................................................ 28

Preglednica 8: Sestava produkcijskega gojišča - modificirano obogateno gojišče z

glicerolom (Atlas, 1993)............................................................................................ 28

Preglednica 9: Seznam laboratorijske opreme................................................................... 30

Preglednica 10: Vpliv emulgatorjev na rast sevov ............................................................ 33

Preglednica 11: Dodatki v selekcijska in sporulacijska gojišča, iz katerih smo izolirali

seve ............................................................................................................................ 36

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 IX

KAZALO SLIK Slika 1: Strukturi dveh saharidnih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986)...................... 5 Slika 2: Strukturi dveh peptidnih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986) ....................... 6 Slika 3: Biosinteza penicilina G (Birmingham, 2006) ........................................................ 6 Slika 4: Strukturi dveh acilogeninskih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986) ............... 7 Slika 5: Strukturi dveh nukleolognih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986) ................. 7 Slika 6: Strukturi dveh mešanih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986) ........................ 8 Slika 7: Taksonomska opredelitev streptomicet (Bergey in Holt, 1994) ............................ 9 Slika 8: Življenjski krog streptomicet (van Wezel, 2002)................................................. 10 Slika 9: Aktivacija maščobnih kislin (Boyer, 2005).......................................................... 11 Slika 10: Spiralna pot β-oksidacije maščobne kisline (Boyer, 2005)................................ 12 Slika 11: Prikaz metabolizma nenasičene maščobne kisline 16:2 (Boyer, 2005) ............. 13 Slika 12: Mehanizem fosfotransferaznega sistema (PTS) pri Escherichii coli (Madigan in

sod., 2003) ................................................................................................................. 18 Slika 13: Nastanek 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadienojske kisline (13-HPODE) in 9-

hidroperoksi-10,12- oktadekadienojske kisline (9-HPODE) (Spiteller in sod., 2001)................................................................................................................................... 20

Slika 14: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na linolno kislino ........................................................................................................................ 23

Slika 15: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na 2-bromoheksadekanojsko kislino ................................................................................. 24

Slika 16: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na polimiksin B ................................................................................................................................ 25

Slika 17: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na ................ 2-deoksiglukozo ........................................................................................................ 26

Slika 18: Preživelost v odvisnosti od koncentracije linolne kisline .................................. 34 Slika 19: HPLC kromatograma standarda (levo) in vzorca L44 (desno) .......................... 35 Slika 20: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na linolno kislino.......................... 36 Slika 21: Povprečne vrednosti donosa spojine SBR0501 izolatov odpornih na linolno

kislino ........................................................................................................................ 37 Slika 22: Preživelost v odvisnosti od koncentracije 2-BrP................................................ 38 Slika 23: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na 2-BrP........................................ 39 Slika 24: Povprečne vrednosti donosa spojine SBR0501 izolatov odpornih na 2-BrP..... 39 Slika 25: Preživelost v odvisnosti od koncentracije polimiksina B................................... 40 Slika 26: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na polimiksin B ............................ 41 Slika 27: Povprečne vrednosti donosa spojine SBR0501 izolatov odpornih na polimiksin

B ................................................................................................................................ 42 Slika 28: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na 2-deoksiglukozo ...................... 43

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 X

KAZALO PRILOG

str. Priloga A: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 %

sojinega olja in 1 % linolne kisline (S:L=3:1)........................................................... 55

Priloga B: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 %

sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)........................................................... 56

Priloga C: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 %

sojinega olja in 1 % linolne kisline (S:L=3:1)........................................................... 57

Priloga D: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 %

sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)........................................................... 58

Priloga E: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 %

sojinega olja in 1 % linolne kisline (S:L=3:1)........................................................... 59

Priloga F: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 %

sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)........................................................... 60

Priloga G: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 %

sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)........................................................... 61

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 XI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI 2-BrP 2-bromoheksadekanojska kislina

ACV-tripeptid peptid sestavljen iz L-amino-adipinske kisline, L-cisteina in L-valina

AMP adenozinmonofosfat

CAP catabolite activator protein = katabolični aktivatorski protein

CCR katabolična represija z virom ogljika (carbon catabolite repression )

CoA koencim A

ddH2O 2x destilirana voda

dH2O destilirana voda

DMSO dimetil sulfoksid

DOG 2-deoksiglukoza

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

LPO lipidna peroksidacija

NMMB selekcijsko – minimalno gojišče (Hodgson, 1982)

pmz

pod mejo zaznave

SP sporulacijsko gojišče

UV ultravijolična svetloba

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006 XII

SLOVARČEK Analog – strukture, ki so si kemijsko sorodne, vendar ne identične Katabolična derepresija – pojav, pri katerem je prekinjena katabolična represija Končni donos spojine SBR0501 – koncentracija inhibitorja esteraz SBR0501 v bioprocesni brozgi, katero proizvaja sev Streptomyces sp. K343-1 Inhibitor – vsaka snov, ki prepreči normalno delovanje encima, ne da bi uničila encim Produkcijsko gojišče S:L=1:3 - produkcijsko gojišče, ki vsebuje 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline Produkcijsko gojišče S:L=3:1 - produkcijsko gojišče, ki vsebuje 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

1

1 UVOD Sekundarni metaboliti so spojine, ki niso nujno potrebne za rast organizmov v laboratorijskem okolju. Njihova dejanska vloga je še vedno predmet razprav med znanstveniki, verjetno pa je pri različnih skupinah organizmov lahko zelo raznolika. Za večino mikroorganizmov je značilno, da se tvorijo sekundarne metabolite v tako imenovani idiofazi. To je faza rasti, ki sledi fazi pospešene rasti (logaritemski fazi), nastopi pa zaradi pomanjkanja hranil, npr. dušika ali fosforja in lahko-metabolizirajočega vira ogljika. Med sekundarne metabolite sodijo tudi inhibitorji esteraz, ki so potencialno uporabni v medicini, saj esteraze razgrajujejo različna zdravila in tako vplivajo na njihovo učinkovitost. Z inhibitorji esteraz bi lahko zmanjšali delovanje karboksi esteraz ter tako posledično vplivali na učinkovitost in stranske pojave aktivnih učinkovin kot so npr. zdravila proti raku (cepacitabin), heroin, kokain, lokalni anastetik prokain. Inhibitorje esteraz proizvajajo tudi streptomicete (Urukalo, 2005). Streptomiceta Streptomyces sp. K343-1 producira metabolit SBR0501, ki kaže zelo visoko inhibitorno aktivnost do esteraz že pri mikromolarnih koncentracijah. Z optimizacijo, gojišča in pogojev gojenja lahko znatno vplivamo na biosintezo in končni donos sekundarnih metabolitov. Tako je Kirn (2005) pokazal, da dodatek maščobnih kislin (olja) pozitivno vpliva na končni donos spojine SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1.

1.1 NAMEN DELA Maščobne kisline v gojišču močno inducirajo biosintezo spojine SBR0501, vendar so tudi toksične v večjih koncentracijah (nad 3 mM), zato je bil cilj naloge izolirati mutante Streptomyces sp. K343-1, ki bi bile odporne na povečane koncentracije linolne kisline in/ali njenih analogov, ki lahko razen odpornosti vplivajo tudi na transport linolne kisline v celico.

1.2 DELOVNE HIPOTEZE Linolna kislina je v večjih koncentracijah toksična za delovni organizem, a je nujno potrebna za donos spojine SBR0501. Zato predvidevamo, da bi bilo mogoče dvigniti donos ciljne spojine SBR0501 s sevi, ki so:

• odporni na povečano koncentracijo linolne kisline ali toksičnih analogov (npr. 2-bromoheksadekanojska kislina) ali imeli povečan transport linolne kisline v celico (povečana odpornost na linolno kislino)

• imajo spremenjene lastnosti celične membrane (npr. odporne na polimiksin B), • imeli dereguliran metabolizem (katabolizem) linolne kisline (npr. deregulacija

katabolične represije, odpornost na 2-deoksiglukozo). S tem namenom naj bi pripravili izolate seva Streptomyces sp. K343-1, ki naj bi prenesli večje koncentracije linolne kisline, 2-bromoheksadekanojske kisline ali pa bili odporni na

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

2

povečane koncentracije 2-deoksiglukoze in polimiksina B in nato ovrednotili produkcijski potencial na ta način izoliranih mutant.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

3

2 PREGLED OBJAV

2.1 SEKUNDARNI METABOLITI Sekundarni metaboliti so spojine, ki niso neposredno vključene v rast, razvoj in razmnoževanje organizmov, ki jih producirajo. Pozornost privabljajo zaradi zanimive in značilne strukture, predvsem pa zaradi praktične pomembnosti, tako v pozitivnem (antibiotiki) kot v negativnem smislu (toksini) (Hütter, 1986). Sekundarni metaboliti so produkti mikroorganizmov, živali in rastlin. Predpostavlja se, da je razpon bioloških aktivnosti sekundarnih metabolitov zelo širok. Služijo lahko kot signali »quorum« zaznavanja, ki sprožijo diferenciacijo celic ali proizvodnjo patogenih determinant (Martın in sod., 2005), lahko jim pomagajo preživeti v naravi (Vining, 1986), vplivajo lahko na razmerje spolnega in nespolnega razvoja spor pri Aspergillus nidulans (Calvo in sod., 2002), lahko so orožje proti tekmecem (Hütter, 1986), lahko so virulentni dejavniki (Calvo in sod., 2002), organizmu lahko dajejo dolgoročne prednosti pri preživetju v biološki skupnosti in okolju (Döhren in Gräfe, 1997), delujejo lahko kot kemijski agensi, ki posredujejo interakcije med organizmi oz. med organizmi in njihovim okoljem (Vining, 1986), lahko imajo tudi vlogo pri transportu kovin (Challis in Hopwood, 2003). Po eni od teorij (Hodgson, 2000) je možna biološka vloga sekundarnih metabolitov uravnavanje neuravnoteženih pogojev rasti z odstranitvijo prekomernih količin primarnih metabolitov, ki nastanejo pod ugodnimi pogoji, npr. velika količina aminokislin. Ne glede na strukturo sekundarnega metabolita lahko predpostavimo, da je odstranitev odvečnih produktov v korist celici (Hodgson, 2000). Na splošno velja, da poteka biosinteza sekundarnih metabolitov ali v času rasti ali pod posebnimi pogoji, ki niso povezani z maksimalno hitrostjo rasti (Hütter, 1986). Še več, maksimalna proizvodnja sekundarnih metabolitov so opazili, kadar v gojišču začne primanjkovati hranil. S proizvodnjo sekundarnih metabolitov so pogosto povezane tudi določene morfološke spremembe (npr. tvorba spor) (Döhren in Gräfe, 1997). Sekundarni metaboliti so pogosto sintetizirani v družinah, to so skupine kemijsko sorodnih komponent. Zähner (1979) meni, da zaradi majhnih razlik v strukturi ali biosintezni poti lahko rečemo, da je sekundarni metabolizem nekakšno igrišče ali poligon evolucije. Vse dokler razvojna pot ali metaboliti ne prinesejo gostitelju slabšega položaja, ga ta obdrži ali prilagaja tekom več generacij (Zähner, 1979, citirano po Hütter, 1986). Preglednica 1: Značilnosti primarnega in sekundarnega metabolizma (Hütter, 1986)

Primarni metaboliti Sekundarni metaboliti Pomembni za rast Nepomembni za rast Znana fiziološka vloga Fiziološka vloga je težko opredeljiva Prisotni skozi ves življenjski cikel Prisotni predvsem v omejenem delu razvojnega

cikla Prisotni pod različnimi pogoji rasti Prisotnost močno pogojena z rastnimi pogoji Pogosto produkti z relativno enostavno kemijsko strukturo

Pogosto produkti s kompleksno kemijsko strukturo

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

4

Preglednica 2: Vloga sekundarnih metabolitov (Döhren in Gräfe, 1997)

Vloga v okolju Vloga v organizmu Zaščita pred ostalimi organizmi Regulacijski signali za morfogenezo Regulacija komenzalizma in sobivanja Regulirajo parjenje Zaščita pred škodljivi vplivi okolja (UV) Detoksifikacija metabolitov Pridobivanje elementov v sledovih Detoksifikacija

2.1.1 Sekundarni metaboliti pri različnih skupinah organizmov Največ je znanega o sekundarnih metabolitih mikroorganizmov. Veliko jih je bilo odkritih med načrtnim iskanjem novih biološko aktivnih spojin za uporabo v medicini. Večino jih uvrščamo med antibiotike. Opisani so še sekundarni metaboliti brez opredeljene bioaktivnosti, ki so jih odkrili le zaradi njihovih značilnosti kot vonj, barva… ( Vining, 1986). Prokarionte, kot proizvajalce sekundarnih metabolitov, lahko po eni od teorij razdelimo v skupine glede na strategijo preživetja. Prva skupina, v katero sodijo aktinomicete, s sekundarnimi metaboliti (antibiotiki) uničijo tekmece. Ker pa so tekmeci v naravnem okolju številčni, je tudi razpon sekundarnih metabolitov streptomicet zelo širok. V drugo skupino sodijo organizmi, ki za preživetje izkoriščajo hitro prilagajanje na drugačne okoljske pogoje in učinkovito izrabo hranil. Mednje sodijo enterobakterije (Vining, 1986). Med evkarionti so najpomembnejše nitaste glive, ki so razvile bogat in širok sekundarni metabolizem. V primerjavi s prokarionti pa tvorijo večcelične glive manj sekundarnih metabolitov (Vining, 1986). Zelo raznoliki so tudi rastlinski sekundarni metaboliti. Predpostavlja se, da so vpleteni pri zaščiti pred mikroorganizmi, zajedalci in insekti, lahko so atraktani ali repelenti, za detoksifikacijo toksinov (Döhren in Gräfe, 1997) ali pa za zaščito pred UV-sevanjem (Yazaki, 2005). Najbolj znani so alkaloidi, veliko pa je tudi esencialnih olj (evgenol, limonen), saponinov (triterpeni, steroidi), monoterpenov in flavonoidov (Wink, 2003; Wallace, 2004). Zanimivo vprašanje pa je, ali naj uvrščamo te substance v primarne ali sekundarne metabolite. Čeprav sodelujejo pri razmnoževanju, tako da privabljajo žuželke, nimajo pomembne vloge v metabolizmu (Vining, 1986). V živalskem kraljestvu največ sekundarnih metabolitov tvorijo členonožci in ostali insekti. Najbolj poznani proizvajalci so pajki, kače, polži, škorpijoni. Pomen sekundarnih metabolitov živali je predvsem zaščita pred drugimi organizmi, imajo pa tudi vlogo pri komunikaciji. Vključujejo hlapne estre, feromone, snovi za označevanje ozemlja ter strupe (Vining, 1986; Mebs, 2001).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

5

2.1.2 Delitev sekundarnih metabolitov glede na biosintezo Obstajajo različni kriteriji, po katerih lahko delimo sekundarne metabolite v skupine. Pri mnogih delitvah se upošteva strukturno raznolikost, predvsem pri delitvi antibiotikov, ki so razdeljeni na skupine kot npr. β-laktamski, peptidni, aminoglikozidni, makrolidni antibiotiki, tetraciklini, ansamicini, ergotalkaloidi. Druga delitev deli sekundarne metabolite glede na njihovo aktivnost. Tukaj so skupine: snovi z antibiotično aktivnostjo (protibakterijska, protiglivna, protivirusna, protirakasta), snovi s farmaloško aktivnostjo (encimski inhibitorji, imunološka aktivnost, biokemijska aktivnost) in snovi za uporabo v agronomiji (pesticidi, herbicidi in insekticidi) (Berdy, 2005). Primarni metabolizem zagotavlja gradbene enote za sekundarni metabolizem, pri tem pa se določeni intermediati uporabljajo pogosteje kot drugi (Vining, 1986). Tako lahko delimo sekundarne metabolite v štiri skupine (saharidi, peptidi, acilogenini, nuklelogi) glede na gradbene enote iz katerih so sestavljeni. V peti skupini pa so spojine, ki izhajajo iz večih različnih prekurzorjev.

• Saharidi: so spojine, ki imajo v osnovni strukturi monosaharide, oligosaharide in polisaharide. Primarni gradnik je navadno glukoza. Modificirana je s relativno kratkimi reakcijami in tvori produkte kot je npr. nojirimicin. Večje modifikacije tvorijo tudi oligosaharide, kot je npr. streptomicin.

NH

CH2OH

OH

HO

OH

OH streptomicin nojirimicin Slika 1: Strukturi dveh saharidnih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986)

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

6

• Peptidi: ti pogosto nastanejo z modifikacijo aminokislin, npr. pirolnitrin (iz triptofana). Vendar to ni edina pot, dobro je poznana tudi skupina oligopeptidnih sekundarnih metabolitov, npr. tirocidin (antibiotik). Te spojine imajo vključene tudi D-aminokisline. Peptidni sekundarni metaboliti lahko nastanejo tudi iz vmesnih produktov biosinteze aminokislin, npr. kloramfenikol. Sinteza peptidnih sekundarnih metabolitov je navadno neribosomska sinteza proteinov, vendar ribosomsko sintetizirani peptidni sekundarni metaboliti niso posebnost.

Cl

NO2

NH

Cl

NO2 CH CH

OH CH2

OH

HN C

O

CHCl2

pirolnitrin kloramfenikol Slika 2: Strukturi dveh peptidnih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986)

izopenicilin N

penicilin G

cefalosporini

L-aminoadipinska kislina

ACV-tripeptid

L-cistein L-valin

Slika 3: Biosinteza penicilina G (Birmingham, 2006)

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

7

• Acilogenini: nastanejo iz aktiviranih acilnih prekurzorjev. Z združitvijo tvorijo različne strukture terpenov, steriodov in karotenoidov (geosmin, geraniol). To vključuje še poliketide, ki npr. eritromicin, tetracikline in cianidin (pigment).

OH

CH3

CH3

OH

OH

CH3HO

O OOH

CONH2

N(CH3)2

OH

geosmin tetraciklin Slika 4: Strukturi dveh acilogeninskih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986)

• Nukleologi: to so sekundarni metaboliti z izrazito podobnostjo monomernim

komponentam nukleinskih kislin. So predvsem modificirani nukleotidi. Sem sodijo spojine kot so npr. formicin in kafein.

N

N

N

HN

Riboza

NH2

N

N N

N

O

H3C

CH3

CH3O

formicin kafein

Slika 5: Strukturi dveh nukleolognih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986)

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

8

• Mešani: te ne moremo uvrstiti med ostale skupine, saj so zgrajeni iz različnih

prekurzorjev iz zgornjih skupin. Med te uvrščamo razne neesencialne porfirine, razne kisline iz prekurzorjev Krebsovega cikla, spojine, ki so nastale z združitvijo aminokislin in acilnega prekurzorja.

NH

H3C

CH3

CH3

O

O

OH

tenavzojska kislina

NH

N

OCH3

NH

CH3

CH3

prodigiosin Slika 6: Strukturi dveh mešanih sekundarnih metabolitov (Vining, 1986)

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

9

2.2 AKTINOMICETE

2.2.1 Aktinomicete Aktinomicete so velika skupina navadno filamentoznih po Gramu pozitivnih bakterij, ki pogosto tvorijo razvejano mrežo filamentov oziroma tako imenovani micelij. Dimenzije micelija aktinomicet so po velikosti podobne dimenzijam bakterij, po obliki pa so podobne miceliju nitastih gliv. Večina aktinomicet tvori spore, vendar se proces nastanka spor med skupinami razlikuje (Madigan in sod., 2003). Znane so postale kot proizvajalci antibiotiokov ter ostalih biološko aktivnih spojin leta 1940, ko so odkrili aktinomicin, še posebno pa leta 1943, ko so odkrili streptomcin, prvi učinkoviti antibiotik v zdravljenju tuberkuloze (Challis in Hopwood, 2003). Aktinomicete proizvajajo 2/3 znanih antibiotikov, ki jih proizvajajo mikroorganizmi, in okoli 60 % vseh ostalih sekundarnih metabolitov z biološko aktivnostjo (Kieser in sod., 2000). K temu deležu rod Streptomyces prispeva 70-80 %, ostale deleže prispevajo Saccharopolyspora, Amycolatopsis, Micromonospora in Actinoplanes (Challis in Hopwood, 2003).

2.2.2 Taksonomija streptomicet

domena: BACTERIA deblo: Firmicutes razred: Actinobacteria podrazred: Actinobacteridae red: Actinomycetales podred: Streptomycineae družina: Streptomycetaceae rod: Streptomyces

Slika 7: Taksonomska opredelitev streptomicet (Bergey in Holt, 1994)

2.2.3 Morfologija in življenjski cikel Kljub različnim barvam kolonij lahko streptomicete na agarju enostavno prepoznamo po nejasnih, hrapavih oblikah, značilni barvi in kompaktni strukturi. Filamenti streptomicet so običajno premera 0,5-1,0 μm, različno dolgi in jim pogosto manjka prečna stena med vegetativno fazo rasti. Rast se pojavlja na koncih filamentov, kjer tudi pogosto pride do razvejanja, kar privede do kompleksnega prepleta matriksa. S staranjem kolonije se začnejo tvoriti sporofori, zračne hife, ki se dvigajo nad površino in tvorijo spore. Spore se imenujejo konidiji in niso sorodni z endosporami bakterij rodu Bacillus in Clostridium. Tvorijo se z nastankom prečne stene v večjedrnih sporoforih, čemur sledi ločevanje posameznih celic naravnost v spore. Spore služijo predvsem v razmnoževalne namene. Elementi zračnega micelija se razlikujejo po obliki in ureditvi pri posameznih vrstah rodu Streptomyces ter so eden od bistvenih ključev za razvrščanje streptomicet v skupine.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

10

Konidiji in sporofori pogosto vsebujejo pigmente, ki dajejo značilno barvo zreli koloniji (Madigan in sod., 2003).

proste spore

10 ur

18 ur 30 ur

2 dni

3 dni

4 do 10 dni

Slika 8: Življenjski krog streptomicet (van Wezel, 2002)

2.2.4 Genom Vsebnost GC-nukleotidnih parov pri streptomicetah je 70–74 % ali več. Odvisno od vrste je velikost kromosomskega zapisa približno 7,8–8,0 Mb (Kieser in sod., 2000), lahko pa je tudi večji. Nukleotidno zaporedje celotnega genoma Streptomyces coelicolor je bilo določeno julija leta 2001. Dolgo je 8.667.507 bp in naj bi vsebovalo 7825 genov, kar je približno dvakrat več od E. coli. Je tudi največji sekvenciran bakterijski genom. Streptomyces avermitilis ima sicer 9.025.608 bp, a ocenjujejo, da ima le 7575 odprtih bralnih okvirjev (Streptomyces, 2006). Večina streptomicet vsebuje linearni kromosom. Velike delecije in podvojitve, ki se pojavljajo s frekvenco 0,1–1 % so značilne za to skupino mikroorganizmov. Zaradi terminalnih delecij na kromosomu se lahko povežeta dva konca in tvorita krožni kromosom, ki je zmožen podvojitve (Kieser in sod., 2000). Večina streptomicet vsebuje plazmide, tako linearne kot tudi krožne, ki so konjugativni in se sami podvojujejo. So velikosti 10–600 kb. Krožni so kovalentno zaprti krogi, ki so v več kopijah, če so majhni, in v manj, če so večji. Večina plazmidov ne nosi zapisa za sintezo antibiotikov (Kieser in sod., 2000).

2.2.5 Ekologija in metabolizem Streptomicete v naravi najpogosteje najdemo kot prostoživeče saprofite v rizosferi (tanka plast zemlje, ki je v kontaktu z rastlinskimi koreninami), kjer s svojimi antibiotiki ščitijo pred potencialnimi patogenimi mikroorganizmi (Challis in Hopwood, 2003) in celo v vodnih območjih (Madigan in sod., 2003). Značilen vonj po zemlji je posledica sinteze vrste metabolitov, ki jih imenujemo geosmini. Večino streptomicet najdemo v alkalnih in

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

11

nevtralnih tleh. Več jih je v vodopropustnih tleh, kot so peščena tla, kar kaže na to, da za rast potrebujejo manjši vodni potencial od večine bakterij v zemlji (Madigan in sod., 2003). Večina streptomicet ima dokaj različne zahteve po virih ogljika. Uporabljajo lahko: ogljikove hidrate, sladkorje, alkohole, maščobne in organske kisline, aminokisline in aromatske spojine (Madigan in sod., 2003). V naravi, kjer streptomicete živijo predvsem v zemlji, je dovolj virov ogljika (kompleksni polisaharidi), toda malo dušika. Posledično imajo aktinomicete za ogljikove hidrate različne katabolične poti. Zaradi pomanjkanja dušika ni presenetljivo, da ima biosinteza aminokislin pri streptomicetah zelo redko inhibicijo s povratno zanko (Hodgson, 2000). Kirn (2005) je pokazal, da dodatek maščobnih kislin (olja) pozitivno vpliva na donos spojine SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1, zato je proces razgradnje maščobnih kislin pri streptomicetah omenjen v posebnem poglavju.

2.3 RAZGRADNJA MAŠČOBNIH KISLIN – β-OKSIDACIJA Produkti β-oksidacije so gradbeni elementi ciljnega produkta, spojine SBR0501. Maščobne kisline se morajo za razgradnjo najprej aktivirati. Tako nasičene kot nenasičene maščobne kisline se aktivirajo na enak način. Maščobna kislina (R-COO-) + ATP + CoASH acil-CoA + AMP ⎯⎯⎯⎯⎯

acil-CoA-sintetaza ⎯← →

Slika 9: Aktivacija maščobnih kislin (Boyer, 2005)

2.3.1 Reakcije β-oksidacije Acil-CoA vstopi v spiralno pot β-oksidacije. Vsak popoln obrat spirale vključuje štiri encimsko katalizirane reakcije, ki vodijo do sprostitve acetil-CoA in verige maščobne kisline, krajše za dva ogljikova atoma. Te reakcije so: (1) oksidacija enojne vezi med dvema ogljikovima atomoma do dvojne vezi, v sodelovanju s FAD, (2) adicija vode na dvojno vez z uvedbo hidroksilne skupine na enega od ogljikov, (3) oksidacija hidroksilne skupine v prisotnosti NAD+ do ketoskupine in (4) razcep vezi C-C in sprostitev acetil-CoA. Število obratov ne ustreza neposredno številu nastalih acetil-CoA, ker v zadnjem obratu nastaneta dva acetil-CoA. Razgradnjo maščobnih kislin predstavljajo predvsem oksidacijske reakcije (dve od štirih reakcij). Drugi dve sta reakciji nehidrolitične cepitve ob adiciji na dvojno vez (Boyer, 2005) .

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

12

RH2C

H2C

H2C C SCoA

O

R CH2

C C C SCoA

H

H O

RH2C C

H

H2C C SCoA

OH ORH2C C

H2C C SCoA

O O

H3C C SCoA

OR

H2C C SCoA

O

FAD

FADH2

acil-CoA-dehidrogenaza

acil-CoA

enoil-CoA H2O

enoil-CoA-hidrataza

L-3-hidroksiacil-CoA

NAD+

NADH + H+

L-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza

3-ketoacil-CoA

CoASH

acetil-CoAacil-CoA

β-ketotiolaza

Slika 10: Spiralna pot β-oksidacije maščobne kisline (Boyer, 2005)

2.3.2 β-oksidacija nenasičenih maščobnih kislin Maščobne kisline z dvojno vezjo nastanejo tudi kot intermediati v procesu β-oksidacije. Vendar ima dvojna vez v intermediatu enoil-CoA konfiguracijo trans, medtem ko je dvojna vez v naravnih maščobnih kislinah v konfiguraciji cis. Za popolno razgradnjo nenasičenih maščobnih kislin zato potrebujemo poleg štirih encimov β-oksidacije še dva pomožna encima. Prvi je enoil-CoA-izomeraza in katalizira preureditev Δ3-dvojne vezi s cis konfiguracijo v Δ2-dvojno vez s trans konfiguracijo. Drugi, 2,4-dienoil-CoA-reduktaza, pa s koencimom NADPH pretvori intermediat trans-Δ2, cis-Δ4 v trans-Δ3-enoil-CoA. Pri tej reakciji se ena dvojna vez reducira in druga premakne (Boyer, 2005).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

13

SCoA

O

SCoA

O

SCoA

O

SCoA

O

SCoA

O

SCoA

O

SCoA

OSCoA

O

NADPH +H+

NADP+

trije obrati β-oksidacije

enoil-CoA izomeraza

poln obrat β-oksidacije

acil-CoA-dehidrogenaza

2,4-dienoil-CoA reduktaza

enoil-CoA-izomeraza

trije obrati β-oksidacije

13 12 10 9

7 6 4 3

7 6

3

2

5 4

5 4

3

2

4

3

3

2

Slika 11: Prikaz metabolizma nenasičene maščobne kisline 16:2 (Boyer, 2005)

2.4 DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA PRODUKCIJO SEKUNDARNIH METABOLITOV

Tvorba sekundarnih metabolitov je pogojena z določenimi dejavniki, kot so (Vining, 1986):

• Katabolična represija z ogljikom: spojine, ki omogočajo hitro asimilacijo vira ogljika zavirajo uporabo alternativnih virov ogljika. Visoka vsebnost glukoze v gojišču, ki je najbolj proučeni primer represije, zavira sintezo encimov, potrebnih za metabolizem ostalih virov ogljika in za sintezo sekundarnih metabolitov.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

14

• Katabolična represija z dušikom: oblika, v kateri je celici dostopen dušik, predvsem kot amonijev ion, močno vpliva na donos sekundarnih metabolitov. Slabše dostopni viri verejtno sproščajo amonijev ion le počasi in omejujejo hitrost rasti celice. Takšno stanje, poznano kot delno stradanje dušika, pozitivno vpliva na sintezo določenih sekundarnih metabolitov, npr. acilogeninov. Podobne učinke so opazili tudi pri dodatku raznih spojin, ki vežejo amonijev ion, npr. magnezijev fosfat. Te vežejo amonijev ion v kompleks, iz katerega ga potem počasi sproščajo in omogočajo rast organizmu.

• Regulacija s fosfatom: organizmi tvorijo neznatne količine sekundarnih

metabolitov, če je v gojišču presežek fosfata. Glavna tarča regulacije s fosfatom naj bi bila sinteza encimov sekundarnega metabolizma. Presežek fosfata zavira sintezo določenih encimov, saj zavira sintezo fosfataz. Dvig znotrajcelične koncentracije ATP, za 2- do 3-krat, povzroči takojšnjo inhibicijo sinteze antibiotikov.

• Bioregulatorji: pri sintezi sekundarnih metabolitov so potrebne določene molekule,

ki po strukturi niso povezane s sekundarnimi metaboliti, niti z njihovimi intermediati. Takšen primer je A-faktor pri sintezi streptomicina. Mutante S. griseus, ki nimajo A-faktorja, imajo blokiran mehanizem diferenciacije in ne morejo sporulirati. Vendar je ta mehanizem prisoten le pri nekaterih vrstah in ni splošen. Vrsta S. coelicolor sporulira normalno tudi brez A-faktorja

2.5 IZBOLJŠAVA DELOVNEGA ORGANIZMA Izboljšava delovnega organizma vključuje fenotipske spremembe kot so npr. povečana produkcija želenih metabolitov, odstranitev neželenih metabolitov ali sprememba celične morfologije, ki omogoči lažjo ločitev organizma od produkta (Queener in Lively, 1986). Z izjemo živilske industrije zelo malo komercialnih procesov uporablja divje tipe sevov, izoliranih neposredno iz narave. Uporabljajo se mutanti, ki so prilagojeni na specifičen proces. Ena od glavnih motivacij za razvoj industrijskih sevov je ekonomika, kajti donos ciljnih produktov pri divjih tipov je navadno prenizek za biosintezo. Obsežen program razvoja sevov lahko traja tudi več let, donosi pa se lahko povečajo tudi za 100 in več krat. Uspešnost programa je odvisna od delovnega seva, procesa in narave ciljnega produkta , ki jo pridobivamo (Crueger in Crueger, 1990). Za stroškovno upravičen proces so potrebni sevi z izboljšanimi bioprocesnimi lastnostmi. Odvisno od sistema so zaželeni sevi, ki imajo krajši čas bioprocesa, ne tvorijo neželenih pigmentov ali drugih stranskih produktov, imajo zmanjšane potrebe po kisiku ali lahko uporabljajo cenejše substrate. Naravni izolati pogosto tvorijo mešanico kemijsko podobnih spojin, praviloma pa želimo mutante, ki tvorijo le eno spojino (Crueger in Crueger, 1990).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

15

2.5.1 Povečanje produkcije sekundarnih metabolitov Bioaktivne molekule so močno oksidirane in gledano z metaboličnega stališča zelo energetsko potratne molekule, zato jih naravni izolati v naravi tvorijo v majhnih količinah (Prosser in Tough, 1991). Produkcijo sekundarnih metabolitov nadzira 5 različnih skupin genov (Crueger in Crueger, 1990):

• Strukturni geni – kodirajo encime za biosintezo sekundarnih metabolitov. • Regulatorni geni – sekundarnega metabolizma. • Geni za odpornost – dajejo odpornost proizvajalcem antibiotikov na lastne

metabolite. • Geni za permeabilnost – nadzorujejo privzem in izločanje spojin. • Regulatorni geni – primarnega metabolizema in tako posredno tudi sekundarnega.

Spremembe v metabolizmu, ki lahko povzročijo povečanje donosa (Döhren in Gräfe, 1997; Nielsen, 1998; Oksman-Caldentey in Inze, 2004):

- Eliminacija ozkih grl pri sintezi prekurzorjev oziroma gradbenih elementov, kateri tvorijo sekundarni metabolit.

- Odprava negativne katabolične regulacije. - Dvignjena odpornost organizma na lasten ciljni metabolit - Odsotnost negativne povratne regulacije (»feedback regulation«) sekundarnih

metabolitov na lastno sintezo. - Povečano izražanje biosinteznih genov vključenih v pot. - Zmanjšan katabolizem (razgradnja) ciljne spojine. - Zmanjšan pretok metabolitov skozi biosintezne poti, ki jih lahko naš ciljni

metabolit deli z ostalimi sekundarnimi metaboliti. - Povečana prepustnost membrane za prekurzorje želenega produkta.

Obstaja več osnovnih genskih pristopov za izboljšanje donosa ciljnega produkta pri biosinteznih postopkih, kot so npr. mutageneza, rekombinacija in kloniranje (Baltz, 1986a). Selekcije, mutageneza in genske rekombinacije so znane in uporabne metode za izboljšanje produkcije sekundarnih metabolitov pri aktinomicetah. Vendar ne dajo informacij o genih, ki so pomembni za visoko produkcijo sekundarnih metabolitov. Gre za naključne mutacije, ki jih navadno ni mogoče definirati (locirati) (Baltz in Hosted, 1996).

2.5.1.1 Selekcija Selekcija je postopek, ko namerno gojimo mutante ali rekombinantne mikroorganizme v pogojih, pri katerih lahko rastejo le tisti z ustreznim genotipom. Direktna uporaba bogatitvenih postopkov za večjo produkcijo sekundarnih metabolitov je težja. Selekcija mora biti posredna, saj so sekundarni metaboliti nepotrebni za preživetje celice (Queener in Lively, 1986). Kot primer selekcije lahko navedemo izolacijo seva, ki če je odporen na več antibiotikov, proizvaja večje količine nekega drugega sekundarnega

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

16

metabolita. Tako se na primer proizvodnja aktinorodina poveča za 1,6–3-krat, če je sev odporen na gentamicin, rifampin ali streptomicin. Še za 1,7–2,5-krat se poveča proizvodnja, če je sev odporen na streptomicin in gentamicin ali streptomicin in rifampin. V primerjavi z divjim tipom pa sev, odporen na vse tri antibiotike, proizvaja kar 48-krat več aktinorodina (Hu in Ochi, 2001). Podobne poskuse je napravil tudi Tamehiro in sod. (2003). Z odpornostjo na streptomicin, gentamicin in rifampin je dvignil produkcijo salinomicina za 2,3-krat. Posebni okoljski pogoji, toksični za večino celic, a netoksični za manjšino, se uporabljajo za bogatitev celične populacije s spremenjenim fenotipom, ki pogosto vpliva tudi na biosintezo želenega metabolita. Takšni selekcijski postopki se imenujejo bogatitveni postopki. Razviti so na podlagi razumevanja celičnega metabolizma in želenega biosinteze produkta (Queener in Lively, 1986).

2.5.1.2 Mutageneza Mutacija je trajna sprememba enega ali več nukleotidov v DNA verigi. V večini primerov so mutacije škodljive, vendar nekatere omogočijo organizmu boljše prilagajanje okolju (Parekh in sod., 2000). Mutageneza je najbolj neposreden in najcenejši postopek izboljšanja industrijskih mikroorganizmov (Queener in Lively, 1986). Je tudi najbolj preprosta: ni potrebno veliko znanja o genetiki in fiziologiji biosinteznih poti delovnega mikroorganizma, ki so vpleteni v biosintezo želenega produkta (Baltz, 1986a). Za izboljšano produkcijo industrijskih sevov streptomicet se uporablja kemijsko ali radiacijsko inducirana mutageneza (Kieser in sod., 2000). Izbira primernega mutagena in njegove količine je bistvenega pomena za uspeh. Za vsak mutagen in organizem je potrebno ovrednotiti primernost mutagenega sredstva in optimizirati koncentracije mutagena, čas izpostavitve in pogoje kultivacije, ki dajejo največji donos (Queener in Lively, 1986). Stopnja spontanih mutacij je navadno 1 od 107 ali 106. Pojavljajo se vsi tipi mutacij: insercije, delecije, transverzije, tranzicije, premiki bralnega okvirja… Z uporabo mutagenih sredstev lahko frekvenco mutacij povečamo na 1 od 105 - 103 (Crueger in Crueger, 1990). Glavni cilj naključnih mutacij je povečanje frekvence želenih mutacij, obenem pa zmanjšati frekvence ostalih negativnih mutacij, ki bi negativno vplivale na donos ciljnega metabolita. Za pridobitev naključnih mutacij se navadno uporabljajo fizikalna in kemijska mutagena sredstva, ko so npr. UV svetloba, hidroksilamin, etil metansulfonat, metil metansulfonat (Baltz, 1986b).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

17

Preglednica 3 : Vrste mutagenih sredstev in njihovo delovanje (Parekh in sod., 2000)

Mutageno sredstvo Povzročena mutacija Učinek na DNA Radiacija X-žarki, gama žarki Prelomi DNA Delecije, strukturne spremembe UV žarki Tvorba pirimidinskih dimerov Transverzije, delecije, premik

bralnega okvirja Kemikalije 5-Bromouracil Napačno parjenje baz Tranzicije Hidroksilamin Deaminacija citozina Tranzicije Etil metansulfonat Alkilacija citozina in adenina Tranzicije Etidijev bromid Interkalacija med dvema

bazama Premik bralnega okvirja

Biološki dejavniki Fagi, plazmidi Zamenjave baz, lomi DNK Delecije, insercije, podvajanje Ko s pomočjo postopka selekcije in mutageneze pridobimo z mutacijo izboljšan sev, ga uporabimo kot izhodni sev v novem ciklu selekcije in mutageneze (Parekh in sod., 2000). Pridobljen sev, ki kaže povečan donos, se podrobno testira in statistično ovrednoti. Postopek mutageneze je kontinuiren proces, ki se ga najprej uporablja za doseganje večjega donosa, nato pa se z njim vzdržuje selekcijski pritisk na seve.

2.5.1.3 Rekombinacija Uporaba naravnega križanja (natural mating) ali fuzije protoplastov za kombiniranje želenih genov iz različnih mutiranih sevov je bila uspešna le poredko, pa še te podatki so težko dostopni zaradi industrijskih skrivnosti (Kieser in sod., 2000). Fuzija protoplastov je vsestranska tehnika za indukcijo rekombinacije. Veliko se uporablja za industrijske mikroorganizme. Zahteva natančne postopke za nastanek protoplastov, fuzijo protoplastov in za regeneracijo celic (Matsushima in Baltz, 1986). Genski inženiring se uspešno uporablja za izboljšanje produkcije primarnih metabolitov in ektracelularnih encimov, prekomerna produkcija sekundarnih encimov pa je veliko bolj kompleksna zaradi kompleksne in večslojne celične regulacije diferenciacije in produkcije sekundarnih encimov (Parekh in sod., 2000). Ena od strategij za izboljšanje produktivnosti uporabnih produktov z genskim inženirstvom je povečanje ekspresije ključnih biosinteznih in regulatornih genov. Vendar ima ta strategija lahko šibko točko, saj prehitro izražanje sekundarnih metabolitov ali proteinov zavre rast celic in posledično količino želenega produkta. Zato je potrebno razviti regulatorni sistem, ki bo zaviral ekpresijo tarčnih genov, dokler celice ne dosežejo pravšnje gostote, tedaj pa bo vključil ekspresijo genov (Herai in sod., 2004). Z povečanjem ekspresije genov pcbC (izopenicilin-N-sintaza) in pcbDE (aciltransferaza) pri sevu Penicillium chrysogenum povečamo donos penicilina za 40 % v primerjavi z divjim tipom (Nielsen, 1998).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

18

2.5.1.4 Katabolična represija Katabolična represija je v naravi široko razširjen pojav. Lahko bi ga definirali kot represijo encimske aktivnosti v prisotnosti razgradnjega produkta (katabolita). Čeprav je to lahko kateri koli razgradnji produkt, je večino zanimanja pritegnil mehanizem glukozne represije (Kwakman in Postma, 1994). Bakterije bodo preferenčno razgradile heksoze, če rastejo v okolju z različnimi viri ogljika. Če je prisotna glukoza, jo bodo bakterije prednostno uporabile. Pojav se imenuje glukozna represija. Glukoza z represijo transkripcije operonov (kot so lac, gal in ara) prepreči uporabo alternativnih virov ogljika (Lewin, 2004). Študije so bile napravljene tako na kvasovkah (Saccharomyces cerevisiae), na po Gramu negativnih bakterijah (Escherichia coli, Salmonella typhimurium) in na po Gramu pozitivnih bakterijah (Bacillus subtilis, Streptomyces coelicolor) (Kwakman in Postma, 1994). Skupinska translokacija je transportni proces, pri katerem se pri prehodu skozi membrano transportirana molekula kemijsko spremeni. Pri prehodu skozi membrano se monosaharidi glukoza, manoza in fruktoza fosforilirajo s fosfotransferaznim sistemom (PTS) (slika 12).

P

PEP

Piruvat

P

P

EnzI HPr Enz

IIa

EnzIIb

EnzIIc

Glukoza

Glukoza 6-fosfat

Slika 12: Mehanizem fosfotransferaznega sistema (PTS) pri Escherichii coli (Madigan in sod., 2003)

Raziskave so pokazale, da je encim streptomicet IIa (imenovan tudi IIaCrr) močno podoben encimu IIa pri E.coli (imenovan tudi IIaGlc). Fosfotransferazi PTS sistema encim I in HPr fosforilirata encim IIa (Kamionka in sod., 2002). Fosforiliran encim IIaGlc fosforilira glukozo. Nefosforiliran IIaGlc inhibira katabolične encime in permeaze za sladkorje. Ker je IIaGlc defosforiliran, ne more stimulirati adenilat-ciklaze in celična koncentracija cAMP ostane nizka. Pomanjkanje cAMP ne more aktivirati transkripcijskega dejavnika CAP, ki je globalni aktivator genov pod katabolično kontrolo (Kamionka in sod., 2002). Hkratna izraba različnih substratov bi povečala možnost navzkrižne inhibicije (intermediati ene poti lahko vplivajo na encime druge poti), zaradi dodatnih metabolnih zank se kakšen substrat lahko spremeni v produkt, dodatni encimi bi povzročili gnečo v citoplazmi, dodatne poti bi lahko vplivale na razmerja ključnih intermediatov, tudi dodatni transportni proteine bi povzročili gnečo v membrani.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

19

2.5.1.5 Toksični metabolitični analogi Namen uporabe toksičnih metabolitičnih analogov je inhibicija encima, ki je nujno potreben za preživetje celice in je vključen v biosintezno pot ciljnega metabolita. Celice, ki bi imele odpornost na večje koncentracije takšnega analoga, naj bi prekomerno izražale gena za encim. To pa bi pomenilo povečan pretok metabolitov preko te biosintezne poti, kar bi lahko pozitivno vplivalo na biosintezo ciljnega metabolita (Parekh in sod., 2000). Poleg tega lahko z dodatkom analogov snovi, ki regulirajo lastno sintezo, dobimo mutanto brez mehanizma s povratno zanko, ki tvori večje količine metabolitov. Primer so biosinteza aminokislin in vitaminov (Queener in Lively, 1986).

2.6 PRISTOPI ZA IZBOLJŠANJE DONOSA SPOJINE SBR0501 Kirn (2005) je pokazal, da je za produkcijo spojine SBR0501 najboljši vir ogljika sojino olje ali linolna kislina. V tej nalogi smo želeli preveriti vpliv večjih koncentracij sojinega olja ali linolne kisline na donos spojine SBR0501. Procesirana maščobna kislina (linolna kislina) je prekurzor ciljne spojine, zato smo z odpornostjo na povečane koncentracije linolne kisline, 2-bromoheksadekanojske kisline in polimiksin B, poskušali povečati donos spojine SBR0501. SOJINO OLJE Sojino olje je dober vir linolne kisline. Preglednica 4: Maščobno kislinska sestava sojinega olja (O'Brien, 1998)

Maščobna kislina % Linolna 53,7 Oleinska 23,3 Palmitinska 10,6 Linolenska 7,6 Stearinska 4,0 Ostale skupaj 0,8

2.6.1 Odpornost na povečane koncentracije linolne kisline Linolna kislina maščobna kislina in kot takšna podvržena celičnemu metabolizmu. Pri tem pa se lahko tvorijo za celico toksične spojine. Poskušali smo izolirati seve, ki bi imeli večjo odpornost na linolno kislino, saj bi tako morda v gojišče dali več linolne kisline in tako dvignili donos spojine SBR0501. Lipidi se oksidirajo po treh različnih mehanizmih: encimska oksidacija, neencimska z radikali posredovana oksidacija in neencimska neradikalna oksidacija. Vsak tip tvori

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

20

specifične produkte (Niki in sod., 2005). Nekateri izmed njih so esencialni za celico (acetil-CoA iz β-oksidacije), drugi pa imajo tudi toksične učinke.

2.6.1.1 Peroksidacija Lipidna peroksidacija (LPO) je proces, v katerem se večkratnenasičene maščobne (PUFA) pretvorijo v lipidne hidroperokside (LOOH), katalizirajo pa ga encimi ali prosti radikali. LOOHs se ob prisotnosti dvovalentnih ionov razgradijo v radikale, ki inducirajo nastanek širokega spektra reaktivnih komponent (Spiteller, 2001).

Toksični produkti peroksidacije Primarni produkti lipidne peroksidacije so hidroperoksidi (Niki in sod., 2005). Prekurzorski molekuli produktov lipidne peroskidacije linolne kisline sta 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadienojska kislina (13-HPODE) in 9-hidroperoksi-10,12-oktadekadienojska kislina (9-HPODE). Iz njiju nastanejo razni produkti s toksičnimi učinki: 4-hidroksi-2-nonenal in 2,4-dekadienal, ki sta zelo toksična za celice sesalcev, v rastlinah 4-hidroksi-2-nonenal inhibira rast patogencev. 2-alkenali so genotoksični in inhibirajo rast gliv (Spiteller in sod., 2001). Heksanal in ostali aldehidi zmanjšajo kalitev semen (Spiteller in sod., 2001).

C5H11

HC C

HCH

HC C

H(CH2)7 C5H11 C

H

HC C

H

HC CH (CH2)7

C5H11 CH

HC

CH2

HC C

H(CH2)7

+ O2+ RH - R

C5H11

HC C

H

HC C

HCH

(CH2)7 C5H11 CH

CH

HC C

H

HC (CH2)7

+ O2+ RH - R

OHOO OH

C5H11 CH

HC

CH

HC C

H(CH2)7

COOHCOOH

COOH COOH

COOH

COOH

Slika 13: Nastanek 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadienojske kisline (13-HPODE) in 9-hidroperoksi-10,12- oktadekadienojske kisline (9-HPODE) (Spiteller in sod., 2001)

Med ostalimi toksičnimi metaboliti so omenjeni še monoepoksidi. Monoepoksida 9,10-cis-epoksioktadekenojska kislina (9,10-EOA) in 12,13-cis-epoksioktadekanojska kislina

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

21

(12,13-EOA) ter diola 9,10-dihidroksioktadekanojska kislina (9,10-DHOA) in 12,13- dihidroksioktadekanojska kislina (12,13-DHOA) inhibirajo prenos elektronov v transportni verigi (Mitchell in sod., 2002). Monoepoksidi linolne kisline se tvorijo z lipidno avtooksidacijo ali spontano pri reakciji OH- skupine z linolno kislino. Levkotoksin je takšen derivat linolne kisline, ki pa je toksičen, če se pretvori v levkotoksindiol. Ta negativno vpliva na transport natrija in kalija preko membrane (Stimers in sod., 1999).

Drugi toksični vplivi linolne kisline Med lipidno peroksidacijo nastanejo tudi aldehidi. Med količinsko najbolj zastopanimi je že omenjeni 4-hidroksi-2-nonenal. Aldehidi so zaradi velike reaktivnosti zelo toksični za celico. Reagirajo lahko z aminokislinami, peptidi in proteini. S pospešitvijo depolimeracije aktina in tubulina poškodujejo citoskelet celice. Modificirajo proteosomske proteine in s tem ovirajo razgradnjo škodljivih proteinov v celici. Zaradi svoje velike reaktivnosti z membranami jim spremenijo strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti. Povečajo permeabilnost membrane in povzročijo razpad celičnih komunikacij (Davydov in sod., 2004). Možno je tudi, da so nenasičene maščobne kisline toksične za celice v fazi pospešene rasti. Dodatek nenasičenih maščobnih kislin v gojišče pomeni povečano vgraditev teh gradnikov v celično membrano, ki zaradi tega postane zelo nestabilna (Carson in Daneo-Moore, 1980).

2.6.2 Odpornost na povečane koncentracije 2-bromoheksadekanojske kisline 2-bromoheksadekanojska kislina (2-BrP) je analog palmitata (Webb in sod., 2000). Inhibira celično rast v mnogo manjših koncentracijah kot linolna kislina in če bi izolirali sev, odporen na večje koncentracije 2-BrP, predpostavljamo, da bi lahko povečali odpornost tudi na linolno kislino.

2.6.2.1 Delovanje α-bromomaščobnih kislin kot model delovanja α-bromomaščobne kisline imajo skelet iz ogljikovih atomov, na katerega imajo pripeto ─COOH skupino in bromov (fluorov) atom na α-C atomu. Z vezavo z acil-CoA-sintetazo preprečujejo tvorbo acil-CoA derivatov (Grillo in sod., 2001). Sevi, ki bi rasli ob povečanih koncenteracijah α-bromo analogov maščobnih kislin, bi morali imeti povečane koncentracije encima acil-CoA-sintetaze. Tako bi lahko hitreje metabolizirali maščobne kisline, ki so prekurzorji ciljnega metabolita.

2.6.3 Odpornost na povečane koncentracije polimiksina B Tarča delovanja polimiksina B je celična membrana. S spremembo lastnosti celične membrane bi lahko vplivali na odpornost na linolno kislino.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

22

2.6.3.1 Toksičnost polimiksina B Polimiksini so neribosomsko sintetizirani peptidi po Gramu-pozitivnih bakterij. Čeprav so jih odkrili že pred več kot 50 leti, način njihovega delovanja še ni popolnoma pojasnjen. Številne študije pa nakazujejo njihovo delovanje na bakterijske citoplazmatske membrane (Clausell in sod., 2003). Zmanjšana prepustnost membran se kaže kot povečana odpornost na različne antibiotike. Polikationski antibiotiki, kot je polimiksin B, povečajo prepustnost membrane (Rahaman in sod., 1998). Vendar pa novejše študije izključujejo prepustnost membran kot način delovanja teh antibiotikov. Osnova primarnega stresa povzročenega z antibiotiki naj bi bila sposobnost peptidov (antibiotikov) tvorbe povezav med fosfolipidi. Kationski polimiksini imajo veliko afiniteto do kislih fosfolipidov. Tvorile naj bi se stabilne povezave med vezikli anionskih fosfolipidov, med temi povezavami pa je hitra izmenjava fosfolipidov. Ta izmenjava je zelo selektivna, saj lahko prehajajo le monoanionski fosfolipidi, ostale komponente pa ne (Clausell in sod., 2003). Polimiksin ima 5 pozitivnih nabojev, s katerimi se lahko poveže z negativnimi naboji dela celične membrane. Ko je dosežena kritična koncetracija polimiksina na membrani, naj bi se tvorile začasne odprtine/pore v dvosloju, skozi katere lahko nato polimiksin preide v celico (Gutsmann in sod., 2005). Zato predpostavljamo, da bi lahko mutante odporne na manjše koncentracije polimiksina B imele neposredno, hitro in selektivno izmenjavo fosfolipidov brez fuzij. Večje koncetracije pa naj bi inducirale fuzijo membran, pri tem pa pride do izgube vodne faze. Pri manjših koncentracijah (2 mol %) se pojavijo posamezni kontakti med vezikli, pri večjih koncentracijah (nad 2 mol %) pa pride do fuzije membran. Predpostavljamo, da pri večjih koncentracijah polimiksin B globlje prodre v lipidni dvosloj (Clausell in sod., 2003).

2.6.4 Odpornost na 2-deoksiglukozo Glukoza preprečuje uporabo alternativnih virov ogljika s sistemom glukozne represije. Tako lahko bakterije uporabljajo linolno kislino šele, ko zmanjka glukoze (ali kakšnega drugega preferenčnega vira ogljika (C)). Linolna kislina se bo tedaj uporabljala kot vir C in ne kot prekurzor ciljnega metabolita. 2-deoksiglukoza (DOG) je glukozni analog, ki se ne metabolizira, a še vedno aktivira glukozno represijo. Med sevi, ki bi bili odporni na povečane koncentracije DOG, bi lahko izolirali mutante ki ne podležejo katabolični represiji z glukozo. Verjetno ne bi imeli sistema glukozne represije, ali pa bi izgubili transportni sistem za prenos DOG v celico (Hodgson, 1982).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

23

3 MATERIALI IN METODE

3.1 DELOVNI POSTOPKI

Slika 14: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na linolno kislino

Priprava trdnih selekcijskih gojišč z 0,5, 1, 2, 3 in 5 mM

linolne kisline

Redčitev spor

Nacepitev spor in kultivacija (7 dni, 28 °C)

Precepitev zraslih kolonij na enako gojišče za potrditev odpornosti,

kultivacija (7 dni, 28°C)

Precepitev zraslih kolonij na sporulacijsko gojišče (SP) z 0,5, 1 in

2 % linolne kisline kultivacija (7 dni, 28°C)

Prenos spor iz SP gojišča z 1 in 2 % linolno kislino v vegetativno gojišče in aerobna kultivacija na stresalniku

(1 dan, 28 °C, 275 min-1)

Inokulacija produkcijskih gojišč z 10 % kulture iz vegetativnega gojišča in aerobna kultivacija na stresalniku

(6 dni, 28°C, 275 min-1)

Vzorčenje in priprava vzorcev za analizo

HPLC analiza

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

24

Slika 15: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na 2-bromoheksadekanojsko kislino

Priprava trdnih selekcijskih gojišč s 5, 6, 7, 8, 9 in 10 μM

2-BrP

Redčitev spor

Nacepitev spor in kultivacija (7 dni, 28 °C)

Precepitev zraslih kolonij na enako gojišče za potrditev odpornosti,

kultivacija (7 dni, 28°C)

Precepitev zraslih kolonij na sporulacijsko gojišče (SP) s 5, 25 in

50 μM 2-BrP kultivacija (7 dni, 28°C)

Prenos spor iz SP gojišča s 50 μM 2-BrP v vegetativno gojišče in

aerobna kultivacija na stresalniku (1 dan, 28 °C, 275 min-1)

Inokulacija produkcijskih gojišč z 10 % kulture iz vegetativnega gojišča in aerobna kultivacija na stresalniku

(6 dni, 28°C, 275 min-1)

Vzorčenje in priprava vzorcev za anlizo

HPLC analiza

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

25

Priprava trdnih selekcijskih gojišč s 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20 in 30 μg/ml polimiksina

B

Redčitev spor

Nacepitev spor in kultivacija (7 dni, 28 °C)

Precepitev zraslih kolonij na enako gojišče za potrditev odpornosti,

kultivacija (7 dni, 28°C)

Precepitev zraslih kolonij na sporulacijsko gojišče (SP) s 10, 50 in

100 μg/ml polimiksina B kultivacija (7 dni, 28°C)

Prenos spor iz SP gojišča s 100 μg/ml polimiksina B v vegetativno gojišče in

aerobna kultivacija na stresalniku (1 dan, 28 °C, 275 min-1)

Inokulacija produkcijskih gojišč z 10 % kulture iz vegetativnega gojišča in aerobna kultivacija na stresalniku

(6 dni, 28°C, 275 min-1)

Vzorčenje in priprava vzorcev za analizo

HPLC analiza

Slika 16: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na polimiksin B

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

26

Slika 17: Hodogram poteka eksperimentalnega dela s kulturami odpornimi na 2-deoksiglukozo

Priprava trdnih selekcijskih gojišč z 10 mM etil

linoleatom ter 50 in 100 mM 2-deoksiglukozo

Redčitev spor

Nacepitev spor in kultivacija (7 dni, 28 °C)

Precepitev zraslih kolonij na enako gojišče za potrditev odpornosti,

kultivacija (7 dni, 28°C)

Precepitev zraslih kolonij na sporulacijsko gojišče (SP) s 100 mM

DOG in 10 mM etil linoleatom kultivacija (7 dni, 28°C)

Prenos spor iz SP gojišča v vegetativno gojišče in aerobna

kultivacija na stresalniku (1 dan, 28 °C, 275 min-1)

Inokulacija produkcijskega gojišča z 10 % kulture iz vegetativnega gojišča in aerobna kultivacija na stresalniku

(6 dni, 28°C, 275 min-1)

Vzorčenje in priprava vzorcev za analizo

HPLC analiza

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

27

3.2 MATERIALI

3.2.1 Izolati Izolat bakterij rodu Streptomyces sp. K343-1 smo dobili iz zbirke mikroorganizmov tovarne zdravil Krka, d.d., Novo mesto

3.2.2 Gojišča

3.2.2.1 Trdno minimalno gojišče Preglednica 5: Sestava trdnega minimalnega gojišča NMMB (Hodgson, 1982)

Sestavina Koncentracija Proizvajalec Čistost glicerol 10 mM (NH4)2SO4 1 g/l MERCK, Nemčija p.a. K2HPO4 0,5 g/l MERCK, Nemčija p.a. MgSO4×7H2O 0,2 g/l SIGMA, Nemčija min. 99,0 % FeSO4×7H2O 0,01g/l KEMIKA, Hrvaška p.a. 1 M NaH2PO4×H2O: K2HPO4 pufer (5:7)

15 ml/l

bakteriološki agar 20 g/l BIOLIFE, Italija dH2O dopolnimo do skupnega volumna 1l

3.2.2.2 Trdno sporulacijsko gojišče Preglednica 6: Sestava trdnega sporulacijskega gojišča - modificirano ISP4 gojišče (Atlas, 1993)

Sestavina Koncentracija (g/l) Proizvajalec koruzni škrob 30 Cerestar dekstrin* 40 Fidelinka sojina moka* 30 Carbill Foods amonijev sulfat 2 Merck kalcijev karbonat 6 Kalcit bakteriološki agar 15 Biolife pitna voda dopolnimo do skupnega volumna 1l

* dekstrin in sojina moka sta dodana ISP4 gojišču

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

28

3.2.2.3 Vegetativno gojišče Preglednica 7: Sestava vegetativnega gojišča - modificirano obogateno gojišče z glicerolom (Atlas, 1993)

Sestavina Koncentracija (g/l) Proizvajalec sojina moka* 10 Carbill Foods glicerol 20 Pan Century Oleochemicals kvasni ekstrakt 5 Sigma pitna voda dopolnimo do skupnega volumna 1l

* sojino moko smo uporabili namesto peptona

3.2.2.4 Produkcijsko gojišče Preglednica 8: Sestava produkcijskega gojišča - modificirano obogateno gojišče z glicerolom (Atlas, 1993)

Sestavina Koncentracija (g/l) Proizvajalec sojin lecitin* 14 Degussa glicerol 20 Pan Century Oleochemicals sojina moka** 32 Carbill Foods kalcijev karbonat 2 Kalcit MES hidrat 2 Sigma (4-morfolinetansulfonična kislina) sojino olje* 10/30 Cognis linolna kislina 10/30 Cognis pitna voda dopolnimo do skupnega volumna 1l * sojino olje in sojin lecitin sta dodana gojišču z glicerolom ** sojino moko smo uporabili namesto peptona

3.2.3 Raztopine in pufri

3.2.3.1 Priprava 1 M NaH2PO4×H2O : K2HPO4 pufra (5:7) V steklenico zatehtamo 69 g in dopolnimo do 500 ml z destilirano vodo. V drugo steklenico zatehtamo 87 g in dopolnimo do 500 ml z destilirano vodo. V gojišče dodajamo v razmerju 5:7 (6,25 ml raztopine NaH2PO4×H2O in 8,75 ml raztopine K2HPO4 na liter gojišča)

3.2.3.2 Priprava založne raztopine emulgatorja (5 g/100 ml) V erlernmajerjevo steklenico zatehtamo 5 g emulgatorja in dopolnimo do 100 ml z destilirano vodo. Na magnetnem mešalu mešamo, dokler se emulgator ne raztopi. Avtoklaviramo 20 minut pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,1 bara.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

29

3.2.3.3 Priprava mobilne faze za HPLC Acetonitril : 0,1 % (v/v) raztopina fosforne kisline (70:30): V merilni valj odmerimo 300 ml ddH2O, 300 μl ortofosforne kisline (85 %) in dopolnimo z acetonitirilom do 1 l. Filtriramo skozi membranski filter 0,45 μm.

3.2.3.4 Priprava založne raztopine polimiksina B (1 mg/ml) Raztopino pripravimo v falkon kiveti, kamor zatehtamo 10 mg polimiksin B sulfata (Sigma), ga raztopimo v 10 ml dH2O in prefiltriramo skozi 0,2 μm membranski filter.

3.2.3.5 Priprava založne raztopine 2-bromoheksadekanojske kisline (1 mM) Raztopino pripravimo v falkon kiveti. Zatehtamo 1 mg 2-bromoheksadekanojske kisline (97 %, Aldrich) in jo raztopimo v 3 ml DMSO. Raztopino 2-bromoheksadekanojske kisline smo dodali v gojišče v eno odstotni koncentraciji (v/v), ki še ni toksična.

3.2.3.6 Priprava založne raztopine 2-DOG (2 mM) Zatehtamo 0,656 g 2-DOG (Acros Organics) in jo raztopimo v 2 ml destilirane vode. Pri eksperimentalnemu delu smo uporabljali še naslednje reagente:

• Metanol (p.a., Merck) • DMSO (min. 99,9 %, Sigma) • Acetonitril (HPLC kvaliteta, J. T. Baker) • Emulgator Triton X-100 (Merck) • Emulgator Tween 80 (Merck) • Emulgator Pemulen TR1 (BF Goodrich) • Etil linoleat (Sigma)

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

30

3.2.4 Oprema Preglednica 9: Seznam laboratorijske opreme

Aparatura Oznaka modela Proizvajalec avtoklav SU 300 Sutjeska, Srbija in Črna gora avtomatske pipete P1, P10, P100, P200,

P1000 Gilson, Francija

brezprašna komora PIO SMBC 122 Iskra, Slovenija centrifuga 5415C Eppendorf, Nemčija digestorij filtrirna naprava Sartorius, Nemčija hladilnik SK 405 LTH, Slovenija inkubator Sutjeska, Srbija in Črna gora magnetno mešalo RH basic 2 IKA Works, Brazilija mikrovalovna pečica Sanyo pH meter Sevenmulti Mettler Toledo, Švica sistem HPLC Thermo Separation Products stresalnik Vrvi-403 Tehtnica, Slovenija sušilnik SO-250S Elektromedica, Slovenija analitska tehtnica Sartorius, analytic Sartorius, Nemčija tehtnica Sartorius, excellence Sartorius, Nemčija vakuumska črpalka Typ.1.20 00 02 Veb Reglerwerk, Nemčija vodna kopel Heto, Danska vrtinčnik Vibromix 104 EV Tehtnica, Slovenija zmrzovalnik LTH, Slovenija

3.2.5 Steklovina in potrošni material

• Čaše • Epruvete • Erlenmajerjeve steklenice (250, 500, 1000 ml) • Falkon kivete (12 in 50 ml) • Merilni valji • Nastavki za pipete • Petrijevke • Steklenice • Cevke za prenos (Transfertubes) (Spectrum, ZDA) • Viale (Thermo Separation Products) • Membranski filtri (Millipore, Irska)

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

31

3.3 METODE DELA

3.3.1 Priprava gojišč

3.3.1.1 Trdno selekcijsko gojišče Zatehtali smo vse sestavine (točka 3.2.2.1) razen glicerola in agarja, dodali destilirano vodo in mešali na magnetnem mešalu. Po dodatku agarja smo gojišče sterilizirali. Posebej smo sterilizirali glicerol, ki smo ga po sterilizaciji v brezprašni komori dodali v ohlajeno gojišče, premešali in razlili na petrijeve plošče. Po dodatku glicerola smo dodali še različne inhibtorje in po potrebi emulgator.

3.3.1.2 Trdno sporulacijsko gojišče Vse sestavine (točka 3.2.2.2) razen agarja smo zatehtali, dodali vodovodno vodo in segrevali do 85 °C ob mešanju na magnetnem mešalu. Ko je temperatura dosegla 85 °C smo prestavili na navadno mešalo (brez segrevanja) ter počakali, da se je gojišče ohladilo. Dodali smo agar, premešali, da se je raztopil, in sterilizirali. Po sterilizaciji smo gojišče ohladili in v brezprašni komori razlili na petrijeve plošče. Po sterilizaciji smo v gojišče dodali različne inhibitorje in po potrebi emulgator.

3.3.1.3 Vegetativno gojišče za pripravo cepiva Glicerol smo zatehtali v stekleno čašo, dodali vodovodno vodo ter ob segrevanju mešali, dokler se glicerol ni raztopil. Med mešanjem smo počasi dodali sojino moko in kvasni ekstrakt. Ko je bilo gojišče homogeno, smo uravnali pH na 7,0. Potrebne alikvote (5 ml) smo odpipetirali v falkon kivete. Na falkon kivete smo z gumicami pričvrstili krpice iz blaga in vse sterilizirali.

3.3.1.4 Tekoče produkcijsko gojišče V stekleno čašo smo zatehtali sojin lecitin in glicerol. Dodali smo vodovodno vodo in ob segrevanju mešali na magnetnem mešalu. Ko sta se lecitin in glicerol raztopila, smo nehali segrevati in med mešanjem počasi dodali še sojino moko, kalcijev karbonat in MES. Uravnali smo pH (7,4) ter v falkon kivete, v katere smo predhodno pipetirali ustrezne količine sojinega olja in linolne kisline, pipetirali alikvote gojišča (5 ml). Na falkon kivete smo z gumicami pričvrstili krpice iz blaga in vse sterilizirali. Uporabljali smo dve različici produkcijskega gojišča. Prvo gojišče je vsebovalo 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline, drugo pa 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline. Sterilizacija vseh gojišč je potekala v avtoklavu 20 minut pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,1 bara.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

32

3.3.2 Potek dela Na selekcijsko gojišče z inhibitorjem v različnih koncentracijah smo nacepili 50 μl spor. Po potrebi smo spore tudi desetiško redčili. Kot kontrolo smo uporabili selekcijsko gojišče brez inhibitorja. Kulture smo inkubirali pri temperaturi 28 °C. Kolonije, ki so zrasle pri največjih koncentracijah inhibitorjev smo precepili na identično selekcijsko gojišče in tako potrdili, da so selekcionirane kulture zares odporne na uporabljeno koncentracijo inhibitorja. Izbrane kolonije smo precepili na sporulacijska gojišča z inhibitorjem. Koncentracije inhibitorja so bile tokrat 5- in 10-krat večje kot v selekcijskem gojišču. Iz sporulacijskega gojišča smo spore s pomočjo cevk za prenos prenesli v vegetativno gojišče. Sledila je aerobna kultivacija na stresalniku pri temperaturi 28 °C in 275 min-1. Po 24 urni kultivaciji na vegetativnem gojišču smo inokulirali produkcijsko gojišče z 10 % kulture iz vegetativnega gojišča. Naslednjih šest dni je potekala aerobna kultivacija na stresalniku pri temperaturi 28 °C in 275 min-1. Po končani kultivaciji smo od vsake kulture vzeli tri vzorce po 0,5 ml in jih do analize shranili v zamrzovalniku pri temperaturi -20 °C. Celotno delo s kulturami je bilo opravljeno aseptično ob gorilniku v brezprašni komori.

3.3.3 Priprava vzorcev za analizo Vzorce kultur smo za analizo odmrznili na sobni temperaturi. Dodali smo jim metanol v razmerju 1:10 in ekstrahirali eno uro na sobni temperaturi. Odvzeli smo 1 ml metanolnega ekstrakta vzorca, ga prenesli v novo Eppendorfovo epruveto in centrifugirali 10 minut pri 12000 min-1 (centrifuga 5415C, Eppendorf, Nemčija). Supernatant smo prenesli vialo in analizirali s HPLC napravo.

3.3.4 Kvantitativno ovrednotenje količine inhibitorjev s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti

V sistem HPLC smo vstavili kolono Inertisil ODS2 (125 mm × 4,0 mm, delci premera 5 μm) in jo spirali z mobilno fazo. V vzorcu volumna 10 μl, injiciranega z uporabo vzorčevalnika, smo s 6-minutno metodo pri temperaturi 50 °C in pretoku 2,0 ml/min z uporabo UV-detektorja pri 200 nm določali koncentracijo inhibitorja. Za umerjanje opisanega analitskega postopka smo uporabili metodo zunanjih standardov, kjer je bila površina določenega vrha standardna mera za koncentracijo. Kot standard smo uporabili izolirano inhibitorno spojino izolata K343-10 (SBR0501).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

33

4 REZULTATI Skladno z delovno hipotezo smo skušali povečati donos spojine SBR0501. Z različnimi pristopi smo od aprila 2005 do oktobra 2005 poskušali izboljšati donos selekcioninih sevov streptomicet. Delo je obsegalo 562 ur. S selekcijo smo želeli pridobiti mutante, ki bi bile odporne na povečane koncentracije linolne kisline, polimiksina B, 2-bromoheksadekanojske kisline in 2-deoksiglukoze. Omenjene substance smo dodajali v različnih koncentracijah v trdna minimalna gojišča NMMB, ugotavljali njihov vpliv na rast sevov in na končni donos spojine SBR0501.

4.1.1 Vpliv emulgatorja Linolna kislina je slabo topna v vodi. Za dobro porazdelitev (disperzijo) kisline v gojišču smo dodali različne emulgatorje. To so površinsko aktivne snovi, ki navadno vplivajo na strukturo in posledično tudi na delovanje celične membrane. Zato smo preverili učinek samih emulgatorjev na seve. Testirali smo tri različne emulgatorje in sicer Pemulen, Triton X-100 in Tween 80, vsakega v dodatku 0,05, 0,1 in 0,25 % (v/v). Ovrednotili smo vpliv emulgatorjev na rast ciljnega mikroorganizma na trdnem selekcijskem gojišču (Preglednica 10). Preglednica 10: Vpliv emulgatorjev na rast sevov

volumski delež 0,05 % 0,1 % 0,25 % emulgator Pemulen preraščena plošča posamezne

kolonije ni rasti

Triton X-100 ni rasti ni rasti ni rasti Tween 80 preraščena plošča preraščena plošča preraščena plošča Na podlagi rezultatov smo se odločili za uporabo Tween 80 v koncentraciji 0,25 % (v/v).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

34

4.1.2 Kultivacija na selekcijskem gojišču z linolno kislino

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5

koncentracija linolne kisline (mM)

Prež

ivel

ost (

%)

6

Slika 18: Preživelost v odvisnosti od koncentracije linolne kisline

Slika 18 prikazuje vpliv koncentracije linolne kisline na preživetje seva K343-1 na trdnem selekcijskem gojišču. Na ploščah z 0,5 mM koncentracijo linolne kisline smo določili 31 odstotno preživelost. Število preživelih celic je še naprej upadalo tako pri dodatku 1 mM linolne kisline (preživelost 15 %), 2 mM linolne kisline (preživelost 0,2 %), 3 mM linolne kisline (preživelost 3,8 %) in 5 mM linolne kisline (preživelost 0,001 %). Zrasle kolonije smo precepili na plošče z enakimi koncentracijami linolne kisline, iz katerih so bile izolirane, zato, da bi potrdili rast na tej koncentraciji. Kolonije, ki so zrasle na ploščah z 0,5 in 1 mM koncentracijo linolne kisline, so po precepitvi ponovno zrasle. Kolonije, ki smo jih izolirali na ploščah z 2 mM linolno kislino po ponovnem precepljanju niso tvorile popolnoma konfluentne rasti, kolonije s plošč s 3 mM linolno kislino so tvorile zgolj posamezne kolonije, tiste s plošč s 5 mM linolno kislino pa sploh niso zrasle. Kolonije, ki so zrasle na trdnem selekcijskem gojišču z 1 mM in 2 mM linolno kislino, smo precepili tudi na enako gojišče brez glicerola. Te kolonije naj bi uporabljale linolno kislino kot edini vir ogljika. Dobili smo nekaj kolonij, ki smo jih ponovno precepili na enako gojišče.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

35

4.1.3 Rezultati tekočinske kromatografije visoke ločljivosti Z analizo standarda smo določili retencijski čas spojine SBR0501, ki je bil približno 3,46 minute. Na podlagi te ocene smo pri vzorcih določili temu najbližji vrh na kromatogramu in računalnik je iz površine izračunal koncetracije spojine SBR0501 v vzorcih. Na sliki 19 je na levi strani kromatogram standarda, na desni strani pa kromatogram enega izmed vzorcev.

SBR

0501

SBR

0501

Slika 19: HPLC kromatograma standarda (levo) in vzorca L44 (desno) min min

4.1.4 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na linolno kislino in vpliv na donos SBR0501

Pri dodatku različnih koncentracij linolne kisline v sporulacijska gojišča je bila preživelost sevov odvisna od dodane koncentracije linolne kisline. Pri dodatku 0,5 % in 1 % linolne kisline je bila preživelost 100 %, pri dodatku 2 % linolne kisline pa 53 %. Zaradi primerjave vpliva linolne kisline v sporulacijskem gojišču na donos spojine SBR0501 smo testirali izolate iz sporulacijskega gojišča z 1 in 2 % linolno kislino.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

36

0

50

100

150

200

250

K1 L31 L32 L33 L34 L41 L42 L43 L44 L52 L53 L54 L55 L63 L64izolat

SBR

0501

( μg/

ml)

gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kislinegojišče z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline

Slika 20: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na linolno kislino

Slika 20 prikazuje donose spojine SBR0501 posameznih sevov odpornih na linolno kislino. V preglednici 11 so našteti dodatki v selekcijska in sporulacijska gojišča, na katerih so zrasli te sevi in na sliki 21 so sevi združeni v skupine glede na predhodno izpostavljenost linolni kislini. Preglednica 11: Dodatki v selekcijska in sporulacijska gojišča, iz katerih smo izolirali seve

Oznaka seva Selekcijsko gojišče Sporulacijsko gojišče Linolna kislina Glicerol Linolna kislina

L31 1 mM 10 mM 2 % L32 1 mM 10 mM 2 % L33 1 mM 10 mM 1 % L34 1 mM 10 mM 1 % L41 1mM / 2 % L42 1mM / 1 % L43 1mM / 1 % L44 1mM / 1 % L52 2mM 10 mM 2 % L53 2mM 10 mM 1 % L54 2mM 10 mM 2 % L55 2mM 10 mM 1 % L62 2mM / 2 % L63 2mM / 2 % L64 2mM / 2 % K1 / / /

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

37

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

K1 L31-L34 L41-L44 L52-L55 L63-L64izolati

SBR

0501

( μg/

ml)

gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kislinegojišče z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline

Slika 21: Povprečne vrednosti donosa spojine SBR0501 izolatov odpornih na linolno kislino

Na sliki 21 vidimo, da je v produkcijskem gojišču s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na 1 mM linolno kislino v selekcijskem gojišču v povprečju boljši kot pri kontrolnih sevih in izolatih odpornih na 2 mM linolno kislino v selekcijskem gojišču. Ob dodatku 10 mM glicerola je bil donos večji za 11 %, brez glicerola pa za 15 %. Odpornost na 2 mM linolno kislino je zmanjšala donos spojine SBR0501 in sicer za 57 % ob dodatku 10 mM glicerola in za 5 % brez dodatka glicerola v selekcijsko gojišče (Priloga A). V produkcijskem gojišču z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline je donos spojine SBR0501 izolatov manjši kot pri kontrolnih sevih. Pri sevih odpornih na 1 mM linolno kislino v selekcijskem gojišču z dodatkom 10 mM glicerola je bil donos manjši za 47 %, brez glicerola pa za 41 %. Odpornost na 2 mM linolno kislino v selekcijskem gojišču je zmanjšala donos za 77 % ob dodatku 10 mM glicerola in za 60 % brez dodanega glicerola (Priloga B).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

38

4.1.5 Kultivacija na selekcijskem gojišču z 2-bromoheksadekanojsko kislino

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12koncentracija 2BrP (μM)

Prež

ivel

ost (

%)

Slika 22: Preživelost v odvisnosti od koncentracije 2-BrP

Slika 22 prikazuje vpliv koncentracije 2-bromoheksadekanojske kisline (2-BrP) na preživetje sevov. 2-BrP je analog maščobne kisline, ki smo ga testirali. V koncentracijskem območju med 50 μM in 500 μΜ je bila inhibicija rasti popolna. Ugotovili smo, da 2-BrP inhibira rast v 1000-krat manjših koncentracijah kot linolna kislina. Preživelost na ploščah s 5 μM koncentracijo 2-BrP je bila 66 % in je padala do 0,02 % pri dodatku 10 μM 2-BrP. Po precepljanju na enaka gojišča, iz katerih so bile kolonije izolirane, številne kolonije niso zrasle, podobno kot pri eksperimentu z linolno kislino. Pri ploščah s 5 μM koncentracijo 2-BrP smo po precepljanju opazili konfluentno rast, na ploščah z 10 μM koncentracijo 2-BrP pa le posamezne kolonije. Ocenili smo, da 5 do 8 μM koncentracija 2-BrP na pločah omogoča izolacijo uporabnih kolonij in smo zato le te tudi dalje testirali.

4.1.6 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na 2-bromoheksadekanojsko kislino in vpliv na donos SBR0501

Na sporulacijskem gojišču s 50 μM 2-BrP so zrasli vsi sevi. Sevov, ki so zrasli na sporulacijskem gojišču z 5 μM ali 25 μM 2-BrP, tako nismo testirali, saj naj bi bili sevi iz sporulacijskega gojišča s 50 mM 2-BrP bolj odporni na 2-BrP. Na sliki 23 so prikazani donosi spojine SBR0501 izolatov, ki so zrasli na trdnih selekcijskih gojiščih z različnimi koncentracijami 2-BrP.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

39

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

K31-K33 B21-B26 B31-B38 B42-B48 B51-B53izolati

SBR

0501

( μg/

ml)

gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kislinegojišče z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline

Slika 23: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na 2-BrP

Sevi s slike 23 so združeni v skupine in prikazani na sliki 24. Seva K31 in K33 sta kontroli in v gojišču nista imeli 2-BrP. Izolati od B21 do B26 so bili izolirani na selekcijskem gojišču s 5 μM 2-BrP, izolati od B31 do B38 na selekcijskem gojišču s 6 μM 2-BrP, izolati od B42 do B48 na selekcijskem gojišču s 7 μM 2-BrP ter izolata B51 in B53 na selekcijskem gojišču z 8 μM 2-BrP.

0

100

200

300

400

500

600

700

K31 K33 B21 B24 B25 B26 B31 B34 B36 B38 B42 B44 B46 B48 B51 B53izolat

SBR

0501

( μg/

ml)

gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kislinegojišče z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline

Slika 24: Povprečne vrednosti donosa spojine SBR0501 izolatov odpornih na 2-BrP

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

40

Že pri kontrolnih sevih smo opazili, da razmerje med sojinim oljem in linolno kislino vpliva na donos spojine SBR0501. Donos kontrolnih sevov je boljši v gojišču, v katerem je bilo 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline. V produkcijskem gojišču s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline (S:L=3:1) je imela večina selekcioniranih izolatov v povprečju boljši donos spojine SBR0501 od kontrolnih sevov. Pri izolatih, odpornimi na 5 μM koncentracijo 2-BrP, je bil povprečen donos večji za 29 %, pri izolatih, odpornimi na 6 μM koncentracijo 2-BrP, je bil večji za 9 %, pri izolatih, odpornimi na 7 μM koncentracije 2-BrP, je bil večji za 4 %. Največji donos je bil pri izolatih, odpornimi na 8 μM koncentracije 2-BrP, in sicer je bil od kontrolnih sevov večji za 32 % (Priloga C). Pri gojišču S:L=3:1 je povečana odpornost na 2-BrP pozitivno vplivala na donos spojine SBR0501. Nasprotno so v produkcijskem gojišču z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline (S:L=1:3) imeli izolati odporni na različne koncentracije 2-BrP na selekcijskem gojišču v povprečju enak ali manjši donos kot kontrolni sevi (Priloga D). Pri izolatih, odpornimi na 5 μM koncentracijo 2-BrP, je bil povprečen donos manjši za 4 %, pri izolatih, odpornimi na 6 μM koncentracijo 2-BrP, je bil manjši za 15 %, pri izolatih, odpornimi na 7 μM koncentracije 2-BrP, je bil večji za 5 % ter za 1 % manjši pri izolatih, odpornimi na 8 μM koncentracije 2-BrP (Priloga D).

4.1.7 Kultivacija na selekcijskem gojišču s polimiksinom B

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35

koncentracija polimiksina B (μg/ml)

Prež

ivel

ost (

%)

Slika 25: Preživelost v odvisnosti od koncentracije polimiksina B

Slika 25 prikazuje vpliv koncentracije polimiksina B na preživetje sevov. Polimiksin B je pri koncentraciji 5 μg/ml na ploščah inhibiral rast 54 % sevov. Pri koncentraciji 20 μg/ml polimiksina B je bila preživelost 0,4 odstotka, pri 30 μg/ml pa le 0,003 %. Za nadaljnje

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

41

teste smo uporabili le seve, ki so zrasli po 5-6 dneh pri koncentracijah 10, 20 in 30 μg/ml. Po šestem dnevu inkubacije se je namreč pojavilo mnogo majhnih kolonij, kar je verjetno posledica razgradnje polimiksina B. Za razliko od testov, pri katerih smo uporabili linolno kislino in 2-BrP, pa je bila rast vseh polimiksin B-odpornih kolonij po precepljanju na plošče z enako koncentracijo polimiksina B konfluentna, kar potrjuje, da so bile vse kolonije zares odporne na polimiksin.

4.1.8 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na polimiksin B in vpliv na donos SBR0501

Na sporulacijskih gojiščih z dodanim 10, 50 in 100 μg/ml polimksina B so zrasli vsi izolati. Za nadaljna testiranja smo uporabili le izolate, ki so zrasli s 100 μg/ml polimiksina B v sporulacijskem gojišču. Na sliki 25 so prikazani končni donosi spojine SBR0501 izolatov iz tega gojišča.

0

100

200

300

400

500

600

700

K21 K22 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P21 P22 P23 P24 P31 P32 P33 P34izolat

SBR

0501

( μg/

ml)

gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kislinegojišče z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline

Slika 26: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na polimiksin B

Sevi s slike 26 so združeni po skupinah in predstavljeni na sliki 27. Seva K21 in K22 sta kontroli in v selekcijskem gojišču nista imeli polimiksina B. Sevi od P11 do P16 so bili izolirani iz selekcijskega gojišča z 10 μg/ml polimiksina B, sevi od P21 do P24 iz selekcijskega gojišča z 20 μg/ml polimiksina B ter sevi od P31 do P34 iz selekcijskega gojišča s 30 μg/ml polimiksina B.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

42

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

K21-K22 P11-P16 P21-P24 P31-P34izolati

SBR

0501

( μg/

ml)

gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kislinegojišče z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline

Slika 27: Povprečne vrednosti donosa spojine SBR0501 izolatov odpornih na polimiksin B

V produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline, so imeli sevi, odporni na 10 μg/ml polimiksina B v selekcijskem gojišču, v povprečju za 5 % večji donos spojine SBR0501 od kontrolnih sevov. Pri sevih odpornih na 20 μg/ml in 30 μg/ml polimiksina B v selekcijskem gojišču, pa se je donos v povprečju zmanjšal za 25 oz. 23 % (Priloga E). V produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline, so imeli vsi selekcionirani sevi boljše donose spojine SBR0501 od kontrolnih sevov. Sevi, odporni na 10 μg/ml polimiksina B, so imeli v povprečju za 52 % večji donos, sevi, odporni na 20 μg/ml polimiksina B, v povprečju za 42 % večjega, sevi, odporni na 30 μg/ml polimiksina B, pa v povprečju za 23 % večji donos kot kontrolni sevi (Priloga F). Tako se donos spojine s povečano odpornostjo na polimiksin B zmanjšuje.

4.1.9 Kultivacija na selekcijskem gojišču z DOG Selekcijo odpornih sevov na 2-DOG smo izvedli na selekcijskem gojišču, ki je vsebovalo 100 mM 2-DOG in 10 mM etil linoleat. Na vsaki plošči je zraslo nekaj posameznih kolonij. Na ploščo smo nacepili 5×106 spor, povprečno pa nam je zraslo 5 kolonij. Povprečna preživelost je bila 0,0001 %. DOG-odporne kolonije smo za potrditev odpornosti precepili na enako gojišče. Če so ponovno zrasle, smo jih precepili na sporulacijsko gojišče ter jih testirali na donos spojine SBR0501. Kot kontrolo smo uporabili nekaj kolonij, ki so zrasle na gojišču brez DOG.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

43

4.1.10 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na 2-deoksiglukozo in vpliv na donos SBR0501

Na donos spojine SBR0501 smo testirali seve, ki naj bi imeli katabolično derepresijo. Za njihovo selekcijo smo uporabili seve, ki so zrasli na gojišču s 100 mM 2-DOG in 10 mM etil linoleata. Na podlagi predhodnih poskusov donosa spojine SBR0501 v produkcijskih gojiščih smo tu uporabili le produkcijsko gojišče s 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline, ki je omogočalo večje donose. Testirali smo 44 sevov s potencialno katabolično derepresijo in večina katabolično derepresiranih sevov je v povprečju imela boljši donos spojine SBR0501 kot kontrolni sevi. Donosi posameznih sevov so prikazani na sliki 28, iz priloge G pa lahko izračunamo, da je donos v povprečju boljši kar za 70 %.

0

100

200

300

400

500

600

700

K D1

D2

D3

D4

D5

D6

D7

D8

D9

D1 0

D1 1

D12

D1 3

D14

D1 5

D16

D1 7

D18

D1 9

D2 0

D2 1

D2 2

D23

D2 4

D25

D2 6

D27

D2 8

D29

D3 0

D3 1

D3 2

D3 3

D34

D3 5

D36

D3 7

D38

D3 9

D40

D4 1

D4 2

D4 3

D4 4

D45

izolat

SBR

0501

( μg/

ml)

Slika 28: Donos spojine SBR0501 izolatov odpornih na 2-deoksiglukozo

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

44

5 RAZPRAVA IN SKLEPI

5.1 RAZPRAVA Maščobne kisline v gojišču močno inducirajo biosintezo spojine SBR0501, vendar so tudi toksične v večjih koncentracijah (nad 3 mM), zato je bil cilj naloge izolirati mutante Streptomyces sp. K343-1, ki so odporne na povečane koncentracije linolne kisline, 2-BrP, polimiksina B ter preučitev vloge katabolične represije na donos želene spojine.

5.1.1 Vpliv zaščite sporulacijskega gojišča Selekcionirane seve smo nacepili na sporulacijska gojišča. Sporulacijsko gojišče je t.i. kompleksno gojišče, ki vsebuje sestavine naravnega izvora, kot so sojina moka, koruzni škrob in dekstrini. Zato navadno ne poznamo natančno sestavo kompleksnih gojišč. Toksičnost inhibitorjev običajno upade na kompleksnih gojiščih, zato smo zaradi ohranitve selekcijskega pritiska v sporulacijsko gojišče dodali večje koncentracije inhibitorjev. V poskusih z linolno kislino, ki jih je opravil Mitchell (Mitchell in sod., 2002) na celicah insektov Sf-21, je bila preživelost pod 3 % že pri 100 μM koncentracijah linolne kisline. V istih poskusih je bilo ugotovljeno še, da pri dodatku 500 μM BSA (goveji serumski albumin) in 100 μM koncentracije linolne kisline celice ohranijo enako preživelost, kot kontrolne celice. Pri naših poskusih smo ugotovili, da dodatek 1 % (v/v) linolne kisline v sporulacijskem gojišču ne vpliva na preživelost bakterije Streptomyces sp. K343-1, dodatek 2 % (v/v) linolne kisline pa zmanjša preživelost za 47 %.

5.1.2 Odpornost Streptomyces sp. K343-1 na linolno kislino, 2-bromoheksadekanojsko kislino, polimiksin B in 2-deoksiglukozo ter vpliv na donos SBR0501

Naš prvi cilj je bil ugotoviti, kolikšne koncentracije linolne kisline v selekcijskem gojišču lahko tolerira sev Streptomices sp. K343-1. Ugotovili smo, da je že pri 2 mM (0,056 % v/v) koncentraciji linolne kisline v selekcijskem gojišču preživelost 0,2 % (slika 18) . Banchio in Gramajo (1997) sta za Streptomyces coliecolor ugotovila, da so koncentracije različnih maščobnih kislin, na katerih bakterija raste, med 0,02 % in 0,1 %. Pri naših poskusih je bila koncentracija linolne kisline, pri kateri je še rasla bakterija Streptomyces sp. K343-1 znotraj teh meja. Pričakovali smo, da bodo sevi s povečano odpornostjo na linolno kislino imeli boljši donos spojine SBR0501. Pričakovanja so se potrdila le pri izolatih, ki smo jih izolirali na sporulacijskih gojiščih z 1 % (v/v) linolno kislino. Povečanje donosa smo opazili le v primeru, ko smo uporabili produkcijsko gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline (sliki 20 in 21).

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

45

Ti sevi so bili izmed vseh testiranih sevov izpostavljeni najmanjšim koncentracijam linolne kisline. Sevi s sporulacijskega gojišča z 2 % (v/v) linolno kislino so v produkcijskem gojišču s 3 % (v/v) sojinim oljem in 1 % (v/v) linolne kisline imeli v povprečju enake donose SBR0501 kot kontrolni sevi. Trend, ki ga tukaj opazimo in se nadaljuje tudi pri ostalih sevih (sliki 20 in 21), nam kaže, da izpostavljenost večjim koncentracijam linolne kisline negativno vpliva na donos spojine SBR0501. Predvidevamo lahko, da se poškodbe, ki jih povzročijo toksični produkti razgradnje linolne kisline, kopičijo in negativno vplivajo na donos ciljnega metabolita. Sekundarni metaboliti pa za preživetje celic niso nujni, zato verjetno celice porabljajo svojo energijo za odpravo poškodb, ne pa za tvorbo nepotrebnih spojin. 2-bromoheksadekanojska kislina je toksični analog palmitinske kisline, ki ireverzibilno inhibira ß-oksidacijo maščobnih kislin (Fong in sod., 1997). Inhibira acil-CoA-sintetazo (Grillo in sod., 2001). Sevi, ki bi bili odporni na povečane koncentracije 2-BrP, bi verjetno imeli več encimov β-oksidacije. Z odstranitvijo inhibitorja bi lahko ti sevi procesirali večje koncentracije linolne kisline. Tako bi dobili več prekurzorjev ciljnega metabolita in posledično več same spojine SBR0501. Na slikah 22 in 23 lahko vidimo, da je donos spojine SBR0501 pri izolatih, odpornimi na 2-BrP, večji pri dodatku večje količine linolne kisline v produkcijsko gojišče (S:L=1:3). To bi lahko pripisali dejstvu, da je v sojinem olju manj same linolne kisline (glej preglednico 4) in tako imajo celice manj substrata za tvorbo ciljnega metabolita. Selekcionirani sevi, odporni na 2-BrP, so imeli boljši donos spojine SBR0501 v primerjavi s kontrolnimi sevi le v primeru, ko smo uporabili produkcijsko gojišče s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline. Nasprotno, v produkcijskem gojišču z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline pa so imeli selekcionirani sevi v povprečju enak donos kot kontrolni sevi. Ena od razlag je, da nekateri sevi, odporni na 2-BrP, v resnici niso imeli večjih koncentracij encimov β-oksidacijskega ciklusa, temveč so imeli inhibiran transportni sistem za prenos 2-BrP v celico. S takšno inhibicijo bi lahko preživeli ob visokih koncentracijah 2-BrP, saj 2-BrP ne bi prišel v celico, kjer bi lahko inhibiral celične procese. Glede na donose kontrolnih sevov ostalih kultivacij pa je možna še ena razlaga. Na slikah 20, 21, 26 in 27 vidimo, da je donos kontrol v produkcijskem gojišču z 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline med seboj podoben, na slikah 23 in 24 pa je 2-krat večji. Zato je možno, da smo tu naredili eksperimentalno napako in da imajo sevi dejansko boljši donos spojine SBR0501. Od sestave celične stene je odvisno, kakšna koncentracija polimksina B je potrebna, da bo inhibirala celično rast. Po Gramu negativne bakterije so manj odporne in pri njih je MIC90, koncentracija, ki inhibira rast 90 % bakterij, med 2 in 16 μg/ml. Po Gramu pozitivne bakterije imajo debelejšo plast peptidoglikana v celični steni in velike molekule težje prodrejo do mesta delovanja, ki je v tem primeru celična membrana. Za te bakterije je MIC90 večja od 20 μg/ml, kar je odvisno od posameznega organizma. Streptomyces sp. K343-1 pripada k po Gramu pozitivnim bakterijam in smo zato pričakovali, da odpornost

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

46

na večje koncentracije polimiksina B lahko vpliva na prepustnost membrane in na donos naše ciljne spojine (Savage in sod., 2002). V literaturi najdemo opis poskusov, pri katerih so donos sekundarnega metabolita povečali s povečano odpornostjo na antibiotike. Med drugim sta Hu in Ochi (2001) z odpornostjo Streptomyces coelicolor na en antibiotik dvignila donos sekundarnega metabolita aktinorodina za 1,6–3-krat. Pri tem je bilo le med 13 in 18 % sevov takšnih, ki so imeli povečano odpornost na antibiotik. Pri sevih odpornih na tri različne antibiotike je bil donos celo za 48-krat večji od kontrolnega seva. Testirali smo izolate Streptomyces sp. K343-1, ki so bili odporni na 10, 20 in 30 μg/ml polimiksina B v selekcijskem gojišču. Na slikah 26 in 27 lahko vidimo, da se donos spojine SBR0501 v gojišču s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline pri sevih, odpornih na polimiksin B, ne spremeni v pozitivnem smislu, saj je manjši tudi za 25 %. V gojišču s 1 % (v/v) sojinega olja in 3 % (v/v) linolne kisline pa je bil donos pri sevih odpornih na 10 μg/ml polimiksina B, kar za 52 % večji, kot pri kontrolnih sevih. Z naraščanjem odpornosti na polimiksin B pa donos rahlo padal, vendar je še vedno večji kot pri kontrolnih sevih. Pri odpornosti na polimiksin B se lahko spremeni permeabilnost membrane, kar verjetno povzroči večji vnos linolne kisline v celico, predvsem v gojišču z več linolne kisline, kjer je večji koncentracijski gradient. Možno pa je tudi, da so izolati imeli okvarjen mehanizem za vnos polimiksina B v celico in je bila odpornost posledica tega pojava. Poznano je, da transport dolgoverižnih maščobnih kislin pri večjih koncentracijah poteka z difuzijo (Banchio in Gramajo, 1997). Bakterije rodu Streptomyces lahko uporabljajo širok spekter različnih hranil. V primarnem metabolizmu so različne metabolne poti podvržene katabolični represiji z virom ogljika, kar preprečuje učinkovito porabo sekundarnih virov ogljika v prisotnosti enostavnih virov ogljika (npr. glukoze, glicerola). Za regulacijo porabe enostavnih virov ogljika je ključen encim glukoza-kinaza, ki aktivira glukozo. Odporni mutanti bakterij Streptomyces na toksičen analog glukoze 2-deoksiglukozo (DOG) imajo lahko neaktiven encim glukoza-kinazo in zato ne morejo uporabljati glukozo kot vir ogljika, kakor tudi nimajo represije z glukozo v prisotnost drugih virov ogljika, npr. glicerola (Ingram in Westpheling, 1995). Donos spojine SBR0501 izolatov Streptomyces sp. K343-1 odpornimi na 2-deoksiglukozo je v primerjavi s kontrolnimi sevi boljši za 70 % (Slika 28). Sevi, ki nimajo katabolične represije v različnih metabolnih poteh – pri porabi enostavnih sladkorjev, glicerola..., prenesejo večje začetne koncentracije vira C (linolne, glicerola), kakor tudi prej začnejo porabljati sekundarni vir C, tako pride prej do tvorbe sekundarnih metabolitov (Saito in sod., 1998), kar verjetno vodi do večjega končnega donosa spojine SBR0501.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

47

5.2 SKLEPI V diplomskem delu smo skladno z delovno hipotezo pripravili seve Streptomyces sp. K343-1 odpornimi na linolno kislino, 2-bromoheksadekanojsko kislino, polimiksin B in 2-deoksiglukozo ter ovrednotili vpliv tovrstnih izolatov seva Streptomyces sp. K343-1 na donos spojine SBR0501. Na podlagi dobljenih rezultatov lahko podamo naslednje sklepe:

• Sestava produkcijskega gojišča oz. razmerje med sojinim oljem in linolno kislino vpliva na donos spojine SBR0501. Kot boljše se je pokazalo gojišče z večjo vsebnostjo linolne kisline (S:L=1:3).

• Odpornost izolatov na linolno kislino nima bistvenega vpliva oz. celo negativno

deluje na donos spojine SBR0501.

• Odpornost izolatov na analog linolne kisline, 2-bromoheksadekanojsko kislino lahko izboljša donos spojine SBR0501 za 29 %.

• Odpornost izolatov na polimiksin B izboljša donos spojine SBR0501 tudi za 52 %,

vendar donos ne narašča linearno z odpornostjo.

• Izolati, odporni na 2-DOG, imajo za 70 % večji donos spojine SBR0501.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

48

6 POVZETEK Sekundarni metaboliti so spojine, ki za organizme niso nujno potrebni v laboratorijskih pogojih. Njihova vloga še ni povsem natančno določena, zaradi njihovih lastnosti in potencialne uporabne v medicini, pa so predmet številnih raziskav. Med najbolj znane proizvajalce sekundarnih metabolitov se uvrščajo bakterije reda Actinomycetales. Znotraj tega reda pa so bakterije rodu Streptomyces najbolj pogosti proizvajalci sekundarnih metabolitov. Med drugim Streptomyces sp. K343-1 proizvaja sekundarni metabolit, inhibitor esteraz SBR0501, prekurzorji zanj pa so maščobne kisline, še posebej linolna kislina. Donos sekundarnih metabolitov pri naravnih sevih je navadno nizek. Na proizvodnjo sekundarnih metabolitov vpliva več različnih dejavnikov, kot so npr. pomanjkanje hranil, katabolična represija z ogljikom in dušikom in regulacija s fosforjem. Za ekonomsko upravičeno proizvodnjo sekundarnih metabolitov potrebujemo seve, ki omogočajo večje donose teh spojin. Obstajajo različni pristopi, kako lahko dvigujemo donose, kot so optimizacija gojišč, selekcija sevov in uporaba genskega inženiringa. V diplomskem delu smo izbrali pristop s selekcijo. Izolirali smo seve, ki so bili odporni na povečane koncentracije linolne kisline, saj naj bi večje količine linolne kisline zagotovile več prekurzorskih molekul za SBR0501. Prav tako naj bi celice odporne na povečane koncentracije polimiksina B imele spremenjene lastnosti celične membrane in bi omogočale večji vnos linolne kisline v celice. Izolati odporni na 2-bromoheksadekanojsko kislino naj bi imeli povečane koncentracije encima acil-CoA-sintetaze. Tako bi lahko hitreje metabolizirali maščobne kisline, ki so prekurzorji ciljnega metabolita. Izolati, odporni na 2-deoksiglukozo, pa naj bi imeli katabolično derepresijo in bi lahko hitreje začeli uporabljati sekundarni vir ogljika – linolno kislino. Uporabljali smo dve vrsti produkcijskega gojišča in sicer z 1 % (v/v) linolne kisline in 3 % (v/v) sojinega olja ter drugo s 3 % (v/v) linolne kisline in 1 % (v/v) sojinega olja. Naši izsledki kažejo, da dodatek večjih koncentracij linolne kisline v produkcijsko gojišče pozitivno vpliva na donos spojine SBR0501, razen pri izolatih, odpornimi na linolno kislino. Pri teh izolatih smo opazili, da večje koncentracije linolne kisline v produkcijskem gojišču negativno vplivajo na končni donos spojine SBR0501. Največje donose, za 15 % večje od kontrol, smo dobili pri izolatih v produkcijskem gojišču s 3 % (v/v) sojinega olja in 1 % (v/v) linolne kisline, izolirani pa so bili iz sporulacijskega gojišča s 1 % (v/v) linolno kislino. Tekom testiranja so bili torej izpostavljeni najmanjšim koncentracijam linolne kisline. Odpornost na 2-bromoheksadekanojsko kislino je povečala donos v primeru odpornosti na 5 in 8 μM 2-BrP in sicer za 30 % v produkcijskem gojišču s 3 % (v/v) sojinim oljem in 1 % (v/v) linolno kislino. V ostalih primerih je bil donos enak ali manjši od kontrol. Odpornost na polimiksin B pozitivno vpliva na donos spojine SBR0501, vendar donos ne narašča linearno z odpornostjo. Odpornost na 10 μg/ml polimiksina B zveča donos za 52 %, na 20 μg/ml za 42 % in na 30 μg/ml za 23 % v primerjavi s kontrolami. Odpornost na 2-deoksiglukozo se je izkazala kot pozitiven vpliv na donos spojine SBR0501, saj se je donos SBR0501 zvečal za 70 % v primerjavi s kontrolnimi sevi. Izolati naj bi imeli katabolično derepresijo, ali pa niso imeli transportnega sistema za DOG (Hodgson, 1982). Če je prišlo do katabolične derepresije je prav hitrejši vnos linolne kisline v celice verjetno vzrok boljšega donosa. Na podlagi rezultatov lahko potrdimo delovno hipotezo, da smo uspeli izolirati seve Streptomyces sp. K343-1, ki so imeli povečan donos spojine SBR0501.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

49

7 VIRI Atlas R. M. 1993. Microbiological media. Boca Raton, CRC Press: 1079 str. Baltz R. H. 1986a. Mutagenesis in Streptomyces spp. V: Manual of industrial microbiology and biotechnology. Demain A. L., Solomon N. A. (eds.). Washington, American Society for Microbiology: 184-190 Baltz R. H. 1986b. Strain improvement: introduction. V: Manual of industrial microbiology and biotechnology. Demain A. L., Solomon N. A. (ed.). Washington, American Society for Microbiology: 154-154 Baltz R. H., Hosted T. J. 1996. Molecular genetic methods for improving secondary-metabolite production in Actinomycetes. Trends in Biotechnology, 14: 245-250 Banchio C., Gramajo H. C. 1997. Medium- and long-chain fatty acid uptake and utilization by Streptomyces coelicolor A3(2): first characterization of a Gram-positive bacterial system. Microbiology, 143: 2439–2447 Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. Journal of Antibiotics, 58, 1: 1-26 Bergey, Holt J.G. (eds.). 1994. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th ed. Baltimore, Wiliams & Wilkins: 787 str. Birmingham W. 2006. Scientific serendipity: Penicilin.Winston-Salem, Wake Forest University http://users.wfu.edu/birmwr4/serendipity/serendipity.html (1.3.2006): 1 str. Boyer R. 2005. Temelji biokemije. Ljubljana, Študentska založba: 634 str. Calvo A. M., Wilson R. A., Bok J. W., Keller N. P. 2002. Relationship between secondary metabolism and fungal development. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66, 3: 447–459 Carson D. D., Daneo-Moore L. 1980. Effects of fatty acids on lysis of Streptococcus faecalis. Journal of Bacteriology, 141, 3: 1122-1126 Challis G. L., Hopwood D. A. 2003. Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 100, suppl 2: 14555-14561 Clausell A., Pujol M., Alsina M. A. Cajal Y. 2003. Influence of polymyxins on the structural dynamics of Escherichia coli lipid membranes. Talanta, 60: 225-234 Crueger W., Crueger A. 1990. Biotechnology: A textbook of industrial microbiology. Brock T. D. (ed.). Sunderland, Sinauer Associates: 357 str.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

50

Davydov V. V., Dobaeva N. M., Bozhkov A. I. 2004. Possible role of alteration of aldehyde’s scavenger enzymes during aging. Experimental Gerontology, 39: 11–16 Dőhren H., Gräfe U. 1997. General aspects of secondary metabolism. V: Biotechnology: a multi-volume comprehensive treatise. 2nd ed. Volume 7. Products of secondary metabolism. Rehm H.-J., Reed G. (eds.). Weinheim, VCH: 1-55 Firn R. D., Jones C. G., 2000. The evolution of secondary metabolism - a unifying model. Molecular Microbiology, 37, 5: 989-994 Fong J. C., Leu S.-J., Chai S.-P. 1997. Differential inhibition of lipolysis by 2-bromopalmitic acid and 4-bromocrotonic acid in 3T3-L1 adipocytes. Biochimica et Biophysica Acta, 1344: 65–73 Grillo M. P., Chiellini G., Tonelli M., Benet L. Z. 2001. Effect of α-fluorination of valproic acid on valproyl-S-acyl-CoA formation in vivo in rats. Drug Metabolism and Disposition, 29: 1210–1215 Gutsmann T., Hagge S. O., David A., Roes S., Böhling A., Hammer M. U., Seydel U. 2005. Lipid-mediated resistance of Gram-negative bacteria against various pore-forming antimicrobial peptides. Journal of Endotoxin Research, 11, 3: 167-173 Herai S., Hashimoto Y., Higashibata H, Maseda H., Ikeda H., Omura S., Kobayashi M. 2004. Hyper-inducible expression system for Streptomycetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 101, 39: 14031 - 14035 Hodgson D. A. 1982. Glucose repression of carbon source uptake and metabolism in Streptomyces coelicolor A3(2) and its pertubation in mutants resistant to 2-Deoxyglucose. Journal of General Microbiology, 128: 241-2430 Hodgson D.A. 2000. Primary metabolism and its control in streptomycetes: a most unusual group of bacteria. Advances in Microbial Physiology, 42: 47-238 Hu H., Ochi K. 2001. Novel approach for improving the productivity of antibiotic-producing strains by inducing combined resistant mutations. Applied and Environmental Microbiology, 67, 4: 1885-1892 Hűtter R. 1986. Overproduction of microbal metabolites. V: Biotechnology: a comprehensive treatise in 8 volumes. Vol. 4: Microbial products II. Pape H., Rehm H.-J. (eds.). Weinheim, VCH: 3-17 Ingram C., Westpheling J. 1995. The glucose kinase gene of Streptomyces coelicolor is not required for glucose repression of the chi63 promoter. Journal of Bacteriology, 177, 12: 3587-3588

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

51

Kamionka A., Parche S., Nothaft H., Siepelmeyer J., Jahreis K., Titgemeyer F. 2002. The phosphotransferase system of Streptomyces coelicolor IIACrr exhibits properties that resemble transport and inducer exclusion function of enzyme IIAGlucose of Escherichia coli. European Journal of Biochemistry, 269: 2143–2150 Kieser T., Bibb J., Buttner M. J., Chaiter K. F., Hopwood D. A. 2000. Practical Streptomyces genetics. Norwich, The John Innes Foundation: 613 str. Kirn M. 2005. Vpliv fizioloških in morfoloških dejavnikov na biosintezo inhibitorja SBR0501 esteraze pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije: 75 str. Kwakman J. H. J. M., Postma P. W. 1994. Glucose kinase has a regulatory role in carbon catabolite repression in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology, 176, 9: 2694-2698 Lewin B. 2004. Genes VIII. 8th ed. Upper Saddle River, Pearson Prentice Hall: 1002 str. Madigan M. T., Martinko J. M., Parker J. 2003. Brock biology of microorganisms. 10th ed. New Jersey, Prentice-Hall: 1019 str. Martın J. F., Casqueiro J., Liras P. 2005. Secretion systems for secondary metabolites: how producer cells send out messages of intercellular communication. Current Opinion in Microbiology, 8: 282–293 Matsushima P., Baltz R. H. 1986. Protoplast fusion. V: Manual of industrial microbiology and biotechnology. Demain A. L., Solomon N. A. (eds.). Washington, American Society for Microbiology: 170-183 Mebs M. 2001. Toxicity in animals. Trends in evolution? Toxicon, 39: 87-96 Mitchell L. A., Moran J. H., Grant D. F. 2002. Linoleic acid, cis-epoxyoctadecenoic acids, and dihydroxyoctadecadienoic acids are toxic to Sf-21 cells in the absence of albumin. Toxicology Letters, 126: 187–196 Nielsen J. 1998. The role of metabolic engineering in the production of secondary metabolites. Current Opinion in Microbiology, 1: 330-336 Niki E., Yoshida Y., Saito Y., Noguchi N. 2005. Lipid peroxidation: Mechanisms, inhibition, and biological effects. Biochemical and Biophysical Research Communication, 338, 1: 668-676 O'Brien R. D. 1998. Fats and oils – formulating and processing for applications. Lancaster, Basel, Technicom Publishing Company: 649 str. Oksman-Caldentey K., Inze D. 2004. Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends in Plant Science, 9, 9: 433-440

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

52

Parekh S., Vinci V. A., Strobel R.J. 2000. Improvement of microbial strains and fermentation processes. Applied Microbiology and Biotechnology, 54: 287-301 Prosser J. I. Tough A. J. 1991. Growth mechanisms and growth kinetics of filamentous microorganisms. Critical Reviews in Biotechology, 10, 4: 253-74 Queener S. W., Lively D. H. 1986. Screening and selection for strain improvement. V: Manual of industrial microbiology and biotechnology. Demain A. L., Solomon N. A. (eds.). Washington, American Society for Microbiology: 155-169 Rahaman S. O., Mukherjee J., Chakrabarti A., Pal S. 1998. Decreased membrane permeability in a polymixin B-resistant Escherichia coli mutant exhibiting multiple resistance to β-lactams as well as aminoglycosides. FEMS Microbiology Letters, 161: 249-254 Saito A., Fujii T., Yoneyama T. Miyashita K. 1998. glkA is involved in glucose repression of chitinase production in Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology, 180, 11: 2911-4 Savage P. B., Li C., Taotafa U., Ding B., Guan Q. 2002. Antibacterial properties of cationic steroid antibiotics. FEMS Microbiology Letters, 217: 1-7 Spiteller G. 2001. Peroxidation of linoleic acid and its relation to aging and age dependent diseases. Mechanisms of Ageing and Development, 122: 617–657 Spiteller P., Kern W., Reiner J., Spiteller G. 2001. Aldehydic lipid peroxidation products derived from linoleic acid. Biochimica et Biophysica Acta, 1531: 188-208 Stimers J. R., Dobretsov M., Hastings S. L., Jude A. J., Grant D. F. 1999. Efects of linoleic acid metabolites on electrical activity in adult rat ventricular myocytes. Biochimica et Biophysica Acta, 1438: 359-368 Streptomyces. 2006. Gambier, Kenyon College http://biology.kenyon.edu/Microbial_Biorealm/bacteria/gram-positive/streptomyces/streptomyces.html#genome (14.2.2006): 1 str. Tamehiro N., Hosaka T., Xu J., Hu H., Otake N., Ochi K. 2003. Innovative approach for improvement of an antibiotic-overproducing industrial strain of Streptomyces albus. Applied and Environmental Microbiology, 69, 11: 6412–6417 Urukalo M. 2005. Razvoj metode in ovrednotenje inhibitorne aktivnosti esteraz izbranih streptomicet. Diplomska naloga. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije: 48 str. van Wezel G. 2002. Cell division and development of streptomycetes. Leiden, Leiden University http://wwwchem.leidenuniv.nl/genexpress/ie/vanwezel/vanwezel.htm (1.3.2006): 1 str.

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

53

Vining L. C. 1986. Secondary metabolism. V: Biotechnology: a comprehensive treatise in 8 volumes. Vol. 4: Microbial products II. Pape H., Rehm H.-J. (eds.). Weinheim, VCH: 19-38 Wallace R. J. 2004. Antimicrobial properties of plant secondary metabolites. Proceedings of the Nutrition Society, 63: 621–629 Webb Y., Hermida-Matsumoto L., Resh M. D. 2000. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry, 275, 1: 261–270 Wink M. 2003. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective. Phytochemistry, 64: 3–19 Yazaki K. 2005. Transporters of secondary metabolites. Current Opinion in Plant Biology, 8: 301–307 Zähner H. 1979. What are secondary metabolites? Folia Microbiology, 24: 435-443 citirano po: Hütter R. 1986. Overproduction of microbal metabolites. V: Biotechnology: a comprehensive treatise in 8 volumes. Vol. 4: Microbial products II. Pape H., Rehm H.-J. (eds.). Weinheim, VCH: 3-17

Špes A. Vpliv maščobnih kislin na biosintezo inhibitorja esteraze SBR0501 pri sevu Streptomyces sp. K343-1. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo, 2006

54

ZAHVALA Najprej bi se rad zahvalil somentorju doc. dr. Hrvoju Petkoviću in asistentu dr. Štefanu Fujsu za strokovno pomoč in vodenje pri diplomskem delu, ter za vso spodbudo med praktičnim delom. Hvala tovarni zdravil Krka, d.d. za opravljene analize. Urški Lešnik in Mateju Šerganu se zahvaljujem za tehnično pomoč in nasvete pri praktičnem delu v laboratoriju. Zahvaljujem se mentorju, prof. dr. Petru Rasporju, za strokovno pomoč in vse nasvete, ki jih nisem bil deležen le med delom diplome, ampak tudi na vseh njegovih predavanjih. Prof. dr. Veroniki Abram gre zahvala za strokovno opravljeno recenzijo diplomskega dela. Na koncu pa bi se rad zahvalil predvsem staršem, sestri Maruši, starim staršem in Alenki. Spremljali, vzpodbujali in podpirali ste me od začetka študija in mi vlivali vso potrebno energijo, da sem lahko prebrodil vse težave, na katere sem naletel v času študija.

PRILOGE Priloga A: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 % sojinega olja in 1 % linolne kisline (S:L=3:1)

SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču

Oznaka seva

Rast na NMMB z:

Rast na SP z:

Paralelke

A B C povprečje SD

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

L31 1 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne 142 179 196 172 28 7

L32 1 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne 162 159 170 164 6 2

L33 1 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 169 200 209 193 21 20

L34 1 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 185 168 201 185 17 15

L41

1 mM linolna 2% linolne 156 172 173 167 10 4

L42

1 mM linolna 1% linolne 208 165 194 189 22 18

L43

1 mM linolna 1% linolne 202 210 170 194 21 21

L44

1 mM linolna 1% linolne 215 181 196 197 17 23

L52 2 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne 174 223 175 191 28 19

L53 2 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 56 65 58 60 5 -63

L54 2 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne pmz 23 pmz 23 -86

L55 2 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne pmz pmz 4 4 -98

L62

2 mM linolna 2% linolne 141 151 158 150 9 -7

L63

2 mM linolna 2% linolne 145 155 154 151 6 -6

L64

2 mM linolna 2% linolne 167 136 160 154 16 -4

K1 kontrola kontrola 162 154 166 161 6

Priloga B: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 % sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)

SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču Oznaka seva

Rast na NMMB z:

Rast na SP z:

paralelke

A B C povprečje SD

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

L31 1 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne 96 122 70 96 26 -53

L32 1 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne 104 85 78 89 13 -57

L33 1 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 81 97 76 85 11 -59

L34 1 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 183 134 176 164 27 -20

L41

1 mM linolna 2% linolne 118 98 139 118 21 -42

L42

1 mM linolna 1% linolne 106 109 89 101 11 -51

L43

1 mM linolna 1% linolne 120 137 134 130 9 -37

L44

1 mM linolna 1% linolne 155 149 113 139 23 -32

L52 2 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne 157 175 166 166 9 -19

L53 2 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 6 14 pmz 10 6 -95

L54 2 mM linolna + 10 mM glicerol

2% linolne pmz pmz 8 8 -96

L55 2 mM linolna + 10 mM glicerol

1% linolne 4 2 pmz 3 1 -99

L63

2 mM linolna 2% linolne 86 65 81 77 11 -62

L64

2 mM linolna 2% linolne 86 95 79 87 8 -58

K1

Kontrola kontrola 173 219 225 206 28

Priloga C: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 % sojinega olja in 1 % linolne kisline (S:L=3:1)

SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču Oznaka

seva Rast na

NMMB z: Rast na SP z:

paralelke

A B C povprečje SD

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

B21 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 492 491 459 481 19 65 B24 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 262 352 256 290 54 -1 B25 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 354 442 399 398 44 36 B26 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 346 313 353 337 21 15 B31 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 219 337 321 292 64 0 B34 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 236 268 235 246 19 -16 B36 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 293 109 377 260 137 -11 B38 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 464 430 528 474 50 62 B42 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 347 462 432 414 60 42 B44 7 μM 2BrP 25 μM 2-BrP 228 300 146 225 77 -23 B46 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 376 290 267 311 57 6 B48 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 252 268 281 267 14 -9 B51 8 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 432 421 390 414 22 42 B53 8 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 345 282 269 299 41 2 B54 8 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 486 481 376 448 62 53 K31 kontrola kontrola 295 275 283 284 11 -3 K33 kontrola kontrola 353 287 259 300 48 3

povprečje kontrol 292

Priloga D: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 % sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)

SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču Oznaka

seva Rast na

NMMB z: Rast na SP z:

paralelke

A B C povprečje SD

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

B21 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 377 274 336 329 52 -32 B24 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 440 572 532 515 68 6 B25 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 522 576 440 513 68 6 B26 5 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 518 510 466 498 28 3 B31 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 439 208 569 405 183 -16 B34 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 326 343 293 321 26 -34 B36 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 537 607 436 526 86 9 B38 6 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 443 359 363 388 47 -20 B42 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 635 468 542 549 84 13 B44 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 426 479 440 449 27 -7 B46 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 523 545 489 519 28 7 B48 7 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 557 522 446 508 57 5 B51 8 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 573 508 503 528 39 9 B53 8 μM 2-BrP 25 μM 2-BrP 417 406 471 432 35 -11 K31 kontrola kontrola 495 463 451 470 23 -3 K33 kontrola kontrola 387 558 548 498 96 3

povprečje kontrol 484

Priloga E: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 3 % sojinega olja in 1 % linolne kisline (S:L=3:1) SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču Oznaka

seva Rast na

NMMB z: Rast na SP z:

paralelke

A B C povprečje SD

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

P11 10 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

258 207 228 231 26 13

P12 10 μ�g/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

202 234 187 208 24 1

P13 10 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

158 271 143 191 70 -7

P14 10 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

154 174 163 164 10 -20

P15 10 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

307 269 231 269 38 31

P16 10 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

214 199 276 230 41 12

P21 20 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

218 228 110 185 66 -10

P22 20 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

211 166 121 166 45 -19

P23 20 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

116 190 227 178 56 -13

P24 20 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

31 69 166 89 70 -57

P31 30 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

238 111 192 181 64 -12

P32 30 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

92 109 103 101 9 -50

P33 30 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

208 120 44 124 82 -40

P34 30 μg/ml polimiksina B

100 μg/ml polimiksina B

149 213 339 234 97 14

K21 kontrola kontrola 224 81 191 165 75

-19

K22 kontrola kontrola

269 301 164 245 72 19

povprečje kontrol 205

Priloga F: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 % sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)

SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču Oznaka

seva Rast na

NMMB z: Rast na SP z:

paralelke

A B C povprečje SD

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

P11 10 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 589 415 274 426 158 61

P12 10 μ�g/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 486 502 530 506 22 91

P13 10 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 342 360 450 384 58 45

P14 10 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 0 0 10 3 6 -99

P15 10 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 242 496 222 320 153 21

P16 10 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 380 335 478 398 73 50

P21 20 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 362 383 418 388 29 47

P22 20 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 377 453 428 419 39 59

P23 20 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 429 459 512 466 42 76

P24 20 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 134 275 340 250 105 -6

P31 30 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 210 412 347 323 103 22

P32 30 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 318 283 358 320 38 21

P33 30 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 478 279 275 344 117 30

P34 30 μg/ml

polimiksina B 100 μg/ml

polimiksina B 353 381 261 332 63 25 kontrola kontrola

K21 453 185 208 282 149 7

K22 kontrola kontrola

99 / 394 247 205 -7 povprečje kontrol 264

Priloga G: Končni donos spojine SBR0501 v produkcijskem gojišču, ki je vsebovalo 1 % sojinega olja in 3 % linolne kisline (S:L=1:3)

SBR0501(μg/ml) v produkcijskem gojišču

Oznaka seva

Rast na NMMB z: paralelke

sprememba donosa (%)

glede na kontrolo

povprečje SD K Kontrola 173 219 225 206 28

D1 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 396 416 406 14 97 D2 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 247 319 283 51 37 D3 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 418 403 411 11 99 D4 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 368 374 371 4 80 D5 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 299 292 296 5 43 D6 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 487 491 489 3 137 D7 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 431 464 448 23 117 D8 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 340 258 299 58 45 D9 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 396 344 370 37 80

D10 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 463 482 473 13 129 D11 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 346 220 283 89 37 D12 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 408 368 388 28 88 D13 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 18 0 9 13 -96 D14 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 295 227 261 48 27 D15 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 449 253 351 139 70 D16 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 200 283 242 59 17 D17 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 400 409 405 6 96 D18 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 504 376 440 91 114 D19 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 395 306 351 63 70 D20 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 455 444 450 8 118 D21 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 461 365 413 68 100 D22 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 405 347 376 41 83 D23 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 392 466 429 52 108 D24 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 22 13 18 6 -92 D25 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 390 287 339 73 64 D26 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 338 427 383 63 86 D27 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 447 389 418 41 103 D28 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 445 491 468 33 127 D29 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 337 399 368 44 79 D30 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 479 438 459 29 123 D31 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 466 386 426 57 107 D32 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 417 406 16 97 D33 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 395 363 301 88 46 D34 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 288 137 213 107 3 D35 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 11 8 10 2 -95 D36 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 426 307 367 84 78 D37 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 363 388 376 18 82 D38 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 444 466 455 16 121 D39 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 248 434 341 132 66

Priloga G : nadaljevanje D40 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 467 388 428 56 108 D41 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 480 469 475 8 130 D42 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 158 146 152 8 -26 D43 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 377 405 391 20 90 D44 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 384 380 382 3 85 D45 100 mM DOG + 10 mM etil linoleat 302 440 371 98 80

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Aleš ŠPES

VPLIV MAŠČOBNIH KISLIN NA BIOSINTEZO INHIBITORJA ESTERAZE SBR0501 PRI SEVU

Streptomyces sp. K343-1

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij

LJUBLJANA, 2006