Vliv prostředí na růst a množení

mikrobiálních populací

Doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.

Vlivy na růst mikroorganismů • Teplota

• pH prostředí

• Vodní aktivita

• Oxidoredukční potenciál

• Povrchové napětí

• Záření

• Hydrostatický tlak

• Elektrický proud

• Ultrazvuk

• Záření

• Mechanické vlivy

• Působení antimikrobiálních látek

• Biologické vlivy

Faktory ovlivňující růst

mikroorganismů v potravinách

Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodní

aktivita,antimikrobiální aktivity

Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra

Implicitní: specifická růstová rychlost,

synergismus, antagonismus,

komensalismus

Technologické: krájení, mytí, balení,

záření, pasteurizace

Vnitřní faktory

• Nutrienty – výživné látky

• pH a pufrační kapacita

• Redox potenciál

• Vodní aktivita

• Antimikrobiální látky

• Antimikrobiální struktury

Živiny • Zdroj energie

• Materiál k tvorbě a obnově buněčných struktur

• C,O,N,S,P - cukry, polysacharidy

• Fe, Mg, K, Ca, Na

• Stopové prvky – Zn, Cu, Co

• Speciální požadavky autotrofní, auxotrofní atd.

Obsah živin

• Koncentrace klíčových živin může do určité míry ovlivnit

rychlost růstu mikroorganismů.

• Vztah mezi rychlostí růstu a koncentrací živiny je znám

jako Monodova rovnice, je matematicky identický

rovnicí Michaelis-Menten (enzymová kinetika).

• •Odráží závislost mikrobiálního růstu na rychlost limitující

enzymové reakci.

Specifická růstová rychlost

Specifická růstová rychlost µ je pro každý mikroorganizmus, typ

výživného média a způsob kultivace odlišná.

Její hodnota je dána vnitřními faktory, tj. vlastními růstovými

schopnostmi mikroorganismu, vnitřními limity jeho růstu, které jsou

určené genetickým

vybavením buňky.

Vliv výživy na růst mikroorganismů

• Monodova rovnice

• μ = μmS / S + Ks

• μ specifická růstová rychlost

• μm maximální specifická růstová rychlost

• S koncentrace limitující živiny

• Ks saturační konstanta

pH prostředí

• Pro bakterie a kvasinky je rozmezí

poměrně úzké, u většiny plísní podstatně

širší

• Bakterie ?

• Kvasinky?

• Plísně?

pH prostředí

min opt max

• B.subtilis 4,3 6,0-7,5 8,5

• S. cerevisiae 3,0- 3,8 4,2-5,0 7,3-7,5

• A.niger 1,2 3,0-8,0 11,0

pH

Bakterie – slabě kyselé až slabě alkalické pH

Kvasinky – preferují kyselé prostředí

Plísně – tolerují velmi široké rozmezí

pH prostředí

• Bakterie v trávicím traktu

• Kyselinotvorné bakterie

• Hnilobné velmi citlivé ůči nízkému pH

• Vnější pH ovlivňuje regulační procesy metabolismu v buňce

• Alkalické prostředí – tvorba glycerolu u kvasinek

• Neutralizací kyselin se zvyšuje tvorba kys. mléčné

• V koncentrovaných cukerných roztocích se tvoří kys. máselná na úkor acetonu a butanolu

• Odolnost vůči zvýšeným teplotám – spory pH 4,3

Oxidoredukční potenciál

• Oxidoredukční potenciál je dán přítomností oxidačních nebo redukčních činidel

• Oxid.čin.: kyslík, dusičnany, železité ionty, peroxidy, železnaté ionty, vodík, sloučeniny se sulfhydrylovou skupinou nebo s reaktivními dvojnými vazbami

• Redukční činidla : cystein, askorbová kyselina, CO2, vodík, thioglykolát sodný)

Oxidoredukční potenciál

• Oxidační redukční potenciál E H je rozdíl

potenciálu mezi platinovou elektrodu

umístěnou do daného prostředí a normální

vodíkovou elektrodou

• Silně oxidační látky – pozitivní

• Silně redukční – negativní

• Aerobní mikroorganismy – pozitivní

• Anaerobní mikroorgansimy - negativní

Redox potenciál - Eh

Vodní aktivita

• Potřeba vody je vyjádřena vodní aktivitou

prostředí, ve kterém se buňky mohou

rozmnožovat

• Vodní aktivita roztoku aH20 čili a w se

rovná poměru tlaku vodních par nad tímto

roztokem k tlaku vodních par nad

destilovanou vodou

Vodní aktivita

• Vztah vodní aktivity ke koncentraci rozpuštěné látky

N w

a w = ---------

N w + N s

• N w - počet molů vody

• N s – počet molů rozpuštěné látky

Aktivita vody - aw

Snížení aktivity vody:

• odstranění využitelné vody sušením, uzením, odpařením, mražením

• zvýšení obsahu tuku

• zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) zvýšení osmotického tlaku (hypertonické prostředí) difuze vody z buňky do prostředí zastavení metabolizmu až smrt buňky

Vodní aktivita Vodní aktivita vody je 1

Bakterie 0,99 – 0,93

(0,65 – 0,63) halofilní 15%,halotolerantní 10%

NaCl (Micrococcus, Staphylococcus)

Kvasinky 0,91- 0,88

Osmotolerantní 0,73 (60% sacharosa)

Zygosaccharomyces rouxii , Z. bailii)

Plísně nižší než b. a kv., vyjímka vodní plísně

Osmofilní plísně 0,60 A. glaucus

Vodní aktivita

• Sušení

• Zvýšení koncentrace rozpuštěných látek

odpařováním

Sacharosa 50-70%

Chlorid sodný 10-15%

Vnitrobuněčný tlak 0,35 do 0,6 MPa

Osmofilní 30 MPA

Aktivita vody - aw

Působení antimikrobiálních látek

• Zastavení rozmnožování mikrobistatické

• Usmrcení mikrobicidní

• Bakteriostatické, bakteriocidní

• Fungistatické, fungicidní

• Nižší koncentrace - stimulační účinek

Působení antimikrobiálních látek Rozdělení :

1. Látky poškozující strukturu buňky nebo její funkci

penicilin, polyenová antibiotika (Streptomyces) – buněčná stěna

rozpuštědla tuků, anionaktivní tenzidy, polyenová antibiotika (Bacillus), fenoly, inhibitory transportu – cytoplasmatická membrána

formadehyd, silná oxidační činidla, silná redukční činidla –bílkoviny

chloramfenikol, erythromycin – ribozomy bakterií

cyklohexiimid – ribozomy kvasinek

2. Látky působící na mikrobiální enzymy

těžké kovy (Hg)

3. Látky reagující s DNA

alkylační činidla, deaminační činidla,cytostatika, mitomycin C

Přirozené antimikrobiální látky

• laktoperoxidasa (mléko), lysozym (vaječný

bílek), saponiny a flavonoidy (byliny a

koření), bakteriociny (LAB), a chitosan -

• krunýře korýšů

• Antimikrobiální látky přítomné v

potravinách a koření byly přidávány ke

• zlepšení chuti.

Rostlinné antimikrobiální látky

• Antimikrobiální látky v rostlinách jsou

běžně esenciální oleje, v listech

(rozmarýn, šalvěj, bazalka, oregáno,

tymián, majoránka, petržel) nebo v

květech

• a pupenech (hřebíček), cibulkách (česnek

a cibule), semenech (kmín, fenykl, mušká-

tový ořišek).

Vnější faktory- environmentální

• relativní vlhkost

• teplota

• atmosféra

Relativní (poměrná) vlhkost vzduchu

• Relativní vlhkost vzduchu udává poměr mezi okamžitým

množstvím vodních par ve vzduchu a množstvím par, které by měl

vzduch o stejném tlaku a teplotě při plném nasycení. Udává se v

procentech (%). Relativní vlhkost se též někdy označuje jako

poměrná vlhkost.

• Je-li m hmotnost vodní páry, která je ve vzduchu obsažena, a M

hmotnost vodní páry, kterou by obsahoval stejný objem vzduchu,

kdyby byl při stejné teplotě a tlaku vodními parami nasycen, pak lze

relativní vlhkost vzduchu vyjádřit jako

• ϕ = 100 m / M [%] . Tento vztah lze s pomocí výrazu pro

absolutní vlhkost vzduchu přepsat ve tvaru

• ϕ = 100 Φ / Φn [%],kde Φn označuje absolutní vlhkost

vzduchu nasyceného vodními parami.

relativní vlhkost

• Relativní vlhkost vzduchu udává poměr mezi

okamžitým množstvím vodních par ve vzduchu a

množstvím par, které by měl vzduch o stejném

tlaku a teplotě při plném nasycení.

• Udává se v procentech (%). Relativní vlhkost se

též někdy označuje jako poměrná vlhkost.

• Hlavním omezujícím faktorem je teplota

vzduchu, neboť pro danou teplotu je vzduch

schopen pojmout jen omezené množství

vodních par.

Teplota

• Psychrofilní – opt. tep. nižší než 20 oC a rostou při teplotách 0 – 5 oC

- psychrotrofní se rozmnožují dosti rychle při teplotách 0-10 oC bez ohledu na optimální teplotu Pseudomonas, Micrococcus, Flavobacterium

• Mesofilní – minimální teplota vyšší než 5 oC a optimální nižší než 45 oC

bakterie 37 oC, kvasinky 30 oC

Teplota

Tři základní body teploty:

• Minimální – nejnižší teplota, při níž se daný

druh rozmnožuje ještě zjistitelnou rychlostí

• Optimální –rozmnožuje se nejvyšší

rychlostí

• Maximální- nejvyšší teplota, při které je

daný druh ještě schopen se rozmnožovat

Teplota

Stanovení minimální teploty je poměrně

obtížné – postupně klesá

Optimální cca o 30 oC vyšší než minimální

Maximální o cca 5-10 oC vyšší než optimální

Teplotní šok – syntéza „heat shock proteins“

Optimální teplota růstu x optimální teplota pro

ostatní pochody v buňce

ts- mutanty – permisivní teplota

- restriktivní teplota

Teplota

• Termofilní – opt. tepl.45 oC a vyšší 50 – 60 oC,

B. stearothermophilis 80 oC, archebakterie více

než 100 oC

• Nerozmnožují se při teplotách kolem 30 – 40 oC

rody:

Bacillus, Clostridium (C. thermosacharolyticum)

Lactobacillus (L.delbrueckii var. bulgaricus)

Thermoactinomyces, Thermomonospora

Teplota

• Smrtící (letální) teplota – nejnižší teplota, při

které je mikroorganismus usmrcen během

určité doby (10 min.)

• Mesofilní: 60- 65 oC, po dobu 10 – 15 min.

• Sporotvorné: 120 oC, po dobu 10 – 15 min.

• Spory kvasinek a plísní : 60-70 oC, 10 min.

Phialospora, Paecilomyces, Byssochlamys

Teplota

• Termální smrtící teplota- nejkratší doba pro usmrcení mikroorganismu za dané teploty

• Vztah mezi letální teplotou a dobou potřebnou k usmrcení mikroorganismu je dána letalitní křivkou

• Technická sterilace nekyselých konzerv

• ( Bacillus coagulans, termofilní druhy)

• Kyselé konzervy?

Teplota

• Chladový šok

• Staphylococcus aureus – poměrně odolný

• B. stearotermophilus na 20 oC – ztrácí životnost

• C. perfringens na 4 oC (95% buněk odumírá)

• Pomalé zmrazování

• Rychlé zmrazení

• Zmrazené potraviny!!!

Vliv teploty na růst

• Optimální teplota pro rozmnožování se musí shodovat s

optimální teplotou pro ostatní procesy buňky.

• S.cerevisiae má optimální teplotu růstu o 5 až 8 oC vyšší

než je T pro tvorbu askospor.

• Působením mutagenních prostředků byly získány

mutanty senzitivní k teplotě (ts-mutanty), které mají

výrazně sníženou jak maximální, tak optimální teplotu.

• Tyto mutanty mají některý nezbytný enzym více

termolabilnější, než mají nezmutované kmeny.

Povrchové napětí

• Povrchové napětí a špatná smáčelivost -

blanka (křís)

• Plísně

• Tenzidy:

• Anionaktivní tenzidy (mýdla)

• Kationaktivní tenzidy

• Neionogenní tenzidy (Tween)

Povrchové napětí

• Anionaktivní - ve vyšších koncentracích

poškozují cyt.m., denaturace bílkovin, alkyl

sulfáty, alkylsulfonáty

• Kationaktivní – ve velmi nízkých

koncentracích mají silné antimikrobiální

účinky, smáčecí účinnost poměrně malá,

kvarterní amoniové nebo pyridiniové soli

Záření

• Elektromagnetické záření o různých vlnových délek

• Infračervené záření a Hertzovy vlny- nejdelší vlnové délky nemají smrtící účinek na mikroorganismy, působí tepelnými účinky

• Viditelné světlo (380 – 760 nm)

• UV záření (210- 310 nm) letální účinek – 265 nm NK, malá pronikavost

Záření

• Roentgenovo záření, γ-záření, kosmické záření (kratší než 10 nm), silné mutagenní a letální účinky, působí na DNA, vyvolávají tvorbu volných radikálů a oxiranu)- indukují zlomy chromozomů

• Nejcitlivější jsou G- bakterie, kvasinky a plísně oddolnější, vysoká odolnost Deinococcus radiodurans, D. radiophilus, D. proteolyticus)

• Mikroorganismy odolnější než člověk (až 4x)

• Vliv přítomnosti kyslíku (-), zmrazení, vysušení

Složení atmosféry

Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný

účinek

• Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných

pro kyslík)

• CO2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při

skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro

potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné

oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

UV záření UV záření má vlnovou délku pod 450 nm a kvantum energie od 3-5 eV (1012).

Tato kvanta poskytují dost energie pro excitaci elektronů v molekulách, z jejich základního stavu na energeticky vyšší orbitaly a tak jsou molekuly reaktivnější.

Chemické reakce v mikroorganismech takto indukované mohou působit selhání kritických metabolických procesů vedoucích k poškození nebo smrti.

UV záření Největší letalitu UV záření vykazuje vlnová délka okolo 260 nm, což odpovídá silné absorpci bazemi nukleových kyselin.

Fotochemická dimerizace thyminů.

Obecně, rezistance k UV záření stoupá od: Gram-negativních ‹ Gram-pozitivním = kvasinky ‹ bakteriální spory ‹ spory plísní ‹ ‹ virusy

Hydrostatický tlak

Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního atmosférického tlaku.

Zvýšení tlaku na 10-20 MPa rozmnožování zpomaluje a 30-40 MPa zcela zastavuje.

Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60 MPa – barofilní x barotolerantní (v hlubinách moří)

Hydrostatický tlak

• Zvýšení tlaku 10 – 20 MPa – zpomalení růstu

• 30 – 40 MPa – rozmnožování se zastaví

• Působení tlaků zmírní teplota 30-40 oC

• moře - barofilní – barotolerantní 60 MPA

• negativní působení na syntézu buněčné stěny

• 5- 60 MPa anomalie v dělení buněk, replikace DNA, prodloužení lag fáze

• Usmrcení : 600-700 MPa (minuty až hodiny)

• spory Bacillus 1 700 MPa/hod

Faktory ovlivňující růst

mikroorganismů v potravinách

• Vnitřní faktory

• Faktory prostředí

• Nepřímé faktory- implicitní

• Faktory zpracování

Implicitní - nepřímé faktory

• Specifická růstová rychlost

• Mutualismus

• Antagonismus

• Komensalismus

Implicitní faktory

• Specifická růstová rychlost –

individuální vlastnost geneticky kódovaná

• Synergismus – spolupráce více druhů

• Antagonismus – negativní ovlivňování

různých typů mezi sebou

• Komensalismus -jedna populace využívá

jinou bez jejího poškozování - jeden má ze

vztahu prospěch zatímco druhý není ovlivněn

Biologické vlivy • Komensalismus – volné sdružení mikroorgansimů jež si ani

neprospívají ani neškodí

• Mikroflora úst, kůže

• Syntrofismus (synergismus) – určité mikroorganismy mohou žít v prostředí pouze v přítomnosti jiných

• Aerobní x anaerobní

• Kefírová kultura

• Symbiosa – vzájemné soužití mikroorganismů prospěšné pro oba

• Řasy a houby

• Antagonismus- jeden druh působí nepříznivě na ostatní

• BMK a hnilobné bakterie

• Producenti antibiotik a citlivé druhy - Streptomyces

• Parazitismus- jeden organismus využívá vnitrobuněčných intermediátu metabolismu jiného mikroorgansimu

• Plísně na na konidích Aspergillus niger

• Saprofytismus – růst na dumřeluých tělech rostlin nebo živočichů

• Metabiosa – produkty jedněch organismů jsou postupně využívány jinými

• Kvasinky-alkohol a octové bakterie - ocet

Faktory ovlivňující růst

mikroorganismů v potravinách

• Vnitřní faktory

• Faktory prostředí

• Nepřímé faktory- implicitní

• Faktory zpracování

Technologické faktory - související s

konečným zpracováním a úpravou

• Krájení

• Mytí

• Balení

• Ozařování

• Pasterace

Mechanické vlivy

Mechanické rozrušení buněk – malé rozměry

buněk neumožňují přímé „sekání“.

Při kultivaci v míchaných reaktorech – střižné

síly

• Abrazivní materiál

• Rozmrazování a rozmrazování

• zmrazení a protlačení úzkou štěrbinou za

pomoci vysokého tlaku- drcení 80-90% buněk

Elektrický proud

• Střídavý el.proud intensita 30 – 100 mA

nemá vliv

• Stejnosměrný el.proud nepřiznivě působí

elektrolytickými účinky

Ultrazvuk

• Zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz, působí letálně jsou-li intenzivní (10 W/cm2) – tzv. Kavitační ultrazvuk- pulsace buněčných membrán a plasmy

• Nejcitlivější jsou dlouhé tyčinkové a vláknité mikroorganismy, koky a kvasinky poměrně odolné

• nemá 100% letální účinek

Nekavitační ultrazvuk (1 MHz a s nízkým rozkmitem) se používá k lékařským účelům

Mikrovlné záření Mikrovlné záření, tj. oblast emitovaného spektra obsahuje frekvence mezi 109 Hz až po 1012 Hz a proto má relativně nízké kvantum energie. Microvlny působí nepřímo na mikroorganismy tím, že tvoří teplo. Když je potravina obsahující vodu umístěna do působení mikrovln, dipolární molekuly vody se spolu spojují. Jelikož pole působení mění svou polaritu 2 nebo 5 x 109 krát každou sekundu v závislosti na typu použité frekvence, molekuly vody neustále oscilují. Tato kinetická energie je předávaná sousedním molekulám a vede k rychlému růstu teploty v celé potravině.

Mikrovlné záření Základním problémem spojeným s domácím užitím mikrovlných ohřívačů je nestejnoměrné ohřívání potraviny, vzhledem k přítomnosti studených míst v troubě, a různé dielektrické vlastnosti (nehomogenost) ošetřované potraviny. Takto mohou vznikat studená místa v potravinách takto ohřívaných a je zde riziko spojené s konzumací neadekvátně tepelně upravenho jídla. Mělo by to být lépe vysvětleno v návodech k použití pro mikrovlné trouby.

Technologie překážek

Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které musí mikroorganizmy překonat.

I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení účinku.

Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí mikroorganizmy vyvinout.

Prediktivní mikrobiologie Jedná se o popis odpovědi

mikroorganizmů k

jednotlivým podmínkám

prostředí hlavně teplota, pH

a vodní aktivita. Používá

matematické modely

(získané laboratorním

testováním) a počítačový

software ke grafickému

popisu odpovědi. Modely PM nenahrazují laboratorní

analýzy nebo úsudek zkušeného

potravinářského mikrobiologa.

ComBase prediktivní

modely – sbírka softwaru

založeného na datech z

ComBase k předpovědi

růstu nebo inaktivace

mikroorganizmů.

FAO/WHO definice probiotik

• Jsou to živé mikroorganismy, které ve vhodném množství přispívají ke zdravotnímu prospěch hostitele.

• [1] Bakterie mléčného kvašení BMK/LAB a bifidobakterie jsou nejčastější typy mikrobů užívaných jako probiotika; ale také některé kvasinky a bacily mohou pomáhat.

• Probiotika jsou obvykle konsumovány jako součást fermentovaných potravin obsahujících aktivní živé kultury; jako je jogurt nebo jako potravní doplňky.

Nejčastější probiotické kultury

• Pro obchodní účely jsou nejčastěji

používány následující rody:Lactobacillus a

Bifidobacterium. Probiotické kmeny

Lactobacillus sp. jsou L. acidophilus,

L.johnsonii, L.casei, L.rhamnosus,

L.gasseri, a L.reuteri.

• Kmeny Bifidobacterium sp. jsou hlavně

B.bifidum, B.longum, a B.infantis.

Ukázka působení prebiotik