vigilancia enterococcus resistente a vancomicina …...por la acetilación de un grupo hidroxilo en...

Vigilancia Vigilancia EnterococcusEnterococcus Resistente a Resistente a Vancomicina (ERV)Vancomicina (ERV)

Laboratorio de Referencia Laboratorio de Referencia Instituto de Salud PInstituto de Salud Púública de Chileblica de Chile

TM Pedro Alarcón López

Enterococcus spp. Más frecuentes en clínica

� Enterococcus faecalis

� Enterococcus faecium� Enterococcus casseliflavus

� Enterococcus raffinosus� Enterococcus avium

� Enterococcus gallinarum

Cocaceas gram-positivas en diplo y cadenas.

Colonias grandes y blancas

Catalasa negativa

Resistentes al calor (60ºC x 30’)

Capaces de crecer: 5º- 65ºC (35ºC →→→→ Tº óptima)

pHs (4.5 a 10.5)

Identificación de Laboratorio

Generalmente se observahemólisis γγγγ aunque tambiénpueden existir de tipo αααα o ββββ

40% de bilis (tolerancia a la bilis)

6,5% NaCl (halotolerantes )

Identificación de Laboratorio

COCACEAS CATALASA NEGATIVAS VANCOMICINA RESISTENTE

LeuconostocWeisellaPediococcus

Enterococcus +

-

PYR LAP

+

+

--

GRAM

Species MAN SOR ARG ARA SBL RAF TEL MOT PIC SUC PYUGroup IE. avium + + - + + - - - - + +

E. malodoratus + + - - + + - - - + +

E. raffinosus + + - + + + - - - + +

E. pseudoavium + + - - + - - - - + +

E. saccharolyticus + + - - + + - - - + -

Group II

E. faecalis +* - +* - + - + - - +* +

Lactococcus spp. + - + - - - - - - v -

E. faecium +* - + + v v - - - +* -

E. casseliflavus - +* + v + -* +* +* + v

E. mundtii + - + + v + - - + + -

E. gallinarum +* - +* + - + - +* - + -

Group III

E. durans - - + - - - - - - - -

E. hirae - - + - - v - - - + -

E.dispar - - + - - + - - - + +

Group IV

E. sulfureus - - - - - + - - + + -

E. cecorum - - - - + + - - - + +

Group V

E. columbae + - - + + + - - - + +

V. fluvialis + - - - + - - + - + -

MAN manitol; SOR sorbosa; ARG arginina; ARA arabino sa; SBL sorbitol; RAFrafinosa;

TEL 0,04% telurito; MOT movilidad; PIG pigmento; SUC sacarosa; PYU piruvato; *occasional exceptions

Cuadro diferencial entre Enterococcuspertenecientes a grupos I y II, más frecuentemente aislados en clínica

PYR+, NaCL 6,5% +, BE +

HidrólisisArginina

Movilidad ReducciónTelurito

Arabinosa Rafinosa Sorbosa

E.faecalis +* + - - -E.faecium + - + V -E.casseliflavusPigmento +

+* + - + + -E.raffinosus - - + + +E.avium - - + - +E.gallinarum +* + - + + -

Tipos de Resistencia en Género Enterococcus spp.

NATURAL ADQUIRIDA

Cefalosporinas Ampicilina

Oxacilinas Cloranfenicol

Clindamicinas Macrolidos

Lincomicina Tetraciclina

Cotrimoxazol Quinolonas

Aminoglicósidos (↓nivel) Glicopeptidos

Estreptograminas

Aminoglicósidos (↑nivel)

Linezolid

Resistencia Ampicilina� Alto nivel : CIM >32ug/ml →→→→ mayor producción de

PBP 5, las cuales poseen una baja afinidad a betalactamicos (más frecuente en E.faecium)

� Bajo nivel : producción de ββββ-lactamasas tipo A (descrito solo en E.faecalis), codificada por el gen blaZ localizado en plasmidios o en cromosomas; es de baja frecuencia.

Resistencia Aminoglicósidosde alto nivel

� Enzimatico: enzimas que modifican el antibiótico transformándolo en elementos inactivos, las mas comunes son:

- Enzima bifuncional (2” fosfotranferasa APH 6”acetil transferasa AACs) inactiva todos los aminoglicosidos menos estreptomicina

- 3” fosfotransferasa (APH) inactiva Kanamicina y amikacina

- 6” adeniltransferasa (ANTs) que inactiva la estreptomicinaEnzimas codificadas por plasmidios transmisibles.

Resistencia a Cloramfenicol

� Mecanismo Enzimático: Cloramfenicol Acetil Transferasa (CAT), la cual media la resistencia por la acetilación de un grupo hidroxilo en la molécula de cloramfenicol, impidiendo la unión al ribosoma bacteriano.

� Los genes de resistencia cat están usualmente ubicados en plasmidios y también en cromosomas.

� Sobre el 50% de Enterococcus son resistentes a cloramfenicol.

Resistencia a Macrolidos

� Enzimatico: Metilasa, que metila un residuo de adenina en el RNA ribosomal 23S de la subunidad 50S del ribosoma; se reduce la unión del antibiótico (eritromicina, azitromicina y claritromicina) al ribosoma. Esto es mediado por el gen erm(B) y gen erm(A). Alto nivel de resistencia a eritromicina (CIM >32 ug/ml).

� Proteínas de eflujo: las cuales expulsan los macrolidos al exterior de la célula. Este mecanismo es mediado por el gen mef(A) y se relaciona con un bajo nivel de resistencia a eritromicina (CIM 2-16 ug/ml).

Resistencia a Quinolonas

� Mutaciones a nivel de los genes gyrA y parC los cuales codifican la subunidad A de la DNA girasa y Topoisomerasa IV respectivamente.

� Mutaciones a nivel del gen gyrA determina un alto nivel de resistencia

� Mutaciones a nivel del gen parC determina un nivel intermedio de resistencia a quinolonas

� La mayoría de los Enterococcus con resistencia a ciprofloxacino es producto de mutaciones en ambos genes.

Resistencia a Streptograminas A y B

� Mediada por los genes vgb(A) y vat(D)� Se transmite a través de plasmidios� Gen vgb(A) codifica a una enzima hidrolasa que

inactiva a streptogramina B� Gen vat(D) codifica a una acetiltransferasa que

inactiva a streptogramina A� Solo observada en Enterococcus faecium� Enterococcus faecalis son intrínsecamente

resistentes a Quinupristin/Dalfopristin

Resistencia a Oxazolidinonas

� Resistencia a Linezolid se debe a una Mutación puntual a nivel del RNA 23S G2576U (G2576T en DNA correspondiente)

� Torezolid nuevo antibiótico en fase de ensayo clínico, cuatro veces mas activo que linezolid

Resistencia a Glicopeptidos

� El mecanismo de acción de los antibióticos glucopéptidos como la vancomicina y la teicoplanina se basa fundamentalmente en su unión al dipéptido terminal D-alanina-D-alanina del precursor del péptidoglucano, inhibiendo la síntesi s de la pared celular.

� Existen diferentes fenotipos de resistencia a los glucopéptidos en Enterococcus spp., producidos por diferentes determinantes genéticos de resistencia, denominados VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG.

EnterococcusFenotipo Van A

� Existe alto nivel de resistencia a ambos antibioticos:

Vancomicina (CIM > 64ug/ml) Teicoplanina (CIM > 16 ug/ml)� Es una resistencia inducible por bajas

concentraciones de vancomicina.� Es por adquisición de un transposón Tn 1546 que

es parte de un plasmidio y que se transmite a otros agentes por conjugación

� El operon vanA se compone por siete genes: vanH, vanA, vanX, vanR, vanS, vanY y vanZ.

EnterococcusFenotipo Van B

� Resistencia intermedia o alta a: Vancomicina (CIM 8y16ug/ml o CIM > 1000ug/ml)

� Sensible a Teicoplanina.� El gen puede estar en el cromosoma o en un

plasmidio por lo que puede ser transferible.� VanB está en transposón Tn 1547.� El operon vanB se compone por siete

genes: vanR, vanS, vanY, vanW, vanH, vanB y vanX.

� La resistencia vanB se transmite en conjunto con la resistencia a ampicilina en el transposon Tn5382.

EnterococcusFenotipo Van C

� Resistencia baja a vancomicina CIM: 8 y 32 ug/ml y Sensible a teicoplanina.

� Resistencia cromosómica , no transferible.� La proteína principal para la resistencia (VanC)

sintetiza el dipéptido D-alanina-D-serina en vez de D-alanina-D-lactato.

� Se ha observado en E.gallinarum (vanC-1), E.casseliflavus (vanC-2) y E.flavescens (vanC-3)

� Estas especies pueden ser parte de la flora normal intestinal y rara vez provocan patología clínica.

EnterococcusFenotipos VanD, VanE y VanG

� Se localizan en el cromosoma y son de naturaleza no transferible.

� Se han encontrado en unas pocas cepas, de forma muy localizada.

� El fenotipo VanD se caracteriza por resistencia moderada a la vancomicina y baja a la teicoplanina.

� Los fenotipos VanE y VanG se caracterizan por resistencia de bajo nivel a vancomicina y sensibilidad a teicoplanina

Distribución de fenotipo Van por especie

Especie VanA VanB VanC VanD VanEE.faecalis X X X XE.faecium X X XE.gallinarum X XE.casseliflavus

X X

E.avium XE.durans XE.raffinosus X

Fenotipos de Resistencia a los glucopéptidos en Enterococcus spp.

Fenotipo CIM Vancoug/ml

CIM Teicoug/ml

Especies más frecuentes

Tipo de Resistencia

Transferible

VanA 64 - >1024 16 - 512 E.faeciumE.faecalis

Adquirida Sí

VanB 4 - 1024 < 0.5 E.faeciumE.faecalis

Adquirida Sí

VanC 2 - 32 < 0.5 E.gallinarumE.casseliflavusE.flavescens

Intrínseca No

VanD 128 4 E.faecium Adquirida No

VanE 16 0.5 E.faecalis Adquirida No

VanG 16 < 0.5 E.faecalis Adquirida No

Evolución de la Resistencia Antimicrobiana

S. aureus

Penicillin

��

[1950s]Penicillin-resistant

S. aureus

Methicillin

��

[1980s]Methicillin-resistant

S. aureus (MRSA)

Vancomycin-ResistantS. aureus

Vancomycin-resistant

enterococcus (VRE)

Vancomycin

[1990s]

[1997]

Vancomycin

(glycopeptide) -

intermediate

resistant

S. aureus

[ ? ]

Circular 4C/28 año 2000

Vigilancia, prevención y control de infecciones intrahospitalarias por

Enterococcus resistentes a vancomicina

Circular 4C/28 (9-5-2000) MINSAL de vigilancia,

prevención y control de IIH por ERV

Aislamiento clínico/portación

Agar sangre de cordero 5% 18- 24 hrs 35ºC

Pruebas determinación (género):CatalasaCrecimiento agar sal 6.5%Hidrólisis bilis esculinaPYRLAPLátex Grupo D

Pruebas Det. EspecieFermentación azúcaresHidrólisis argininaReducción de teluritoMovilidad, pigmento, etc.

Confirmación ERV laboratorio de referencia

Enterococcus faecium

Enterococcus faecalis

Enterococcus:Detección de Vancomicina Resistencia

� Se determina presuntivamente en el laboratorio por método difusión con disco vancomicina 30ug.

� Incubación 24 horas a 35°C.� Leer con luz transmitida.� Sensible Intermedio Resistente

> 17 15-16 < 14

� Confirmación por Concentración Inhibitoria Minima (CIM)

Métodos de Concentración Mínima Inhibitoria

Nº Cepas Estudiadas

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

154 206 249 374 474 618890

1660

4017 4123

Nº Cepas estudiadas años 2000-2009Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram Positivas

(I.S.P)

Nº Cepas Estudiadas

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 20082009

42 63 117 275 309 436682

1284

37343919

Confirmación Resistencia a VancomicinaEnterococcus spp

Conf irmación Resistencia a Vanco

Año 2009 existió un 95% de correlación en la

resistencia a Vancomicina

Van A

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1 1 1 4 0 3 4 134

2015

2547

Aislamientos Enterococcus spp. VanA2000-2009

Van A

Aislamientos VanA corresponden al 65% de cepas resistentes año 2009

Van B

0

500

1000

1500

2000

41 59 116265

32

412606

1053

1686

1360

Aislamientos Enterococcus spp. VanB años 2000-2009

Van B

Van C

0

50

100

0 8 6 8 826

95

67

39

16

Aislamientos Enterococcus spp. VanC años 2000-2009

Van C

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

Van BVan AVan C

Genotipos Van años 2000-2009Laboratorio de Referencia - ISP

VanB

Control VanB(+)(-)

457 bp

Control VanB(+)(-)

Control VanA(-) (+)

732bp

Gen Blanco Producto (bp) Secuencia Partidor Referencia

VanA 732 GGGAAAACGACAATTGCGTACAATGCGGCCGTTA

Dutka-Malen et Al.J. Clin. Microbiol. 33:24-27

VanB 457 GGGAAAACGACAATTGCGTACAATGCGGCCGTTA

Evers et Al.Gene 140:97-102

ERV, genotipo resistencia Van, reacción de la polimerasa en cadena

Laboratorio Microbiología Molecular, Sección Bacteriología ISP

VanA

Cepas de Enterococcus spp . recibidas por el Laboratorio de Referencia de Coc aceas Gram Positivas del Instituto de Salud Pública (n=4123 cepas)

Distribución por Servicios de SaludENERO - DICIEMBRE 2009

11

1538

2213

371

161257

14562

3671

273428

481415

5703029

1535

4692

2172

0 100 200 300 400 500 600 700 800

S.S.A co ncag ua

S.S.A nt o f ag ast a

S.S.A raucania Sur

S.S.A r ica

S.S.A t acama

S.S.A ysen

S.S.B io B io

S.S.C hi lo e

S.S.C o ncep cio n

S.S.C o q uimb o

S.S.d el Lib er t ad o r B ernard o O" Hig g ins

S.S.d el M aule

S.S.Iq uiq ue

S.S.M . Sur Or ient e

S.S.M .C ent ral

S.S.M .N o r t e

S.S.M .Occid ent e

S.S.M .Or ient e

S.S.M .Sur

S.S.M ag al lanes

S.S.Ñ ub le

S.S.Oso rno

S.S.R elo ncavi

S.S.T alcahuano

S.S.V ald ivia

S.S.V alp araiso - San ant o nio

S.S.V iña d el mar- Qui l lo t a

Nº de Cepas

1

1

20

7

1

4

11

28

131

59

1

627

231

250

394

297

441

4

4

1

34

0 100 200 300 400 500 600 700

S.S.A co ncag ua

S.S.A nt o f ag ast a

S.S.A raucania Sur

S.S.A r ica

S.S.A t acama

S.S.B io B io

S.S.C o ncep cio n

S.S.C o q uimb o

S.S.d el Lib er t ad o r B ernard o O" Hig g ins

S.S.d el M aule

S.S.Iq uiq ue

S.S.M . Sur Or ient e

S.S.M .C ent ral

S.S.M .N o r t e

S.S.M .Occid ent e

S.S.M .Or ient e

S.S.M .Sur

S.S.M ag al lanes

S.S.V ald ivia

S.S.V alp araiso - San ant o nio

S.S.V iña d el mar- Qui l lo t a

Ser

vici

os

de

Sal

ud

Numero de Cepas

Enterococcus spp . Fenotipos VanA distribuidos por Servicios de Salu dENERO - DICIEMBRE 2009 (n = 2547 cepas)

Abscesos

Hisopado Rectal

L iquido esteril Orina

Punta Cateter

Sec recionesTejidos

418

3404

1 59 1

287

2 1120

1 21

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Numero de Cepas

Tipo de Muestra

Enterococcus spp . Resistentes a Vancomicina por tipo de muestra año 2009Total de cepas estudiadas: 3919

I

R

3939

167 9 7 10

5001000150020002500300035004000

Enterococcus faecium


Enterococcus casseliflavus

Enterococcus gallinarum

Enterococcus avium

Especies de Enterococcus aisladas año 2009Laboratorio de Cocaceas Gram positivas (n = 4123 ce pas)

Instituto de Salud Publica

Numero cepas

Especies de Enterococcus provenientes de muestras clínicas año 2009

Recibidas por Laboratorio de Referencia I.S.P.

Numero total de muestras clínicas 554

Susceptibilidad a Vancomicina de Enterococcus faeciumResistentes : 490 (97,4%), 351 (71.6%) Genotipo VanAIntermedios : 2 (0,4%)Sensibles : 11 (2,2%)Susceptibilidad a Vancomicina de Enterococcus faecalisResistentes : 3 (1 VanA y 2 Van B) (6.4%)Sensibles : 44 Cepas

Muestras Enterococcus

faecium


Enterococcus gallinarum

Enterococcus casseliflavus

Tejidos 21 3 1

Abscesos 4

Liquido estéril

63 4 2

Orina 293 27

Catéter 1 2

Secreciones 121 11 1

Total 503 47 1 3

Patrón de Resistencia de Enterococcus faecium (n=3436 cepas) provenientes de Hisopados Rectales enviados al ISP año 2009.

Patrón de Resistencia de Enterococcus faecalis (n=120cepas) provenientes de Hisopados Rectales enviados al ISP año 2009.

Laboratorio de GenLaboratorio de Gen éética tica Molecular ISPMolecular ISP

ERV, Laboratorio de Referencia, en la ERV, Laboratorio de Referencia, en la bbúúsqueda de marcadores:squeda de marcadores:

Factores de VirulenciaFactores de Virulencia

� Determinación genética de determinantes de virulencia en aislamientos de casos clínicos y portación:

� Hialuronidasa� Gelatinasa� Otros determinantes enzimáticos

ERV, Detección de factores de virulencia en cepas de E. faecium

� Sustancia de Agregación (gen asa1)

� Hialuronidasa (gen hyl)

� Citolisina (gen cylA)

� Gelatinasa (gen gelE)

� Proteína de superficie (gen esp)

Vankerckhoven et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 4473- 9

Billström et al, Int J Antiimicrob Agents 2008; 32: 374-377

Gen cylA: 688 pb

Gen asa1: 375 pb Gen gelE: 510 pb

Gen esp: 530 pb

Gen cylA: 688 pb

Gen gelE: 510 pbGen asa1: 375 pb

Factores de virulencia

Cepas Asa Esp Hyl Cyt gel

E540-07 (-) (-) (-) (-) (-)

E656-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E967-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E1028-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E508-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E487-07 (+) (+) (-) (-) (+)

E495-07 (+) (+) (-) (-) (-)

E561-07 (+) (+) (-) (-) (-)

E598-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E632-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E633-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E402-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E694-07 (-) (+) (-) (-) (-)

E905-07 (-) (-) (-) (-) (-)

Factores de virulencia en cepas de E. faecium VanA de casos clínicos en Chile

ERV, Detección de Resistencia a Linezolid en cepas de E. faecium

Amplificación mediante PCR y análisis genético de una región del gen que codifica para el ARN ribosomal 23S

� Una región del ARN ribosomal 23S fue amplificado por PCR en las muestras 2291-09 y 4144-09.

� El producto fue purificado y secuenciado en un equipo ABIS Prism 3130 de Applied Biosystem.

� La secuencia obtenida fue editada y comparada con secuencia controles sensible y resistente a Linezolid en Genebank

� Ambas secuencias presentaban la mutación G2576T.

St 1 2St 1 2

650 pb

D i c e ( O p t: 1 . 0 0 % ) ( T o l 1 . 5 % - 1 . 5 % ) ( H > 0 .0 % S > 0 .0 % ) [ 0 . 0 % - 1 0 0 . 0 % ]S m a I

100

95

9085

80757065

S m a I

4 1 4 4 - 0 9

4 1 5 4 - 0 9

3 7 9 0 - 0 9

4 0 5 7 - 0 9

4 1 7 0 - 0 9

3 5 7 1 - 0 9

3 6 2 0 - 0 9

3 6 2 2 - 0 9

4 2 3 4 - 0 9

3 5 7 2 - 0 9

4 1 3 3 - 0 9

4 2 7 0 - 0 9

4 1 3 1 - 0 9

4 0 9 0 - 0 9

4 2 6 0 - 0 9

4 1 5 1 - 0 9

4 1 5 2 - 0 9

4 1 5 3 - 0 9

4 2 1 7 - 0 9

4 2 2 1 - 0 9

4 2 2 7 - 0 9

4 2 4 6 - 0 9

4 2 2 2 - 0 9

4 2 4 8 - 0 9

4 2 6 8 - 0 9

4 2 1 3 - 0 9

4 2 2 3 - 0 9

4 2 5 9 - 0 9

4 2 6 3 - 0 9

4 2 4 7 - 0 9

4 2 5 1 - 0 9

4 1 4 5 - 0 9

4 2 3 2 - 0 9

4 2 2 6 - 0 9

4 2 4 9 - 0 9

4 1 3 0 - 0 9

4 2 5 3 - 0 9

4 2 6 2 - 0 9

4 1 0 9 - 0 9

4 1 1 2 - 0 9

3 5 8 8 - 0 9

3 5 8 9 - 0 9

4 2 6 1 - 0 9

4 2 5 2 - 0 9

4 2 5 4 - 0 9

3 9 8 3 - 0 9

3 5 7 3 - 0 9

4 0 5 9 - 0 9

4 0 8 8 - 0 9

4 0 8 9 - 0 9

4 1 3 2 - 0 9

4 1 5 0 - 0 9

3 6 1 9 - 0 9

4 2 2 8 - 0 9

4 2 5 5 - 0 9

H t o r a x

H S o t e r o d e l R i o

P o s t a C e n t r a l



H . S a n B o r j a



H o s p i t a l U n i v e rs i d a d d e C h i .

H . S a n B o r j a

H P a d r e H u r t a d o


V i d a i n t e g r a


H o s p i t a l B a r r o s L u c o






C R S C o r d i l l e r a

H C a l v o M a c k e n n a




L a b B i o n e t





H d e l P i n o

H t o r a x

V i d a I n t e g r a



V i d a i n t e g r a

H d e l P i n o


H D i p r e c a

H D i p r e c a

H . S a n B o r j a

H . S a n B o r j a


H d e l P i n o

H d e l P i n o


H . S a n B o r j a







H d e l P i n o

H d e l P i n o

h i s o p a d o r e c t a l

h i s p a d o r e c t a l


o r i n a

L i q u i d o p e r i t o n e a l






T e j i d o

D re n a j e


o r i n a

o r i n a






o r i n a




L i q u i d o p e r i t o n e a l

s e c r e c i ó n t r a q u e a l


o r i n a

o r i n a






L i q u i d o a b d o m i n a l



o r i n a





o r i n a



s a n g r e



o r i n a


T e j i d o




o r i n a

v a n A

v a n A

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Vigilancia Molecular de E faecium 2009 de Región Metropolitana

MUCHAS GRACIASMUCHAS GRACIASMUCHAS GRACIASMUCHAS GRACIAS

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vigilancia enterococcus resistente a vancomicina …...por la acetilación de un grupo hidroxilo en...

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