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I

(Veroumlffentlichungsbeduumlrftige Rechtsakte die in Anwendung des EG-VertragsEuratom-Vertrags erlassen wurden)

VERORDNUNGEN

VERORDNUNG (EG) Nr 1522009 DER KOMMISSION

vom 27 Januar 2009

zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchung vonFuttermitteln

(Text von Bedeutung fuumlr den EWR)

DIE KOMMISSION DER EUROPAumlISCHEN GEMEINSCHAFTEN mdash

gestuumltzt auf den Vertrag zur Gruumlndung der EuropaumlischenGemeinschaft

gestuumltzt auf die Verordnung (EG) Nr 8822004 des EuropaumlischenParlaments und des Rates vom 29 April 2004 uumlber amtlicheKontrollen zur Uumlberpruumlfung der Einhaltung des Lebensmittel-und Futtermittelrechts sowie der Bestimmungen uumlber Tier-gesundheit und Tierschutz (1) insbesondere auf Artikel 11Absatz 4 Buchstaben a b und c

in Erwaumlgung nachstehender Gruumlnde

(1) Die nachstehenden Rechtsakte wurden zur Durchfuumlhrungder Richtlinie 70373EWG erlassen und bleiben gemaumlszligArtikel 61 Absatz 2 der Verordnung (EG) Nr 8822004 inKraft

mdash Erste Richtlinie 71250EWG der Kommission vom15 Juni 1971 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (2)

mdash Zweite Richtlinie 71393EWG der Kommission vom18 November 1971 zur Festlegung gemeinschaft-licher Analysemethoden fuumlr die amtliche Untersu-chung von Futtermitteln (3)

mdash Dritte Richtlinie 72199EWG der Kommission vom27 April 1972 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchung vonFuttermitteln (4)

mdash Vierte Richtlinie 7346EWG der Kommission vom5 Dezember 1972 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchung vonFuttermitteln (5)

mdash Erste Richtlinie 76371EWG der Kommission vom1 Maumlrz 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicherProbenahmeverfahren fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (6)

mdash Siebte Richtlinie 76372EWG der Kommission vom1 Maumlrz 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (7)

mdash Achte Richtlinie 78633EWG der Kommission vom15 Juni 1978 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (8)

mdash Neunte Richtlinie 81715EWG der Kommission vom31 Juli 1981 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (9)

mdash Zehnte Richtlinie 84425EWG der Kommission vom25 Juli 1984 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (10)

mdash Richtlinie 86174EWG der Kommission vom 9 April1986 zur Festlegung der Methode zur Berechnung desEnergiegehalts von Mischfuttermitteln fuumlr Gefluuml-gel (11)

2622009 DE Amtsblatt der Europaumlischen Union L 541

(1) ABl L 165 vom 3042004 S 1 Berichtigte Fassung im ABl L 191vom 2852004 S 1

(2) ABl L 155 vom 1271971 S 13(3) ABl L 279 vom 20121971 S 7(4) ABl L 123 vom 2951972 S 6

(5) ABl L 83 vom 3031973 S 21(6) ABl L 102 vom 1541976 S 1(7) ABl L 102 vom 1541976 S 8(8) ABl L 206 vom 2971978 S 43(9) ABl L 257 vom 1091981 S 38(10) ABl L 238 vom 691984 S 34(11) ABl L 130 vom 1651986 S 53

mdash Elfte Richtlinie 9370EWG der Kommission vom28 Juli 1993 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (1)

mdash Zwoumllfte Richtlinie 93117EG der Kommission vom17 Dezember 1993 zur Festlegung gemeinschaft-licher Analysemethoden fuumlr die amtliche Untersu-chung von Futtermitteln (2)

mdash Richtlinie 9864EG der Kommission vom 3 Septem-ber 1998 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyse-methoden fuumlr die Bestimmung von AminosaumlurenRohfetten und Olaquindox in Futtermitteln und zurAumlnderung der Richtlinie 71393EWG (3)

mdash Richtlinie 199927EG der Kommission vom 20 April1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyseme-thoden fuumlr die Bestimmung von Amprolium Dicla-zuril und Carbadox in Futtermitteln sowie zurAumlnderung der Richtlinien 71250EWG und 7346EWG und zur Aufhebung der Richtlinie 74203EWG (4)

mdash Richtlinie 199976EG der Kommission vom 23 Juli1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyseme-thoden fuumlr die Bestimmung von Lasalocid-Natrium inFuttermitteln (5)

mdash Richtlinie 200045EG der Kommission vom 6 Juli2000 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyseme-thoden fuumlr die Bestimmung von Vitamin A Vitamin Eund Tryptophan in Futtermitteln (6)

mdash Richtlinie 200270EG der Kommission vom 26 Juli2002 zur Festlegung von Anforderungen an dieBestimmung der Gehalte an Dioxinen und dioxinaumlhn-lichen PCB in Futtermitteln (7)

mdash Richtlinie 2003126EG der Kommission vom23 Dezember 2003 uumlber die Analysemethode zurBestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs beider amtlichen Untersuchung von Futtermitteln (8)

(2) Da die Richtlinie 70373EWG durch die Verordnung (EG)Nr 8822004 ersetzt wurde ist es angezeigt die Durch-fuumlhrungsrechtsakte zu dieser Richtlinie aufzuheben und ineiner einzigen Verordnung zusammenzufassen Gleichzeitigsollten die Methoden und Verfahren entsprechend denneuesten wissenschaftlichen und technologischen Erkennt-nissen angepasst werden Methoden die zu ihrem Zwecknicht mehr verwendet werden sollten gestrichen werdenEs ist geplant die Probenahmebestimmungen zu gegebenerZeit zu aktualisieren um den juumlngsten Entwicklungen beider Erzeugung Lagerung Befoumlrderung und Vermarktungvon Futtermitteln Rechnung zu tragen Dennoch ist esangezeigt die bestehenden Probenahmebestimmungen vor-laumlufig beizubehalten

(3) Die Richtlinien 71250EWG 71393EWG 72199EWG7346EWG 76371EWG 76372EWG 78633EWG81715EWG 84425EWG 86174EWG 9370EWG93117EG 9864EG 199927EG 199976EG 200045EG 200270EG und 2003126EG sollten daheraufgehoben werden

(4) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maszlignahmen ent-sprechen der Stellungnahme des Staumlndigen Ausschusses fuumlrdie Lebensmittelkette und Tiergesundheit mdash

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN

Artikel 1

Die Probenahmen fuumlr die amtliche Untersuchung von Futter-mitteln auf ihre Bestandteile Zusatzstoffe und unerwuumlnschteStoffe ausgenommen Ruumlckstaumlnde von Schaumldlingsbekaumlmpfungs-mitteln und Mikroorganismen erfolgen nach den in Anhang Iaufgefuumlhrten Verfahren

Artikel 2

Die Vorbereitung der Analyseproben und die Formulierung derErgebnisse erfolgen nach den in Anhang II aufgefuumlhrtenMethoden

Artikel 3

Die Analyse fuumlr die amtliche Untersuchung von Futtermittelnerfolgt nach den Methoden die in Anhang III (Analysemethodenzur Untersuchung der Zusammensetzung von Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und Mischfuttermitteln) Anhang IV (Ana-lysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf ihrenGehalt an zugelassenen Zusatzstoffen) Anhang V (Analyseme-thoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf unerwuumlnschteStoffe) und Anhang VI (Analysemethoden zur Bestimmung derBestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Unter-suchung von Futtermitteln) aufgefuumlhrt sind

Artikel 4

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln fuumlr Gefluumlgel wird inUumlbereinstimmung mit Anhang VII berechnet

Artikel 5

Die in Anhang VIII aufgefuumlhrten Analysemethoden fuumlr dieUntersuchung auf rechtswidriges Vorhandensein von nicht mehrzugelassenen Zusatzstoffen in Futtermitteln werden zu Bestaumlti-gungszwecken verwendet

Artikel 6

Die Richtlinien 71250EWG 71393EWG 72199EWG 7346EWG 76371EWG 76372EWG 78633EWG 81715EWG 84425EWG 86174EWG 9370EWG 93117EG 9864EG 199927EG 199976EG 200045EG 200270EGund 2003126EG werden aufgehoben

Verweise auf die aufgehobenen Richtlinien gelten als Verweiseauf die vorliegende Verordnung nach den Entsprechungstabellenin Anhang IX

L 542 DE Amtsblatt der Europaumlischen Union 2622009

(1) ABl L 234 vom 1791993 S 17(2) ABl L 329 vom 30121993 S 54(3) ABl L 257 vom 1991998 S 14(4) ABl L 118 vom 651999 S 36(5) ABl L 207 vom 681999 S 13(6) ABl L 174 vom 1372000 S 32(7) ABl L 209 vom 682002 S 15(8) ABl L 339 vom 24122003 S 78

Artikel 7

Diese Verordnung tritt am zwanzigsten Tag nach ihrer Veroumlffentlichung im Amtsblatt der Europaumlischen Union inKraft

Sie gilt ab dem 26 August 2009

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedemMitgliedstaat

Bruumlssel den 27 Januar 2009

Fuumlr die Kommission

Androulla VASSILIOU

Mitglied der Kommission


ANHANG I

PROBENAHMEVERFAHREN

1 ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH

Die zur amtlichen Untersuchung bestimmten Futtermittelproben werden gemaumlszlig den nachstehenden Verfahrenentnommen Die dabei erhaltenen Proben gelten als repraumlsentativ fuumlr die betreffende Partie

2 PROBENAHMEPERSONAL

Die Probenahme erfolgt durch die von den Mitgliedstaaten zu diesem Zweck bevollmaumlchtigten Personen

3 BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Partie Futtermittelmenge die eine Einheit bildet und von der angenommen wird dass sie einheitliche Merkmalebesitzt

Einzelprobe Menge die an einer Stelle der Partie entnommen wird

Sammelprobe Gesamtmenge von aus einer Partie entnommenen Einzelproben

Reduzierte Sammelprobe Repraumlsentative Teilmenge der Sammelprobe die nach mengenmaumlszligiger Verringerungerhalten wird

Endprobe Teilmenge der reduzierten Sammelprobe oder der homogenisierten Sammelprobe

4 GERAumlTE

41 Die Geraumlte zur Probenahme muumlssen aus einem Material bestehen das die zu beprobenden Erzeugnisse nichtbeeinflusst Diese Geraumlte koumlnnen von den Mitgliedstaaten zugelassen werden

42 Empfohlene Geraumlte fuumlr die Probenahme fester Futtermittel

421 Manuelle Probenahme

4211 Schaufel mit ebenem Boden und rechteckig hochgebogenem Rand

4212 Probestecher mit langem Schlitz oder Kammerstecher Die Groumlszlige des Probestechers ist den Merkmalen der Partie(Tiefe des Behaumllters Groumlszlige des Sacks usw) und der Groumlszlige der Futtermittelteilchen anzupassen

422 Mechanische Probenahme

Zugelassene mechanische Geraumlte duumlrfen zur Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln verwendetwerden

423 Probenteiler

Zur Zerlegung der Probe in ungefaumlhr gleiche Teile bestimmte Geraumlte duumlrfen zur Herstellung der Einzelprobensowie zur Vorbereitung von reduzierten Sammelproben und Endproben verwendet werden

5 MENGENMAumlSSIGE ANFORDERUNGEN

5A Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse die gleichmaumlszligig im Futtermittel verteiltsind

5A1 PartieDie Partie darf nur so groszlig sein dass von allen Teilen aus denen die Partie besteht Probenentnommen werden koumlnnen


5A2 Einzelproben

5A21 Lose Futtermittel Mindestanzahl der Einzelproben

5A211 Partien bis zu 25 t 7

5A212 Partien von mehr als 25 t radic 20 Mal die Zahl der Tonnen aus denen diePartie besteht () begrenzt auf houmlchstens40 Einzelproben

5A22 Verpackte Futtermittel Mindestanzahl der zu beprobenden Pa-ckungen ()

5A221 Packungen von mehr als 1 kg Inhalt

5A2211 Partien aus 1-4 Packungen Alle Packungen

5A2212 Partien aus 5-16 Packungen 4

5A2213 Partien aus mehr als 16 Packungen radic Anzahl der Packungen aus denen die Partiebesteht () begrenzt auf houmlchstens 20 Pa-ckungen

5A222 Packungen bis 1 kg Inhalt 4

5A23 Fluumlssige oder halbfluumlssige Futtermittel Mindestanzahl der zu beprobenden Behaumll-ter ()

5A231 Behaumllter von mehr als 1 l Inhalt

5A2311 Partien aus 1-4 Behaumlltern Alle Behaumllter

5A2312 Partien aus 5-16 Behaumlltern 4

5A2313 Partien aus mehr als 16 Behaumlltern radic Anzahl der Behaumllter aus denen die Partiebesteht () begrenzt auf houmlchstens 20 Behaumll-ter

5A232 Behaumllter bis zu 1 l Inhalt 4

5A24 Futterbloumlcke und Lecksteine Mindestanzahl der zu beprobenden Futter-bloumlcke oder Lecksteine ()1 Futterblock oder Leckstein je Partie von 25Einheiten begrenzt auf houmlchstens 4 Futter-bloumlcke oder Lecksteine

5A3 SammelprobenJe Partie ist eine einzige Sammelprobe erforderlich Die Gesamtmenge der Einzelproben ausdenen sich die Sammelprobe zusammensetzt darf nicht unter den nachstehend festgesetztenMindestmengen liegen

5A31 Lose Futtermittel 4 kg

5A32 Verpackte Futtermittel

5A321 Packungen von mehr als 1 kg 4 kg

5A322 Packungen bis zu 1 kg Gewicht des Inhalts von 4 Originalpackungen

5A33 Fluumlssige oder halbfluumlssige Futtermittel

5A331 Behaumllter von mehr als 1 l Inhalt 4 l

5A332 Behaumllter bis zu 1 l Inhalt Volumen des Inhalts von 4 Originalbehaumlltern

5A34 Futterbloumlcke oder Lecksteine

5A341 mit einem Einzelgewicht von mehr als 1 kg 4 kg

5A342 mit einem Einzelgewicht bis zu 1 kg Gewicht von 4 Originalbloumlcken oder -steinen


5A4 EndprobeDie Sammelprobe dient sofern erforderlich nach Reduzierung der Herstellung derEndproben Mindestens eine Endprobe ist zu untersuchen Die Menge jeder zurUntersuchung bestimmten Endprobe darf nicht unter den nachstehend festgesetztenMindestmengen liegen

Feste Futtermittel 500 g

Fluumlssige oder halbfluumlssige Futtermittel 500 ml

5B Bei der Untersuchung auf unerwuumlnschte Stoffe oder Erzeugnisse die ungleichmaumlszligig imFuttermittel verteilt sein koumlnnen wie z B Aflatoxine Mutterkorn Ricinus und Crotalaria inEinzelfuttermitteln ()

5B1 Partie siehe 5A1

5B2 Einzelproben

5B21 Lose Futtermittel siehe 5A21

5B22 Verpackte Futtermittel Mindestanzahl der zu beprobenden Pa-ckungen

5B221 Partien aus 1-4 Packungen Alle Packungen

5B222 Partien aus 5-16 Packungen 4

5B223 Partien aus mehr als 16 Packungen radic Anzahl der Packungen aus der die Partiebesteht () begrenzt auf houmlchstens 40 Pa-ckungen

5B3 SammelprobenDie Anzahl der Sammelproben haumlngt von der Groumlszlige der Partie ab Die Mindestanzahl derSammelproben je Partie ist nachstehend angegeben Die Gesamtmenge der Einzelproben ausdenen sich die Sammelprobe zusammensetzt darf nicht unter 4 kg liegen

5B31 Lose Futtermittel

Gewicht der Partie (t) Mindestanzahl der Sammelproben je Partie

bis zu 1 t 1

mehr als 1 bis 10 t 2


mehr als 40 t 4

5B32 Verpackte Futtermittel

Anzahl der Packungen die die Partie bilden Mindestanzahl der Sammelproben je Partie

von 1 bis 16 1

17 bis 200 2

201 bis 800 3

mehr als 800 4

5B4 EndprobeJede Sammelprobe ergibt nach Reduzierung die Endproben Mindestens eine Endprobe jeSammelprobe ist zu untersuchen Das Gewicht der zur Untersuchung bestimmten Endprobendarf nicht unter 500 g liegen

() Wenn die Zahl einen Bruch ergibt ist dieser auf die naumlchsthoumlhere ganze Zahl aufzurunden() Fuumlr Packungen oder Behaumllter bis zu 1 kg oder 1 l Inhalt sowie fuumlr Futterbloumlcke oder Lecksteine bis zu 1 kg bildet der Inhalt

einer Originalverpackung oder eines Originalbehaumllters ein Futterblock oder ein Leckstein eine Einzelprobe() Die unter 5A vorgesehenen Methoden sind bestimmt fuumlr die Untersuchung auf Aflatoxine Mutterkorn Ricinus und

Crotalaria in Allein- und Ergaumlnzungsfuttermitteln


6 VORSCHRIFTEN FUumlR DIE ENTNAHME VORBEREITUNG UND VERPACKUNG DER PROBEN

61 Allgemeines

Die Proben sind so schnell wie moumlglich zu entnehmen und vorzubereiten wobei mit der angemessenen Sorgfaltvorzugehen ist damit das Erzeugnis weder veraumlndert noch verunreinigt wird Die fuumlr die Probenahme bestimmtenGeraumlte Flaumlchen und Behaumllter muumlssen sauber und trocken sein

62 Einzelproben

62A Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse die gleichmaumlszligig im Futtermittel verteilt sind

Die Einzelproben sind nach dem Zufallsprinzip aus der gesamten Partie zu entnehmen Ihre Groumlszlige muss ungefaumlhrgleich sein

62A1 L o s e F u t t e rm i t t e l

Die Partie ist kuumlnstlich in ungefaumlhr gleiche Teile aufzuteilen Nach dem Zufallsprinzip ist entsprechend der Anzahlder unter 5A2 vorgesehenen Einzelproben eine Anzahl Teile zu waumlhlen und jedem dieser Teile mindestens eineProbe zu entnehmen

Die Probenahme kann auch bei einer Partie erfolgen die sich in Bewegung (Aufladen bzw Abladen) befindet

62A2 Ve r p a c k t e F u t t e rm i t t e l

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Packungen ist nach 5A2 festgelegt aus jeder dieser Packungen istein Teil des Inhalts mit einem Probestecher oder einer Schaufel zu entnehmen Gegebenenfalls sind die Proben zuentnehmen nachdem die Packungen getrennt entleert worden sind Wenn erforderlich sind bei jeder einzelnenSammelprobe Klumpen zu zerdruumlcken dazu werden diese gegebenenfalls von dem uumlbrigen Material abgetrenntund anschlieszligend wieder untergemischt

62A3 F l uuml s s i g e o d e r h a l b f l uuml s s i g e h omog e n e o d e r h omoge n i s i e r b a r e F u t t e rm i t t e l

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Behaumllter ist nach 5A2 festgelegt aus jedem dieser Behaumllter ist eineProbe zu entnehmen nachdem sein Inhalt falls noumltig homogenisiert worden ist

Die Einzelproben koumlnnen auch beim Ablassen des Erzeugnisses entnommen werden

62A4 F l uuml s s i g e o d e r h a l b f l uuml s s i g e n i c h t h omog e n i s i e r b a r e F u t t e rm i t t e l

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Behaumllter ist nach 5A2 festgelegt die Proben sind verschiedenenHoumlhen zu entnehmen

Die Proben koumlnnen ebenfalls waumlhrend des Ablassens eines Erzeugnisses nach Beseitigung der ersten Bestandteileentnommen werden

In beiden Faumlllen muss das Gesamtvolumen der entnommenen Proben mindestens 10 l betragen

62A5 F u t t e r b l ouml ck e u n d L e c k s t e i n e

Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Futterbloumlcke oder Lecksteine ist nach 5A2 festgelegt jedem Blockoder Stein ist ein Teil zu entnehmen

62B Bei der Untersuchung auf unerwuumlnschte Stoffe oder Erzeugnisse die ungleichmaumlszligig im Futtermittel verteilt sein koumlnnen wiez B Aflatoxine Mutterkorn Ricinus und Crotalaria in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen

Die Partie ist entsprechend der Anzahl der unter 5B3 vorgesehenen Sammelproben kuumlnstlich in eine Anzahlungefaumlhr gleicher Teile aufzuteilen Falls diese Anzahl groumlszliger als 1 ist ist die Gesamtanzahl der unter 5B2vorgesehenen Einzelproben ungefaumlhr gleich auf die verschiedenen Teile zu verteilen Anschlieszligend sind Probenungefaumlhr gleicher Groumlszlige (1) dergestalt zu ziehen dass das Gesamtgewicht der Proben jedes Teiles nicht unter 4 kgliegt wie dies fuumlr jede Sammelprobe erforderlich ist Die aus verschiedenen Teilen stammenden Einzelprobenduumlrfen nicht miteinander vereinigt werden


(1) Bei den verpackten Futtermitteln ist ein Teil des zu beprobenden Inhalts mittels eines Probestechers oder einer Schaufel zu entnehmennachdem die Packungen gegebenenfalls getrennt geleert wurden

63 Vorbereitung der Sammelproben


Die Einzelproben sind zu einer einzigen Sammelprobe zusammenzufassen


Die Einzelproben aus jedem Teil der Partie sind zu mischen und daraus ist die in 5B3 vorgesehene AnzahlSammelproben herzustellen Dabei ist darauf zu achten dass die Herkunft jeder Sammelprobe angegeben wird

64 Vorbereitung der Endproben

Jede Sammelprobe ist sorgfaumlltig zu mischen bis sie homogen ist (1) Wenn noumltig wird die Sammelprobe zuerstauf bis zu mindestens 2 kg bzw 2 l entweder mittels eines mechanischen oder automatischen Probenteilers oderdurch das Vierteilungsverfahren reduziert (reduzierte Sammelprobe)

Dann werden mindestens 3 ungefaumlhr gleich groszlige Endproben entsprechend den mengenmaumlszligigen Anforderungenunter 5A4 oder 5B4 hergestellt Jede Probe ist in einen geeigneten Behaumllter zu fuumlllen Es sind alle notwendigenVorkehrungen zu treffen damit jede Veraumlnderung der Zusammensetzung bzw jede Verunreinigung oderVerfaumllschung der Probe waumlhrend des Transports oder der Lagerung vermieden wird

65 Verschlieszligung und Kennzeichnung der Endproben

Die Behaumllter oder Packungen sind so zu versiegelnzu plombieren und zu kennzeichnen dass sie nicht ohneBeschaumldigung des Siegelsder Plombe geoumlffnet werden koumlnnen wobei die gesamte Kennzeichnung von demSiegelder Plombe mit erfasst werden muss

7 PROBENAHMEPROTOKOLL

Fuumlr jede Probenahme ist ein Probenahmeprotokoll zu erstellen aus dem die Identitaumlt der beprobten Partieeindeutig hervorgeht

8 VERWENDUNG DER PROBEN

Fuumlr jede Sammelprobe wird so schnell wie moumlglich mindestens eine Endprobe mdash zusammen mit den Angabendie fuumlr die Untersuchung erforderlich sind mdash an das zugelassene Laboratorium gesandt


(1) Wenn erforderlich sind bei jeder einzelnen Sammelprobe Klumpen zu zerdruumlcken dazu werden diese gegebenenfalls von dem uumlbrigenMaterial abgetrennt und anschlieszligend wieder untergemischt

ANHANG II

ALLGEMEINE BESTIMMUNGEN HINSICHTLICH DER METHODEN ZUR ANALYSE VON FUTTERMITTELN

A VORBEREITUNG DER PROBEN ZUR ANALYSE

1 Zweck

Die nachfolgend beschriebenen Verfahren beziehen sich auf die Vorbereitung der zur Analyse bestimmten Endprobendie nach der Probenahme gemaumlszlig den Bestimmungen von Anhang I an die Kontrolllaboratorien gesandt wurden

Die Vorbereitung dieser Proben ist so vorzunehmen dass die in den Analysemethoden vorgesehenen Einwaagenhomogen und repraumlsentativ fuumlr die Endproben sind

2 Vorsichtsmaszlignahmen

Die Wahl des Verfahrens fuumlr die Probenvorbereitung haumlngt von der Art der angewandten Analysemethode ab Daherist es von groumlszligter Bedeutung sicherzustellen dass das angewandte Probenvorbereitungsverfahren fuumlr die jeweiligeAnalysemethode geeignet ist

Alle notwendigen Schritte sind so durchzufuumlhren dass eine Verunreinigung der Probe und eine Veraumlnderung ihrerZusammensetzung so weit wie moumlglich vermieden werden

Das Zerkleinern Mischen und Sieben ist moumlglichst rasch durchzufuumlhren wobei die Probe moumlglichst wenig Luft undLicht ausgesetzt wird Die Verwendung von Muumlhlen oder Zerkleinerungsgeraumlten die zu einer merklichen Erwaumlrmungder Probe fuumlhren koumlnnten ist zu vermeiden

Fuumlr besonders hitzeempfindliche Futtermittel wird manuelles Zerkleinern empfohlen Es ist auszligerdem darauf zuachten dass die verwendeten Geraumlte keine Kontaminationsquelle fuumlr Spurenelemente bilden

Kann die Probe nicht ohne eine signifikante Veraumlnderung ihres Feuchtigkeitsgehalts vorbereitet werden so ist dieservor und nach der Vorbereitung gemaumlszlig dem in Anhang III Teil A festgelegten Verfahren zu bestimmen

3 Verfahren

Die Probe ist fuumlr Analyse- bzw Referenzzwecke mittels angemessener Teilungsmethoden wie alternierendes SchaufelnRiffel- oder Rotationsteilung in geeignete Teilproben zu teilen Das Kegeln und das Vierteilungsverfahren werden nichtempfohlen da mit diesen eine hohe Teilungsfehlerquote bei den Teilproben einhergehen kann Die Referenzprobensind in einem geeigneten sauberen und trockenen luftdicht verschlieszligbaren Behaumllter aufzubewahren Die fuumlr dieAnalyse bestimmten Teilproben von mindestens 100 g sind wie nachfolgend angegeben vorzubereiten

31 Futtermittel die direkt gemahlen werden koumlnnen

Sofern keine besonderen Angaben in der Analysemethode gemacht werden wird die gesamte Probe nach demZerkleinern erforderlichenfalls durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm Seitenlaumlnge (entsprechend derEmpfehlung ISO R 565) passiert Zu starkes Zerkleinern ist zu vermeiden

Die gesiebte Probe wird gemischt und in einen geeigneten sauberen trockenen luftdicht verschlieszligbaren Behaumllterabgefuumlllt Unmittelbar vor der Einwaage muss die Probe erneut gemischt werden

32 Futtermittel die nach Trocknung gemahlen werden koumlnnen

Sofern keine besonderen Angaben in der Analysemethode gemacht werden wird die Probe bis auf einenFeuchtigkeitsgehalt von 8 bis 12 unter Anwendung des unter Nummer 43 der Methode zur Bestimmung desFeuchtigkeitsgehalts (siehe Anhang III Teil A) vorgesehenen Vortrocknungsverfahrens getrocknet Die weitereVorbereitung erfolgt gemaumlszlig Nummer 31

33 Fluumlssige oder halbfluumlssige Futtermittel

Die Probe wird in einen geeigneten sauberen trockenen luftdicht verschlieszligbaren Behaumllter abgefuumlllt und unmittelbarvor der Einwaage gruumlndlich gemischt

34 Andere Futtermittel

Proben die nach keinem der oben genannten Verfahren vorbereitet werden koumlnnen sind durch ein anderes Verfahrenzu behandeln das eine homogene und repraumlsentative Einwaage der Endprobe gestattet


4 Aufbewahrung der Proben

Die Proben muumlssen bei einer Temperatur gelagert werden die ihre Zusammensetzung nicht beeinflusst Fuumlr Probendie zur Analyse von Vitaminen oder besonders lichtempfindlichen Stoffen bestimmt sind werden braune Glasgefaumlszligeverwendet

B BESTIMMUNGEN UumlBER IN ANALYSEVERFAHREN VERWENDETE REAGENZIEN UND GERAumlTE

1 Vorbehaltlich besonderer Angaben in den Analysemethoden muumlssen alle zur Analyse verwendeten Reagenzien vonanalysenreiner (p a) Qualitaumlt sein Bei der Analyse von Spurenelementen muss die Reinheit der Reagenzien in einemReagenzienblindversuch uumlberpruumlft werden Je nach dem erhaltenen Wert kann eine weitere Reinigung der Reagenzienerforderlich sein

2 Bei jedem in den Analysemethoden erwaumlhnten Loumlsungs- Verduumlnnungs- Spuumll- oder Auswaschvorgang bei dem keineAngabe uumlber die Art des zu verwendenden Loumlsungs- oder Verduumlnnungsmittels gemacht wird ist Wasser zuverwenden Im Allgemeinen wird destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet In besonderen in denAnalysemethoden angegebenen Faumlllen muss das Wasser speziellen Reinigungsverfahren unterzogen werden

3 Da die uumlbliche Ausstattung von Kontrolllaboratorien vorausgesetzt wird werden nur besondere Instrumente undGeraumlte oder solche die speziellen Anforderungen entsprechen muumlssen in den Analysemethoden aufgefuumlhrt Siemuumlssen gut gereinigt sein vor allem bei der Bestimmung von sehr geringen Stoffmengen

C ANWENDUNG VON ANALYSEMETHODEN UND FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE

1 Extraktionsverfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Extraktionsverfahren vor Generell koumlnnen andere Extraktionsverfahren als dasin der Methode genannte angewandt werden unter der Bedingung dass das verwendete Extraktionsverfahren fuumlr dieanalysierte Matrix eine vergleichbare Extraktionseffizienz aufweist wie das in der Methode genannte Verfahren

2 Clean-up-Verfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Clean-up-Verfahren vor Generell koumlnnen andere Clean-up-Verfahren als das inder Methode genannte angewandt werden unter der Bedingung dass das verwendete Clean-up-Verfahren fuumlr dieanalysierte Matrix zu vergleichbaren Analyseergebnissen fuumlhrt wie das in der Methode genannte Verfahren

3 Berichterstattung uumlber die angewandte Analysemethode

Im Allgemeinen wird zur Bestimmung eines Stoffes in Futtermitteln eine einzige Analysemethode festgelegt Werdenmehrere Methoden genannt muss die vom Kontrolllaboratorium angewandte Methode im Analysebericht angegebenwerden

4 Anzahl der Bestimmungen

Das im Analysebericht angegebene Ergebnis soll den Mittelwert aus mindestens 2 Bestimmungen von separatenEinwaagen der Probe mit ausreichender Wiederholbarkeit darstellen

Allerdings sind bei der Analyse auf unerwuumlnschte Stoffe mdash sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung deutlich(gt 50 ) unter dem zu kontrollierenden Sollwert liegt mdash keine weiteren Bestimmungen erforderlich unter derBedingung dass die geeigneten Qualitaumltsverfahren angewandt werden

Bei der Kontrolle des angegebenen Gehalts an einem Stoff oder einer Zutat sind mdash sofern das Ergebnis der erstenBestimmung den angegebenen Gehalt bestaumltigt d h wenn das Analyseergebnis innerhalb des akzeptablenToleranzbereichs fuumlr den angegebenen Gehalt liegt mdash keine weiteren Bestimmungen erforderlich unter der Bedingungdass die geeigneten Qualitaumltsverfahren angewandt werden

In einigen Faumlllen ist dieser Toleranzbereich in Rechtsvorschriften wie beispielsweise in der Richtlinie 79373EWG desRates (1) definiert

5 Bericht uumlber die Analyseergebnisse

Das Ergebnis ist gemaumlszlig den Angaben in den Analysemethoden mit einer angemessenen Zahl an signifikanten Ziffernanzugeben und falls noumltig auf den Feuchtigkeitsgehalt der Endprobe vor deren Vorbereitung umzurechnen


(1) ABl L 86 vom 641979 S 30

6 Messunsicherheit und Wiederfindungsrate bei der Analyse auf unerwuumlnschte Stoffe

Hinsichtlich unerwuumlnschter Stoffe im Sinne der Richtlinie 200232EG einschlieszliglich Dioxinen und dioxinaumlhnlichenPCB erfuumlllt ein zur Verfuumltterung bestimmtes Erzeugnis die Bestimmung bezuumlglich des festgelegten Houmlchstgehaltsnicht wenn das Analyseergebnis unter Beruumlcksichtigung der erweiterten Messunsicherheit und der Berichtigung umdie Wiederfindungsrate den Houmlchstgehalt uumlberschreitet Zur Beurteilung ob die Houmlchstgehalte eingehalten werdenwird die um die Wiederfindungsrate berichtigte gemessene Konzentration sowie die vom Analyseergebnis subtrahierteerweiterte Messunsicherheit herangezogen Dieses Verfahren wird nur dann angewandt wenn die Analysemethode dieSchaumltzung der Messunsicherheit und die Berichtigung um die Wiederfindungsrate ermoumlglicht (z B nicht moumlglich beimikroskopischer Analyse)

Das Analyseergebnis ist wie folgt anzugeben (soweit die verwendete Analysemethode die Schaumltzung derMessunsicherheit und der Wiederfindungsrate ermoumlglicht)

a) Berichtigung um die Wiederfindungsrate wobei diese anzugeben ist Eine Berichtigung um die Wieder-findungsrate ist nicht erforderlich wenn Letztere zwischen 90 und 110 betraumlgt

b) als bdquox +ndash Uldquo wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Messunsicherheit bezeichnen und ein Faktorvon 2 verwendet wird der zu einem Konfidenzniveau von ca 95 fuumlhrt

Liegt jedoch das Analyseergebnis deutlich (gt 50 ) unter dem zu kontrollierenden Sollwert mdash und unter derBedingung dass die geeigneten Qualitaumltsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck derUumlberpruumlfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient mdash koumlnnen die Analyseergebnisse ohne Berichtigung um dieWiederfindungsrate angegeben werden und die Angabe der Wiederfindungsrate und der Messunsicherheit kann indiesen Faumlllen entfallen


ANHANG III

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON FUTTERMITTEL-AUSGANGSERZEUGNISSEN UND MISCHFUTTERMITTELN

A BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS

1 Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methode erlaubt die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts von Futtermitteln Bei Futtermitteln die fluumlchtigeStoffe wie z B organische Saumluren enthalten ist zu beachten dass zusammen mit dem Feuchtigkeitsgehalt auchbedeutende Mengen an fluumlchtigen Stoffen bestimmt werden

Sie betrifft nicht die Untersuchung von Milcherzeugnissen als Futtermittel-Ausgangserzeugnisse die Unter-suchung von Mineralstoffen und Mischungen die uumlberwiegend aus Mineralstoffen bestehen die Untersuchungvon tierischen und pflanzlichen Fetten und Oumllen oder die Untersuchung von Oumllsaaten und Oumllfruumlchten

2 Prinzip

Die Probe wird unter definierten Bedingungen getrocknet die von der Art des Futtermittels abhaumlngen DerGewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt isteine zusaumltzliche Vortrocknung erforderlich

3 Geraumlte

31 Zerkleinerungsgeraumlt aus einem Material das keine Feuchtigkeit absorbiert leicht zu reinigen ist eine schnelle undgleichmaumlszligige Zerkleinerung ermoumlglicht ohne eine merkliche Erwaumlrmung hervorzurufen das so weit wie moumlglichden Kontakt mit der Auszligenluft verhindert und den unter 411 und 412 gestellten Anforderungen entspricht(z B Mikroschlagkreuzmuumlhlen Mikrozerkleinerer mit Wasserkuumlhlung zerlegbare Kegelmuumlhlen langsamlaufende Kegelmuumlhlen oder Zahnscheibenmuumlhlen)

32 Analysenwaage Genauigkeit 1 mg

33 Trockene Gefaumlszlige aus korrosionsbestaumlndigem Metall oder Glas mit luftdicht schlieszligenden Deckeln die Nutzflaumlchemuss eine Verteilung der Probe von ca 03 gcm2 ermoumlglichen

34 Elektrisch beheizter temperaturgeregelter Trockenschrank (plusmn 2 oC) der eine schnelle Regelung der Temperaturgewaumlhrleistet und eine gute Luumlftung besitzt (1)

35 Elektrisch beheizter regulierbarer Vakuumtrockenschrank mit einer Oumllpumpe der entweder mit einerVorrichtung fuumlr die Zufuhr warmer und getrockneter Luft oder mit einem Trocknungsmittel (z B Calciumoxid)ausgestattet ist

36 Exsikkator mit dicker perforierter Platte aus Metall oder Porzellan der ein wirksames Trocknungsmittel enthaumllt

4 Verfahren

Anmerkung Die Verfahren die in diesem Abschnitt beschrieben werden muumlssen unverzuumlglich nach demOumlffnen der Packungen die die Proben enthalten durchgefuumlhrt werden Die Analysen sindmindestens doppelt auszufuumlhren

41 Vorbereitung

411 F u t t e rm i t t e l a u szlig e r d e n un t e r 4 1 2 u n d 4 1 3 g en a nn t e n

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen und erforderlichenfalls unter Vermeidung von Feuchtigkeits-aumlnderungen entsprechend zerkleinert oder geteilt (siehe 6)

412 G e t r e i d e u n d G r uuml t z e

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen Diese Menge wird so gemahlen dass zumindest 50 derTeilchen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 05 mm passiert werden koumlnnen und dass beim Passierendurch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ein Ruumlckstand von houmlchstens 10 verbleibt


(1) Fuumlr die Trocknung von Getreide Mehl Gruumltze und Grieszlig muss der Trockenschrank eine Waumlrmekapazitaumlt haben mit der er nachBeladung mit der Houmlchstzahl gleichzeitig zu trocknender Proben die voreingestellte Temperatur von 131 oC in weniger als 45 min wiedererreicht Die Luumlftung muss so beschaffen sein dass die Ergebnisse nach 2-stuumlndiger Trocknung einer sein gesamtes Fassungsvermoumlgenauslastenden Anzahl an Weichweizenproben von den Ergebnissen nach 4-stuumlndiger Trocknung um weniger als 015 abweichen

413 F l uuml s s i g e o d e r b r e i i g e F u t t e rm i t t e l F u t t e rm i t t e l d i e uuml b e r w i e g e n d a u s Ouml l e n un dF e t t e n b e s t e h e n

Etwa 25 g der Probe auf 10 mg genau gewogen werden entnommen mit einer entsprechenden auf 10 mggenau gewogenen Menge wasserfreiem Sand vermischt bis ein homogenes Produkt entsteht

42 Trocknung


Ein Gefaumlszlig (33) wird mit seinem Deckel auf 1 mg genau gewogen Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau indas tarierte Gefaumlszlig eingewogen und gleichmaumlszligig verteilt Das Gefaumlszlig wird ohne Deckel in den auf 103 oCvorgeheizten Trockenschrank gestellt Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfaumlllt ist dasGefaumlszlig moumlglichst rasch hineinzustellen Es wird 4 h lang getrocknet wobei die Trocknungszeit von demZeitpunkt an gerechnet wird an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 103 oC erreicht hat NachOumlffnen des Trockenschranks wird das Gefaumlszlig sofort mit dem Deckel verschlossen aus dem Schrank genommen30 bis 45 min lang zum Abkuumlhlen in den Exsikkator (36) gestellt und anschlieszligend auf 1 mg genau gewogen

Bei Futtermitteln die uumlberwiegend aus Oumllen und Fetten bestehen wird eine zusaumltzliche Trocknung von 30 minim Trockenschrank bei 130 oC vorgenommen Der Unterschied zwischen den beiden Waumlgeergebnissen darfhoumlchstens 01 Feuchtigkeit betragen

422 G e t r e i d e M e h l G r uuml t z e u n d G r i e szlig

Ein Gefaumlszlig (33) wird mit seinem Deckel auf 05 mg genau gewogen Etwa 5 g der zerkleinerten Probe werden auf1 mg genau in das tarierte Gefaumlszlig eingewogen und gleichmaumlszligig verteilt Das Gefaumlszlig wird ohne Deckel in den auf130 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfaumllltist das Gefaumlszlig moumlglichst rasch hineinzustellen Es wird 2 h lang getrocknet wobei die Trocknungszeit von demZeitpunkt an gerechnet wird an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 130 oC erreicht hat NachOumlffnen des Trockenschranks wird das Gefaumlszlig sofort mit dem Deckel verschlossen aus dem Schrank genommen30 bis 45 min lang zum Abkuumlhlen in den Exsikkator (36) gestellt und anschlieszligend auf 1 mg genau gewogen

423 Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 Futtermittel-Ausgangserzeugnissewie z B Johannisbrotschrot hydrolysierte Getreideerzeugnisse Malzkeime Zuckerruumlbenschnitzel Fisch- undZuckerpresssaumlfte Mischfuttermittel mit einem Gehalt an kristallwasserhaltigen Mineralstoffen von mehr als 25

Ein Gefaumlszlig (33) wird mit seinem Deckel auf 05 mg genau gewogen Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genauin das tarierte Gefaumlszlig eingewogen und gleichmaumlszligig verteilt Das Gefaumlszlig wird ohne Deckel in den auf80 bis 85 oC vorgeheizten Vakuumtrockenschrank (35) gestellt Damit die Temperatur des Vakuumtrocken-schranks nicht zu stark abfaumlllt ist das Gefaumlszlig moumlglichst rasch hineinzustellen

Der Druck wird auf 100 Torr eingestellt Die Probe wird 4 h lang bei diesem Druck entweder unter Zufuhr vonheiszliger trockener Luft oder mittels eines Trocknungsmittels (etwa 300 g fuumlr 20 Proben) getrocknet Im letzterenFall wird beim Erreichen des vorgeschriebenen Drucks die Verbindung zur Vakuumpumpe unterbrochen DieTrocknungszeit wird von dem Zeitpunkt an gerechnet an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut80 bis 85 oC erreicht hat Nach Ablauf der Trocknungszeit wird der Vakuumtrockenschrank vorsichtig wieder aufatmosphaumlrischen Druck gebracht Nach Oumlffnen des Vakuumtrockenschranks wird das Gefaumlszlig sofort mit demDeckel verschlossen aus dem Schrank genommen zum Abkuumlhlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (36)gestellt und anschlieszligend auf 1 mg genau gewogen Es wird im Vakuumtrockenschrank weitere 30 min bei 80 bis85 oC getrocknet und erneut gewogen Der Unterschied zwischen den beiden Waumlgeergebnissen darf houmlchstens01 Feuchtigkeit betragen

43 Vortrocknung

431 F u t t e rm i t t e l a u szlig e r d e n un t e r 4 3 2 g e n a nn t e n

Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt deren Zerkleinerung schwierig ist ist eineVortrocknung wie folgt vorzunehmen

Von der nicht zerkleinerten Probe (sofern erforderlich koumlnnen gepresste oder klumpenhaltige Futtermittel grobzerkleinert werden) werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefaumlszlig (z B eine Aluminiumschale von20 times 12 cm mit einem Rand von 05 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von60 bis 70 oC getrocknet bis der Feuchtigkeitsgehalt einen Wert zwischen 8 und 12 erreicht hat Anschlieszligendwird das Gefaumlszlig aus dem Trockenschrank genommen im Labor 1 h lang offen abkuumlhlen gelassen und dann auf10 mg genau gewogen Im Folgenden wird die Probe unverzuumlglich wie unter 411 angegeben zerkleinert und jenach Art des Futtermittels entsprechend den Angaben unter 421 oder 423 getrocknet

432 G e t r e i d e

Koumlrner deren Feuchtigkeitsgehalt houmlher als 17 ist muumlssen wie folgt vorgetrocknet werden


Von den nicht gemahlenen Koumlrnern werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefaumlszlig (z B in eineAluminiumschale von 20 times 12 cm mit einem Rand von 05 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank beieiner Temperatur von 130 oC 5 bis 7 min getrocknet Anschlieszligend wird das Gefaumlszlig aus dem Trockenschrankgenommen im Labor 2 h lang offen abkuumlhlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen Im Folgenden wirddie Probe unverzuumlglich wie unter 412 angegeben gemahlen und entsprechend den Angaben unter 422getrocknet

5 Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgenden Formeln berechnet

51 Trocknung ohne Vortrocknung

X =m minusm0eth THORN

m 100

wobei

m = Anfangsgewicht der Probe in gm0 = Gewicht der trockenen Probe in g

52 Trocknung mit Vortrocknung

Xp =m2 minusm0eth THORN m1

m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

wobei

m = Anfangsgewicht der Probe in gm1 = Gewicht der Probe nach der Vortrocknung in gm2 = Gewicht der Probe nach der Zerkleinerung oder dem Zermahlen in gm0 = Gewicht der trockenen Probe in g

53 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 02 Feuchtigkeit (absolut) nicht uumlberschreiten

6 Bemerkung

Wenn eine Zerkleinerung sich als notwendig erweist und dabei mit einer Aumlnderung des Feuchtigkeitsgehalts desMaterials gerechnet werden muss so sind die Analyseergebnisse die die Bestandteile des Futtermittels betreffenauf den Feuchtigkeitsgehalt der Originalprobe umzurechnen

B BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UNDOumlLEN


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Wasser und fluumlchtigen Stoffen in tierischen undpflanzlichen Fetten und Oumllen

2 Prinzip

Die Probe wird bei 103 oC getrocknet bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt (der Gewichtsverlust zwischen 2aufeinanderfolgenden Waumlgungen darf 1 mg nicht uumlberschreiten) Der Gewichtsverlust wird durch Wiegenbestimmt

3 Geraumlte

31 Schale mit flachem Boden aus korrosionsbestaumlndigem Material Durchmesser 8 bis 9 cm Houmlhe ca 3 cm

32 Thermometer mit verstaumlrkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende von ca 80 bis mindestens 110 oCgraduiert Laumlnge ca 10 cm

33 Sandbad oder elektrische Heizplatte


34 Exsikkator der ein wirksames Trocknungsmittel enthaumllt

35 Analysenwaage

4 Verfahren

Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene gewogene Schale (31)eingewogen die das Thermometer (32) enthaumllt und auf dem Sandbad oder der elektrischen Heizplatte (33)unter staumlndigem Ruumlhren mit dem Thermometer so erhitzt dass in ca 7 min eine Temperatur von 90 oC erreichtwird

Entsprechend der Haumlufigkeit mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen wird die Heizintensitaumltverringert Die Temperatur darf 105 oC nicht uumlberschreiten Unter staumlndigem Abkratzen des Bodens der Schalewird weiter umgeruumlhrt bis sich keine Blasen mehr bilden

Um sicherzustellen dass keine Feuchtigkeit mehr vorhanden ist wird mehrmals auf 103 oC plusmn 2 oC erhitzt undzwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen jeweils auf 93 oC gekuumlhlt Anschlieszligend wird bis zur Raum-temperatur im Exsikkator (34) abkuumlhlen gelassen und gewogen Dieses Verfahren ist so oft zu wiederholen bisder Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Waumlgungen 2 mg nicht mehr uumlberschreitet

Anmerkung Eine Gewichtserhoumlhung der Probe nach wiederholter Erwaumlrmung zeigt eine Oxidation des Fettesan In diesem Fall wird der Berechnung das Ergebnis der Waumlgung zugrunde gelegt die unmittelbarvor dem Auftreten der Gewichtszunahme ausgefuumlhrt wurde


Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgender Formel berechnet

X = m1 minusm2eth THORN 100m

wobei

m = Probeneinwaage in gm1 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g vor dem Erhitzenm2 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g nach dem Erhitzen

Ergebnisse unter 005 sollten mit der Bezeichnung bdquoweniger als 005 ldquo angegeben werden

Wiederholbarkeit


C BESTIMMUNG DES ROHPROTEINGEHALTS


Die Methode erlaubt die Berechnung des Rohproteingehalts von Futtermitteln anhand des nach Kjeldahlbestimmten Stickstoffgehalts

2 Prinzip

Die Probe wird durch Schwefelsaumlure in Anwesenheit eines Katalysators aufgeschlossen Der saure Aufschluss wirddurch eine Natriumhydroxidloumlsung alkalisiert Das Ammoniak wird durch Destillation abgetrennt und in einerdefinierten Menge Schwefelsaumlure aufgefangen deren Uumlberschuss durch eine Standard-Natriumhydroxidloumlsungtitriert wird

Alternativ wird das freigesetzte Ammoniak in uumlberschuumlssiger Borsaumlureloumlsung destilliert gefolgt von einerTitration mit Salz- oder Schwefelsaumlureloumlsung

3 Reagenzien

31 Kaliumsulfat


32 Katalysator Kupfer(II)-oxid CuO oder Kupfer(II)-sulfatpentahydrat CuSO4 5H2O

33 Zinkgranulat

34 Schwefelsaumlure ρ20 = 184 gml

35 Schwefelsaumlure volumetrische Standardloumlsung c(H2SO4) = 025 moll



38 Methylrot-Indikator 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (σ = 95 bis 96 ) geloumlst

39 Natriumhydroxidloumlsung (Verwendung technischer Qualitaumlt moumlglich) β = 40 g100 ml (40 )

310 Natriumhydroxid volumetrische Standardloumlsung c(NaOH) = 025 moll


312 Bimssteinkoumlrner mit Salzsaumlure gewaschen und gegluumlht

313 Acetanilid (Schmelzpunkt = 114 oC N-Gehalt = 1036 )

314 Saccharose (stickstofffrei)

315 Borsaumlure (H3BO3)

316 Methylrot-Indikatorloumlsung 100 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol oder Methanol geloumlst

317 Bromkresolgruumlnloumlsung 100 mg Bromkresolgruumln werden in 100 ml Ethanol oder Methanol geloumlst

318 Borsaumlureloumlsung (10 bis 40 gl in Abhaumlngigkeit vom eingesetzten Geraumlt)

Bei einer kolorimetrischen Endpunktbestimmung sind der Borsaumlureloumlsung Methylrot- und Bromkresolindikato-ren zuzufuumlgen Wird 1 l Borsaumlureloumlsung zubereitet sind vor dem Auffuumlllen zur Marke 7 ml Methylrot-Indikatorloumlsung (316) und 10 ml Bromkresolgruumlnloumlsung (317) zuzufuumlgen

In Abhaumlngigkeit von dem verwendeten Wasser kann sich der pH-Wert von einer Borsaumlureloumlsung zur anderenunterscheiden Haumlufig ist eine Einstellung des pH-Werts mithilfe einer geringen Menge Alkali erforderlich umeine positive Blindprobe zu erhalten

Anmerkung Eine Zugabe von rund 3 ml NaOH (311) zu 1 l Borsaumlure von 10 gl fuumlhrt in der Regel zu gutenEinstellungen Die Loumlsung ist bei Raumtemperatur aufzubewahren und waumlhrend der Auf-bewahrung vor Lichteinfall und Ammoniakdaumlmpfen zu schuumltzen

319 Salzsaumlure volumetrische Standardloumlsung c(HCl) = 010 moll

Anmerkung Andere Konzentrationen volumetrischer Loumlsungen (35 36 37 310 311 und 319) koumlnnenverwendet werden sofern die Berechnungen entsprechend berichtigt werden Die Konzentratio-nen sind stets auf 4 Dezimalstellen genau anzugeben

4 Geraumlte

Fuumlr Aufschluss Destillation und Titration nach dem Kjeldahl-Verfahren geeignete Geraumlte

5 Verfahren

51 Aufschluss

Von der Probe wird 1 g auf 0001 g genau gewogen und in den Kolben des Aufschlussgeraumlts gegebenAnschlieszligend werden 15 g Kaliumsulfat (31) eine geeignete Katalysatormenge (32) (03 bis 04 g Kupfer(II)-oxidoder 09 bis 12 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat) 25 ml Schwefelsaumlure (34) und ggf einige Bimssteinkoumlrnchen(312) zugesetzt und vermischt


Der Kolben wird wenn notwendig unter regelmaumlszligigem Schwenken zunaumlchst maumlszligig erhitzt bis die Substanzverkohlt ist und das Schaumlumen aufgehoumlrt hat Dann wird die Fluumlssigkeit staumlrker erhitzt und gleichmaumlszligig amSieden gehalten Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Saumlure auf der Kolbenwand Ein Uumlberhitzen derKolbenwaumlnde und Ansetzen organischer Partikel ist zu vermeiden

Sobald die Loumlsung klar ist und sich hellgruumln faumlrbt wird sie noch weitere 2 h am Sieden gehalten und danachabkuumlhlen gelassen

52 Destillation

Es wird vorsichtig so viel Wasser zugegeben dass die Sulfate vollstaumlndig geloumlst werden Nach dem Abkuumlhlenwerden ggf einige Koumlrner Zinkgranulat (33) zugesetzt Es wird entweder gemaumlszlig 521 oder 522weiterverfahren

521 D e s t i l l a t i o n v on S c hw e f e l s auml u r e

In den Auffangkolben des Destillationsapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau25 ml Schwefelsaumlure (35 oder 37) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (38) hinzugefuumlgt

Der Aufschlusskolben wird mit dem Kuumlhler des Destillationsapparats verbunden und das Ende des Kuumlhlersmindestens 1 cm tief in die Fluumlssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 83) Dann werden 100 mlNatriumhydroxidloumlsung (39) langsam in den Aufschlusskolben eingefuumlllt wobei kein Ammoniak entweichendarf (siehe Bemerkung 81) Der Kolben wird so lange erhitzt bis alles Ammoniak uumlberdestilliert ist

522 D e s t i l l a t i o n v on Bo r s auml u r e

Wird der Ammoniakgehalt des Destillats von Hand titriert findet das im Folgenden beschriebene VerfahrenAnwendung Bei einem voll automatisierten Destilliergeraumlt das auch die Titration des Ammoniakgehalts desDestillats vornimmt ist die Betriebsanleitung des Herstellers zu befolgen

Ein Auffangkolben mit 25 bis 30 ml Borsaumlureloumlsung (318) wird so unter den Ablauf des Kuumlhlers gestellt dasssich das Ablaufrohr unter der Oberflaumlche der uumlberschuumlssigen Borsaumlureloumlsung befindet Das Destilliergeraumlt wird soeingestellt dass es 50 ml Natriumhydroxidloumlsung (39) abgibt Die Bedienung des Destilliergeraumlts erfolgtentsprechend den Anleitungen des Herstellers Anschlieszligend wird das durch die Zugabe der Natriumhydroxid-loumlsung freigesetzte Ammoniak abdestilliert Das Destillat wird in der Borsaumlure (Auffangsaumlure) aufgefangen DieDestillatmenge (Dauer der Dampfdestillation) haumlngt von der in der Probe enthaltenen Menge Stickstoff abHierbei sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen

Anmerkung In einem halbautomatischen Destilliergeraumlt erfolgen die Zugabe von uumlberschuumlssigem Natrium-hydroxid und die Dampfdestillation automatisch

53 Titration

Es wird entweder gemaumlszlig 531 oder 532 weiterverfahren

531 S c hw e f e l s auml u r e

Die uumlberschuumlssige Schwefelsaumlure im Auffangkolben wird mit Natriumhydroxidloumlsung (310 oder 311) inAbhaumlngigkeit von der Konzentration der verwendeten Schwefelsaumlure) titriert bis der Endpunkt erreicht ist

532 B o r s auml u r e

Der Inhalt des Auffangkolbens wird mit der volumetrischen Standardloumlsung der Salzsaumlure (319) oder mit dervolumetrischen Standardloumlsung der Schwefelsaumlure (36) unter Verwendung einer Buumlrette titriert und die Mengedes eingesetzten Titrationsmittels abgelesen

Bei der kolorimetrischen Endpunktbestimmung ist der Endpunkt erreicht wenn sich der Inhalt erstmals pinkverfaumlrbt Die Buumlrette ist auf 005 ml genau abzulesen Eine beleuchtete Magnetruumlhrplatte oder ein fotometrischerDetektor koumlnnen bei der Visualisierung des Endpunkts hilfreich sein

Dies kann automatisch erfolgen bei Verwendung eines Wasserdampfdestillators mit automatischer Titration

Hinsichtlich des Betriebs des jeweiligen Destillators bzw des Destillier-Titriergeraumlts sind die Anleitungen desHerstellers zu befolgen


Anmerkung Bei Verwendung eines automatischen Titrationssystems beginnt die Titration unmittelbar mit demStart der Destillation und es wird die 1 ige Borsaumlureloumlsung (318) eingesetzt

Wird ein vollautomatisches Destilliergeraumlt eingesetzt kann die automatische Titration desAmmoniaks auch mittels Endpunktbestimmung unter Verwendung eines potenziometrischen pH-Systems durchgefuumlhrt werden

In diesem Fall wird eine automatische Titriervorrichtung mit einem pH-Meter verwendet Das pH-Meter ist nach dem uumlblichen Labor-pH-Kalibrierverfahren ordnungsgemaumlszlig im Bereich pH 4 bisph 7 zu kalibrieren

Der pH-Endpunkt der Titration ist bei einem pH-Wert von 46 erreicht dem steilsten Punkt derTitrationskurve (Wendepunkt)

54 Blindversuch

Zur Bestaumltigung dass die Reagenzien stickstofffrei sind wird ein Blindversuch (Aufschluss Destillation undTitration) mit 1 g Saccharose (314) anstelle der Probe durchgefuumlhrt


Die Berechnungen werden gemaumlszlig 61 oder 62 durchgefuumlhrt

61 Berechnung fuumlr die Titration nach 531

Der Rohproteingehalt ausgedruumlckt als Massenanteil wird nach folgender Formel berechnet

V0 minusV1eth THORN c 0014 100 625m

wobei

V0 = Volumen NaOH (310 oder 311) das im Blindversuch eingesetzt wurde in mlV1 = Volumen NaOH (310 oder 311) das in der Titration der Probe eingesetzt wurde in mlc = Konzentration des Natriumhydroxids (310 oder 311) in mollm = Probeneinwaage in g


621 T i t r a t i o n m i t S a l z s auml u r e


V1 minusV0eth THORN c 14 625m

wobei

m = Probeneinwaage in gc = Konzentration der volumetrischen Standardloumlsung von Salzsaumlure (319) in mollV0 = Volumen der Salzsaumlure die im Blindversuch eingesetzt wurde in mlV1 = Volumen der Salzsaumlure die fuumlr die Probenmenge eingesetzt wurde in ml

622 T i t r a t i o n m i t S c hw e f e l s auml u r e



wobei

m = Probeneinwaage in gc = Konzentration der volumetrischen Standardloumlsung von Schwefelsaumlure (36) in mollV0 = Volumen der Schwefelsaumlure (36) die im Blindversuch eingesetzt wurde in mlV1 = Volumen der Schwefelsaumlure (36) die fuumlr die Probenmenge eingesetzt wurde in ml


7 Beurteilung des Verfahrens

71 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf diefolgenden Werte nicht uumlberschreiten

mdash 02 absolut bei Gehalten von weniger als 20 Rohprotein

mdash 10 relativ zum houmlheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 Rohprotein

mdash 04 absolut bei Gehalten von mehr als 40 Rohprotein

72 Genauigkeit

Die Analyse (Aufschluss Destillation und Titration) wird mit 15 bis 20 g Acetanilid (313) in Gegenwart von 1 gSaccharose (314) durchgefuumlhrt 1 g Acetanilid verbraucht 1480 ml Schwefelsaumlure (35) Die Wiederfindungmuss mindestens 99 betragen

8 Bemerkungen

81 Es koumlnnen manuelle halbautomatische oder automatische Geraumlte verwendet werden Bei Geraumlten die einUmfuumlllen zwischen Aufschluss und Destillation erfordern ist darauf zu achten dass dies verlustlos geschiehtVerfuumlgt der Destillationsapparat nicht uumlber einen Tropftrichter so erfolgt die Zugabe der Natriumhydroxidloumlsungunmittelbar vor dem Anschlieszligen des Kolbens an den Kuumlhler die Fluumlssigkeit ist in diesem Fall langsam an denKolbenwaumlnden entlang laufen zu lassen

82 Kommt es waumlhrend des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung ist mit der Bestimmung von vorn zubeginnen und eine groumlszligere als die oben genannte Menge an Schwefelsaumlure (34) zu verwenden

83 Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufuumlllende Menge Schwefelsaumlure (37)gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefuumlllt werden

84 Fuumlr Routineanalysen koumlnnen auch andere Methoden zur Bestimmung des Rohproteins herangezogen werden diein diesem Teil C beschriebene Kjeldahl-Methode ist jedoch die Referenzmethode Die Gleichwertigkeit derErgebnisse der alternativen Methode (z B DUMAS) im Vergleich zur Referenzmethode muss fuumlr jede Matrixeinzeln nachgewiesen werden Da die Ergebnisse einer alternativen Methode auch nach Feststellung ihrerGleichwertigkeit leicht von den Ergebnissen der Referenzmethode abweichen koumlnnen muss im Analyseberichtangegeben werden welche Analyse zur Bestimmung des Rohproteins verwendet wurde

D BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Harnstoffgehalts von Futtermitteln

2 Prinzip

Die Probe wird unter Zusatz eines Klaumlrungsmittels in Wasser suspendiert Die Suspension wird filtriert NachZugabe von 4-Dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) wird der Gehalt an Harnstoff im Filtrat durch Messung derExtinktion bei einer Wellenlaumlnge von 420 nm bestimmt

3 Reagenzien

31 4-Dimethylaminobenzaldehydloumlsung 16 g 4-DMAB werden in 100 ml 96 igen Ethanols geloumlst und 10 mlSalzsaumlure (ρ20 = 119 gml) hinzugefuumlgt Das Reagenz ist houmlchstens 2 Wochen haltbar

32 Carrez-Loumlsung I 219 g Zinkazetat Zn(CH3COO)22H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser geloumlst und auf100 ml mit Wasser aufgefuumlllt

33 Carrez-Loumlsung II 106 g Kaliumhexacyanoferrat (II) K4Fe(CN)63H2O werden in Wasser geloumlst und auf 100 mlmit Wasser aufgefuumlllt

34 Aktivkohle keinen Harnstoff adsorbierend (zu pruumlfen)


35 Harnstoffloumlsung (Massenkonzentration = 01 )

4 Geraumlte

41 Mechanisches Schuumlttelgeraumlt ca 35 bis 40 min-1

42 Reagenzglaumlser 160 times 16 mm mit Schliffstopfen

43 Spektralfotometer

5 Verfahren

51 Analysengang der Probe

Von der Probe werden 2 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle (34) in einen 500-ml-Messkolben gebracht Hierzu werden 400 ml Wasser und 5 ml Carrez-Loumlsung I (32) gegeben ca 30 s gemischtund dann 5 ml Carrez-Loumlsung II (33) zugesetzt Das Ganze wird 30 min lang im Schuumlttelgeraumlt rotiert Dann wirdmit Wasser zur Marke aufgefuumlllt geschuumlttelt und filtriert

Von den klaren und farblosen Filtraten werden je 5 ml in je ein Reagenzglas mit Schliffstopfen pipettiert 5 ml 4-DMAB-Loumlsung (31) zugesetzt und gemischt Die Glaumlser werden in einem Wasserbad bei 20 oC (+ndash 4 oC)temperiert Nach 15 min wird die Extinktion der Probenloumlsung im Vergleich mit der Blindprobenloumlsung derReagenzien im Spektralfotometer bei 420 nm gemessen

52 Kalibrationskurve

Volumen von 1 2 4 5 bzw 10 ml Harnstoffloumlsung (35) werden entnommen in je 100-ml-Messkolbengebracht und mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt Von jeder Loumlsung werden 5 ml mit je 5 ml 4-DMAB-Loumlsung (31)gemischt Die Extinktion wird wie oben angegeben im Vergleich mit einer Loumlsung die 5 ml 4-DMAB und 5 mlharnstofffreies Wasser enthaumllt gemessen Es wird eine Kalibrationskurve aufgestellt


Mithilfe der Kalibrationskurve ist die Menge an Harnstoff in der Versuchsprobe zu bestimmen

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudruumlcken

7 Bemerkungen

71 Bei einem Harnstoffgehalt von mehr als 3 ist die Einwaage auf 1 g zu reduzieren bzw die Anfangsloumlsung soweit zu verduumlnnen dass in 500 ml houmlchstens 50 mg Harnstoff enthalten sind

72 Bei niedrigen Harnstoffgehalten wird die Einwaage erhoumlht soweit das Filtrat klar und farblos bleibt

73 Enthaumllt die Probe einfache Stickstoffverbindungen insbesondere Aminosaumluren so ist die Extinktion bei 435 nmzu messen

E BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLUumlCHTIGEN STICKSTOFFHALTIGEN BASEN

I DURCH MIKRODIFFUSION


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an fluumlchtigen stickstoffhaltigen Basen ausgedruumlckt alsAmmoniak in Futtermitteln

2 Prinzip

Die Probe wird mit Wasser extrahiert die Loumlsung geklaumlrt und filtriert Die fluumlchtigen stickstoffhaltigen Basenwerden nach Zusatz von Kaliumcarbonatloumlsung durch Mikrodiffusion abgetrennt in einer Borsaumlureloumlsungaufgefangen und mit Schwefelsaumlure titriert


3 Reagenzien

31 Trichloressigsaumlureloumlsung (Massenkonzentration = 20 )

32 Indikator 33 mg Bromkresolgruumln und 65 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (Volumenkonzentra-tion = 95 bis 96 ) geloumlst

33 Borsaumlureloumlsung 10 g Borsaumlure werden in einem 1-l-Messkolben in 200 ml Ethanol (Volumenkonzentra-tion = 95 bis 96 ) und 700 ml Wasser geloumlst Vom Indikator (32) werden 10 ml hinzugefuumlgt Die Loumlsung wirdgemischt und noumltigenfalls unter Zusatz von Natriumhydroxidloumlsung auf eine hellrote Farbe gebracht Von dieserLoumlsung kann 1 ml bis zu 300 μg NH3 binden

34 Gesaumlttigte Kaliumkarbonatloumlsung 100 g Kaliumcarbonat werden in 100 ml siedendem Wasser geloumlst Nach demAbkuumlhlen wird die Loumlsung filtriert

35 001 moll Schwefelsaumlure

4 Geraumlte


42 Conwayschalen (vgl Skizze) aus Glas oder Plastik

43 Mikrobuumlretten mit 001-ml-Einteilung

5 Verfahren

Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegebenund 30 min lang im Schuumlttelgeraumlt gemischt oder verruumlhrt Dann werden 50 ml Trichloressigsaumlureloumlsung (31)hinzugefuumlgt mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt kraumlftig geschuumlttelt und durch einen Faltenfilter filtriert

In die Mitte der Conwayschale wird 1 ml Borsaumlureloumlsung (33) und in den Ring der Schale 1 ml des Probenfiltratspipettiert Die Schale wird mit dem angefetteten Deckel teilweise bedeckt dann wird schnell 1 ml der gesaumlttigtenKaliumcarbonatloumlsung (34) in den Ring gegeben und die Schale luftdicht verschlossen Um mit Sicherheit eineMischung der beiden Reagenzien zu erreichen wird die Schale vorsichtig in waagerechter Stellung gedrehtDarauf laumlsst man das Ganze mindestens 4 h lang bei Raumtemperatur oder 1 h lang bei 40 oC stehen

Die in der Borsaumlureloumlsung enthaltenen fluumlchtigen Basen werden anschlieszligend mit Schwefelsaumlure (35) unterVerwendung einer Mikrobuumlrette (43) titriert

Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzufuumlhren


1 ml H2SO4 (001 moll) entspricht 034 mg Ammoniak


Wiederholbarkeit


mdash 10 relativ bei Ammoniakgehalten von weniger als 10

mdash 01 absolut bei Ammoniakgehalten von 10 oder mehr

7 Bemerkung

Enthaumllt die Probe mehr als 06 Ammoniak ist das urspruumlngliche Filtrat zu verduumlnnen


CONWAY CELL

Scale 11


II DURCH DESTILLATION


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an fluumlchtigen stickstoffhaltigen Basen ausgedruumlckt alsAmmoniak in Fischmehl das praktisch keinen Harnstoff enthaumllt Sie ist nur anzuwenden bei Gehalten lt 025 Ammoniak

2 Prinzip

Die Probe wird mit Wasser extrahiert die Loumlsung geklaumlrt und filtriert Die fluumlchtigen stickstoffhaltigen Basenwerden nach Zusatz von Magnesiumoxid in der Siedehitze abgetrennt und in einer definierten MengeSchwefelsaumlure aufgefangen deren Uumlberschuss durch Natriumhydroxidloumlsung zuruumlcktitriert wird

3 Reagenzien


32 Magnesiumoxid

33 Antischaumemulsion (z B Silikon)


35 01 moll Natriumhydroxidloumlsung

36 Methylrotloumlsung 03 in Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 )

4 Geraumlte


42 Destillationsapparatur nach Kjeldahl

5 Verfahren

Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegebenund 30 min lang im Schuumlttelgeraumlt gemischt oder geruumlhrt Dann werden 50 ml Trichloressigsaumlureloumlsung (31)hinzugefuumlgt es wird mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt kraumlftig geschuumlttelt und durch einen Faltenfilter filtriert

Je nach dem vermuteten Gehalt an fluumlchtigen stickstoffhaltigen Basen wird eine entsprechende Menge (imAllgemeinen 100 ml) des klaren Filtrats auf 200 ml verduumlnnt und 2 g Magnesiumoxid (32) sowie einige TropfenAntischaumemulsion (33) hinzugefuumlgt Die Loumlsung muss gegen Lackmuspapier alkalisch reagieren anderenfallsist noch Magnesiumoxid (32) zuzusetzen Es ist gemaumlszlig 52 und 53 der Analysenmethode zur Bestimmung desRohproteingehalts (Teil C dieses Anhangs) weiterzuverfahren





Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 (relativ) Ammoniak nicht uumlberschreiten

F BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSAumlUREN (AUSSER TRYPTOPHAN)


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freien (synthetischen und natuumlrlichen) sowie der gesamten(peptidgebundenen und freien) Aminosaumluren in Futtermitteln unter Verwendung eines Aminosaumlureanalysators


Die Methode ist fuumlr folgende Aminosaumluren anwendbar Cyst(e)in Methionin Lysin Threonin Alanin ArgininAsparaginsaumlure Glutaminsaumlure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Phenylalanin Prolin Serin Tyrosin und Valin

Die Methode unterscheidet nicht zwischen Salzen von Aminosaumluren und dient auch nicht zur Unterscheidungder D- und L-Formen der Aminosaumluren Sie ist nicht zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan oderHydroxyanaloga der Aminosaumluren anwendbar

2 Prinzip

21 Freie Aminosaumluren

Die freien Aminosaumluren werden mit verduumlnnter Salzsaumlure extrahiert Mitextrahierte stickstoffhaltigeMakromolekuumlle werden mit Sulfosalicylsaumlure ausgefaumlllt und durch Filtrieren entfernt Die filtrierte Loumlsung wirdauf einen pH-Wert von 220 eingestellt Die Aminosaumluren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrenntund nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt

22 Gesamtaminosaumluren

Die gewaumlhlte Methode haumlngt von den zu untersuchenden Aminosaumluren ab Cyst(e)in und Methionin muumlssen vorder Hydrolyse zu Cysteinsaumlure bzw Methioninsulfon oxidiert werden Tyrosin muss im Hydrolysat der nichtoxidierten Probe bestimmt werden Alle uumlbrigen unter 1 genannten Aminosaumluren koumlnnen aus dem Hydrolysatder oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden

Die Oxidation wird bei 0 oC mit einer Perameisensaumlure-Phenol-Mischung durchgefuumlhrt UumlberschuumlssigesOxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstoumlrt Die oxidierte bzw die nicht oxidierte Probe wird mitSalzsaumlure (320) 23 h lang hydrolysiert Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von 220 eingestellt DieAminosaumluren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrinfotometrisch bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt

3 Reagenzien

Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualitaumlt zu verwenden (Leitfaumlhigkeit lt 10 μScm)

31 Wasserstoffperoxid w (Massenanteil) = 30

32 Ameisensaumlure w (Massenanteil) = 98 bis 100

33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid

36 5-Sulfosalicylsaumlure-Dihydrat

37 Salzsaumlure Dichte ca 118 gml

38 Tri-Natriumcitrat-Dihydrat

39 22prime-Thiodiethanol (Thiodiglycol)

310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin

312 Petrolether Siedeintervall 40 bis 60 oC

313 Norleucin oder sonstige fuumlr die Verwendung als interner Standard geeignete Verbindung

314 Stickstoffgas (lt 10 ppm Sauerstoff)

315 1-Octanol


316 Aminosaumluren

3161 Standardstoffe gemaumlszlig Auflistung unter 1 Es duumlrfen nur reine Verbindungen ohne Kristallwasser verwendetwerden Sie sind vor der Verwendung im Vakuum uumlber P2O5 oder H2SO4 1 Woche lang zu trocknen

3162 Cysteinsaumlure

3163 Methioninsulfon

317 Natriumhydroxidloumlsung c = 75 moll

300 g NaOH (35) in Wasser loumlsen und auf 1 l auffuumlllen



319 Phenolhaltige Ameisensaumlureloumlsung

889 g Ameisensaumlure (32) werden mit 111 g Wasser gemischt anschlieszligend werden 473 g Phenol (33)hinzugefuumlgt

320 Hydrolysemischung c = 6 mol HCll unter Zusatz von 1 g Phenoll

Zu 492 ml HCl (37) wird 1 g Phenol (33) hinzugefuumlgt und mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt

321 Extraktionsloumlsung c = 01 mol HCll 2 Thiodiglycol enthaltend 82 ml HCl (37) werden in ca 900 ml Wassergegeben 20 ml Thiodiglycol (39) hinzugefuumlgt und es wird mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt (37 und 39 duumlrfennicht unmittelbar gemischt werden)

322 5-Sulfosalicylsaumlureloumlsung β = 6

60 g 5-Sulfosalicylsaumlure (36) in Wasser loumlsen und mit Wasser auf 1 l auffuumlllen

323 Oxidationsmischung (Perameisensaumlure-Phenol)

05 ml Wasserstoffperoxid (31) werden mit 45 ml phenolhaltiger Ameisensaumlureloumlsung (319) in einem kleinenBecherglas gemischt Es wird bei 20 bis 30 oC 1 h stehen gelassen um die Bildung von Perameisensaumlure zubewirken Anschlieszligend wird die Loumlsung 15 min in ein Eisbad gestellt bevor sie der Probe zugegeben wird

Vorsicht Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen

324 Citratpufferloumlsung c = 02 mol Na+l pH 220

1961 g Natriumcitrat (38) 5 ml Thiodiglycol (39) 1 g Phenol (33) und 1650 ml HCl (37) werden inca 800 ml Wasser geloumlst Der pH-Wert wird auf 220 eingestellt Mit Wasser auf 1 l auffuumlllen

325 Elutionspuffer entsprechend den Anforderungen des verwendeten Geraumltes (49)

326 Ninhydrinreagenz entsprechend den Bedingungen des verwendeten Geraumltes (49)

327 Aminosaumluren-Standardloumlsungen Diese Loumlsungen sind bei lt 5 oC aufzubewahren

3271 Aminosaumluren-Standard-Stammloumlsung (3161)

c = 25 μmolml je Aminosaumlure in Salzsaumlure

Diese Loumlsung ist im Handel erhaumlltlich

3272 Standard-Stammloumlsung von Cysteinsaumlure und Methioninsulfon c = 125 μmolml

02115 g Cysteinsaumlure (3162) und 02265 g Methioninsulfon (3163) werden in Citratpufferloumlsung (324) ineinem 1 000-ml-Messkolben geloumlst und es wird mit Citratpufferloumlsung zur Marke aufgefuumlllt Die Loumlsung ist beilt 5 oC houmlchstens 12 Monate haltbar Sie wird nicht benoumltigt falls die Standard-Stammloumlsung (3271) bereitsCysteinsaumlure und Methioninsulfon enthaumllt


3273 Stammloumlsung des internen Standards z B Norleucin c = 20 μmolml

06560 g Norleucin (313) werden in Citratpufferloumlsung (324) in einem Messkolben geloumlst und es wird mitCitratpufferloumlsung auf 250 ml aufgefuumlllt Diese Loumlsung ist bei lt 5 oC houmlchstens 6 Monate haltbar

3274 Aminosaumlurenkalibrierloumlsung zur Verwendung bei Hydrolysaten c = 5 nmol50 μl Cysteinsaumlure undMethioninsulfon und c = 10 nmol50 μl der uumlbrigen Aminosaumluren 22 g Natriumchlorid (310) werden ineinem 100-ml-Becherglas in 30 ml Citratpufferloumlsung (324) geloumlst Es werden 400 ml Standard-Stammloumlsungder Aminosaumluren (3271) 400 ml Standard-Stammloumlsung von Cysteinsaumlure und Methinoninsulfon (3272)und falls verwendet 050 ml Stammloumlsung des internen Standards (3273) hinzugefuumlgt Der pH-Wert wird mitNatriumhydroxid (318) auf 220 eingestellt

Die Loumlsung wird quantitativ in einen 50-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt und es wird mit Citratpufferloumlsung (324) zurMarke aufgefuumlllt und gemischt

Die Loumlsung ist bei lt 5 oC houmlchstens 3 Monate haltbar

Siehe auch Bemerkungen unter 91

3275 Aminosaumlurenkalibrierloumlsung zur Verwendung bei Hydrolysaten gemaumlszlig 5331 und bei Extrakten gemaumlszlig 52 DieKalibrierloumlsung wird gemaumlszlig 3274 hergestellt jedoch ohne Zugabe von Natriumchlorid


4 Geraumlte

41 100- oder 250-ml-Rundkolben mit Ruumlckflusskuumlhler

42 100-ml-Borosilikat-Glasflaschen mit Schraubverschluss mit Gummidichtungteflonbeschichteter Dichtung (z BDuran Schott)

43 Trockenschrank mit forcierter Umluft auf plusmn 2 oC regelbar

44 pH-Meter (auf drei Dezimalstellen genau)

45 Membranfilter 022 μm Porengroumlszlige

46 Zentrifuge

47 Vakuum-Rotationsverdampfer

48 Mechanischer Schuumlttler oder Magnetruumlhrer

49 Aminosaumlureanalysator oder HPLC-Einrichtung mit Ionenaustauschersaumlule Einrichtung fuumlr Ninhydrin-Nach-saumlulenderivatisierung und Fotometer

Die Saumlule wird mit sulfoniertem Polystyrolharz gefuumlllt das die Trennung der einzelnen Aminosaumluren und derenAbtrennung von sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen ermoumlglicht Die Pumpen fuumlr die Ninhydrin- und fuumlrdie Pufferloumlsungen muumlssen uumlber den Zeitraum des Kalibrationslaufes und des Probenlaufes eine Flussstabilitaumltvon plusmn 05 gewaumlhrleisten

Bei einigen Aminosaumlureanalysatoren koumlnnen auch Hydrolyseverfahren angewandt werden wenn die HydrolysateNatriumionenkonzentrationen von c = 08 moll aufweisen und die restliche Ameisensaumlure des Oxidations-schrittes enthalten Andere Analysatoren bieten keine befriedigende Abtrennung bestimmter Aminosaumluren fallsdas Hydrolysat uumlberschuumlssige Ameisensaumlure undoder hohe Natriumionenkonzentrationen aufweist In diesemFall wird das Saumlurevolumen nach der Hydrolyse und vor der pH-Wert-Einstellung durch Einengen auf ca 5 mlreduziert Das Einengen ist unter Vakuum bei houmlchstens 40 oC vorzunehmen

5 Verfahren

51 Vorbereitung der Probe

Die Probe wird so fein vermahlen dass sie ein Sieb mit 05 mm Maschenweite passieren kann Proben mit hohemFeuchtigkeitsgehalt muumlssen vor dem Vermahlen entweder bei einer Temperatur von houmlchstens 50 oCluftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Vermahlen mitPetrolether (312) zu extrahieren


52 Bestimmung des Gehalts an freien Aminosaumluren in Futtermitteln und Vormischungen

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (51) auf 02 mg genau in einen Erlenmeyerkolbeneinwiegen und 1000 ml Extraktionsloumlsung (321) hinzufuumlgen Mit einem mechanischen Schuumlttler 60 minschuumltteln bzw mit einem Magnetruumlhrer (48) ruumlhren Nach dem Absetzen lassen werden mit einer Pipette100 ml der uumlberstehenden Loumlsung in ein 100-ml-Becherglas gegeben

Es werden 50 ml Sulfosalicylsaumlureloumlsung (322) unter Ruumlhren hinzugefuumlgt und mithilfe des Magnetruumlhrers wird5 min weitergeruumlhrt Die uumlberstehende Loumlsung wird filtriert oder zentrifugiert um alle Ausfaumlllungen zuentfernen Von der klaren Loumlsung werden 100 ml in ein 100-ml-Becherglas gegeben und unter Verwendung vonNatriumhydroxidloumlsung (318) wird der pH-Wert auf 220 eingestellt Die Loumlsung wird mit Citratpufferloumlsung(324) in einen Messkolben geeigneter Groumlszlige uumlberfuumlhrt und mit Citratpufferloumlsung (324) zur Marke aufgefuumlllt

Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffuumlllen 100 ml der Stammloumlsung des internenStandards (3273) fuumlr jeweils 100 ml Endloumlsung hinzugefuumlgt und mit Citratpufferloumlsung (324) zur Markeaufgefuumlllt

Anschlieszligend wird die Chromatografie gemaumlszlig 54 durchgefuumlhrt

Werden die Extrakte nicht am selben Tag chromatografiert sind sie bei lt 5 oC aufzubewahren

53 Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosaumluren

531 O x i d a t i o n

01 bis 1 g der vorbereiteten Probe (51) werden auf 02 mg genau eingewogen

mdash in einen 100-ml-Rundkolben (41) fuumlr die offene Hydrolyse (5323) oder

mdash in einen 250-ml-Rundkolben (41) falls eine niedrige Natriumionenkonzentration (5331) erforderlich istoder

mdash in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (42) fuumlr die geschlossene Hydrolyse (5324)

Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von etwa 10 mg und einen Feuchtigkeitsgehalt von houmlchstens 100 mghaben

Der Kolbendie Flasche wird in ein Eisbad gestellt und auf 0 oC abgekuumlhlt Dann werden 5 ml derOxidationsmischung (323) hinzugefuumlgt und es wird mithilfe eines Glasspatels mit gebogener Spitze gemischtDer Behaumllter der den Spatel enthaumllt wird mit einer luftdichten Folie verschlossen das Eiswasserbad mit demverschlossenen Behaumllter in einen Kuumlhlschrank mit einer Temperatur von 0 oC gestellt und 16 h stehen gelassenNach 16 h wird der Behaumllter aus dem Kuumlhlschrank genommen und das uumlberschuumlssige Oxidationsreagenz durchZusatz von 084 g Natriumdisulfit (34) zersetzt

Es wird gemaumlszlig 5321 weiterverfahren

532 H y d r o l y s e

5321 Hy d r o l y s e d e r o x i d i e r t e n P r o b e n

Zu der oxidierten Probe (die gemaumlszlig 531 vorbereitet wurde) werden 25 ml Hydrolysemischung (320) gegebenDabei ist darauf zu achten dass alle Probenruumlckstaumlnde die an den Seitenwaumlnden des Gefaumlszliges sowie am Spatelhaften abgewaschen werden

Je nach dem verwendeten Hydrolyseverfahren wird gemaumlszlig 5323 oder 5324 weiterverfahren

5322 Hy d r o l y s e d e r n i c h t o x i d i e r t e n P r o b e n

In einen 100-ml- oder 250-ml-Rundkolben (41) bzw in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (42)werden 01 bis 1 g der vorbereiteten Probe (51) auf 02 mg genau eingewogen Die Einwaage muss einenStickstoffgehalt von ca 10 mg aufweisen Vorsichtig 25 ml Hydrolysemischung (320) hinzufuumlgen und mit derProbe vermischen Es wird entweder gemaumlszlig 5323 oder gemaumlszlig 5324 weiterverfahren

5323 O f f e n e H y d r o l y s e ( R uuml c k f l u s s h y d r o l y s e )

Zu der nach 5321 oder 5322 hergestellten Mischung werden 3 Glasperlen hinzugegeben Sie wird zumSieden erhitzt und unter Ruumlckfluss genau 23 h am Sieden gehalten Nach Beendigung der Hydrolyse wird derRuumlckflusskuumlhler mit 5 ml Citratpufferloumlsung (324) gespuumllt und der abgehaumlngte Kolben im Eisbad gekuumlhlt



5324 G e s c h l o s s e n e H y d r o l y s e

Die Flasche mit der nach 5321 oder 5322 vorbereiteten Mischung wird bei 110 oC in den Trockenschrank(43) gestellt Um einen durch Gasentwicklung hervorgerufenen Druckaufbau zu vermeiden und eine Explosionzu verhindern wird der Schraubverschluss waumlhrend der ersten Stunde nur lose auf die Flasche gelegt Die Flaschedarf nicht verschlossen werden Nach 1 h wird die Flasche mit dem Deckel fest verschlossen und 23 h imTrockenschrank (43) belassen Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Flasche aus dem Trockenschrankgenommen der Verschluss vorsichtig geoumlffnet die Flasche in ein Eisbad gestellt und abkuumlhlen gelassen

Je nach dem Verfahren fuumlr die pH-Wert-Einstellung (533) wird der Inhalt der Flasche quantitativ mitCitratpufferloumlsung (324) in ein 250-ml-Becherglas oder in einen 250-ml-Rundkolben uumlberfuumlhrt


533 pH -We r t - E i n s t e l l u n g

Je nach der Natriumionentoleranz des Aminosaumlureanalysators (49) wird die pH-Wert-Einstellung gemaumlszlig 5331oder 5332 vorgenommen

5331 F uuml r Am i n o s auml u r e a n a l y s a t o r e n o d e r HP LC - E i n r i c h t u n g e n ( 4 9 ) d i e e i n e n i e d r i g e N a -t r i um i o n e n k o n z e n t r a t i o n e r f o r d e r n

Werden Aminosaumlureanalysatoren verwendet bei denen eine geringe Natriumionenkonzentration erforderlich ist(wenn also das Saumlurevolumen reduziert werden muss) wird die Verwendung einer Stammloumlsung eines internenStandards (3273) empfohlen

In diesem Fall sind dem Hydrolysat vor dem Verdampfen 200 ml der internen Standardloumlsung (3273)hinzuzufuumlgen

Zu dem nach 5323 oder 5324 erhaltenen Hydrolysat werden 2 Tropfen 1-Octanol (315) gegeben

Das Volumen wird am Rotationsverdampfer (47) unter Vakuum bei 40 oC auf 5 bis 10 ml reduziert Wurde dasVolumen beim Einengen versehentlich auf weniger als 5 ml reduziert wird das Hydrolysat verworfen und dieAnalyse wiederholt

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidloumlsung (318) auf 220 eingestellt und es wird gemaumlszlig 534weiterverfahren

5332 F uuml r a l l e s o n s t i g e n Am i n o s auml u r e a n a l y s a t o r e n ( 4 9 )

Die nach 5323 oder 5324 erhaltenen Hydrolysate werden durch vorsichtige Zugabe unter Ruumlhren von 17 mlNatriumhydroxidloumlsung (317) teilweise neutralisiert wobei eine Temperatur von unter 40 oC eingehaltenwerden muss

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidloumlsung (317 und anschlieszligend 318) bei Raumtemperatur auf 220eingestellt und es wird gemaumlszlig 534 weiterverfahren

534 P r o b e n l ouml s u n g f uuml r d i e C h r oma to g r a f i e

Das auf pH 220 eingestellte Hydrolysat (5331 oder 5332) wird mit Citratpufferloumlsung (324) quantitativ ineinen 200-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt und mit Citratpufferloumlsung (324) zur Marke aufgefuumlllt

Falls bisher noch kein interner Standard hinzugefuumlgt worden ist werden vor dem Auffuumlllen 200 ml des internenStandards (3273) hinzugegeben und dann mit Citratpufferloumlsung (324) zur Marke aufgefuumlllt Es wird sorgfaumlltiggemischt


Falls die Probenloumlsungen nicht am selben Tag chromatografiert werden sind sie bei lt 5 oC aufzubewahren

54 Chromatografie

Falls erforderlich wird der Extrakt (52) oder das Hydrolysat (534) vor der Chromatografie auf Raumtemperaturgebracht Die Mischung wird geschuumlttelt und eine geeignete Menge durch einen 022-μm-Membranfilter (45)filtriert Die so erhaltene klare Loumlsung wird der Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung einesAminosaumlureanalysators bzw einer HPLC-Einrichtung (49) unterzogen

Die Einspritzung kann von Hand oder automatisch erfolgen Wesentlich ist dass jeweils die gleiche Mengeplusmn 05 der Standardloumlsung und der Probenloumlsung eingespritzt wird es sei denn es wird ein interner Standardverwendet Das Verhaumlltnis der Konzentrationen von Natriumionen und Aminosaumluren sollte in der Standard- undder Probenloumlsung so aumlhnlich wie moumlglich sein


Die Haumlufigkeit von Kalibrationslaumlufen haumlngt von der Stabilitaumlt des Ninhydrinreagenzes und des Analysatorsys-tems ab Die Standardloumlsung oder die Probenloumlsung wird mit Citratpufferloumlsung (324) so verduumlnnt dass diePeakflaumlche des Standards etwa 30 bis 200 der Peakflaumlche der einzelnen Aminosaumluren in der Probenloumlsungausmacht

Die Chromatografie der Aminosaumluren unterscheidet sich leicht je nach Art des verwendeten Analysators und deseingesetzten Harzes Das System muss in der Lage sein die Aminosaumluren vollstaumlndig voneinander und von densonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen zu trennen Im Betriebsbereich muss das chromatografische Systembei Aumlnderungen der Aminosaumluremengen die der Saumlule hinzugefuumlgt wird eine lineare Reaktion aufweisen

Wird eine equimolare Loumlsung der zu bestimmenden Aminosaumluren analysiert sollten bei der Chromatografie dieunten angegebenen Verhaumlltnisse von Tal zu Peakhoumlhe zwischen den uumlberlappenden Peaks erreicht werden Dieseequimolare Loumlsung muss mindestens 30 der maximalen Menge jeder Aminosaumlure enthalten die mit demjeweiligen Aminosaumlureanalysator (49) noch praumlzise bestimmt werden kann

Fuumlr die Trennung von Threonin-Serin darf das Verhaumlltnis von Tal zur Peakhoumlhe des niedrigeren der 2 sichuumlberlappenden Peaks auf dem Chromatogramm nicht mehr als 210 betragen (wenn nur Cyst(e)in MethioninThreonin und Lysin bestimmt werden beeintraumlchtigt eine unzureichende Trennung von angrenzenden Peaks dieBestimmung) Fuumlr alle uumlbrigen Aminosaumluren sollte die Trennung besser als 110 sein

Das System muss gewaumlhrleisten dass Lysin von bdquoLysinartefaktenldquo und Omithin abgetrennt wird


Die Flaumlchen der Proben- und der Kalibrationsstandardpeaks werden fuumlr jede einzelne Aminosaumlure bestimmt undder Gehalt (X) in g Aminosaumlure je kg Probe berechnet

X =A cM VBm 1 000

Bei Verwendung eines internen Standards ist zu multiplizieren mitDC

A = Peakflaumlche Hydrolysat oder Extrakt

B = Peakflaumlche Kalibrierstandardloumlsung

C = Peakflaumlche interner Standard im Hydrolysat oder Extrakt

D = Peakflaumlche interner Standard Kalibrierstandardloumlsung

M = Molmasse der zu bestimmenden Aminosaumlure

c = Konzentration des Standards in μmolml

m = Probeneinwaage (auf Originalgewicht berichtigt falls getrocknet oder entfettet) in g

V = Gesamtvolumen des Hydrolysats (534) in ml oder errechnetes Gesamtverduumlnnungsvolumen des Extrakts(61) in ml

Sowohl Cystin als auch Cystein werden im Hydrolysat der oxidierten Probe als Cysteinsaumlure bestimmt jedoch alsCystin (C6H12N2O4S2 M = 24030 gmol) unter Verwendung der Molmasse von 12015 gmol (05 times 24030 gmol) berechnet

Methionin wird als Methioninsulfon in Hydrolysaten der oxidierten Probe bestimmt aber unter Verwendung desM von Methionin (14921 gmol) als Methionin berechnet

Zugesetztes freies Methionin wird nach Extraktion als Methionin bestimmt wobei fuumlr die Berechnung das gleicheM verwendet wird

61 Das Gesamtverduumlnnungsvolumen der Extrakte (F) fuumlr die Bestimmung des Gehalts an freien Aminosaumluren (52)wird wie folgt berechnet

F =100 ml 10 mlthorn 5 mleth THORN

10 ml V

10

V = Volumen des Endextrakts



Das Verfahren ist in einem auf internationaler Ebene im Jahr 1990 durchgefuumlhrten Vergleichstest an 4verschiedenen Futtermitteln (Mischfuttermittel fuumlr Schweine Mischfuttermittel fuumlr Mastkuumlken Eiweiszligkonzentratund einer Vormischung) erprobt worden Die nach der Eliminierung von Ausreiszligern erhaltenen Ergebnisse(Mittelwerte und Standardabweichungen) sind in den Tabellen unter diesem Punkt dargestellt

Mittelwerte in gkg

ReferenzmaterialAminosaumlure

Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin

Schweinemischfutter 694n = 15

301n = 17

327n = 17

955n = 13

Mastkuumlkenmischfutter 931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16

Eiweiszligkonzentrat 2232n = 16

506n = 17

1201n = 17

4774n = 15

Vormischung 5842n = 16

mdash 9021n = 16

9803n = 16

n = Anzahl der beteiligten Laboratorien

71 Wiederholbarkeit

Fuumlr die untersuchten Aminosaumluren wurde die Wiederholbarkeit ermittelt Sie ist ausgedruumlckt als Standard-abweichung der Wiederholbarkeit fuumlr den oben genannten Vergleichstest in der folgenden Tabelle dargestellt

Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr) in gkg




010n = 17

011n = 17

026n = 13


011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15


mdash 219n = 16

206n = 16


Variationskoeffizient () fuumlr die Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr)



Schweinemischfut-ter

19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13

Mastkuumlkenmischfut-ter

21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


26n = 17

22n = 17

24n = 15





mdash 24n = 16

21n = 16


72 Vergleichbarkeit

Die Ergebnisse hinsichtlich der Standardabweichung der Vergleichbarkeit die sich aus den oben genanntenUntersuchungen ergeben sind in nachstehender Tabelle dargestellt

Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR) in gkg




030n = 17

023n = 17

030n = 13


034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15


mdash 620n = 16

662n = 16


Variationskoeffizient () fuumlr die Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR)




99n = 17

70n = 17

32n = 13


88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15


mdash 69n = 16

67n = 16


8 Verwendung von Referenzmaterialien

Die korrekte Anwendung der Methode ist durch Mehrfachbestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien(soweit verfuumlgbar) zu uumlberpruumlfen Fuumlr die Kalibration wird die Verwendung einer zertifizierten Aminosaumlu-restandardloumlsung empfohlen

9 Bemerkungen

91 Wegen der Unterschiede zwischen den Aminosaumlureanalysatoren sind die Endkonzentrationen der Aminosaumlu-renkalibrierloumlsungen (3274 und 3275) und der Hydrolysate (534) als Richtwerte anzusehen


Der lineare Reaktionsbereich des Geraumlts muss fuumlr alle Aminosaumluren gepruumlft werden

Die Standardloumlsung wird mit Citratpufferloumlsung verduumlnnt um Peakflaumlchen in der Mitte des Bereichs zu erhalten

92 Falls Geraumlte fuumlr die Hochleistungsfluumlssigkeitschromatografie zur Analyse der Hydrolysate eingesetzt werden sinddie Versuchsbedingungen gemaumlszlig den Empfehlungen des Herstellers zu optimieren

93 Wird diese Methode fuumlr Futtermittel angewandt die mehr als 1 Chlorid enthalten (KraftfuttermittelMineralfuttermittel Ergaumlnzungsfuttermittel) so koumlnnte der Methioningehalt unterschaumltzt werden und es ist einemodifizierte Oxidation erforderlich

G BESTIMMUNG DES TRYPTOPHANGEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan und des Gehalts an freiem Tryptophan inFuttermitteln Sie dient nicht zur Unterscheidung zwischen D- und L-Formen

2 Prinzip

Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan wird die Probe unter alkalischen Bedingungen mit gesaumlttigterBariumhydroxid-Loumlsung hydrolysiert auf 110 oC erhitzt und 20 h auf dieser Temperatur gehalten Nach derHydrolyse wird ein interner Standard zugegeben

Zur Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan wird die Probe unter leicht sauren Bedingungen inGegenwart eines internen Standards extrahiert

Tryptophan und der interne Standard im Hydrolysat bzw im Extrakt werden durch HPLC mitFluoreszenzdetektor bestimmt

3 Reagenzien

31 Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualitaumlt zu verwenden (Leitfaumlhigkeit lt 10 μScm)

32 Standardsubstanz Tryptophan (ReinheitGehalt ge 99 ) im Vakuum uumlber Phosphorpentoxid getrocknet

33 Interner Standard α-Methyl-Tryptophan (ReinheitGehalt ge 99 ) im Vakuum uumlber Phosphorpentoxidgetrocknet

34 Bariumhydroxid-Octahydrat (das Ba(OH)28H2O darf nicht uumlbermaumlszligig der Luft ausgesetzt werden um dieBildung von BaCO3 zu vermeiden das die Bestimmung beeintraumlchtigen koumlnnte) (siehe Bemerkung 93)

35 Natriumhydroxid

36 Orthophosphorsaumlure w (Massenanteil) = 85

37 Salzsaumlure ρ20 = 119 gml

38 Methanol HPLC-Qualitaumlt



400 g NaOH (35) in Wasser loumlsen und mit Wasser (31) auf 1 l auffuumlllen

311 Salzsaumlure c = 6 moll

492 ml HCl (37) mit Wasser auf 1 l auffuumlllen






314 Orthophosphorsaumlure c = 05 moll

34 ml Orthophosphorsaumlure (36) mit Wasser (31) auf 1 l auffuumlllen

315 Konzentrierte Tryptophanloumlsung (32) c = 250 μmolml

02553 g Tryptophan (32) in einem 500-ml-Messkolben in Salzsaumlure (313) loumlsen und mit Salzsaumlure (313) zurMarke auffuumlllen Bei mdash 18 oC houmlchstens 4 Wochen aufbewahren

316 Konzentrierte interne Standardloumlsung c = 250 μmolml

02728 g α-Methyl-Tryptophan (33) in einem 500-ml-Messkolben in Salzsaumlure (313) loumlsen und mit Salz-saumlure (313) zur Marke auffuumlllen Bei mdash 18 oC houmlchstens 4 Wochen aufbewahren

317 Kalibrierstandardloumlsung von Tryptophan und internem Standard

200 ml konzentrierte Tryptophanloumlsung (315) und 200 ml konzentrierte interne Standardloumlsung (α-Methyl-Tryptophan) (316) mit Wasser (31) und Methanol (38) auf etwa dasselbe Volumen und etwa dieselbeMethanolkonzentration (10 bis 30 ) wie das fertige Hydrolysat verduumlnnen

Diese Loumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden

Waumlhrend der Zubereitung vor direktem Sonnenlicht schuumltzen

318 Essigsaumlure

319 111-Trichlor-2-methyl-2-propanol

320 Ethanolamin w (Massenanteil) gt 98

321 Loumlsung von 1 g 111-Trichlor-2-methyl-2-propanol (319) in 100 ml Methanol (38)

322 Mobile Phase fuumlr die HPLC 300 g Essigsaumlure (318) + 900 ml Wasser (31) + 500 ml Loumlsung (321) von 111-Trichlor-2-methyl-2-propanol (319) in Methanol (38) (1g100ml) Der pH-Wert wird mit Ethanolamin (320)auf 500 eingestellt Mit Wasser (31) auf 1 l auffuumlllen

4 Geraumlte

41 HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor

42 HPLC-Trennsaumlule 125 times 4 mm C18 3 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

43 pH-Meter

44 Polypropylen-Kolben 125 ml Weithals mit Schraubverschluss


46 Autoklav 110 (plusmn 2) oC 14 (plusmn 01) bar


48 Vortex-Schuumlttelgeraumlt


5 Verfahren

51 Vorbereitung der Proben


52 Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan (Extrakt)

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (51) auf 1 mg genau in einen Erlenmeyerkolbeneinwiegen 1000 ml Salzsaumlure (313) und 500 ml konzentrierte interne Standardloumlsung (316) zugeben Miteinem mechanischen Schuumlttler oder einem Magnetruumlhrer (47) 60 min schuumltteln bzw mischen Absetzen lassenund 100 ml der uumlberstehenden Loumlsung in ein Becherglas pipettieren 5 ml Orthophosphorsaumlure (314) zugebenDer pH-Wert wird mit Natriumhydroxidloumlsung (310) auf 3 eingestellt Ausreichend Methanol (38) fuumlr eineMethanolkonzentration von 10 bis 30 im Endvolumen zugeben In einen Messkolben mit ausreichendemVolumen uumlberfuumlhren und mit Wasser auf das fuumlr die Chromatografie notwendige Volumen verduumlnnen (entsprichtetwa dem Volumen der Kalibrierstandardloumlsung (317))

Einige ml der Loumlsung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Saumlule durch einen 045-μm-Membranfilter (45)filtriert Die Chromatografie gemaumlszlig 54 durchfuumlhren

Standardloumlsung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schuumltzen Falls es nicht moumlglich ist die Extrakteam selben Tag zu analysieren koumlnnen sie bei 5 oC maximal 3 Tage aufbewahrt werden

53 Bestimmung des Gehalts an Gesamttryptophan (Hydrolysat)

01 bis 1 g der vorbereiteten Probe (51) werden auf 02 mg genau in den Polypropylenkolben (44) eingewogenDie Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca 10 mg aufweisen 84 g Bariumhydroxid-Octahydrat (34) und10 ml Wasser zugeben Mithilfe eines Vortex-Schuumlttelgeraumlts (48) oder Magnetruumlhrgeraumlts (47) mischen Denteflonbeschichteten Magneten in der Mischung lassen Die Gefaumlszligwaumlnde mit 4 ml Wasser abspuumllen Schraubkappeaufsetzen und Kolben locker verschlieszligen In einem Autoklaven (46) 30 bis 60 min mit kochendem Wassererhitzen Den Autoklaven schlieszligen und 20 h bei 110 (+ndash 2) oC autoklavieren

Vor dem Oumlffnen des Autoklaven ist die Temperatur auf knapp unter 100 oC zu senken Um Kristallisation desBa(OH)28HO2 zu vermeiden sind der warmen Mischung 30 ml Wasser mit Zimmertemperatur zuzugebenLeicht schuumltteln oder ruumlhren 200 ml konzentrierte interne Standardloumlsung (α-Methyl-Tryptophan) (316)zugeben Die Gefaumlszlige im Wasser-Eisbad 15 min kuumlhlen

Anschlieszligend 5 ml Orthophosphorsaumlure (314) zugeben Das Gefaumlszlig im Kuumlhlbad belassen und unter Ruumlhren mitHCl (311) neutralisieren der pH-Wert wird mit HCl (312) auf 30 eingestellt Ausreichend Methanol fuumlr eineMethanolkonzentration von 10 bis 30 im Endvolumen zugeben In einen Messkolben mit ausreichendemVolumen uumlberfuumlhren und mit Wasser auf das fuumlr die Chromatografie notwendige Volumen verduumlnnen (z B100 ml) Die Zugabe von Methanol darf keine Praumlzipitation verursachen


Standardloumlsung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schuumltzen Falls es nicht moumlglich ist dieHydrolysate am selben Tag zu analysieren koumlnnen sie bei 5 oC houmlchstens 3 Tage aufbewahrt werden

54 HPLC-Bestimmung

Die folgenden Angaben fuumlr eine isokratische Trennung sind Richtwerte andere Parameter koumlnnen verwendetwerden sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen fuumlhren (siehe auch Bemerkungen 91 und 92)

HPLC-Trennsaumlule (42) 125 times 4 mm C18 3 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

Saumlulentemperatur Raumtemperatur

Mobile Phase (322) 300 g Essigsaumlure (318) + 900 ml Wasser (31) + 500 ml Loumlsung (321) von 111-Trichlor-2-methyl-2-propanol (319) in Methanol (38) (1 g100 ml) Den pH-Wertmit Ethanolamin (320) auf 50 einstellen Mit Wasser (31) auf 1 l auffuumlllen

Durchflussrate 1 mlmin

Gesamtlaufzeit ca 34 min

Detektionswellenlaumlnge Anregung 280 nm Emission 356 nm

Einspritzvolumen 20 μl



Die Menge von Tryptophan (X) in g je 100 g Probe wird wie folgt berechnet

X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m

A = Peakflaumlche des internen Standards Kalibrierstandardloumlsung (317)

B = Peakflaumlche von Tryptophan Extrakt (52) oder Hydrolysat (53)

V1 = Volumen der konzentrierten Tryptophanloumlsung (315) das der Kalibrierloumlsung (317) zugegeben wurde inml (2 ml)

c = Konzentration der konzentrierten Tryptophanloumlsung (315) die der Kalibrierloumlsung (317) zugegebenwurde in μmolml (= 250)

V2 = Volumen der konzentrierten internen Standardloumlsung (316) das bei der Extraktion (52) (= 500 ml) oderdem Hydrolysat (53) (= 200 ml) zugegeben wurde in ml

C = Peakflaumlche des internen Standards Extrakt (52) oder Hydrolysat (53)

D = Peakflaumlche von Tryptophan Kalibrierstandardloumlsung (317)

V3 = Volumen der konzentrierten internen Standardloumlsung (316) das der Kalibrierstandardloumlsung (317)zugegeben wurde in ml (200 ml)

m = Probeneinwaage (korrigiert auf Originalgewicht falls getrocknet undoder entfettet) in g

M = Molmasse von Tryptophan (= 20423 gmol)

7 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 des houmlheren Werts nicht uumlberschreiten

8 Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein EG-Ringversuch (4 Vergleichstest) durchgefuumlhrt bei dem 3 Proben von bis zu 12 Laboratorienanalysiert wurden um die Hydrolysemethode zu zertifizieren Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert DieErgebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst

Probe 1Schweinefutter

Probe 2Schweinefutter mit Zusatz

von L-Tryptophan

Probe 3Kraftfutter fuumlr Schweine

L 12 12 12n 50 55 50Mittelwert [gkg] 242 340 422sr [gkg] 005 005 008r [gkg] 014 014 022VKr [ ] 19 16 19sR [gkg] 015 020 009R [gkg] 042 056 025VKR [ ] 63 60 22

L = Zahl der Laboratorien die Ergebnisse uumlbermittelt haben

n = Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreiszliger (Ausreiszligertest von Cochran Dixon)

sr = Standardabweichung der Wiederholbarkeit

sR = Standardabweichung der Vergleichbarkeit

r = Wiederholbarkeit

R = Vergleichbarkeit

VKr = Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit in

VKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit in


Es wurde ein weiterer EG-Ringversuch (3 Vergleichstest) durchgefuumlhrt bei dem 2 Proben von bis zu13 Laboratorien analysiert wurden um die Methode zur Extraktion von freiem Tryptophan zu zertifizieren JedeProbe wurde mehrfach (5-mal) analysiert Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst

Probe 4Mischung aus Weizen und Soja

Probe 5Mischung aus Weizen und Soja (= Probe4) mit Tryptophan-Zusatz (0457 gkg)

L 12 12n 55 60Mittelwert [gkg] 0391 0931sr [gkg] 0005 0012r [gkg] 0014 0034VKr [ ] 134 134sR [gkg] 0018 0048R [gkg] 0050 0134VKR [ ] 471 511







VKr = Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit

VKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

Es wurde ein weiterer EG-Vergleichstest durchgefuumlhrt bei dem 4 Proben von bis zu 7 Laboratorien analysiertwurden um die Tryptophan-Hydrolyse zu zertifizieren Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabellezusammengefasst Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert

Probe 1Schweine mischfut-

termittel(CRM 117)

Probe 2Fischmehl mit gerin-

gem Fettgehalt(CRM 118)

Probe 3Sojamehl(CRM 119)

Probe 4Magermilch pulver

(CRM 120)

L 7 7 7 7n 25 30 30 30Mittelwert [gkg] 2064 8801 6882 5236sr [gkg] 0021 0101 0089 0040r [gkg] 0059 0283 0249 0112VKr [ ] 104 115 130 076sR [gkg] 0031 0413 0283 0221R [gkg] 0087 1156 0792 0619VKR [ ] 148 469 411 422









9 Bemerkungen

91 Mit den folgenden besonderen Chromatografiebedingungen kann eine bessere Trennung von Tryptophan und α-Methyl-Tryptophan erreicht werden


Isokratische Trennung gefolgt von der Reinigung der Gradientensaumlule

HPLC-Trennsaumlule 125 times 4 mm C18 5 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

Saumlulentemperatur 32 oC

Mobile Phase A 001 moll KH2PO4Methanol 95 + 5 (V+V)

B Methanol

Gradientenprogramm 0 min 100 A 0 B

15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B



92 Die Durchfuumlhrung der Chromatografie variiert je nach Art der HPLC und der verwendeten Saumlulenpackung DasSystem muss so gewaumlhlt werden dass eine Grundlinientrennung zwischen Tryptophan und dem internenStandard moumlglich ist Die Abbauprodukte muumlssen deutlich von Tryptophan und dem internen Standard getrenntwerden Zur Untersuchung der Grundlinie unter dem internen Standard auf Verunreinigungen sind Hydrolysateohne internen Standard zu analysieren Die Laufzeit muss lang genug sein dass alle Abbauprodukte eluiertwerden andernfalls koumlnnen spaumlte Elutionspeaks anschlieszligende Chromatografiedurchgaumlnge beeintraumlchtigen

Im Betriebsbereich muss das Chromatografiesystem eine lineare Reaktion ergeben Die lineare Reaktion ist beieiner konstanten (der normalen) Konzentration des internen Standards und unterschiedlichen Tryptophankon-zentrationen zu messen Die Groumlszlige des Tryptophan- und des internen Standardpeaks muumlssen sich innerhalb deslinearen Bereichs des HPLC-Fluoreszenzsystems befinden Sollten der Tryptophan- undoder der interneStandardpeakdie internen Standardpeaks zu klein oder zu hoch sein ist die Analyse mit einer anderenProbengroumlszlige undoder einem anderen Endvolumen zu wiederholen

93 Bariumhydroxid

Aumllteres Bariumhydroxid ist schwerer loumlslich Dies kann zur Folge haben dass die Loumlsung fuumlr die HPLC-Bestimmung nicht klar ist und zu niedrigen Tryptophan-Werten fuumlhren kann

H BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ROHOumlLEN UND -FETTEN


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Rohoumll- und Rohfettgehalts von Futtermitteln Sie erstreckt sich nichtauf die Analyse von Oumllsaaten und Oumllfruumlchten

Je nach Art und Zusammensetzung des Futtermittels sowie in Abhaumlngigkeit vom Zweck der Untersuchung isteines der beiden nachstehend beschriebenen Verfahren anzuwenden

11 Verfahren A mdash Direkt extrahierbare Rohoumlle und Rohfette

Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen pflanzlicher Herkunft mit Ausnahmederjenigen die in den Anwendungsbereich von Verfahren B fallen

12 Verfahren B mdash Gesamtgehalt an Rohoumllen und Rohfetten

Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen tierischen Ursprungs und bei allenMischfuttermitteln Es ist auszligerdem bei allen Erzeugnissen anzuwenden aus denen Oumlle und Fette ohne vorherigeHydrolyse nicht vollstaumlndig extrahiert werden koumlnnen (z B Kleber Hefen Kartoffeleiweiszlig und Erzeugnisse dieVerfahren unterzogen wurden wie Extrudieren Flockieren und Erhitzen)

13 Auswertung der Ergebnisse

In allen Faumlllen in denen mit Verfahren B ein houmlheres Ergebnis erzielt wird als mit Verfahren A gilt das mitVerfahren B erhaltene Ergebnis als der richtige Wert


2 Prinzip

21 Verfahren A

Die Probe wird mit Petrolether extrahiert Das Loumlsungsmittel wird abdestilliert und der Ruumlckstand getrocknet undgewogen

22 Verfahren B

Die Probe wird unter Erhitzen mit Salzsaumlure behandelt Die Mischung wird abgekuumlhlt und filtriert Dergewaschene und getrocknete Ruumlckstand wird nach Verfahren A weiterbehandelt

3 Reagenzien

31 Petrolether Siedeintervall 40 bis 60 oC Die Bromzahl muss weniger als 1 und der Abdampfruumlckstand weniger als2 mg100 ml betragen

32 Natriumsulfat wasserfrei


34 Filterhilfsmittel z B Kieselgur Hyflo-Supercel

4 Geraumlte

41 Extraktionsapparat Sofern das Geraumlt mit einem Siphon (Soxhletapparat) ausgestattet ist muss die Ruumlckfluss-menge so bemessen sein dass das Loumlsungsmittel mindestens 10-mal in der Stunde ablaumluft Wenn es sich um einGeraumlt ohne Siphon handelt muss die Ruumlckflussmenge etwa 10 mlmin betragen

42 Extraktionshuumllsen Diese muumlssen frei sein von petroletherloumlslichen Stoffen und eine Porositaumlt besitzen die denAnforderungen nach 41 Genuumlge leistet

43 Trockenschrank Vakuumtrockenschrank eingestellt auf 75 oC (plusmn 3 oC) oder Lufttrockenschrank eingestellt auf100 oC (plusmn 3 oC)

5 Verfahren

51 Verfahren A (siehe Bemerkung 81)

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau abgewogen dann in eine Extraktionshuumllse (42) uumlberfuumlhrt und miteinem fettfreien Wattebausch abgedeckt

Die Huumllse wird in einen Extraktionsapparat (41) eingesetzt und 6 h lang mit Petrolether (31) extrahiert DerPetroletherextrakt wird in einem trockenen mit einigen Koumlrnern Bimsstein (1) versehenen tarierten Kolbenaufgefangen

Nach beendeter Extraktion wird das Loumlsungsmittel abdestilliert Anschlieszligend wird der Ruumlckstand mit Kolben15 h im Trockenschrank (43) getrocknet und nach dem Abkuumlhlen in einem Exsikkator gewogen Durch einezweite Trocknung von 30 min Dauer ist zu pruumlfen ob das Gewicht der Oumlle und Fette konstant geblieben ist (derGewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Waumlgungen darf 1 mg nicht uumlberschreiten)

52 Verfahren B

Von der Probe (siehe Bemerkung 82) werden 25 g auf 1 mg genau abgewogen und in ein 400-ml-Becherglasoder einen 300-ml-Erlenmeyerkolben gebracht Anschlieszligend werden 100 ml Salzsaumlure (33) und einige KoumlrnerBimsstein hinzugefuumlgt Das Becherglas wird mit einem Uhrglas abgedeckt bzw dem Erlenmeyerkolben wird einRuumlckflusskuumlhler aufgesetzt Das Gemisch wird auf kleiner Flamme oder auf einer Heizplatte bis zum Siedepunkterhitzt und 1 h schwach sieden gelassen Es ist zu verhindern dass das Material sich an den Waumlnden des Gefaumlszligesfestsetzt

Dann wird abgekuumlhlt und so viel vom Filterhilfsmittel (34) zugesetzt dass beim Filtrieren kein Oumll- bzwFettverlust eintritt Filtriert wird unter Verwendung eines feuchten fettfreien doppelten Filterpapiers DerRuumlckstand wird bis zur neutralen Reaktion mit kaltem Wasser gewaschen Danach ist zu uumlberpruumlfen dass dasFiltrat keine Oumlle und Fette mehr enthaumllt Bei Vorhandensein von Oumllen oder Fetten muss vor der Hydrolyse eineExtraktion der Probe mit Petrolether nach Verfahren A vorgenommen werden


(1) Soll das Oumll oder Fett spaumlter einer Qualitaumltspruumlfung unterzogen werden sind die Bimssteinkoumlrner durch Glasperlen zu ersetzen

Das doppelte Filterpapier mit dem Ruumlckstand ist auf ein Uhrglas zu legen und ca 15 h bei 100 oC (plusmn 3 oC) imLufttrockenschrank (43) zu trocknen

Das doppelte Filterpapier mit dem trockenen Ruumlckstand wird in eine Extraktionshuumllse (42) uumlberfuumlhrt und miteinem fettfreien Wattebausch abgedeckt Die Huumllse wird in einen Extraktionsapparat (41) eingesetzt Dann wirdwie unter 51 Absaumltze 2 und 3 beschrieben weiterverfahren


Das Gewicht des Ruumlckstands wird als Prozentsatz der Probe ausgedruumlckt

7 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen eines Analytikers darf bei ein undderselben Probe die folgenden Werte nicht uumlberschreiten

mdash 02 absolut bei Gehalten an Rohoumllen und -fetten von unter 5

mdash 40 relativ zum houmlchsten Wert bei Gehalten von 5 bis 10

mdash 04 absolut bei Gehalten uumlber 10

8 Bemerkungen

81 Bei Erzeugnissen mit hohem Oumll- und Fettgehalt die schwer zu zerkleinern sind oder sich zur Entnahme einerreduzierten homogenen Probe nicht eignen ist folgendermaszligen zu verfahren

Von der Probe werden 20 g auf 1 mg genau abgewogen und mit 10 g oder mehr wasserfreiem Natrium-sulfat (32) gemischt Dann wird mit Petrolether (31) wie unter 51 beschrieben extrahiert Der dabeiaufgefangene Extrakt wird mit Petrolether (31) auf 500 ml aufgefuumlllt und gemischt Von der Loumlsung werden50 ml entnommen und in einen kleinen trockenen mit Bimssteinkoumlrnchen versehenen und tarierten Kolbengebracht Das Loumlsungsmittel wird abdestilliert und dann wird wie unter 51 letzter Absatz beschriebengetrocknet und weiterverfahren

Der Extraktionsruumlckstand in der Huumllse wird vom Loumlsungsmittel befreit auf 1 mm zerkleinert und wieder zuruumlckin die Extraktionshuumllse gebracht (ohne Zugabe von Natriumsulfat) Dann wird wie unter 51 Absaumltze 2 und 3beschrieben fortgefahren

Der Gehalt an Oumllen und Fetten ausgedruumlckt als Prozentsatz der Probe wird nach folgender Formel berechnet

(10 m1 + m2) times 5

wobei

m1 = Gewicht des Ruumlckstands in g nach der ersten Extraktion (aliquoter Teil des Extrakts)m2 = Gewicht des Ruumlckstands in g nach der zweiten Extraktion

82 Bei oumll- und fettarmen Erzeugnissen kann mit einer Einwaage von 5 g gearbeitet werden

83 Heimtierfutter mit hohem Wassergehalt muss vor der Hydrolyse und Extraktion nach Verfahren B moumlglicher-weise mit wasserfreiem Natriumsulfat gemischt werden

84 Bei dem Verfahren nach 52 kann die Verwendung von heiszligem statt kaltem Wasser zum Waschen desRuumlckstands nach der Filtration moumlglicherweise wirksamer sein

85 Die Trocknungszeit von 15 h muss bei einigen Futtermitteln moumlglicherweise verlaumlngert werden UumlbermaumlszligigesTrocknen ist zu vermeiden da dies zu niedrigen Ergebnissen fuumlhren kann Es kann auch ein Mikrowellengeraumltverwendet werden

86 Bei einem Rohoumll-fettgehalt von mehr als 15 wird vor der Hydrolyse eine Extraktion nach Verfahren A unddanach eine erneute Extraktion nach Verfahren B empfohlen Dies haumlngt zum Teil von der Art des Futtermittelsund der Art des Rohfetts im Futtermittel ab


I BESTIMMUNG DES ROHFASERGEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an saumlure- und alkaliunloumlslichen fettfreien organischenBestandteilen in Futtermitteln herkoumlmmlicherweise als Rohfaser bezeichnet

2 Prinzip

Die gegebenenfalls entfettete Probe wird nacheinander mit kochender Schwefelsaumlureloumlsung und kochenderKaliumhydroxidloumlsung definierter Konzentrationen behandelt Der Ruumlckstand wird durch Filtration auf einemgesinterten Glasfilter getrennt gewaschen getrocknet gewogen und bei 475 bis 500 oC verascht DerGewichtsverlust bei dieser Veraschung entspricht der Rohfaser der Einwaage

3 Reagenzien

31 Schwefelsaumlure c = 013 moll

32 Antischaummittel (z B n-Oktanol)

33 Filterhilfsmittel (Celite 545 oder gleichwertiges Mittel) 4 h auf 500 oC erhitzt (86)

34 Aceton



37 Kaliumhydroxidloumlsung c = 023 moll

4 Geraumlte

41 Heizvorrichtung fuumlr den Aufschluss mit Schwefelsaumlure und Kaliumhydroxidloumlsung ausgestattet mit einerHalterung fuumlr den Glasfiltertiegel (42) und einem Abflussrohr mit Hahn zum Fluumlssigkeitsablauf fuumlr denVakuumanschluss und sofern moumlglich auch mit einem Anschluss fuumlr die Zufuhr von Druckluft Vor dertaumlglichen Inbetriebnahme muss die gesamte Apparatur mit Wasser 5 min erhitzt werden

42 Glasfiltertiegel mit eingeschmolzenem gesintertem Glasfilter (Porengroumlszlige 40 bis 90 μm) Vor dem erstmaligenGebrauch wird der Tiegel einige Minuten bei 500 oC gegluumlht und dann abkuumlhlen gelassen (86)

43 Siedezylinder (mindestens 270 ml) mit einem Ruumlckflusskuumlhler

44 Trockenschrank mit Thermostat

45 Muffelofen mit Thermostat

46 Extraktionsvorrichtung mit einer Halterung fuumlr den Glasfiltertiegel (42) und einem Abflussrohr mit Hahn fuumlrden Fluumlssigkeitsablauf und den Vakuumanschluss

47 Verbindungsringe zur Verbindung von Heizvorrichtung (41) Filtertiegel (42) und Siedezylinder (43)Verbindungsringe zur Verbindung von Kaltextraktionsvorrichtung (46) und Filtertiegel

5 Verfahren

Von der vorbereiteten Probe werden 1 g auf 1 mg genau in den Glasfiltertiegel (42) eingewogen (sieheBemerkungen 81 82 und 83) und es wird 1 g Filterhilfsmittel (33) hinzugefuumlgt

Der Glasfiltertiegel (42) wird in die Heizvorrichtung (41) eingesetzt und mit dem Siedezylinder (43) verbunden150 ml auf Siedetemperatur erhitzte Schwefelsaumlure (31) werden in den mit dem Tiegel verbundenenSiedezylinder uumlberfuumlhrt und es werden erforderlichenfalls einige Tropfen Antischaummittel (32) hinzugefuumlgt

Die Fluumlssigkeit wird innerhalb von 5 plusmn 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min im kraumlftigen Sieden gehalten


Der Hahn im Abflussrohr (41) wird geoumlffnet und die Schwefelsaumlure mithilfe von Vakuum durch denGlasfiltertiegel abgesaugt Der Filterruumlckstand wird 3-mal mit je 30 ml kochendem Wasser gewaschen Nachjedem Waschvorgang ist der Ruumlckstand trocken zu saugen

Der Auslaufhahn wird geschlossen und es werden 150 ml siedende Kaliumhydroxidloumlsung (37) und einigeTropfen Antischaummittel (32) in den mit dem Siedezylinder verbundenen Glasfiltertiegel gegeben DieFluumlssigkeit wird innerhalb von 5 plusmn 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min im kraumlftigen Sieden gehalten DieFiltration und das Waschen des Ruumlckstands werden in der gleichen Weise durchgefuumlhrt wie nach der Behandlungmit Schwefelsaumlure

Nach dem letzten Waschen wird der Ruumlckstand trocken gesaugt und der Tiegel mit Inhalt vom Siedezylindergeloumlst und an die Kaltextraktionsvorrichtung (46) angeschlossen Unter Anlegen von Vakuum wird derRuumlckstand 3-mal mit je 25 ml Aceton (34) gewaschen wobei der Ruumlckstand nach jedem Waschvorgang trockenzu saugen ist

Der Filtertiegel mit Inhalt wird im Trockenschrank bei 130 oC bis zur Massekonstanz getrocknet in einemExsikkator abgekuumlhlt und anschlieszligend rasch gewogen Danach wird der Filtertiegel mit Inhalt in einenMuffelofen gebracht und mindestens 30 min bei einer Temperatur von 475 bis 500 oC bis zur Massekonstanzverascht (der Gewichtsverlust in 2 aufeinanderfolgenden Waumlgungen darf 2 mg nicht uumlberschreiten)

Nach dem Erhitzen wird der Tiegel zunaumlchst im Muffelofen und dann im Exsikkator abgekuumlhlt und anschlieszligendgewogen

Es wird ein Blindversuch ohne Probe durchgefuumlhrt Der beim Veraschen auftretende Gewichtsverlust darf 4 mgnicht uumlberschreiten


Der Gehalt an Rohfaser als Prozentsatz der Probe wird nach folgender Formel berechnet

X =m0 minusm1eth THORN 100

m

wobei

m = Einwaage in g

m0 = Gewichtsverlust nach dem Veraschen waumlhrend der Bestimmung in g

m1 = Gewichtsverlust nach dem Veraschen waumlhrend des Blindversuchs in g

7 Wiederholbarkeit


mdash 06 absolut bei einem Rohfasergehalt von weniger als 10

mdash 6 relativ zum houmlheren Wert bei einem Rohfasergehalt von 10 und mehr

8 Bemerkungen

81 Futtermittel welche mehr als 10 Rohfett enthalten muumlssen vor der Bestimmung mit Petrolether (35) entfettetwerden Dazu wird der Glasfiltertiegel (42) mit Inhalt an die Kaltextraktionsvorrichtung (46) angeschlossen undunter Anlegen von Vakuum 3-mal mit je 30 ml Petrolether gewaschen wobei sichergestellt wird dass derRuumlckstand trocken ist Der Tiegel mit Inhalt wird an die Heizvorrichtung (41) angeschlossen Danach ist gemaumlszlig5 fortzufahren

82 Futtermittel die Fette enthalten welche nicht direkt mit Petrolether (35) extrahiert werden koumlnnen muumlssen wieunter 81 angegeben entfettet werden und nach dem Sieden mit Saumlure ein weiteres Mal entfettet werden Nachdem Sieden mit Saumlure und dem anschlieszligenden Waschvorgang wird der Tiegel mit Inhalt an dieKaltextraktionsvorrichtung (46) angeschlossen und 3-mal mit je 30 ml Aceton und danach weitere 3-mal mitje 30 ml Petrolether entfettet Der Filtertiegel (42) wird trocken gesaugt und die Analyse wie unter 5beschrieben fortgesetzt beginnend mit der Behandlung mit Kaliumhydroxidloumlsung


83 Bei Futtermitteln die mehr als 5 Carbonate ausgedruumlckt als Calciumcarbonat enthalten wird der Tiegel (42)mit der eingewogenen Probemenge an die Heizvorrichtung (41) angeschlossen Die Probe wird 3-mal mit je30 ml Salzsaumlure (36) gewaschen Nach jeder Zugabe wird die Probe vor dem Absaugen etwa 1 min stehengelassen Anschlieszligend wird 1-mal mit 30 ml Wasser gewaschen Danach ist wie unter 5 angegebenfortzufahren

84 Wenn ein Geraumlt benutzt wird bei dem mehrere Glasfiltertiegel an derselben Heizvorrichtung gleichzeitigbefestigt sind duumlrfen 2 Einzelbestimmungen derselben Probe nicht in derselben Untersuchungsreihevorgenommen werden

85 Wenn nach dem Sieden mit Saumlure bzw Lauge Schwierigkeiten bei der Filtration eintreten wird Druckluft durchdas Auslassrohr der Heizvorrichtung zugefuumlhrt und anschlieszligend die Filtration fortgesetzt

86 Die Veraschungstemperatur darf 500 oC nicht uumlberschreiten um die Haltbarkeit der Glasfiltertiegel zu verlaumlngernBeim Erhitzen und Abkuumlhlen sind vor allem uumlbermaumlszligige Temperaturspruumlnge zu vermeiden

J BESTIMMUNG DES ZUCKERGEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern und des Gesamtzuckers nachInversion ausgedruumlckt als Glucose oder gegebenenfalls nach Multiplikation mit dem Faktor 095 als SaccharoseSie wird bei Mischfuttermitteln angewendet Fuumlr andere Futtermittel sind besondere Verfahren vorgesehenGegebenenfalls muss der Gehalt an Lactose getrennt bestimmt und dieses Ergebnis bei der Berechnungberuumlcksichtigt werden

2 Prinzip

Die Zucker werden in verduumlnntem Ethanol geloumlst die Loumlsung wird mit den Loumlsungen Carrez I und II geklaumlrtNach dem Verdunsten des Ethanols werden vor und nach der Inversion die Bestimmungen nach der Luff-Schoorl-Methode durchgefuumlhrt

3 Reagenzien

31 Ethanolloumlsung (Volumenkonzentration = 40 ) Dichte 0948 gml bei 20 oC auf den Umschlagspunkt vonPhenolphthalein eingestellt

32 Carrez-Loumlsung I 219 g Zinkacetat Zn(CH3COO)22H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser geloumlst und mitWasser auf 100 ml aufgefuumlllt

33 Carrez-Loumlsung II 106 g Kaliumhexacyanoferrat (II) K4Fe(CN)63H2O werden in Wasser geloumlst und mit Wasserauf 100 ml aufgefuumlllt

34 Methylorangeloumlsung (Massenkonzentration = 01 )

35 Salzsaumlure 4 moll


37 Natriumhydroxidloumlsung 01 moll

38 Reagenz nach Luff-Schoorl

Die Zitronensaumlureloumlsung (382) ist unter vorsichtigem Ruumlhren in die Natriumcarbonatloumlsung (383) zu gieszligenNach Zugabe der Kupfersulfatloumlsung (381) ist mit Wasser auf 1 l aufzufuumlllen Uumlber Nacht absetzen lassen unddann filtrieren

Die Konzentration des so erhaltenen Reagenz (Cu 005 moll Na2CO3 1 moll) muss gepruumlft werden siehe 54letzter Absatz Der pH-Wert der Loumlsung muss bei etwa 94 liegen

381 Kupfersulfatloumlsung 25 g Kupfersulfat CuSO45H2O eisenfrei werden in 100 ml Wasser geloumlst


382 Zitronensaumlureloumlsung 50 g Zitronensaumlure C6H8O7H2O werden in 50 ml Wasser geloumlst

383 Natriumcarbonatloumlsung 1438 g Natriumcarbonat wasserfrei werden in ca 300 ml warmem Wasser geloumlst DieLoumlsung wird abkuumlhlen gelassen

39 Natriumthiosulfatloumlsung 01 moll

310 Staumlrkeloumlsung eine Aufschlaumlmmung von 5 g loumlslicher Staumlrke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasserhinzugefuumlgt und 3 min lang im Sieden gehalten dann wird abkuumlhlen gelassen und gegebenenfalls 10 mgQuecksilberiodid als Konservierungsmittel hinzugefuumlgt

311 Schwefelsaumlure 3 moll

312 Kaliumiodidloumlsung (Massenkonzentration = 30 )

313 Bimssteinkoumlrner mit Salzsaumlure ausgekocht mit Wasser gewaschen und getrocknet

314 3-Methylbutan-1-ol

4 Geraumlte

Mechanisches Schuumlttelgeraumlt ca 35 bis 40 min-1

5 Verfahren

51 Extraktion der Probe

Von der Probe werden 25 g auf 1 mg genau in einen 250-ml-Messkolben eingewogen Nach Zugabe von 200 mlEthanol (31) wird der Kolben 1 h lang im Schuumlttelgeraumlt gemischt Anschlieszligend werden 5 ml Carrez-LoumlsungI (32) hinzugefuumlgt und es wird ca 30 s lang geruumlhrt Dann werden 5 ml Carrez-Loumlsung II (33) hinzugefuumlgt und1 min lang geruumlhrt nun wird mit Ethanol (31) zur Marke aufgefuumlllt homogenisiert und filtriert Vom Filtratwerden 200 ml abpipettiert und auf ungefaumlhr die Haumllfte des Volumens eingeengt um den groumlszligten Teil desEthanols zur Verdunstung zu bringen Der Abdampfruumlckstand wird mit warmem Wasser in einen 200-ml-Messkolben uumlbergespuumllt abgekuumlhlt mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt homogenisiert und falls erforderlichfiltriert Diese Loumlsung wird fuumlr die Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern und nach Inversion zurBestimmung des Gesamtzuckers verwendet

52 Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern

Eine Menge von houmlchstens 25 ml der Loumlsung die weniger als 60 mg reduzierende Zucker ausgedruumlckt alsGlucose enthaumllt wird abpipettiert falls erforderlich mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefuumlllt und der Gehaltan reduzierendem Zucker nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt Das Ergebnis wird als Prozentsatz Glucosein der Probe ausgedruumlckt

53 Bestimmung des Gehalts an Gesamtzucker nach Inversion

Von der Loumlsung werden 50 ml in einen 100-ml-Messkolben pipettiert einige Tropfen Methylorangeloumlsung (34)hinzugefuumlgt und dann vorsichtig unter staumlndigem Ruumlhren Salzsaumlure (35) bis zum eindeutigen Umschlag nachRot hinzugegeben Dann werden 15 ml Salzsaumlure (36) hinzugefuumlgt und der Kolben wird 30 min lang in ein Badmit kraumlftig siedendem Wasser gestellt dann schnell auf die Temperatur von etwa 20 oC abgekuumlhlt und 15 mlNatriumhydroxidloumlsung (37) hinzugegeben Der Kolben wird mit Wasser auf 100 ml aufgefuumlllt geschuumlttelt undeine Menge von houmlchstens 25 ml entnommen die weniger als 60 mg reduzierende Zucker ausgedruumlckt alsGlucose enthaumllt Falls erforderlich wird mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefuumlllt und der Gehalt anreduzierenden Zuckern nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt Das Ergebnis wird als Prozentsatz Glucoseoder gegebenenfalls nach Multiplikation mit dem Faktor 095 als Saccharose ausgedruumlckt

54 Titration nach Luff-Schoorl

In einen 300-ml-Erlenmeyerkolben werden 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (38) pipettiert und anschlieszligendgenau 25 ml der geklaumlrten Zuckerloumlsung hinzugefuumlgt Nach Zugabe von 2 Koumlrnchen Bimsstein (313) wird unterSchuumltteln mit der Hand uumlber freier Flamme von mittlerer Houmlhe erhitzt so dass die Fluumlssigkeit in etwa 2 min zumSieden kommt Anschlieszligend wird der Erlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe in dieein Loch von etwa 6 cm Durchmesser gestanzt wurde gestellt vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flammeentzuumlndet und so eingestellt dass der Kolben nur am Boden erhitzt wird Dann wird der Kolben mit einemRuumlckflusskuumlhler verbunden Von diesem Augenblick an wird der Kolben genau 10 min sieden gelassen undanschlieszligend sofort in kaltem Wasser abgekuumlhlt Nach etwa 5 min wird wie folgt titriert


Der Fluumlssigkeit werden 10 ml Kaliumiodidloumlsung (312) und unmittelbar danach aber vorsichtig (wegen derGefahr des uumlbermaumlszligigen Schaumlumens) 25 ml Schwefelsaumlure (311) zugegeben Dann wird mit Natriumthiosulfat-loumlsung (39) zunaumlchst bis zum Auftreten einer mattgelben Farbe titriert und nach Zugabe von Staumlrkeloumlsung(310) als Indikator die Titration zu Ende gefuumlhrt

Die gleiche Titration wird in einer Mischung aus genau 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (38) und 25 ml Wassernach Zugabe von 10 ml Kaliumiodidloumlsung (312) und 25 ml Schwefelsaumlure (311) durchgefuumlhrt jedoch ohnevorheriges Erhitzen


Aus der unten angefuumlhrten Tabelle wird die Menge Glucose in mg abgelesen die der Differenz der Ergebnissebeider Titrationen ausgedruumlckt in ml Natriumthiosulfatloumlsung (01 moll) entspricht Das Ergebnis wird alsProzentsatz der Probe angegeben

7 Sonderverfahren

71 Bei sehr stark melassehaltigen Futtermitteln und anderen wenig homogenen Futtermitteln werden 20 g in einen1-l-Messkolben eingewogen 500 ml Wasser hinzugefuumlgt und 1 h lang im Schuumlttelgeraumlt gemischt Danach wirdmdash jedoch mit jeweils der 4-fachen Menge der Carrez-Loumlsungen I (32) und II (33) mdash wie unter 51 beschriebengeklaumlrt Anschlieszligend wird mit Ethanol (Volumenkonzentration = 80 ) zur Marke aufgefuumlllt

Die Loumlsung wird homogenisiert und filtriert Das Ethanol wird wie unter 51 beschrieben entfernt BeiAbwesenheit verkleisterter Staumlrke wird mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt

72 Bei Melasse und Futtermittel-Ausgangserzeugnissen die reich an Zucker aber praktisch staumlrkefrei sind(Johannisbrot Zuckerruumlbentrockenschnitzel usw) werden 5 g in einen 250-ml-Messkolben eingewogen und200 ml destilliertes Wasser hinzugefuumlgt Dann wird 1 h lang oder falls erforderlich laumlnger im Schuumlttelgeraumltgemischt Danach wird mit den Carrez-Loumlsungen I (32) und II (33) wie unter 51 beschrieben geklaumlrt undanschlieszligend mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt homogenisiert und filtriert Zur Bestimmung des Gesamtzucker-gehalts wird wie unter 53 beschrieben verfahren

8 Bemerkungen

81 Es wird empfohlen vor dem Erhitzen mit dem Luff-Schoorl-Reagenz (unabhaumlngig vom Volumen) etwa 1 ml 3-Methylbutan-1-ol (314) hinzuzufuumlgen um die Schaumbildung zu vermeiden

82 Die Differenz zwischen dem Gehalt an Gesamtzucker nach Inversion ausgedruumlckt als Glucose und dem Gehaltan reduzierenden Zuckern ausgedruumlckt als Glucose ergibt nach Multiplikation mit dem Faktor 095 das Ergebnisals Prozentsatz Saccharose

83 Zur Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern mit Ausnahme von Milchzucker (Lactose) gibt es 2Moumlglichkeiten

831 Fuumlr eine annaumlhernde Berechnung wird der aus einer getrennten Bestimmung ermittelte Lactosegehalt mit 0675multipliziert und das Ergebnis von dem Gehalt an reduzierenden Zuckern abgezogen

832 Fuumlr eine genaue Berechnung der reduzierenden Zucker (mit Ausnahme von Lactose) ist es notwendig dass beidenendguumlltigen Bestimmungen die gleiche Menge der Einwaage zugrunde liegt Die eine Bestimmung wird in einemTeil der nach 51 hergestellten Loumlsung durchgefuumlhrt die zweite Bestimmung in einem Teil der Loumlsung die bei derBestimmung des Lactosegehalts mittels der fuumlr diesen Zweck vorgesehenen Methode (nach Vergaumlrung deranderen Zuckerarten und Klaumlrung) hergestellt wird

In beiden Faumlllen wird der anwesende Zucker nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt und in mg Glucoseberechnet Diese beiden Werte werden voneinander subtrahiert und die Differenz wird als Prozentsatz der Probeausgedruumlckt

Beispiel

Die beiden abpipettierten Mengen entsprechen bei jeder Bestimmung einer Probeneinwaage von 250 mg

Im ersten Fall werden 17 ml Natriumthiosulfatloumlsung 01 moll entsprechend 442 mg Glucose verbraucht imzweiten Fall werden 11 ml entsprechend 276 mg Glucose verbraucht

Die Differenz betraumlgt also 166 mg Glucose

Der Gehalt an reduzierenden Zuckern (mit Ausnahme von Lactose) berechnet als Glucose ist demnach

4 16610

= 664


Tabelle fuumlr 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl

ml Na2 S2 O3 01 moll 2 min erhitzen 10 min sieden

Na2 S2 O3

01 moll

Glucose Fructose Invert-zucker

C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll

ml mg Differenz mg Differenz Mg Differenz ml

1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223

K BESTIMMUNG DES LACTOSEGEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Lactosegehalts von Futtermitteln die mehr als 05 Lactose enthalten

2 Prinzip

Die Zucker werden in Wasser geloumlst Die Loumlsung wird mit Hefe mdash Saccharomyces cerevisiae mdash vergoren wobei dieLactose nicht angegriffen wird Nach Klaumlrung und Filtration wird der Gehalt an Lactose im Filtrat nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt

3 Reagenzien

31 Saccharomyces-cerevisiae-Suspension 25 g frische Hefe werden in 100 ml Wasser suspendiert Im Kuumlhlschrank istdie Suspension houmlchstens 1 Woche haltbar

32 Carrez-Loumlsung I 219 g Zinkacetat Zn (CH3COO)22H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser geloumlst und mitWasser auf 100 ml aufgefuumlllt



Die Zitronensaumlureloumlsung (342) wird unter vorsichtigem Ruumlhren in die Natriumcarbonatloumlsung (343) gegossenNach Zugabe der Kupfersulfatloumlsung (341) wird auf 1 l mit Wasser aufgefuumlllt Uumlber Nacht absetzen lassen unddann filtrieren Die Konzentration des so erhaltenen Reagenz (Cu 005 moll Na2CO3 1 moll) muss gepruumlftwerden Der pH-Wert muss bei etwa 94 liegen









39 Staumlrkeloumlsung Eine Aufschlaumlmmung von 5 g loumlslicher Staumlrke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasserhinzugefuumlgt und 3 min lang im Sieden gehalten dann wird abgekuumlhlt und gegebenenfalls 10 mgQuecksilberiodid als Konservierungsmittel hinzugefuumlgt

4 Geraumlte

Wasserbad mit Thermostat auf 38 bis 40 oC eingestellt

5 Verfahren

Von der Probe wird 1 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 25 bis 30 ml Wasser in einen 100-ml-Messkolbengebracht Der Messkolben wird 30 min lang in ein Bad mit siedendem Wasser gestellt und auf eine Temperaturvon etwa 35 oC abgekuumlhlt Anschlieszligend werden 5 ml Hefesuspension (31) zugefuumlgt Dann wird der Kolbengeschuumlttelt 2 h lang in einem Wasserbad bei 38 bis 40 oC stehen gelassen und auf etwa 20 oC abgekuumlhlt

Danach werden 25 ml Carrez-Loumlsung I (32) hinzugefuumlgt und es wird 30 s lang geruumlhrt Dann werden 25 mlCarrez-Loumlsung II (33) hinzugefuumlgt und es wird nochmals 30 s lang geruumlhrt Nun wird mit Wasser auf 100 mlaufgefuumlllt gemischt und filtriert Vom Filtrat wird eine Menge von houmlchstens 25 ml die moumlglichst 40 bis 80 mgLactose enthaumllt in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben abpipettiert Gegebenenfalls wird mit Wasser auf 25 mlaufgefuumlllt

Auf dieselbe Weise wird ein Blindversuch mit 5 ml Hefesuspension (31) ausgefuumlhrt Dann wird der Gehalt anLactose nach der Luff-Schoorl-Methode wie folgt bestimmt Nach Zugabe von genau 25 ml des Reagenz nachLuff-Schoorl (34) und von 2 Koumlrnchen Bimsstein (35) wird unter Schuumltteln mit der Hand uumlber freier Flammevon mittlerer Houmlhe erhitzt so dass die Fluumlssigkeit in etwa 2 min zum Sieden kommt Anschlieszligend wird derErlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe in die ein Loch von etwa 6 cm Durchmessergestanzt wurde gestellt vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flamme entzuumlndet und so eingestellt dass derKolben nur am Boden erhitzt wird Dann wird der Kolben mit einem Ruumlckflusskuumlhler verbunden Von diesemAugenblick an wird der Kolben genau 10 min sieden gelassen und anschlieszligend sofort in kaltem Wasserabgekuumlhlt Nach etwa 5 min wird wie folgt titriert

Zu der Fluumlssigkeit werden 10 ml Kaliumiodidloumlsung (36) und unmittelbar danach aber vorsichtig (wegen derGefahr des uumlbermaumlszligigen Schaumlumens) 25 ml Schwefelsaumlure (37) hinzugegeben Dann wird mit Natriumthio-sulfatloumlsung (38) zunaumlchst bis zum Auftreten einer mattgelben Farbe titriert und nach Zugabe von Staumlrkeloumlsung(39) als Indikator die Titration zu Ende gefuumlhrt



Aus der unten angefuumlhrten Tabelle wird die Menge Lactose in mg abgelesen die der Differenz der Ergebnissebeider Titrationen ausgedruumlckt in ml Natriumthiosulfatloumlsung (01 moll) entspricht

Das Ergebnis entspricht dem Gehalt an wasserfreier Lactose und wird als Prozentsatz der Probe ausgedruumlckt

7 Bemerkung

Wenn mehr als 40 vergaumlrbare Zucker vorhanden sind werden mehr als 5 ml Hefesuspension (31) verwendet




Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223

L BESTIMMUNG DES STAumlRKEGEHALTS

POLARIMETRISCHES VERFAHREN


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Staumlrke und ihrer Abbauprodukte mit hoher Molmasse inFuttermitteln zum Zweck der Pruumlfung ihrer Uumlbereinstimmung mit dem angegebenen Energiegehalt (Anhang VII)und mit der Richtlinie 9625EG des Rates (1)

2 Prinzip

Die Methode basiert auf einer doppelten Bestimmung Bei der ersten Bestimmung wird die Probe mit verduumlnnterSalzsaumlure behandelt Nach Klaumlrung und Filtration wird die optische Drehung der Loumlsung polarimetrischgemessen

Bei der zweiten Bestimmung wird die Probe mit 40 igem Ethanol extrahiert Nach Behandlung des Filtrats mitSalzsaumlure wird geklaumlrt filtriert und die optische Drehung unter den gleichen Bedingungen wie bei der erstenBestimmung gemessen

Der Unterschied zwischen den beiden Messungen multipliziert mit einem bekannten Faktor ergibt denStaumlrkegehalt der Probe

3 Reagenzien

31 Salzsaumlure Loumlsung (Massenanteil = 25 ) Dichte 1126 gml


(1) ABl L 125 vom 2351996 S 35

32 Salzsaumlure Loumlsung (Massenkonzentration = 113 )

Die Konzentration muss durch Titration mit Natriumhydroxidloumlsung (01 moll) in Gegenwart von Methylrot(Massenkonzentration = 01 ) in Ethanol (Volumenkonzentration = 94 ) gepruumlft werden Fuumlr dieNeutralisierung von 10 ml werden 3094 ml NaOH (01 moll) benoumltigt



35 Ethanol Loumlsung (Volumenkonzentration = 40 ) Dichte 0948 gml bei 20 oC

4 Geraumlte

41 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen und Ruumlckflusskuumlhler

42 Polarimeter oder Saccharimeter

5 Verfahren


Die Probe muss so fein gemahlen werden dass sie vollstaumlndig durch ein Rundlochsieb mit einemLochdurchmesser von 05 mm passiert werden kann

52 Bestimmung der gesamten optischen Drehung (P oder S) (siehe Bemerkung 71)

Von der Probe werden 25 g auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und 25 ml Salzsaumlure (32)hinzugefuumlgt Der Kolben wird geschuumlttelt bis sich der Stoff gleichmaumlszligig verteilt hat dann werden weitere 25 mlSalzsaumlure (32) hinzugegeben Der Kolben wird in ein Bad mit kochendemWasser gestellt und waumlhrend der ersten3 min kraumlftig und regelmaumlszligig geschuumlttelt um die Bildung von Klumpen zu verhindern Die in dem Wasserbadenthaltene Wassermenge muss ausreichen um das Wasser auch dann noch uumlber dem Siedepunkt zu halten wennder Kolben eingetaucht wird Waumlhrend des Schuumlttelns darf der Kolben nicht aus dem Wasser herausgenommenwerden Nach genau 15 min wird der Kolben aus dem Wasserbad entfernt 30 ml kaltes Wasser hinzugefuumlgt undunverzuumlglich auf 20 oC abgekuumlhlt

Danach werden 5 ml Carrez-Loumlsung I (33) hinzugefuumlgt und es wird ca 30 s lang geschuumlttelt Anschlieszligendwerden 5 ml Carrez-Loumlsung II (34) hinzugefuumlgt und es wird nochmals 30 s geschuumlttelt Dann wird mit Wasserzur Marke aufgefuumlllt gemischt und filtriert Ist das Filtrat nicht vollstaumlndig klar (was selten vorkommt) muss dieBestimmung mit groumlszligeren Mengen Carrez-Loumlsungen I und II z B 10 ml wiederholt werden

Anschlieszligend wird die optische Drehung der Loumlsung in einem 200-mm-Rohr mit einem Polarimeter oder einemSaccharimeter gemessen

53 Bestimmung der optischen Drehung (P oder S) der in 40 igem Ethanol loumlslichen Substanzen

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und etwa 80 ml Ethanol(35) hinzugefuumlgt (siehe Bemerkung 72) Anschlieszligend wird der Kolben 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassenund waumlhrenddessen 6-mal kraumlftig geschuumlttelt damit sich die Testprobe gruumlndlich mit dem Ethanol vermischtDann wird mit Ethanol (35) zur Marke aufgefuumlllt geschuumlttelt und filtriert

Von dem Filtrat werden 50 ml (= 25 g der Probe) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben abpipettiert und 21 mlSalzsaumlure (31) hinzugefuumlgt der Kolben wird kraumlftig geschuumlttelt an einen Ruumlckflusskuumlhler angeschlossen und inein Bad mit siedendem Wasser gestellt Nach genau 15 min wird der Erlenmeyerkolben aus dem Wasserbadherausgenommen und der Inhalt in einen 100-ml-Messkolben mit einer kleinen Menge von kaltem Wasseruumlberspuumllt anschlieszligend wird auf eine Temperatur von 20 oC abgekuumlhlt

Danach wird mit den Carrez-Loumlsungen I (33) und II (34) geklaumlrt mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt geschuumltteltund filtriert und die optische Drehung gemessen wie unter 52 zweiter und dritter Absatz beschrieben


Der Staumlrkegehalt () wird wie folgt berechnet

61 Polarimetrische Messung

Staumlrkegehalt ethTHORN =2 000 P minus P0eth THORN

αfrac12 20degD

P = Optische Drehung insgesamt in Winkelgrad


P = Optische Drehung in Winkelgrad der in 40 igem Ethanol loumlslichen Substanzen

αfrac12 20degD= Spezifische optische Drehung von reiner Staumlrke Fuumlr diesen Faktor D werden die nachstehenden

allgemein anerkannten Werte angewendet

+ 1859o Reisstaumlrke+ 1857o Kartoffelstaumlrke+ 1846o Maisstaumlrke+ 1827o Weizenstaumlrke+ 1815o Gerstenstaumlrke+ 1813o Haferstaumlrke+ 1840o sonstige Staumlrkearten sowie Staumlrkegemische in Mischfuttermitteln

62 Saccharimetrische Messung

Staumlrkegehalt ethTHORN =2 000

αfrac12 20degD

2 N 0665eth THORN S minus S0eth THORN100

minus266 N S minus S0eth THORN

αfrac12 20degD

S = Optische Drehung insgesamt in Saccharimeter-Grad

S = Optische Drehung in Saccharimeter-Grad der in 40 igem Ethanol loumlslichen SubstanzenN = Gewicht (g) von Saccharose in 100 ml Wasser das bei Messung mit einem 200-mm-Rohr eine optische

Drehung von 100 Saccharimeter-Grad bewirkt1629 g fuumlr die franzoumlsischen Saccharimeter2600 g fuumlr die deutschen Saccharimeter2000 g fuumlr gemischte Saccharimeter

αfrac12 20degD= Spezifische optische Drehung von reiner Staumlrke (siehe 61)

63 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 04 (absolut) bei Staumlrkegehalten von weniger als 40 und 1 (relativ) bei Staumlrkegehalten von 40 und mehr nichtuumlberschreiten

7 Bemerkungen

71 Enthaumllt die Probe mehr als 6 Carbonate berechnet als Calciumcarbonat so muumlssen diese vor der Bestimmungder gesamten optischen Drehung durch Behandlung mit der genau notwendigen Menge verduumlnnterSchwefelsaumlure zerstoumlrt werden

72 Bei Erzeugnissen mit hohem Lactosegehalt z B bei Molkenpulver oder Magermilchpulver wird nach Zusatz von80 ml Ethanol (35) wie folgt verfahren Der Messkolben wird an einen Ruumlckflusskuumlhler angeschlossen und30 min lang in ein Wasserbad von 50 oC gestellt Nach dem Abkuumlhlen wird das Verfahren wie unter 53beschrieben fortgefuumlhrt

73 Folgende Futtermittel-Ausgangserzeugnisse fuumlhren sofern sie in groumlszligeren Mengen in Futtermitteln vorhandensind erwiesenermaszligen zu Interferenzen bei der Bestimmung des Staumlrkegehalts durch das polarimetrischeVerfahren und koumlnnten so falsche Ergebnisse zur Folge haben

mdash (Zucker-)Ruumlbenerzeugnisse wie (Zucker-)Ruumlbenschnitzel (Zucker-) Ruumlbenmelasse (Zucker-)Ruumlbenmelasse-schnitzel (Zucker-)Ruumlbenvinasse (Ruumlben-)Zucker

mdash Zitrustrester

mdash Leinsamen Leinkuchen Leinextraktionsschrot

mdash Rapssamen Rapskuchen Rapsextraktionsschrot Rapsschalen

mdash Sonnenblumenkerne Sonnenblumenextraktionsschrot Sonnenblumenextraktionsschrot aus teilgeschaumllterSaat

mdash Kokoskuchen Kokosextraktionsschrot

mdash Kartoffelpuumllpe

mdash Trockenhefe


mdash Erzeugnisse mit hohem Inulingehalt (z B Topinambur-Chips und -Mehl)

mdash GriebenGrammeln

M BESTIMMUNG DES ROHASCHEGEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Rohaschegehalts von Futtermitteln

2 Prinzip

Die Probe wird bei 550 oC verascht der Ruumlckstand wird gewogen

3 Reagenzien

Ammoniumnitrat Loumlsung (Massenkonzentration = 20 )

4 Geraumlte

41 Heizplatte

42 Elektrischer Muffelofen mit Thermostat

43 Veraschungsschale aus Quarzglas Porzellan oder Platin entweder rechteckig (ca 60 times 40 times 25 mm) oder rund(Durchmesser 60 bis 75 mm Houmlhe 20 bis 40 mm)

5 Verfahren

Etwa 5 g (25 g bei Stoffen die zur Blasenbildung neigen) der Probe werden auf 1 mg genau in eine vorher bei550 oC gegluumlhte abgekuumlhlte und tarierte Veraschungsschale eingewogen Die Schale wird auf der Heizplatteallmaumlhlich bis zum Verkohlen des Stoffes erhitzt Die Veraschung erfolgt gemaumlszlig 51 oder 52

51 Die Schale wird in den auf 550 oC eingestellten Muffelofen gebracht und darin bei dieser Temperatur so langegehalten bis sich eine weiszlige hellgraue oder roumltliche Asche bildet die offensichtlich frei von Kohlepartikeln istDann wird die Schale in einen Exsikkator gestellt und unmittelbar nach dem Abkuumlhlen gewogen

52 Die Schale wird 3 h lang in den auf 550 oC eingestellten Muffelofen gebracht Dann wird die Schale in einenExsikkator gestellt und unmittelbar nach dem Abkuumlhlen gewogen Anhand einer zweiten Veraschung von 30 minist zu pruumlfen ob das Gewicht der Asche konstant geblieben ist (der Gewichtsverlust zwischen 2aufeinanderfolgenden Waumlgungen darf 1 mg nicht uumlberschreiten)


Das Gewicht des Ruumlckstands wird berechnet indem das Leergewicht abgezogen wird


7 Bemerkungen

71 Bei schwer zerstoumlrbaren Stoffen werden der abgekuumlhlten Rohasche nach einer ersten Veraschung von mindestens 3 heinige Tropfen 20 iger Ammoniumnitratloumlsung oder Wasser zugefuumlgt (jedoch vorsichtig um ein Zerstaumlubenoder Verkleben der Asche zu vermeiden) Nach Trocknung im Trockenschrank wird die Veraschungweitergefuumlhrt Der Vorgang wird gegebenenfalls bis zur vollstaumlndigen Veraschung wiederholt

72 Bei Stoffen die der unter 71 beschriebenen Behandlung widerstehen ist wie folgt vorzugehen Nach einer Veraschungvon 3 h wird die Asche mit warmem Wasser aufgenommen und durch einen kleinen aschefreien Filter abfiltriertIn der urspruumlnglichen Schale werden Filter und dessen Inhalt verascht Das Filtrat wird in die abgekuumlhlte Schalegebracht bis zur Trockne eingedampft verascht und gewogen


73 Bei Oumllen und Fetten wird eine Probe von 25 g in eine Schale entsprechender Abmessung genau eingewogen Eswird dann durch Anzuumlnden des Stoffes mit einem Streifen aus aschefreiem Filterpapier verkohlt Nach derVerkohlung wird mit moumlglichst geringer Menge Wasser angefeuchtet Anschlieszligend wird getrocknet und dieVeraschung wie unter 5 beschrieben zu Ende gefuumlhrt

N BESTIMMUNG DES GEHALTS AN IN SALZSAumlURE UNLOumlSLICHER ASCHE


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an in Salzsaumlure unloumlslichen mineralischen Bestandteilen vonFuttermitteln Abhaumlngig von der Art der Probe sind 2 Verfahren vorgesehen

11 Verfahren A anzuwenden bei organischen Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und bei den meisten Misch-futtermitteln

12 Verfahren B anzuwenden bei Mineralstoffen und Mineralstoffmischungen sowie bei allen Mischfuttermittelnderen Gehalt an in Salzsaumlure unloumlslicher Asche bei der Bestimmung nach Verfahren A mehr als 1 betraumlgt

2 Prinzip

21 Verfahren A Die Probe wird verascht Die Asche wird in Salzsaumlure zum Sieden gebracht und der unloumlslicheRuumlckstand abfiltriert und gewogen

22 Verfahren B Die Probe wird mit Salzsaumlure behandelt Die Loumlsung wird abfiltriert der Ruumlckstand wird veraschtund die so erhaltene Asche nach Verfahren A weiterbehandelt

3 Reagenzien


32 Trichloressigsaumlure Loumlsung (Massenkonzentration = 20 )


4 Geraumlte

41 Heizplatte


43 Veraschungsschalen aus Quarzglas Porzellan oder Platin entweder rechteckig (ca 60 times 40 times 25 mm) oder rund(Durchmesser 60 bis 75 mm Houmlhe 20 bis 40 mm)

5 Verfahren

51 Verfahren A

Die Einwaage wird unter den Bedingungen die fuumlr die Bestimmung des Rohaschegehalts beschrieben sindverascht Es kann auch die bei dieser Analyse erhaltene Asche verwendet werden

Die Asche wird zusammen mit 75 ml Salzsaumlure (31) in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Inhalt uumlberfuumlhrt Eswird vorsichtig zum Sieden erhitzt und 15 min weiter in schwachem Sieden gehalten Die warme Loumlsung wirddurch einen aschefreien Papierfilter filtriert und der Ruumlckstand mit warmem Wasser bis zum Ausbleiben dersauren Reaktion ausgewaschen Der Filter mit dem Ruumlckstand wird nach dem Trocknen bei einer Temperatur vonmindestens 550 oC und houmlchstens 700 oC in einer tarierten Veraschungsschale verascht und anschlieszligend imExsikkator gekuumlhlt und gewogen

52 Verfahren B

Von der Analysenprobe werden 5 g auf 1 mg genau in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Fassungsvermoumlgeneingewogen Dann werden nacheinander 25 ml Wasser und 25 ml Salzsaumlure (31) zugegeben gemischt und eswird bis zum Nachlassen des Aufbrausens gewartet Zuletzt werden weitere 50 ml Salzsaumlure (31) zugegebenNach dem Nachlassen der eventuell erneut auftretenden Gasentwicklung wird das Becherglas 30 min lang oderwenn notwendig laumlnger in ein siedendes Wasserbad gestellt bis die vollstaumlndige Hydrolyse eventuell


vorhandener Staumlrke eingetreten ist Es wird warm durch einen aschefreien Filter filtriert Der Filter wird mit etwa50 ml warmem Wasser ausgewaschen (siehe Bemerkung 7) Anschlieszligend wird der Filter mit Ruumlckstand in eineVeraschungsschale gestellt getrocknet und bei einer Temperatur von mindestens 550 oC und houmlchstens 700 oCverascht Die Asche wird mit 75 ml Salzsaumlure (31) in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Fassungsvermoumlgenuumlberfuumlhrt und anschlieszligend wie unter 51 zweiter Absatz beschrieben weiterbehandelt


Das Gewicht des Ruumlckstands wird berechnet indem das Leergewicht abgezogen wird Das Ergebnis ist alsProzentsatz der Probe auszudruumlcken

7 Bemerkung

Treten bei der Filtration Schwierigkeiten auf so wird die Bestimmung wiederholt Hierbei werden anstelle von50 ml Salzsaumlure (31) 50 ml 20 iger Trichloressigsaumlureloumlsung (32) zugegeben der Filter wird mit einer warmen1 igen Trichloressigsaumlureloumlsung (33) ausgewaschen

O BESTIMMUNG DES GEHALTS AN CARBONATEN


Die Methode erlaubt es in den meisten Futtermitteln den Gehalt an Carbonaten herkoumlmmlicherweise alsCalciumcarbonat bezeichnet zu bestimmen

In bestimmten Faumlllen (z B bei Eisencarbonat) ist jedoch eine besondere Methode anzuwenden

2 Prinzip

Die Carbonate werden mit Salzsaumlure zersetzt die frei gewordene Kohlensaumlure wird in einem graduierten Rohraufgefangen Das erhaltene Gasvolumen wird mit demjenigen verglichen welches unter den gleichenBedingungen von einer bekannten Menge Calciumcarbonat freigesetzt wird

3 Reagenzien

31 Salzsaumlure Dichte 110 gml

32 Calciumcarbonat

33 Schwefelsaumlure etwa 005 moll mit Methylrot angefaumlrbt

4 Geraumlte

Apparatur nach Scheibler-Dietrich (siehe Skizze) oder gleichwertiges Geraumlt

5 Verfahren

Je nach dem Carbonatgehalt der Probe wird eine Einwaage wie folgt eingewogen

mdash 05 g bei Erzeugnissen mit einem Anteil von 50 bis 100 Carbonaten ausgedruumlckt als Calciumcarbonat


mdash 2 bis 3 g bei anderen Erzeugnissen

Die Einwaage wird in die Spezialflasche (4) der Apparatur gebracht die mit einem Roumlhrchen ausunzerbrechlichem Material versehen ist das 10 ml Salzsaumlure (31) enthaumllt Anschlieszligend wird die Flasche andie Apparatur angeschlossen Dann wird der Drei-Weg-Hahn (5) so gedreht dass das Rohr (1) mit der Auszligenluftin Verbindung steht Mit dem beweglichen Rohr (2) das mit angefaumlrbter Schwefelsaumlure (33) gefuumlllt und mit demgraduierten Rohr (1) verbunden ist wird das Niveau der Fluumlssigkeit auf den Nullpunkt der Skala eingestellt DerHahn (5) wird so gedreht dass das Rohr (1) mit dem Rohr (3) verbunden ist Anschlieszligend wird der Nullpunktkontrolliert


Die Salzsaumlure (31) wird durch Kippen der Flasche (4) langsam uumlber die Einwaage laufen gelassen DurchAbsenken des beweglichen Rohrs (2) wird der Druck ausgeglichen Die Flasche (4) wird so lange hin und herbewegt bis die Kohlensaumlureentwicklung ganz aufgehoumlrt hat

Der Druckausgleich erfolgt indem die Fluumlssigkeit in den Rohren (1) und (2) wieder auf gleiches Niveau gebrachtwird Nach einigen Minuten mdash sobald das Volumen konstant ist mdash kann abgelesen werden

Es ist ein Vergleichsversuch mit 05 g Calciumcarbonat (32) unter denselben Bedingungen durchzufuumlhren


Der Gehalt an Carbonaten ausgedruumlckt als Calciumcarbonat wird nach folgender Formel berechnet

X =V 100V1 2m

wobei

X = Massenanteil () an Carbonaten in der Probe ausgedruumlckt als CalziumkarbonatV = ml CO2 von der Einwaage freigesetztV1 = ml CO2 aus 05 g CaCO3 freigesetztm = Probeneinwaage in g

7 Bemerkungen

71 Betraumlgt die Einwaage mehr als 2 g werden vor Beginn des Versuchs 15 ml destilliertes Wasser in die Flasche (4)zugegeben und gemischt Beim Vergleichsversuch ist dieselbe Wassermenge zu verwenden

72 Bei Verwendung eines Apparats dessen Volumen von dem der Scheibler-Dietrich-Apparatur abweicht sind dieEinwaage die Vergleichsmenge und die Berechnung der Ergebnisse entsprechend anzupassen



P BESTIMMUNG DES GESAMTPHOSPHORGEHALTS

FOTOMETRISCHE METHODE


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Gesamtphosphor in Futtermitteln Sie ist besonders fuumlr dieUntersuchung von Futtermitteln mit einem geringen Gehalt an Phosphor geeignet In bestimmten Faumlllen(phosphorreiche Erzeugnisse) kann eine gravimetrische Methode angewandt werden

2 Prinzip

Die Probe wird entweder auf trockenem Wege (bei organischen Futtermitteln) oder auf nassem Wege (beiMineralstoffen und fluumlssigen Futtermitteln) aufgeschlossen und in Saumlure geloumlst Die Loumlsung wird mit demVanadat-Molybdat-Reagenz behandelt Die Extinktion der gelb gefaumlrbten Loumlsung wird bei 430 nm imSpektralfotometer gemessen

3 Reagenzien

31 Calciumcarbonat

32 Salzsaumlure ρ20 = 110 gml (ca 6 moll)

33 Salpetersaumlure ρ20 = 1045 gml

34 Salpetersaumlure ρ20 = 138 bis 142 gml


36 Vanadat-Molybdat-Reagenz 200 ml Ammoniumheptamolybdatloumlsung (361) werden mit 200 ml Ammo-niummonovanadatloumlsung (362) und 134 ml Salpetersaumlure (34) in einem l-l-Messkolben gemischt und mitWasser zur Marke aufgefuumlllt

361 Ammoniumheptamolybdatloumlsung 100 g Ammoniumheptamolybdat (NH4) 6Mo7O24 4H2O werden in heiszligemWasser geloumlst 10 ml Ammoniakwasser (D 091 gml) werden hinzugefuumlgt und das Volumen wird mit Wasserauf 1 l aufgefuumlllt

362 Ammoniummonovanadatloumlsung 235 g Ammoniummonovanadat NH4VO3 werden in 400 ml heiszligem Wassergeloumlst 20 ml verduumlnnte Salpetersaumlure (7 ml HNO3 (34) + 13 ml H2O) werden unter staumlndigem Ruumlhren langsamhinzugefuumlgt und das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt

37 Phosphor-Standardloumlsung 1 mg je ml 4387 g Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 werden in Wasser geloumlstDas Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt

4 Geraumlte

41 Veraschungsschalen aus Quarzglas Platin oder Porzellan

42 Elektrischer Muffelofen mit Thermostat auf 550 oC eingestellt

43 Kjeldahl-Kolben 250 ml

44 Messkolben und Praumlzisions-Pipetten


46 Reagenzglaumlser ca 16 mm Durchmesser mit Stopfen graduiert bis zu 145 mm Durchmesser Fassungsvermoumlgen25 bis 30 ml

5 Verfahren

51 Vorbereitung der Loumlsung

Je nach der Art der Probe wird die Loumlsung wie unter 511 oder 512 angegeben vorbereitet


511 A l l g em e i n e s Ve r f a h r e n

Von der Probe werden 1 g oder mehr auf 1 mg genau in einen Kjeldahl-Kolben eingewogen und mit 20 mlSchwefelsaumlure (35) versetzt dann wird geschuumlttelt um das Material vollstaumlndig mit der Saumlure zu benetzen undum zu verhindern dass es an den Wandungen des Kolbens anhaftet anschlieszligend wird der Kolben erhitzt und10 min im Sieden gehalten Nach geringem Abkuumlhlen werden 2 ml Salpetersaumlure (34) hinzugefuumlgt es wirdschwach erhitzt und wieder etwas abgekuumlhlt Dann wird noch ein wenig Salpetersaumlure (34) hinzugegeben underneut zum Sieden erhitzt Das Verfahren wird so oft wiederholt bis die Loumlsung farblos geworden ist Hieraufwird abgekuumlhlt etwas Wasser zugesetzt und die Fluumlssigkeit in einen 500-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt wobei derKjeldahl-Kolben mit heiszligem Wasser ausgespuumllt wird Nach Abkuumlhlen wird mit Wasser zur Marke aufgefuumlllthomogenisiert und filtriert

512 Ve r f a h r e n f uuml r P r o b e n d i e o r g a n i s ch e S t o f f e e n t h a l t e n a b e r f r e i s i n d v o n C a l c i um -b zw M a g n e s i umd i h y d r o g e n pho s p h a t e n

Von der Probe werden 25 g auf 1 mg genau in eine Veraschungsschale eingewogen und mit 1 g Calciumcarbo-nat (31) vollstaumlndig vermischt Im Muffelofen wird bei 550 oC verascht bis die Asche weiszlig oder grau ist (kleineMengen Kohle stoumlren nicht) Die Asche wird in ein 250-ml-Becherglas gebracht 20 ml Wasser und so vielSalzsaumlure (32) zugefuumlgt bis das Aufbrausen ausbleibt Zuletzt werden weitere 10 ml Salzsaumlure (32) zugegebenDann wird das Becherglas auf ein Sandbad gestellt und bis zur Trockne eingedampft um die Kieselsaumlure unloumlslichzu machen Der Ruumlckstand wird in 10 ml Salpetersaumlure (33) aufgenommen und 5 min lang auf dem Sandbadoder der Heizplatte zum Sieden erhitzt wobei der Ruumlckstand nicht ganz trocken werden darf Die Fluumlssigkeitwird in einen 500-ml-Messkolben uumlbergespuumllt wobei das Becherglas mehrmals mit heiszligem Wasserausgewaschen wird Nach Abkuumlhlen wird mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt homogenisiert und filtriert

52 Entwicklung der Faumlrbung und Messung der Extinktion

Ein aliquoter Teil des nach 511 oder 512 erhaltenen Filtrats wird verduumlnnt um eine Konzentration anPhosphor von houmlchstens 40 μgml zu erhalten Von dieser Loumlsung werden 10 ml in ein Reagenzglas (46)pipettiert und 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (36) hinzugefuumlgt Das Reagenzglas wird geschuumlttelt und dannmindestens 10 min bei einer Temperatur von 20 oC stehen gelassen Anschlieszligend wird die Extinktion imSpektralfotometer bei 430 nm gegen eine Loumlsung von 10 ml Wasser und 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (36)gemessen


Aus der Standardloumlsung (37) werden Loumlsungen hergestellt die 5 10 20 30 bzw 40 μg Phosphor je mlenthalten Zu jeweils 10 ml dieser Loumlsungen werden 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (36) hinzugefuumlgt DasReagenzglas wird geschuumlttelt und dann mindestens 10 min bei einer Temperatur von 20 oC stehen gelassenDann wird die Extinktion entsprechend den unter 52 genannten Bedingungen gemessen Die Kalibrationskurvewird aufgestellt indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Phosphormenge auf derAbszisse aufgetragen werden Bei Phosphorkonzentrationen von 0 bis 40 μgml ist die Kurve linear


Der Phosphorgehalt der Analysenprobe wird mithilfe der Kalibrationskurve bestimmt


Wiederholbarkeit


mdash 3 relativ zum houmlheren Wert bei einem Phosphorgehalt von unter 5

mdash 015 absolut bei einem Phosphorgehalt von mehr als 5

Q BESTIMMUNG DES CHLORGEHALTS AUS CHLORIDEN


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Chlorsgehalts aus wasserloumlslichen Chloriden herkoumlmmlicherweise alsNatriumchlorid bezeichnet Sie ist bei allen Futtermitteln anwendbar

2 Prinzip

Die Chloride werden in Wasser geloumlst Handelt es sich um Erzeugnisse die organische Stoffe enthalten wird eineKlaumlrung vorgenommen Die Loumlsung wird mittels Salpetersaumlure schwach angesaumluert und die Chloride werden miteiner Silbernitratloumlsung als Silberchlorid gefaumlllt Der Silbernitratuumlberschuss wird mit einer Ammoniumthiocya-natloumlsung nach der Volhard-Methode zuruumlcktitriert


3 Reagenzien

31 Ammoniumthiocyanatloumlsung 01 moll

32 Silbernitratloumlsung 01 moll

33 Gesaumlttigte Ammonium-Eisen(III)-Sulfatloumlsung (NH4)Fe(SO4)2

34 Salpetersaumlure Dichte 138 gml

35 Diethylether

36 Aceton


38 Carrez-Loumlsung II 106 g Kaliumhexacyanoferrat(II) K4Fe(CN)63H2O werden in Wasser geloumlst und mit Wasserauf 100 ml aufgefuumlllt

39 Aktivkohle chloridfrei und keine Chloride adsorbierend

4 Geraumlte


5 Verfahren


Je nach der Art der Probe wird wie unter 511 512 oder 513 beschrieben eine Loumlsung hergestellt

Gleichzeitig ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzufuumlhren

511 P r o b e n d i e f r e i v o n o r g a n i s c h e n S t o f f e n s i n d

Eine Menge von houmlchstens 10 g der Analysenprobe mit einem Gehalt von houmlchstens 3 g Chlor in Form vonChloriden wird auf 1 mg genau abgewogen und in einen 500-ml-Messkolben mit 400 ml Wasser von etwa 20 oCgebracht Dann wird 30 min lang in dem Schuumlttelgeraumlt rotiert zur Marke aufgefuumlllt homogenisiert und filtriert

512 P r o b e n d i e o r g a n i s ch e S t o f f e e n t h a l t e n (m i t Au s n a hme d e r u n t e r 5 1 3 a n g e -f uuml h r t e n E r z e u g n i s s e )

Etwa 5 g der Analysenprobe werden auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle in einen 500-ml-Messkolben gebracht Hierzu werden 400 ml Wasser von etwa 20 oC und 5 ml Carrez-Loumlsung I (37) gegeben30 s geruumlhrt und anschlieszligend 5 ml Carrez-Loumlsung II (38) zugesetzt Dann wird 30 min lang in demSchuumlttelgeraumlt rotiert zur Marke aufgefuumlllt homogenisiert und filtriert

513 B a c k f u t t e r L e i n k u c h e n un d L e i nmeh l E r z e u g n i s s e m i t e i n em hoh e n L e i nmeh l g e -h a l t o d e r s o n s t i g e E r z e u g n i s s e m i t e i n em hoh e n G eh a l t a n P f l a n z e n s c h l e im od e rko l l o i d a l e n S t o f f e n ( z B v e r k l e i s t e r t e S t auml r k e )

Die Loumlsung wird wie unter 512 beschrieben zubereitet jedoch nicht filtriert Es wird dekantiert (fallserforderlich zentrifugiert) dann werden 100 ml der uumlberstehenden Loumlsung in einen 200-ml-Messkolbenpipettiert Es wird mit Aceton (36) gemischt und mit demselben Loumlsungsmittel zur Marke aufgefuumlllthomogenisiert und filtriert

52 Titration

Von dem Filtrat das nach 511 512 oder 513 erhalten wurde werden (je nach dem zu erwartendenChlorgehalt) 25 bis 100 ml in einen Erlenmeyerkolben pipettiert Die aliquote Menge darf houmlchstens 150 mgChlor (Cl) enthalten Falls erforderlich wird mit Wasser auf mindestens 50 ml verduumlnnt Dann werden 5 mlSalpetersaumlure (34) 20 ml der gesaumlttigten Ammonium-Eisen(III)-Sulfatloumlsung (33) und 2 TropfenAmmoniumthiocyanatloumlsung (31) aus einer bis zum Nullpunkt gefuumlllten Buumlrette hinzugesetzt Anschlieszligendwird aus einer Buumlrette Silbernitratloumlsung (32) zugegeben bis ein Uumlberschuss von 5 ml vorhanden ist Dannwerden 5 ml Diethylether (35) zugegeben und es wird kraumlftig geschuumlttelt um den Niederschlag zum Ausflockenzu bringen Der Uumlberschuss an Silbernitrat wird mit Ammoniumthiocyanatloumlsung (31) titriert bis einerotbraune Farbe auftritt die 1 min bestaumlndig ist



Die Menge Chlor (X) ausgedruumlckt als Natriumchlorid wird nach folgender Formel berechnet

X =5845 V1 minusV2eth THORN

m

wobei

V1 = zugegebene Silbernitratloumlsung 01 moll in mlV2 = Ammoniumthiocyanatloumlsung 01 moll die fuumlr die Titration verbraucht werden in mlm = Probeneinwaage in g

Falls der Blindversuch einen Verbrauch an Silbernitratloumlsung 01 moll anzeigt wird dieser Wert von demVolumen (V1minusV2) abgezogen

7 Bemerkungen

71 Die Titration kann auch mit der potenziometrischen Methode erfolgen

72 Bei sehr fettreichen Erzeugnissen ist eine vorherige Entfettung mit Diethylether oder Petrolether durchzufuumlhren

73 Bei Fischmehl kann die Titration nach der Mohr-Methode durchgefuumlhrt werden


ANHANG IV

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON FUTTERMITTELN AUF IHREN GEHALT ANZUGELASSENEN ZUSATZSTOFFEN

A BESTIMMUNG DES VITAMIN-A-GEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Vitamin-A-(Retinol-)Gehalts in Futtermitteln und VormischungenUnter Vitamin A wird der nach dieser Methode ermittelte Gehalt an all-trans-Vitamin-A-Alkohol und seinen cis-Isomeren verstanden Der Vitamin-A-Gehalt wird in Internationalen Einheiten (IE) je kg angegeben Eine IEentspricht der Aktivitaumlt von 0300 μg all-trans-Vitamin-A-Alkohol oder 0344 μg all-trans-Vitamin-A-Acetat oder0550 μg all-trans-Vitamin-A-Palmitat

Die Bestimmungsgrenze betraumlgt 2 000 IE Vitamin Akg

2 Prinzip

Die Probe wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidloumlsung hydrolysiert und das Vitamin A wird mit Petroletherextrahiert Das Loumlsungsmittel wird eingedampft der Ruumlckstand wird in Methanol geloumlst und falls notwendig aufdie erforderliche Konzentration verduumlnnt Der Vitamin-A-Gehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsf-luumlssigkeitschromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV- oder Fluoreszenzdetektors bestimmt Diechromatografischen Bedingungen werden so gewaumlhlt dass keine Ruftrennung zwischen all-trans-Vitamin-A-Alkohol und seinen cis-Isomeren erfolgt

3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol

34 Kaliumhydroxid-Loumlsung c = 50 g100 ml

35 Natriumascorbat-Loumlsung c = 10 g100 ml (siehe Bemerkung 77)

36 Natriumsulfid Na2S x H2O (x = 7 bis 9)

361 Natriumsulfid-Loumlsung c = 05 moll in Glycerin β = 120 gl (fuumlr x = 9) (siehe Bemerkung 78)

37 Phenolphthalein-Loumlsung c = 2 g100 ml in Ethanol (31)

38 2-Propanol

39 Mobile Phase fuumlr die HPLC Mischung von Methanol (33) und Wasser z B 980 + 20 (V+V) DasMischungsverhaumlltnis ist der jeweils verwendeten Saumlule anzupassen

310 Stickstoff sauerstofffrei

311 All-trans-Vitamin-A-Acetat reinst mit zertifizierter Aktivitaumlt z B 280 times 106 IEg

3111 Stammloumlsung von all-trans-Vitamin-A-Acetat 50 mg Vitamin-A-Acetat (311) auf 01 mg genau in einen 100-ml-Messkolben einwiegen In 2-Propanol (38) loumlsen und zur Marke mit demselben Loumlsungsmittel auffuumlllen DerSollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 1 400 IE Vitamin A je ml Der genaue Gehalt ist gemaumlszlig 5631 zu bestimmen

312 All-trans-Vitamin-A-Palmitat reinst mit zertifizierter Aktivitaumlt z B 180 times 106 IEg

3121 Stammloumlsung von all-trans-Vitamin-A-Palmitat 80 mg Vitamin-A-Palmitat (312) auf 01 mg genau in einen100-ml-Messkolben einwiegen In 2-Propanol (38) loumlsen und mit demselben Loumlsungsmittel zur Marke auffuumlllenDer Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 1 400 IE Vitamin A je ml Der genaue Gehalt ist gemaumlszlig 5632 zubestimmen


313 26-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (siehe Bemerkung 75)

4 Geraumlte


42 Braunglasgeraumlte

421 Stehkolben oder Erlenmeyerkolben 500 ml mit Schliffhuumllse

422 Messkolben mit Schliffstopfen enghalsig 10 25 100 und 500 ml

423 Scheidetrichter konische Form 1 000 ml mit Schliffstopfen

424 Spitzkolben 250 ml mit Schliffhuumllsen

43 Allihn-Ruumlckflusskuumlhler Mantellaumlnge 300 mm Kernschliff mit Adapter fuumlr Gaseinleitung

44 Phasentrennungsfaltenfilter Durchmesser 185 mm (z B Schleicher amp Schuell 597 HY 12)

45 HPLC-Einrichtung mit Injektionssystem

451 HPLC-Trennsaumlule 250 times 4 mm C18 5 oder 10 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule (Leistungskriterium nurein Peak fuumlr alle Retinol-Isomeren unter diesen HPLC-Bedingungen)

452 UV- oder Fluoreszenzdetektor mit variabler Wellenlaumlngeneinstellung

46 Spektralfotometer mit Quarz-Kuumlvetten von 10 mm Schichtdicke

47 Wasserbad mit Magnetruumlhrer

48 Extraktionsapparat (Abbildung 1) bestehend aus

481 1-l-Standzylinder mit Schliff und Schliffstopfen

482 Schliffeinsatz mit Seitenarm und einem in der Houmlhe verschiebbaren Rohr in der Mitte Das verschiebbare Rohrsollte ein U-foumlrmiges unteres Ende und eine Duumlse am entgegengesetzten Ende haben so dass die obereFluumlssigkeitsphase aus dem Zylinder in den Scheidetrichter uumlberfuumlhrt werden kann

5 Verfahren

Anmerkung Vitamin A ist empfindlich gegenuumlber Licht (UV-Strahlung) und Oxidation Es muss deshalb unterAusschluss von Licht (Verwendung von Braunglasgeraumlten oder von mit Aluminiumfolie umhuumllltenGlasgeraumlten) und Sauerstoff (Stickstoffspuumllung) gearbeitet werden Waumlhrend der Extraktion mussdas Luftpolster uumlber der Fluumlssigkeit durch Stickstoff ersetzt werden (zur Vermeidung vonUumlberdruck Stopfen rechtzeitig luumlften)


Die Probe wird unter Vermeidung von Erwaumlrmung so fein vermahlen dass sie ein Sieb mit 1 mm Maschenweitepassieren kann Die Zerkleinerung darf erst unmittelbar vor dem Einwiegen und Verseifen erfolgen da sonstVitamin-A-Verluste auftreten koumlnnen

52 Verseifung

Je nach Vitamin-A-Gehalt 2 bis 25 g der Probe auf 1 mg genau in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben(421) einwiegen Nacheinander unter Schwenken 130 ml Ethanol (31) etwa 100 mg BHT (313) 2 mlNatriumascorbat-Loumlsung (35) und 2 ml Natriumsulfid-Loumlsung (36) zusetzen Den Kolben mit einemRuumlckflusskuumlhler (43) verbinden und in ein Wasserbad mit Magnetruumlhrer (47) geben Bis zum Sieden erhitzenund 5 min am Ruumlckflusskuumlhler kochen Anschlieszligend 25 ml Kaliumhydroxidloumlsung (34) durch denRuumlckflusskuumlhler (43) zugeben und unter staumlndigem Ruumlhren und schwachem Stickstoffstrom 25 minweiterkochen Den Kuumlhler mit etwa 20 ml Wasser ausspuumllen und den Kolbeninhalt auf Zimmertemperaturabkuumlhlen


53 Extraktion

Die Verseifungsloumlsung wird mit insgesamt 250 ml Wasser quantitativ in einen 1 000-ml-Scheidetrichter (423)oder in den Extraktionsapparat (48) uumlberspuumllt Der Verseifungskolben wird mit 25 ml Ethanol (31) undanschlieszligend mit 100 ml Petrolether (32) nachgewaschen und die Spuumllfluumlssigkeiten werden ebenfalls in denScheidetrichter oder den Extraktionsapparat uumlberfuumlhrt Das WasserEthanol-Verhaumlltnis in den vereinigtenLoumlsungen muss etwa 21 betragen 2 min lang kraumlftig schuumltteln und dann 2 min lang absetzen lassen

531 E x t r a k t i o n m i t h i l f e e i n e s S c h e i d e t r i c h t e r s ( 4 2 3 )

Nach Phasentrennung (siehe Bemerkung 73) wird die Petroletherphase in einen anderen Scheidetrichter (423)uumlberfuumlhrt Diese Extraktion 2-mal mit je 100 ml Petrolether (32) und 2-mal mit je 50 ml Petrolether (32)wiederholen

Die vereinigten Extrakte werden im Scheidetrichter zunaumlchst unter leichtem Schwenken (Vermeidung vonEmulsionsbildung) 2-mal mit jeweils 100 ml Wasser gespuumllt und dann durch mehrmaliges Schuumltteln mitweiteren Portionen von 100 ml Wasser so oft gewaschen bis das Waschwasser bei Zugabe von Phenolphthalein-Loumlsung (37) farblos bleibt (4-maliges Waschen ist normalerweise ausreichend) Zur Entfernung eventuellsuspendierten Wassers wird der gewaschene Extrakt durch einen trockenen Phasentrennungsfaltenfilter (44) ineinen 500-ml-Messkolben (422) filtriert Scheidetrichter und Filter mit 50 ml Petrolether (32) nachwaschenmit Petrolether (32) zur Marke auffuumlllen und gut schuumltteln

532 E x t r a k t i o n m i t h i l f e e i n e s E x t r a k t i o n s a p p a r a t s ( 4 8 )

Nach Phasentrennung (siehe Bemerkung 73) wird der Schliffstopfen des Standzylinders (481) durch denSchliffeinsatz (482) ersetzt und das verschiebbare Rohr so eingestellt dass sich das U-foumlrmige untere Endegerade uumlber dem Niveau der Grenzflaumlche befindet Durch Druckausuumlbung von einer am Seitenarm angebrachtenStickstoffleitung wird die obere Petroletherphase in einen 1 000-ml-Scheidetrichter (423) uumlberfuumlhrt 100 mlPetrolether (32) werden in den Standzylinder gegeben der mit einem Stopfen verschlossen und gruumlndlichgeschuumlttelt wird Nach der Phasentrennung wird die obere Phase wie zuvor in den Scheidetrichter uumlberfuumlhrtDiese Extraktion wird noch 1-mal mit 100 ml Petrolether (32) und 2-mal mit je 50 ml Petrolether (32)wiederholt und die Petroletherphasen werden in den Scheidetrichter uumlberfuumlhrt

Die vereinigten Petroletherextrakte wie unter 531 erlaumlutert waschen und wie dort beschrieben weiterverfahren

54 Vorbereitung der Probenloumlsung fuumlr die HPLC

Ein aliquoter Teil der Petrolether-Loumlsung (gemaumlszlig 531 oder 532) wird in einen 250-ml-Spitzkolben (424)pipettiert Das Loumlsungsmittel wird unter vermindertem Druck und bei einer Badtemperatur von houmlchstens 40 oCam Rotationsverdampfer (41) fast bis zur Trockne eingedampft Danach wird unter Stickstoff (310)Druckausgleich geschaffen und der Kolben vom Rotationsverdampfer abgenommen Das restliche Loumlsungsmittelwird im Stickstoffstrom (310) abgeblasen und der Ruumlckstand wird sofort in einer definierten Menge (10 bis100 ml) Methanol (33) aufgenommen (die Konzentration von Vitamin A muss etwa 5 bis 30 IEml betragen)

55 Bestimmung durch HPLC

Die Abtrennung von Vitamin A erfolgt mithilfe einer Umkehrphasen-C18-Saumlule (451) und die Konzentrationwird mithilfe eines UV-Detektors (325 nm) oder eines Fluoreszenzdetektors (Anregung 325 nm Emission475 nm) (452) gemessen

Hierzu wird ein aliquoter Teil (z B 20 μl) der nach 54 erhaltenen methanolischen Loumlsung auf die Trennsaumlulegegeben und mit der mobilen Phase (39) eluiert Die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) von mehreren Einspritzungenderselben Probenloumlsung wird ermittelt In gleicher Weise werden auch die mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) vonmehreren Einspritzungen der Kalibrierloumlsungen (562) bestimmt

H P LC - B e d i n g u n g e n

Die folgenden Angaben sind Richtwerte andere Parameter koumlnnen verwendet werden sofern sie zuvergleichbaren Ergebnissen fuumlhren

HPLC-Trennsaumlule (451) 250 times 4 mm C18 5 oder 10 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

Mobile Phase (39) Mischung von Methanol (33) und Wasser z B 980 + 20 (V+V)

Durchflussrate 1 bis 2 mlmin

Detektor (452) UV-Detektor (325 nm) oder Fluoreszenzdetektor(Anregung 325 nm Emission 475 nm)


56 Kalibrierung

561 H e r s t e l l e n d e r G e b r a u ch s s t a n d a r d l ouml s u n g e n

Von der Vitamin-A-Acetat-Stammloumlsung (3111) oder der Vitamin-A-Palmitat-Stammloumlsung (3121) 20 ml ineinen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben (421) pipettieren und wie unter 52 beschrieben aber ohne Zugabevon BHT hydrolysieren Anschlieszligend mit Petrolether (32) gemaumlszlig 53 extrahieren und mit Petrolether (32) auf500 ml auffuumlllen 100 ml dieses Extrakts werden am Rotationsverdampfer (siehe 54) fast bis zur Trockneeingedampft Das verbleibende Loumlsungsmittel wird im Stickstoffstrom (310) abgeblasen und der Ruumlckstand wirdin 100 ml Methanol (33) aufgenommen Der Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 560 IE Vitamin A je ml Dergenaue Gehalt ist nach 5633 zu bestimmen Die Gebrauchsstandardloumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestelltwerden

Von dieser Gebrauchsstandardloumlsung werden 20 ml in einen 20-ml-Messkolben pipettiert Es wird mit Metha-nol (33) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Sollgehalt dieser verduumlnnten Gebrauchsstandardloumlsung betraumlgt56 IE Vitamin A je ml

562 H e r s t e l l e n d e r K a l i b r i e r l ouml s u n g e n un d E r s t e l l u n g d e r K a l i b r a t i o n s k u r v e

Von der verduumlnnten Gebrauchsstandardloumlsung werden 10 ml 20 ml 50 ml bzw 100 ml in jeweils einen 20-ml-Messkolben pipettiert Es wird mit Methanol (33) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Sollgehalt dieserLoumlsungen betraumlgt 28 IE 56 IE 140 IE bzw 280 IE Vitamin A je ml

Von jeder Kalibrierloumlsung werden mehrmals 20 μl eingespritzt und die mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) werdengemessen Anhand der so ermittelten mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) und unter Beruumlcksichtigung der Ergebnisseder UV-Kontrolle (5633) wird eine Kalibrationskurve erstellt

563 UV- Kon t r o l l e d e r S t a n d a r d l ouml s u n g e n

5631 V i t am i n -A -A c e t a t - S t amm l ouml s u n g

Von der Vitamin-A-Acetat-Stammloumlsung (3111) werden 20 ml in einen 50-ml-Messkolben (422) pipettiertund es wird mit 2-Propanol (38) zur Marke aufgefuumlllt Der Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 56 IE Vitamin A jeml Von dieser verduumlnnten Vitamin-A-Acetat-Loumlsung werden 30 ml in einen 25-ml-Messkolben pipettiert eswird mit 2-Propanol (38) zur Marke aufgefuumlllt Der Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 672 IE Vitamin A je ml DasUV-Spektrum dieser Loumlsung wird gegen 2-Propanol (38) im Spektralfotometer (46) zwischen 300 und 400 nmgemessen Das Extinktionsmaximum muss zwischen 325 und 327 nm liegen

Berechnung des Vitamin-A-Gehalts

IE Vitamin Aml = E326 times 190

(E1 1 cm E fuumlr Vitamin-A-Acetat = 1 530 bei 326 nm in 2-Propanol)

5632 V i t am i n -A - Pa lm i t a t - S t amm l ouml s u n g

Von der Vitamin-A-Palmitat-Stammloumlsung (3121) werden 20 ml in einen 50-ml-Messkolben (422) pipettiertund es wird mit 2-Propanol (38) zur Marke aufgefuumlllt Der Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 56 IE Vitamin A jeml Von dieser verduumlnnten Vitamin-A-Palmitat-Loumlsung werden 30 ml in einen 25-ml-Messkolben pipettiert eswird zur Marke mit 2-Propanol (38) aufgefuumlllt Der Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 672 IE Vitamin A je ml DasUV-Spektrum dieser Loumlsung wird gegen 2-Propanol (38) im Spektralfotometer (46) zwischen 300 und 400 nmgemessen Das Extinktionsmaximum muss zwischen 325 und 327 nm liegen



(E1 1 cm fuumlr Vitamin-A-Palmitat = 957 bei 326 nm in 2-Propanol)

5633 V i t am i n -A -G e b r a u c h s s t a n d a rd l ouml s u n g

Von der gemaumlszlig 561 hergestellten unverduumlnnten Vitamin-A-Gebrauchsstandardloumlsung werden 30 ml in einen50-ml-Messkolben (422) pipettiert und es wird mit 2-Propanol (38) zur Marke aufgefuumlllt 50 ml dieser Loumlsungwerden in einen 25-ml-Messkolben pipettiert es wird mit 2-Propanol (38) zur Marke aufgefuumlllt Der Sollgehaltdieser Loumlsung betraumlgt 672 IE Vitamin A je ml Das UV-Spektrum dieser Loumlsung wird gegen 2-Propanol (38) imSpektralfotometer (46) zwischen 300 und 400 nm gemessen Das Extinktionsmaximum muss zwischen 325und 327 nm liegen




(E1 1 cm E fuumlr Vitamin-A-Alkohol = 1 821 bei 325 nm in 2-Propanol)


Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Vitamin-A-Peaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve(562) die Konzentration der Probenloumlsung in IEml bestimmt

Der Vitamin-A-Gehalt w (in IEkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =500 c V2 1 000

V1 m[IEkg]

wobei

c = Vitamin-A-Konzentration der Probenloumlsung (54) in IEmlV1 = Volumen der Probenloumlsung (54) in mlV2 = Volumen des unter 54 entnommenen aliquoten Teils in mlm = Probeneinwaage in g

7 Bemerkungen

71 Bei Proben mit niedriger Vitamin-A-Konzentration kann es zweckmaumlszligig sein die Petroletherextrakte von2 Verseifungsansaumltzen (Einwaage 25 g) zu einer Probenloumlsung fuumlr die HPLC-Bestimmung zu vereinigen

72 Die Einwaage fuumlr die Analyse darf houmlchstens 2 g Fett enthalten

73 Bei schlechter Phasentrennung koumlnnen etwa 10 ml Ethanol (31) zur Zerstoumlrung der Emulsion zugegebenwerden

74 Bei Lebertran oder anderen reinen Fetten ist die Verseifungsdauer auf 45 bis 60 min zu erhoumlhen

75 Statt BHT kann Hydrochinon verwendet werden

76 Bei Verwendung einer Normalphasensaumlule ist die Trennung der Retinolisomeren moumlglich Allerdings muumlssen indiesem Fall fuumlr die Berechnungen die Peakhoumlhen (-flaumlchen) aller cis- und trans-Isomeren addiert werden

77 Statt Natriumascorbat-Loumlsung koumlnnen etwa 150 mg Ascorbinsaumlure verwendet werden

78 Statt Natriumsulfid-Loumlsung koumlnnen etwa 50 mg EDTA verwendet werden

79 Bei der Bestimmung des Gehalts an Vitamin A in Milchaustausch-Futtermitteln sind folgende Aspekte zuberuumlcksichtigen

mdash bei der Verseifung (52) Aufgrund des Fettgehalts in der Probe ist gegebenenfalls die Menge dereingesetzten Kaliumhydroxidloumlsung (34) zu erhoumlhen

mdash bei der Extraktion (53) Aufgrund des Vorhandenseins von Emulsionen ist gegebenenfalls eine Anpassungdes WasserEthanol-Verhaumlltnisses von 21 erforderlich

Um festzustellen ob die angewandte Analysemethode zuverlaumlssige Ergebnisse fuumlr diese spezifische Matrix(Milchaustausch-Futtermittel) liefert ist ein Wiederfindungstest an einer weiteren Probeneinwaage durchzu-fuumlhren Ist die Wiederfindungsrate kleiner als 80 muss das Analyseergebnis um die Wiederfindung korrigiertwerden

8 Wiederholbarkeit



9 Ergebnisse eines Ringversuchs (1)

Vormischungen Fertigfuttervor-mischungen Mineralfutter Einweiszligkonzent-

ratFerkelaufzuchtfut-

ter

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mittelwert[IEkg]

1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070

sr [IEkg] 051 times 106 0039 times 106 22 080 12 280 682

r [IEkg] 143 times 106 0109 times 106 61 824 34 384 1 910

VKr [ ] 30 35 41 81 38

SR [IEkg] 136 times 106 0069 times 106 46 300 23 060 3 614

R [IEkg] 381 times 106 0193 times 106 129 640 64 568 10 119

VKR [ ] 80 62 86 15 20

L = Anzahl der Laboratorienn = Anzahl der Einzelwertesr = Standardabweichung der WiederholbarkeitsR = Standardabweichung der Vergleichbarkeitr = WiederholbarkeitR = VergleichbarkeitVKr = Variationskoeffizient der WiederholbarkeitVKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit


(1) Durchgefuumlhrt von der Fachgruppe Futtermittel des Verbands deutscher landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten(VDLUFA)


B BESTIMMUNG DES VITAMIN-E-GEHALTS


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Vitamin-E-Gehalts von Futtermitteln und Vormischungen DerVitamin-E-Gehalt wird in mg DL-α-Tocopherol-Acetat je kg angegeben 1 mg DL-α-Tocopherol-Acetat entspricht091 mg DL-α-Tocopherol (Vitamin E)

Die Bestimmungsgrenze betraumlgt 2 mg Vitamin Ekg Diese Grenze wird nur mit dem Fluoreszenzdetektorerreicht Bei einem UV-Detektor betraumlgt die Bestimmungsgrenze 10 mgkg

2 Prinzip

Die Probe wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidloumlsung hydrolysiert und das Vitamin E wird mit Petroletherextrahiert Das Loumlsungsmittel wird eingedampft der Ruumlckstand wird in Methanol geloumlst und falls notwendig aufdie erforderliche Konzentration verduumlnnt Der Vitamin-E-Gehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungs-fluumlssigkeitschromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV- oder Fluoreszenzdetektors bestimmt

3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol








310 DL-α-Tocopherol-Acetat reinst mit zertifizierter Aktivitaumlt

3101 DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammloumlsung 100 mg DL-α-Tocopherol-Acetat (310) auf 01 mg genau in einen 100-ml-Messkolben einwiegen In Ethanol (31) loumlsen und mit demselben Loumlsungsmittel zur Marke auffuumlllen 1 mldieser Loumlsung enthaumllt 1 mg DL-α-Tocopherol-Acetat (UV-Kontrolle siehe 5613 Stabilisierung siehe Bemer-kung 74)

311 DL-α-Tocopherol reinst mit zertifizierter Aktivitaumlt

3111 DL-α-Tocopherol-Stammloumlsung Von DL-α-Tocopherol (311) werden 100 mg auf 01 mg genau in einen 100-mlMesskolben eingewogen In Ethanol (31) loumlsen und mit demselben Loumlsungsmittel zur Marke auffuumlllen 1 mldieser Loumlsung enthaumllt 1 mg DL-α-Tocopherol (UV-Kontrolle siehe 5623 Stabilisierung siehe Bemerkung 74)


4 Geraumlte

41 Rotationsfilmverdampfer










451 HPLC-Trennsaumlule 250 times 4 mm C18 5 oder 10 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule






482 Schliffeinsatz mit Seitenarm und einem in der Houmlhe verschiebbaren Rohr in der Mitte Das verschiebbare Rohrmuss ein U-foumlrmiges unteres Ende und eine Duumlse am entgegengesetzten Ende haben so dass die obereFluumlssigkeitsphase aus dem Zylinder in den Scheidetrichter uumlberfuumlhrt werden kann

5 Verfahren

Anmerkung Vitamin E ist empfindlich gegenuumlber Licht (UV-Strahlung) und Oxidation Daher muss unterAusschluss von Licht (Verwendung von Braunglasgeraumlten oder von mit Aluminiumfolie umhuumllltenGlasgeraumlten) und Sauerstoff (Stickstoffspuumllung) gearbeitet werden Waumlhrend der Extraktion mussdas Luftpolster uumlber der Fluumlssigkeit durch Stickstoff ersetzt werden (zur Vermeidung vonUumlberdruck Stopfen immer wieder luumlften)


Die Probe wird unter Vermeidung von Erwaumlrmung so fein vermahlen dass sie ein Sieb mit 1 mm Maschenweitepassieren kann Die Zerkleinerung darf erst unmittelbar vor dem Einwiegen und Verseifen erfolgen da sonstVitamin-E-Verluste auftreten koumlnnen

52 Verseifung

Je nach Vitamin-E-Gehalt 2 bis 25 g der Probe auf 001 g genau in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben(421) einwiegen Nacheinander unter Schwenken 130 ml Ethanol (31) etwa 100 mg BHT (312) 2 mlNatriumascorbat-Loumlsung (35) und 2 ml Natriumsulfid-Loumlsung (36) zusetzen Den Kolben mit demRuumlckflusskuumlhler (43) verbinden und in ein Wasserbad mit Magnetruumlhrer (47) geben Bis zum Sieden erhitzenund 5 min am Ruumlckflusskuumlhler kochen Anschlieszligend 25 ml Kaliumhydroxidloumlsung (34) durch denRuumlckflusskuumlhler (43) zugeben und unter staumlndigem Ruumlhren und schwachem Stickstoffstrom 25 minweiterkochen Den Kuumlhler mit etwa 20 ml Wasser ausspuumllen und den Kolbeninhalt auf Zimmertemperaturabkuumlhlen

53 Extraktion

Die Verseifungsloumlsung wird mit insgesamt 250 ml Wasser quantitativ in einen 1 000-ml-Scheidetrichter (423)oder in den Extraktionsapparat (48) uumlberspuumllt Der Verseifungskolben wird mit 25 ml Ethanol (31) undanschlieszligend mit 100 ml Petrolether (32) nachgewaschen und die Spuumllfluumlssigkeiten werden ebenfalls in denScheidetrichter oder den Extraktionsapparat uumlberfuumlhrt Das WasserEthanol-Verhaumlltnis in den vereinigtenLoumlsungen muss etwa 21 betragen 2 min kraumlftig schuumltteln und dann 2 min absetzen lassen




Die vereinigten Extrakte werden im Scheidetrichter unter leichtem Schwenken (Vermeidung von Emulsions-bildung) 2-mal mit jeweils 100 ml Wasser gespuumllt und dann durch mehrmaliges Schuumltteln mit weiterenPortionen von 100 ml Wasser so oft gewaschen bis das Waschwasser bei Zugabe von Phenolphthalein-Loumlsung(37) farblos bleibt (4-maliges Waschen ist normalerweise ausreichend) Zur Entfernung eventuell suspendiertenWassers wird der gewaschene Extrakt durch einen trockenen Phasentrennungsfaltenfilter (44) in einen 500-ml-Messkolben (422) filtriert Scheidetrichter und Filter mit 50 ml Petrolether (32) nachwaschen mit Petrolether(32) zur Marke auffuumlllen und gut schuumltteln


Nach Phasentrennung (siehe Bemerkung 73) wird der Stopfen des Standzylinders (481) durch den Schliffeinsatz(482) ersetzt und das verschiebbare Rohr so eingestellt dass sich das U-foumlrmige untere Ende gerade uumlber demNiveau der Grenzflaumlche befindet Durch Druckausuumlbung von einer am Seitenarm angebrachten Stickstoffleitungwird die obere Petroletherphase in einen 1 000-ml-Scheidetrichter (423) uumlberfuumlhrt 100 ml Petrolether (32)werden in den Standzylinder gegeben der mit einem Stopfen verschlossen und gruumlndlich geschuumlttelt wird Nachder Phasentrennung wird die obere Phase wie zuvor in den Scheidetrichter uumlberfuumlhrt Diese Extraktion wird noch1-mal mit 100 ml Petrolether (32) und 2-mal mit je 50 ml Petrolether (32) wiederholt und diePetroletherphasen werden in den Scheidetrichter uumlberfuumlhrt



Ein aliquoter Teil der Petrolether-Loumlsung (gemaumlszlig 531 oder 532) wird in einen 250-ml-Spitzkolben (424)pipettiert Das Loumlsungsmittel wird unter vermindertem Druck und bei einer Badtemperatur von houmlchstens 40 oCam Rotationsverdampfer (41) fast bis zur Trockne eingedampft Danach wird unter Stickstoff (39)Druckausgleich geschaffen und der Kolben vom Rotationsverdampfer abgenommen Das restliche Loumlsungsmittelwird im Stickstoffstrom (39) abgeblasen und der Ruumlckstand wird sofort in einer definierten Menge(10 bis 100 ml) Methanol (33) aufgenommen (die Konzentration von DL-α-Tocopherol muss etwa 5 bis 30 μgml betragen)


Die Abtrennung von Vitamin E erfolgt mithilfe einer Umkehrphasen-C18-Saumlule (451) und die Konzentrationwird mithilfe eines Fluoreszenzdetektors (Anregung 295 nm Emission 330 nm) oder eines UV-Detektors(292 nm) (452) gemessen


H P LC - P a r ame t e r





Detektor (452) Fluoreszenzdetektor(Anregung 295 nm Emission 330 nm) oder UV-Detektor (292 nm)

56 Kalibrierung (DL-α-Tocopherol-Acetat oder DL-α-Tocopherol)

561 D L - α -To c o ph e r o l - Ac e t a t - S t a n d a r d

5611 He r s t e l l e n d e r G e b r a u c h s s t a n d a r d l ouml s u n g

Von der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammloumlsung (3101) werden 25 ml in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyer-kolben (421) pipettiert und wie unter 52 beschrieben hydrolysiert Anschlieszligend mit Petrolether (32) gemaumlszlig53 extrahieren und mit Petrolether auf 500 ml auffuumlllen Von diesem Extrakt werden 25 ml amRotationsverdampfer (siehe 54) fast bis zur Trockne eingedampft Das verbleibende Loumlsungsmittel wird imStickstoffstrom (39) abgeblasen und der Ruumlckstand wird in 250 ml Methanol (33) aufgenommen DerSollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 455 μg DL-α-Tocopherol je ml das entspricht 50 μg DL-α-Tocopherol-Acetat jeml Die Gebrauchsstandardloumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden


5612 He r s t e l l e n d e r K a l i b r i e r l ouml s u n g e n u n d E r s t e l l u n g d e r K a l i b r a t i o n s k u r v e

Von der Gebrauchsstandardloumlsung werden 10 ml 20 ml 40 ml bzw 100 ml in jeweils einen 20-ml-Messkolben pipettiert es wird mit Methanol (33) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Sollgehalt dieserLoumlsungen betraumlgt 25 μgml 50 μgml 100 μgml bzw 250 μgml DL-α-Tocopherol-Acetat d h 228 μgml455 μgml 910 μgml bzw 228 μgml DL-α-Tocopherol

Von jeder Kalibrierloumlsung werden mehrmals 20 μl eingespritzt und die mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) werdengemessen Anhand der so ermittelten mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) wird eine Kalibrationskurve erstellt

5613 UV-K o n t r o l l e d e r D L - α -To c o p h e r o l - A c e t a t - S t amm l ouml s u n g ( 3 1 0 1 )

Von der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammloumlsung (3101) werden 50 ml mit Ethanol auf 250 ml aufgefuumlllt DasUV-Spektrum dieser Loumlsung wird gegen Ethanol (31) im Spektralfotometer (46) zwischen 250 und 320 nmgemessen

Das Extinktionsmaximum muss bei 284 nm liegen

E1 1 cm = 436 bei 284 nm in Ethanol

Bei der vorliegenden Verduumlnnung muss eine Extinktion von 084 bis 088 erzielt werden

562 D L - α -To c o ph e r o l - S t a n d a r d


Von der DL-α-Tocopherol-Stammloumlsung (3111) werden 2 ml in einen 50-ml-Messkolben pipettiert und inMethanol (33) geloumlst es wird mit Methanol zur Marke aufgefuumlllt Der Sollgehalt dieser Loumlsung betraumlgt 40 μg DL-α-Tocopherol je ml das entspricht 440 μg DL-α-Tocopherol-Acetat je ml Die Gebrauchsstandardloumlsung mussvor Gebrauch frisch hergestellt werden


Von der Gebrauchsstandardloumlsung werden 10 ml 20 ml 40 ml bzw 100 ml in jeweils einen 20-ml-Messkolben pipettiert es wird mit Methanol (33) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Sollgehalt dieserLoumlsungen betraumlgt 20 μgml 40 μgml 80 μgml bzw 200 μgml DL-α-Tocopherol d h 220 μgml 440 μgml 879 μgml bzw 220 μgml DL-α-Tocopherol-Acetat


5623 UV-K o n t r o l l e d e r D L - α -To c o p h e r o l - S t amm l ouml s u n g ( 3 1 1 1 )

Von der DL-α-Tocopherol-Stammloumlsung (3111) werden 20 ml mit Ethanol auf 250 ml aufgefuumlllt das UV-Spektrum dieser Loumlsung wird gegen Ethanol (31) im Spektralfotometer (46) zwischen 250 und 320 nmgemessen Das Extinktionsmaximum muss bei 292 nm liegen


Bei der vorliegenden Verduumlnnung muss eine Extinktion von 06 erzielt werden


Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Vitamin-E-Peaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve(5612 oder 5622) die Konzentration der Probenloumlsung in μgml (berechnet als α-Tocopherol-Acetat)bestimmt

Der Vitamin-E-Gehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =500 c V2

V1 m[mgkg]

wobei

c = Vitamin-E-Konzentration (als α-Tocopherol-Acetat) der Probenloumlsung (54) in μgmlV1 = Volumen der Probenloumlsung (54) in mlV2 = Volumen des unter 54 entnommenen aliquoten Teils in mlm = Probeneinwaage in g


7 Bemerkungen

71 Bei Proben mit niedriger Vitamin-E-Konzentration kann es zweckmaumlszligig sein die Petroletherextrakte von 2Verseifungsansaumltzen (Einwaage 25 g) zu einer Probenloumlsung fuumlr die HPLC-Bestimmung zu vereinigen



74 Nach der spektralfotometrischen Vermessung der DL-α-Tocopherol-Acetat- oder der DL-α-Tocopherol-Loumlsungnach 5613 bzw 5623 empfiehlt es sich der Loumlsung (3101 bzw 3102) etwa 10 mg BHT (312) zuzusetzenund die Loumlsung im Kuumlhlschrank aufzubewahren (Haltbarkeit houmlchstens 4 Wochen)


76 Bei Verwendung einer Normalphasensaumlule ist die Trennung von α- β- γ- und δ-Tocopherol moumlglich



79 Vitamin-E-Acetat hydrolysiert unter alkalischen Bedingungen sehr schnell und ist deshalb sehr oxidationsanfaumllliginsbesondere in Gegenwart von Spurenelementen wie Eisen oder Kupfer Bei der Bestimmung des Vitamin-E-Gehalts in Vormischungen bei denen ein Gehalt von 5 000 mgkg uumlberschritten wird koumlnnte es zu einemAbbau von Vitamin E kommen Deshalb wird zur Bestaumltigung eine HPLC-Methode mit einem enzymatischenAufschluss der Vitamin-E-Formel ohne einen alkalischen Verseifungsschritt empfohlen

8 Wiederholbarkeit



Vormischungen Fertigfuttervor-mischungen Mineralfutter Eiweiszligkonzent-


ter

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Mittelwert [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

VKr [ ] 22 38 27 41 38

SR mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

VKR [ ] 48 55 60 60 127





C BESTIMMUNG DES GEHALTS AN DEN SPURENELEMENTEN EISEN KUPFER MANGAN UND ZINK


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an den Spurenelementen Eisen Kupfer Mangan und Zink inFuttermitteln Die Bestimmungsgrenzen liegen bei

mdash Eisen (Fe) 20 mgkg

mdash Kupfer (Cu) 10 mgkg

mdash Mangan (Mn) 20 mgkg

mdash Zink (Zn) 20 mgkg

2 Prinzip

Die Probe wird nach Zerstoumlrung eventuell vorhandener organischer Substanz in Salzsaumlure geloumlst Die ElementeEisen Kupfer Mangan und Zink werden nach entsprechender Verduumlnnung der Analysenloumlsung mittelsAtomabsorptionsspektrometrie bestimmt

3 Reagenzien

Vorbemerkungen

Das zur Herstellung der Reagenzien und Analysenloumlsungen verwendete Wasser muss bdquofreildquo von den zubestimmenden Kationen sein d h das Wasser muss entweder in einer Borsilikatglas- oder Quarzapparatur 2-fach destilliert oder durch doppelten Ionenaustausch gereinigt worden sein

Die zur Analyse verwendeten Reagenzien muumlssen mindestens von analysenreiner Qualitaumlt sein Die Abwesenheitdes zu bestimmenden Elements wird mittels eines Blindversuchs kontrolliert Falls erforderlich sind dieReagenzien einer zusaumltzlichen Reinigung zu unterziehen

Anstelle der nachfolgend beschriebenen Standardloumlsungen koumlnnen auch handelsuumlbliche Standardloumlsungenverwendet werden deren Reinheit garantiert und vor der Verwendung kontrolliert wurde

31 Salzsaumlure (D 119 gml)

32 Salzsaumlure (6 moll)


34 Fluorwasserstoffsaumlure (Volumenkonzentration = 38 bis 40 ) Eisengehalt weniger als 1 mgl Gluumlhruumlckstand(als Sulfat) weniger als 10 mgl

35 Schwefelsaumlure (D 184 gml)

36 Wasserstoffperoxid ca 100 Volumina Sauerstoff (Massenanteil = 30 )

37 Eisen-Standardloumlsung (1 000 μg Feml) wie folgt zubereitet oder eine gleichwertige handelsuumlbliche Loumlsung 1 gEisendraht wird in 200 ml 6 moll Salzsaumlure (32) geloumlst Es werden 16 ml Wasserstoffperoxid (36) zugegebendann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt

371 Eisen-Gebrauchsstandardloumlsung (100 μg Feml) Die Standardloumlsung (37) wird im Verhaumlltnis 19 mit Wasserverduumlnnt

38 Kupfer-Standardloumlsung (1 000 μg Cuml) wie folgt zubereitet oder eine gleichwertige handelsuumlbliche Loumlsung

mdash In 25 ml 6 moll Salzsaumlure (32) wird 1 g Kupfer in Pulverform geloumlst Es werden 5 ml Wasserstoffper-oxid (36) zugegeben und dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt


381 Kupfer-Gebrauchsstandardloumlsung (10 μg Cuml) Die Standardloumlsung (38) wird im Verhaumlltnis 19 mit Wasserverduumlnnt anschlieszligend wird die so entstandene Loumlsung wiederum im Verhaumlltnis 19 mit Wasser verduumlnnt

39 Mangan-Standardloumlsung (1 000 μg Mnml) wie folgt zubereitet oder eine gleichwertige handelsuumlbliche Loumlsung

mdash In 25 ml 6 moll Salzsaumlure (32) wird 1 g Mangan in Pulverform geloumlst dann wird mit Wasser auf 1 laufgefuumlllt

391 Mangan-Gebrauchsstandardloumlsung (10 μg Mnml) Die Standardloumlsung (39) wird im Verhaumlltnis 19 mit Wasserverduumlnnt anschlieszligend wird die so entstandene Loumlsung wiederum im Verhaumlltnis 19 mit Wasser verduumlnnt

310 Zink-Standardloumlsung (1 000 μg Znml) wie folgt zubereitet oder eine gleichwertige handelsuumlbliche Loumlsung

mdash In 25 ml 6 moll Salzsaumlure (32) wird 1 g Zink in Streifen- oder Plattenform geloumlst dann wird mit Wasserauf 1 l aufgefuumlllt

3101 Zink-Gebrauchsstandardloumlsung (10 μg Znml) Die Standardloumlsung (310) wird im Verhaumlltnis 19 mit Wasserverduumlnnt anschlieszligend wird die so entstandene Loumlsung wiederum im Verhaumlltnis 19 mit Wasser verduumlnnt

311 Lanthanchloridloumlsung In 150 ml Wasser wird 12 g Lanthanoxid geloumlst und 100 ml 6 moll Salzsaumlure (32)zugegeben Dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuumlllt

4 Geraumlte

41 Muffelofen mit Regelvorrichtung und gegebenenfalls mit Temperaturanzeige

42 Glasgeraumlte muumlssen aus resistentem Borsilikatglas sein Es wird empfohlen Glasgeraumlte zu benutzen dieausschlieszliglich der Bestimmung des Gehalts an Spurenelementen vorbehalten bleiben

43 Atomabsorptions-Spektralfotometer das Geraumlt muss innerhalb des vorgesehenen Messbereichs hinsichtlichseiner Empfindlichkeit und Genauigkeit den Anforderungen der jeweiligen Methode genuumlgen

5 Verfahren (1)

51 Proben mit organischen Bestandteilen

511 Ve r a s c h u n g un d H e r s t e l l u n g d e r An a l y s e n l ouml s u n g (2)

5111 Von der Probe werden 5 bis 10 g (auf 02 mg genau abgewogen) in eine Quarz- oder Platinschale gegeben (sieheAnmerkung b) und im Trockenschrank bei 105 oC getrocknet dann wird die Schale in den kalten Muffelofen(41) verbracht Der Ofen wird geschlossen (siehe Anmerkung c) und die Temperatur innerhalb von ca 90 minlangsam auf 450 bis 475 oC erhoumlht Diese Temperatur wird 4 bis 16 h (z B uumlber Nacht) aufrechterhalten umKohleteilchen zu entfernen dann wird der Ofen geoumlffnet und abkuumlhlen gelassen (siehe Anmerkung d)

Die Asche wird mit Wasser angefeuchtet und in ein 250-ml-Becherglas gegeben Die Schale wird mit insgesamtetwa 5 ml Salzsaumlure (31) ausgespuumllt die anschlieszligend langsam und vorsichtig (da es aufgrund von CO2-Bildungeventuell zu einer heftigen Reaktion kommen kann) in das Becherglas gegeben wird Unter Schuumltteln wirdSalzsaumlure (31) tropfenweise zugegeben bis die Schaumbildung aufhoumlrt Die Salzsaumlure wird unter gelegentlichemUmruumlhren mit einem Glasstab bis zur Trockne abgedampft


(1) Andere Aufschlussmethoden koumlnnen verwendet werden sofern erwiesen ist dass sie zu vergleichbaren Ergebnissen fuumlhren (z BMikrowellen-Druckaufschluss)

(2) Gruumlnfutter (frisch oder getrocknet) kann groumlszligere Mengen pflanzlicher Kieselsaumlure enthalten welche Spurenelemente binden kann unddaher entfernt werden muss Bei Proben dieser Futtermittel muss also nach folgendem geaumlnderten Verfahren vorgegangen werden DasVerfahren 5111 wird bis zur Filtration durchgefuumlhrt Das den unloumlslichen Ruumlckstand enthaltende Filterpapier wird 2-mal mitkochendem Wasser ausgewaschen in eine Quarz- oder Platinschale gegeben und im Muffelofen (41) bei weniger als 550 oC bis zurvollstaumlndigen Elimination aller Kohlepartikel verascht Nach dem Abkuumlhlen werden einige Tropfen Wasser und danach 10-15 mlFluorwasserstoffsaumlure (34) zugegeben und bei ca 150 oC zur Trockne eingedampft Verbleibt im Ruumlckstand noch Kieselsaumlure so wirddiese erneut in einigen ml Fluorwasserstoffsaumlure (34) geloumlst und anschlieszligend zur Trockne eingedampft Dann werden 5 TropfenSchwefelsaumlure (35) zugesetzt und so lange erhitzt bis keine weiszligen Daumlmpfe mehr auftreten Nach Zugabe von 5 ml 6 moll Salzsaumlure(32) und etwa 30 ml Wasser wird erhitzt und die Loumlsung in den 250-ml-Messkolben filtriert Letzterer wird mit Wasser zur Markeaufgefuumlllt (HCl-Konzentration etwa 05 moll) Anschlieszligend wird wie ab 512 beschrieben weiterverfahren

Dem Ruumlckstand werden 15 ml 6 moll Salzsaumlure (32) und anschlieszligend etwa 120 ml Wasser zugefuumlgtUmgeruumlhrt wird mit dem Glasstab der in dem Becherglas zu belassen ist Letzteres wird mit einem Uhrglasabgedeckt Die Fluumlssigkeit wird langsam zum Sieden gebracht und so lange im Sieden gehalten bis die Aschevollstaumlndig geloumlst ist Dann wird durch ein aschefreies Filterpapier filtriert und das Filtrat in einem 250-ml-Messkolben aufgefangen Das Becherglas und der Filter werden mit 5 ml heiszliger 6 moll Salzsaumlure (32) und 2-malmit kochendem Wasser ausgewaschen Anschlieszligend wird der Messkolben mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt (HCl-Konzentration etwa 05 moll)

5112 Sollte der Filterruumlckstand schwarz aussehen (Kohlenstoff) so wird er im Trockenschrank abermals bei 450 bis475 oC verascht Diese Veraschung die nur wenige Stunden erfordert (etwa 3 bis 5 h) ist abgeschlossen wenn dieAsche weiszlig oder nahezu weiszlig aussieht Der Ruumlckstand wird mit etwa 2 ml Salzsaumlure (31) aufgenommen zurTrockne eingedampft und mit 5 ml 6 moll Salzsaumlure (32) versetzt Nach dem Erwaumlrmen wird die Loumlsung in denMesskolben filtriert und Letzterer mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt (HCl-Konzentration etwa 05 moll)

Anmerkungen

a) Bei der Bestimmung des Gehalts an Spurenelementen ist unbedingt auf die Gefahr von Verunreinigungeninsbesondere durch Zink Kupfer und Eisen zu achten Deshalb muumlssen die bei der Probenvorbereitungbenutzten Geraumlte frei von diesen Metallen sein

Um die Gefahr von Verunreinigungen einzuschraumlnken ist in staubfreier Luft mit absolut reinen Geraumltenund sorgfaumlltig gewaschenen Glasgeraumlten zu arbeiten Die Zinkbestimmung ist fuumlr Verunreinigungen durchGlasgeraumlte Reagenzien Staub usw besonders anfaumlllig

b) Die Einwaage wird nach dem etwa zu erwartenden Spurenelementgehalt des Futtermittels unterBeruumlcksichtigung der Empfindlichkeit des verwendeten Spektralfotometers berechnet Bei Futtermitteln dieeinen niedrigen Gehalt an Spurenelementen aufweisen kann es erforderlich sein eine Probe von10 bis 20 g einzuwaumlgen und das Volumen der Analysenloumlsung auf 100 ml zu begrenzen

c) Die Veraschung muss in einem geschlossenen Muffelofen ohne Einblasen von Luft oder Sauerstoff erfolgen

d) Die vom Pyrometer angezeigte Temperatur darf 475 oC nicht uumlberschreiten

512 S p e k t r a l f o t ome t r i s c h e B e s t immung

5121 He r s t e l l e n d e r K a l i b r i e r l ouml s u n g e n

Aus den Gebrauchsstandardloumlsungen 371 381 391 und 3101 werden fuumlr jedes der zu bestimmendenSpurenelemente eine Reihe von Kalibrierloumlsungen hergestellt Jede dieser Kalibrierloumlsungen hat eine HCl-Konzentration von etwa 05 moll und (im Falle von Eisen Mangan und Zink) einen Lanthanchlorid-Gehalt dereiner Massenkonzentration von 01 La entspricht

Die gewaumlhlten Spurenelementkonzentrationen muumlssen im Empfindlichkeitsbereich des verwendeten Spektral-fotometers liegen Die nachfolgenden Tabellen zeigen Beispiele fuumlr die Zusammensetzung typischer Reihen vonKalibrierloumlsungen Je nach Typ und Empfindlichkeit des verwendeten Spektralfotometers kann es jedocherforderlich sein fuumlr die Kalibrierloumlsungen eine andere Konzentration zu waumlhlen

Eisen

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5

ml Gebrauchsstandardloumlsung (371)(1 ml = 100 μg Fe)

0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7

10 ml Lanthanchloridloumlsung (311) zugeben und mit Wasser auf 100 ml auffuumlllen

Kupfer

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10

ml Gebrauchsstandardloumlsung (381)(1 ml = 10 μg Cu)

0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10

ml Gebrauchsstandardloumlsung (391)(1 ml = 10 μg Mn)

0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08

ml Gebrauchsstandardloumlsung (3101)(1 ml = 10 μg Zn)

0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


5122 He r s t e l l e n d e r A n a l y s e n l ouml s u n g

Fuumlr die Bestimmung des Kupfergehalts kann die nach 511 hergestellte Analysenloumlsung in der Regel direktverwendet werden Gegebenenfalls wird ein aliquoter Teil dieser Analysenloumlsung in einen 100-ml-Messkolbenpipettiert und mit 05 moll Salzsaumlure (33) zur Marke aufgefuumlllt um ihre Konzentration in den Bereich derKalibrierloumlsungen zu bringen

Fuumlr die Bestimmung des Gehalts an Eisen Mangan und Zink wird ein aliquoter Teil der nach 511 hergestelltenLoumlsung in einen 100-ml-Messkolben pipettiert Es werden 10 ml Lanthanchloridloumlsung (311) zugegeben undmit 05 moll Salzsaumlure (33) zur Marke aufgefuumlllt (siehe Bemerkung 8)

5123 B l i n d v e r s u c h

Es wird ein Blindversuch ausgefuumlhrt der alle Verfahrensschritte umfassen muss nur dass das Probematerial selbstweggelassen wird Die Kalibrierloumlsung bdquo0ldquo ersetzt nicht den Blindversuch

5124 Me s s u n g d e r A t om a b s o r p t i o n

Die Atomabsorption der Kalibrierloumlsungen und der Analysenloumlsungen ist mit oxydierender Luft-Azetylen-Flamme bei folgenden Wellenlaumlngen zu messen

Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm

Jede Messung ist 4-mal auszufuumlhren

52 Mineralfutter

Enthaumllt die Probe keine organischen Substanzen so eruumlbrigt sich eine vorherige Veraschung In diesem Fall wirddann ab 5111 zweiter Absatz weiterverfahren Ein Abrauchen mit Fluorwasserstoffsaumlure kann entfallen


Die Spurenelementkonzentration in der Analysenloumlsung wird mithilfe einer Kalibrationskurve berechnet und dasErgebnis in mg Spurenelementkg der Probe (ppm) ausgedruumlckt


7 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen eines Analytikers bei ein und derselbenProbe darf die folgenden Werte nicht uumlberschreiten

mdash 5 mgkg absolut fuumlr Spurenelementgehalte bis 50 mgkg

mdash 10 des houmlheren Werts fuumlr Spurenelementgehalte von 50 bis 100 mgkg

mdash 10 mgkg absolut fuumlr Spurenelementgehalte von 100 bis 200 mgkg

mdash 5 des houmlheren Werts fuumlr Spurenelementgehalte von mehr als 200 mgkg

8 Bemerkung

Das Vorhandensein von groumlszligeren Phosphatmengen kann die Bestimmung des Gehalts an Eisen Mangan undZink beeintraumlchtigen Diese Interferenzen sind durch die Zugabe von Lanthanchloridloumlsung (311) zu korrigierenWeist die Probe jedoch das Gewichtsverhaumlltnis Ca + MgP gt 2 auf kann auf die Zugabe von Lanthanchlorid-loumlsung (311) zu der Analysenloumlsung und den Kalibrierloumlsungen verzichtet werden

D BESTIMMUNG DES HALOFUGINONGEHALTS

DL-trans-7-Brom-6-chlor-3-(3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl)-4(3H)-chinazolinon-hydrobromid


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Halofuginongehalts von Futtermitteln Die Bestimmungsgrenze betraumlgt1 mgkg

2 Prinzip

Nach der Behandlung mit heiszligem Wasser wird Halofuginon als freie Base mit Ethylacetat extrahiert undanschlieszligend durch Ausschuumltteln mit Salzsaumlure in das Hydrochlorid uumlberfuumlhrt Der Extrakt wird durchIonenaustauschchromatografie gereinigt Der Halofuginongehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsfluumls-sigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt

3 Reagenzien

31 Acetonitril HPLC-Qualitaumlt

32 Amberlite XAD-2-Harz

33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat

35 Essigsaumlure (Eisessig)

36 Halofuginon-Standardsubstanz DL-trans-7-Brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-4(3H)-chinazo-linon-hydrobromid E 764

361 H a l o f u g i n o n - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 1 00 μ g m l

Von Halofuginon (36) werden 50 mg auf 01 mg genau in einen 500-ml-Messkolben eingewogen und inAmmoniumacetat-Pufferloumlsung (318) geloumlst Es wird mit der Pufferloumlsung zur Marke aufgefuumlllt und gemischtDiese Loumlsung ist 3 Wochen haltbar wenn sie im Dunkeln bei 5 oC aufbewahrt wird

362 K a l i b r i e r l ouml s u n g e n

Von der Standard-Stammloumlsung (361) werden 10 20 30 40 bzw 60 ml jeweils in einen 100-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit der mobilen Phase (321) zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt DieseLoumlsungen enthalten Halofuginon in Konzentrationen von 10 20 30 40 bzw 60 μgml Die Loumlsungenmuumlssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden


37 Salzsaumlure (ρ20 = ca 116 gml)

38 Methanol

39 Silbernitrat

310 Natriumascorbat

311 Natriumcarbonat (Soda)

312 Natriumchlorid

313 EDTA (Ethylendiamintetraessigsaumlure Dinatriumsalz)

314 Wasser HPLC-Qualitaumlt

315 Natriumcarbonatloumlsung c = 10 g100 ml

316 Mit Natriumchlorid gesaumlttigte Natriumcarbonatloumlsung c = 5 g100 ml

50 g Natriumcarbonat (311) werden in Wasser geloumlst und auf 1 l verduumlnnt dann wird Natriumchlorid (312)zugegeben bis die Loumlsung gesaumlttigt ist

317 Salzsaumlure ca 01 moll

10 ml Salzsaumlure (37) werden mit Wasser auf 1 l verduumlnnt

318 Ammoniumacetat-Pufferloumlsung ca 025 moll

193 g Ammoniumacetat (33) und 30 ml Essigsaumlure (35) werden in Wasser (314) geloumlst und auf 1 l verduumlnnt

319 Vorbereitung des Amberlite XAD-2-Harzes

Eine ausreichende Menge Amberlite (32) wird mit Wasser chloridfrei gewaschen Die Pruumlfung derWaschfluumlssigkeit erfolgt mit Silbernitratloumlsung (320) Danach wird das Harz mit 50 ml Methanol (38)gewaschen Das Methanol wird verworfen und das Harz in frischem Methanol aufbewahrt

320 Silbernitratloumlsung ca 01 moll

017 g Silbernitrat (39) werden in 10 ml Wasser geloumlst

321 Mobile Phase fuumlr die HPLC

500 ml Acetonitril (31) werden mit 300 ml Ammoniumacetat-Pufferloumlsung (318) und 1 200 ml Wasser (314)gemischt Der pH-Wert wird mit Essigsaumlure (35) auf 43 eingestellt Die Loumlsung wird durch einen 022-μm-Fil-ter (48) filtriert und entgast (z B durch 10-minuumltige Ultraschallbehandlung) Diese Loumlsung ist 1 Monat langhaltbar wenn sie in einem verschlossenen Gefaumlszlig im Dunkeln aufbewahrt wird

4 Geraumlte

41 Ultraschallbad

42 Rotationsverdampfer

43 Zentrifuge

44 HPLC-Einrichtung mit UV-Detektor mit variabler Wellenlaumlngeneinstellung oder Diodenarray-Detektor


45 Glassaumlule (300 times 10 mm) mit gesintertem Glasfilter und Absperrhahn

46 Glasfaserfilter 150 mm Durchmesser




5 Verfahren

Anmerkung Halofuginon ist als freie Base in Alkali- und Ethylacetat-Loumlsungen instabil Es darf houmlchstens30 min in Ethylacetat bleiben

51 Allgemeines

511 Zur Pruumlfung dass weder Halofuginon noch Stoumlrsubstanzen vorhanden sind ist eine Blindprobe zu untersuchen

512 Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe untersucht wird die mit Halofuginon angereichertwurde Die zugesetzte Menge an Halofuginon sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen ZurAnreicherung auf einen Gehalt von 3 mgkg werden 300 μl der Standard-Stammloumlsung (361) zu 10 g derBlindprobe gegeben Es wird gemischt und 10 min gewartet bevor mit der Extraktion (52) fortgefahren wird

Anmerkung Fuumlr den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe aumlhnlich zusammengesetzt sein wie die zuuntersuchende Probe und Halofuginon darf nicht nachweisbar sein

52 Extraktion

Von der vorbereiteten Probe werden 10 g auf 01 g genau in ein 200-ml-Zentrifugenglas eingewogen Es werden05 g Natriumascorbat (310) 05 g EDTA (313) und 20 ml Wasser hinzugefuumlgt und es wird gemischt DasZentrifugenglas wird 5 min in ein 80 oC heiszliges Wasserbad gestellt Nach dem Abkuumlhlen auf Raumtemperaturwerden 20 ml Natriumcarbonatloumlsung (315) hinzugefuumlgt und es wird gemischt Unmittelbar danach werden100 ml Ethylacetat (34) hinzugefuumlgt und es wird 15 s kraumlftig von Hand geschuumlttelt Danach wird dasZentrifugenglas mit gelockertem Stopfen 3 min in ein Ultraschallbad (41) gestellt Es wird 2 min zentrifugiertund die Ethylacetatphase durch einen Glasfaserfilter (46) in einen 500-ml-Scheidetrichter dekantiert DieExtraktion der Probe wird mit weiteren 100 ml Ethylacetat wiederholt Die vereinigten Extrakte werden 1 minlang mit 50 ml der mit Natriumchlorid gesaumlttigten Natriumcarbonatloumlsung (316) gewaschen Die waumlssrige Phasewird verworfen

Die organische Phase wird 1 min mit 50 ml Salzsaumlure (317) extrahiert Die untere Saumlurephase wird in einen 250-ml-Scheidetrichter abgelassen Die organische Phase wird erneut 15 min mit weiteren 50 ml Salzsaumlure extrahiertDie beiden Saumlureextrakte werden vereinigt und durch ca 10 s langes Schuumltteln mit 10 ml Ethylacetat (34)gewaschen

Die waumlssrige Phase wird quantitativ in einen 250-ml-Rundkolben uumlberfuumlhrt und die organische Phase verworfenDas restliche in der sauren Loumlsung enthaltene Ethylacetat wird mithilfe des Rotationsverdampfers (42) entferntDie Temperatur des Wasserbads darf 40 oC nicht uumlberschreiten Bei einem Unterdruck von ca 25 mbar wird dasrestliche Ethylacetat bei 38 oC innerhalb von 5 min entfernt

53 Clean-up

531 Vo r b e r e i t u n g d e r Amb e r l i t e s auml u l e

Fuumlr jeden Probenextrakt wird eine XAD-2-Saumlule vorbereitet Von dem vorbereiteten Amberlite (319) werden10 g mit Methanol (38) in eine Glassaumlule (45) eingefuumlllt Auf das obere Ende des Harzbettes wird ein kleinerGlaswattebausch gebracht Das Methanol wird aus der Saumlule ablaufen gelassen und das Harz mit 100 ml Wassergewaschen Sobald die Fluumlssigkeit das obere Ende des Harzbettes erreicht hat wird der Absperrhahn geschlossenVor Gebrauch ist die Saumlule 10 min zu aumlquilibrieren Die Saumlule darf nie trockenlaufen

532 C l e a n - u p d e r P r o b e

Der Extrakt (52) wird quantitativ auf die vorbereitete Amberlitesaumlule (531) aufgebracht und eluiert Das Eluatwird verworfen Die Elutionsgeschwindigkeit darf 20 mlmin nicht uumlberschreiten Der Rundkolben wird mit20 ml Salzsaumlure (317) gespuumllt und die Austauschersaumlule mit der Spuumllfluumlssigkeit gewaschen Die eventuell auf derSaumlule verbliebene saure Loumlsung wird mit einem Luftstrom restlos ausgeblasen Die Waschloumlsungen werdenverworfen Es werden 100 ml Methanol (38) auf die Saumlule gegeben und ein Eluat von 5 bis 10 ml in einem250-ml-Rundkolben aufgefangen Das restliche Methanol wird 10 min lang zur Aumlquilibrierung auf dem Harzbelassen anschlieszligend wird die Elution mit einer Elutionsgeschwindigkeit von houmlchstens 20 mlmin fortgesetztund das Eluat in demselben Rundkolben aufgefangen Das Methanol wird am Rotationsverdampfer (42)abgedampft wobei die Temperatur des Wasserbads 40 oC nicht uumlbersteigen darf Der Ruumlckstand wird unterVerwendung der mobilen Phase (321) quantitativ in einen 10-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit dermobilen Phase zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Ein aliquoter Teil wird durch einen Membranfilter (47)filtriert Diese Loumlsung wird fuumlr die HPLC-Bestimmung (54) aufbewahrt


54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r


HPLC-Trennsaumlule (441)

Mobile Phase fuumlr die HPLC (321)


Detektionswellenlaumlnge 243 nm

Einspritzvolumen 40 bis 100 μl

Die Stabilitaumlt des chromatografischen Systems wird uumlberpruumlft indem die Kalibrierloumlsung (362) die 30 μgmlenthaumllt mehrmals eingespritzt wird bis konstante Peakhoumlhen (-flaumlchen) und Retentionszeiten erreicht sind

542 E r s t e l l u n g d e r K a l i b r a t i o n s k u r v e

Jede Kalibrierloumlsung (362) wird mehrmals eingespritzt und die Peakhoumlhen (-flaumlchen) fuumlr die einzelnenKonzentrationen werden gemessen Es wird eine Kalibrationskurve erstellt indem die mittleren Peakhoumlhen oder-flaumlchen der Kalibrierloumlsungen auf der Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in μgml auf derAbszisse aufgetragen werden

543 B e s t immung d e r P r o b e n l ouml s u n g

Der Probenextrakt (532) wird mehrmals eingespritzt wobei dasselbe Volumen wie fuumlr die Einspritzung derKalibrierloumlsungen verwendet wird und die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Halofuginonpeaks wird ermittelt


Aus der mittleren Peakhoumlhe (-flaumlche) der Halofuginonpeaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskur-ve (542) die Konzentration der Probenloumlsung in μgml bestimmt

Der Halofuginongehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c 10m

wobei

c = Halofuginonkonzentration der Probenloumlsung in μgml

m = Probeneinwaage in g

7 Uumlberpruumlfung der Ergebnisse

71 Identitaumlt

Die Identitaumlt des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestaumltigtwerden wobei die Spektren der Probenloumlsung und der Kalibrierloumlsung (362) die 60 μgml enthaumllt verglichenwerden

711 C o - C h r oma t o g r a f i e

Eine Probenloumlsung wird mit einer geeigneten Menge einer Kalibrierloumlsung (362) versetzt Die Menge deszugesetzten Halofuginons muss dem erwarteten Halofuginongehalt der Probenloumlsung entsprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desHalofuginonpeaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darf houmlchstens plusmn 10 von der des Peaks dernicht angereicherten Probenloumlsung abweichen


712 D i o d e n a r r a y -D e t e k t i o n

Die Ergebnisse werden gemaumlszlig den nachstehenden Kriterien beurteilt

a) Die Wellenlaumlngen bei maximaler Absorption des Proben- und des Standardspektrums an der Peakspitzedes Chromatogramms muumlssen innerhalb eines Bereichs uumlbereinstimmen der durch das Aufloumlsungsver-moumlgen des Detektionssystems bestimmt wird Fuumlr die Diodenarray-Detektion betraumlgt dieser Bereich in derRegel plusmn 2 nm

b) Zwischen 225 und 300 nm duumlrfen sich das Proben- und das Standardspektrum an den Peakspitzen desChromatogramms in den Bereichen zwischen 10 und 100 relativer Absorption nicht unterscheidenDieses Kriterium ist erfuumlllt wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den beidenSpektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 der Absorption des Standardanalyten betraumlgt

c) Zwischen 225 und 300 nm duumlrfen sich die Spektren des Probenextrakts im Anstieg an der Spitze und imAbstieg des Probenpeaks in den Bereichen zwischen 10 und 100 relativer Absorption nichtunterscheiden Dieses Kriterium ist erfuumlllt wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichungder Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 der Absorption des Spektrums amPeakmaximum betraumlgt

Wird eines dieser Kriterien nicht erfuumlllt gilt das Vorhandensein des Analyten als nicht bestaumltigt

72 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf beieinem Halofuginongehalt von bis zu 3 mgkg 05 mgkg nicht uumlberschreiten

73 Wiederfindungsrate

Fuumlr eine angereicherte Blindprobe muss die Wiederfindung mindestens 80 betragen


Es wurde ein Ringversuch (1) durchgefuumlhrt bei dem 3 Proben von 8 Laboratorien untersucht wurden DieErgebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst

Ergebnisse

Probe A(Blindprobe)nach Erhalt

Probe B (Mehl) Probe C (Pellets)

Nach Erhalt Nach 2 Mona-ten Nach Erhalt Nach 2 Monaten

Mittelwert [mgkg] NN 280 242 289 245sR [mgkg] mdash 045 043 040 042VKR [ ] mdash 16 18 14 17Wiederfindung [ ] 86 74 88 75

NN = nicht nachweisbarsR = Standardabweichung der VergleichbarkeitVKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

E BESTIMMUNG DES ROBENIDINGEHALTS

13-bis[(4-Chlorobenzyliden)amino]-guanidin-hydrochlorid


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Robenidingehalts von Futtermitteln Die Bestimmungsgrenze betraumlgt5 mgkg


(1) The Analyst 108 1983 S 1252-1256

2 Prinzip

Die Probe wird mit angesaumluertem Methanol extrahiert Der Extrakt wird getrocknet und ein aliquoter Teil zumClean-up auf eine Aluminiumoxidsaumlule gegeben Robenidin wird mit Methanol von der Saumlule eluiert eingeengtund mit der mobilen Phase auf ein geeignetes Volumen gebracht Der Robenidingehalt wird mittelsUmkehrphasen-Hochleistungsfluumlssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektorsbestimmt

3 Reagenzien

31 Methanol

32 Angesaumluertes Methanol

In einen 500-ml-Messkolben werden 40 ml Salzsaumlure (ρ20 = 118 gml) uumlberfuumlhrt Es wird mit Methanol (31)zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt Diese Loumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden


34 Molekularsieb

Typ 3A 8 bis 12 Mesh (Korngroumlszlige 16 bis 25 mm kristallines Aluminiumsilicat Porendurchmesser 03 nm)

35 Aluminiumoxid sauer Aktivitaumltsstufe I fuumlr die Saumlulenchromatografie

100 g Aluminiumoxid werden in ein geeignetes Gefaumlszlig gegeben und mit 20 ml Wasser versetzt Das Gefaumlszlig wirdverschlossen und etwa 20 min geschuumlttelt Das Aluminiumoxid ist in einem gut verschlossenen Behaumllteraufzubewahren

36 Kaliumdihydrogenphosphatloumlsung c = 0025 moll

In einem 1 000-ml-Messkolben werden 340 g Kaliumdihydrogenphosphat in Wasser (HPLC-Qualitaumlt) geloumlst Eswird zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt

37 Dinatriumhydrogenphosphatloumlsung c = 0025 moll

In einem 1 l-Messkolben werden 355 g wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat (oder 445 g Dihydrat oder895 g Dodecahydrat) in Wasser (HPLC-Qualitaumlt) geloumlst Es wird zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt


Folgende Reagenzien werden gemischt

650 ml Acetonitril (33)

250 ml Wasser (HPLC-Qualitaumlt)

50 ml Kaliumdihydrogenphosphatloumlsung (36)

50 ml Dinatriumhydrogenphosphatloumlsung (37)

Die Loumlsung wird durch einen 022-μm-Filter (46) filtriert und entgast (z B durch 10-minuumltige Ultraschallbe-handlung)

39 Standardsubstanz

Robenidin 13-bis[(4-Chlorobenzyliden)amino]-guanidin-hydrochlorid rein

391 Ro b e n i d i n - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 3 00 μ g m l

Von der Robenidin-Standardsubstanz (39) werden 30 mg auf 01 mg genau eingewogen in einem 100-ml-Messkolben in angesaumluertem Methanol (32) geloumlst und mit demselben Loumlsungsmittel zur Marke aufgefuumlllt unddurchmischt Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt und im Dunkeln aufbewahrt


392 Ro b e n i d i n - S t a n d a r d l ouml s u n g 1 2 μ g m l

Von der Standard-Stammloumlsung (391) werden 100 ml in einen 250-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit dermobilen Phase (38) zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumllltund im Dunkeln aufbewahrt


Von der Robenidin-Standardloumlsung (392) werden 50 100 150 200 bzw 250 ml jeweils in einen 50-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit der mobilen Phase (38) zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt DieseLoumlsungen enthalten Robenidin in Konzentrationen von 12 24 36 48 bzw 60 μgml Die Loumlsungen muumlssenvor Gebrauch frisch hergestellt werden


4 Geraumlte

41 Glassaumlule

Braunglas mit Absperrhahn und Reservoir mit einem Fassungsvermoumlgen von ca 150 ml Innendurchmesser10 bis 15 mm Laumlnge 250 mm



44 HPLC-Einrichtung mit UV-Detektor mit variabler Wellenlaumlngeneinstellung oder Diodenarray-Detektor mit einemMessbereich von 250 bis 400 nm


45 Glasfaser-Filterpapier z B Whatman GFA oder gleichwertig



5 Verfahren

Anmerkung Robenidin ist lichtempfindlich Bei allen Verfahrensschritten sind Braunglasgeraumlte zu verwenden

51 Allgemeines

511 Zur Pruumlfung dass weder Robenidin noch Stoumlrsubstanzen vorhanden sind ist eine Blindprobe zu untersuchen

512 Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe (511) untersucht wird die mit Robenidinangereichert wurde Die zugesetzte Menge an Robenidin sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechenZur Anreicherung auf einen Gehalt von 60 mgkg werden 30 ml der Standard-Stammloumlsung (391) in einen250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben Die Loumlsung wird in einem Stickstoffstrom auf ca 05 ml eingeengt Dannwerden 15 g der Blindprobe zugegeben Es wird gemischt und 10 min stehen gelassen bevor mit der Extrak-tion (52) fortgefahren wird

Anmerkung Fuumlr den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe aumlhnlich zusammengesetzt sein wie die zuuntersuchende Probe und Robenidin darf nicht nachweisbar sein

52 Extraktion

Von der vorbereiteten Probe werden 15 g auf 001 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen mit1000 ml angesaumluertem Methanol (32) versetzt und nach Verschlieszligen des Kolbens 1 h auf dem Schuumlttler (42)geschuumlttelt Die Loumlsung wird uumlber Glasfaserfilterpapier (45) filtriert und das gesamte Filtrat in einem 150-ml-Erlenmeyerkolben aufgefangen Es werden 75 g Molekularsieb (34) zugegeben und nach Verschlieszligen desKolbens wird 5 min geschuumlttelt Anschlieszligend wird sofort durch ein Glasfaserfilterpapier filtriert Diese Loumlsungwird fuumlr die Reinigung (53) aufbewahrt


53 Reinigung

531 Vo r b e r e i t u n g d e r A l um i n i umox i d - S auml u l e

In das untere Ende der Glassaumlule (41) wird ein Glaswattebausch eingebracht der mit einem Glasstabzusammengedruumlckt wird Von dem vorbereiteten Aluminiumoxid (35) werden 110 g auf die Saumlule aufgebrachtDabei ist darauf zu achten dass der Kontakt mit der Luft so gering wie moumlglich gehalten wird Durch leichtesKlopfen an das untere Ende der befuumlllten Saumlule wird das Aluminiumoxid verdichtet

532 R e i n i g u n g d e r P r o b e

Von dem Probenextrakt (52) werden 50 ml mit einer Pipette auf die Saumlule gegeben wobei die Pipettenspitze dieSaumlulenwand beruumlhren soll Nach Absorption der Loumlsung durch das Aluminiumoxid wird das Robenidin mit100 ml Methanol (31) bei einer Flussrate von 2-3 mlmin von der Saumlule eluiert und das Eluat in einem 250-ml-Rundkolben aufgefangen Die Methanolloumlsung wird am Rotationsverdampfer (43) bei 40 oC und untervermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt Der Ruumlckstand wird mit 3 bis 4 ml der mobilen Phase (38)erneut geloumlst und quantitativ in einen 10-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Der Kolben wird mehrmals mit je 1 bis 2 mlder mobilen Phase gespuumllt und die Spuumllloumlsungen werden in den Messkolben gegeben Es wird mit der mobilenPhase zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Ein aliquoter Teil wird durch einen 045-μm-Membranfilter (47)filtriert Diese Loumlsung wird fuumlr die HPLC-Bestimmung (54) aufbewahrt

54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r



mobile Phase fuumlr die HPLC (38)



Einspritzvolumen 20 bis 50 μl)



Jede Kalibrierloumlsung (393) wird mehrmals eingespritzt und die Peakhoumlhen (-flaumlchen) fuumlr die einzelnenKonzentrationen werden gemessen Es wird eine Kalibrationskurve erstellt indem die mittleren Peakhoumlhen(-flaumlchen) der Kalibrierloumlsungen auf der Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in μgml auf derAbszisse aufgetragen werden


Der Probenextrakt (532) wird mehrmals eingespritzt wobei dasselbe Volumen wie fuumlr die Einspritzung derKalibrierloumlsungen verwendet wird und die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Robenidinpeaks wird ermittelt


Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Robenidinpeaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve (542)die Konzentration der Probenloumlsung in μgml bestimmt

Der Robenidingehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c 200

m

wobei

c = Robenidinkonzentration der Probenloumlsung in μgml




71 Identitaumlt



Eine Probenloumlsung wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierloumlsung (393) versetzt Die Menge des zugesetztenRobenidins muss dem erwarteten Robenidingehalt der Probenloumlsung entsprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desRobenidinpeaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darf houmlchstens plusmn 10 von der des Peaks dernicht angereicherten Probenloumlsung abweichen







72 Wiederholbarkeit

Bei einem Robenidingehalt von mehr als 15 mgkg darf die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier parallelerBestimmungen an ein und derselben Probe 10 des houmlheren Werts nicht uumlberschreiten


Fuumlr eine angereicherte Blindprobe muss die Wiederfindungsrate mindestens 85 betragen


Bei einem EG-Ringversuch wurden 4 Proben von Gefluumlgel- und Kaninchenfutter in Form von Mehl oder Pelletsvon 12 Laboratorien analysiert Jede Probe wurde doppelt analysiert Die Ergebnisse sind in der nachstehendenTabelle zusammengefasst

Gefluumlgelfutter Kaninchenfutter

Mehl Pellets Mehl Pellets

Mittelwert [mgkg] 2700 2799 436 401sr [mgkg] 146 126 144 166VKr [ ] 54 45 33 41sR [mgkg] 436 336 461 391VKR [ ] 161 120 106 97Wiederfindung [ ] 900 933 872 802

sr = Standardabweichung der WiederholbarkeitVKr = Variationskoeffizient der WiederholbarkeitsR = Standardabweichung der VergleichbarkeitVKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit


F BESTIMMUNG DES DICLAZURILGEHALTS

26-Dichlor-alpha-(4-chlorophenyl)-4-(45-dihydro-35-dioxo-124-triazin-2-(3H)-yl)benzacetonitril


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Diclazurilgehalts von Futtermitteln und Vormischungen DieNachweisgrenze betraumlgt 01 mgkg die Bestimmungsgrenze 05 mgkg

2 Prinzip

Nach Hinzufuumlgen eines internen Standards wird die Probe mit angesaumluertem Methanol extrahiert BeiFuttermitteln wird ein aliquoter Teil des Extrakts mit einer C18-Festphasen-Extraktionskartusche gereinigtDiclazuril wird aus der Kartusche mit einem Gemisch aus angesaumluertem Methanol und Wasser eluiert Nach demEinengen wird der Ruumlckstand in DMFWasser geloumlst Bei Vormischungen wird der Extrakt eingeengt und derRuumlckstand in DMFWasser geloumlst Der Diclazurilgehalt wird mittels ternaumlrer Gradienten-Hochleistungsfluumlssig-keitschromatografie (HPLC) uumlber eine Umkehrphase unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt

3 Reagenzien


32 Ammoniumacetat

33 Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBHS)



36 NN-Dimethylformamid (DMF)


38 Standardsubstanz Diclazuril II-24 26-Dichlor-alpha-(4-chlorophenyl)-4-(45-dihydro-35-dioxo-124-triazin-2-(3H)-yl)benzacetonitril rein E 771

381 D i c l a z u r i l - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 5 00 μ g m l

Von der Diclazuril-Standardsubstanz (38) werden 25 mg auf 01 mg genau in einen 50-ml-Messkolbeneingewogen und in DMF (36) geloumlst es wird mit DMF (36) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Messkolbenwird mit Aluminiumfolie umhuumlllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kuumlhlschrankaufbewahrt Bei einer Temperatur von le 4 oC ist diese Loumlsung 1 Monat haltbar

382 D i c l a z u r i l - S t a n d a r d l ouml s u n g 5 0 μ g m l

Von der Standard-Stammloumlsung (381) werden 500 ml in einen 50-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt es wird mitDMF (36) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt (oder einMesskolben aus braunem Glas verwendet) und im Kuumlhlschrank aufbewahrt Bei einer Temperatur von le 4 oC istdiese Loumlsung 1 Monat haltbar

39 Interne Standardsubstanz 26 Dichloro-α-(4-chlorophenyl)-4-(45-dihydro-35-dioxo-124-triazin-2-(3H)-yl)-α-methylbenzacetonitril

391 I n t e r n e S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 5 00 μ g m l

Von der internen Standardsubstanz (39) werden 25 mg auf 01 mg genau in einen 50-ml-Messkolbeneingewogen und in DMF (36) geloumlst es wird mit DMF (36) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Messkolbenwird mit Aluminiumfolie umhuumlllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kuumlhlschrankaufbewahrt Bei einer Temperatur von le 4 oC ist diese Loumlsung 1 Monat haltbar

392 I n t e r n e S t a n d a r d l ouml s u n g 5 0 μ g m l

Von der internen Standard-Stammloumlsung (391) werden 500 ml in einen 50-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt es wirdmit DMF (36) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt (oder einMesskolben aus braunem Glas verwendet) und im Kuumlhlschrank aufbewahrt Bei einer Temperatur von le 4 oC istdiese Loumlsung 1 Monat haltbar


393 I n t e r n e S t a n d a r d l ouml s u n g f uuml r Vo rm i s c hu n g e n p 1 000 mg m l

(p = Diclazuril-Sollgehalt in der Vormischung in mgkg)

Von der internen Standardsubstanz werden p10 mg auf 01 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogenund mittels Ultraschallbad (46) in DMF (36) geloumlst es wird mit DMF (36) zur Marke aufgefuumlllt und gemischtDer Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und imKuumlhlschrank aufbewahrt Bei einer Temperatur von le 4 oC ist diese Loumlsung 1 Monat haltbar

310 Kalibrierloumlsung 2 μgml

In einen 50-ml-Messkolben werden 200 ml Diclazuril-Standardloumlsung (382) und 200 ml interneStandardloumlsung (392) pipettiert Es werden 16 ml DMF (36) hinzugefuumlgt anschlieszligend wird mit Wasser zurMarke aufgefuumlllt und gemischt Diese Loumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden

311 C18-Festphasen-Extraktionskartusche z B Bond Elut Groumlszlige 1 cc Sorptionsmenge 100 mg

312 Extraktionsloumlsung angesaumluertes Methanol

50 ml Salzsaumlure (37) werden in 1 000 ml Methanol (35) pipettiert und gemischt


3131 Elutionsmittel A Ammoniumacetat-Tetrabutylammoniumhydrogensulfat-Loumlsung

5 g Ammoniumacetat (32) und 34 g TBHS (33) werden in 1 000 ml Wasser (31) geloumlst und gemischt

3132 Elutionsmittel B Acetonitril (34)

3133 Elutionsmittel C Methanol (35)

4 Geraumlte

41 Mechanischer Schuumlttler

42 HPLC-Einrichtung fuumlr ternaumlren Gradienten

421 HPLC-Trennsaumlule 3 μm Korngroumlszlige 100 times 46 mm z B Hypersil ODS oder vergleichbare Saumlule

422 UV-Detektor mit variabler Wellenlaumlngeneinstellung oder Diodenarray-Detektor



45 Vakuumeinrichtung

46 Ultraschallbad

5 Verfahren

51 Allgemeines

511 B l i n d p r o b e

Zur Pruumlfung dass weder Diclazuril noch Stoumlrsubstanzen vorhanden sind ist eine Blindprobe zu untersuchen DieBlindprobe muss aumlhnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe und Diclazuril oderStoumlrsubstanzen duumlrfen nicht nachweisbar sein

512 W i e d e r f i n d u n g s t e s t

Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe untersucht wird die mit Diclazuril angereichertwurde Die zugesetzte Menge sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen Zur Anreicherung aufeinen Gehalt von 1 mgkg werden 01 ml der Standard-Stammloumlsung (381) zu 50 g der Blindprobe gegeben Eswird gruumlndlich gemischt 10 min stehen gelassen und nochmals mehrfach gemischt bevor mit der Extrak-tion (52) fortgefahren wird


Ist eine der zu untersuchenden Probe aumlhnliche Blindprobe nicht verfuumlgbar (siehe 511) so kann einWiederfindungstest mithilfe des Additionsverfahrens durchgefuumlhrt werden In diesem Fall wird die zuuntersuchende Probe mit einer Diclazurilmenge angereichert die der bereits in der Probe vorhandenen Mengeentspricht Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht und die Wieder-findungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden

52 Extraktion

521 F u t t e rm i t t e l

Von der Probe werden 50 g auf 001 g genau eingewogen und in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben uumlberfuumlhrt Eswerden 100 ml der internen Standardloumlsung (392) und 200 ml Extraktionsloumlsung (312) hinzugefuumlgtAnschlieszligend wird der Kolben verschlossen Die Mischung wird uumlber Nacht auf dem Schuumlttler (41) geschuumltteltund anschlieszligend 10 min stehen gelassen Ein aliquoter Teil von 20 ml der uumlberstehenden Loumlsung wird in einengeeigneten Glasbehaumllter uumlberfuumlhrt und mit 20 ml Wasser verduumlnnt Diese Loumlsung wird auf eine Extraktions-kartusche (311) gegeben und mittels Vakuum (45) hindurch gesaugt Die Kartusche wird mit 25 ml einerMischung aus Extraktionsloumlsung (312) und Wasser 65 + 35 (V+V) ausgewaschen Die gesammelten Fraktionenwerden verworfen und der Wirkstoff und der interne Standard werden mit 25 ml einer Mischung ausExtraktionsloumlsung (312) und Wasser 80 + 20 (V+V) eluiert Diese Fraktion wird mithilfe eines Rotationsver-dampfers (43) bei 60 oC zur Trockne eingeengt Der Ruumlckstand wird in 10 ml DMF (36) geloumlst es werden15 ml Wasser (31) hinzugefuumlgt gemischt und durch einen Membranfilter (44) filtriert Anschlieszligend wird dieHPLC-Bestimmung (53) durchgefuumlhrt

522 Vo rm i s c hu n g e n

Von der Probe wird 1 g auf 0001 g genau eingewogen und in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben uumlberfuumlhrt Eswerden 100 ml interne Standardloumlsung (393) und 200 ml Extraktionsloumlsung (312) hinzugefuumlgt und derKolben wird verschlossen Die Mischung wird uumlber Nacht auf dem Schuumlttler (41) geschuumlttelt und anschlieszligend10 min stehen gelassen Ein 10 000p-ml-Aliquot (p = Diclazuril-Sollgehalt in der Vormischung in mgkg) deruumlberstehenden Loumlsung wird in einen Rundkolben geeigneter Groumlszlige uumlberfuumlhrt Es wird mithilfe einesRotationsverdampfers (43) bei vermindertem Druck und 60 oC zur Trockne eingeengt Der Ruumlckstand wirdin 100 ml DMF (36) geloumlst es werden 150 ml Wasser (31) hinzugefuumlgt und gemischt Anschlieszligend wird dieHPLC-Bestimmung (53) durchgefuumlhrt

53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r


HPLC-Trennsaumlule(421)

100 times 46 mm Hypersil ODS 3 μmKorngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

Mobile Phase Elutionsmittel A (3131) waumlssrige Loumlsung von Ammoniumacetatund Tetrabutylammonium-Hydrogen-sulfat

Elutionsmittel B (3132) Acetonitril

Elutionsmittel C (3133) Methanol

Elutionsmodus mdash linearer Gradientmdash Anfangsbedingungen A + B + C = 60 + 20 + 20 (V+V+V)mdash nach 10 min Gradientenelution 30 min lang A + B + C = 45 + 20 + 35 (V+V

+V)Mit Elutionsmittel B 10 min spuumllen



Detektionswellen-laumlnge

280 nm


532 B e s t immung d e r K a l i b r i e r l ouml s u n g

Von der Kalibrierloumlsung (310) werden 20 μl mehrmals eingespritzt und fuumlr Diclazuril und den internenStandard wird die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) bestimmt


Von der Probenloumlsung (521 oder 522) werden mehrmals 20 μl eingespritzt und fuumlr Diclazuril und deninternen Standard wird die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) bestimmt



61 Futtermittel

Der Diclazurilgehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

wobei

hds = Peakhoumlhe (-flaumlche) von Diclazuril in der Probenloumlsung (521)his = Peakhoumlhe (-flaumlche) des internen Standards in der Probenloumlsung (521)hdc = Peakhoumlhe (-flaumlche) von Diclazuril in der Kalibrierloumlsung (310)hic = Peakhoumlhe (-flaumlche) des internen Standards in der Kalibrierloumlsung (310)cdc = Diclazurilkonzentration in der Kalibrierloumlsung in μgml (310)m = Probeneinwaage in gV = Volumen der Probenextrakts gemaumlszlig 521 (d h 25 ml)

62 Vormischungen


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

wobei

hdc = Peakhoumlhe (-flaumlche) von Diclazuril in der Kalibrierloumlsung (310)hic = Peakhoumlhe (-flaumlche) des internen Standards in der Kalibrierloumlsung (310)hds = Peakhoumlhe (-flaumlche) von Diclazuril in der Probenloumlsung (522)his = Peakhoumlhe (-flaumlche) des internen Standards in der Probenloumlsung (522)cdc = Diclazurilkonzentration in der Kalibrierloumlsung in μgml (310)m = Probeneinwaage in gV = Volumen des Probenextrakts gemaumlszlig 522 (d h 25 ml)p = Diclazuril-Sollgehalt in der Vormischung in mgkg


71 Identitaumlt

Die Identitaumlt des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestaumltigtwerden wobei die Spektren der Probenloumlsung (521 oder 522) und der Kalibrierloumlsung (310) verglichenwerden


Eine nach 521 oder 522 hergestellte Probenloumlsung wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierloumlsung (310)angereichert Die Menge des zugesetzten Diclazurils muss dem erwarteten Diclazurilgehalt der Probenloumlsungentsprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desDiclazurilpeaks und des Peaks des internen Standards vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darfhoumlchstens plusmn 10 von der des urspruumlnglichen Diclazurilpeaks oder Standardpeaks des nicht angereichertenProbenextrakts abweichen






c) Zwischen 230 und 320 nm duumlrfen sich die Spektren des Probenextrakts im Anstieg an der Spitze und imAbstieg des Probenpeaks in den Bereichen zwischen 10 und 100 relativer Absorption nichtunterscheiden Dieses Kriterium ist erfuumlllt wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichungzwischen den Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 der Absorption des Spektrums amPeakmaximum betraumlgt


72 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darffolgende Werte nicht uumlberschreiten

mdash 30 relativ zum houmlheren Wert bei Diclazurilgehalten zwischen 05 und 25 mgkg

mdash 075 mgkg bei Diclazurilgehalten zwischen 25 und 5 mgkg

mdash 15 relativ zum houmlheren Wert bei Diclazurilgehalten von mehr als 5 mgkg


Bei einer angereicherten (Blind-)Probe muss die Wiederfindungsrate mindestens 80 betragen


Bei einem Ringversuch wurden 5 Proben von 11 Laboratorien untersucht Diese Proben bestanden aus 2Vormischungen von denen eine mit einer organischen Matrix (O 100) und die andere mit einer anorganischenMatrix (A 100) gemischt war Der theoretische Diclazurilgehalt liegt bei 100 mgkg Die 3 Gefluumlgelmischfutter-mittel stammten von 3 verschiedenen Herstellern (NL) (L1Z1K1) Der theoretische Diclazurilgehalt liegt bei1 mgkg Die Laboratorien wurden beauftragt jede der Proben 1- oder 2-mal zu untersuchen (NaumlhereInformationen zu diesem Ringversuch sind dem Journal of AOAC International Band 77 Nr 6 1994 S 1359-1361 zu entnehmen) Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst

Probe 1A 100

Probe 2O 100

Probe 3L1

Probe 4Z1

Probe 5K1

L 11 11 11 11 6n 19 18 19 19 12Mittelwert 1008 1035 089 115 089sr (mgkg) 588 764 015 002 003VKr ( ) 583 738 1732 192 334sR (mgkg) 759 764 017 011 012VKR ( ) 753 738 1861 967 1365

Sollgehalt (mgkg) 100 100 1 1 1

L = Anzahl der Laboratorien

n = Anzahl der Einzelwerte





9 Bemerkungen

Es muss vorab erwiesen sein dass das Diclazurilsignal im linearen Konzentrationsbereich liegt

G BESTIMMUNG DES GEHALTS AN LASALOCID-NATRIUM

Monocarboxylsaumlure-Polyether-Natriumsalz gebildet durch Streptomyces lasaliensis



Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Lasalocid-Natrium in Futtermitteln und Vormischungen DieNachweisgrenze betraumlgt 5 mgkg die Bestimmungsgrenze 10 mgkg

2 Prinzip

Lasalocid-Natrium wird aus der Probe mit angesaumluertem Methanol extrahiert und mittels Umkehrphasen-Hochleistungsfluumlssigchromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines spektrofluorometrischen Detektorsbestimmt

3 Reagenzien

31 Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)


33 Orthophosphorsaumlureloumlsung c = 20

235 ml Orthophosphorsaumlure (32) werden mit Wasser auf 100 ml aufgefuumlllt

34 6-Methyl-2-Heptylamin (15-Dimethylhexylamin) w (Massenanteil) = 99


36 Salzsaumlure Dichte = 119 gml

37 Phosphatpufferloumlsung c = 001 moll

In 500 ml Wasser (311) werden 136 g KH2PO4 (31) geloumlst und es werden 35 ml Orthophosphorsaumlure (32)sowie 100 ml 6-Methyl-2-Heptylamin (34) hinzugefuumlgt Den pH-Wert mit Orthophosphorsaumlureloumlsung (33) aufpH 40 einstellen und mit Wasser (311) auf 1 000 ml auffuumlllen


In einen 1 000-ml-Messkolben werden 50 ml Salzsaumlure (36) gegeben und es wird mit Methanol (35) zur Markeaufgefuumlllt und gemischt Diese Loumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden

39 Mobile Phase fuumlr die HPLC Phosphatpuffer-Methanolloumlsung 5 + 95 (V+V)

Von der Phosphatpufferloumlsung (37) werden 5 ml mit 95 ml Methanol (35) vermischt

310 Lasalocid-Natrium-Standardsubstanz garantiert rein C34H53O8Na (Monocarboxylsaumlure-Polyether-Natriumsalzgebildet durch Streptomyces lasaliensis) E 763

3101 L a s a l o c i d -N a t r i um - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 5 00 μ g m l

Von Lasalocid-Natrium (310) werden 50 mg auf 01 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und inangesaumluertem Methanol (38) geloumlst Es wird mit demselben Loumlsungsmittel zur Marke aufgefuumlllt und gemischtDiese Loumlsung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden

3102 L a s a l o c i d -N a t r i um - S t a n d a r d l ouml s u n g 5 0 μ g m l

Von der Standard-Stammloumlsung (3101) werden 100 ml in einen 100-ml-Messkolben pipettiert es wird mitangesaumluertem Methanol (38) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Diese Loumlsung muss vor Gebrauch frischhergestellt werden



Von der Lasalocid-Natrium-Standardloumlsung (3102) werden 10 20 40 50 bzw 100 ml in jeweils einen 50-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit angesaumluertem Methanol (38) zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt DieseKalibrierloumlsungen enthalten jeweils 10 20 40 50 bzw 100 μg Lasalocid-Natrium je ml Die Loumlsungenmuumlssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden


4 Geraumlte

41 Ultraschallbad (oder Schuumlttel-Wasserbad) mit Temperatursteuerung


43 HPLC-Einrichtung mit Injektionssystem fuumlr Einspritzvolumina von 20 μl

431 HPLC-Trennsaumlule 125 times 4 mm mit Umkehrphase C18 5 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

432 Spektrofluorometer mit variabler Einstellung fuumlr Anregungs- und Emissionswellenlaumlngen

5 Verfahren

51 Allgemeines


Fuumlr die Durchfuumlhrung des Wiederfindungstests (512) ist zur Pruumlfung dass weder Lasalocid-Natrium nochStoumlrsubstanzen vorhanden sind eine Blindprobe zu untersuchen Die Blindprobe muss aumlhnlich zusammengesetztsein wie die zu untersuchende Probe und Lasalocid-Natrium oder Stoumlrsubstanzen duumlrfen nicht nachweisbar sein


Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe untersucht wird die mit Lasalocid-Natriumangereichert wurde Die zugesetzte Menge sollte in etwa der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen ZurAnreicherung auf einen Gehalt von 100 mgkg werden 100 ml der Standard-Stammloumlsung (3101) in einen250-ml-Erlenmeyerkolben uumlberfuumlhrt Die Loumlsung wird auf ca 05 ml eingeengt Dann werden 50 g derBlindprobe zugegeben Es wird gruumlndlich gemischt 10 min stehen gelassen und erneut mehrmals gemischtbevor mit der Extraktion (52) fortgefahren wird

Ist eine der zu untersuchenden Probe aumlhnliche Blindprobe nicht verfuumlgbar (siehe 511) so kann einWiederfindungstest mithilfe des Additionsverfahrens durchgefuumlhrt werden In diesem Fall wird die zuuntersuchende Probe mit einer Lasalocid-Natrium-Menge angereichert die in etwa der bereits in der Probevorhandenen Menge entspricht Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht unddie Wiederfindungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden

52 Extraktion


Von der Probe werden 5 bis 10 g auf 001 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Stopfen eingewogenund 1000 ml angesaumluertes Methanol (38) mit einer Pipette hinzugefuumlgt Der Stopfen wird lose aufgesetzt undder Inhalt zum Dispergieren geschwenkt Der Kolben wird 20 min in ein Ultraschallbad (41) mit einerTemperatur von ca 40 oC gestellt dann entnommen und auf Raumtemperatur abkuumlhlen gelassen Der Kolbenwird etwa 1 h stehen gelassen bis die Schwebstoffe sich abgesetzt haben Dann wird ein aliquoter Teil uumlber einen045-μm-Membranfilter (42) in ein geeignetes Gefaumlszlig filtriert Anschlieszligend wird die HPLC-Bestimmung (53)durchgefuumlhrt


Rund 2 g der nicht gemahlenen Vormischung werden auf 0001 g genau in einen 250-ml-Messkolben gegebenEs werden 1000 ml angesaumluertes Methanol (38) hinzugefuumlgt der Inhalt wird zum Dispergieren geschwenkt DerKolben wird mit Inhalt 20 min lang in ein Ultraschallbad (41) mit einer Temperatur von ca 40 oC gestellt dannentnommen und auf Raumtemperatur abkuumlhlen gelassen Es wird mit angesaumluertem Methanol (38) zur Markeaufgefuumlllt und sorgfaumlltig gemischt Der Kolben wird etwa 1 h stehen gelassen bis die Schwebstoffe sich abgesetzthaben Dann wird ein aliquoter Teil durch einen 045-μm-Membranfilter (42) filtriert Ein aliquoter Teil desklaren Filtrats wird mit angesaumluertem Methanol (38) verduumlnnt um eine Loumlsung mit einer Konzentration vonetwa 4 μgml Lasalocid-Natrium zu erhalten Anschlieszligend wird die HPLC-Bestimmung (53) durchgefuumlhrt


53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r



125 times 4 mm Umkehrphase C18 5 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule

Mobile Phase (39) Mischung aus Phosphatpufferloumlsung (37) und Methanol (35) 5 + 95 (V+V)Durchflussrate 12 mlminDetektionswellen-laumlnge

Anregung 310 nmEmission 419 nm




Jede Kalibrierloumlsung (3103) wird mehrmals eingespritzt und es werden die mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) fuumlrdie einzelnen Konzentrationen gemessen Es wird eine Kalibrationskurve erstellt indem die mittleren Peakhoumlhen(-flaumlchen) auf der Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in μgml auf der Abszisse aufgetragenwerden


Die nach 521 bzw 522 gewonnenen Probenextrakte werden mehrmals eingespritzt wobei dasselbe Volumenwie fuumlr die Einspritzung der Kalibrierloumlsungen verwendet wird Die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Lasalocid-Natrium-Peaks wird ermittelt


Aus der mittleren Peakhoumlhe (-flaumlche) der Probenloumlsung (533) wird anhand der Kalibrationskurve dieKonzentration an Lasalocid-Natrium (μgml) bestimmt

61 Futtermittel

Der Gehalt an Lasalocid-Natrium w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c V1

m[mgkg]

wobei

c = Lasalocid-Natrium-Konzentration der Probenloumlsung (521) in μgmlV1 = Volumen des Probenextrakts gemaumlszlig 521 (d h 100 ml)m = Probeneinwaage in g

62 Vormischungen


w =c V2 f

m[mgkg]

wobei

c = Lasalocid-Natrium-Konzentration der Probenloumlsung (522) in μgmlV2 = Volumen des Probenextrakts gemaumlszlig 522 in ml (d h 250 ml)f = Verduumlnnungsfaktor gemaumlszlig 522m = Probeneinwaage in g


71 Identitaumlt

Nachweis- und Bestimmungsverfahren denen die Fluoreszenzdetektion zugrunde liegt sind im Vergleich zurUV-Detektion weniger interferenzanfaumlllig Die Identitaumlt des Analyten kann durch Co-Chromatografie bestaumltigtwerden



Ein Probenextrakt (521 oder 522) wird mit einer entsprechenden Menge Kalibrierloumlsung (3103) angereichertDie zugesetzte Lasalocid-Natrium-Menge muss in etwa dem Lasalocid-Natrium-Gehalt des Probenextraktsentsprechen Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Lasalocid-Natrium-Menge und der Verduumlnnung desExtrakts darf nur die Houmlhe des Lasalocid-Natrium-Peaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darfhoumlchstens plusmn 10 von der urspruumlnglichen Peakbreite abweichen die sich bei dem nicht angereichertenProbenextrakt ergibt

72 Wiederholbarkeit


mdash 15 relativ zum houmlheren Wert bei Lasalocid-Natrium-Gehalten zwischen 30 und 100 mgkg

mdash 15 mgkg bei Lasalocid-Natrium-Gehalten zwischen 100 und 200 mgkg

mdash 75 des houmlheren Werts bei Lasalocid-Natrium-Gehalten von mehr als 200 mgkg


Bei einer angereicherten (Blind-)Probe muss die Wiederfindungsrate bei Futtermitteln mindestens 80 betragenBei angereicherten Vormischungsproben muss die Wiederfindungsrate mindestens 90 betragen


In einem Ringversuch () wurden 2 Vormischungen (Proben 1 und 2) und 5 Futtermittel (Proben 3 bis 7) in 12Laboratorien untersucht Jede Probe wurde doppelt analysiert Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabellezusammengefasst

Probe 1Vormi-schung

Huumlhnerfut-ter

Probe 2Vormi-

schung Trut-hahnfutter

Probe 3Truthahn-pellets

Probe 4Huumlhner-kruumlmelfut-

ter

Probe 5Truthahn-futter

Probe 6Gefluumlgel-futter A

Probe 7Gefluumlgelfut-

ter B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Mittelwert[mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175VKr [ ] 212 252 224 284 244 400 537sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349VKR [ ] 566 545 503 934 569 718 1070

Sollgehalt[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

() Gehalt nach Angabe des Herstellers() Im Laboratorium zubereitetes Futter

L = Anzahl der Laboratorienn = Anzahl der Einzelwertesr = Standardabweichung der WiederholbarkeitsR = Standardabweichung der VergleichbarkeitVKr = Variationskoeffizient der WiederholbarkeitVKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit


() Analyst 1995 120 S 2175-2180

ANHANG V

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON FUTTERMITTELN AUF UNERWUumlNSCHTE STOFFE

A BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FREIEM UND GESAMTGOSSYPOL


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol Gesamtgossypol und chemisch verwandtenSubstanzen in Samen Mehl und Kuchen von Baumwollsaat sowie in Mischfuttermitteln die diese Futtermittel-Ausgangsstoffe enthalten sofern mehr als 20 mgkg an freiem Gossypol Gesamtgossypol und chemischverwandten Substanzen vorhanden sind

2 Prinzip

Gossypol wird in Gegenwart von 3-Amino-1-Propanol entweder mit einer Isopropanol-Hexan-Mischung (zurBestimmung des Gehalts an freiem Gossypol) oder mit Dimethylformamid (zur Bestimmung des Gesamtgossypol-gehalts) extrahiert und mittels Anilin zu Gossypoldianilin umgesetzt dessen Extinktion bei 440 nm gemessen wird

3 Reagenzien

31 Isopropanol-Hexan-Mischung Isopropanol (Volumenanteil = 60 ) wird mit n-Hexan (Volumenanteil = 40 gemischt

32 Loumlsungsmittel A In einen 1-l-Messkolben werden ca 500 ml Isopropanol-Hexan-Mischung (31) 2 ml 3-Amino-1-Propanol 8 ml Eisessig und 50 ml Wasser gegeben und es wird mit Isopropanol-Hexan-Mischung (31) zur Markeaufgefuumlllt Dieses Reagenz ist 1 Woche lang haltbar

33 Loumlsungsmittel B In einen 100-ml-Messkolben werden 2 ml 3-Amino-1-Propanol und 10 ml Eisessig pipettiert aufRaumtemperatur abgekuumlhlt und mit N N-Dimethylformamid zur Marke aufgefuumlllt Dieses Reagenz ist 1 Wochelang haltbar

34 Anilin Wenn die Extinktion im Blindversuch 0022 uumlberschreitet ist das Anilin uumlber Zinkstaub unter Verwerfung derersten und der letzten 10 des Destillats zu destillieren In einem braunen geschlossenen Gefaumlszlig ist dieses Reagenzim Kuumlhlschrank einige Monate haltbar

35 Gossypol-Standardloumlsung A In einen 250-ml-Messkolben werden 279 mg Gossypol-Acetat eingewogen und mitLoumlsungsmittel A (32) geloumlst Dann wird mit Loumlsungsmittel A (32) zur Marke aufgefuumlllt Von dieser Loumlsung werden50 ml in einen 250-ml-Messkolben pipettiert und es wird mit Loumlsungsmittel A (32) zur Marke aufgefuumlllt DieGossypol-Konzentration dieser Loumlsung betraumlgt 002 mgml Vor Gebrauch 1 h lang bei Raumtemperatur stehenlassen

36 Gossypol-Standardloumlsung B In einen 50-ml-Messkolben werden 279 mg Gossypol-Acetat eingewogen und mitLoumlsungsmittel B (33) geloumlst Dann wird mit Loumlsungsmittel B (33) zur Marke aufgefuumlllt Die Gossypol-Konzentration dieser Loumlsung betraumlgt 05 mgml

Die Standard-Gossypol-Loumlsungen A und B sind vor Lichteinwirkung geschuumltzt 24 h lang haltbar

4 Geraumlte

41 Mechanisches Schuumlttelgeraumlt ca 35 min-1


5 Verfahren

51 Einwaage

Die Menge der Einwaage richtet sich nach dem vermuteten Gehalt an Gossypol in der Probe Dabei solltevorzugsweise mit einer geringen Einwaage und einem relativ groszligen aliquoten Teil des Filtrats gearbeitet werdenum genuumlgend Gossypol fuumlr eine genaue fotometrische Messung zu erhalten Fuumlr die Bestimmung des Gehalts an freiemGossypol in Samen Mehl und Kuchen von Baumwollsaat darf houmlchstens 1 g eingewogen werden beiMischfuttermitteln bis zu 5 gn Ein aliquoter Teil des Filtrats von 10 ml ist in den meisten Faumlllen geeignet ermuss 50 bis 100 μg Gossypol enthalten Fuumlr die Bestimmung des Gehalts an Gesamtgossypol muss 05 bis 5 geingewogen werden so dass in einem aliquoten Teil des Filtrats von 2 ml 40 bis 200 μg Gossypol enthalten sind

Die Analyse ist bei einer Raumtemperatur von etwa 20 oC auszufuumlhren


52 Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol

Die Einwaage wird in einen 250-ml-Kolben mit Schliffhals dessen Boden mit Glassplittern bedeckt ist uumlberfuumlhrtMit Hilfe einer Pipette werden 50 ml des Loumlsungsmittels A (32) hinzugegeben Anschlieszligend wird der Kolbenverschlossen und 1 h lang im Schuumlttelgeraumlt geschuumlttelt Dann wird durch einen trockenen Filter filtriert und dasFiltrat in einem kleinen Kolben mit Schliffhals aufgefangen Waumlhrend der Filtration wird der Trichter mit einemUhrglas bedeckt

Es werden gleich groszlige aliquote Teile des Filtrats die 50 bis 100 μg Gossypol enthalten in 2 25-ml-Messkolben (Aund B) pipettiert und gegebenenfalls mit Loumlsungsmittel A (32) auf 10 ml aufgefuumlllt Dann wird der Inhalt desKolbens (A) mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) zur Marke aufgefuumlllt Diese Loumlsung wird als Vergleichs-loumlsung fuumlr die Messung der Probenloumlsung verwendet

Danach werden je 10 ml des Loumlsungsmittels A (32) in 2 weitere 25-ml-Messkolben (C und D) pipettiert Der Inhaltdes Kolbens (C) wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) zur Marke aufgefuumlllt Diese Loumlsung wird alsVergleichsloumlsung fuumlr die Messung der Blindprobenloumlsung verwendet

Zu den Messkolben (D) und (B) werden je 2 ml Anilin (34) zugegeben Die Kolben werden dann 30 min lang uumlbereinem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Faumlrbung erhitzt auf Raumtemperatur abgekuumlhlt mit derIsopropanol-Hexan-Mischung (31) jeweils zur Marke aufgefuumlllt geschuumlttelt und 1 h lang stehen gelassen

Dann werden im Spektralfotometer bei 440 nm unter Verwendung von 1-cm-Glaskuumlvetten die Extinktion derBlindprobe (D) im Vergleich mit der Vergleichsloumlsung (C) und die Extinktion der Probenloumlsung (B) im Vergleich mitder Vergleichsloumlsung (A) gemessen

Die Extinktion der Blindprobenloumlsung wird von der Extinktion der Probenloumlsung subtrahiert (= korrigierteExtinktion) Anhand des so ermittelten Werts wird der Gehalt an freiem Gossypol wie unter 6 angegebenberechnet

53 Bestimmung des Gehalts an Gesamtgossypol

Eine Einwaage die 1 bis 5 mg Gossypol enthaumllt wird in einen 50-ml-Messkolben gegeben dann werden 10 ml desLoumlsungsmittels B (33) hinzugefuumlgt Gleichzeitig wird ein Blindversuch mit 10 ml des Loumlsungsmittels B (33) ineinem anderen 50-ml-Messkolben vorbereitet Beide Messkolben werden 30 min lang uumlber einem Bad mitsiedendem Wasser erhitzt auf Raumtemperatur abkuumlhlen gelassen und mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31)jeweils zur Marke aufgefuumlllt Es wird geschuumlttelt 10 bis 15 min stehen gelassen dann filtriert und das Filtrat inKolben mit Schliffhals aufgefangen

Es werden jeweils 2 ml des Filtrats der Probe in 2 25-ml-Messkolben und jeweils 2 ml des Filtrats des Blindversuchsin 2 andere 25-ml-Messkolben pipettiert Je 1 Kolben jeder Versuchsreihe wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) auf 25 ml aufgefuumlllt Diese Loumlsungen werden als Vergleichsloumlsungen verwendet

Zu den beiden anderen Messkolben werden je 2 ml Anilin (34) hinzugefuumlgt Anschlieszligend werden die Kolben30 min lang uumlber einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Faumlrbung erhitzt auf Raumtemperaturabkuumlhlen gelassen mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) auf jeweils 25 ml aufgefuumlllt geschuumlttelt und 1 h langstehen gelassen

Die Extinktionen werden wie unter 52 fuumlr freies Gossypol angegeben gemessen Anhand des so ermittelten Wertswird der Gehalt an Gesamtgossypol wie unter 6 angegeben berechnet


Die Berechnung der Ergebnisse kann anhand der spezifischen Extinktion (61) oder anhand einer Kalibrationskur-ve (62) erfolgen

61 Anhand der spezifischen Extinktion

Die spezifischen Extinktionen berechnen sich unter den beschriebenen Bedingungen wie folgt

Freies Gossypol E11 cm

=625

Gesamtgossypol E11 cm

=600


Der Gehalt an freiem bzw an Gesamtgossypol der Probe wird nach folgender Formel berechnet

Gossypol E 1 250

E 11cm p a

wobei

E = korrigierte Extinktion ermittelt gemaumlszlig 52

p = Einwaage in g

a = aliquoter Teil des Filtrats in ml

62 Anhand einer Kalibrationskurve

621 F r e i e s Go s s y p o l

Es werden 2 Reihen von je 5 25-ml-Messkolben vorbereitet In beide Reihen werden jeweils 20 40 60 80 bzw100 der Gossypol-Standardloumlsung A (35) pipettiert das Volumen wird mit dem Loumlsungsmittel A (32) auf 10 mlaufgefuumlllt Jeder Reihe wird ein weiterer 25-ml-Messkolben hinzugefuumlgt der nur 10 ml des Loumlsungsmittels A (32)enthaumllt (Blindversuch)

Die Kolben der ersten Reihe einschlieszliglich des Kolbens fuumlr den Blindversuch werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) auf 25 ml aufgefuumlllt (Vergleichsreihe)

Den Kolben der zweiten Reihe einschlieszliglich des Blindversuchs werden jeweils 2 ml Anilin (34) zugesetztAnschlieszligend werden die Kolben 30 min lang uumlber einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Faumlrbungerhitzt auf Raumtemperatur abgekuumlhlt mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) zur Marke aufgefuumlllt geschuumltteltund 1 h lang stehen gelassen (Standardreihe)

Die Extinktion der Loumlsungen der Standardreihe wird gemaumlszlig 52 durch einen Vergleich mit den entsprechendenLoumlsungen der Vergleichsreihe ermittelt Die Kalibrationskurve wird aufgestellt indem die Extinktionswerte auf derOrdinate und die entsprechende Gossypolmenge (in μg) auf der Abszisse aufgetragen werden

622 G e s am t g o s s y p o l

Es werden 6 50-ml-Messkolben vorbereitet In den ersten werden 10 ml des Loumlsungsmittels B (33) und in dieuumlbrigen je 20 40 60 80 bzw 100 ml der Gossypol-Standardloumlsung B (36) pipettiert Der Inhalt eines jedenKolbens wird mit dem Loumlsungsmittel B (33) auf 10 ml aufgefuumlllt Anschlieszligend werden die Kolben 30 min languumlber einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt auf Raumtemperatur abgekuumlhlt mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) zur Marke aufgefuumlllt und geschuumlttelt

In 2 Reihen von je 6 25-ml Messkolben werden jeweils 20 ml dieser Loumlsung pipettiert Die Kolben der ersten Reihewerden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) auf 25 ml aufgefuumlllt (Vergleichsreihe)

Den Kolben der zweiten Reihe werden jeweils 2 ml Anilin (34) zugesetzt Dann werden sie 30 min lang uumlber einemBad mit siedendem Wasser erhitzt auf Raumtemperatur abgekuumlhlt mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (31) zurMarke aufgefuumlllt geschuumlttelt und 1 h lang stehen gelassen (Standardreihe)


63 Wiederholbarkeit


mdash 15 relativ zum houmlheren Wert bei Gossypol-Gehalten unter 500 ppm

mdash 75 ppm absolut bei Gossypol-Gehalten zwischen 500 und 750 ppm

mdash 10 relativ zum houmlheren Wert bei Gossypol-Gehalten uumlber 750 ppm


B BESTIMMUNG DES GEHALTS AN DIOXINEN (PCDDPCDF) UND DIOXINAumlHNLICHEN PCB

I PROBENAHMEVERFAHREN UND AUSWERTUNG VON ANALYSEERGEBNISSEN


Die Proben fuumlr die amtliche Untersuchung des Gehalts an Dioxinen (polychlorierte Dibenzo-p-dioxine (PCDD) undpolychlorierte Dibenzofurane (PCDF)) sowie dioxinaumlhnlichen polychlorierten Biphenylen (PCB) (1) in Futtermittelnwerden nach den in Anhang I beschriebenen Verfahren genommen Hinsichtlich der Untersuchung auf Stoffe oderErzeugnisse die in Futtermitteln gleichmaumlszligig verteilt sind gelten die quantitativen Anforderungen gemaumlszlig Anhang IPunkt 5A Die mit diesem Verfahren gewonnenen Sammelproben sind als repraumlsentativ fuumlr die betreffenden Partienoder Teilpartien anzusehen Anhand der in den Laborproben bestimmten Gehalte wird festgestellt ob die in derRichtlinie 200232EG des Europaumlischen Parlaments und des Rates (2) festgesetzten Houmlchstgehalte eingehaltenwerden

2 Uumlbereinstimmung der Partie bzw Teilpartie mit den Houmlchstgehalten

Die Partie wird angenommen wenn das Ergebnis einer Einzelanalyse den entsprechenden Houmlchstgehalt gemaumlszligRichtlinie 200232EG unter Beruumlcksichtigung der Messunsicherheit nicht uumlberschreitet

Die Partie entspricht nicht dem in der Richtlinie 200232EG festgelegten Houmlchstgehalt wenn die Obergrenze (3)(bdquoUpperboundldquo) des Ergebnisses das durch eine Zweitanalyse (4) bestaumltigt wird unter Beruumlcksichtigung derMessunsicherheit den Houmlchstgehalt zweifelsfrei uumlberschreitet


(1) Tabelle der TEF (= Toxizitaumltsaumlquivalenzfaktoren) fuumlr Dioxine Furane und dioxinaumlhnliche PCB

Kongener TEF-Wert Kongener TEF-Wert

Dibenzo-p-dioxine (bdquoPCDDldquo) bdquoDioxinaumlhnlicheldquo PCB2378-TCDD 112378-PeCDD 1 Nicht-ortho PCB123478-HxCDD 01 PCB 77 00001123678-HxCDD 01 PCB 81 00001123789-HxCDD 01 PCB 126 011234678-HpCDD 001 PCB 169 001OCDD 00001 Mono-ortho PCB

PCB 105 00001Dibenzofurane (bdquoPCDFldquo) PCB 114 000052378-TCDF 01 PCB 118 0000112378-PeCDF 005 PCB 123 0000123478-PeCDF 05 PCB 156 00005123478-HxCDF 01 PCB 157 00005123678-HxCDF 01 PCB 167 000001123789-HxCDF 01 PCB 189 00001234678-HxCDF 011234678-HpCDF 0011234789-HpCDF 001OCDF 00001

Abkuumlrzungen bdquoTldquo = tetra bdquoPeldquo = penta bdquoHxldquo = hexa bdquoHpldquo = hepta bdquoOldquo = octa bdquoCDDldquo = Chlordibenzo-p-dioxin bdquoCDFldquo = Chlorodiben-zofuran bdquoCBldquo = Chlorbiphenyl

(2) ABl L 140 vom 3052002 S 10(3) Zur Berechnung der Obergrenze (bdquoUpperboundldquo) wird der Beitrag jedes nicht quantifizierten Kongeners zum TEQ der Bestimmungs-

grenze gleichgesetztDas Konzept der Untergrenze (bdquoLowerboundldquo) setzt voraus dass der Beitrag jedes nicht quantifizierten Kongeners zum TEQ mit 0veranschlagt wirdDas Konzept des Mittelwerts (bdquoMediumboundldquo) setzt voraus dass der Beitrag jedes nicht quantifizierten Kongeners zum TEQ mit derHaumllfte der Bestimmungsgrenze gleichgesetzt wird

(4) Die Zweitanalyse ist erforderlich um eine interne Kreuzkontamination oder eine versehentliche Vermischung der Proben auszuschlieszligenMit der Erstanalyse welche die Messunsicherheit beruumlcksichtigt wird die Einhaltung der Houmlchstgehalte uumlberpruumlftBei einer Untersuchung wegen einer Dioxinkontamination kann auf die Bestaumltigung durch Zweitanalyse verzichtet werden wenn sich dieuntersuchten Proben auf das Kontaminationsereignis zuruumlckverfolgen lassen

Die Messunsicherheit kann auf eine der beiden folgenden Arten beruumlcksichtigt werden

mdash durch Berechnung der erweiterten Messunsicherheit unter Verwendung eines Faktors von 2 was einKonfidenzniveau von ca 95 ergibt Eine Partie ist zu beanstanden wenn der gemessene Wert minus U uumlberdem zulaumlssigen Houmlchstgehalt liegt Bei einer getrennten Bestimmung des Gehalts an Dioxinen unddioxinaumlhnlichen PCB ist die Summe der geschaumltzten erweiterten Messunsicherheit der getrenntenAnalyseergebnisse der Dioxine und dioxinaumlhnlichen PCB fuumlr die Summe der Dioxine und dioxinaumlhnlichenPCB anzulegen

mdash durch Bestimmung der Entscheidungsgrenze (CCα) gemaumlszlig den Bestimmungen der Entscheidung 2002657EG der Kommission (1) (Nummer 3125 des Anhangs mdash Fall von Stoffen mit einem festgelegten zulaumlssigenGrenzwert) Eine Partie ist zu beanstanden wenn der gemessene Wert gleich CCα ist oder diesen Wertuumlbersteigt

Diese Auslegungsvorschriften gelten fuumlr das Analyseergebnis der zur amtlichen Untersuchung entnommenen ProbeDas Recht der Mitgliedstaaten fuumlr die Analyse zu Verteidigungs- oder Schiedszwecken nationale Vorschriftenanzuwenden bleibt davon unberuumlhrt

II PROBENVORBEREITUNG UND ANFORDERUNGEN AN ANALYSEMETHODEN ZUR AMTLICHENUNTERSUCHUNG DES GEHALTS AN DIOXINEN (PCDDPCDF) UND DIOXINAumlHNLICHEN PCB


Diese Anforderungen gelten wenn Futtermittel-Ausgangserzeugnisse und Futtermittel zur Bestimmung ihresGehalts an Dioxinen (polychlorierte Dibenzo-p-dioxine (PCDD) und polychlorierte Dibenzofurane (PCDF)) sowiedioxinaumlhnlichen polychlorierten Biphenylen (PCB) untersucht werden

Bei der Uumlberwachung des Dioxingehalts in Futtermitteln kann ein Screening-Verfahren angewandt werden mitdessen Hilfe diejenigen Proben mit einem Gehalt an Dioxinen und dioxinaumlhnlichen PCB ausgewaumlhlt werden dieweniger als 25 unter der interessierenden Konzentration oder daruumlber liegen Die Konzentration der Dioxine indenjenigen Proben mit signifikanten Werten muss dann durch ein Bestaumltigungsverfahren ermitteltbestaumltigt werden

Screening-Verfahren sind Verfahren die zum Nachweis des Vorhandenseins von Dioxinen und dioxinaumlhnlichen PCBin der interessierenden Konzentration verwendet werden Diese Verfahren ermoumlglichen einen hohen Proben-durchsatz und werden eingesetzt um eine groszlige Anzahl von Proben auf moumlgliche positive Ergebnisse zu sichtenSie sind speziell dafuumlr ausgelegt falsch negative Ergebnisse zu vermeiden

Bestaumltigungsverfahren sind Verfahren die vollstaumlndige oder ergaumlnzende Daten liefern damit Dioxine unddioxinaumlhnliche PCB in der interessierenden Konzentration eindeutig identifiziert und quantifiziert werden koumlnnen

2 Hintergrund

Da Umweltproben und biologische Proben (einschlieszliglich Proben von Futtermittel-AusgangserzeugnissenFuttermitteln) im Allgemeinen komplexe Mischungen verschiedener Dioxin-Kongenere enthalten wurde zurErleichterung der Risikobewertung das Konzept der Toxizitaumltsaumlquivalenzfaktoren (TEF) entwickelt Durch diese TEFwerden Konzentrationen aus Gemischen aus 2378-substituierten PCDD und PCDF und einige nicht-ortho- undmono-orthochlorsubstituierte PCB mit dioxinaumlhnlicher Aktivitaumlt in Toxizitaumltsaumlquivalenten (TEQ) von 2378-TCDDausgedruumlckt Die Konzentrationen der einzelnen Substanzen in einer bestimmten Probe werden mit ihren jeweiligenTEF multipliziert und anschlieszligend addiert woraus sich die Gesamtkonzentration an dioxinaumlhnlichenVerbindungen ausgedruumlckt in TEQ ergibt

Ausschlieszliglich fuumlr die Zwecke dieser Verordnung gilt als akzeptierte spezifische Bestimmungsgrenze eines einzelnenKongeners die Konzentration eines Analyts in einem Probenextrakt die ein Signal des Messgeraumlts bei 2verschiedenen charakteristischen Ionen (Fragmentionen) hervorruft die mit einem Signal-Rausch-Verhaumlltnis von31 bei dem weniger empfindlichen Signal verbunden sind Weiterhin muumlssen die Grundanforderungen erfuumllltwerden wie z B Retentionszeit und Isotopenverhaumlltnis gemaumlszlig dem Bestimmungsverfahren nach der Beschreibungin der EPA-Methode 1613 Revision B

3 Anforderungen an die Qualitaumltssicherung bei der Probenvorbereitung

Es gelten die allgemeinen Bestimmungen hinsichtlich der Vorbereitung der Proben zur Analyse gemaumlszlig Anhang II

Daruumlber hinaus sind folgende Anforderungen zu erfuumlllen

mdash Die Proben sind in Glas- Aluminium- Polypropylen- oder Polyethylen-Behaumlltern zu lagern und zutransportieren Spuren von Papierstaub sind vom Probenbehaumllter zu entfernen Glaumlser sind mit Loumlsungs-mitteln auszuspuumllen die zuvor auf das Vorhandensein von Dioxinen uumlberpruumlft wurden


(1) ABl L 221 vom 1782002 S 8

mdash Es ist eine Blindanalyse vorzunehmen indem das gesamte Analyseverfahren durchgefuumlhrt und nur die Probedabei weggelassen wird

mdash Das Gewicht der fuumlr die Extraktion verwendeten Probe muss ausreichend groszlig sein um die Anforderungen andie Messempfindlichkeit zu erfuumlllen

4 Anforderungen an Laboratorien

mdash Die Laboratorien haben den Nachweis der Leistungsfaumlhigkeit eines Verfahrens im Bereich der interessierendenKonzentration z B 05 times 1 times und 2 times die interessierende Konzentration mit einem akzeptablenAbweichungskoeffizienten fuumlr wiederholte Untersuchung zu fuumlhren Naumlheres zu den Akzeptanzkriteriensiehe 5

mdash Die Bestimmungsgrenze liegt beim Bestaumltigungsverfahren im Bereich von etwa einem Fuumlnftel derinteressierenden Konzentration damit sichergestellt ist dass im Bereich der interessierenden Konzentrationakzeptable Abweichungskoeffizienten eingehalten werden

mdash Als interne Qualitaumltssicherungsmaszlignahmen werden regelmaumlszligige Blindkontrollen und Experimente mitgespikten Proben oder Analysen von Kontrollproben (sofern erhaumlltlich vorzugsweise zertifiziertesReferenzmaterial) durchgefuumlhrt

mdash Die erfolgreiche Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen zur Bewertung der Leistung von Laboratorienist der beste Weg Kompetenz bei spezifischen Untersuchungen nachzuweisen Allerdings belegt eineerfolgreiche Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen beispielsweise in Bezug auf Boden- oderAbwasserproben nicht zwangslaumlufig auch eine Kompetenz im Bereich Lebensmittel- oder Futtermittelprobendie eine geringere Kontamination aufweisen Daher ist die kontinuierliche Teilnahme an Laborvergleichs-untersuchungen zur Bestimmung des Gehalts an Dioxin und dioxinaumlhnlichen PCB in den entsprechendenFuttermittel-Lebensmittelmatrizen obligatorisch

mdash Laboratorien muumlssen von einer anerkannten Stelle akkreditiert sein die nach ISOIEC-Leitfaden 58 arbeitetdamit sichergestellt ist dass die Laboratorien bei ihren Untersuchungen Qualitaumltssicherungsverfahrenanwenden Die Laboratorien muumlssen gemaumlszlig der Norm ISOIEC17025 akkreditiert sein

5 Anforderungen an Methoden zur Analyse auf Dioxine und dioxinaumlhnliche PCB

Grundsaumltzliche Anforderungen an Untersuchungsverfahren

mdash Groszlige Messempfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenze Bei PCDD und PCDF muumlssen dienachweisbaren Mengen wegen der extrem hohen Toxizitaumlt einiger dieser Verbindungen im BereichPikogramm TEQ (10-12 g) liegen Der Gehalt an PCB ist bekanntlich houmlher als derjenige an PCDD und PCDFBei den meisten PCB-Kongeneren ist eine Messempfindlichkeit im Bereich Nanogramm (10-9 g) bereitsausreichend Zur Messung der toxischeren dioxinaumlhnlichen PCB-Kongenere (insbesondere der nicht-ortho-substituierten Kongenere) muss jedoch die gleiche Messempfindlichkeit erreicht werden wie fuumlr die PCDD undPCDF

mdash Hohe Selektivitaumlt (Spezifizitaumlt) PCDD PCDF und dioxinaumlhnliche PCB muumlssen von einer Vielzahl anderergemeinsam extrahierter und moumlglicherweise interferierender Verbindungen unterschieden werden die inKonzentrationen von bis zu mehreren Groumlszligenordnungen houmlher als diejenigen der zu pruumlfenden Analytenvorhanden sind Bei GaschromatografieMassenspektrometrie-(GCMS-)Verfahren ist eine Unterscheidungzwischen verschiedenen Kongeneren erforderlich wie beispielsweise zwischen toxischen (z B die 17 2378-substituierten PCDD und PCDF sowie dioxinaumlhnliche PCB) und anderen Kongeneren Bioassays muumlssen eineselektive Bestimmung der TEQ-Werte als Summe aus PCDD PCDF und dioxinaumlhnlichen PCB ermoumlglichen

mdash Hohe Genauigkeit (Richtigkeit und Praumlzision) Die Bestimmung muss eine valide und zuverlaumlssigeSchaumltzung der tatsaumlchlichen Konzentration in einer Probe ermoumlglichen Hohe Genauigkeit (Messgenauigkeitder Grad der Uumlbereinstimmung zwischen dem Ergebnis einer Messung und dem wahren oder ermitteltenWert der Messgroumlszlige) ist notwendig damit die Zuruumlckweisung des Ergebnisses einer Probenuntersuchungaufgrund der geringen Zuverlaumlssigkeit der TEQ-Schaumltzung vermieden wird Die Genauigkeit des Analyse-verfahrens wird angegeben durch die Richtigkeit (Differenz zwischen dem gemessenen Mittelwert einesAnalyten in einem zertifizierten Material und seinem zertifizierten Wert ausgedruumlckt als Prozentsatz diesesWertes) und der Praumlzision (RSDR relative Standardabweichung berechnet aus unter Wiederholbarkeits-bedingungen ermittelten Ergebnissen)

Screening-Verfahren koumlnnen Bioassays und GCMS-Verfahren umfassen Bestaumltigungsverfahren sind hochaufloumlsendeGaschromatografie-hochaufloumlsende Massenspektrometrie-Verfahren (HRGCHRMS)


Die folgenden Kriterien muumlssen vom Gesamt-TEQ-Wert erfuumlllt werden

Screening-Verfahren Bestaumltigungsverfahren

Falsch negativer Anteil lt 1

Richtigkeit - 20 bis + 20

Praumlzision RSDR lt 30 lt 15

6 Spezielle Anforderungen an GCMS-Verfahren wenn sie zu Screening- oder Bestaumltigungszweckeneingesetzt werden

mdash Die Addition von 13C-markierten 2378-chlorsubstituierten internen PCDDF-Standards und 13C-markierteninternen dioxinaumlhnlichen PCB-Standards ist gleich zu Beginn des Analyseverfahrens z B vor der Extraktiondurchzufuumlhren damit das Analyseverfahren validiert werden kann Bei jeder der tetra- bis octa-chloriertenhomologen Gruppen von PCDDF (und bei jeder der homologen Gruppen von dioxinaumlhnlichen PCB soferndioxinaumlhnliche PCB zu bestimmen sind) muss mindestens ein Kongener zugegeben werden (alternativ dazumindestens ein Kongener je massenspektrometrisch ausgewaumlhlter Ionenaufzeichnungsfunktion zur Uumlber-wachung von PCDDF und dioxinaumlhnlichen PCB) Im Fall der Bestaumltigungsverfahren ist die Verwendung aller17 13C-markierten 2378-substituierten internen PCDDF-Standards und aller 12 13C-markierten internendioxinaumlhnlichen PCB-Standards eindeutig vorzuziehen

mdash Die relativen Responsefaktoren sind mittels geeigneter Kalibrierloumlsungen auch fuumlr diejenigen Kongenere zubestimmen bei denen kein 13C-markiertes Analogon zugegeben ist

mdash Bei Futtermitteln pflanzlichen Ursprungs und Futtermitteln tierischen Ursprungs die weniger als 10 Fettenthalten ist die Addition der internen Standards vor der Extraktion obligatorisch Bei Futtermittelntierischen Ursprungs die mehr als 10 Fett enthalten koumlnnen die internen Standards entweder vor derExtraktion oder nach der Fettextraktion zugegeben werden Die Extraktionseffizienz ist auf geeignete Weisezu validieren je nachdem auf welcher Stufe interne Standards zugegeben und ob die Ergebnisse auf Produkt-oder Fettbasis angegeben werden

mdash Vor der GCMS-Analyse sind 1 oder 2 Wiederfindungs-(Surrogat-) Standard(s) zu addieren

mdash Es ist eine Kontrolle der Wiederfindungsrate erforderlich Bei Bestaumltigungsverfahren muumlssen die Wieder-findungsraten der einzelnen internen Standards im Bereich von 60 bis 120 liegen Geringere oder houmlhereWiederfindungsraten fuumlr einzelne Kongenere insbesondere fuumlr einige hepta- und octa-chlorierte Diben-zodioxine und Dibenzofurane koumlnnen unter der Bedingung akzeptiert werden dass ihr Beitrag zum TEQ-Wert 10 des gesamten TEQ-Werts (basierend auf der Summe von PCDDF und dioxinaumlhnlichen PCB) nichtuumlbersteigt Bei Screening-Verfahren muumlssen die Wiederfindungsraten im Bereich von 30 bis 140 liegen

mdash Die Dioxine sind von interferierenden chlorierten Verbindungen wie z B nicht dioxinaumlhnlichen PCB undchlorierten Diphenylethern mittels geeigneter chromatografischer Verfahren abzutrennen (vorzugsweise mitFlorisil- Aluminiumoxid- undoder Aktivkohlensaumlule)

mdash Die gaschromatografische Auftrennung der Isomere ist ausreichend (lt 25 von Peak zu Peak zwischen123478-HxCDF und 123678-HxCDF)

mdash Die Bestimmung ist nach der EPA-Methode 1613 Revision B (bdquoTetra- through octa-chlorinated dioxins andfurans by isotope dilution HRGCHRMSldquo) oder nach einer anderen Methode mit gleichwertigenLeistungskriterien durchzufuumlhren

mdash Bei Futtermitteln deren Dioxinkontamination im Bereich des Houmlchstwerts oder daruumlber liegt darf dieDifferenz zwischen Ober- und Untergrenze houmlchstens 20 betragen Bei Futtermitteln mit einerKontamination die deutlich unter der Houmlchstgrenze liegt kann die Differenz im Bereich von 25 bis 40 liegen

7 Screening-Verfahren

71 Einfuumlhrung

Ein Screening-Verfahren kann zu unterschiedlichen analytischen Zwecken eingesetzt werden zum reinen Screeningund zur quantitativen Untersuchung


S c r e e n i n g

Das Messsignal der Proben wird mit demjenigen einer Referenzprobe bei der interessierenden Konzentrationverglichen Proben mit einem niedrigeren Wert als demjenigen der Referenzprobe werden als negativ erklaumlrtdiejenigen mit einem houmlheren Signal als positiv vermutet Weitere Anforderungen sind

mdash Bei jeder Testreihe sind eine Blind- und eine Referenzprobemehrere Referenzproben einzubeziehen die zurgleichen Zeit und unter den gleichen Bedingungen extrahiert und untersucht werden Die Referenzprobe(n)mussmuumlssen im Vergleich zur Blindprobe ein deutlich erhoumlhtes Messsignal aufweisen

mdash Zusaumltzliche Referenzproben deren Konzentration das 05- und 2-fache der interessierenden Konzentrationbetraumlgt sind einzubeziehen damit die ordnungsgemaumlszlige Durchfuumlhrung des Tests in dem fuumlr die Kontrolle derinteressierenden Konzentration relevanten Bereich nachgewiesen werden kann

mdash Bei der Untersuchung anderer Matrizen ist die Eignung der Referenzprobe(n) nachzuweisen vorzugsweisedurch die Aufnahme von Proben bei denen sich durch HRGCHRMS ein TEQ-Gehalt vergleichbar mit demder Referenzprobe ergeben hat oder andernfalls durch die Aufnahme einer Blindprobe die bis zu dieser Houmlhegespikt wurde

mdash Da in Bioassays keine internen Standards verwendet werden koumlnnen sind Wiederholbarkeitstests zurInformation uumlber die Standardabweichung innerhalb einer Testreihe sehr wichtig Der Abweichungs-koeffizient muss unter 30 liegen

mdash Bei Bioassays sind die zu bestimmenden Analyten moumlgliche auftretende Stoumlrungen und der maximalakzeptable Blindwert zu definieren

Qu a n t i t a t i v e Un t e r s u c h un g

Zur quantitativen Untersuchung sind Standardverduumlnnungsreihen 2- oder 3-fache Clean-ups und Messungen derProben sowie Blind- und Wiederfindungskontrollen erforderlich Das Ergebnis kann in TEQ ausgedruumlckt werdenwobei davon ausgegangen wird dass die fuumlr das Signal verantwortlichen Verbindungen dem TEQ-Prinzipentsprechen Eine Kalibrierungskurve ergibt sich durch die Verwendung von TCDD (oder einer Standardmischungaus DioxinenFuranendioxinaumlhnlichen PCB) Damit kann der TEQ-Wert im Extrakt und somit in der Probeerrechnet werden Dieser TEQ-Wert wird anschlieszligend um den fuumlr eine Blindprobe (zur Beruumlcksichtigung vonVerunreinigungen durch Loumlsungsmittel und Chemikalien) errechneten TEQ-Wert und um eine Wiederfindung(errechnet aus dem TEQ-Wert in einer Qualitaumltskontrollprobe mit etwa der interessierenden Konzentration)korrigiert Es sei hier darauf hingewiesen dass der offensichtliche Wiederfindungsverlust teilweise auf Matrixeffekteundoder auf die Unterschiede zwischen den TEF-Werten in den Bioassays und den amtlichen TEF-Werten der WHOzuruumlckzufuumlhren sein kann

72 Anforderungen an zum Screening verwendete Untersuchungsverfahren

mdash Zum Screening koumlnnen GCMS-Verfahren und Bioassays verwendet werden Bei GCMS-Verfahren sind dieunter 6 festgelegten Anforderungen heranzuziehen Spezielle Anforderungen sind fuumlr zellbasierte Bioassaysund Kit-basierte Bioassays unter 73 bzw 74 festgelegt

mdash Es sind Informationen uumlber die Anzahl falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse eines groszligenProbensatzes unterhalb und oberhalb der Houmlchstgehalte oder der Ausloumlsewerte im Vergleich zum TEQ-Gehalt erforderlich der durch ein Bestaumltigungsverfahren bestimmt wurde Der tatsaumlchliche Anteil der falschnegativen Ergebnisse muss unter 1 liegen Der Anteil der falsch positiven Proben muss so gering sein dassein Screening von Vorteil ist

mdash Positive Ergebnisse sind immer durch ein Bestaumltigungsverfahren abzusichern (HRGCHRMS) Auszligerdem sinddie Proben aus einem groszligen TEQ-Bereich durch HRGCHRMS (ca 2 bis 10 der negativen Proben) zubestaumltigen Informationen uumlber Uumlbereinstimmungen von Bioassay- und HRGCHRMS-Ergebnissen sind zurVerfuumlgung zu stellen

73 Spezielle Anforderungen an zellbasierte Bioassays

mdash Fuumlr jeden Testlauf in einem Bioassay ist eine Referenzkonzentrationsreihe von TCDD oder einem Dioxin-Furan-Gemisch (vollstaumlndige Dosis-Response-Kurve mit R2 gt 095) erforderlich Zu Screening-Zwecken kanneine erweiterte Kurve im Niedrigkonzentrationsbereich zur Untersuchung von Proben im Niedriggehaltbe-reich verwendet werden

mdash Zum Beleg der Richtigkeit der Ergebnisse des Bioassays uumlber einen konstanten Zeitraum hinweg sollte eineTCDD-Referenzkonzentration (etwa 3 times die Bestimmungsgrenze) auf einem Qualitaumltskontrollblatt verwendetwerden Eine Alternative dazu waumlre die relative Response einer Referenzprobe im Vergleich zur TCDD-Kalibrierungslinie da die Response der Zellen von vielen Faktoren abhaumlngen kann

mdash Fuumlr jeden Typ Referenzmaterial sind Qualitaumltskontroll-Charts aufzuzeichnen und zu pruumlfen damitsichergestellt ist dass das Ergebnis mit den Leitlinien uumlbereinstimmt


mdash Insbesondere bei quantitativen Berechnungen muss die Induktion der Probenverduumlnnung innerhalb deslinearen Teils der Response-Kurve liegen Uumlber dem linearen Teil der Response-Kurve liegende Proben sind zuverduumlnnen und neu zu testen Daher wird empfohlen immer mindestens 3 oder mehr Verduumlnnungen zurgleichen Zeit zu testen

mdash Die Standardabweichung darf bei einer 3-fachen Bestimmung einer Probenloumlsung houmlchstens 15 betragenund zwischen 3 unabhaumlngigen Versuchen houmlchstens 30

mdash Die Nachweisgrenze kann auf 3 times die Standardabweichung der Blindloumlsung oder des Hintergrundsignalsfestgelegt werden Eine andere Moumlglichkeit waumlre einen uumlber dem Hintergrund liegenden Messwertanzuwenden (Induktionsfaktor 5 times der Blindwert des Loumlsungsmittels) der anhand der Kalibrationskurve desTages berechnet wird Die Bestimmungsgrenze kann auf 5- bis 6 times die Standardabweichung der Blindloumlsungoder des Hintergrundsignals festgelegt werden oder es kann ein Signal uumlber dem Hintergrund(Induktionsfaktor 10 times der Blindwert des Loumlsungsmittels) angewandt werden der anhand der Kalibrations-kurve des Tages berechnet wird

74 Spezielle Anforderungen an Kit-basierte Bioassays

mdash Es muss sichergestellt werden dass die Kit-basierten Bioassays ausreichend empfindlich und zuverlaumlssig fuumlrFuttermittel sind

mdash Bei der Vorbereitung und Untersuchung der Proben sind die Anweisungen des Herstellers zu beachten

mdash Testkits deren Haltbarkeitsdatum abgelaufen ist duumlrfen nicht mehr verwendet werden

mdash Materialien oder Bestandteile die zur Verwendung mit anderen Kits bestimmt sind duumlrfen nicht verwendetwerden

mdash Die Testkits sind bei den angegebenen Lagertemperaturen aufzubewahren und bei der angegebenenBetriebstemperatur zu verwenden

mdash Die Nachweisgrenze fuumlr Immunoassays wird bestimmt als Summe aus dem Mittelwert und der 3-fachenStandardabweichung von 10 Untersuchungen des Blindwerts dividiert durch den Steigungsbeitrag derlinearen Regressionsgleichung

mdash Fuumlr die Labortests sind Referenzstandards zu verwenden damit sichergestellt ist dass das Messsignal desStandards im Test innerhalb eines akzeptablen Bereichs liegt

8 Bericht uumlber die Ergebnisse

Sofern das Untersuchungsverfahren dies zulaumlsst muumlssen die Untersuchungsergebnisse die Werte der einzelnenPCDDF- und PCB-Kongenere enthalten und als Obergrenze (bdquoUpperboundldquo) Untergrenze (bdquoLowerboundldquo) undMittelwert (bdquoMediumboundldquo) vorgelegt werden damit moumlglichst viele Informationen in den Untersuchungsbe-richten enthalten sind und die Ergebnisse somit entsprechend den speziellen Anforderungen interpretiert werdenkoumlnnen

In dem Bericht muss auch der Lipidgehalt der Probe sowie das zur Lipidextraktion verwendete Verfahren genanntwerden

Die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards sind zur Verfuumlgung zu stellen sofern dieWiederfindungen auszligerhalb des unter 6 genannten Bereichs liegen oder sofern die Gehalte in den Proben denHoumlchstgehalt uumlberschreiten bzw gegebenenfalls auch auf Nachfrage

Da die Messunsicherheit bei der Entscheidung uumlber die Konformitaumlt einer Probe zu beruumlcksichtigen ist muss dieserParameter ebenfalls vorgelegt werden Das Analyseergebnis ist als x +ndash U anzugeben wobei x das Analyseergebnisund U die erweiterte Messunsicherheit unter Verwendung eines Faktors von 2 der zu einem Konfidenzwert vonca 95 fuumlhrt darstellen Bei einer getrennten Bestimmung des Gehalts an Dioxinen und dioxinaumlhnlichen PCB istdie Summe der geschaumltzten erweiterten Messunsicherheit der getrennten Analyseergebnisse der Dioxine unddioxinaumlhnlichen PCB fuumlr die Summe der Dioxine und dioxinaumlhnlichen PCB zu berechnen

Wird die Messunsicherheit durch Anwendung des CCα (vgl Abschnitt I 2 dieses Teils B) beruumlcksichtigt so ist dieserParameter anzugeben


ANHANG VI

ANALYSEMETHODEN ZUR BESTIMMUNG DER BESTANDTEILE TIERISCHEN URSPRUNGS BEI DERAMTLICHEN UNTERSUCHUNG VON FUTTERMITTELN

Bedingungen fuumlr den mikroskopischen Nachweis die Identifizierung oder die Schaumltzung von Bestandteilentierischen Ursprungs in Futtermitteln


Diese Bedingungen gelten fuumlr den Nachweis von Bestandteilen tierischen Ursprungs (definiert als Erzeugnisse ausder Verarbeitung von Tierkoumlrpern oder Teilen von Tierkoumlrpern von Saumlugetieren Gefluumlgel und Fischen) inFuttermitteln durch mikroskopische Untersuchung im Rahmen des koordinierten Kontrollprogramms im Bereichder Futtermittel gemaumlszlig der Verordnung (EG) Nr 8822004 des Europaumlischen Parlaments und des Rates (1) Unterder Voraussetzung dass die in diesem Anhang aufgefuumlhrten Methoden bei allen amtlichen Untersuchungenangewandt werden kann auch eine zweite Untersuchung mittels abweichender oder alternativer Methodendurchgefuumlhrt werden um den Nachweis bestimmter Arten tierischer Bestandteile zu verbessern oder um denUrsprung der tierischen Bestandteile weiter zu spezifizieren Auszligerdem kann bei der Untersuchung bestimmterspezifischer Bestandteile tierischen Ursprungs wie z B Plasma oder Knochen in Talg (siehe auch 9) ein anderesProtokoll verwendet werden sofern diese Analysen zusaumltzlich zu den im koordinierten Kontrollprogrammvorgesehenen durchgefuumlhrt werden

2 Empfindlichkeit

Je nach Art der Bestandteile tierischen Ursprungs koumlnnen in Futtermitteln sehr geringe Mengen (lt 01 ) festgestelltwerden

3 Prinzip

Eine gemaumlszlig den Bestimmungen in Anhang I entnommene Probe wird nach geeigneter Aufbereitung zurIdentifizierung verwendet Das nachfolgende Protokoll eignet sich fuumlr die Handhabung von Futtermitteln mitgeringem Feuchtigkeitsgehalt Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt von uumlber 14 sind vor der Handhabungzu trocknen (zu kondensieren) Spezielle Futtermittel oder Einzelfuttermittel (z B Fette Oumlle) muumlssen gezieltbehandelt werden (siehe 9) Identifiziert werden die tierischen Bestandteile anhand charakteristischer mikro-skopisch erkennbarer Merkmale (d h Muskelfasern und andere Fleischpartikel Knorpel Knochen Horn HaareBorsten Blut Federn Eierschalen Graumlten Schuppen) Die Identifizierung wird sowohl in der Siebfraktion (61) alsauch im konzentrierten Sediment (62) der Probe durchgefuumlhrt

4 Reagenzien

41 Einbettungsmittel

411 Chloralhydrat (waumlssrig Massenkonzentration = 60 )

412 Lauge (NaOH Massenkonzentration = 25 oder KOH Massenkonzentration = 25 ) fuumlr die Siebfraktionen

413 Paraffinoumll oder Glyzerin (Viskositaumlt 68 bis 81) fuumlr mikroskopische Beobachtungen im Sediment

42 Spuumllmittel

421 96 iger Alkohol

422 Aceton

43 Konzentrationsmittel

431 Tetrachlorethylen (Dichte 162)


(1) ABl L 165 vom 3042004 S 1 Berichtigte Fassung im ABl L 191 vom 2852004 S 1

44 Nachweisreagenzien

441 Iod-Iodkalium-Loumlsung (2 g Iodkalium in 100 ml Wasser loumlsen und unter haumlufigem Schuumltteln 1 g Iod zufuumlgen)

442 Alizarinrot (25 ml 1 M Salzsaumlure in 100 ml Wasser loumlsen und dieser Loumlsung 200 mg Alizarinrot zufuumlgen)

443 Cystin-Reagenz (2 g Bleiacetat 10 g NaOH100 ml H2O)

444 Iod-Iodkalium-Loumlsung (geloumlst in 70 igem Ethanol)

45 Bleichmittel

451 Handelsuumlbliche Natriumhypochlorit-Loumlsung (96 aktives Chlor)

5 Geraumlte und Hilfsmittel

51 Analysenwaage (Genauigkeit von 001 g auszliger fuumlr das konzentrierte Sediment 0001 g)

52 Zerkleinerungsgeraumlte (Muumlhle oder Moumlrser insbesondere fuumlr Futtermittel gt 15 Fett bei Analyse)

53 Sieb mit einer Maschenweite von houmlchstens 050 mm

54 Scheidetrichter oder Absetzglas mit konischem Boden

55 Stereomikroskop (mindestens 40-fache Vergroumlszligerung)

56 Zusammengesetztes Mikroskop (mindestens 400-fache Vergroumlszligerung) mit Durchlicht oder Polarisierungsein-richtung

57 Standardglaswaren fuumlr Laboratorien

Alle Geraumlte sind gruumlndlich zu reinigen Scheidetrichter und Glaswaren sind in einer Spuumllmaschine zu waschen Siebesind mit einer steifborstigen Buumlrste zu reinigen

6 Verfahren

Pelletierte Futtermittel koumlnnen vorgesiebt werden sofern beide Fraktionen als getrennte Probe untersucht werden

Mindestens 50 g der Untersuchungsprobe werden behandelt (mittels geeigneter Zerkleinerungsgeraumlte (52)vorsichtig zerkleinert sofern dies zur Erreichung einer geeigneten Struktur erforderlich ist) Das zerkleinerteMaterial wird in 2 repraumlsentative Teile geteilt einen fuumlr die Siebfraktion (mindestens 5 g) (61) und einen fuumlr daskonzentrierte Sediment (mindestens 5 g) (62) Faumlrbungen mit Nachweisreagenzien (63) koumlnnen zur Identifizierungzusaumltzlich verwendet werden

Zur Angabe der Art des tierischen Proteins und des Ursprungs der Partikel kann ein System zur Unterstuumltzung derEntscheidungsfindung wie z B ARIES verwendet werden und Referenzproben koumlnnen dokumentiert werden

61 Identifizierung von Bestandteilen tierischen Ursprungs in den Siebfraktionen

Mindestens 5 g der Probe werden durch Sieben (53) in 2 Fraktionen getrennt

Die Siebfraktion(en) mit den groszligen Partikeln (oder ein repraumlsentativer Teil der Fraktion) wird in einer duumlnnenSchicht auf einer geeigneten Unterlage aufgebracht und unter dem Stereomikroskop (55) bei verschiedenenVergroumlszligerungen systematisch auf Bestandteile tierischen Ursprungs untersucht

Praumlparate mit derden Feinpartikel-Siebfraktion(en) werden systematisch unter dem zusammengesetzten Mikroskop(56) bei verschiedenen Vergroumlszligerungen auf Bestandteile tierischen Ursprungs untersucht


62 Identifizierung von Bestandteilen tierischen Ursprungs im konzentrierten Sediment

Mindestens 5 g der Probe werden (auf 001 g genau) in einen Scheidetrichter oder einen Absetzbecher mitkonischem Boden eingewogen und mit mindestens 50 ml Tetrachlorethylen (431) versetzt Die Mischung wirdwiederholt geschuumlttelt oder umgeruumlhrt

mdash Wird ein geschlossener Scheidetrichter verwendet so wird das Sediment nach einer ausreichenden Standzeit(mindestens 3 min) abgetrennt Es wird noch einmal geschuumlttelt und nach weiteren mindestens 3 minStandzeit noch einmal abgetrennt

mdash Wird ein offener Absetzbecher verwendet so wird das Sediment nach einer Standzeit von mindestens 5 minabgetrennt

Das gesamte Sediment wird getrocknet und anschlieszligend ausgewogen (auf 0001 g genau) Das Wiegen ist nurnotwendig wenn eine Schaumltzung erforderlich ist Besteht das Sediment aus vielen groszligen Partikeln kann es durchein Sieb (53) in 2 Fraktionen gesiebt werden Das trockene Sediment wird unter dem Stereomikroskop (55) undunter dem zusammengesetzten Mikroskop (56) auf Knochenbestandteile untersucht

63 Verwendung von Einbettungsmitteln und Nachweisreagenzien

Die mikroskopische Identifizierung der Bestandteile tierischen Ursprungs kann durch spezielle Einbettungsmittelund Nachweisreagenzien unterstuumltzt werden

Chloralhydrat (411) Durch vorsichtiges Erhitzen koumlnnen Zellstrukturen eindeutiger erkannt werden weilStaumlrketeilchen gelatinieren und unerwuumlnschter Zelleninhalt entfernt wird

Lauge (412) Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid klaumlren das Material und tragen so zum Nachweis vonMuskelfasern Haaren und anderen Keratinstrukturen bei

Paraffinoumll und Glyzerin (413) Knochenbestandteile sind in diesem Einbettungsmittel gut nachzuweisen weildie meisten Lakunen mit Luft gefuumlllt bleiben und als schwarze etwa 5 bis 15 μm groszlige Loumlcher zu erkennen sind

Iod-Iodkalium-Loumlsung (441) Wird fuumlr den Nachweis von Staumlrke (Blau-Violettfaumlrbung) und Eiweiszlig (Gelb-Orangefaumlrbung) verwendet Die Loumlsung kann bei Bedarf verduumlnnt werden

Alizarinrotloumlsung (442) Rot-Pinkfaumlrbung von Knochen Graumlten und Schuppen Das gesamte Sediment wird vorder Trocknung (siehe 62) in ein Reagenzglas gefuumlllt und 2-mal mit etwa 5 ml Alkohol (421) gespuumllt (jedes Malwird verwirbelt nach etwa 1 min Absetzzeit wird das Loumlsungsmittel abgegossen) Vor der Verwendung diesesNachweisreagenzes wird das Sediment durch Zusatz von mindestens 1 ml Natriumhydroxidloumlsung (451) gebleichtDie Reaktionszeit betraumlgt etwa 10 min Danach wird das Reagenzglas mit Wasser gefuumlllt nach einer Absetzzeit desSediments von 2 bis 3 min werden das Wasser und die suspendierten Partikel abgeschuumlttet Das Sediment wirdnoch 2-mal mit etwa 10 ml Wasser gespuumllt (dabei wird verwirbelt absetzen gelassen und das Wasser wird jedesMal abgegossen) Von der Alizarinrot-Loumlsung werden dann 2 bis 10 oder mehr Tropfen (je nach Ruumlckstandsmenge)zugefuumlgt Die Mischung wird geschuumlttelt und die Reaktion kann ein paar Sekunden lang stattfinden Das eingefaumlrbteSediment wird 2-mal mit etwa 5 ml Alkohol (421) gespuumllt und anschlieszligend 1-mal mit Aceton (422) (jedes Malwird verwirbelt das Loumlsungsmittel wird nach einer Absetzzeit von 1 min abgegossen Danach ist das Sedimentfertig zur Trocknung

Cystin-Reagenz (443) Durch vorsichtiges Erhitzen werden cystinhaltige Bestandteile (Haare Federn usw)schwarzbraun gefaumlrbt

64 Untersuchung von Futtermitteln die moumlglicherweise Fischmehl enthalten

Mindestens 1 Objekttraumlger mit der feinen Siebfraktion und der feinen Fraktion des Sediments wird unter demzusammengesetzten Mikroskop untersucht (siehe 61 und 62)

Ist auf der Etikettierung Fischmehl als Zutat angegeben oder wird das Vorhandensein von Fischmehl vermutet oderin der ersten Untersuchung nachgewiesen werden mindestens 2 weitere Objekttraumlger mit der feinen Siebfraktionder urspruumlnglichen Probe sowie die gesamte Sedimentfraktion untersucht

7 Berechnung und Auswertung

Die Mitgliedstaaten stellen sicher dass die unter dieser Nummer beschriebenen Verfahren angewandt werden wenneine amtliche Analyse zur Schaumltzung des Anteils (und nicht nur des Vorhandenseins) von Bestandteilen tierischenUrsprungs durchgefuumlhrt wird

Die Berechnung kann nur erfolgen wenn die tierischen Bestandteile Knochenfragmente enthalten


Knochenfragmente warmbluumltiger Landtiere (d h Saumlugetiere und Voumlgel) sind von den verschiedenen Fischknochenim mikroskopischen Praumlparat durch die charakteristischen Lakunen (Knochenzellenhoumlhlen) zu unterscheiden DieSchaumltzung des Gehalts an tierischen Bestandteilen im Probenmaterial erfolgt unter Beruumlcksichtigung

mdash des geschaumltzten Gehalts (Massenanteil) an Knochenfragmenten im konzentrierten Sediment und

mdash des Knochengehalts (Massenanteil) in den Bestandteilen tierischen Ursprungs

Die Schaumltzung ist auf der Grundlage von (wenn moumlglich) mindestens 3 Praumlparaten und mindestens 5 Feldern proPraumlparat durchzufuumlhren Bei Mischfuttermitteln enthaumllt das konzentrierte Sediment in der Regel nebenKnochenfragmenten von Landtieren und Fischknochenfragmenten auch andere Partikel mit hohem spezifischenGewicht z B Mineralien Sand verholzte Pflanzenfragmente usw

71 Geschaumltzter Anteil der Knochenfragmente

Knochenfragmente von Landtieren ( ) = (S times c)W

Fischknochen- und Schuppenfragmente ( ) = (S times d)W

(S = Sediment (mg) c = Korrekturfaktor ( ) fuumlr den geschaumltzten Anteil von Landtierknochen im Sedimentd = Korrekturfaktor ( ) fuumlr den geschaumltzten Anteil von Fischknochen- und Schuppenfragmenten imSediment W = Einwaage des Probenmaterials fuumlr die Sedimentation (mg))

72 Geschaumltzter Anteil an Bestandteilen tierischen Ursprungs

Der Knochenanteil in tierischen Erzeugnissen kann sehr stark variieren (Der Prozentsatz liegt im Fall vonKnochenmehlen in der Groumlszligenordnung von 50 bis 60 und im Fall von Fleischmehlen bei 20 bis 30 beiFischmehlen variiert der Knochen- und Schuppenanteil je nach Kategorie und Ursprung des Fischmehls und liegtnormalerweise bei 10 bis 20 )

Ist die Art des Tiermehls in der Probe bekannt so ist es moumlglich den Anteil zu schaumltzen

Geschaumltzter Anteil an Bestandteilen von Landtiererzeugnissen ( ) = (S times c)(W times f) times 100

geschaumltzter Anteil an Bestandteilen von Fischerzeugnissen ( ) = (S times d)(W times f) times 100

(S = Sediment (mg) c = Korrekturfaktor ( ) fuumlr den geschaumltzten Anteil von Landtierknochenbestandteilen imSediment d = Korrekturfaktor ( ) fuumlr den geschaumltzten Anteil von Fischknochen- und Schuppenfragmentenim Sediment f = Korrekturfaktor fuumlr den Knochenanteil der Bestandteile tierischen Ursprungs derUntersuchungsprobe W = Einwaage des Probenmaterials fuumlr die Sedimentation (mg))

8 Darstellung der Untersuchungsergebnisse

Der Bericht enthaumllt zumindest Informationen uumlber das Vorhandensein von Bestandteilen die von Landtieren odervon Fischmehl stammen Die verschiedenen Befunde koumlnnen wie folgt dargestellt werden

81 Hinsichtlich des Vorhandenseins von Bestandteilen von Landtieren

mdash Soweit mikroskopisch erfassbar wurden in der vorliegenden Probe keine Bestandteile von Landtierenfestgestellt

oder

mdash soweit mikroskopisch erfassbar wurden in der vorliegenden Probe Bestandteile von Landtieren festgestellt

82 Und hinsichtlich des Vorhandenseins von Fischmehl

mdash Soweit mikroskopisch erfassbar wurden in der vorliegenden Probe keine Bestandteile von Fischen festgestellt

oder

mdash soweit mikroskopisch erfassbar wurden in der vorliegenden Probe Bestandteile von Fischen festgestellt


Sofern von Fischen oder Landtieren stammende Bestandteile festgestellt werden enthaumllt der Bericht uumlber dieUntersuchungsergebnisse erforderlichenfalls auch eine Schaumltzung der Menge an nachgewiesenen Bestandteilen (x lt 01 01 bis 05 05 bis 5 oder gt 5 ) nach Moumlglichkeit eine naumlhere Bestimmung der Art der Landtiereund der identifizierten tierischen Bestandteile (Muskelfasern Knorpel Knochen Horn Haare Borsten Federn BlutEierschalen Fischknochen Schuppen)

Wird die Menge an tierischen Bestandteilen geschaumltzt ist der verwendete Korrekturfaktor f anzugeben

Werden Knochenbestandteile von Landtieren identifiziert muss der Bericht folgenden Zusatz enthalten

bdquoEs kann nicht ausgeschlossen werden dass es sich um Bestandteile von Saumlugetieren handeltldquo

Dieser Zusatz ist nicht notwendig in den Faumlllen in denen die Knochenfragmente von Landtieren spezifiziert sind inKnochenfragmente von Gefluumlgel oder von Saumlugetieren

9 Fakultatives Protokoll zur Analyse von Fett oder Oumll

Folgendes Protokoll kann zur Analyse von Fett oder Oumll verwendet werden

mdash Handelt es sich um festes Fett wird es beispielsweise in einem Mikrowellenofen erhitzt bis es fluumlssig ist

mdash Der Probe werden mittels einer Pipette am Boden 40 ml Fett entnommen und in ein Zentrifugenroumlhrchengegeben

mdash 10 min bei 4 000 min-1 zentrifugieren

mdash Ist das Fett nach der Zentrifugierung fest wird es noch einmal in einem Ofen erwaumlrmt bis es fluumlssig istDanach ist die Zentrifugierung 5 min lang bei 4 000 min-1 zu wiederholen

mdash Mithilfe eines kleinen Loumlffels oder eines Spatels wird eine Haumllfte der abgegossenen Verunreinigungen auf einekleine Petrischale oder einen Objekttraumlger zur mikroskopischen Identifizierung eines moumlglichen Gehalts antierischen Bestandteilen aufgebracht (Fleischfasern Federn Knochenfragmente usw) Als Einbettungsmittelfuumlr die mikroskopische Untersuchung wird Paraffinoumll oder Glyzerin empfohlen

mdash Die verbleibenden Verunreinigungen werden zur Sedimentierung gemaumlszlig 62 verwendet


ANHANG VII

METHODE ZUR BERECHNUNG DES ENERGIEGEHALTS VON FUTTERMITTELN FUumlR GEFLUumlGEL

1 Berechnungsmethode und Formel des Energiegehalts

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln fuumlr Gefluumlgel wird anhand der prozentualen Anteile bestimmter analytischerBestandteile der Futtermittel nach nachstehender Formel berechnet Dieser Wert wird in Megajoules (MJ) umsetzbarerN-korrigierter Energie (ME) je kg Mischfuttermittel ausgedruumlckt und nach folgender Formel berechnet

MJ MEkg = 01551 times Rohprotein + 03431 times Rohfett + 01669 times Staumlrke + 01301 times Gesamtzucker(ausgedruumlckt als Saccharose)

2 Toleranzen auf die angegebenen Gehalte

Ergibt sich bei den amtlichen Untersuchungen eine energieerhoumlhende oder energievermindernde Abweichungzwischen dem Kontrollergebnis und dem angegebenen Gehalt so gilt eine Mindesttoleranz von 04 MJ MEkg

3 Ausdruck der Ergebnisse

Das nach vorstehender Formel errechnete Ergebnis ist mit nur einer Dezimalstelle anzugeben

4 Probenahmeverfahren und Analysemethoden

Die Probenahme beim Mischfuttermittel und die Bestimmung des Gehalts an der Berechnungsmethodezugrundeliegenden analytischen Bestandteilen erfolgt in Uumlbereinstimmung mit den gemeinschaftlichen Probenahme-verfahren bzw Analysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchung von Futtermitteln

Anzuwenden sind

mdash fuumlr die Bestimmung des Rohfettgehalts Verfahren B der Methode zur Bestimmung des Gehalts an Rohoumllen und-fetten wie in Anhang III Teil H beschrieben

mdash fuumlr die Bestimmung des Staumlrkegehalts die polarimetrische Methode wie in Anhang III Teil L beschrieben


ANHANG VIII

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON FUTTERMITTELN AUF DAS VORHANDENSEIN NICHTMEHR ZUGELASSENER ZUSATZSTOFFE

Wichtiger hinweis

Zum Nachweis des Vorhandenseins nicht mehr zugelassener Zusatzstoffe in Futtermitteln koumlnnen empfindlichereAnalysemethoden als die in diesem Anhang beschriebenen verwendet werden

Die in diesem Anhang aufgefuumlhrten Analysemethoden werden fuumlr Bestaumltigungszwecke herangezogen

A BESTIMMUNG DES METHYLBENZOQUATGEHALTS

7-Benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-chinolon


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Methylbenzoquatgehalts von Futtermitteln Die Bestimmungsgrenzebetraumlgt 1 mgkg

2 Prinzip

Methylbenzoquat wird mit methanolischer Methansulfonsaumlure-Loumlsung aus der Probe extrahiert Der Extrakt wirdmit Dichlormethan mittels Ionenaustauschchromatografie und anschlieszligend erneut mit Dichlormethangereinigt Der Methylbenzoquatgehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsfluumlssigkeitschromatografie(HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt

3 Reagenzien

31 Dichlormethan



Gemisch aus Methanol (32) und Wasser (HPLC-Qualitaumlt) 75 + 25 (V+V)


34 Methansulfonsaumlure-Loumlsung c = 2

200 ml Methansulfonsaumlure werden mit Methanol (32) auf 1 000 ml verduumlnnt

35 Salzsaumlure c = 10

100 ml Salzsaumlure (ρ20 118 gml) werden mit Wasser auf 1 000 ml verduumlnnt

36 Kationenaustauschharz Amberlit CG-120 (Na) 100 bis 200 Mesh

Dieses Harz wird vor der Verwendung vorbehandelt Von dem Harz werden 100 g mit 500 ml verduumlnnterSalzsaumlure (35) aufgeschlaumlmmt und auf einer Heizplatte unter staumlndigem Ruumlhren zum Sieden gebracht Es wirdabkuumlhlen gelassen und die Saumlure wird dekantiert Anschlieszligend wird durch einen Papierfilter unter Vakuumfiltriert Das Harz wird 2-mal mit je 500 ml Wasser und danach mit 250 ml Methanol (32) gewaschenAnschlieszligend wird das Harz nochmals mit 250 ml Methanol gespuumllt und der Filterkuchen trocken gesaugt Dasgetrocknete Harz wird in einer verschlossenen Flasche aufbewahrt


37 Standardsubstanz Methylbenzoquat (7-Benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-chinolon) rein

371 M e t h y l b e n z o q u a t - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 5 00 μ g m l

Von der Standardsubstanz (37) werden 50 mg auf 01 mg genau eingewogen in einem 100-ml-Messkolben inmethanolischer Methansulfonsaumlure (34) geloumlst zur Marke aufgefuumlllt und gemischt

372 M e t h y l b e n z o q u a t - S t a n d a r d l ouml s u n g 5 0 μ g m l

Von der Methylbenzoquat-Standard-Stammloumlsung (371) werden 50 ml in einen 50-ml-Messkolben uumlberfuumlhrtEs wird mit Methanol (32) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt


Von der Methylbenzoquat-Standardloumlsung (372) werden 10 20 30 40 bzw 50 ml jeweils in einen 25-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Mit der mobilen Phase (33) wird zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt Diese Loumlsungenenthalten Methylbenzoquat in Konzentrationen von 20 40 60 80 bzw 100 μgml Die Loumlsungen muumlssenvor Gebrauch frisch hergestellt werden

4 Geraumlte

41 Laborschuumlttler


43 Glassaumlule (250 times 15 mm) mit Absperrhahn und Reservoir mit einem Fassungsvermoumlgen von ca 200 ml





5 Verfahren

51 Allgemeines

511 Zur Pruumlfung dass weder Methylbenzoquat noch Stoumlrsubstanzen vorhanden sind wird eine Blindprobeuntersucht

512 Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe untersucht wird die mit Methylbenzoquatangereichert wurde Die zugesetzte Menge an Methylbenzoquat sollte der in der Probe vorhandenen Mengeentsprechen Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 15 mgkg werden 20 g der Blindprobe mit 600 μlStandard-Stammloumlsung (371) versetzt Es wird gemischt und 10 min stehen gelassen bevor mit der Extrak-tion (52) fortgefahren wird

Fuumlr den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe aumlhnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchendeProbe und Methylbenzoquat darf nicht nachweisbar sein

52 Extraktion

Von der vorbereiteten Probe werden 20 g auf 001 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingewogenNach Zugabe von 1000 ml Methansulfonsaumlure-Loumlsung (34) wird mechanisch (41) 30 min geschuumlttelt DieLoumlsung wird durch ein Filterpapier filtriert und das Filtrat fuumlr die Fluumlssig-Fluumlssig-Trennung (53) aufbewahrt

53 Fluumlssig-Fluumlssig-Trennung

Von dem durch 52 erhaltenen Filtrat werden 250 ml in einen 500-ml-Scheidetrichter uumlberfuumlhrt der 100 mlSalzsaumlure (35) enthaumllt Nach Zugabe von 100 ml Dichlormethan (31) wird 1 min geschuumlttelt diePhasentrennung abgewartet und die untere Phase (Dichlormethan) in einen 500-ml-Rundkolben ablaufengelassen Die Extraktion der waumlssrigen Phase wird 2-mal mit je 40 ml Dichlormethan wiederholt und die Extraktewerden zum ersten Extrakt im Rundkolben gegeben Das Dichlormethanextrakt wird am Rotationsverdampfer(42) bei 40 oC und vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt Der Ruumlckstand wird in 20 bis 25 mlMethanol (32) geloumlst und der Kolben verschlossen Der gesamte Extrakt wird fuumlr die Ionenaustauschchromato-grafie (54) aufbewahrt


54 Ionenaustauschromatografie

541 Vo r b e r e i t u n g d e r K a t i o n e n a u s t a u s c h s auml u l e

In das untere Ende der Glassaumlule (43) wird ein Glaswattebausch eingebracht Von dem behandeltenKationenaustauschharz (36) werden 50 g mit 50 ml Salzsaumlure (35) aufgeschlaumlmmt in die Glassaumlule gegebenund absetzen gelassen Nachdem der Saumlureuumlberschuss bis knapp zur Harzoberflaumlche abgelaufen ist wird dieSaumlule so lange mit Wasser gewaschen bis die Waschfluumlssigkeit neutral gegen Lackmus ist Dann werden 50 mlMethanol (32) auf die Saumlule gegeben und bis zur Harzoberflaumlche ablaufen gelassen

542 S auml u l e n c h r oma to g r a f i e

Der Extrakt (53) wird mittels einer Pipette vorsichtig auf die Saumlule gegeben Der Rundkolben wird 2-mal mit je5 bis 10 ml Methanol (32) gespuumllt Die anfallenden Spuumllloumlsungen werden ebenfalls auf die Saumlule gegebenNachdem der Extrakt bis zur Harzoberflaumlche abgelaufen ist wird die Saumlule mit 50 ml Methanol gewaschenwobei die Flussrate houmlchstens 5 mlmin betragen darf Die Waschfluumlssigkeit wird verworfen Das Methylben-zoquat wird mit 150 ml methanolischer Methansulfonsaumlure-Loumlsung (34) von der Saumlule eluiert und das Eluat ineinem 250-ml-Erlenmeyerkolben aufgefangen


Das Eluat (542) wird in einen 1-l-Scheidetrichter uumlberfuumlhrt Der Erlenmeyerkolben wird mit 5 bis 10 mlMethanol (32) gespuumllt und die anfallende Spuumllfluumlssigkeit ebenfalls in den Scheidetrichter gegeben Dann werden300 ml Salzsaumlure-Loumlsung (35) und 130 ml Dichlormethan (31) zugefuumlgt Es wird 1 min geschuumlttelt und diePhasentrennung abgewartet Die untere Phase (Dichlormethan) wird in einen 500-ml-Rundkolben abgelassenDie Extraktion der waumlssrigen Phase wird 2-mal mit je 70 ml Dichlormethan wiederholt und diese Extraktewerden zum ersten Extrakt im Rundkolben gegeben

Der Dichlormethanextrakt wird am Rotationsverdampfer (42) bei 40 oC und vermindertem Druck bis zurTrockne eingeengt Der Ruumlckstand im Rundkolben wird in ca 5 ml Methanol (32) geloumlst und die Loumlsungquantitativ in einen 10-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Der Rundkolben wird 2-mal mit je 1 bis 2 ml Methanolgespuumllt und die Spuumllloumlsungen werden in den Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit Methanol zur Marke aufgefuumllltund durchmischt Ein aliquoter Teil wird durch einen Membranfilter (46) filtriert Die Loumlsung wird fuumlr die HPLC-Bestimmung (56) aufbewahrt

56 HPLC-Bestimmung

561 P a r ame t e r


mdash HPLC-Trennsaumlule (441)

mdash mobile Phase fuumlr die HPLC Methanol-Wasser-Gemisch (33)

mdash Durchflussrate 1 bis 15 mlmin

mdash Detektionswellenlaumlnge 265 nm

mdash Einspritzvolumen 20 bis 50 μl



Jede Kalibrierloumlsung (373) wird mehrmals eingespritzt und die Peakhoumlhen (-flaumlchen) fuumlr die einzelnenKonzentrationen werden gemessen Es wird eine Kalibrationskurve gezeichnet indem die mittleren Peakhoumlhenoder -flaumlchen auf der Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in μgml auf der Abszisse aufgetragenwerden


Der Probenextrakt (55) wird mehrmals eingespritzt wobei dasselbe Volumen wie fuumlr die Einspritzung derKalibrierloumlsungen verwendet wird und die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Methylbenzoquatpeaks wird ermittelt


Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Methylbenzoquatpeaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve(562) die Konzentration der Probenloumlsung in μgml bestimmt


Der Methylbenzoquatgehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c 40m

wobei

c = Methylbenzoquatkonzentration der Probenloumlsung in μgmlm = Probeneinwaage in g


71 Identitaumlt



Ein Probenextrakt wird mit einer geeigneten Menge Methylbenzoquat-Standardloumlsung (372) versetzt Die Mengedes zugesetzten Methylbenzoquats muss dem erwarteten Methylbenzoquatgehalt des Probenextrakts ent-sprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desMethylbenzoquatpeaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darf houmlchstens plusmn 10 von der des Peaksder nicht angereicherten Probenloumlsung abweichen







72 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf beiMethylbenzoquatgehalten von 4-20 mgkg 10 des houmlheren Wertes nicht uumlberschreiten




Es wurden 5 Proben von 10 Laboratorien untersucht Jede Probe wurde doppelt analysiert

Blindprobe Mehl 1 Pellets 1 Mehl 2 Pellets 2

Mittelwert [mgkg] NN 450 450 890 870sr [mgkg] mdash 030 020 060 050



VKr [ ] mdash 670 440 670 570sR [mgkg] mdash 040 050 090 100VKR [ ] mdash 890 1110 1010 1150Wiederfindung [ ] mdash 9200 9300 9200 8900

NN = Nicht nachweisbarsr = Standardabweichung der WiederholbarkeitVKr = Variationskoeffizient der WiederholbarkeitsR = Standardabweichung der VergleichbarkeitVKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

B BESTIMMUNG DES OLAQUINDOXGEHALTS

N-(2-Hydroxyethyl)-3-methyl-2-chinoxalin-carbamid-14-dioxid


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Olaquindoxgehalts von Futtermitteln Die Bestimmungsgrenze betraumlgt5 mgkg

2 Prinzip

Die Probe wird mit einem Methanol-Wasser-Gemisch extrahiert Der Gehalt an Olaquindox wird durchUmkehrphasen-Hochleistungsfluumlssigkeitschromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektorsbestimmt

3 Reagenzien

31 Methanol




Wasser (33)-Methanol (32)-Gemisch z B 900 + 100 (V+V)

35 Standardsubstanz Olaquindox rein N-(2-Hydroxyethyl)-3-methyl-2-chinoxalin-carbamid-14-dioxid E 851

351 O l a q u i n d ox - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 2 50 μ g m l

Von Olaquindox (35) werden 50 mg auf 01 mg genau in einen 200-ml-Messkolben eingewogen und es werden190 ml Wasser zugefuumlgt Dann wird der Kolben 20 min in ein Ultraschallbad (41) gestellt Nach derUltraschallbehandlung wird die Loumlsung auf Raumtemperatur gebracht es wird mit Wasser zur Marke aufgefuumllltund gemischt Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt und im Kuumlhlschrank aufbewahrt Die Loumlsungmuss monatlich frisch hergestellt werden

352 O l a q u i n d ox - S t a n d a r d l ouml s u n g 2 5 μ g m l

Von der Standard-Stammloumlsung (351) werden 100 ml in einen 100-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit dermobilen Phase (34) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt undim Kuumlhlschrank aufbewahrt Die Loumlsung muss taumlglich frisch hergestellt werden


Von der Standardloumlsung (352) werden 10 20 50 100 150 bzw 200 ml jeweils in einen 50-ml-Messkolbenuumlberfuumlhrt Mit der mobilen Phase (34) wird zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt Der Kolben wird mitAluminiumfolie umhuumlllt Diese Kalibrierloumlsungen enthalten jeweils 05 10 25 50 75 bzw 100 μgOlaquindox je ml

Die Loumlsungen muumlssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden


4 Geraumlte

41 Ultraschallbad

42 Mechanisches Schuumlttelgeraumlt




5 Verfahren

Anmerkung Olaquindox ist lichtempfindlich Alle Analysenschritte sind deshalb bei gedaumlmpftem Licht oderunter Verwendung von Braunglasgeraumlten durchzufuumlhren

51 Allgemeines

511 Zur Pruumlfung dass weder Olaquindox noch Stoumlrsubstanzen vorhanden sind wird eine Blindprobe untersucht

512 Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe untersucht wird die mit Olaquindox angereichertwurde Die zugesetzte Menge an Olaquindox sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen ZurAnreicherung auf einen Gehalt von 50 mgkg werden 100 ml der Standard-Stammloumlsung (351) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben uumlberfuumlhrt und im Stickstoffstrom auf ca 05 ml eingeengt Dann werden 50 g derBlindprobe zugegeben Es wird gruumlndlich gemischt und 10 min stehen gelassen bevor mit der Extraktion (52)fortgefahren wird

Anmerkung Fuumlr den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe aumlhnlich zusammengesetzt sein wie die zuuntersuchende Probe und Olaquindox darf nicht nachweisbar sein

52 Extraktion

Von der Probe werden 50 g auf 001 g genau in einen 1 000-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 100 mlMethanol (31) versetzt Der Kolben wird 5 min in das Ultraschallbad (41) gestellt Es werden 410 ml Wasserzugegeben und die Probenloumlsung wird weitere 15 min mit Ultraschall behandelt Danach wird der Kolben ausdem Ultraschallbad genommen und es wird 30 min auf dem Schuumlttelgeraumlt (42) geschuumlttelt Die Probenloumlsungwird durch einen Faltenfilter filtriert Von dem Filtrat werden 100 ml in einen 20-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt eswird mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Ein aliquoter Teil wird durch einen Membranfilter (44)filtriert (siehe Bemerkung 9) Anschlieszligend wird die HPLC-Bestimmung (53) durchgefuumlhrt

53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r


Analysensaumlule (431)Mobile Phase (34) Wasser (33)-Methanol (32)- Gemisch 900 + 100 (V+V)Durchflussrate 15 bis 2 mlminDetektionswellenlaumlnge 380 nmEinspritzvolumen 20 bis 100 μl



Jede Kalibrierloumlsung (353) wird mehrmals eingespritzt und die Peakhoumlhen (-flaumlchen) fuumlr die einzelnenKonzentrationen werden gemessen Es wird eine Kalibrationskurve erstellt indem die mittleren Peakhoumlhen(-flaumlchen) auf der Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in μgml auf der Abszisse aufgetragenwerden


Der Probenextrakt (52) wird mehrmals eingespritzt wobei dasselbe Volumen wie fuumlr die Einspritzung derKalibrierloumlsungen verwendet wird Die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Olaquindoxpeaks wird ermittelt



Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Olaquindoxpeaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve(532) die Konzentration der Probenloumlsung in μgml bestimmt

Der Olaquindoxgehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c 1000

m

wobei

c = Olaquindoxkonzentration des Probenextrakts (52) in μgml



71 Identitaumlt

Die Identitaumlt des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestaumltigtwerden wobei die Spektren der Probenloumlsung (52) und der Kalibrierloumlsung (353) die 50 μgml enthaumlltverglichen werden


Ein Probenextrakt (52) wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierloumlsung (353) versetzt Die zugesetzteOlaquindoxmenge muss dem erwarteten Olaquindoxgehalt des Probenextrakts entsprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desOlaquindoxpeaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darf houmlchstens plusmn 10 von der des Peaks desnicht angereicherten Probenextrakts abweichen







72 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf beieinem Olaquindoxgehalt zwischen 10 und 200 mgkg 15 des houmlheren Wertes nicht uumlberschreiten





Es wurde ein EG-Ringversuch durchgefuumlhrt bei dem 4 Ferkelfuttermittel einschlieszliglich eines Blindfuttermittelsvon bis zu 13 Laboratorien untersucht wurden Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabellezusammengefasst

Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4

L 13 10 11 11n 40 40 44 44Mittelwert [mgkg] mdash 146 480 954sr [mgkg] mdash 082 205 636sR [mgkg] mdash 162 428 842VKr [ ] mdash 56 43 67VKR [ ] mdash 111 89 88

Sollgehalt[mgkg] mdash 15 50 100Wiederfindung [ ] mdash 973 960 954


9 Bemerkung

Obwohl die Methode fuumlr Futtermittel mit Olaquindoxgehalten von mehr als 100 mgkg nicht validiert wurdekoumlnnen durch Verringerung der Einwaage undoder Verduumlnnung des Extrakts (52) auf den Konzentrations-bereich der Kalibrationskurve (532) zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden

C BESTIMMUNG DES AMPROLIUMGEHALTS

1-[(4-Amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methyl-pyridiniumchlorid-hydrochlorid


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Amproliumgehalts von Futtermitteln und Vormischungen DieNachweisgrenze betraumlgt 1 mgkg die Bestimmungsgrenze 5 mgkg

2 Prinzip

Die Probe wird mit einem Methanol-Wasser-Gemisch extrahiert Nach Verduumlnnung mit der mobilen Phase undMembranfiltration wird der Amproliumgehalt mittels Hochleistungsfluumlssigkeitschromatografie (HPLC) uumlber einKationenaustauschermaterial unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt

3 Reagenzien

31 Methanol



34 Natriumdihydrogenphosphatloumlsung c = 01 moll

Von dem Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat werden 1380 g in einem 1 000-ml-Messkolben in Was-ser (33) geloumlst Es wird mit Wasser (33) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt


35 Natriumperchloratloumlsung c = 16 moll

Von dem Natriumperchloratmonohydrat werden 22474 g in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser (33)geloumlst Es wird mit Wasser (33) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt

36 Mobile Phase fuumlr die HPLC (siehe Bemerkung 91)

Mischung aus Acetonitril (32) Natriumdihydrogenphosphatloumlsung (34) und Natriumperchloratloumlsung (35)450 + 450 + 100 (V+V+V) Vor der Verwendung wird die Loumlsung durch einen 022-μm-Membranfilter (43)filtriert und entgast (z B mindestens 15 min im Ultraschallbad (44))

37 Standardsubstanz Amprolium rein 1-[(4-Amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methyl-pyridiniumchlorid-hydrochlorid E 750 (siehe 92)

371 Amp r o l i um - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 5 00 μ g m l

Von Amprolium (37) werden 50 mg auf 01 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen in 80 mlMethanol (3l) geloumlst und 10 min in ein Ultraschallbad (44) gestellt Nach der Ultraschallbehandlung wird dieLoumlsung auf Raumtemperatur gebracht es wird mit Wasser zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Bei einerTemperatur von le 4 oC ist diese Loumlsung 1 Monat lang haltbar

372 Amp r o l i um - S t a n d a r d l ouml s u n g 5 0 μ g m l

Von der Standard-Stammloumlsung (371) werden 50 ml in einen 50-ml-Messkolben pipettiert es wird mit derExtraktionsloumlsung (38) zur Marke aufgefuumlllt und gemischt Bei einer Temperatur von le 4 oC ist diese Loumlsung1 Monat lang haltbar


Von der Amprolium-Standardloumlsung (372) werden 05 10 bzw 20 ml jeweils in einen 50-ml-Messkolbenuumlberfuumlhrt Mit der mobilen Phase (36) wird zur Marke aufgefuumlllt und durchmischt Diese Loumlsungen enthaltenjeweils 05 10 bzw 20 μg Amprolium je ml Die Loumlsungen muumlssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden

38 Extraktionsloumlsung

Methanol (31)-Wasser-Mischung 2 + 1 (V+V)

4 Geraumlte


411 HPLC-Trennsaumlule fuumlr die Kationenaustauschchromatografie 125 times 4 mm z B Nucleosil 10 SA 5 oder 10 μmKorngroumlszlige oder vergleichbare Saumlule


42 Membranfilter PTFE-Material 045 μm Porengroumlszlige


44 Ultraschallbad

45 Mechanisches Schuumlttelgeraumlt oder Magnetruumlhrer

5 Verfahren

51 Allgemeines


Fuumlr die Durchfuumlhrung des Wiederfindungstests (512) muss zur Pruumlfung dass weder Amprolium nochStoumlrsubstanzen vorhanden sind eine Blindprobe untersucht werden Die Blindprobe muss aumlhnlich zusammen-gesetzt sein wie die zu untersuchende Probe und Amprolium oder Stoumlrsubstanzen duumlrfen nicht nachweisbarsein



Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe untersucht wird die mit Amprolium angereichertwurde Die zugesetzte Menge an Amprolium sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen ZurAnreicherung auf einen Gehalt von 100 mgkg werden 100 ml der Standard-Stammloumlsung (371) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben uumlberfuumlhrt und auf ca 05 ml eingeengt Dann werden 50 g der Blindprobe zugegeben Eswird gruumlndlich gemischt 10 min stehen gelassen und nochmals mehrfach gemischt bevor mit der Extrak-tion (52) fortgefahren wird

Ist eine der zu untersuchenden Probe aumlhnliche Blindprobe nicht verfuumlgbar (siehe 511) so kann einWiederfindungstest mithilfe des Additionsverfahrens durchgefuumlhrt werden In diesem Fall wird die zuuntersuchende Probe mit einer Amproliummenge angereichert die der bereits in der Probe vorhandenen Mengeentspricht Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht und die Wieder-findungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden

52 Extraktion

521 Vo rm i s c hu n g e n (Amp r o l i umge h a l t lt 1 ) u n d F u t t e rm i t t e l

Je nach Amproliumgehalt werden 5 bis 40 g der Probe auf 001 g genau in einen 500-ml-Erlenmeyerkolbeneingewogen und mit 200 ml Extraktionsloumlsung (38) versetzt Der Kolben wird 15 min in ein Ultraschallbad (44)gestellt und anschlieszligend 60 min auf dem Schuumlttelgeraumlt geschuumlttelt oder auf dem Magnetruumlhrer (45) geruumlhrt Einaliquoter Teil des Extrakts wird mit der mobilen Phase (36) auf einen Amproliumgehalt von 05 bis 2 μgmlverduumlnnt und gemischt (siehe Bemerkung 93) Von dieser verduumlnnten Loumlsung werden 5 bis 10 ml durch einenMembranfilter (42) filtriert Anschlieszligend wird die HPLC-Bestimmung (53) durchgefuumlhrt

522 Vo rm i s c hu n g e n (Amp r o l i umge h a l t ge 1 )

Je nach Amproliumgehalt werden 1 bis 4 g der Vormischung auf 0001 g genau in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 200 ml Extraktionsloumlsung (38) versetzt Der Kolben wird 15 min in einUltraschallbad (44) gestellt und anschlieszligend 1 h auf dem Schuumlttelgeraumlt geschuumlttelt oder auf dem Magnetruumlhrergeruumlhrt (45) Ein aliquoter Teil des Extrakts wird mit der mobilen Phase (36) auf einen Amproliumgehalt von05 bis 2 μgml verduumlnnt und gemischt Von dieser verduumlnnten Loumlsung werden 5 bis 10 ml durch einenMembranfilter (42) filtriert Anschlieszligend wird die HPLC-Bestimmung (53) durchgefuumlhrt

53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r

Die folgenden Angaben sind Richtwerte andere Parameter koumlnnen verwendet werden sofern sie zuvergleichbaren

Ergebnissen fuumlhrenHPLC-Trennsaumlule (411) 125 times 4 mm Kationenaustausch Nucleosil 10 SA 5 oder 10 μm Korngroumlszlige oder

vergleichbare SaumluleMobile Phase (36) Mischung aus Acetonitril (32) Natriumdihydrogenphosphat-Loumlsung (34) und

Natriumperchlorat-Loumlsung (35) 450 + 450 + 100 (V+V+V)Durchflussrate 07 bis 1 mlminDetektionswellenlaumlnge 264 nmEinspritzvolumen 100 μl



Jede Kalibrierloumlsung (373) wird mehrmals eingespritzt und die mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) werden fuumlr dieeinzelnen Konzentrationen gemessen Es wird eine Kalibrationskurve erstellt indem die mittleren Peakhoumlhen(-flaumlchen) auf der Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in μgml auf der Abszisse aufgetragenwerden


Der Probenextrakt (52) wird mehrmals eingespritzt wobei dasselbe Volumen wie fuumlr die Einspritzung derKalibrierloumlsungen verwendet wird Die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Amproliumpeaks wird ermittelt


Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Amproliumpeaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve(532) die Konzentration der Probenloumlsung in μgml bestimmt


Der Amproliumgehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =V c f

m[mgkg]

wobei

V = Volumen der Extraktionsloumlsung (38) in ml gemaumlszlig 52 (d h 200 ml)c = Amproliumkonzentration der Probenloumlsung (52) in μgmlf = Verduumlnnungsfaktor gemaumlszlig 52m = Probeneinwaage in g


71 Identitaumlt



Eine Probenloumlsung (52) wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierloumlsung (373) angereichert Die zugesetzteAmproliummenge muss dem Amproliumgehalt des Probenextrakts entsprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desAmproliumpeaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darf houmlchstens plusmn 10 von der des Peaks dernicht angereicherten Probenloumlsung abweichen






Wird eines dieser Kriterien nicht erfuumlllt so gilt das Vorhandensein des Analyten als nicht bestaumltigt

72 Wiederholbarkeit


mdash 15 des houmlheren Werts bei einem Amproliumgehalt zwischen 25 und 500 mgkg

mdash 75 mgkg bei einem Amproliumgehalt zwischen 500 und 1 000 mgkg

mdash 75 des houmlheren Werts bei einem Amproliumgehalt von uumlber 1 000 mgkg





Bei einem Ringversuch wurden 3 Gefluumlgelfuttermittel (Proben 1 bis 3) 1 Mineralfuttermittel (Probe 4) und 1Vormischung (Probe 5) untersucht Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst

Probe 1(Blindprobe) Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5

L 14 14 14 14 15n 56 56 56 56 60Mittelwert [mgkg] mdash 455 188 5 129 25 140sr [mgkg] mdash 226 357 178 550VKr [ ] mdash 495 190 346 220sR [mgkg] mdash 295 118 266 760VKR [ ] mdash 647 627 519 300

Sollgehalt [mgkg] mdash 50 200 5 000 25 000

L = Anzahl der Laboratorienn = Anzahl der Einzelwertesr = Standardabweichung der WiederholbarkeitVKr = Variationskoeffizient der WiederholbarkeitsR = Standardabweichung der VergleichbarkeitVKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

9 Bemerkungen

91 Enthaumllt die Probe Thiamin so erscheint der Thiaminpeak in der Chromatografie kurz vor dem AmproliumpeakBei Anwendung dieser Methode muumlssen Amprolium und Thiamin getrennt werden Sind Amprolium undThiamin nicht durch die bei dieser Methode verwendete Saumlule (411) getrennt sollten bis zu 50 desAcetonitrilanteils der mobilen Phase (36) durch Methanol ersetzt werden

92 Gemaumlszlig dem britischen Arzneibuch zeigt das Spektrum einer Amproliumloumlsung (c = 002 moll) in Salzsaumlure(c = 01 moll) Maxima bei 246 nm und 262 nm Die Absorption betraumlgt 084 bei 246 nm bzw 080 bei262 nm

93 Der Extrakt muss immer mit der mobilen Phase verduumlnnt werden da sich sonst die Retentionszeit desAmproliumpeaks durch Veraumlnderungen der Ionenstaumlrke betraumlchtlich verschieben kann

D BESTIMMUNG DES CARBADOXGEHALTS

Methyl 3-(2-chinoxalinylmethylen)carbazat N1N4-dioxid


Die Methode erlaubt die Bestimmung des Carbadoxgehalts von Futtermitteln Vormischungen und Zube-reitungen Die Nachweisgrenze betraumlgt 1 mgkg die Bestimmungsgrenze 5 mgkg

2 Prinzip

Die Probe wird mit Wasser aumlquilibriert und anschlieszligend mit Methanol-Acetonitril extrahiert Bei Futtermittelnwird ein aliquoter Teil des filtrierten Extrakts auf einer Aluminiumoxid-Saumlule gereinigt Bei Vormischungen undZubereitungen wird ein aliquoter Teil des filtrierten Extrakts mit einem Gemisch aus Wasser Methanol undAcetonitril auf eine geeignete Konzentration verduumlnnt Der Carbadoxgehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsfluumlssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt

3 Reagenzien

31 Methanol



33 Essigsaumlure w = 100

34 Aluminiumoxid neutral Aktivitaumltsstufe I

35 Methanol-Acetonitril 1 + 1 (V+V)

500 ml Methanol (31) werden mit 500 ml Acetonitril (32) gemischt

36 Essigsaumlure σ = 10

10 ml Essigsaumlure (33) werden auf 100 ml in Wasser geloumlst

37 Natriumacetat


39 Acetat-Pufferloumlsung c = 001 moll pH = 60

082 g Natriumacetat (37) werden in 700 ml Wasser (38) geloumlst und der pH-Wert wird mit Essigsaumlure (36) auf60 eingestellt Die Loumlsung wird in einen 1 000-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es wird mit Wasser (38) zur Markeaufgefuumlllt und gemischt


825 ml der Acetat-Pufferloumlsung (39) werden mit 175 ml Acetonitril (32) vermischt


311 Standardsubstanz

Carbadox rein Methyl 3-(2-chinoxalinylmethylen)carbazat N1N4-dioxid E 850

3111 C a r b a d ox - S t a n d a r d - S t amm l ouml s u n g 1 00 μ g m l ( s i e h e Anme r k u n g un t e r bdquo5 Ve r f a h -r e n ldquo )

Von der Carbadox-Standardsubstanz (311) werden 25 mg auf 01 mg genau in einen 250-ml-Messkolbeneingewogen und im Ultraschallbad (47) in Methanol-Acetonitril (35) geloumlst Nach der Ultraschallbehandlungwird die Loumlsung auf Raumtemperatur gebracht zur Marke mit Methanol-Acetonitril (35) aufgefuumlllt undgemischt Der Kolben wird mit Aluminiumfolie umhuumlllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) undim Kuumlhlschrank aufbewahrt Bei einer Temperatur von le 4 oC ist diese Loumlsung 1 Monat lang haltbar


Von der Standard-Stammloumlsung (3111) werden 20 50 100 bzw 200 ml jeweils in einen 100-ml-Messkolben uumlberfuumlhrt Es werden jeweils 30 ml Wasser hinzugefuumlgt es wird mit Methanol-Acetonitril (35) zurMarke aufgefuumlllt und gemischt Die Kolben werden mit Aluminiumfolie umhuumlllt Diese Loumlsungen enthaltenjeweils 20 50 100 bzw 200 μgml Carbadox

Kalibrierloumlsungen muumlssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden

Anmerkung Fuumlr die Bestimmung des Carbadoxgehalts in Futtermitteln die weniger als 10 mgkg enthaltenmuumlssen Kalibrierloumlsungen mit einer Konzentration von weniger als 20 μgml bereitet werden

312 Wasser-[Methanol-Acetonitril (35)]-Gemisch z B 300 + 700 (V+V)

300 ml Wasser werden mit 700 ml des Methanol-Acetonitril-Gemisches (35) vermischt

4 Geraumlte

41 Laborschuumlttler oder Magnetruumlhrer



43 Glassaumlule (Laumlnge 300 bis 400 mm Innendurchmesser etwa 10 mm) mit Sinterglasfritte und Auslaufhahn

Anmerkung Eine Glassaumlule mit Absperrhahn oder eine konisch zulaufende Glassaumlule koumlnnen ebenfallsverwendet werden in diesem Fall wird ein kleiner Glaswattebausch in den unteren Teil der Saumluleeingebracht und mit einem Glasstab zusammengedruumlckt



442 UV-Detektor mit variabler Wellenlaumlngeneinstellung oder Diodenarray-Detektor mit einem Messbereich von225 bis 400 nm



47 Ultraschallbad

5 Verfahren

Anmerkung Carbadox ist lichtempfindlich Alle Analysenschritte sind daher bei gedaumlmpftem Licht oder unterVerwendung von Braunglasgeraumlten durchzufuumlhren Alternativ koumlnnen die Glaswaren mitAluminiumfolie umwickelt werden

51 Allgemeines


Fuumlr die Durchfuumlhrung des Wiederfindungstests (512) muss zur Pruumlfung dass weder Carbadox nochStoumlrsubstanzen vorhanden sind eine Blindprobe untersucht werden Die Blindprobe muss aumlhnlich zusammen-gesetzt sein wie die zu untersuchende Probe und Carbadox oder Stoumlrsubstanzen duumlrfen nicht nachweisbar sein


Die Wiederfindungsrate wird ermittelt indem eine Blindprobe (511) untersucht wird die mit Carbadoxangereichert wurde Die zugesetzte Menge an Carbadox sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechenZur Anreicherung auf einen Gehalt von 50 mgkg werden 50 ml der Standard-Stammloumlsung (3111) in einen200-ml-Erlenmeyerkolben gegeben Die Loumlsung wird in einem Stickstoffstrom auf ca 05 ml eingeengt Dannwerden 10 g der Blindprobe zugegeben Es wird gemischt und 10 min stehen gelassen bevor mit demExtraktionsschritt (52) fortgefahren wird

Ist eine der zu untersuchenden Probe aumlhnliche Blindprobe nicht verfuumlgbar (siehe 511) so kann einWiederfindungstest mithilfe des Standard-Additionsverfahrens durchgefuumlhrt werden In diesem Fall wird die zuuntersuchende Probe mit einer Carbadoxmenge angereichert die der bereits in der Probe vorhandenen Mengeentspricht Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht und die Wieder-findungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden

52 Extraktion


Von der Probe werden 10 g auf 001 g genau in einen 200-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen Nach Zugabe von150 ml Wasser wird gemischt und 5 min stehen gelassen Dann werden 350 ml Methanol-Acetonitril (35)hinzugefuumlgt der Kolben wird verschlossen und 30 min auf dem Schuumlttelgeraumlt geschuumlttelt oder auf demMagnetruumlhrer (41) geruumlhrt Die Loumlsung wird uumlber Glasfaser-Filterpapier (42) filtriert Diese Loumlsung wird fuumlr dieReinigung (53) aufbewahrt

522 Vo rm i s c hu n g e n ( 0 1 b i s 2 0 )

Von der nicht gemahlenen Probe wird 1 g auf 0001 g genau in einen 200-ml-Erlenmeyerkolben eingewogenNach Zugabe von 150 ml Wasser wird gemischt und 5 min stehen gelassen Dann werden 350 ml Methanol-Acetonitril (35) hinzugefuumlgt der Kolben wird verschlossen und 30 min auf dem Schuumlttelgeraumlt geschuumlttelt oderauf dem Magnetruumlhrer (41) geruumlhrt Die Loumlsung wird uumlber Glasfaser-Filterpapier (42) filtriert


Ein aliquoter Teil des Filtrats wird in einen 50-ml-Messkolben pipettiert Es werden 150 ml Wasser hinzugefuumlgtes wird zur Marke mit Methanol-Acetonitril (35) aufgefuumlllt und gemischt Die Carbadox-Konzentration derfertigen Loumlsung muss bei etwa 10 μgml liegen Ein aliquoter Teil wird durch einen 045-μm-Membranfilter (46)filtriert

Anschlieszligend wird die HPLC-Bestimmung (54) durchgefuumlhrt

523 Z u b e r e i t u n g e n ( gt 2 )

Von der nicht gemahlenen Probe werden 02 g auf 0001 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolbeneingewogen Es werden 450 ml Wasser hinzugefuumlgt gemischt und 5 min stehen gelassen Dann werden1050 ml Methanol-Acetonitril (35) hinzugefuumlgt Der Kolben wird verschlossen geschuumlttelt 15 min in einUltraschallbad (47) gestellt und anschlieszligend 15 min auf dem Schuumlttelgeraumlt geschuumlttelt oder auf demMagnetruumlhrer geruumlhrt (41) Die Loumlsung wird uumlber Glasfaser-Filterpapier (42) filtriert

Ein aliquoter Teil des Filtrats wird mit dem Wasser-Methanol-Acetonitril-Gemisch (312) verduumlnnt bis eineendguumlltige Carbadoxkonzentration von 10 bis 15 μgml erreicht ist (Verduumlnnungsfaktor 10 fuumlr eine 10 igeZubereitung) Ein aliquoter Teil wird durch einen 045-μm-Membranfilter (46) filtriert


53 Reinigung


Von Aluminiumoxid (34) werden 4 g abgewogen und in die Glassaumlule (43) eingebracht


Von dem filtrierten Extrakt (521) werden 15 ml auf die Aluminiumoxid-Saumlule gegeben und die ersten 2 ml desEluats werden verworfen Die folgenden 5 ml werden aufgefangen und ein aliquoter Teil davon durch einen 045-μm-Membranfilter (46) filtriert


54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r


Ergebnissen fuumlhrenHPLC-Trennsaumlule (441) 300 times 4 mm C18 10 μm Korngroumlszlige oder vergleichbare SaumluleMobile Phase (310) Gemisch aus Acetat-Pufferloumlsung (39) und Acetonitril (32) 825 + 175 (V+V)Durchflussrate 15 bis 2 mlminDetektionswellenlaumlnge 365 nmEinspritzvolumen 20 μl

Die Stabilitaumlt des chromatografischen Systems wird uumlberpruumlft indem die Kalibrierloumlsung (3112) die 50 μgmlenthaumllt mehrmals eingespritzt wird bis konstante Peakhoumlhen (-flaumlchen) und Retentionszeiten erhalten werden


Jede Kalibrierloumlsung (3112) wird mehrmals eingespritzt und die Peakhoumlhen (-flaumlchen) werden fuumlr die einzelnenKonzentrationen gemessen Es wird eine Kalibrationskurve erstellt indem die mittleren Peakhoumlhen (-flaumlchen) aufder Ordinate und die dazugehoumlrigen Konzentrationen in gml auf der Abszisse aufgetragen werden


Der Probenextrakt [(532) fuumlr Futtermittel (522) fuumlr Vormischungen und (523) fuumlr Zubereitungen] wirdmehrmals eingespritzt und die mittlere Peakhoumlhe (-flaumlche) der Carbadoxpeaks ermittelt


Aus der mittleren Houmlhe (Flaumlche) der Carbadoxpeaks der Probenloumlsung wird anhand der Kalibrationskurve (542)die Carbadoxkonzentration der Probenloumlsung in μgml bestimmt


61 Futtermittel

Der Carbadoxgehalt w (in mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c V1

m[mgkg]

wobei

c = Carbadoxkonzentration der Probenloumlsung (532) in μgmlV1 = Extraktionsvolumen in ml (d h 50)m = Probeneinwaage in g

62 Vormischungen und Zubereitungen

Der Carbadoxgehalt w (mgkg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet

w =c V2 f

m[mgkg]

wobei

c = Carbadoxkonzentration der Probenloumlsung (522 oder 523) in μgmlV2 = Extraktionsvolumen in ml (d h 50 fuumlr Vormischungen 150 fuumlr Zubereitungen)f = Verduumlnnungsfaktor gemaumlszlig 522 (Vormischungen) oder 523 (Zubereitungen)m = Probeneinwaage in g


71 Identitaumlt

Die Identitaumlt des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestaumltigtwerden wobei die Spektren des Probenextrakts und der Kalibrierloumlsung (3112) die 100 μgml enthaumlltverglichen werden


Ein Probenextrakt wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierloumlsung (3112) angereichert Die zugesetzteCarbadoxmenge muss in etwa dem vermuteten Carbadoxgehalt des Probenextrakts entsprechen

Unter Beruumlcksichtigung der zugesetzten Menge und der Verduumlnnung des Extrakts darf nur die Houmlhe desCarbadoxpeaks vergroumlszligert sein Die Peakbreite in halber Houmlhe darf houmlchstens plusmn 10 von der des Peaks der nichtangereicherten Probenloumlsung abweichen








72 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf beieinem Carbadoxgehalt von 10 mgkg und mehr 15 des houmlheren Wertes nicht uumlberschreiten




Bei einem Ringversuch wurden 6 Futtermittel 4 Vormischungen und 3 Zubereitungen von 8 Laboratorienuntersucht Jede Probe wurde doppelt analysiert (Naumlhere Informationen zu diesem Ringversuch sind dem Journalof the AOAC Band 71 1988 S 484-490 zu entnehmen) Die Ergebnisse (mit Ausnahme von Ausreiszligern) sindin der nachstehenden Tabelle zusammengefasst

Tabelle 1

Ergebnisse des Ringversuchs fuumlr Futtermittel

Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6

L 8 8 8 8 8 8n 15 14 15 15 15 15Mittelwert [mgkg] 500 476 482 497 469 497sr [mgkg] 290 269 138 155 152 212VKr [ ] 58 56 29 31 32 43sR [mgkg] 392 413 223 258 226 244VKR [ ] 78 87 46 52 48 49

Sollgehalt [mgkg] 500 500 500 500 500 500

Tabelle 2

Ergebnisse des Ringversuchs fuumlr Vormischungen und Zubereitungen

Vormischungen Zubereitungen

A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8n 14 14 14 14 16 16 16Mittelwert [mgkg] 889 929 921 876 946 981 104sr [mgkg] 037 028 028 044 41 51 77VKr [ ] 42 30 30 50 43 52 74sR [mgkg] 037 028 040 055 54 64 77VKR [ ] 42 30 43 63 57 65 74

Sollgehalt [mgkg] 100 100 100 100 100 100 100



ANHANG IX

ENTSPRECHUNGSTABELLEN GEMAumlSS ARTIKEL 6

1 Richtlinie 71250EWG

Richtlinie 71250EWG Vorliegende Verordnung

Artikel 1 Unterabsatz 1 Artikel 3Artikel 1 Unterabsatz 2 Artikel 2Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 Anhang IIAnhang Teil 2 mdash

Anhang Teil 3 mdash

Anhang Teil 4 Anhang III Teil OAnhang Teil 5 Anhang III Teil MAnhang Teil 6 Anhang III Teil NAnhang Teil 7 Anhang III Teil QAnhang Teil 9 Anhang III Teil KAnhang Teil 10 mdash

Anhang Teil 11 mdash

Anhang Teil 12 Anhang III Teil JAnhang Teil 14 Anhang III Teil DAnhang Teil 16 mdash



Artikel 1 Artikel 3Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang Teil I Anhang III Teil AAnhang Teil II Anhang III Teil EAnhang Teil III Anhang III Teil PAnhang Teil IV Anhang III Teil H




Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Anhang I Teil 1 Anhang III Teil LAnhang I Teil 2 Anhang III Teil CAnhang I Teil 2 mdash

Anhang I Teil 3 mdash

Anhang I Teil 3 Anhang V Teil AAnhang II mdash





Artikel 4 mdash

Anhang I Teil 1 Anhang III Teil BAnhang I Teil 2 mdash

Anhang I Teil 3 Anhang III Teil I




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang I



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 mdash

Anhang Teil 2 mdash

Anhang Teil 3 Anhang IV Teil C



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang VII




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang IV Teil D

12 Richtlinie 93117EG

Richtlinie 93117EG Vorliegende Verordnung

Artikel 1 Artikel 3 und 5Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 Anhang IV Teil EAnhang Teil 2 Anhang VIII Teil A




Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Anhang Teil A Anhang III Teil FAnhang Teil C Anhang VIII Teil B





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Artikel 7 mdash

Anhang Teil A Anhang VIII Teil CAnhang Teil B Anhang IV Teil FAnhang Teil C Anhang VIII Teil D




Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Anhang Anhang IV Teil G




Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Anhang Teil A Anhang IV Teil AAnhang Teil B Anhang IV Teil BAnhang Teil C Anhang III Teil G



Artikel 1 Artikel 1Artikel 2 Artikel 2 und 3Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Anhang I Anhang I und Anhang V Teil B(I)Anhang II Anhang II und Anhang V Teil B(II)





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Anhang Anhang VI


mdash Elfte Richtlinie 9370EWG der Kommission vom28 Juli 1993 zur Festlegung gemeinschaftlicherAnalysemethoden fuumlr die amtliche Untersuchungvon Futtermitteln (1)

mdash Zwoumllfte Richtlinie 93117EG der Kommission vom17 Dezember 1993 zur Festlegung gemeinschaft-licher Analysemethoden fuumlr die amtliche Untersu-chung von Futtermitteln (2)

mdash Richtlinie 9864EG der Kommission vom 3 Septem-ber 1998 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyse-methoden fuumlr die Bestimmung von AminosaumlurenRohfetten und Olaquindox in Futtermitteln und zurAumlnderung der Richtlinie 71393EWG (3)

mdash Richtlinie 199927EG der Kommission vom 20 April1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyseme-thoden fuumlr die Bestimmung von Amprolium Dicla-zuril und Carbadox in Futtermitteln sowie zurAumlnderung der Richtlinien 71250EWG und 7346EWG und zur Aufhebung der Richtlinie 74203EWG (4)

mdash Richtlinie 199976EG der Kommission vom 23 Juli1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyseme-thoden fuumlr die Bestimmung von Lasalocid-Natrium inFuttermitteln (5)

mdash Richtlinie 200045EG der Kommission vom 6 Juli2000 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analyseme-thoden fuumlr die Bestimmung von Vitamin A Vitamin Eund Tryptophan in Futtermitteln (6)

mdash Richtlinie 200270EG der Kommission vom 26 Juli2002 zur Festlegung von Anforderungen an dieBestimmung der Gehalte an Dioxinen und dioxinaumlhn-lichen PCB in Futtermitteln (7)

mdash Richtlinie 2003126EG der Kommission vom23 Dezember 2003 uumlber die Analysemethode zurBestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs beider amtlichen Untersuchung von Futtermitteln (8)

(2) Da die Richtlinie 70373EWG durch die Verordnung (EG)Nr 8822004 ersetzt wurde ist es angezeigt die Durch-fuumlhrungsrechtsakte zu dieser Richtlinie aufzuheben und ineiner einzigen Verordnung zusammenzufassen Gleichzeitigsollten die Methoden und Verfahren entsprechend denneuesten wissenschaftlichen und technologischen Erkennt-nissen angepasst werden Methoden die zu ihrem Zwecknicht mehr verwendet werden sollten gestrichen werdenEs ist geplant die Probenahmebestimmungen zu gegebenerZeit zu aktualisieren um den juumlngsten Entwicklungen beider Erzeugung Lagerung Befoumlrderung und Vermarktungvon Futtermitteln Rechnung zu tragen Dennoch ist esangezeigt die bestehenden Probenahmebestimmungen vor-laumlufig beizubehalten

(3) Die Richtlinien 71250EWG 71393EWG 72199EWG7346EWG 76371EWG 76372EWG 78633EWG81715EWG 84425EWG 86174EWG 9370EWG93117EG 9864EG 199927EG 199976EG 200045EG 200270EG und 2003126EG sollten daheraufgehoben werden

(4) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maszlignahmen ent-sprechen der Stellungnahme des Staumlndigen Ausschusses fuumlrdie Lebensmittelkette und Tiergesundheit mdash

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN

Artikel 1

Die Probenahmen fuumlr die amtliche Untersuchung von Futter-mitteln auf ihre Bestandteile Zusatzstoffe und unerwuumlnschteStoffe ausgenommen Ruumlckstaumlnde von Schaumldlingsbekaumlmpfungs-mitteln und Mikroorganismen erfolgen nach den in Anhang Iaufgefuumlhrten Verfahren

Artikel 2

Die Vorbereitung der Analyseproben und die Formulierung derErgebnisse erfolgen nach den in Anhang II aufgefuumlhrtenMethoden

Artikel 3

Die Analyse fuumlr die amtliche Untersuchung von Futtermittelnerfolgt nach den Methoden die in Anhang III (Analysemethodenzur Untersuchung der Zusammensetzung von Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und Mischfuttermitteln) Anhang IV (Ana-lysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf ihrenGehalt an zugelassenen Zusatzstoffen) Anhang V (Analyseme-thoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf unerwuumlnschteStoffe) und Anhang VI (Analysemethoden zur Bestimmung derBestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Unter-suchung von Futtermitteln) aufgefuumlhrt sind

Artikel 4

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln fuumlr Gefluumlgel wird inUumlbereinstimmung mit Anhang VII berechnet

Artikel 5

Die in Anhang VIII aufgefuumlhrten Analysemethoden fuumlr dieUntersuchung auf rechtswidriges Vorhandensein von nicht mehrzugelassenen Zusatzstoffen in Futtermitteln werden zu Bestaumlti-gungszwecken verwendet

Artikel 6

Die Richtlinien 71250EWG 71393EWG 72199EWG 7346EWG 76371EWG 76372EWG 78633EWG 81715EWG 84425EWG 86174EWG 9370EWG 93117EG 9864EG 199927EG 199976EG 200045EG 200270EGund 2003126EG werden aufgehoben

Verweise auf die aufgehobenen Richtlinien gelten als Verweiseauf die vorliegende Verordnung nach den Entsprechungstabellenin Anhang IX


(1) ABl L 234 vom 1791993 S 17(2) ABl L 329 vom 30121993 S 54(3) ABl L 257 vom 1991998 S 14(4) ABl L 118 vom 651999 S 36(5) ABl L 207 vom 681999 S 13(6) ABl L 174 vom 1372000 S 32(7) ABl L 209 vom 682002 S 15(8) ABl L 339 vom 24122003 S 78

Artikel 7






Androulla VASSILIOU



ANHANG I

PROBENAHMEVERFAHREN











4 GERAumlTE








423 Probenteiler






5A2 Einzelproben


































5B2 Einzelproben









bis zu 1 t 1



mehr als 40 t 4



von 1 bis 16 1

17 bis 200 2

201 bis 800 3

mehr als 800 4







61 Allgemeines


62 Einzelproben





































ANHANG II



1 Zweck









3 Verfahren

































(1) ABl L 86 vom 641979 S 30








ANHANG III






2 Prinzip


3 Geraumlte







4 Verfahren


41 Vorbereitung









42 Trocknung









43 Vortrocknung




432 G e t r e i d e








m 100

wobei




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

wobei


53 Wiederholbarkeit


6 Bemerkung





2 Prinzip


3 Geraumlte






35 Analysenwaage

4 Verfahren








wobei



Wiederholbarkeit





2 Prinzip



3 Reagenzien

31 Kaliumsulfat



33 Zinkgranulat





















4 Geraumlte


5 Verfahren

51 Aufschluss





52 Destillation









53 Titration














54 Blindversuch







wobei






wobei





wobei




71 Wiederholbarkeit





72 Genauigkeit


8 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien







4 Geraumlte




5 Verfahren









7 Bemerkungen








2 Prinzip



3 Reagenzien






4 Geraumlte




5 Verfahren








Wiederholbarkeit




7 Bemerkung



CONWAY CELL

Scale 11





2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Magnesiumoxid





4 Geraumlte



5 Verfahren







Wiederholbarkeit








2 Prinzip






3 Reagenzien




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin




315 1-Octanol


316 Aminosaumluren





































4 Geraumlte






46 Zentrifuge






5 Verfahren

















































54 Chromatografie











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Mittelwerte in gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Wiederholbarkeit






010n = 17

011n = 17

026n = 13


011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15


mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


26n = 17

22n = 17

24n = 15





mdash 24n = 16

21n = 16


72 Vergleichbarkeit






030n = 17

023n = 17

030n = 13


034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15


mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15


mdash 69n = 16

67n = 16




9 Bemerkungen










2 Prinzip




3 Reagenzien





35 Natriumhydroxid
























318 Essigsaumlure





4 Geraumlte



43 pH-Meter







5 Verfahren













54 HPLC-Bestimmung












X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Wiederholbarkeit






von L-Tryptophan


























termittel(CRM 117)





(CRM 120)










9 Bemerkungen







B Methanol


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B





93 Bariumhydroxid













2 Prinzip

21 Verfahren A


22 Verfahren B


3 Reagenzien





4 Geraumlte




5 Verfahren





52 Verfahren B









7 Wiederholbarkeit





8 Bemerkungen





(10 m1 + m2) times 5

wobei











2 Prinzip


3 Reagenzien




34 Aceton




4 Geraumlte








5 Verfahren














m

wobei

m = Einwaage in g



7 Wiederholbarkeit




8 Bemerkungen











2 Prinzip


3 Reagenzien





















4 Geraumlte


5 Verfahren














7 Sonderverfahren




8 Bemerkungen







Beispiel





4 16610

= 664




Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Prinzip


3 Reagenzien















4 Geraumlte


5 Verfahren









7 Bemerkung





Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Prinzip




3 Reagenzien



(1) ABl L 125 vom 2351996 S 35






4 Geraumlte



5 Verfahren















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Wiederholbarkeit


7 Bemerkungen





mdash Zitrustrester






mdash Trockenhefe







2 Prinzip


3 Reagenzien


4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren







7 Bemerkungen










2 Prinzip



3 Reagenzien




4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren

51 Verfahren A



52 Verfahren B






7 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Calciumcarbonat


4 Geraumlte


5 Verfahren












X =V 100V1 2m

wobei


7 Bemerkungen









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Calciumcarbonat









4 Geraumlte







5 Verfahren















Wiederholbarkeit







2 Prinzip



3 Reagenzien





35 Diethylether

36 Aceton




4 Geraumlte


5 Verfahren










52 Titration






m

wobei



7 Bemerkungen





ANHANG IV






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol









4 Geraumlte

















5 Verfahren




52 Verseifung



53 Extraktion




















56 Kalibrierung



























w =500 c V2 1 000

V1 m[IEkg]

wobei


7 Bemerkungen













8 Wiederholbarkeit






ter

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mittelwert[IEkg]

1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070



VKr [ ] 30 35 41 81 38



VKR [ ] 80 62 86 15 20









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Geraumlte


















5 Verfahren




52 Verseifung


53 Extraktion














































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

wobei



7 Bemerkungen










8 Wiederholbarkeit





ter

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Mittelwert [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

VKr [ ] 22 38 27 41 38

SR mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

VKR [ ] 48 55 60 60 127












2 Prinzip


3 Reagenzien

Vorbemerkungen























4 Geraumlte




5 Verfahren (1)










Anmerkungen










Eisen

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kupfer

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfutter





7 Wiederholbarkeit






8 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat









38 Methanol

39 Silbernitrat

310 Natriumascorbat


312 Natriumchlorid
















4 Geraumlte

41 Ultraschallbad


43 Zentrifuge








5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion




53 Clean-up






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 10m

wobei




71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Ergebnisse











(1) The Analyst 108 1983 S 1252-1256

2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol




34 Molekularsieb















39 Standardsubstanz










4 Geraumlte

41 Glassaumlule









5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion



53 Reinigung





54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 200

m

wobei





71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit















2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Ammoniumacetat






























4 Geraumlte








46 Ultraschallbad

5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












280 nm








61 Futtermittel


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit









Probe 1A 100

Probe 2O 100

Probe 3L1

Probe 4Z1

Probe 5K1









9 Bemerkungen







2 Prinzip


3 Reagenzien























4 Geraumlte






5 Verfahren

51 Allgemeines






52 Extraktion






53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt





72 Wiederholbarkeit









Probe 1Vormi-schung

Huumlhnerfut-ter

Probe 2Vormi-




ter




ter B


5 050 16 200 765 784 929 483 326


Sollgehalt[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 S 2175-2180

ANHANG V





2 Prinzip


3 Reagenzien








4 Geraumlte



5 Verfahren

51 Einwaage





















=625


=600



Gossypol E 1 250

E 11cm p a

wobei


p = Einwaage in g













63 Wiederholbarkeit
































2 Hintergrund








(1) ABl L 221 vom 1782002 S 8
































71 Einfuumlhrung



S c r e e n i n g




































ANHANG VI





2 Empfindlichkeit


3 Prinzip


4 Reagenzien





42 Spuumllmittel

421 96 iger Alkohol

422 Aceton










45 Bleichmittel











6 Verfahren















































oder




oder

















ANHANG VII











Anzuwenden sind




ANHANG VIII


Wichtiger hinweis







2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Dichlormethan



















4 Geraumlte








5 Verfahren

51 Allgemeines




52 Extraktion













56 HPLC-Bestimmung

561 P a r ame t e r
















w =c 40m

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit
















2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol














4 Geraumlte

41 Ultraschallbad





5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion


53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












w =c 1000

m

wobei




71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit











9 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol



















4 Geraumlte






44 Ultraschallbad


5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














w =V c f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit














9 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol









37 Natriumacetat

















4 Geraumlte











47 Ultraschallbad

5 Verfahren


51 Allgemeines






52 Extraktion












53 Reinigung






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r











61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei




w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Tabelle 1




Sollgehalt [mgkg] 500 500 500 500 500 500

Tabelle 2



A B C D A B C


Sollgehalt [mgkg] 100 100 100 100 100 100 100



ANHANG IX





Artikel 3 mdash


Anhang Teil 3 mdash







Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash








Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Anhang Anhang I



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 mdash

Anhang Teil 2 mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang VII




Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Artikel 7 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Anhang Anhang VI


Artikel 7






Androulla VASSILIOU



ANHANG I

PROBENAHMEVERFAHREN











4 GERAumlTE








423 Probenteiler






5A2 Einzelproben


































5B2 Einzelproben









bis zu 1 t 1



mehr als 40 t 4



von 1 bis 16 1

17 bis 200 2

201 bis 800 3

mehr als 800 4







61 Allgemeines


62 Einzelproben





































ANHANG II



1 Zweck









3 Verfahren

































(1) ABl L 86 vom 641979 S 30








ANHANG III






2 Prinzip


3 Geraumlte







4 Verfahren


41 Vorbereitung









42 Trocknung









43 Vortrocknung




432 G e t r e i d e








m 100

wobei




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

wobei


53 Wiederholbarkeit


6 Bemerkung





2 Prinzip


3 Geraumlte






35 Analysenwaage

4 Verfahren








wobei



Wiederholbarkeit





2 Prinzip



3 Reagenzien

31 Kaliumsulfat



33 Zinkgranulat





















4 Geraumlte


5 Verfahren

51 Aufschluss





52 Destillation









53 Titration














54 Blindversuch







wobei






wobei





wobei




71 Wiederholbarkeit





72 Genauigkeit


8 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien







4 Geraumlte




5 Verfahren









7 Bemerkungen








2 Prinzip



3 Reagenzien






4 Geraumlte




5 Verfahren








Wiederholbarkeit




7 Bemerkung



CONWAY CELL

Scale 11





2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Magnesiumoxid





4 Geraumlte



5 Verfahren







Wiederholbarkeit








2 Prinzip






3 Reagenzien




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin




315 1-Octanol


316 Aminosaumluren





































4 Geraumlte






46 Zentrifuge






5 Verfahren

















































54 Chromatografie











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Mittelwerte in gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Wiederholbarkeit






010n = 17

011n = 17

026n = 13


011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15


mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


26n = 17

22n = 17

24n = 15





mdash 24n = 16

21n = 16


72 Vergleichbarkeit






030n = 17

023n = 17

030n = 13


034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15


mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15


mdash 69n = 16

67n = 16




9 Bemerkungen










2 Prinzip




3 Reagenzien





35 Natriumhydroxid
























318 Essigsaumlure





4 Geraumlte



43 pH-Meter







5 Verfahren













54 HPLC-Bestimmung












X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Wiederholbarkeit






von L-Tryptophan


























termittel(CRM 117)





(CRM 120)










9 Bemerkungen







B Methanol


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B





93 Bariumhydroxid













2 Prinzip

21 Verfahren A


22 Verfahren B


3 Reagenzien





4 Geraumlte




5 Verfahren





52 Verfahren B









7 Wiederholbarkeit





8 Bemerkungen





(10 m1 + m2) times 5

wobei











2 Prinzip


3 Reagenzien




34 Aceton




4 Geraumlte








5 Verfahren














m

wobei

m = Einwaage in g



7 Wiederholbarkeit




8 Bemerkungen











2 Prinzip


3 Reagenzien





















4 Geraumlte


5 Verfahren














7 Sonderverfahren




8 Bemerkungen







Beispiel





4 16610

= 664




Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Prinzip


3 Reagenzien















4 Geraumlte


5 Verfahren









7 Bemerkung





Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Prinzip




3 Reagenzien



(1) ABl L 125 vom 2351996 S 35






4 Geraumlte



5 Verfahren















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Wiederholbarkeit


7 Bemerkungen





mdash Zitrustrester






mdash Trockenhefe







2 Prinzip


3 Reagenzien


4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren







7 Bemerkungen










2 Prinzip



3 Reagenzien




4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren

51 Verfahren A



52 Verfahren B






7 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Calciumcarbonat


4 Geraumlte


5 Verfahren












X =V 100V1 2m

wobei


7 Bemerkungen









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Calciumcarbonat









4 Geraumlte







5 Verfahren















Wiederholbarkeit







2 Prinzip



3 Reagenzien





35 Diethylether

36 Aceton




4 Geraumlte


5 Verfahren










52 Titration






m

wobei



7 Bemerkungen





ANHANG IV






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol









4 Geraumlte

















5 Verfahren




52 Verseifung



53 Extraktion




















56 Kalibrierung



























w =500 c V2 1 000

V1 m[IEkg]

wobei


7 Bemerkungen













8 Wiederholbarkeit






ter

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mittelwert[IEkg]

1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070



VKr [ ] 30 35 41 81 38



VKR [ ] 80 62 86 15 20









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Geraumlte


















5 Verfahren




52 Verseifung


53 Extraktion














































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

wobei



7 Bemerkungen










8 Wiederholbarkeit





ter

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Mittelwert [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

VKr [ ] 22 38 27 41 38

SR mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

VKR [ ] 48 55 60 60 127












2 Prinzip


3 Reagenzien

Vorbemerkungen























4 Geraumlte




5 Verfahren (1)










Anmerkungen










Eisen

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kupfer

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfutter





7 Wiederholbarkeit






8 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat









38 Methanol

39 Silbernitrat

310 Natriumascorbat


312 Natriumchlorid
















4 Geraumlte

41 Ultraschallbad


43 Zentrifuge








5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion




53 Clean-up






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 10m

wobei




71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Ergebnisse











(1) The Analyst 108 1983 S 1252-1256

2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol




34 Molekularsieb















39 Standardsubstanz










4 Geraumlte

41 Glassaumlule









5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion



53 Reinigung





54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 200

m

wobei





71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit















2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Ammoniumacetat






























4 Geraumlte








46 Ultraschallbad

5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












280 nm








61 Futtermittel


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit









Probe 1A 100

Probe 2O 100

Probe 3L1

Probe 4Z1

Probe 5K1









9 Bemerkungen







2 Prinzip


3 Reagenzien























4 Geraumlte






5 Verfahren

51 Allgemeines






52 Extraktion






53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt





72 Wiederholbarkeit









Probe 1Vormi-schung

Huumlhnerfut-ter

Probe 2Vormi-




ter




ter B


5 050 16 200 765 784 929 483 326


Sollgehalt[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 S 2175-2180

ANHANG V





2 Prinzip


3 Reagenzien








4 Geraumlte



5 Verfahren

51 Einwaage





















=625


=600



Gossypol E 1 250

E 11cm p a

wobei


p = Einwaage in g













63 Wiederholbarkeit
































2 Hintergrund








(1) ABl L 221 vom 1782002 S 8
































71 Einfuumlhrung



S c r e e n i n g




































ANHANG VI





2 Empfindlichkeit


3 Prinzip


4 Reagenzien





42 Spuumllmittel

421 96 iger Alkohol

422 Aceton










45 Bleichmittel











6 Verfahren















































oder




oder

















ANHANG VII











Anzuwenden sind




ANHANG VIII


Wichtiger hinweis







2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Dichlormethan



















4 Geraumlte








5 Verfahren

51 Allgemeines




52 Extraktion













56 HPLC-Bestimmung

561 P a r ame t e r
















w =c 40m

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit
















2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol














4 Geraumlte

41 Ultraschallbad





5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion


53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












w =c 1000

m

wobei




71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit











9 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol



















4 Geraumlte






44 Ultraschallbad


5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














w =V c f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit














9 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol









37 Natriumacetat

















4 Geraumlte











47 Ultraschallbad

5 Verfahren


51 Allgemeines






52 Extraktion












53 Reinigung






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r











61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei




w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Tabelle 1




Sollgehalt [mgkg] 500 500 500 500 500 500

Tabelle 2



A B C D A B C


Sollgehalt [mgkg] 100 100 100 100 100 100 100



ANHANG IX





Artikel 3 mdash


Anhang Teil 3 mdash







Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash








Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Anhang Anhang I



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 mdash

Anhang Teil 2 mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang VII




Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Artikel 7 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Anhang Anhang VI


ANHANG I

PROBENAHMEVERFAHREN











4 GERAumlTE








423 Probenteiler






5A2 Einzelproben


































5B2 Einzelproben









bis zu 1 t 1



mehr als 40 t 4



von 1 bis 16 1

17 bis 200 2

201 bis 800 3

mehr als 800 4







61 Allgemeines


62 Einzelproben





































ANHANG II



1 Zweck









3 Verfahren

































(1) ABl L 86 vom 641979 S 30








ANHANG III






2 Prinzip


3 Geraumlte







4 Verfahren


41 Vorbereitung









42 Trocknung









43 Vortrocknung




432 G e t r e i d e








m 100

wobei




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

wobei


53 Wiederholbarkeit


6 Bemerkung





2 Prinzip


3 Geraumlte






35 Analysenwaage

4 Verfahren








wobei



Wiederholbarkeit





2 Prinzip



3 Reagenzien

31 Kaliumsulfat



33 Zinkgranulat





















4 Geraumlte


5 Verfahren

51 Aufschluss





52 Destillation









53 Titration














54 Blindversuch







wobei






wobei





wobei




71 Wiederholbarkeit





72 Genauigkeit


8 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien







4 Geraumlte




5 Verfahren









7 Bemerkungen








2 Prinzip



3 Reagenzien






4 Geraumlte




5 Verfahren








Wiederholbarkeit




7 Bemerkung



CONWAY CELL

Scale 11





2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Magnesiumoxid





4 Geraumlte



5 Verfahren







Wiederholbarkeit








2 Prinzip






3 Reagenzien




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin




315 1-Octanol


316 Aminosaumluren





































4 Geraumlte






46 Zentrifuge






5 Verfahren

















































54 Chromatografie











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Mittelwerte in gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Wiederholbarkeit






010n = 17

011n = 17

026n = 13


011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15


mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


26n = 17

22n = 17

24n = 15





mdash 24n = 16

21n = 16


72 Vergleichbarkeit






030n = 17

023n = 17

030n = 13


034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15


mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15


mdash 69n = 16

67n = 16




9 Bemerkungen










2 Prinzip




3 Reagenzien





35 Natriumhydroxid
























318 Essigsaumlure





4 Geraumlte



43 pH-Meter







5 Verfahren













54 HPLC-Bestimmung












X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Wiederholbarkeit






von L-Tryptophan


























termittel(CRM 117)





(CRM 120)










9 Bemerkungen







B Methanol


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B





93 Bariumhydroxid













2 Prinzip

21 Verfahren A


22 Verfahren B


3 Reagenzien





4 Geraumlte




5 Verfahren





52 Verfahren B









7 Wiederholbarkeit





8 Bemerkungen





(10 m1 + m2) times 5

wobei











2 Prinzip


3 Reagenzien




34 Aceton




4 Geraumlte








5 Verfahren














m

wobei

m = Einwaage in g



7 Wiederholbarkeit




8 Bemerkungen











2 Prinzip


3 Reagenzien





















4 Geraumlte


5 Verfahren














7 Sonderverfahren




8 Bemerkungen







Beispiel





4 16610

= 664




Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Prinzip


3 Reagenzien















4 Geraumlte


5 Verfahren









7 Bemerkung





Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Prinzip




3 Reagenzien



(1) ABl L 125 vom 2351996 S 35






4 Geraumlte



5 Verfahren















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Wiederholbarkeit


7 Bemerkungen





mdash Zitrustrester






mdash Trockenhefe







2 Prinzip


3 Reagenzien


4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren







7 Bemerkungen










2 Prinzip



3 Reagenzien




4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren

51 Verfahren A



52 Verfahren B






7 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Calciumcarbonat


4 Geraumlte


5 Verfahren












X =V 100V1 2m

wobei


7 Bemerkungen









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Calciumcarbonat









4 Geraumlte







5 Verfahren















Wiederholbarkeit







2 Prinzip



3 Reagenzien





35 Diethylether

36 Aceton




4 Geraumlte


5 Verfahren










52 Titration






m

wobei



7 Bemerkungen





ANHANG IV






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol









4 Geraumlte

















5 Verfahren




52 Verseifung



53 Extraktion




















56 Kalibrierung



























w =500 c V2 1 000

V1 m[IEkg]

wobei


7 Bemerkungen













8 Wiederholbarkeit






ter

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mittelwert[IEkg]

1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070



VKr [ ] 30 35 41 81 38



VKR [ ] 80 62 86 15 20









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Geraumlte


















5 Verfahren




52 Verseifung


53 Extraktion














































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

wobei



7 Bemerkungen










8 Wiederholbarkeit





ter

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Mittelwert [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

VKr [ ] 22 38 27 41 38

SR mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

VKR [ ] 48 55 60 60 127












2 Prinzip


3 Reagenzien

Vorbemerkungen























4 Geraumlte




5 Verfahren (1)










Anmerkungen










Eisen

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kupfer

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfutter





7 Wiederholbarkeit






8 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat









38 Methanol

39 Silbernitrat

310 Natriumascorbat


312 Natriumchlorid
















4 Geraumlte

41 Ultraschallbad


43 Zentrifuge








5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion




53 Clean-up






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 10m

wobei




71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Ergebnisse











(1) The Analyst 108 1983 S 1252-1256

2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol




34 Molekularsieb















39 Standardsubstanz










4 Geraumlte

41 Glassaumlule









5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion



53 Reinigung





54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 200

m

wobei





71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit















2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Ammoniumacetat






























4 Geraumlte








46 Ultraschallbad

5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












280 nm








61 Futtermittel


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit









Probe 1A 100

Probe 2O 100

Probe 3L1

Probe 4Z1

Probe 5K1









9 Bemerkungen







2 Prinzip


3 Reagenzien























4 Geraumlte






5 Verfahren

51 Allgemeines






52 Extraktion






53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt





72 Wiederholbarkeit









Probe 1Vormi-schung

Huumlhnerfut-ter

Probe 2Vormi-




ter




ter B


5 050 16 200 765 784 929 483 326


Sollgehalt[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 S 2175-2180

ANHANG V





2 Prinzip


3 Reagenzien








4 Geraumlte



5 Verfahren

51 Einwaage





















=625


=600



Gossypol E 1 250

E 11cm p a

wobei


p = Einwaage in g













63 Wiederholbarkeit
































2 Hintergrund








(1) ABl L 221 vom 1782002 S 8
































71 Einfuumlhrung



S c r e e n i n g




































ANHANG VI





2 Empfindlichkeit


3 Prinzip


4 Reagenzien





42 Spuumllmittel

421 96 iger Alkohol

422 Aceton










45 Bleichmittel











6 Verfahren















































oder




oder

















ANHANG VII











Anzuwenden sind




ANHANG VIII


Wichtiger hinweis







2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Dichlormethan



















4 Geraumlte








5 Verfahren

51 Allgemeines




52 Extraktion













56 HPLC-Bestimmung

561 P a r ame t e r
















w =c 40m

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit
















2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol














4 Geraumlte

41 Ultraschallbad





5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion


53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












w =c 1000

m

wobei




71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit











9 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol



















4 Geraumlte






44 Ultraschallbad


5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














w =V c f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit














9 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol









37 Natriumacetat

















4 Geraumlte











47 Ultraschallbad

5 Verfahren


51 Allgemeines






52 Extraktion












53 Reinigung






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r











61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei




w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Tabelle 1




Sollgehalt [mgkg] 500 500 500 500 500 500

Tabelle 2



A B C D A B C


Sollgehalt [mgkg] 100 100 100 100 100 100 100



ANHANG IX





Artikel 3 mdash


Anhang Teil 3 mdash







Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash








Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Anhang Anhang I



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 mdash

Anhang Teil 2 mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang VII




Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Artikel 7 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Anhang Anhang VI


5A2 Einzelproben


































5B2 Einzelproben









bis zu 1 t 1



mehr als 40 t 4



von 1 bis 16 1

17 bis 200 2

201 bis 800 3

mehr als 800 4







61 Allgemeines


62 Einzelproben





































ANHANG II



1 Zweck









3 Verfahren

































(1) ABl L 86 vom 641979 S 30








ANHANG III






2 Prinzip


3 Geraumlte







4 Verfahren


41 Vorbereitung









42 Trocknung









43 Vortrocknung




432 G e t r e i d e








m 100

wobei




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

wobei


53 Wiederholbarkeit


6 Bemerkung





2 Prinzip


3 Geraumlte






35 Analysenwaage

4 Verfahren








wobei



Wiederholbarkeit





2 Prinzip



3 Reagenzien

31 Kaliumsulfat



33 Zinkgranulat





















4 Geraumlte


5 Verfahren

51 Aufschluss





52 Destillation









53 Titration














54 Blindversuch







wobei






wobei





wobei




71 Wiederholbarkeit





72 Genauigkeit


8 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien







4 Geraumlte




5 Verfahren









7 Bemerkungen








2 Prinzip



3 Reagenzien






4 Geraumlte




5 Verfahren








Wiederholbarkeit




7 Bemerkung



CONWAY CELL

Scale 11





2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Magnesiumoxid





4 Geraumlte



5 Verfahren







Wiederholbarkeit








2 Prinzip






3 Reagenzien




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin




315 1-Octanol


316 Aminosaumluren





































4 Geraumlte






46 Zentrifuge






5 Verfahren

















































54 Chromatografie











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Mittelwerte in gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Wiederholbarkeit






010n = 17

011n = 17

026n = 13


011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15


mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


26n = 17

22n = 17

24n = 15





mdash 24n = 16

21n = 16


72 Vergleichbarkeit






030n = 17

023n = 17

030n = 13


034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15


mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15


mdash 69n = 16

67n = 16




9 Bemerkungen










2 Prinzip




3 Reagenzien





35 Natriumhydroxid
























318 Essigsaumlure





4 Geraumlte



43 pH-Meter







5 Verfahren













54 HPLC-Bestimmung












X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Wiederholbarkeit






von L-Tryptophan


























termittel(CRM 117)





(CRM 120)










9 Bemerkungen







B Methanol


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B





93 Bariumhydroxid













2 Prinzip

21 Verfahren A


22 Verfahren B


3 Reagenzien





4 Geraumlte




5 Verfahren





52 Verfahren B









7 Wiederholbarkeit





8 Bemerkungen





(10 m1 + m2) times 5

wobei











2 Prinzip


3 Reagenzien




34 Aceton




4 Geraumlte








5 Verfahren














m

wobei

m = Einwaage in g



7 Wiederholbarkeit




8 Bemerkungen











2 Prinzip


3 Reagenzien





















4 Geraumlte


5 Verfahren














7 Sonderverfahren




8 Bemerkungen







Beispiel





4 16610

= 664




Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Prinzip


3 Reagenzien















4 Geraumlte


5 Verfahren









7 Bemerkung





Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Prinzip




3 Reagenzien



(1) ABl L 125 vom 2351996 S 35






4 Geraumlte



5 Verfahren















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Wiederholbarkeit


7 Bemerkungen





mdash Zitrustrester






mdash Trockenhefe







2 Prinzip


3 Reagenzien


4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren







7 Bemerkungen










2 Prinzip



3 Reagenzien




4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren

51 Verfahren A



52 Verfahren B






7 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Calciumcarbonat


4 Geraumlte


5 Verfahren












X =V 100V1 2m

wobei


7 Bemerkungen









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Calciumcarbonat









4 Geraumlte







5 Verfahren















Wiederholbarkeit







2 Prinzip



3 Reagenzien





35 Diethylether

36 Aceton




4 Geraumlte


5 Verfahren










52 Titration






m

wobei



7 Bemerkungen





ANHANG IV






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol









4 Geraumlte

















5 Verfahren




52 Verseifung



53 Extraktion




















56 Kalibrierung



























w =500 c V2 1 000

V1 m[IEkg]

wobei


7 Bemerkungen













8 Wiederholbarkeit






ter

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mittelwert[IEkg]

1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070



VKr [ ] 30 35 41 81 38



VKR [ ] 80 62 86 15 20









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Geraumlte


















5 Verfahren




52 Verseifung


53 Extraktion














































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

wobei



7 Bemerkungen










8 Wiederholbarkeit





ter

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Mittelwert [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

VKr [ ] 22 38 27 41 38

SR mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

VKR [ ] 48 55 60 60 127












2 Prinzip


3 Reagenzien

Vorbemerkungen























4 Geraumlte




5 Verfahren (1)










Anmerkungen










Eisen

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kupfer

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfutter





7 Wiederholbarkeit






8 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat









38 Methanol

39 Silbernitrat

310 Natriumascorbat


312 Natriumchlorid
















4 Geraumlte

41 Ultraschallbad


43 Zentrifuge








5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion




53 Clean-up






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 10m

wobei




71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Ergebnisse











(1) The Analyst 108 1983 S 1252-1256

2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol




34 Molekularsieb















39 Standardsubstanz










4 Geraumlte

41 Glassaumlule









5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion



53 Reinigung





54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 200

m

wobei





71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit















2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Ammoniumacetat






























4 Geraumlte








46 Ultraschallbad

5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












280 nm








61 Futtermittel


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit









Probe 1A 100

Probe 2O 100

Probe 3L1

Probe 4Z1

Probe 5K1









9 Bemerkungen







2 Prinzip


3 Reagenzien























4 Geraumlte






5 Verfahren

51 Allgemeines






52 Extraktion






53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt





72 Wiederholbarkeit









Probe 1Vormi-schung

Huumlhnerfut-ter

Probe 2Vormi-




ter




ter B


5 050 16 200 765 784 929 483 326


Sollgehalt[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 S 2175-2180

ANHANG V





2 Prinzip


3 Reagenzien








4 Geraumlte



5 Verfahren

51 Einwaage





















=625


=600



Gossypol E 1 250

E 11cm p a

wobei


p = Einwaage in g













63 Wiederholbarkeit
































2 Hintergrund








(1) ABl L 221 vom 1782002 S 8
































71 Einfuumlhrung



S c r e e n i n g




































ANHANG VI





2 Empfindlichkeit


3 Prinzip


4 Reagenzien





42 Spuumllmittel

421 96 iger Alkohol

422 Aceton










45 Bleichmittel











6 Verfahren















































oder




oder

















ANHANG VII











Anzuwenden sind




ANHANG VIII


Wichtiger hinweis







2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Dichlormethan



















4 Geraumlte








5 Verfahren

51 Allgemeines




52 Extraktion













56 HPLC-Bestimmung

561 P a r ame t e r
















w =c 40m

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit
















2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol














4 Geraumlte

41 Ultraschallbad





5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion


53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












w =c 1000

m

wobei




71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit











9 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol



















4 Geraumlte






44 Ultraschallbad


5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














w =V c f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit














9 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol









37 Natriumacetat

















4 Geraumlte











47 Ultraschallbad

5 Verfahren


51 Allgemeines






52 Extraktion












53 Reinigung






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r











61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei




w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Tabelle 1




Sollgehalt [mgkg] 500 500 500 500 500 500

Tabelle 2



A B C D A B C


Sollgehalt [mgkg] 100 100 100 100 100 100 100



ANHANG IX





Artikel 3 mdash


Anhang Teil 3 mdash







Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash








Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Anhang Anhang I



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 mdash

Anhang Teil 2 mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang VII




Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Artikel 7 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Anhang Anhang VI







5B2 Einzelproben









bis zu 1 t 1



mehr als 40 t 4



von 1 bis 16 1

17 bis 200 2

201 bis 800 3

mehr als 800 4







61 Allgemeines


62 Einzelproben





































ANHANG II



1 Zweck









3 Verfahren

































(1) ABl L 86 vom 641979 S 30








ANHANG III






2 Prinzip


3 Geraumlte







4 Verfahren


41 Vorbereitung









42 Trocknung









43 Vortrocknung




432 G e t r e i d e








m 100

wobei




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

wobei


53 Wiederholbarkeit


6 Bemerkung





2 Prinzip


3 Geraumlte






35 Analysenwaage

4 Verfahren








wobei



Wiederholbarkeit





2 Prinzip



3 Reagenzien

31 Kaliumsulfat



33 Zinkgranulat





















4 Geraumlte


5 Verfahren

51 Aufschluss





52 Destillation









53 Titration














54 Blindversuch







wobei






wobei





wobei




71 Wiederholbarkeit





72 Genauigkeit


8 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien







4 Geraumlte




5 Verfahren









7 Bemerkungen








2 Prinzip



3 Reagenzien






4 Geraumlte




5 Verfahren








Wiederholbarkeit




7 Bemerkung



CONWAY CELL

Scale 11





2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Magnesiumoxid





4 Geraumlte



5 Verfahren







Wiederholbarkeit








2 Prinzip






3 Reagenzien




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin




315 1-Octanol


316 Aminosaumluren





































4 Geraumlte






46 Zentrifuge






5 Verfahren

















































54 Chromatografie











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Mittelwerte in gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Wiederholbarkeit






010n = 17

011n = 17

026n = 13


011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15


mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


26n = 17

22n = 17

24n = 15





mdash 24n = 16

21n = 16


72 Vergleichbarkeit






030n = 17

023n = 17

030n = 13


034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15


mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15


mdash 69n = 16

67n = 16




9 Bemerkungen










2 Prinzip




3 Reagenzien





35 Natriumhydroxid
























318 Essigsaumlure





4 Geraumlte



43 pH-Meter







5 Verfahren













54 HPLC-Bestimmung












X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Wiederholbarkeit






von L-Tryptophan


























termittel(CRM 117)





(CRM 120)










9 Bemerkungen







B Methanol


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B





93 Bariumhydroxid













2 Prinzip

21 Verfahren A


22 Verfahren B


3 Reagenzien





4 Geraumlte




5 Verfahren





52 Verfahren B









7 Wiederholbarkeit





8 Bemerkungen





(10 m1 + m2) times 5

wobei











2 Prinzip


3 Reagenzien




34 Aceton




4 Geraumlte








5 Verfahren














m

wobei

m = Einwaage in g



7 Wiederholbarkeit




8 Bemerkungen











2 Prinzip


3 Reagenzien





















4 Geraumlte


5 Verfahren














7 Sonderverfahren




8 Bemerkungen







Beispiel





4 16610

= 664




Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Prinzip


3 Reagenzien















4 Geraumlte


5 Verfahren









7 Bemerkung





Na2 S2 O3

01 moll


C6 H12 O6

LactoseC12 H22 O11

MaltoseC12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Prinzip




3 Reagenzien



(1) ABl L 125 vom 2351996 S 35






4 Geraumlte



5 Verfahren















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Wiederholbarkeit


7 Bemerkungen





mdash Zitrustrester






mdash Trockenhefe







2 Prinzip


3 Reagenzien


4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren







7 Bemerkungen










2 Prinzip



3 Reagenzien




4 Geraumlte

41 Heizplatte



5 Verfahren

51 Verfahren A



52 Verfahren B






7 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Calciumcarbonat


4 Geraumlte


5 Verfahren












X =V 100V1 2m

wobei


7 Bemerkungen









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Calciumcarbonat









4 Geraumlte







5 Verfahren















Wiederholbarkeit







2 Prinzip



3 Reagenzien





35 Diethylether

36 Aceton




4 Geraumlte


5 Verfahren










52 Titration






m

wobei



7 Bemerkungen





ANHANG IV






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol









4 Geraumlte

















5 Verfahren




52 Verseifung



53 Extraktion




















56 Kalibrierung



























w =500 c V2 1 000

V1 m[IEkg]

wobei


7 Bemerkungen













8 Wiederholbarkeit






ter

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Mittelwert[IEkg]

1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070



VKr [ ] 30 35 41 81 38



VKR [ ] 80 62 86 15 20









2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Geraumlte


















5 Verfahren




52 Verseifung


53 Extraktion














































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

wobei



7 Bemerkungen










8 Wiederholbarkeit





ter

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Mittelwert [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

VKr [ ] 22 38 27 41 38

SR mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

VKR [ ] 48 55 60 60 127












2 Prinzip


3 Reagenzien

Vorbemerkungen























4 Geraumlte




5 Verfahren (1)










Anmerkungen










Eisen

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kupfer

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfutter





7 Wiederholbarkeit






8 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat









38 Methanol

39 Silbernitrat

310 Natriumascorbat


312 Natriumchlorid
















4 Geraumlte

41 Ultraschallbad


43 Zentrifuge








5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion




53 Clean-up






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 10m

wobei




71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Ergebnisse











(1) The Analyst 108 1983 S 1252-1256

2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol




34 Molekularsieb















39 Standardsubstanz










4 Geraumlte

41 Glassaumlule









5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion



53 Reinigung





54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r















w =c 200

m

wobei





71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit















2 Prinzip


3 Reagenzien


32 Ammoniumacetat






























4 Geraumlte








46 Ultraschallbad

5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












280 nm








61 Futtermittel


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit









Probe 1A 100

Probe 2O 100

Probe 3L1

Probe 4Z1

Probe 5K1









9 Bemerkungen







2 Prinzip


3 Reagenzien























4 Geraumlte






5 Verfahren

51 Allgemeines






52 Extraktion






53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei


62 Vormischungen


w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt





72 Wiederholbarkeit









Probe 1Vormi-schung

Huumlhnerfut-ter

Probe 2Vormi-




ter




ter B


5 050 16 200 765 784 929 483 326


Sollgehalt[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 S 2175-2180

ANHANG V





2 Prinzip


3 Reagenzien








4 Geraumlte



5 Verfahren

51 Einwaage





















=625


=600



Gossypol E 1 250

E 11cm p a

wobei


p = Einwaage in g













63 Wiederholbarkeit
































2 Hintergrund








(1) ABl L 221 vom 1782002 S 8
































71 Einfuumlhrung



S c r e e n i n g




































ANHANG VI





2 Empfindlichkeit


3 Prinzip


4 Reagenzien





42 Spuumllmittel

421 96 iger Alkohol

422 Aceton










45 Bleichmittel











6 Verfahren















































oder




oder

















ANHANG VII











Anzuwenden sind




ANHANG VIII


Wichtiger hinweis







2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Dichlormethan



















4 Geraumlte








5 Verfahren

51 Allgemeines




52 Extraktion













56 HPLC-Bestimmung

561 P a r ame t e r
















w =c 40m

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit
















2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol














4 Geraumlte

41 Ultraschallbad





5 Verfahren


51 Allgemeines




52 Extraktion


53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r












w =c 1000

m

wobei




71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit











9 Bemerkung






2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol



















4 Geraumlte






44 Ultraschallbad


5 Verfahren

51 Allgemeines







52 Extraktion





53 HPLC-Bestimmung

531 P a r ame t e r














w =V c f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt











72 Wiederholbarkeit














9 Bemerkungen








2 Prinzip


3 Reagenzien

31 Methanol









37 Natriumacetat

















4 Geraumlte











47 Ultraschallbad

5 Verfahren


51 Allgemeines






52 Extraktion












53 Reinigung






54 HPLC-Bestimmung

541 P a r ame t e r











61 Futtermittel


w =c V1

m[mgkg]

wobei




w =c V2 f

m[mgkg]

wobei



71 Identitaumlt












72 Wiederholbarkeit






Tabelle 1




Sollgehalt [mgkg] 500 500 500 500 500 500

Tabelle 2



A B C D A B C


Sollgehalt [mgkg] 100 100 100 100 100 100 100



ANHANG IX





Artikel 3 mdash


Anhang Teil 3 mdash







Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash








Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Anhang Anhang I



Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Teil 1 mdash

Anhang Teil 2 mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 1 mdash

Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash

Anhang mdash




Artikel 3 mdash

Anhang Anhang VII




Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Artikel 7 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash





Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash






Artikel 3 mdash

Artikel 4 mdash

Artikel 5 mdash

Artikel 6 mdash

Anhang Anhang VI


verordnungen - eur-lex.europa.eu

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