øvelsesvejledning til almen velsesvejledning... · pdf file2. år blok 1...
TRANSCRIPT
2. år Blok 1
Øvelsesvejledning
til Almen Mikrobiologi
Lars H. Hansen, Bo Jensen,
Anders Priemé, Sten Struwe, Søren J. Sørensen
Afdeling for Mikrobiologi
Biologisk Institut
Københavns Universitet
2007
Almen Mikrobiologi 2007 Indholdsfortegnelse
INDHOLDSFORTEGNELSE
OVERSIGT OVER ØVELSER OG KOLLOKVIER ............................................................................ 4 GENERELLE SIKKERHEDSREGLER FOR DE STUDERENDES LABORATORIEARBEJDE........ 5
Første gang du er i et nyt laboratorium ..........................................................................................................5 Inden du begynder på et arbejde ...................................................................................................................5 Under laboratoriearbejdet...............................................................................................................................6 Efter endt laboratoriearbejde ..........................................................................................................................6 Uheld ved laboratoriearbejde .........................................................................................................................7 Generelle kommentarer..................................................................................................................................7
1. INTRODUKTION........................................................................................................................... 8 1.1. Substratfremstilling ..................................................................................................................................8 1.2. Inkubering og opbevaring af kulturer.......................................................................................................8 1.3. Steriliseringsmetoder...............................................................................................................................9
Tørsterilisering..........................................................................................................................................10 Autoklavering ............................................................................................................................................10 Dampsterilisering......................................................................................................................................10 Flambering og glødning............................................................................................................................11 Sterilfiltrering.............................................................................................................................................11
1.4. Basale teknikker ....................................................................................................................................12 Podning.....................................................................................................................................................12 Podning med podenål...............................................................................................................................12 Podning med pipette.................................................................................................................................12 Podning med sprøjte ................................................................................................................................13 Fortyndinger..............................................................................................................................................13
Fraktioneret udstrygning...............................................................................................................................13 Tælling af mikroorganismer ......................................................................................................................14 Pladespredning på agar ...........................................................................................................................14 Indstøbning i agar .....................................................................................................................................15 Tælling i tællekammer ..............................................................................................................................16
2. VÆKST AF MIKROORGANISMER ............................................................................................ 17 2.1 Vækst i væskekultur ...............................................................................................................................17
Øvelse 1: Vækstkurve ..............................................................................................................................17 2.2 Vækst på overflade.................................................................................................................................19
2
Almen Mikrobiologi 2007 Indholdsfortegnelse
Øvelse 2: Radiær udbredelse...................................................................................................................19 Selektive medier: ......................................................................................................................................19 Atamons indvirkning på svampevækst (Geotrichum candidum): .............................................................20
Øvelse 3: Bakterie-kimtal i hakket oksekød .................................................................................................22 Øvelse 4: Indvirkning af bakteriehæmmende behandlinger af hakket oksekød ..........................................23
3. IDENTIFIKATION AF MIKROORGANISMER............................................................................. 25 Øvelse 5: Identifikation af bakterier ..............................................................................................................25
Gram-farvning...........................................................................................................................................27 Katalase....................................................................................................................................................28 Cytochrom c oxidase ................................................................................................................................29 Oxidativ eller fermenterende glukoseomsætning.....................................................................................29
API identifikations kits...............................................................................................................................33 Identifikation af mikrosvampe.......................................................................................................................33
Skimmelsvampe .......................................................................................................................................34 Gærsvampe ..............................................................................................................................................35 Mugsvampe ..............................................................................................................................................35
Fremstilling af præparater af skimmelsvampe .........................................................................................35 Øvelse 6: Identifikation af mikrosvampe.......................................................................................................36
4. KVANTITATIVE BESKRIVELSER AF BAKTERIEPOPULATIONER I SPILDEVAND................ 37 Brug af indikatorbakterier .........................................................................................................................38 Decimal fortyndingsrække af spildevandet til alle øvelserne fra 7 til 12 ..................................................39
Øvelse 7: Antal koloniformende enheder (CFU) .........................................................................................39 Øvelse 8: Bestemmelse af totalt bakterietal ................................................................................................40 Øvelse 9: Påvisning af Clostridium perfringens (C. welchii).........................................................................41 Øvelse 10: Påvisning af fækale enterokokker ..............................................................................................43 Øvelse 11: Kvantitativ bestemmelse af coliforme bakterier .........................................................................44 Øvelse 12: Antibiotikaresistente bakterier i spildevand................................................................................48 Isolering af antibiotikaresistente bakterier fra spildevand ............................................................................48 Forekomst af multiresistens..........................................................................................................................50
SUBSTRATOPSKRIFTER.............................................................................................................. 52
3
Almen Mikrobiologi 2007 Oversigt over øvelser og kollokvier
OVERSIGT OVER ØVELSER OG KOLLOKVIER
Se særskilt dokument: "Øvelsesoversigt 2007"
4
Almen Mikrobiologi 2007 Generelle sikkerhedsregler
Generelle sikkerhedsregler for de studerendes laboratoriearbejde
Første gang du er i et nyt laboratorium
Orienter dig om, hvor sikkerhedsudstyr findes, og hvordan det anvendes.
Orienter dig om, hvilke flugtveje der er, og hvor de fører hen.
Inden du begynder på et arbejde
Overtøj må ikke medbringes i laboratorierne.
Er det nødvendigt at medbringe tasker, skal de placeres, så de ikke
generer nogen.
Der skal altid bæres kittel ved alt laboratoriearbejde. Kitlen bruges ikke
blot for at skåne dit almindelige tøj, men også for at beskytte dig mod
skadelige stoffer.
Kitlen skal være knappet foran og bør vaskes ofte, samt når man har
mistanke om, at der er kommet sundhedsskadelige stoffer på.
Du bør ikke gå til frokost i kittel.
Du skal bære briller ved alt farligt laboratoriearbejde, helst
laboratoriesikkerhedsbriller.
Anden ansigtsbeskyttelse kan være påkrævet.
Handsker bør kun bruges ved arbejde med
ætsende/sundhedsskadelige/smittefarlige stoffer. Handskerne tages af
ved endt arbejde og bør kun bruges så kort tid som muligt. Hvis der
spildes på handskerne kasseres disse straks.
Hvis du har langt hår: bind det op, så det ikke kan komme i roterende
maskiner eller antændes af en åben flamme, f.eks. en bunsenbrænder
(langt løsthængende hår er også uhensigtsmæssigt ved biologisk
laboratoriearbejde).
5
Almen Mikrobiologi 2007 Generelle sikkerhedsregler
Sørg for at få en ordentlig instruktion i brug af apparatur, inden du
begynder på arbejdet (læs øvelsesvejledningen grundigt).
Under laboratoriearbejdet
Du må ikke løbe/jage hverken i laboratoriet eller på gangene ved
laboratoriet. Mange ulykker kan undgås, hvis man tager det lidt med ro.
Al indtagelse af mad eller drikke samt tobaksrygning er forbudt i
laboratoriet. Slik i lommerne er således også uacceptabelt. Arbejde hvor
farlige flygtige stoffer kan dannes eller forekommer skal foregå i
stinkskab; der skal altid arbejdes med mindst mulig lugeåbning under
hensyntagen til det arbejde, der skal udføres. Det er især fordelagtigt, at
lugekanten er under ansigtshøjde, hvilket også beskytter mod stænk.
Ved afpipettering skal der anvendes gummibold eller anden forsvarlig
sugeanordning.
Hæld aldrig kemikalier tilbage i beholderen.
Tages kemikalier ud af stinkskabene, skal de opbevares i lukkede
beholdere, f.eks. tilproppede reagensglas.
Kemikalierester skal, hvad enten det er små eller store mængder,
opsamles efter de gældende forskrifter, der er ophængt i lokalet.
Kemikalieaffald må normalt ikke hældes i vasken, da afløbene i
stinkskabene såvel som fra andre vaske i laboratoriet er direkte forbundet
med det almindelige kloaksystem.
Efter endt laboratoriearbejde
Vis omtanke ved rengøring af glasapparatur; kan eventuelt foregå i
stinkskabene med sprit og vand for at undgå farlige dampe og lugtgener.
Den enkelte skal sørge for forsvarlig oprydning og rengøring af
arbejdspladsen, før laboratoriet forlades (kemikaliespild m.v. tørres op).
Før laboratoriet forlades, bør man vaske hænder, og kitlen skal tages af.
6
Almen Mikrobiologi 2007 Generelle sikkerhedsregler
Uheld ved laboratoriearbejde
Ved uheld tilkaldes hjælp så hurtigt som muligt. Brug din sunde fornuft.
Uheld, uanset størrelse og omfang, skal anmeldes (specielle blanketter) til
det pågældende instituts sikkerhedsgruppe.
Blanketter udleveres hos øvelsesvejlederen.
Generelle kommentarer
Vis samme hensyn over for andre, som du selv ønsker at blive genstand
for.
Stinkskabe er primært beregnet til at bortskaffe luftforurening ved
processer, der foregår inde i skabene - selv om de også medvirker til den
generelle fornyelse af laboratorieluften.
7
Almen Mikrobiologi 2007 Introduktion
1. INTRODUKTION
1.1. Substratfremstilling
Et næringsmedium til mikroorganismer skal indeholde alle de stoffer,
mikroorganismerne kræver for at kunne vokse. Foruden vand skal mediet
indeholde uorganiske mineralsalte, suppleret med kulstof-, energi- og
kvælstofkilde samt eventuelle vækststoffer. De fleste mikroorganismer
man dyrker med henblik på økologiske eller kliniske undersøgelser, er
heterotrofe og er i stand til at vokse på sammensatte (komplekse)
substrater. Der tilsættes som regel kødekstrakt, gærekstrakt, pepton
(oligo- og polypeptider), jordekstrakt eller vitaminopløsning.
Ved substratfremstillingen blandes ingredienserne, og pH indstilles på
den ønskede værdi, lettest med et pH-meter. pH justeres med 0,1 M
NaOH eller 0,1 M HCl. Mængden, der skal tilsættes, kan beregnes ved
først at indstille på 10 ml af substratet, eller justering foretages ved direkte
tildrypning til mediet under omrøring og kontinuert pH-måling.
De fleste substrater autoklaveres ved 121°C i 20 minutter og kan, hvis de
er tilstrækkeligt beskyttede mod fordampning og kontaminering,
opbevares lang tid – eventuelt i køleskab.
Substrater, der stivnes med agar, skal køles til ca. 45°C inden
ophældning i sterile plast-petriskåle. Rørglas med agarsubstrat kan efter
autoklavering anbringes skråt for at give en stor agaroverflade
(skråstivning).
1.2. Inkubering og opbevaring af kulturer
Inkubering af kulturer sker i thermostat indstillet på den ønskede
temperatur. Inkubationstiden er afhængig af mikroorganismens
væksthastighed og formålet med forsøget. Ved inkubering af petriskåle
ved temperaturer over 25°C skal disse anbringes med bunden opad, og
hvis inkubationen er langvarig, i plastikposer for ikke at tørre ud.
8
Almen Mikrobiologi 2007 Introduktion
Langtidsopbevaring af bakterie- og svampekulturer kan ske ved lav
temperatur (ca. 4°C), bedst på rørglas, overhældt med steril paraffinolie.
Andre langtidsopbevaringsmetoder er frysetørring, frysning i flydende
kvælstof eller opbevaring i 20% glycerol ved -80°C.
1.3. Steriliseringsmetoder
Et effektivt drab af mikroorganismer er paradoksalt nok en forudsætning
for et vellykket arbejde med renkulturer af mikroorganismer. I stedet for
"drab" og "udryddelse" anvendes det mindre dramatiske "sterilisation",
hvorved forstås en proces, hvor et givet materiale befris for levende
mikroorganismer eller deres hvilestadier. Når et sterilt materiale eller et
medie podet med definerede kulturer inficeres af andre mikroorganismer,
siger man, at det er blevet kontamineret. Begreberne "desinficeret",
"aseptisk" og "infektion" anvendes hovedsageligt i forbindelse med
medicin og hygiejne.
Mikroorganismer varierer stærkt i deres følsomhed overfor forskellige
sterilisationsmetoder. Udover artsforskelle har faktorer såsom
vandindhold, mediets pH, alderen af cellerne og tilstedeværelsen af
sporer betydning for følsomheden. Den decimale reduktionstid (D10)
nødvendig for at reducere en given mikrobiel population 90% under givne
omstændigheder anvendes hyppigt som mål for effektiviteten af en
behandling (se tabel).
Sporer fra Decimal reduktionstid (D10) i sekunder
ved våd varme
105° 120° 130° 140° 150° 160°
Bacillus cereus 12,1 4,2 2,6 1,3 1,0 0,7
Bacillus subtilis 27,8 4,5 3,1 2,1 1,1 0,5
Bacillus stearothermophilus 2857 38,6 8,8 3,9 2,4 1,4
Sterilisation kan opnås ved tør varme, våd varme, filtrering, kemiske
metoder eller bestråling.
9
Almen Mikrobiologi 2007 Introduktion
Tørsterilisering Alle tørre glasvarer (pipetter, kolber, etc.) steriliseres i en varmeovn ved
160°C i 2-3 timer. Den lange opholdstid er nødvendig for at sikre, at alle
bakteriesporer er dræbt. Til mikrobiologisk brug er det nødvendigt, at
sætte en lille tot vandskyende vat i enden af pipetterne. De steriliseres
enten indpakket i brunt papir, glas- eller metalrør. Kolber forsynes med
vat i mundingen og overbindes med papir eller staniol.
Autoklavering De fleste medier og substrater kan tåle autoklavering ved et overtryk på 1
atm., dvs. 121°C i 20 minutter. Autoklavering finder sted i en autoklave,
der kan være tilsluttet enten gas eller elektricitet. Der skal være destilleret
vand i bunden af autoklaven, og det er vigtigt, at dampen har drevet al
atmosfærisk luft ud, inden autoklaveringen begynder, fordi der ellers ikke
opnås en tilstrækkelig høj temperatur. Medier og substrater autoklaveres
som regel i rørglas, kolber eller infusionsflasker, der er forsynet med
vandskyende vat overbundet med papir eller løstsiddende skruelåg. Hvis
substratet er tilsat agar, må kolben højst være 3/4 fyldt, da substratet
ellers stødkoger (koger over).
Autoklavering kan også benyttes til at sterilisere glasvarer og instrumenter
samt til at sterilisere kontamineret materiale før opvask.
Sukkerholdige substrater skal autoklaveres ved temperaturer under
110°C for at hindre karamellisering, evt. tilsættes sukker sterilt efter
autoklavering.
Dampsterilisering Hvis mediet eller substratet ikke kan tåle mere end 100°C, kan der
foretages en dampsterilisation i autoklaven (åben ventil) i 90 minutter,
eller hvis absolut sterilisation er påkrævet gentages processen 3 dage i
træk i 30 minutter (kochning). Dette skulle sikre, at alle bakteriesporer er
spiret og dernæst dræbt.
10
Almen Mikrobiologi 2007 Introduktion
Flambering og glødning Podenåle og andre metalinstrumenter, der kan tåle høje temperaturer,
skal glødes i en bunsenbrænder inden brug. Skalpeller, spatler o.a., der
ikke kan tåle at blive glødet, skal dyppes i alkohol (96%) og flamberes.
Sterilfiltrering Membranfiltrering benyttes til sterilisering af væsker, men også til
opsamling af bakterier i vand- og jordprøver med henblik på tælling, især
hvis antallet af kim er ringe, og en koncentrering er nødvendig.
Et membranfilter er en tynd polymér-membran, der fås med porestørrelser
fra 0,025 μm til 15 μm, og de mest anvendte typer er af celluloseacetat og
cellulosenitrat fra Sartorius, Millipore og Gelman.
Filterholderen og sugeflasken skal være steriliserede inden brugen
(autoklaveret i indpakket stand). Det sterile filter anbringes, tragten
monteres ovenpå, og suget tilsluttes. Prøven hældes i, suges igennem
filtret, og der skylles efter med vand (eller PBS-opløsning).
11
Almen Mikrobiologi 2007 Basale teknikker
1.4. Basale teknikker
Podning Podning af bakterier og svampe foretages almindeligvis med podenål,
pipette eller sprøjte.
Podning med podenål Stregkultur: Podenålen køles efter udglødning i randen af agaren eller i en
flydende kultur. Med en glødet podenål (med øje eller vinkelbøjet) ridses
forsigtigt i overfladen af agar i en skål eller skråstivnet agar i et rør.
Stikkultur: Med en glødet podenål (lige) podes i et rør med agar fra
toppen til bunden.
Podenål kan også benyttes til at overføre podemateriale til både faste og
flydende substrater.
Podning med pipette Pipetter benyttes til overførsel af mikroorganismer fra flydende medier
eller vandprøver til faste substrater eller medier. Hvis mængden, der skal
overføres, blot er nogle dråber eller et ubestemt kvantum, benyttes
finpipetter. Til afmåling af bestemte mængder, f.eks. ved fortynding og
pladespredning, anvendes graduerede stangpipetter eller finpipetter.
Fuldpipetter kan anvendes (1-50 ml), hvis man ikke har brug for
graduering.
Podning skal foregå i så sterile omgivelser som muligt, helst i poderum
eller sterilbænk. Mundinger på rør og kolber flamberes i en gasflamme,
efter at vatproppen er taget af. Glasvarerne holdes med den ene hånd,
mens vatproppen tages ud og holdes med den anden hånds lillefinger,
således at podenål eller pipette kan bruges af de frie fingre. Før
påsætning af proppen flamberes mundingen af glasset igen.
12
Almen Mikrobiologi 2007 Basale teknikker
Podning med sprøjte Anaerobe bakteriekulturer, er som oftest ekstremt følsomme overfor ilt,
podes mest hensigtsmæssigt med sterile éngangssprøjter forsynet med
en tynd kanyle. Før podningen gasses sprøjten omhyggeligt med steril
kvælstof for at sikre anaerobitet.
Fortyndinger Det vil som regel være nødvendigt at fortynde den vandprøve eller
jordsuspension, der skal undersøges for mikroorganismer, inden podning
foretages. Dette foregår ved, at der laves en serie decimale fortyndinger
efter følgende procedure:
Fortyndingerne udføres med sterile 1 ml pipetter og pipetteskift eller med
finpipetter og skift af pipettespids, og blanding af prøven for hver
fortynding. Som fortyndingsmedium benyttes PBS-opløsning.
Fraktioneret udstrygning
Denne teknik benyttes, når man ønsker en separation af
mikroorganismerne i en blandet prøve eller forskellige stammer i en
renkultur.
Udstrygningen foretages med en podenål på en agaroverflade, der skal
være helt tør. Dette opnås ved at tørre skålen uden låg i en sterilbænk.
Først podes nær kanten af skålen, dernæst steriliseres podenålen i en
flamme, køles, og der udstryges fra podematerialet. Således fortsættes
13
Almen Mikrobiologi 2007 Basale teknikker
flere gange skålen rundt, som ovenstående tegning angiver. Der skulle
derved blive mulighed for at opnå enkeltliggende kolonier, hvorfra der kan
isoleres videre.
Tælling af mikroorganismer
Pladespredning på agar Pladespredningsmetoden kan benyttes til svampe- og bakterietællinger.
Det er en indirekte metode, hvor man tæller de "kim", der kan vokse frem
til kolonier på det benyttede substrat.
Inden pladespredningen skal der normalt laves decimale fortyndinger af
prøven. Fra passende fortyndinger af udgangsmaterialet afpipetteres 0,1
ml på skåle med substrat. Dråben spredes på agaroverfladen med en
drigalskispatel. Skålene inkuberes ved ønsket temperatur, indtil
kolonierne er vokset frem.
Optælling foregår nemmest på bagsiden af skålene ved at markere hver
talt koloni med en speedmarker. Tælles svampekolonier, må der højst
være 25; tælles bakterier må der højst være 50-200 kolonier på hver skål.
Hvis en svampe- eller bakteriekoloni dækker mere end en fjerdedel af
skålen, skal denne kasseres. Antal CFU (colony forming units) pr. g eller
ml prøve beregnes ved at gange antallet af kolonier på skålene med
14
Almen Mikrobiologi 2007 Basale teknikker
fortyndingen og yderligere x 10, da der kun er spredt 0,1 ml på hver
plade.
Indstøbning i agar Indstøbningsmetoden benyttes hovedsageligt til bakterie-tællinger. På en
pladespredningsskål kan kolonierne undertiden være svære at adskille
ved tælling. Endvidere kan mange mikroorganismers selvbevægelighed
medføre, at kolonier breder sig hurtigt over en fugtig agaroverflade. En
bedre adskillelse opnås derfor ofte ved at indstøbe prøven i agar.
Substratet autoklaveres i rør med 20 ml i hver og nedkøles i vandbad til
45-50°C inden podningen. Fra decimale fortyndinger podes 0,1 ml i rør af
15
Almen Mikrobiologi 2007 Basale teknikker
hver fortynding. Rørene rulles mellem hænderne, og indholdet hældes i
skåle med et tyndt lag agar i bunden. Blanding kan også ske ved, at 0,1-1
ml af fortyndingerne afpipetteres i bunden af tomme skåle eller skåle med
et tyndt lag agar, og det smeltede, nedkølede substrat hældes over.
Dernæst roteres pladerne for at sikre fuldstændig opblanding.
Optælling som ved pladespredning.
Tælling i tællekammer Der findes forskellige typer tællekamre. Alle har imidlertid det til fælles, at
de har et kvadratnet indridset i glasset. Længden af siderne i dette net og
dybden af kammeret er kendt.
Inden brugen skal tællekammeret renses i alkohol og tørres. En dråbe af
den suspension, der skal undersøges, anbringes på kvadratnettet og
dækglasset lægges på eller klemmes fast afhængigt af typen. Under
mikroskop tælles 10 tilfældige felter. Tællingen gentages med en ny dråbe
efter at tællekammeret er renset. Middeltallet pr. kvadrat udregnes (celler
på selve linierne tælles kun på de to af siderne).
Følgende er et regneeksempel med en bestemt type cellekammer: Hvert
lille felt har et areal på 0,0025 mm2. Dybden i kammeret er 0,1 mm. Hvis
man antager, at hvert lille kvadrat i gennemsnit indeholder 8 celler, dvs. 8
celler i et volumen på 0,0025 mm2 x 0,1 mm. (1 ml udgør 1000 mm3).
Pr. ml suspension findes:
1000 x 8/0,00025 = 3,2 x 107 celler /ml
16
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
2. VÆKST AF MIKROORGANISMER
Øvelserne skal vise, hvorledes mikroorganismer vokser i væskekultur og
på overflader. Forskelle på vækst af encellede og flercellede
mikroorganismer belyses og de generelle vækstbegreber gennemgås.
2.1 Vækst i væskekultur
Øvelse 1: Vækstkurve
Vækst i væskekulturer kan for de fleste mikroorganismer simpelt måles ved at følge stigningen i populationens optiske densitet (O.D.) ved en given bølgelængde. Formålet med øvelsen er at bestemme den specifikke væksthastighed af en mikroorganisme, der vokser under omrøring i en kolbe, samt at iagttage de forskellige vækstfaser i denne dyrkning.
Fremgangsmåde
Som testorganisme anvendes bakterien Pseudomonas putida (uwc 1), og væksten måles ved optisk densitet (O.D.) på et spektrofotometer. Vandbadene er indstillet til forskellige temperaturer. Vælg et vandbad til hele øvelsen og noter temperaturen. En Erlenmeyerkolbe med sterilt vækstmedium podes fra forkulturer med
steril pipette (1 ml). Kolben mærkes med holdnummer. Podetidspunktet
17
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
noteres, kolben omrøres, og der udtages en prøve (1 ml) med steril
pipette. Kolben anbringes straks i det valgte rystevandbad, og prøven
overføres til en kuvette. Prøvens O.D. aflæses umiddelbart i
spektrofotometer ved 450 nm overfor vand (alle hold) samt overfor en af
følgende bølgelængder 350, 550 eller 650 nm (husk at bruge de samme
to bølgelængder hver gang samt i begge tilfælde at nulstille overfor
vand).
Efter 15 minutter udtages den næste prøve, som aflæses i spektrofotometer. Derefter udtages prøverne hvert 15 minut på samme måde. I rapporten afsættes O.D. som funktion af tiden på semilogaritmisk papir (husk at notere bølgelængderne).
Bakterie: Pseudomonas putida (uwc 1),
OD 450 nm
Valgfri bølgelængde
OD nm
18
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
2.2 Vækst på overflade
Øvelse 2: Radiær udbredelse Formålet med denne øvelse er at demonstrere, hvorledes bakterier og
skimmelsvampe vokser på et fast substrat med/uden antibiotika (både
nystatin eller penicillin+ streptomycin) samt at teste effekten af
svampehæmningsmidlet atamon i forskellige koncentrationer og ved
forskellig pH. Den anvendte metodik bruges ofte til biologisk bestemmelse
af visse stoffers koncentration.
Fremgangsmåde
Selektive medier: Der anvendes en svamp Geotrichum candidum og en bakterie
Pseudomonas putida.
Arbejdet foregår så sterilt som muligt. Pladerne (hhv. svampe og bakterie)
podes vha. en podenål. Lågene på petriskålene må kun lettes lidt, ikke
fjernes helt, når der podes; podenålen glødes inden og mellem hver
podning. Hvert hold poder 2 kontrolplader (uden hæmmer), en for hver af
de to mikroorganismer, samt 4 plader, en af henholdsvis nystatin og
penicillin+streptomycin for hver organisme. Podningen foregår ved med
podenålen at afsætte en lille "prik" midt i petriskålene.
Skålene inkuberes ved 30ºC. Den følgende laboratoriedag måles
diameteren af hver koloni med en lineal.
19
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
Sammenligning af vækst på plader: Skimmelsvamp: Geotrichum candidum..................
Tid (i timer) Kr
Radius af koloni (μm) kontrol
+ nystatin
+penicillin+streptomycin
Bakterie: Pseudomonas putida
Tid (i timer) Kr
Radius af koloni (μm) kontrol
+nystatin
+penicillin+streptomycin
Koloniens radiære væksthastighed (Kr) er defineret som:
Kr = ΔR/ΔT
hvor ΔR er ændringen i koloniens radius i tidsrummet ΔT. Beregn den radiære væksthastighed i μm/time for kontrollerne. Bakteriekoloni .................. μm/time Svampekoloni .................... μm/time
Atamons indvirkning på svampevækst (Geotrichum candidum):
Arbejdet foregår så sterilt som muligt. Pladerne med atamon podes vha.
en podenål. Lågene på petriskålene må kun lettes lidt, ikke fjernes helt,
når der podes; podenålen glødes inden og mellem hver podning. Podning
foregår ved med podenålen at afsætte en lille “prik” midt i petriskålene.
20
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
Der podes 6 plader, en af hver af følgende atamon-koncentrationer: 0%,
0.05%, 0.1%, 0,2%, 0.4%, 0.8% (vægt/volumen) og med ukendt
koncentration. pH i disse plader er indstillet til 5,5. Ved atamon-
koncentrationerne 0 og 0,05% skal der endvidere podes plader med pH
4,5 og med pH 6,5.
Alle skålene inkuberes ved 30°C. De følgende laboratoriedage måles
diameteren af hver koloni med en lineal. Idet forsøget skal foregå ved
konstant temperatur, må pladerne ikke anbringes på laboratoriebordet i
længere tid.
Atamon konc. kontrol 0.05% 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% ukendt
Måledag 1
koloniradius (μm)
Måledag 2
koloniradius (μm)
Atamon konc. kontrol 0.05% 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% ukendt
Kr (μm/time)
pH 4.5
atamon
pH 6.5
atamon
med(0.05%) uden med(0.05%) uden
Måledag 1
Måledag 2
radiær væksthastighed
PH i plader 4.5
med
4.5
uden
5.5
med
5.5
uden
6.5
med
6.5
uden
Kr
(μm/ time)
Atamon koncentration i den ukendte plade: ………….%
21
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
2.3 Bestemmelse af bakterie-kimtal i hakket oksekød
Formålet med denne øvelse er at introducere sterile arbejdsteknikker
samt at undersøge udviklingen i bakterieantallet i hakket oksekød
opbevaret ved køleskabstemperatur og stuetemperatur.
Øvelse 3: Bakterie-kimtal i hakket oksekød
Protokollen til bestemmelse af bakterieantallet i hakket oksekød følger
principperne i Dansk Standard for bestemmelse af kimtal i hakket
oksekød.
Ved forsøgets start er 500 g hakket oksekød blevet blandet ved at ælte
kødet grundigt i to minutter. Kødet deles i to halvdele, som pakkes i
plastikfolie. Den ene halvdel placeres i køleskab ved 4 °C, mens den
anden halvdel placeres ved stuetemperatur.
Umiddelbart før øvelsens start har lærerstaben udtaget en prøve fra det
opbevarede kød og har homogeniseret 10 g hakket oksekød i 100 ml PBS
i 10 minutter på rystebord ved maksimal hasighed.
Hvert småhold får udleveret en homogeniseret portion hakket oksekød,
som har været opbevaret i enten 0, 1, 2 eller 4 dage ved en af de to
temperaturer og laver en fortyndingsrække i PBS:
Dag 0: til 10-5
Dag 1, 2 og 4: til 10-7
Husk at den udleverede prøve repræsenterer en 10-1 fortynding!
Fra følgende fortyndinger:
Dag 0: 10-4 til 10-5
Dag 1, 2 og 4: 10-6 til 10-7
pladespredes 0,1 ml på en petriskål med Plate Count Agar (PCA) med
cycloheximid (cycloheximid hæmmer svampevækst). Lav tre replikater af
hver pladespredning.
Podematerialet fordeles med en steril Drigalski spatel.
22
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
Pladerne mærkes med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 °C i
to døgn inden tælling af kolonier (Dansk Standard foreskriver fem døgns
inkubation, men det harmonerer ikke med dette øvelsesforløb, så vi nøjes
med inkubation i to døgn – vores erfaring er, at stort set alle CFU er
synlige efter to døgn).
Ved afslutningen af det praktiske arbejde, og når I forlader laboratoriet
skal I altid vaske hænder. Brug sæbe og vask grundigt. Husk at vaske
håndleddene.
Test af effekten af håndvask: Hver person inddeler en petriskål med Plate Count Agar i fire lige store
dele med en tusch:
Område 1) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger INDEN
håndvask.
Område 2) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER
håndvask, men INDEN tørring i håndklæde.
Område 3) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER tørring i
håndklæde.
Område 4) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER vask
med 70% etanol og afdampning af denne, men INDEN tørring i
håndklæde.
Pladen mærkes med navn og holdnummer med tusch på låget og stilles til
inkubation ved 25 °C i to døgn inden tælling af kolonier.
Øvelse 4: Indvirkning af bakteriehæmmende behandlinger af hakket oksekød
Til denne øvelse benytter samtlige småhold hakket oksekød opbevaret
ved 4 °C i fire døgn.
23
Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer
10 g hakket oksekød i 100 ml PBS, A) autoklaveres i 20 minutter; B)
pasteuriseres under omrøring, så kødet opnår 71 °C i 15 sek; eller C)
koges i 2 minutter.
Hver gruppe får udleveret en af ovenstående prøver og laver følgende
fortyndingsrække ud fra den udleverede prøve ( som er10-1):
A) Autoklavering: til 10-1 (anvendes ufortyndet)
B) Pasteurisering: til 10-2 (fortyndes 10 gange)
C) Kogning: til 10-2 (fortyndes ti gange)
hvorfra der pladespredes 0,1 ml på en petriskål med PCA med
cycloheximid. Lav en plade af hver fortynding. Podematerialet fordeles
med en steril Drigalski spatel.
Pladerne mærkes med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 °C i
to døgn inden tælling af kolonier.
Test af steril teknik Hvert småhold får udleveret en prøve med sterilt vand og laver
fortyndingsrække til 10-4 i PBS. Der pladespredes 0,1 ml af 10-4
fortyndingen på en petriskål med PCA med cycloheximid (der laves kun
en plade).
Efter 7 dage checkes for vækst på pladen.
24
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
3. IDENTIFIKATION AF MIKROORGANISMER
Øvelse 5: Identifikation af bakterier
Der er mange grunde til at beskæftige sig med identifikation af bakterier
f.eks. i klinikken, i levnedsmiddelkontrol, i vandhygiejne og i økologiske
undersøgelser. I de fleste forsøg på identifikation indsnævrer man
overvejelserne til kun at omfatte et begrænset udvalg af samtlige
forekommende bakterier, og praksis viser, at det til mange formål er
tilstrækkeligt. Hvis man derimod begynder helt forfra med en ukendt
bakterie (svarende til brug af identifikationsnøgler for andre organismer) er
begyndelsen på identifikationsprocessen vanskelig.
Der findes mange måder at indlede en identifikation på, og på grund af
den store praktiske interesse er der også udviklet flere kommercielle
identifikationssystemer f.eks. API systemet (www.biomerieux.com) og
BIOLOG (www.biolog.com). Disse identifikationssystemer bygger på
bakteriernes fysiologiske egenskaber, og enten skal bakterierne vokse i
substraterne og omsætte dem, eller også skal allerede dannede enzymer
reagere med substraterne. Mange af de benyttede substrater er stærkt
selektive og tillader kun visse bakteriers vækst. Dette princip benyttes især
til påvisning af bestemte bakterier i blandede prøver (se 1.3 & 1.4).
Udover bakteriernes forskellige fysiologiske egenskaber benyttes også
enkelte morfologiske karakterer til at "adskille" bakterier. I det nedenfor
beskrevne enkle system, der bygger på Cowan et al. (1993) Cowan &
Steel´s Manual for the Identification of Medical Bacteria, indgår celleform,
sporedannelse og bevægelighed således som overordnede kriterier
sammen med cellens omsætning af glucose og vækst under aerobe og
anaerobe forhold.
Hvis man ikke kan identificere en bakterie, kan man mod behørig betaling
få den identificeret hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (www.dsmz.de), som har stor ekspertise i
bakterieidentifikation og besidder det nødvendige appatur.
25
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Isolering og rendyrkning Det er meget vigtigt, at de bakterieisolater, man vil identificere, er rene og
altså ikke blandinger af forskellige bakteriestammer. Det kan være svært
at sikre sig dette, men gentagen udstrygning på forskellige substrater med
efterfølgende opformering fra enkeltkolonier er en nødvendig
sikkerhedsforanstaltning.
Den mest benyttede metode til at isolere bakterier fra blandede prøver er
brug af agarsubstrater med forskellige kulstofkilder - og inkubering under
aerobe forhold. Allerede herved har man afskåret sig fra at isolere en
række bakterier, hvoraf mange er hyppigt forekommende og vigtige i
naturen.
De anaerobe og fototrofe bakterier er udelukkede, de kemolithoautotrofe
vokser ikke, og selv heterotrofe bakterier med lav væksthastighed vokser
ikke frem på de sædvanlige medier. Det vil derfor kun være et udvalg af
hurtigtvoksende, heterotrofe bakterier der normalt isoleres, og det er disse
bakterier, der bliver lagt vægt på i det følgende.
Primær karakterisering Til den primære karakterisering af bakterier med henblik på identifikation
benyttes følgende egenskaber i Cowan et al.´s skemaer:
Cellemorfologi: Gramfarvningsreaktion
Celleform og arrangement
Bevægelighed
Sporedannelse
Fysiologi: Katalase
Cytochrom-oxidase
Oxidation-fermentation
26
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Med disse oplysninger er det muligt at identificere en lang række
almindelige bakterier til gruppe eller slægt efter de indledende skemaer for
Gram-positive og Gram-negative bakterier.
I denne øvelse skal hvert småhold identificere to ukendte isolater på
grundlag af ovennævnte morfologiske og fysiologiske karakteristika.
Bakteriekulturerne udleveres på agarplader mærket med en kode.
Første trin i identifikationsprocessen er at fremstille friske præparater til
vurdering af bakteriernes eventuelle bevægelighed og sporedannelse.
Gram-farvning og testene til bestemmelse af fysiologiske egenskaber
udføres som beskrevet i de efterfølgende afsnit. Resultaterne indføres i
skemaet, hvorefter det skulle være muligt at bestemme de to ukendte
isolaters slægt.
Gram-farvning Gram-farvning er den klassiske indledende test, som benyttes til inddeling
af bakterier i to hovedgrupper af vidt forskellig fysiologisk karakter.
Cellevæggen hos Gram-positive bakterier består af flere murein-lag, og
det formodes, at der under farvningen sker en dehydrering, så
farvekomplekset bindes i cellevæggen. De Gram-negative bakterier
indeholder derimod kun ét murein-lag, men en stor del lipider. Under
farvningen opløses lipiderne i alkohol, cellevæggen bliver porøs og
farvekomplekset udvaskes. For tydeligere at kunne se de nu farveløse
Gram-negative celler, foretages til sidst en farvning med en kontrastfarve -
erythrosin. Ved undersøgelse i mikroskopet vil de Gram-positive bakterier
være mørkviolette (blå), mens de Gram-negative bakterier på grund af
kontrastfarvningen er lys pink (rød).
Gram-reaktionen kan ændres med cellens fysiologiske tilstand. Kun unge
bakteriekulturer bør derfor benyttes til Gram-farvning. Metoden kræver en
vis standardisering, det er derfor vigtigt at overholde tidsangivelserne.
27
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Fremgangsmåde 1. En dråbe frisk bakteriekultur udstryges på et affedtet objektglas (sørg
for at udstryge nok bakterier på glasset). Objektglasset mærkes med
blyant, idet den senere affarvning i etanol fjerner tusch.
2. Objektglasset lufttørres under lampe og flammefikseres. Objektglasset
skal være helt tørt inden flammefikseringen.
3. Objektglasset nedsænkes i krystalviolet-opløsning (opl. 1) i 1 min.
4. Præparatet skylles herefter med vand i 3-4 sekunder.
5. Præparatet henstår i jodopløsningen (opl. 2) i 1 min.
6. Affarvning med 96% etanol (opl. 3) (der skylles med flere hold, indtil
der ikke fjernes mere farve).
7. Afskylning med vand.
8. Kontrastfarvning med erythrosin-opløsning i 2 min. (opl. 4).
9. Præparatet skylles i vand, afdryppes og tørres. Det er herefter klar til
mikroskopering.
Gram-præparaterne undersøges i mikroskop og både celleform og
resultatet af Gram-farvningsreaktionen noteres.
Katalase Katalase er et enzym, der dannes af obligat aerobe og fakultativt
anaerobe bakterier, mens det ikke dannes af mikroaerofile og obligat
anaerobe bakterier. Katalase omsætter brintoverilte (H2O2), der dannes
ved flavoproteiners elektronoverførsel til O2, til H2O og O2. Mikroaerofile
bakterier har i stedet en peroxidase, der oxiderer organiske forbindelser
med H2O2.
Blandt aerobt voksende bakterier er mælkesyrebakterierne den eneste
katalase-negative gruppe.
Som eksempler kan nævnes:
K+ : Micrococcus, Staphylococcus, Propionibacterium, enterobakterier,
Bacillus.
K- : Mælkesyrebakterier (f.eks. Streptococcus), Clostridium.
28
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Fremgangsmåde Katalase-testen udføres ved direkte på kolonier på agarpladen at tilsætte
en dråbe 3% H2O2-opløsning. Ved positiv reaktion ses luftudvikling (O2) i
form af bobler eller skum. Selv svage bobler registreres som positiv
reaktion.
Cytochrom c oxidase
Alle obligat aerobe og fakultativt anaerobe bakterier er i besiddelse af
cytochrom-oxidaser og -reduktaser. Visse af disse bakterier har cytochrom
c oxidase, som også er i stand til at oxidere den kunstige elektrondonor
N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylen-diamin-dihydrochlorid, der ved oxidation
skifter fra farveløs til blå. Da de fleste aerobe Gram-positive bakterier
mangler cytochrom c oxidase, har testen kun praktisk betydning ved
identifikation af aerobe Gram-negative bakterier.
Som eksempler kan nævnes:
O+ : Pseudomonas, Aeromonas, Acetobacter, Vibrio.
O- : Enterobakterier, f.eks. Escherichia coli.
Fremgangsmåde Med en podenål udstryges en koloni på en strip med N,N,N,N-tetramethyl-
p-phenyl-diamin-dihydrochlorid. Ved positiv reaktion ses en blåfarvning i
løbet af 10 sek. Sværtning efter 30 sekunder eller mere regnes for negativ
reaktion.
Oxidativ eller fermenterende glukoseomsætning
Bakteriernes kulhydratomsætning foregår enten respiratorisk (aerobt) eller
fermenterende (anaerobt). Denne forskel kan undersøges ved at pode
bakterien i Hugh & Leifsons medium, hvor glukose (i høj koncentration) er
kulstofkilden. Peptonindholdet skal derimod være lavt for at modvirke, at
basiske produkter (NH3) fra peptonnedbrydningen neutraliserer den
29
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
dannede syre fra kulhydratnedbrydningen (specielt den svage
syredannelse ved den oxidative omsætning). Substratet er halvflydende
(0,3% agar) med det formål at undgå væskestrømninger, hvorved den
oxidativt dannede svage syre, der produceres øverst i glasset, ikke
opblandes i det øvrige substrat og neutraliseres.
Bakterier, der viser fermentativ nedbrydning af glukose, er enten obligat
eller fakultativt anaerobe. Bakterier, der ikke kan nedbryde glukose, kan
eventuelt udnytte substratets pepton og derfor alligevel vokse i substratet
uden at danne syre.
Testen er af mindre betydning for Gram-positive bakterier (kun
Micrococcus, Nocardia og nogle Bacillus-arter er rent oxidative), men er
vigtig ved identifikationen af Gram-negative bakterier, idet alle
enterobakterier (vigtige slægter som Escherichia, Salmonella, Shigella,
Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Erwina, Serratia, Yersinia, Vibrio og
Aeromonas) nedbryder glukose fermentativt. Blandt de Gram-negative
bakterier er Pseudomonas den vigtigste oxidative slægt.
Fremgangsmåde Til undersøgelsen anvendes to rør med H & L medium, der begge podes
som stikkultur. Det ene rør påhældes 1/2-1 cm tykt lag smeltet vaseline
(for at holde kulturen anaerob). Kulturerne inkuberes ved 37 °C. Aflæsning
efter 24-96 timer.
NB: H & L medium vil være podede inden øvelserne, så disse blot skal
aflæses. Ved aflæsning undersøges dels for bakteriel vækst, dels for
farvereaktion med indikatorfarve i mediet (se nedenstående skema), hvor
gul indikerer aktivitet.
30
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Tilsmeltede rør Åbne rør _________________________________________________________
Aerob vækst - + Anaerob vækst + - Fakultativ anaerob vækst + + Fermentativ nedbrydning, F gul gul eller grøn Oxidativ nedbrydning, O grøn gul Ingen nedbrydning grøn grøn eller blå
Identifikation af vigtige Gram-positive slægter (Skemaer frit efter Cowan et al. (1993))
Form Bevægelighed
Aerob vækst
Anaerob vækst
Kat Ox Sy OF
Micrococcus Kugler - + - + - (+) O
Staphylococcus Kugler - + + + - + F
Streptococcus Kugler - + + - - + F
Leuconostoc Kugler - - + - - + F
Corynebacterium Stave - + + + - (+) (F)
Lactobacillus Stave - + + - - + F
Bacillus Stave m. sporer
(+) + (+) + (+) (+) O/F
Clostridium Stave m. sporer
(+) - + - - (+) F
Nocardia Stave - + - + - + O
Kat, Katalase test; Ox, Cytochrom c oxidase; Sy, Syredannelse fra glukose; OF, Oxidation - Fermentation
31
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Identifikation af vigtige Gram-negative slægter
Form Bevæge-lighed
Aerob vækst
Anaerobvækst
Kat Ox Sy OF
Neisseria Kugler - + - + + + O
Acinetobacter K/S - + - + - + O
Bacteroides Stave - - + (-) - (+) F
Alcaligenes Stave (+) + - + +/- - -
Flavobacterium Stave - + - + + + O
Pseudomonas Stave + + (-) + + (+) O
Vibrio Stave krumme
+ + + + + + O/F
Serratia* Stave (+) + + + - + F
Campylobacter Stave + ** - (+) + - -
*) gælder også andre Enterobakterier; **) i 5% O2
Samlede resultater for bakterie-identifikation
Nr Form Gram Endo-sporer
Bevæge- lighed
Aerob vækst
Anaerobvækst
Kat Ox Sy OF Slægt
Sekundær karakterisering De primære tests identificerer højst den ukendte bakterie til slægt. Det er
derfor ofte nødvendigt at benytte sekundære tests til yderligere
identifikation. Valget af sekundære tests er forskellige fra gruppe til
gruppe. Tabel 24.3 i Brock Biology of Microorganisms giver en oversigt
over en række vigtige diagnostiske tests for klinisk vigtige bakteriegrupper.
Udover de klassiske undersøgelser for vækst på specifikke medier og
enzym-assays anvendes idag en række molekylære teknikker til yderligere
identifikation af bakterieisolater. Disse metoder omfatter en række
typninger baseret på restriktionsenzym-analyse af plasmid- og
kromosomalt DNA. Sekventering af DNA kodende for 16S RNA er den
mest anvendte metode til fylogenetiske studier, mens reaktioner med
specifikke antistoffer er meget anvendt inden for klinisk mikrobiologisk
identifikation.
32
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Api identifikations kits
Der findes en række testkits til identifikation af bakterieisolater. API
systemet er et eksempel på et sådant system. Testkittet består at en
række brønde der indeholder specifikke vækstmedier og nogle enkelte
enzymsubstrater. Brøndene podes med en bekteriesuspension og efter
en vis inkubationstid (24-48 timer, afhængig af hvilket system man
anvender) kan testene aflæses. Aflæsningen af API testkit omsættes til
en talkode. Bakteriens navn fås ved opslag af talkoden i APIs
identifikationskatalog.
Identifikation af mikrosvampe
Mikrosvampe omfatter skimmelsvampe (Fungi Imperfecti eller
Deuteromycetes), mugsvampe (Murorales) og gærsvampe
(Ascomyceter).
Svampe findes vidt udbredt i naturen og har en vigtig økologisk rolle som
nedbrydere af organisk materiale, især komplekse molekyler som lignin.
Forskellige slægter er i stand til at producere enzymer til omsætning i
naturen af plantekomponenter som f. eks. stivelse, pektin, cellulose og
lignin. Visse mikrosvampe kan producere antibiotika, hvorfor
mikrosvampe har stor industriel interesse. Andre svampe udskiller
toksiske metabolitter, der kan gøre foder og levnedsmidler giftige for dyr
og mennesker. Skimmelsvampe finder man også i stigende grad i
fugtplagede boliger, hvor de er årsag til det såkaldte "sick building
syndrome". Både i økologiske studier og ved kommercielle screeninger er
identifikation af isolerede svampe en nødvendighed.
Isolering af mikrosvampe er traditionelt foregået ved pladespredning. På
pladerne vil kolonier vokse frem ved spiring af de spredte konidier. For at
få et indblik i om der også findes levedygtige hyfer i undersøgelses-
materialet, kan jordvaskemetoden benyttes. Vaskede jordpartikler
(mineralkorn, organiske rester) placeres på agarplader, hvorefter levende
hyfer kan vokse frem til kolonier. Ved begge metoder er det nødvendigt at
33
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
rendyrke de enkelte isolater for at få renkulturer af de forskellige svampe
inden en identifikation.
Skimmelsvampe Identifikation af mikrosvampe er helt afhængig af genkendelsen af
morfologiske strukturer. Makroskopisk iagttages koloniernes form,
struktur, farve, sporulering og luftmyceliedannelse. Dette sker på
standardmedier for visse slægters vedkommende (f.eks. Penicillium,
Aspergillus og Fusarium), men i øvrigt på et komplekst medium, f.eks. V-8
agar.
Mikroskopisk benyttes en lang række karakterer som adskillelses-
grundlag mellem slægter og mellem arter. Dette gælder f.eks. konidiernes
størrelse, form, pigmentering, overfladestruktur og opdeling i celler.
Konidierne kan dannes ved simpel septering af en hyfe, hvor
enkeltcellerne kan fungere som konidier, eller konidierne dannes på
kondiebærere ved knopskyding eller fra phialider eller annelider.
Konidierne sidder enkeltvis, i kæder eller i hoveder, hvor mange konidier
er holdt sammen af slim. Konidiebærerne kan være placeret direkte på
hyferne eller være samlet mange sammen i koremier eller pyknider.
Terminologi til bestemmelse af skimmelsvampe Pyknide: oftest kugleformet beholder til konidier, apikal åbning.
Koremier: mange kondiebærere samlet i en stilk.
Perithecier: oftest kugleformet beholder til ascosporer.
Basipetal: kædedannelse, den yngste konidie dannes ved basis.
Acropetal: kædedannelse, den yngste konidie dannes i toppen, dvs. at
hver ny konidie dannes oven på den forrige.
Thallisk: kædedannelse, hyferne fragmenteres og der dannes
arthrosporer.
Blastosporer: konidier dannes som knopskydning på konidiofor eller hyfe.
Phialide: celler hvorfra konidier dannes i basipetale kæder eller
slimhoveder, ofte flaskeformede celler, runde-ovale
konidier.
Kolarette: en krave øverst på en phialide.
34
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
Annelider: celler hvorfra konidier dannes i basipetale kæder, mens den
øverste del af konidioforen vokser med ringdannelse til
følge. Konidier med lige afskåret basis.
Gærsvampe Gærsvampe er encellede og identificeres dels på grundlag af deres
morfologi og dels ved hjælp af fysiologiske tests ligesom bakterier med
hovedvægten på forgæring af kulhydrater. Vegetativt deler de sig ved
knopskydning, og de har kønnet formering ved dannelse af ascosporer.
Mugsvampe Mugsvampe identificeres på grundlag af luftmyceliets vækst på agar, dets
farve, højde, sporangie- og zygosporedannelse. Mikroskopisk benyttes
sporangiesporernes størrelse, form, farve, overfladestruktur,
sporangiestørrelse og form samt zygosporekarakteristika.
Terminologi til bestemmelse af mugsvampe Sporangier: er oftest kugleformede. De vegetative sporer dannes i
sporangier og frigives, når ydervæggen brister.
Kolumella: er en central, steril del af sporangiet.
Apofyse: er en opsvulmning lige under sporangiet.
Zygospore: kønnet spore, oftest tykvæggede og piggede.
Fremstilling af præparater af skimmelsvampe
Dækglaskulturer Denne metode er velegnet til fremstilling af mikroskopiske præparater af
skimmelsvampe. Hyferne klæbes eller adhæderes til et dækglas, og
konidiedannelsen kan følges ved mikroskopering. Ved fremstilling af et
væskepræparat fra en koloni på en agarplade går konidieopbygningen let
i stykker.
I en petriskål med agar udskæres sterilt fire agarblokke med et propbor
(en skalpel eller en flad podenål kan også benyttes). Dernæst løftes disse
blokke op på agarfladen med en steril podenål. Hver blok podes med
35
Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer
svampen, der skal undersøges, og et flamberet (og dernæst afkølet)
dækglas lægges ovenpå hver blok. Mellem blokkene kan der fremstilles
en stregkultur. Inkubationen sker ved passende temperatur, indtil
svampen er vokset frem.
Ved mikroskopering anbringes dækglasset med kultursiden nedad i en
dråbe vand eller et svampefarvestof (f.eks. cotton-blue). Stregkulturen i
petriskålen iagttages ved direkte mikroskopering med 10× objektiv.
Tapepræparat Præparater til mikroskopering kan også fremstilles ved at fange hyfer med
konidier på et stykke tape. Herefter afsættes en dråbe cotton-blue, på et
objektglas, og tapen klæbes til glasset med kultursiden nedad i dråben.
Gemmepræparat Dækglasset anbringes i et urglas med Farmers fikseringsvæske i 5 min.
Dernæst dyppes det i 96% alkohol og lægges med den bevoksede side
opad på et stykke filtrerpapir. Når alkoholen er fordampet, anbringes
dækglasset på et objektglas i en dråbe lactophenol tilsat cotton-blue. Efter
en uges forløb lakkes dækglassets rand til med neglelak.
Øvelse 6: Identifikation af mikrosvampe
Fremgangsmåde Hvert småhold skal identificere de udleverede præparater af mikrosvampe
ved hjælp af de udleverede identifikationspapirer.
Derudover skal hvert småhold undersøge mikrosvampe opvokset på
forskellige fødevarer eller agarplader.
36
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
4. KVANTITATIVE BESKRIVELSER AF BAKTERIEPOPULATIONER I SPILDEVAND
Vi har valgt at bruge spildevand som prøvemateriale i denne øvelse. Dels
er bakterieindholdet i spildevand forholdsvis højt, og dels kan en sådan
undersøgelse relateres til en række sundhedsmæssige problemstillinger.
Et af hovedformålene med denne øvelse er at demonstrere nogle
forskellige metoder til at bestemme antallet af bakterier i en prøve. Dette
gøres dels ved en direkte tælling i mikroskop og dels ved tælling af
kolonier på generelle vækstmedier. Endvidere anslås antallet statistisk på
baggrund af positiv farvereaktion i en række flydende vækstmedier.
Et andet hovedformål er at undersøge forekomst af forskellige fækale
indikatororganismer i hhv. renset og urenset (råt) spildevand. Dette gælder
bl.a. de coliforme bakterier, fækale enterococcer og Clostridium
perfringens. En eller flere af disse bakterier benyttes normalt som
indikatorbakterier i vand.
Endelig undersøges udbredelsen af antibiotika resistens blandt coliforme
bakterier. Dette belyses dels ved at bestemme antallet af tetracyklin- og
ampicillin-resistente bakterier, dels ved en analyse for forekomsten af
multiresistens.
Dansk Standard har lavet en række procedurer for mikrobiologiske
vandundersøgelser. Disse forskrifter bruges af alle offentlige kontrol-
myndigheder. De fleste af procedurerne i denne øvelse er tilpasset Dansk
Standards forskrifter.
Spildevand og i mindre omfang ferskvand og havvand indeholder en
række bakterier, som normalt optræder i tarmen på pattedyr. På grund af
fækal forurening af vandmiljøet spredes disse bakterier i spildevandet og
derfra videre til recipientmiljøet.
Visse sygdomsfremkaldende bakterier (patogener) spredes også ofte ved
en fækal forurening. Fækalt forurenet drikke- og/eller badevand udgør
derfor en potentiel sundhedsfare.
For at karakterisere vands hygiejniske tilstand undersøges almindeligvis
antallet af en eller flere normalt forekommende tarmbakterier. En direkte
37
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
bestemmelse af indholdet af patogene bakterier er i dag mulig for de fleste
organismers vedkommende. De kan dog ikke danne baggrund for den
rutinemæssige undersøgelse af vandkvaliteten, idet de patogene bakterier
kun optræder sporadisk og ofte i et lille antal. Desuden er disse analyser
dyre og besværlige. Man vælger derfor ofte at teste for tilstedeværelsen af
en eller flere indikatororganismer.
Brug af indikatorbakterier Det er alment accepteret at følgende punkter skal være opfyldt i rimeligt
omfang, hvis en bakterie skal kunne bruges som indikatororganisme:
1. Den skal være til stede, når de patogene organismer er der.
2. Den skal på den anden side kun optræde, når der er sandsynlighed
for, at de patogene også er der.
3. Den skal være til stede i meget større antal end patogenerne.
4. Den skal være mere resistent overfor en desinfektion end
patogenerne.
5. Den skal være hurtigt voksende på et relativt simpelt medie.
6. Den skal indgå i simple og karakteristiske reaktioner, som med
lethed identificerer gruppen eller arten.
7. Den skal være tilfældigt fordelt i den udtagne prøve.
8. Dens vækst skal kunne ske uafhængigt af andre organismer (der
skal ikke kunne optræde en hæmning af indikatoren).
Sammenfattende kan man fastslå, at der ikke eksisterer nogen bakterier,
som kan betegnes som perfekte indikatorer under alle forhold. Således
har flere undersøgelser vist, at det er muligt at finde patogener på steder,
hvor det ikke var muligt at påvise forekomst af indikatororganismer som
f.eks. coliforme bakterier. Normalt vil tilstedeværelse af indikatorbakterier
kunne bruges til at indicere forekomsten af en fækal forurening, mens man
ikke vil kunne slutte omvendt, at manglen på samme angiver
omgivelsernes renhed.
38
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Decimal fortyndingsrække af spildevandet til alle øvelserne fra 7 til 12 Af vandprøven laves decimale fortyndinger i PBS-opløsning. Pipettespids
skiftes, og røret whirles grundigt mellem hver fortyndning. Der laves
følgende fortyndinger:
Renset spildevand 10 0 - 10-5
Urenset spildevand 10-1 - 10-7
NB! Hvert hold arbejder enten med renset eller råt spildevand.
Øvelse 7: Antal koloniformende enheder (CFU)
Formålet med denne øvelse er, at bestemme det totale antal aerobe
heterotrofe bakterier i spildevandet før og efter rensning. Man vil, ud fra
disse tal, få et indtryk af hvor meget bakterietallet falder ved rensning af
39
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
spildevand. Selv om fjernelse af det bakterielle indhold i spildevandet ikke
indgår som en selvstændig del af spildevandsrensningen i
rensningsanlæg, vil totaltallet af bakterier i spildevandet falde drastisk
under rensningsprocessen. Dette skyldes først og fremmest at bakterierne
overvejende er knyttet til partikulært organisk materiale i spildevandet, og
et af hovedformålene med spildevandsrensningen er netop at fjerne det
organiske materiale.
Til kvantificering af det totale antal bakterier i spildevand benyttes et
komplekst medium, Plate Count Agar (PCA), som en lang række af de
almindelige bakterier kan vokse på.
0,1 ml fra hver fortynding pladespredes på PCA-plader. Renset spildevand 10 0 - 10-3
Urenset spildevand 10-2 - 10-5
Alle plader inkuberes med bunden opad ved stuetemperatur i mindst 48
timer.
Efter inkubation ved stuetemperatur tælles antallet af kolonier på pladerne.
Antal CFU (colony forming units) pr. plade omregnes til CFU pr. ml prøve.
Fortyndinger med mellem 50 og 200 kolonier pr. plade tælles.
Øvelse 8: Bestemmelse af totalt bakterietal
En stor del af de naturligt forekommende bakterier vil ikke danne kolonier
på en agarplade. Det kan skyldes at de fysisk/kemiske forhold eller
næringsforholdene på vækstmediet ikke tillader vækst af disse bakterier.
En indlysende måde at komme uden om dette problem er at tælle
bakterierne direkte i prøven.
Direkte tælling af bakterier er imidlertid ikke så simpelt som det kunne
lyde, og tælling foregår derfor på et udleveret billede.
For det første må tællingerne foregå i mikroskop. For det andet skal
bakterierne fikseres så de ikke bevæger sig under tællingen. For det tredie
40
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
vil der i naturlige prøver være en mængde små partikler som i mikroskopet
vil ligne bakterier. Man bliver derfor nødt til at farve bakterierne så man
kan kende dem. Et fjerde problem er, at man ikke umiddelbart kan skelne
døde og levende bakterieceller.
I denne øvelse skal en enkelt farvemetode, den såkaldte Acridinorange
(AO) -metode anvendes.
AO fluorescerer når det binder sig til nukleinsyrer. Når AO binder sig til
RNA, giver AO-RNA komplekser anledning til fluorescens i det røde
område mens AO-DNA komplekser fluorescerer med grønt lys.
Ved farvning med AO opnår man en fiksering af bakterierne (de dør ved
farvningen). Man opnår endvidere at kunne skelne mellem levende
bakterier (grønne eller røde) og diverse partikler (gul-orange).
Farvningen med AO kan kun ses i UV-lys, så tællingerne må foregå i
epifluorescens-mikroskop.
Beregning
Det udleverede billed viser et udsnit af filtret på 7,5 x 10-3 mm2.
Arealet af hele det nedfiltrerede område: 339 mm2
Beregn antal bakterier pr. ml prøve.
Øvelse 9: Påvisning af Clostridium perfringens (C. welchii)
Denne sporedannende bakterie er knyttet til tarmen. Det vigtigste
tvivlsspørgsmål i forbindelse med brugen af denne organisme som
indikator, vedrører den usikkerhed som hersker omkring
størrelsesordenen af sporernes normale udbredelse i naturen. Det har dog
aldrig været muligt at påvise Clostridium perfringens i vand, som ud fra
hygiejniske kriterier er blevet betegnet som værende af tilfredsstillende
kvalitet. Fordelene ved brugen af denne bakterie er, at den som følge af
sin sporedannende egenskab vil være mere resistent overfor ydre
påvirkninger end de andre nævnte indikatororganismer, hvorfor den bedre
vil opfylde punkterne 1 og 4 (side 38). Ved undersøgelse af vand, hvor den
41
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
tilledte forurening har indeholdt toxiske stoffer, kan Clostridium perfringens
foretrækkes fremfor E. coli.
I meget forurenet vand findes 104 - 105 kim (celler eller evt. sporer) af
Clostridium perfringens pr. ml eller g, mens områder med ringe forurening
har under 100.
I Dansk Standard defineres Clostridium perfringens som obligat anaerobe,
sporedannende Gram-positive stave, der ved 48°C reducerer sulfit til sulfid
inden for 24 timer.
Til påvisning af Clostridium benyttes hyppigst et særligt differential-
medium med tilsætning af sulfit og en jern-forbindelse (se evt. opskrift)
samt evt. antibiotika. Den sværtning af mediet som ses, skyldes
udfældning af sulfider.
Den høje dyrkningstemperatur og det ret høje sulfitindhold i substratet
bortselekterer andre sulfitreducerende bakterier fra Clostridium
perfringens.
Lige inden podning af flaskerne smeltes substratet og sættes i vandbad
ved 50°C. Til hver flaske tilsættes 1 ml 1% natrium-sulfit; Na2SO3 og 2
dråber 5% ammoniumferrosulfat; (NH4)2 Fe(SO4)2 med sterile
injektionssprøjter og kanyler (begge opløsninger er sterilfiltrerede).
Fra hver af nedenstående fortyndinger podes 1 ml over i flasker med
smeltet jernsulfit-agar. Der laves 2 glas fra hver fortynding. Prøven
blandes med substratet ved at rulle flaskerne mellem håndfladerne.
Flaskerne stilles til afkøling på bordet. Når agaren er stivnet inkuberes
flaskerne ved 48°C i 24 timer.
Urenset spildevand 10-2 & 10-3
Renset spildevand 100 & 10-1
Efter 48 timer Optælling sker ved at tælle alle sorte kolonier, der er over 2 mm i
diameter.
Antal Clostridier pr. ml spildevand udregnes under hensyntagen til de
anvendte fortyndinger.
42
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Øvelse 10: Påvisning af fækale enterokokker
Fækalier indeholder flere forskellige Enterococcus-arter, hvor
Enterococcus faecalis vil være den hyppigste. Som hos E. coli vil brugen
af denne bakterie som indikator være knyttet til en påvisning af en nylig
tilledt forurening. Fordelene ved brug af denne bakterie hænger sammen
med dens større resistens overfor en række parametre, som f.eks. pH,
end E. coli.
Til isolering af Enterococcus faecalis benyttes et medium, der er så
selektivt, at ingen af de øvrige almindeligt forekommende bakterier i
spildevandet (f.eks. E. coli og Enterobacter aerogenes) kan vokse.
I forurenet vand forekommer enterokokker i betydeligt ringere antal end
coli-bakterierne og man kan derfor opkoncentrere bakterierne ved at
filtrere vandprøven på et membranfilter (0,2 µm) i stedet for at benytte
MPN-metoden (4.5).
Membranfiltret overføres til Natriumazid-agar (NaN3) som hæmmer alle
respirerende bakteriers vækst. Der opstår en rødfarvning af kolonierne,
når mediets indhold af triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) reduceres til
formazan.
Vandprøvens størrelse vælges således, at der højst kommer 50 kolonier
pr. filter, hvilket formodentlig svarer til 1 - 5 ml moderat forurenet vand.
Filtertragten skylles efter med ca. 30 ml vand for at få alle bakterier med
og for at opnå en god fordeling af bakterierne på filtret.
Renset spildevand 1 & 5 ml (ufortyndet)
Urenset spildevand 1 & 5 ml (NB. 10-1 fortyndning)
Filtrene anbringes på Natriumazid-agar og inkuberes i 48 timer ved 37°C.
NB! Disse plader må ikke inkuberes med bunden opad.
43
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Efter 48 timer: Enterokokker vil vise sig som rosa, røde eller purpurfarvede 0,5 - 2,0 mm
store kolonier. Antallet af enterokok-kolonier på filtret tælles. Hvis der er
mere end 200 kolonier pr. filter tælles kun 1/4 filterareal.
Antal enterokokker pr. ml prøve udregnes under hensyntagen til de
anvendte volumener og fortyndinger.
Øvelse 11: Kvantitativ bestemmelse af coliforme bakterier
Coliforme bakterier er en fællesbetegnelse for en gruppe af forskellige
gram-negative stavformede bakterier, som har den egenskab tilfælles, at
de kan forgære laktose under dannelse af syre og gas.
De coliforme bakterier vil under normale omstændigheder optræde i
naturen og er således ikke udelukkende bundet til en fækal forurening.
Gruppen kan derfor ikke alene bruges som en indikator for de hygiejniske
forhold i det pågældende vand, (punkt 2, side 38 vil ikke være opfyldt i
tilstrækkelig grad). Idet en stor del af de coliforme bakterier dog som oftest
vil være af fækal oprindelse, vil en bestemmelse af antallet altid kunne
give et fingerpeg om vandkvalitet - særlig i forbindelse med en for E. coli
ufavorabel tilstand, hvor flere af de andre coliforme bakterier vil være mere
hårdføre end E. coli.
E. coli har den fordel, at den er direkte knyttet til tarmen, og da E. coli
type I samtidig let kan bestemmes (idet den kan forgære laktose ved 44°C
i modsætning til resten af den coliforme gruppe) vil denne bakterie
gennemgående være en velegnet indikatororganisme. Dette forhold ses
tydeligt afspejlet i den aktuelle udformning af Dansk Standard for
vandundersøgelser. Brugen af E. coli som det eneste mål for den
hygiejniske tilstand i det pågældende vand vil dog have sine
begrænsninger. Således har undersøgelser vist, at denne bakterie i
havvand vil være genstand for en større reduktion i antallet end det kunne
forventes ud fra den normale fortynding i det vandige miljø. Dette forhold
skyldes hovedsagelig sedimentation samt det faktum, at bakterien ikke er
tilpasset forholdene i havmiljøet. E. coli vil derfor kun være velegnet til at
44
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
spore en nylig fækal forurening inden for en vis afstand fra
forureningskilden.
Ideen med denne øvelse er at bestemme den hygiejniske tilstand i to
forskellige vandprøver: Urenset spildevand og renset spildevand.
Metoden der benyttes er den samme metode som angives i Dansk
Standard til bestemmelse af coliforme bakterier.
Ved denne metode anvendes Most Probable Number (MPN) princippet til
at estimere antallet af levende bakterier i prøven. Afhængigt af det
selektive dyrkningsmedium, som benyttes, kan der foretages opgørelser
over antal bakterier med en bestemt egenskab. Metoden giver ikke som
pladespredningsmetoden et konkret antal, men et sandsynligt antal
bakterier. Bakterierne forekommer Poisson-fordelte og man kan derfor ud
fra antallet af "positive" glas i forskellige fortyndinger beregne det sand-
synlige antal bakterier i udgangsmaterialet.
E. coli samt nærtstående bakterier kan forgære laktose under udvikling af
gas (H2, CO2) og syre. Disse forhold undersøges ved at pode
vandprøverne i MacConkey-bouillon (McC) ophældt på reagensglas
indeholdende et mini-reagensglas (Durham-rør), som er vendt på hovedet
for at kunne opsamle evt. gasser. I glas med forgærende bakterier vil
indikatoren bromcreosol-purpur slå om til sur reaktion (gul) og der vil
opsamles gas i Durham-røret (undertiden først ved bankning på glassets
kant). Bakterier, der kan vokse i dette medie, hvor der er tilsat galdesalt,
vil her blive betragtet som coliforme bakterier.
Ved anvendelse af en sandsynlighedstabel fås "most probable number" af
bakterier i vandprøven.
Fra hver fortynding podes 5 McC-rør med 1 ml i hvert, altså 25 rør i alt.
McC-rørene må ikke rystes efter podning idet dette kan forårsage “falske”
luftbobler i Durham-rørene
Renset spildevand 10-1 - 10-5
Urenset spildevand 10-3 - 10-7
Efter podning inkuberes glassene ved 37°C i 48 timer.
45
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
46
Ved positiv reaktion farves mediet gult og der ses en luftboble i Durham-
røret.
Ved aflæsningen vælges tre på hinanden følgende fortyndinger, hvor der
så vidt muligt både er positive og negative glas. Antallet af rør, hvori der
ses farveomslag og luftboble (positiv reaktion) tælles for hver af de tre
fortyndinger, og man får herved en 3-cifret tal-kode (f.eks. 5-4-1) som ved
opslag i sandsynligheds-tabellen danner grundlag for MPN-tallet. Det
fundne MPN-tal skal derefter ganges med fortyndingsgraden i den mindst
fortyndede af de tre valgte fortyndinger.
Efter aflæsning af MPN-testen podes der fra to af de positive glas 10 μl
over i nye MacConkey rør, samt i rør med peptonvand for at undersøge for
forekomst af E. coli type I.
Begge podninger inkuberes herefter ved 44°C i 24 timer.
Der testes for tilstedeværelsen af indol i peptonvandskulturen ved at
tilsætte 6-10 dråber Kovac’s reagens, hvorefter kulturen rystes kraftigt. En
positiv reaktion viser sig ved en kraftig rød farve i den øverste fase i
glasset.
Er der syredannelse, gasproduktion og positiv indolreaktion med Kovac’s
reagens betragtes E. coli type I som påvist.
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Tabel for MPN/g(ml) results MPN category confidence limits 1 2 99% 95% 0 0 1 0.2 x <0.1 1.3 <0.1 1.0 0 1 0 0.2 x <0.1 1.4 <0.1 1.0 1 0 0 0.2 x <0.1 1.5 <0.1 1.1 1 0 1 0.4 x 0.1 1.9 0.1 1.5 1 1 0 0.4 x 0.1 1.9 0.1 1.5 1 2 0 0.6 x 0.1 2.3 0.2 1.8 2 0 0 0.4 x 0.1 2.2 0.1 1.7 2 0 1 0.7 x 0.1 2.6 0.2 2.1 2 1 0 0.7 x 0.1 2.6 0.2 2.1 2 1 1 0.9 x 0.2 3.1 0.3 2.5 2 2 0 0.9 x 0.2 3.1 0.3 2.5 3 0 0 0.8 x 0.1 3.1 0.3 2.5 3 0 1 1.1 x 0.2 3.7 0.4 2.9 3 1 0 1.1 x 0.2 3.7 0.4 3.0 3 1 1 1.4 x 0.4 4.3 0.6 3.5 3 2 0 1.4 x 0.4 4.3 0.6 3.5 3 2 1 1.7 x 0.5 4.9 0.8 4.1 3 3 0 1.7 x 0.5 5.0 0.8 4.1 4 0 0 1.3 x 0.3 4.9 0.5 3.9 4 0 1 1.7 x 0.5 5.8 0.7 4.6 4 1 0 1.7 x 0.5 5.9 0.7 4.7 4 1 1 2.1 x 0.6 6.8 0.9 5.5 4 2 0 2.2 x 0.7 7.1 0.9 5.7 4 2 1 2.6 x 0.8 8.1 1.2 6.6 4 3 0 2.7 x 0.9 8.3 1.3 6.8 4 3 1 3.3 x 1.1 9.5 1.5 7.7 4 4 0 3.4 x 1.2 9.8 1.5 8.1 5 0 0 2.3 x 0.6 11.6 0.9 8.7 5 0 1 3.1 x 0.9 14.5 1.4 11.2 5 1 0 3 x 1 16 1 12 5 1 1 5 x 1 20 2 15 5 1 2 6 x 2 23 3 19 5 2 0 5 x 1 22 2 17 5 2 1 7 x 2 27 3 21 5 2 2 9 x 3 31 4 25 5 3 0 8 x 2 32 3 25 5 3 1 11 x 3 38 4 30 5 3 2 14 x 4 44 6 36 5 4 0 13 x 3 50 5 39 5 4 1 17 x 5 61 7 48 5 4 2 22 x 7 73 9 59 5 4 3 28 x 9 87 13 70 5 4 4 35 x 12 101 16 83 5 5 0 24 x 6 127 10 95 5 5 1 30 x 10 180 10 130 5 5 2 50 x 10 250 20 200 5 5 3 90 x 20 380 30 300 5 5 4 160 x 40 700 60 530
Category 1: Normal results, obtained in 95% of cases. Category 2: Less likely results, obtained only in 4% of cases. These are not to be used for important
decisions. Results that are even less likely than those of category 2 are not mentioned in the table and are always unacceptable.
Fra: J.C. De Man 1975. European Journal of Applied Microbiology. Vol. 1 nr. 1 1975
47
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Resultater fra øvelse 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Øvelse 7 8 9 10 11 11
Spildevand PCA
CFU pr. ml
Total tælling
Celler pr. ml
Clostridier
CFU pr. ml
Enterococcer
CFU pr. ml
MacConkey
MPN pr. ml
E.coli type I
Ja/Nej
Egne
resultater
Urenset
middel)
Renset
(middel)
Øvelse 12: Antibiotikaresistente bakterier i spildevand
Forekomsten af resistens hos bakterier kan skyldes kromosomale eller
plasmidbårne resistensgener, eller forhold som f.eks. membran-
impermeabilitet, der gør, at de bakteriedræbende/hæmmende stoffer
aldrig når ind i cellen. Hver bakterieart kan være mere eller mindre følsom
over for et givet antibiotikum og det er derfor vigtigt i enhver
resistensundersøgelse at inddrage en bedømmelse af, hvilke
organismegrupper, der rent faktisk undersøges (Gram-type, antibiotiku-
mets spektrum, "naturlige" resistenser).
Gennem de seneste årtier har man kunnet spore en stigning i forekomsten
af antibiotikaresistente bakterier - specielt i de miljøer som omgiver
mennesker og husdyr. Årsagerne hertil kan f.eks. være et forhøjet
antibiotikaforbrug, spredning af plasmidbårne resistensgener i miljøer med
høj bakterietæthed, kemisk stress som følge af en generel
forureningstilstand eller den direkte forekomst af små mængder
antibiotiske stoffer i miljøet.
Isolering af antibiotikaresistente bakterier fra spildevand
Som udgangspunkt for isoleringen af antibiotikaresistente bakterier kan
benyttes agarplader, som udover vækstmediet også indeholder antibiotika
i den ønskede koncentration. Eftersom de allerfleste antibiotika
ødelægges ved høje temperaturer, fremstilles antibiotikapladerne ved at
48
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
tilsætte en antibiotikaopløsning til agarmedie, der er blevet autoklaveret og
derefter afkølet til ca. 50°C. Antibiotikapladerne har begrænset holdbarhed
og det er derfor vigtigt at anvende frisklavede plader til
resistensundersøgelsen.
Der eksisterer utallige metoder til bestemmelse af bakteriel resistens og til
fastsættelsen af, hvor meget antibiotika det enkelte isolat kan tåle. Dette
har specielt stor betydning ved behandlingen af bakterieinfektioner hos
mennesker. Som et udtryk for, hvor meget antibiotika der skal til at
forhindre vækst af en bakterie, anvendes minimum hæmmende
koncentration, MIC (minimum inhibitory concentration), der angives som
regel i µg/ml.
I resistensundersøgelser af f.eks. spildevand er det vigtigt at anvende
antibiotikakoncentrationer, der erfaringsmæssigt vil forhindre vækst af alle
de bakterier, som ikke er i besiddelse af resistensmekanismer. På den
anden side må antibiotikakoncentrationen i mediet ikke blive så høj, at den
overskrider selv de resistente bakteriers MIC-værdi.
Af spildevandsprøven laves decimale fortyndinger i PBS-buffer. Fra
passende fortynding pladespredes 0,1 ml på EMB plader. Hvis der
forventes et lavt antal bakterier, kan en opkoncentrering på filtre være
nødvendig. Dette foregår som foreskrevet i øvelse 10, dog anvendes der
10 ml prøve:
EMB plader:
Renset Spildevand: 100 og 10-2
Urenset spildevand: 10-2 og 10-4
EMB + 10 µg/ml tetracyklin plader:
Renset Spildevand: Filtrer 10 ml af 100 og 100
Urenset spildevand: 100 og 10-2
EMB + 50 µg/ml ampicillin plader:
Renset Spildevand: Filtrer 10 ml af 100 og 100
Urenset spildevand: 100 og 10-2
Pladerne inkuberes ved 37°C i 24 timer.
49
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Kolonierne tælles på EMB plader med og uden tilsætning af antibiotika, og
antallet pr. ml spildevand udregnes under hensyntagen til de anvendte
fortyndinger. Beregn desuden på basis af EMB-pladetællinger
spildevandets procentuelle indhold af tetracyklin- og ampicillinresistente
bakterier.
Bemærk: E. coli vil ses som flade, sorte kolonier med metalskær i
påfaldende lys.
NB. Pladerne skal også bruges i Forekomst af multiresistens.
EMB EMB +AP ampicillin EMB + TC tetracyklin
CFU pr. ml CFU pr. ml % CFU pr.ml %
Forekomst af multiresistens
Den enkelte bakterie kan være resistent overfor flere forskellige
antibiotika. Multiresistens er blevet defineret som resistens overfor 3 eller
flere antibiotika samtidigt. Ved (egentlig) multiresistens forstås oftest
resistens overfor flere antibiotika af forskellig type, som involverer helt
forskellige resistensgener.
Replikateknikker anvendes for let at kunne teste bakterieisolaters vækst
på flere forskellige medietyper. Der findes i handlen særlige replikablokke
til anvendelse med velour eller filterpapir, men ved øvelserne her
anvendes sterile tandstikker til at overføre bakteriematerialet til forskellige
antibiotikaplader. Ved undersøgelse for multiresistens er det vigtigt at
arbejde med enkeltisolater. I princippet bør bakteriekolonier derfor være
renstrøget adskillige gange for at sikre, at der arbejdes med renkulturer.
Der udvælges 24 enkelt-liggende antibiotikaresistente kolonier fra både
ampicillin- og tetracyklinpladerne, som nummereres med spritpen på
bagsiden af petriskålen. En steril tandstik dyppes i en koloni og der
afsættes små streger med tandstikken på en serie af nye antibiotikaplader.
50
Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand
Stregerne sættes i samme position på alle fem nye antibiotikaplader. Til
sidst sættes en streg med tandstikken på en EMB-plade uden antibiotika.
Denne plade fungerer som kontrol for vækst og danner desuden
sammenligningsgrundlag, når antibiotikapladerne skal aflæses.
I denne undersøgelse anvendes EMB-plader med følgende antibiotika:
tetracyklin 10 µg/ml, streptomycin 50 µg/ml, ampicillin 50 µg/ml,
chloramphenicol 20 µg/ml, cefalexin 50 µg/ml.
Undersøg for vækst af antibiotika-resistente bakterier på EMB plader med
de forskellige antibiotika. En resistent bakterie vokser lige så godt på
antibiotikapladen som på kontrolpladen. Er væksten hæmmet, har isolatet
en MIC-værdi, der ligger under den i pladen anvendte
antibiotikakoncentration. Lav en opgørelse over hvor mange isolater der
havde 1, 2, 3 osv. resistenser.
Hvor mange % af de undersøgte kolonier var multiresistente (havde tre
eller flere resistenser)?
EMB +TC
CFU pr. ml
streptomycin
%
chloramphenicol
%
cefalexin
%
ampicillin
%
tetracyklin %
multiresistente
%
EMB +AP
CFU pr. ml
streptomycin
%
chloramphenicol
%
cefalexin
%
tetracyklin
%
ampicillin %
multiresistente
%
51
Almen Mikrobiologi 2007 Substratopskrifter
SUBSTRATOPSKRIFTER
Clostridium-agar (jern-sulfit agar)
Ingredienser:
Kødekstrakt 10 g Pepton 10 g Agar 15 g Dest. vand 1000 ml
Substratet hældes på 20 ml hætteglas, 10 ml i hvert glas og autoklaveres ved 121°C i 20 min. Lige inden podning af glassene smeltes substratet og sættes i vandbad ved 50°C. Til hvert glas sættes 1 ml 1% natrium-sulfit, Na2SO3 og 2 dråber 5% ammoniumferrosulfat, (NH4)2Fe(SO4)2. (Begge opløsninger skal være sterilfiltrerede).
Eosin-methylenblåt agar (EMB-agar)
Ingredienser:
Kaliumfosfat, sek. K2HPO4 2 g Pepton 10 g Laktose 10 g Eosin 0,4 g Methylenblåt 0,1 g Agar 15 g Dest. vand 1000 ml
Ingredienserne blandes. Autoklaveres ved 121°C i 20 min. Hældes på skåle.
Gram-farvning
opl.1 Krystalviolet-opløsning
Krystalviolet 10 g Ammoniumoxalat 4 g 96% Alkohol 100 ml Ionbyttet vand 400 ml
opl.2 Efterfarvning
Jod 4 g Kaliumjodid 8 g 96% Alkohol 100 ml Ionbyttet vand 400 ml
opl.3 Differentiering
Opløsning 2. 25 ml 96% Alkohol 475 ml
opl.4 Kontrastfarvning
Erythrosin 5 g Phenol 25 g Ionbyttet vand 500 ml
52
Almen Mikrobiologi 2007 Substratopskrifter
Hugh & Leifsons medium (H & L)
Ingredienser:
Pepton 2,0 g NatriumkloridNaCl 5,0 g Sek. Kaliumfosfat K2HPO4 0,3 g Bromthymolblåt (vandopl.) 0,03g Glucose 10,0 g Agar 3,0 g Destilleret vand 1000 ml
Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7,2. Agar tilsættes. Autoklaveres 20 min. ved 121°C.
LB medium
Ingredienser:
Gærekstrakt 5,0 g Bacto-Tryptone 10,0 g Natriumklorid 10,0 g (Agar) 15,0 g Dest. vand 1000 ml
Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7,0 (agar kan tilsættes, hvis mediet skal bruges som agarplader) og autoklaveres.
MacConkey bouillon
Ingredienser:
Natriumtaurocholat (Galdesalt) 5 g Laktose 10 g Pepton 20 g Natriumklorid 5 g Bromkresolpurpur (1% alk.) 2 ml Dest. vand 1000 ml
Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7,4 og der tilsættes bromkresolpurpur. Substratet fyldes på glas, ca. 5-7 ml og der anbringes dværgreagensglas med bunden opad i hvert glas. Autoklaveres ved 110°C i 15 min.
Natriumazid agar
Ingredienser:
Tryptone 20 g Gærekstrakt 5 g Glucose 2 g Kaliumfosfat sek. K2HPO4 4 g Natriumazid 0,4 g Triphenyltetrazoliumklorid (TTC) 0,1 g Agar 10 g Dest. vand 1000 ml
53
Almen Mikrobiologi 2007 Substratopskrifter
Ingredienserne (undtagen TTC og agar) opløses. pH indstilles på 7,2. Dernæst tilsættes agar og substratet autoklaveres. Efter nedkøing til 50°C tilsættes TTC opløst i lidt sterilt vand. Ophældes i petriskåle.
PBS-opløsning (Phosphate Buffered Saline)
Ingredienser:
Na2HPO4 14,4 g KH2PO4 2,4 g NaCl 80 g KCl 2,0 g Dest. vand 1000 ml
pH justeres til 7,2-7,4. Autoklaveres ved 121°C i 20 min.
Peptonvand
Ingredienser:
Tryptone 10 g Natriumklorid NaCl 5 g Dest. vand 1000 ml
Tryptonen fugtes i en kolbe med en ringe mængde koldt vand, dernæst tilsættes NaCl og resten af vandet. pH indstilles til 7,4. Mediet autoklaveres ved 121°C i 15 min.
Plate Count Agar (PCA)
Ingredienser:
Tryptone-pepton 5 g Gærekstrakt 2,5 g Glucose 1 g Agar 15 g Dest. vand 990 ml
Ingredienserne blandes uden agar og pH indstillestil 7,0. Agaren tilsættes og der autoklaveres ved 121°C i 20 min.
Efter afkøling tilsættes 50 mg cycloheximid opløst I 10 ml sterilt vand
Simmons citratagar
Ingredienser:
Magnesiumsulfat MgSO4,7H2O 0,2 g Ammoniumdihydrogenfosfat NH4H2PO4 1,0 g Kaliumdihydrogenfosfat KH2PO4 0,75 g Dikaliumhydrogenfosfat K2HPO4 0,25 g Natriumcitrat (triNa-citrat 2,72 g) 2,0 g Natriumklorid NaCl 5,0 g Agar 10,0 g Bromthymolblåt 0,08 g Dest. vand 1000 ml
54
Almen Mikrobiologi 2007 Substratopskrifter
Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7.0 - 7.2. Efter autoklavering ved 121°C i 15 min. justeres pH til 7.2. Efter afkøling til 45-50°C ophældes substratet (godt blandet) i skåle.
V 8 Agar
Ingredienser:
V-8 juice 200 ml
Calciumcarbonat (slæmmet) CaCO3 3.0 g
Agar 20,0 g
Dest. vand. 800 ml
Ingredienserne minus agar blandes og koges. Filtreres gennem ostelærred og fyldes op til 1000 ml, hvorefter agaren tilsættes. Der autoklaveres i 20 min. ved 121°C.
Forkulturmedium for Geotrichum candidum
Pr Liter
glucose autoklaveres for sig som 27 g/l
mediet laves dobbeltkoncentreret.
Hver forkulturkolbe
225 ml dobbeltkoncentreret medium
15 ml destilleret vand
10 ml glucose (27g/l) tilsættes efter aautoklavering
NH4Cl 1
KH2PO4 6.23
NaHPO4, 2H2O 3.72
MgSO4, 7 H2O 0.24
pH 6.5
Geotrichum podes 48 mindst 48 timer før start af øvelse
Til vækst på overflade anvendes
(pr. liter)
Glucose 15 g Gærekstrakt 4 MgSO4, 7 H2O 0,5 K2HPO4, 3 H2O 1,3 agar 15 g Atamon tilsættes og pH er indstillet til 5,5
Glucose autoklaveres for sig og tilsættes efter autoklaveringen ved 121ºC i 20 min.
55
Almen Mikrobiologi 2007 Substratopskrifter
Vækstmedium for Pseudomonas putida
Til øvelsen med dyrkning i væskekultur anvendes
(pr. liter)
Glucose 0,25 g gærekstrakt 0,25 g NH4Cl 1 g K2HPO4, 3 H2O 6,23 g Na2HPO4, 2 H2O 3,72 g MgSO4, 7 H2O 0,25 g
pH indstilles til 6,5
Glucose autoklaveres for sig og tilsættes efter autoklaveringen ved 121C i 20 min.
Endelig medievolumen pr. kolbe er 50 ml.
56