variabilità genetica di mhc di classe ii locus drb in...

Variabilità genetica di MHC di classe II locus DRB in popolazioni

selvatiche di camoscio alpino (Rupicapra r. rupicapra) e

camoscio pirenaico (Rupicapra p. pyrenaica)

Tesi di Dottorato di Ricerca in Scienze di Sanità Pubblica e Microbiologia

Curriculum Microbiologia e Parassitologia

Dr.ssa Sofia Ingrosso

Tra i petroglifici presenti sulle pareti rocciose

del Parco archeologico presso Vila Nova de

Fez Côa (Pirenei della Catalogna), risalenti a

20 30 mila anni fa, nel Paleolitico Superiore, si

può riconoscere la figura di un capride, forse

un camoscio. Nel profilo ottenuto mediante

una difficile picchiettatura irregolare anziché

con un'incisione lineare, si distinguono il

corpo, le zampe, la testa e le corna appenna

accennate.

Indagare l’imprevedibilità del certo, ridurre ai minimi termini. Il comune denominatore

si chiama conoscenza e la ricerca inizia …

Iago.

Dottorato di Ricerca in Scienze di Sanità Pubblica e Microbiologia

Curriculum Microbiologia e Parassitologia

XXI ciclo AA 2008/2009

Variabilità genetica di MHC di classe II locus DRB in popolazioni selvatiche

di camoscio alpino (Rupicapra r. rupicapra) e camoscio pirenaico

(Rupicapra p. pyrenaica)

Dottorando: SOFIA INGROSSO

Docente Guida Coordinatore

Prof. Stefano D’Amelio Prof. Gianfranco Tarsitani

INDICE

1. INTRODUZIONE 5

1.1 Introduzione generale 5 1.1.1 I markers neutrali 6 1.1.2 I markers dei processi adattativi 7 1.1.3 Studi sulla variabilità genetica delle MHC nei vertebrati 8

1.2 Il Complesso Maggiore di Istocompatibilità 10 1.2.1 Struttura e funzione delle proteine delle MHC 11 1.2.2 L’organizzazione genetica delle MHC 16 1.2.3 Il polimorfismo delle MHC 17 1.2.4 I meccanismi di selezione 19

1.3 Caratteristiche generali del camoscio 21 1.3.1 Origine ed evoluzione del camoscio 24 1.3.2 Distribuzione geografica 26 1.3.3 Biologia del camoscio 29 1.3.4 Una malattia parassitaria: la rogna sarcoptica 32 1.3.5 Breve introduzione alla genetica della conservazione 37 1.3.6 L’importanza della genetica per la conservazione delle popolazioni di camoscio 39

1.4 Obiettivi della ricerca 40

2. MATERIALI E METODI 43

2.1 Campioni analizzati 43

2.2 L’area di studio 49 2.2.1 La Provincia di Belluno 49 2.2.2 La Provincia di Lecco 52 2.2.3 La Spagna pirenaica 52

2.3 Il campionamento 52

2.4 Caratterizzazione molecolare 54 2.4.1 Estrazione ed isolamento del DNA 55

2.4.2 Amplificazione dell’esone 2 delle MHC di classe II 56

2.5 Analisi dei dati 60 2.5.1 Codifica delle sequenze 60 2.5.2 Ricostruzione degli aplotipi con metodi statistici 61

3. RISULTATI 65

3.1 Polimorfismo dell’esone 2 delle MHC di classe locus DRB 65

3.2 Diversità genetica intra-popolazioni 83

3.3 Diversità genetica tra-popolazioni 91

3.4 Alberi di Neighbor-Joining 95

4. DISCUSSIONE DEI DATI E CONSIDERAZIONI 97

4.1 Variabilità genetica delle popolazioni di camoscio 98

4.2 Variabilità nucleotidica delle popolazioni di camoscio 102

5. CONCLUSIONI 105

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 107

ALLEGATI 125

5

INTRODUZIONE

1.1 Introduzione generale

Negli ultimi decenni, i geni del complesso maggiore di istocompatibilità (Major

Histocompatibility Complex, MHC) hanno attirato l’interesse dei ricercatori

principalmente spinti dal proposito di comprendere i processi che sostengono il

polimorfismo genetico (Klein 1986; Apanius et al. 1977; Bernatchez & Landry 2003).

Dopo la scoperta dello straordinario numero degli alleli delle MHC nelle popolazioni

naturali, è stato supposto che la selezione naturale è responsabile del loro

mantenimento (Clarke & Kirby 1966). La relazione tra i genotipi delle MHC e

l’insorgenza o il decorso delle infezioni è stata ampiamente comprovata (Apanius et

al. 1966; Bernatchez & Landry 2003). Alcuni Autori hanno dimostrato una

significativa associazione tra aplotipi o alleli delle MHC e le malattie (Briles et al.

1977; Hill et al. 1991; Decamposlima et al. 1993; Godot et al. 2000; Langefors et al.

2001; Wegner et al. 2003 b; Harf & Sommer 2005), altri Autori hanno dimostrato il

vantaggio dell’eterozigosi delle MHC (Penn et al. 2002; McClelland et al. 2003),

oppure la superiorità competitiva degli individui con un elevato numero di

sequenze varianti delle MHC (Wegner et al. 2003 a; Bonneaud et al. 2004; Wegner

et al. 2004).

L'obiettivo della presente ricerca è di valutare la variabilità genetica intra ed

inter specifica in popolazioni selvatiche di camoscio alpino e pirenaico e di valutare

se la pressione selettiva esercitata da infezioni parassitarie può modulare la

variabilità genetica degli ospiti e se tale variabilità può essere correlata con la

diversa capacità dell’ospite di sviluppare una resistenza al parassita e con le

percentuali di sopravvivenza agli eventi epidemici.

6

1.1.1 I markers neutrali

Studi genetici condotti su animali selvatici sono stati eseguiti negli ultimi venti

anni, per quantificare il differenziamento genetico ed i livelli di diversità genetica in

individui e popolazioni potenzialmente isolate, utilizzando dei markers neutrali,

come sequenze di DNA mitocondriale, microsatelliti o polimorfismi di singoli

nucleotidi (SNPs) (Avise 2000; Sunnucks 2003; Lowe et al. 2004). Mentre questi loci

sono molto importanti per analizzare gli aspetti demografici ed evolutivi come la

ricostruzione filogenetica e la storia delle popolazioni, i livelli e le modalità di flusso

genico tra le popolazioni, i livelli di ibridazione tra specie e sottospecie, il grado di

parentela tra gli individui (Blouin et al. 1996; Balloux & Lugon-Moulin 2002;

Brumfield et al. 2003; Morin et al. 2004), la variabilità dei loci neutrali tende però a

sottostimare o ignorare i processi adattativi importanti e non ci da informazioni

dirette in merito ai processi selettivi coinvolti nella relazione tra individui ed il loro

ambiente ovvero sulla capacità di adattamento ai cambiamenti futuri (Meyers &

Bull 2002, Van Tienderen et al. 2002). Questi aspetti, comunque, sono rilevanti in

studi di ecologia evolutiva e di biologia della conservazione (Crandall et al. 2000;

Stockwell et al. 2003). Studi recenti, inoltre, condotti in diversi taxa e condizioni

hanno rilevato che l’evoluzione spesso si realizza in una scala temporale piuttosto

breve, ad esempio in decadi (Stockwell et al. 2003). In alcuni casi, il tempo

trascorso tra la separazione di popolazioni è troppo breve per lasciare un “segno”

evidenziabile in loci neutrali così le differenze tra le popolazioni possono essere

rilevate solo nei geni sottoposti a selezione (Cohen 2002), come ad esempio i geni

altamente variabili del complesso maggiore di istocompatibilità. Contrariamente ai

markers neutrali, la variabilità delle MHC può darci informazioni riguardo i processi

evolutivi ed adattativi. Il confronto tra i markers neutrali, che sono loci non tradotti

in proteine e ritenuti quindi debolmente sottoposti a pressioni selettive, e loci

codificanti e chiaramente soggetti alla selezione naturale come i geni delle MHC,

sono molto importanti per distinguere i ruoli relativi che hanno avuto i processi

7

demografici e quelli selettivi nel modellare la variabilità genetica intra e tra

popolazioni, e per capire direttamente i livelli di variabilità genetica adattativa

(Hedrick et al. 2001 a, b; Sommer 2005; Mona et al. 2008). Lo studio della

variabilità genetica adattativa delle MHC è importante sia per rispondere alle

questioni di tipo ecologico relative all’individuo stesso ed all’interazione tra

organismi ed il loro ambiente (fitness: sopravvivenza, capacità riproduttiva, scelta

ed attrazione del maschio per la riproduzione, fecondità, resistenza alle malattie,

etc.), ma ha anche un valore negli studi di conservazione e gestione della

variabilità genetica di una specie, e quindi della specie stessa (Amos 2000, Slate

et al. 2000, Acevedo-Whitehouse et al. 2003).

1.1.2 I markers dei processi adattativi

Molte popolazioni naturali di vertebrati sono minacciate non solo dalla

drammatica diminuzione dell’areale totale del proprio habitat ma anche dalla

crescente frammentazione e degradazione dello stesso, che ha causato una

riduzione della dimensione delle popolazioni attraverso la generazione di barriere

che hanno ostacolato il flusso genico tra gli individui (Wahlberg et al. 1996; Meffe

& Carral 1997; Peacock & Smith 1997). Le piccole popolazioni soffrono della

riduzione della diversità genetica dovuta alla deriva genetica ed agli effetti

dell’inbreeding (Harrison & Astings 1996; Dudash & Fenster 2000; Keller & Waller

2002). Gli effetti negativi, quali l’aumento della velocità della perdita allelica, la

fissazione di alleli svantaggiosi e la minore disponibilità di individui eterozigoti,

sono stati osservati in studi teorici ed empirici (Primack 1993; Saccheri et al. 1998).

La perdita di variabilità genetica può essere associata alla riduzione a breve termine

dei componenti della fitness come la sopravvivenza, la capacità riproduttiva, la

velocità di accrescimento ed alla ridotta abilità di adattarsi ai cambiamenti a lungo

termine dell’ambiente (Primack 1993; Lande 1988; Brewer et al. 1990; Lacy 1997;

Frankham & Ralls 1998; Biilsma et al. 2000). Un crescente numero di studi indicano

che la diversità genetica dell’ospite gioca una ruolo rilevante nella resistenza delle

8

popolazioni contro patogeni ed epidemie in generale (Keller & Waller 2002;

Coltman et al. 1999; Meagher 1999; Cassinello et al. 2001; Little 2002; Altizer et al.

2003; Bernatchez & Landry 2003; Spielman et al. 2004). Le diverse funzioni e

caratteristiche che coinvolgono le MHC relativamente ai processi biologici ed

ecologici degli organismi, rendono i geni delle MHC quali candidati ottimali per

studiare i meccanismi ed il significato dell’adattamento molecolare nei vertebrati.

1.1.3 Studi sulla variabilità genetica delle MHC nei vertebrati

Il complesso maggiore di istocompatibilità comprende una regione di geni

altamente polimorfici i cui prodotti sono espressi da una gran varietà di cellule, che

giocano un ruolo centrale nel meccanismo di risposta immunitaria ad antigeni

proteici. I prodotti di questi geni, infatti, forniscono il sistema per rendere

riconoscibili peptidi antigenici ai linfociti T. Nelle popolazioni esistono diverse

forme alleliche codominanti nell’MHC ognuno dei quali può avere una diversa

capacità di legare e presentare determinati antigeni proteici. Geni dell’MHC di

classe II sono stati studiati in molti vertebrati tra i quali alcune specie ittiche, quali il

salmone, la carpa e lo spinarello (Bakker & Zbinden 2001; Reusch et al. 2001, 2004;

Ottovà et al. 2005). Tali studi hanno evidenziato una elevata variabilità non solo

intra-specifica ma anche trans-specifica con l’esistenza di linee evolutive comuni

condivise tra specie diverse. La variabilità genetica delle MHC, principalmente

concentrata in una regione del gene denominata DRB (Domine Region of Binding)

che codifica per la regione PBR, (Peptide-Binding Region) è correlata alla capacità

di rispondere e di riconoscere una elevata varietà di peptidi antigenici diversi. I

parassiti possono rappresentare un fattore potenziale per modulare la diversità

dell’MHC. Questo può avvenire sia per un vantaggio dell’eterozigote, in quanto

capace di riconoscere uno spettro più ampio di antigeni derivanti da patogeni, sia

per un vantaggio degli alleli rari, in quanto potenzialmente in grado di rispondere a

nuove forme di parassiti (Hughes & Nei 1992; Jeffery & Bangham 2000). D’altro

canto va sottolineato che questo processo di aumento della variabilità può non

9

essere necessariamente un beneficio per le specie e può essere limitato dalla

necessità di eliminare i linfociti T che reagiscono contro combinazioni tra MHC e

peptidi di origine endogena (Wegner et al. 2003 b).

Numerosi studi sul polimorfismo dell’MHC sono stati condotti su mammiferi

ungulati e in particolare su bovini e ovini (Lewin et al. 1999), sulla capra (Takada et

al. 1998), sul cervo (Swarbrick et al. 1995), sull’alce (Mikko & Anderson 1995), sul

capriolo, la renna e il daino (Mikko et al. 1999). Tali studi hanno messo in evidenza

una significativa differenza tra specie e specie nei parametri di variabilità genetica.

In alcuni casi elevati valori di polimorfismo dell’MHC sono stati registrati anche

successivamente a significativi “colli di bottiglia” come quello causato dalla peste

bovina nel bufalo africano alla fine del XIX secolo (Wenink et al. 1998).

Studi sull’impatto della presenza di patogeni e in particolare degli agenti di

parassitosi sulla variabilità del complesso maggiore di istocompatibilità hanno

dimostrato che elevati livelli di polimorfismo possono essere correlati con la

capacità di difendersi dagli agenti patogeni (Hedrick 2002) e che popolazioni che

mostrano bassi livelli di polimorfismo genetico possono essere più suscettibili alle

malattie parassitari.

Per quanto riguarda il camoscio alpino (Rupicapra rupicapra rupicapra), studi

sulla variabilità genetica dell’MHC, principalmente concentrata nella regione del

gene denominata PBR (Peptide-Binding Region) hanno dimostrato alti livelli di

polimorfismo nel gene DRB (Schaschal et al. 2004, 2005, 2006; Alvarez-Busto et al.

2007; Mona et al. 2008). Tali alti livelli di polimorfismo erano inaspettati poiché

l’habitat alpino del camoscio dovrebbe fornire scarsità d’infezioni parassitarie, per

le condizioni climatiche avverse, per i periodi più brevi a disposizione degli stadi

infettivi dei patogeni, e per una generalizzata diminuzione della biodiversità. La

storia demografica di questa specie, caratterizzata da elevata frammentazione degli

habitat frequentati e le forti riduzioni della popolazione dovuta alle infestazioni di

10

rogna sarcoptica (Rossi et al. 1995) avrebbero dovuto, inoltre, influenzare

negativamente i livelli di variabilità genetica delle popolazioni di camoscio.

1.2 Il Complesso Maggiore di Istocompatibilità

Il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) è stato identificato

inizialmente attraverso il suo ruolo nel rigetto dei trapianti. La capacità di

distinguere il sé dal non-sé è una caratteristica protettiva di quasi tutti gli organismi

multicellulari; questa capacità risponde ad una esigenza di preservazione

dell’individualità e, in generale, serve ad assicurare che i meccanismi di difesa siano

diretti verso microrganismi infettanti ed altre molecole estranee senza causare

danni ai tessuti dell’ospite.

Le strutture fondamentali dell’MHC sono proteine di superficie altamente

polimorfiche. Due sono le classi di molecole identificate nel sistema dei vertebrati,

codificate da un tratto di DNA di 2000-4000 Kilobasi. Si tratta di un gruppo di geni

strettamente connessi che costituiscono il più importante componente genetico

del sistema immunitario dei mammiferi (Klein 1986).

Le molecole di classe I, i classici “antigine da trapianto”, sono presenti sulla

superficie di tutte le cellule nucleate (Piertney & Oliver 2006) e sono coinvolte nel

riconoscimento delle cellule bersaglio da parte delle cellule T citotossiche. Le

cellule bersaglio possono essere sia cellule autologhe infettate da virus sia cellule

tumorali: le cellule T citotossiche riconoscono, sulla superficie di queste cellule, le

molecole di classe I autologhe in associazione con antigeni virali o agenti tumorali

(il sé modificato); nel caso di cellule di un trapianto, gli antigeni MHC estranei

espressi su queste cellule sono riconosciuti dalle cellule T citotossiche in quanto

non-sé (Klein 1986).

11

Un secondo gruppo di geni codificano per le molecole di classe II delle MHC. Le

molecole di classe II sono espresse principalmente sulle cellule che “presentano”

l’antigene (APC) e sui linfociti B. Le molecole di classe II hanno un ruolo

fondamentale nella “presentazione” dell’antigene ai linfociti T helper (Th) da parte

delle APC. Le cellule Th , infatti, riconoscono l’antigene solo se esposto sulla

superficie delle APC in associazione con le molecole di classe II delle MHC (Klein &

Horejsi 1997; Dengjel et al. 2005).

1.2.1 Struttura e funzione delle proteine delle MHC

Le molecole di classe I consistono di un eterodimero formato da una catena

pesante (43 kDa) legata, non covalentemente, ad una catena più piccola (11 kDa),

chiamata β2 microglobulina, monomorfica, codificata al di fuori delle MHC (fig. 1.1).

La catena pesante è organizzata in tre domini globulari esposti all’esterno ed è

ancorata alla membrana da un tratto idrofobico, terminando con un corto

segmento idrofilico C-terminale all’interno del citoplasma.

12

In base alla loro sequenza e

struttura cristallina queste molecole

si dividono in quattro domini: un

dominio N-terminale legante

peptidi, uno extra-cellulare simile a

quello dell’emoglobina, un dominio

trans-membrana e il dominio

citoplasmatico. Due di questi

domini (α1 e α2) formano una tasca

che può ospitare un peptide di 9−11

ΑΑ, che una volta legato viene

presentato alle cellule T; gli altri due

domini (α3 e β1) stabilizzano la

molecola e vengono detti “dominio

simil Ig”.

Figura 1.1 Strutture delle molecole MHC di classe I e II. Sono rappresentati i domini, la parte transmembranaria e le tasche di legame per il peptide antigene. Immagine tratta da: Abbas Lichtman, Fondamenti di Immunologia, Piccin.

Le molecole di classe II sono anch’esse glicoproteine transmembranarie, e

consistono di una catena alfa e di una catena beta di peso molecolare 34 e 28 kDa

rispettivamente. Sono costituite ciascuna da due domini globulari ed ancorate alla

membrana in modo analogo alle molecole di classe I. Anche per le molecole di

classe II ritroviamo i quattro domini: un dominio legante peptidi, formato dalle

catene α1 e β1, un dominio simil Ig formato dalle catene α2 e β2, un dominio

transmembrana e un dominio citoplasmatico.

13

Sia le molecole di classe I che quelle di classe II fungono da bersaglio per i

linfociti T, che regolano la risposta immunitaria. Gli antigeni espressi in associazione

all'MHC di classe I vengono riconosciuti dai linfociti T citotossici, anche detti linfociti

T CD8+ che vengono attivati agendo da effettori per la risposta immunitaria cellulo-

mediata, ossia risposte immunitarie specifiche, provocando la lisi delle cellule che

esprimono tali proteine. Queste ultime possono essere cellule tumorali o cellule in

cui stanno avvenendo processi di replicazione di virus. L'MHC di seconda classe sarà

riconosciuto invece dai recettori dei linfociti T helper, altrimenti detti linfociti T

CD4+, che rispondo alla stimolazione producendo citochine.

Le cellule T, in dettaglio, riconoscono gli antigeni nel contesto delle molecole

delle MHC, non riconoscono di fatto gli antigeni nella loro forma nativa, ma

piuttosto dei loro frammenti peptidici generati dalle APC. Le APC infatti, dopo aver

captato l’antigeni, lo internalizzano e lo sottopongono a proteolisi. Solo dopo aver

così modificato l’antigene, le APC ne espongono i frammenti in membrana,

associati alle molecole MHC. Ma come avviene l’interazione fra le molecole MHC

ed i frammenti dell’antigene derivati dalla proteolisi? La risposta a questa domanda

viene da due osservazioni sperimentali. Confrontando le sequenze aminoacidiche

di differenti forme alleliche delle molecole di classe I e classe II, si è osservato che

le variazioni alleliche non sono distribuite a caso e che i residui polimorfici sono

raggruppati in regioni particolari della molecola. Recentemente, inoltre, la

definizione della struttura tridimensionale per le molecola delle MHC di classe I e di

classe II, ha messo in evidenza il fatto che i residui aminoacidici variabili di queste

proteine sono disposti in una profonda tasca della molecola, mentre i residui

invarianti restano all’esterno. E’ ovvio che la posizione dei residui variabili

all’interno della tasca è strategica, perché determina la capacità delle molecole

delle MHC di formare un sito accettore per i frammenti peptidici originati dalla

degradazione dell’antigene (Fig. 1.2).

http://it.wikipedia.org/wiki/Risposta_immunitaria

14

Figura 1.3 Le molecole di classe II, insieme al peptide a esse associato, vengono riconosciute dal TCR. La parte invariante della molecola MHC è legata invece dalla molecola CD4.

Figura 1.4 Le molecole di classe I, insieme al peptide ad esse associato, vengono riconosciute dal TCR. La parte invariante della molecola MHC è legata invece dalla molecola CD8.

Il riconoscimento dell’antigene, quindi, da parte dei linfociti T avviene

attraverso un recettore che riconosce il complesso dell’antigene alloggiato in un

sito formato dalla parte polimorfica delle molecole MHC. Questi siti polimorfici si

Fig. 1.2 La tasca di legame per l’antigene è formata solo dalla catena α nella classe I e dalle catene α e β nella classe II. La classe I può alloggiare peptidi di 8-11 aa, mentre la classe II può alloggiare peptidi di 10-30 aa. Il legame è possibile se pochi requisiti strutturali vengono soddisfatti. Immagine tratta da: Abbas Lichtman, Fondamenti di Immunologia, Piccin.

15

trovano nella parte N-terminale delle catene alfa e beta delle molecole di classe II

(Fig. 1.3) e nei domini α1 e α2 delle molecole d classe I (Fig. 1.4).

Le molecole CD4 e CD8 hanno struttura invariabile ed interagiscono con parti

invarianti delle molecole MHC, stabilizzando l’interazione TCR con il complesso Ag-

MHC.

Nella figura seguente vengono sintetizzate le modalità di azione delle molecole

di classe I e di classe II delle MHC.

Figura 1.5 Rappresentazione schematica dei meccanismi di azione delle molecole di classe I e classe II delle MHC. Vie di ingresso degli antigeni nella cellula e vie di processamento.

In merito ai geni codificanti per le molecole di classe II, molte ricerche in

mammiferi si sono concentrate sul secondo esone codificante le porzioni funzionali

dei siti di legame dell’antigene (Peptide Binding Region, PBR)(Ohta 1998). I patterns

osservati per i loci DRB codificanti per la regione PBR, comunque, sono in generale

dei buoni indicatori della variabilità genetica delle MHC costituendo uno dei loci

polimorfici più conosciuti nei vertebrati (Hedrick 1994; Huges & Huges 1995). La

16

variabilità delle molecole delle MHC è correlata con la diversità dei recettori dei

linfociti T che determinano la resistenza a malattie o parassitosi di un organismo ed

in conclusione potrebbe influenzare a lungo termine la probabilità di sopravvivenza

di una popolazione (Paterson et al. 1998; Hedrick et al. 2001 a, b; Langefors et al.

2001).

1.2.2 L’organizzazione genetica delle MHC

L’elevato polimorfismo ritrovato nelle MHC di classe II si concentra

principalmente nell’esone 2, che codifica per il β1-dominio del sito di legame

dell’antigene, PBR. In alcune specie di ruminanti ungulati come bovini (Bos taurus)

ed ovini (Ovis aries) sono stati caratterizzati i seguenti geni delle MHC di classe II:

DRA, DRB, DQA e DQB. Nei bovini la regione DR comprende 3 geni DRB ed un gene

DRA (Lewin et al. 1999). Tra i tre loci DRB, il DRB3 viene espresso maggiormente

rispetto agli altri loci e mostra un maggiore polimorfismo. Più di 100 DRB3 alleli

sono ad oggi conosciuti nei bovini (Bola Committee, Web site:

http://www.projects.roslin.ac.uk/bola/DRBtab.html).

Negli ovini l’organizzazione delle MHC di classe II è similare a quella dei bovini,

con la differenza che il locus maggiormente polimorfico è il DRB1 (Dutia et al. 1994;

Schwaiger et al. 1996). Altri studi confermano l’elevato polimorfismo del locus DRB

in Capra aegagrus e Capra hircus (Schwaiger et al. 1993; Takada et al. 1998), Ovis

canadensis (Gutierrez-Espeleta et al. 2001), nel cervo Odocoileus virginianus (Van

der Bussche et al. 1999) e Cervus elaphus (Swarbrick et al. 1995). D’altra parte,

Mikko & Andersson (1995) e Ellengren et al. (1996) rilevarono un basso livello di

variabilità genetica in corrispondenza dei medesimi loci, in Alces alces del Nord

America e del Nord Europa. Inoltre, una limitata diversità nel DRB locus è stata

anche riscontrata in Capreulus capreulus e Rangifer tarandus della Norvegia e della

Svezia, ed in Ovibos moschatus e Cervus doma in cui questo locus è monomorfico

(Mikko et al. 1999). Nel bufalo africano (Syncerus caffer), infine, è stato rilevato una

http://www.projects.roslin.ac.uk/bola/DRBtab.html

17

elevata variabilità genetica del locus DRB3 a dispetto degli abbattimenti causati da

una epidemia di peste scoppiata alla fine del XIX secolo (Wenink et al. 1998). La

stessa Ovis canadensis ha mostrato un aumento dei livelli di polimorfismo in

corrispondenza di un declino della popolazione provocato principalmente da una

epidemia trasmessa dai bovini (Gutierrez-Espeleta et al. 2001).

Per quanto riguarda il camoscio alpino (Rupicapra rupicapra rupicapra), studi

sulla variabilità genetica delle MHC, principalmente concentrata nella regione del

gene PBR (Peptide-Binding Region) hanno dimostrato alti livelli di polimorfismo nel

gene DRB (Schaschl et al. 2004, 2006). Tali alti livelli di polimorfismo erano

inaspettati poiché l’habitat alpino del camoscio dovrebbe fornire scarsità

d’infezioni parassitarie, per le condizioni climatiche avverse, per i periodi più brevi a

disposizione degli stadi infettivi dei patogeni, e per una generalizzata diminuzione

della biodiversità. La storia demografica di questa specie, caratterizzata da elevata

frammentazione degli habitat frequentati e le forti riduzioni della popolazione

dovuta alle infezioni di rogna sarcoptica (Rossi et al. 1995) avrebbero dovuto,

inoltre, influenzare negativamente la variabilità genetica delle popolazioni di

camoscio.

1.2.3 Il polimorfismo delle MHC

Uno degli aspetti peculiari del complesso MHC è il suo incredibile polimorfismo

(Robinson et al. 2003), mostrando in confronto con altri loci una poco comune alta

variabilità nel numero di alleli ed elevata variabilità nucleotidica (Parham & Ohta

1996). Considerando la funzione dei prodotti genici delle MHC, è facile immaginare

una buona ragione per spiegare il vantaggio del polimorfismo di questo locus. Gli

antigeni sono visti nel contesto dei prodotti genici delle MHC, ed antigeni diversi

interagiscono in modo efficace con alcune, ma non tutte, le proteine delle MHC.

L’esteso polimorfismo dei geni MHC garantisce una più alta probabilità che un

individuo possa esprimere almeno una proteina MHC in grado di interagire bene

18

con un dato antigene, rendendo il soggetto responsivo a quella sostanza. A livello di

popolazione, il polimorfismo aumenta fortemente la probabilità che almeno alcuni

individui della popolazione sopravvivano in caso di improvvisa “entrata in scena” di

un nuovo antigene, per esempio un virus o un parassita mortale.

L’elevata variabilità, è stato visto concentrarsi in una zona ben definita delle

MHC che corrisponderebbe al sito di legame dell’antigene che mostra alti livelli di

varianti non solo per quanto concerne il numero degli alleli codificanti coinvolti ma

anche per l’estensione delle sequenze varianti degli alleli stessi (Huges & Yeager

1998). Secondo l’ipotesi nulla, si è dimostrato che la velocità delle sostituzioni

sinonime dei nucleotidi (ds) è più alta (ds>dn) della velocità delle sostituzioni non-

sinonime (dn) perché le sostituzione non sinonime variano la composizione degli

aminoacidi delle proteine provocando cambiamenti deleteri (Hughes & Nei 1988,

1989); molti studi, comunque, dimostrano che il sito di legame dell’antigene

peptidico (PBR) mostra più sostituzioni non sinonime che sostituzioni sinonime

(dn>ds) (Brown et al. 1988, 1993). Questo non può essere spiegato da una più

elevata velocità di mutazione in questa specifica regione (Huges & Yeager 1998;

Brown et al. 1988, 1993). Un ruolo fondamentale nell’arrangiamento della

variabilità nucleotidica a livello dei geni delle MHC è svolto dall’azione della

selezione bilanciante che favorisce positivamente la diversificazione dei loci

(Hughes & Nei 1988, 1989; Bergstrom & Gyllensten 1995; Bernatchez & Landry

2003). La selezione bilanciante non agisce solo nel mantenere un elevato numero di

alleli nelle popolazioni ma opera anche nella persistenza della diversità allelica in

periodi estremamente lunghi relativamente alla variazione genetica neutrale

(Richman 2000), definita come “evoluzione trans-specifica del polimorfismo” (Klein

1986). La conseguente alterazione del PBR assicura il “processamento” di diversi

tipi di antigeni (Brown et al. 1988, 1993; Janeway & Travers 2002).

Il mantenimento del polimorfismo intra popolazione dipende dal risultato

dell’intensità di selezione, dalla velocità di mutazione e dalla grandezza della

19

popolazione stessa (Huges & Yagger 1998). In determinate circostanze la forza della

selezione operante sugli alleli delle MHC può risultare insufficiente a mantenere la

variazione quando la popolazione è troppo piccola numericamente o troppo

frammentata (Sommer 2005). La ricombinazione intragenica sembra essere uno

dei meccanismi più importanti deputati a sostenere la variabilità genomica delle

MHC (Gyllensten et al. 1991; Andersson & Mikko 1995; Bergstrom et al. 1998;

Richman et al. 2003; Schaschl 2006). L’abilità di una popolazione naturale di

mantenere la variabilità genetica in geni funzionali dipende dalle pressioni selettive

coinvolte. La selezione bilanciante contrasta gli effetti della deriva genetica e

ritarda la fissazione di alleli

1.2.4 I meccanismi di selezione

I due principali meccanismi della selezione bilanciante (ipotesi del vantaggio

dell’eterozigote e selezione frequenza-dipendente) sono stati considerati i maggiori

responsabili degli alti livelli di polimorfismo delle MHC nell’uomo e nei vertebrati

(Hedrick 1994, 1999; Jeffery & Bergham 2000; Richman 2000; Miller et al. 2001;

Penn 2002; Bernatchez & Landry 2003).

La selezione naturale, in generale, opera attraverso due meccanismi favorendo

gli eterozigoti o gli alleli rari; gli individui eterozigoti sarebbero favoriti perché sono

in grado di far fronte a un numero più grande di antigeni. Alternativamente se gli

alleli sono vantaggiosi per il portatore quando sono rari, in quanto i patogeni sono

selezionati per sfuggire al maggior numero di alleli MHC, la variabilità genetica è

mantenuta in un tipico ciclo di coevoluzione ospite-parassita.

In particolare, nel valutare il potenziale evolutivo dei meccanismi del vantaggio

dell’eterozigote bisogna fare una differenziazione tra dominanza (vantaggio

dell’eterozigote in senso stretto) e sovradominanza (superiorità dell’eterozigote). Il

termine dominanza si riferisce al fatto che alla eterozigosi è associata la resistenza

20

a malattie per esempio, ma di fatto possono mascherare alleli suscettibili recessivi.

La sovradominanza, invece, è il tipico meccanismo che promuove la variabilità delle

MHC (Penn 2002; Penn et al. 2002). In questo caso, infatti, gli eterozigoti mostrano

una maggiore fitness rispetto ai parenti omozigoti, poiché posseggono una

maggiore varietà di MHC capaci di rispondere ad un ampio range di antigeni

(Hughes & Nei 1989; Takahata & Nei 1990).

Il secondo meccanismo, selezione frequenza-dipendente, si realizza quando un

allele o genotipo è favorevole o meno se portato con una certa frequenza

(Takahata & Nei 1990; Clarke & Kirby 1966). Le dinamiche ospite-parassita possono

essere considerate come un ciclo coevolutivo. I patogeni si adattano ad infettare i

più comuni genotipi ospiti, lasciando i genotipi ospiti rari non infettati (Lively &

Dybdahl 2000). Se gli alleli sono favoriti quando sono rari, ma contro selezionati

quando sono comuni, ne risulta un polimorfismo bilanciato. Gli alleli delle MHC che

forniscono la resistenza ad un maggior numero di parassiti conferiscono un

vantaggio dell’ospite, si trasmettono alla popolazione e divengono comuni. Questo

meccanismo aumenta la selezione dei parassiti capaci di evadere il riconoscimento

da parte di questi alleli comuni. Come la patogenicità dei parassiti varia, la fitness

relativa dei genotipi comuni dell’ospite diminuisce e crea un vantaggio selettivo in

favore degli alleli rari.

In più, meccanismi riproduttivi come la scelta del compagno disassortativa e le

interazioni materno-fetali potrebbero essere considerati come meccanismi

alternativi o complementari del mantenimento della diversità delle MHC (Potts &

Wakeland 1993; Edwards & Potts 1996; Penn & Potts 1999; Penn 2002; Penn &

Fisher 2004). La preferenza del compagno con maggiore variabilità delle MHC

favorirebbe: i. l’aumento della persistenza degli eterozigoti nella prole (Zuk 1990);

ii. promuovere figli con vari target di alleli delle MHC come protezione contro

patogeni che si adattano rapidamente ai genotipi parentali (Clarke & Kirby 1966;

Takahata & Nei 1990; Penn & Potts 1999); iii. sfavorire l’inbreeding o

21

l’incompatibilità genetica (Brown & Eklund 1994; Acevedo-Whitehouse et al. 2003);

iv. assicurare una diversità ottimale nella prole per rispondere alla resistenza del

parassita (Hedrick 2004).

1.3 Caratteristiche generali del camoscio

Il camoscio è un mammifero tipico degli ambienti montani che appartiene al

superordine degli Ungulati (il termine ungulato significa “provvisto di zoccolo”); la

sua classificazione completa è riportata in Tabella 1:

Camoscio alpino

Classificazione Caratteristiche generali

Phylum Cordati Parte terminale delle dita ricoperte da robuste unghie.

Subphylum Vertebrati Numero di dita pari.

Classe Mammalia Stomaco con quattro camere.

Superordine Ungulata Corna cave, non caduche, crescita annuale, presenza in entrambi i sessi.

Ordine Artiodactyla

Sottordine Ruminantia

Famiglia Bovidae

Sottofamiglia Caprinae

Tribù Rupicaprini Genere Rupicapra

Specie Rupicapra rupicapra rupicapra, Linnaeus, 1758

Tabella 1: Inquadramento tassonomico del camoscio delle Alpi.

A livello specifico, la tassonomia del camoscio ha subito recentemente alcune

revisioni, e ancora adesso non è del tutto chiara e condivisa dai diversi autori. Fino

alla metà degli anni ottanta si pensava che il genere possedesse un’unica specie

sulla base dei dati morfologici e dei reperti fossili (Lydekker 1913; Couturier 1938;

Dolan 1963). Questa specie era R. rupicapra, che era suddivisa in dieci sottospecie

sulla base delle aree geografiche di provenienza.

22

Negli anni seguenti furono condotte delle analisi più approfondite dei caratteri

morfologici (Lovari & Scala 1980; Lovari 1987; Masini & Lovari 1988), etologici

(Lovari 1985) e genetici (Nascetti et al. 1985) che portarono all’identificazione di

due specie: R. rupicapra distribuito in tutta l’Europa centro-orientale e suddiviso in

7 sottospecie (cartusiana, rupicapra, tatrica, carpatica, balcanica, asiatica e

caucasica) e R. pyrenaica localizzato solamente sulla catena dei Pirenei e in centro

Italia, e comprendente 3 sottospecie (parva, pyrenaica e ornata) (Fig. 1.7 a e b).

Queste distinzioni sono state recentemente confermate da studi basati su

marcatori genetici molecolari (microsatelliti, d-loop, ecc.). Negli ultimi anni si è

sviluppata l’idea, basandosi anche su dati genetici (Pérez et al. 2002), che l’alta

differenziazione morfologica riscontrata in R. pyrenaica ornata (il camoscio

d’Abruzzo) possa essere ricondotta ad uno status di nuova specie: il camoscio

Appenninico. Questa differenziazione potrebbe essere dovuta al forte isolamento

geografico che caratterizza questa popolazione del centro Italia da lungo tempo.

Agli stessi risultati arriva anche un lavoro recente che analizza delle popolazioni di

camoscio provenienti da diverse regioni europee, tra cui alcuni campioni di R.

pyrenaica ornata. Questo studio arriva alla conclusione che ci sarebbero tre linee

evolutive differenti nel genere Rupicapra: quella del camoscio nord-orientale,

quella sud-occidentale e una linea indipendente per R. pyrenaica ornata

(Crestanello 2002-2004).

Il camoscio alpino e quello dei Pirenei possiedono alcune caratteristiche

distintive:

il camoscio dei Pirenei ha dimensioni inferiori;

il mantello invernale ha una diversa colorazione. La macchia golare

chiara nella specie R. pyrenaica è nettamente più estesa, e arriva

fino al petto dell’animale; due bande scure la separano dalle parti

biancastre o isabelline poste ai lati del collo che scendono fino alle

23

spalle. Queste chiazze non sono presenti nel manto del camoscio

settentrionale così come quelle localizzate nella coscia.

la fontanella etmoidale, cioè quella parte di cranio compresa tra

l’osso frontale e l’osso mascellare, appare più lunga e

completamente suturata nella specie pyrenaica, mentre è più corta

e ancora aperta nella specie rupicapra. Inoltre la distanza tra le

corna alla base e le dimensioni medie del cranio sono più grandi in

rupicapra, mentre l’angolo tra le corna e il cranio é maggiore in

pyrenaica (le corna in questa specie sono inclinate all’indietro).

Le due specie hanno sviluppato nel corso dell’evoluzione moduli

comportamentali diversi, soprattutto nella sfera riproduttiva.

Se la suddivisione in due e probabilmente tre specie viene ormai accettata da

molti, c’è sicuramente più disaccordo sulla suddivisione nelle varie sottospecie,

visto anche che i caratteri morfologici non sono in grado da soli di differenziarle in

modo sicuro.

Figura 1.7 a Rupicapra rupicapra rupicapra (foto scaricata dal sito www.stelviopark.it/.../Bolzano/bz_04.htm

http://www.stelviopark.it/images/Depliant/Bolzano/bz_04.htm

24

Figura 1.7 b Rupicapra pyrenaica pyrenaica (foto di David Shackleton)

1.3.1 Origine ed evoluzione del camoscio

Per comprendere le differenze nella distribuzione attuale delle diverse specie di

camoscio, è necessario vedere quali sono le ipotesi sulla storia evolutiva della tribù

dei Rupicaprini. Uno dei possibili progenitori dei Rupicaprini si pensa possa essere

Pachigazzella grangeri, un genere comparso nel Pliocene in Cina, circa 5-7 milioni

di anni fa (Masini & Lovari 1988).

Dall’Asia centrale nel tardo Miocene (10 milioni di anni fa) i Rupicaprini si

sarebbero diffusi verso sud, est e nord-ovest sino ad occupare il loro attuale areale

distributivo. In particolare si ritiene che gli avi del camoscio si siano diffusi verso

occidente, a partire da una regione ad ovest dell’Himalaya, lungo le catene

montuose del sistema asiatico durante il Pleistocene medio (da 120.000 a 700.000

anni fa), approfittando delle glaciazioni per estendere l’areale distributivo verso

ovest (Fig.1.8).

25

In Europa, l’esistenza del camoscio durante la glaciazione del Riss (250-150 mila

anni fa) è suggerita da un unico reperto fossile, rinvenuto sui Pirenei francesi

(Caune de l’Arago) e attribuito alla forma pyrenaica.

A partire dalla glaciazione del Würm in avanti (tra 80.000 e i 12.000 anni fa) i

fossili di questo rupicaprino diventano comuni e confermano la distinzione già

esistente tra le specie rupicapra e pyrenaica. La specie pyrenaica si sarebbe evoluta

in Europa occidentale direttamente dai Rupicaprini immigranti nel medio

Pleistocene, durante la glaciazione del Riss, mentre rupicapra si sarebbe evoluta in

Europa orientale o in Asia Minore durante un periodo di isolamento interglaciale

(Lovari & Scala 1980).

Figura 1.8: Probabile radiazione dei Rupicaprini (da Lovari & Scala 1980).

Durante la glaciazione del Würm, i nuovi camosci di tipo rupicapra avrebbero

raggiunto, con una seconda ondata colonizzatrice, l’Europa centro-meridionale.

L’areale distributivo quindi sarebbe stato molto più ampio e continuo dell’attuale e

avrebbe compreso gran parte dell’Europa centrale e centro-meridionale, con la

specie pyrenaica già geograficamente diffusa nella penisola Iberica e negli

26

Appennini, e la specie rupicapra diffusa dal Caucaso all’arco alpino, fino alle Alpi

Apuane e, forse, agli Appennini settentrionali.

Alla fine della glaciazione del Würm (circa 12.000 anni fa), con l’innalzamento

della temperatura e i conseguenti cambiamenti ambientali, i camosci di tipo alpino

furono costretti a ritirarsi sui rilievi montuosi, l’areale della specie si frammentò ed

iniziarono così a differenziarsi le diverse sottospecie.

Questa è solo una delle teorie esistenti sulla differenziazione delle varie

sottospecie di Rupicapra. Una seconda ipotesi più semplice prevede che ci sia stato

un unico evento di colonizzazione durante la glaciazione del Riss (da 300.000 a

120.000 anni fa), che portò il camoscio ad invadere tutte le pianure dell’Europa

meridionale, le Alpi e i Pirenei. In seguito, durante periodi più caldi, ci sarebbe stato

il ritiro verso le cime delle principali catene montuose, dove si sarebbero suddivise

specie e sottospecie (Lovari & Scala 1980).

1.3.2 Distribuzione geografica

Il genere Rupicapra è attualmente presente nelle aree montane dell’Europa

occidentale, centrale e dell’Asia Minore, con una distribuzione disomogenea in

relazione ai principali rilievi montuosi, risultato della diffusione naturale e, in parte,

di immissioni effettuate dall’uomo (Figura 1.9). Il camoscio nord-orientale (R.

rupicapra) è naturalmente presente in tutte le regioni montane dell’Europa centro-

occidentale fino ai monti del Caucaso e alla Turchia (massiccio della Chartreuse,

Alpi, Alti e Bassi Tatra, Carpazi rumeni e penisola Balcanica, Bosnia, Montenegro,

Macedonia, Albania, Grecia e Bulgaria), mentre il camoscio dei Pirenei (R.

pyrenaica) è presente in modo discontinuo in alcune aree montane dell’Europa

sud-occidentale (Pirenei, Monti Cantabrici e Appennino meridionale).

27

Figura 1.9 Distribuzione europea del camoscio (in blu R. pyrenaica, in rosso R. rupicapra).

Elenchiamo brevemente la distribuzione delle sottospecie:

R. pyrenaica parva (Cabrera, 1911): presente in Spagna sui monti

cantatrici.

R. pyrenaica pyrenaica (Bonaparte, 1845): presente in Spagna e in

Francia sui Pirenei.

R. pyrenaica ornata (Neumann, 1899): presente in Italia in Abruzzo.

Composta attualmente da 350-400 individui, ora si trovano solo nel

Parco Nazionale d’Abruzzo, ma fino alla fine dell’Ottocento era

presente su tutto l’Appennino centrale.

R. rupicapra cartusiana (Couturier, 1938): presente in Francia nel

massiccio della Chartreuse. E’ a rischio d’estinzione a causa

dell’elevata diminuzione numerica.

R. rupicapra tatrica (Blahout, 1971): presente in Cecoslovacchia e

Polonia sui monti Tatra nei Carpazi occidentali.

28

R. rupicapra balcanica (Bolkay, 1925): presente nei monti della

Jugoslavia centro-meridionale, dell’Albania, della Grecia sulla

catena dei Balcani.

R. rupicapra carpatica (Couturier, 1938): presente nei Carpazi

orientali.

R. rupicapra caucasica (Lydekker, 1910): presente nel Caucaso.

R. rupicapra asiatica (Lydekker, 1908): presente sul Tauro,

Antitauro, Catena dei Monti Pontici.

R. rupicapra rupicapra (Linneo, 1758): presente nelle Alpi francesi,

italiane, svizzere, austriache, jugoslave settentrionali, bavaresi, del

Liechtenstein, nel Giura e introdotto nei Vosgi, nelle regioni

montuose dell’Elba e nella Foresta Nera. Questa sottospecie è la

più numerosa, con l’Italia al terzo posto preceduta da Austria e

Svizzera. In Italia questo camoscio è presente su tutto l’arco alpino

con concentrazioni maggiori nelle aree protette (Parco Nazionale

del Gran Paradiso, Parco Regionale Valdieri-Entracque, Parco

Nazionale dello Stelvio) e in Trentino Alto Adige (Mustoni et al.,

2003).

In Italia il camoscio alpino è uniformemente diffuso, anche se con densità

differenti, in tutte le regioni alpine, dal Friuli - Venezia Giulia (la distribuzione

appare continua nelle province di Pordenone e Udine e puntiforme in quella di

Trieste), Veneto, Trentino–Alto Adige, Lombardia, Piemonte, Valle d’Aosta, sino alla

Liguria (presente in Provincia di Imperia e sporadiche comparse in Provincia di

Savona). Le consistenze e le densità appaiono però estremamente eterogenee a

seconda della zona geografica considerata. L’estensione dell’areale distributivo

ammonta comunque a 41.130 Km2. Il camoscio era molto diffuso su tutto l’arco

alpino fino alla seconda metà del 1700; ebbe poi un notevole calo e, solo dopo la

Seconda Guerra Mondiale, si espanse nuovamente per raggiungere l’attuale

29

consistenza, ma si pensa che questo fenomeno di generale espansione non sia

ancora terminato. Al progressivo miglioramento dello status di questi animali ha

contribuito in maniera determinante la creazione di parchi e di altri istituti di

protezione che hanno favorito un più rapido incremento e stabilizzazione dei nuclei

presenti. Una raccolta e sintesi di informazioni sullo status del camoscio alpino é

stata condotta dal ”Istituto Nazionale per la Fauna Selvatica” che ha preso in

considerazione anche le popolazioni presenti all’interno delle aree protette e nelle

zone precluse all’attività venatoria.

Il numero di esemplari attualmente presente sull’arco alpino è pari a circa

137.000, con un incremento dell’11% rispetto a quanto rilevato nel 2000, dovuto

principalmente dalla crescita delle popolazioni nella parte occidentale dell’arco

alpino. La specie si distribuisce con densità (riferite all'estensione delle sole aree

ritenute idonee alla presenza del Camoscio per ciascuna provincia) comprese fra un

minimo di 1,3 capi/km2 in provincia di Brescia ed un massimo di oltre 10 capi/ km2

in provincia di Lecco.

Nei Parchi e nelle Aziende faunistico venatorie vivono circa 20.000 individui,

pari al 16% dell’intera popolazione italiana. Le consistenze più elevate si registrano

nelle province autonome di Trento e Bolzano e in Piemonte, nei cui territori risulta

al momento presente il 62% dei camosci alpini italiani. I contingenti più numerosi

sono presenti nelle province di Trento e Bolzano (23.000 ciascuna), Belluno, Cuneo,

Torino e Aosta (dai 9.000 ai 12.000) e Sondrio (8.500) (Mustoni et al. 2003).

1.3.3 Biologia del camoscio

Il camoscio è un animale che può arrivare al massimo ad un’età di 20 – 25 anni;

raramente però si raggiungono queste età, infatti le femmine raggiungono

generalmente i 15 – 18 anni e i maschi i 9 – 10 anni. Questo si deve alle difficili

condizioni di vita e, per quanto riguarda i maschi, ad un forte affaticamento nel

30

periodo riproduttivo che li rende più vulnerabili alle insidie invernali. Un altro

fattore che impedisce il raggiungimento da parte del camoscio di età elevate è

l’attività venatoria.

La struttura corporea del camoscio è compatta, con zampe lunghe e forti;

nonostante queste caratteristiche si presenta come un animale agile. Rispetto agli

altri ungulati, è un considerato di media taglia; in età adulta raggiunge pesi di 30–

45 Kg per il maschio e 25–35 Kg per la femmina.

Il mantello si presenta di colore variabile con la stagione, viene cambiato due

volte l’anno con due mute che avvengono in maniera graduale e lenta. Il manto

estivo ha una durata di circa tre mesi e mezzo. In autunno, si verifica la prima muta

che modifica, in previsione del freddo invernale, il colore e la lunghezza del pelo. Il

mantello invernale ha una durata di 8 mesi e mezzo. Con l’arrivo della primavera si

verifica la seconda muta che comporta la perdita dei lunghi e dritti peli scuri e dei

sottili peli di lana, che hanno contribuito all’isolamento dal freddo durante

l’inverno.

Le corna del camoscio sono presenti in entrambe i sessi e si presentano

uncinate e di color ebano. Le corna sono permanenti, a crescita continua;

raggiungono in genere i 22 –26 cm di altezza nei maschi e i 14 – 18 cm nelle

femmine.

Gli arti del camoscio hanno una struttura scheletrica ideale per lo scatto e per

la corsa.

La comunicazione sociale tra i camosci avviene mediante segnali di tipo visivo;

questo animale è dotato di una buona vista anche se non particolarmente acuta, la

visione binoculare (quella tridimensionale) sembra essere ristretta a un campo di

circa 45°. Il riconoscimento tra partner secondo le classi sociali, avviene grazie alla

31

valutazione visiva di alcune caratteristiche riguardanti il colore e la struttura del

corpo e della testa. Anche l’olfatto gioca un ruolo importante nelle interazioni

sociali e nella difesa dai predatori. L’udito è discreto e i padiglioni auricolari

estremamente mobili favoriscono la percezione dei suoni. Le femmine e i piccoli

emettono una specie di belato, mentre i maschi durante la stagione riproduttiva

emettono un suono rauco gutturale.

La vita di relazione del camoscio è influenzata in gran misura dal grado di

maturazione sociale dell’individuo. La struttura sociale di base è di tipo matriarcale

ed è fondata sul legame madre–piccolo, che si scioglie nel secondo anno di vita del

capretto.

Gli animali vengono distinti in capretti (fino al compimento di un anno), giovani

(maschi di 1-2 anni, femmine di un anno), subadulti (maschi di 3-4 anni, femmine di

2-3 anni), adulti (maschi di 5-9 anni, femmine di 4-11 anni) e anziani (maschi di 10 o

più anni e femmine con 12 o più anni). La maggior parte dei camosci vive in gruppi

di dimensioni e composizione variabili a seconda del periodo dell’anno e della zona

geografica.

Il periodo degli amori inizia a fine ottobre e si conclude a metà dicembre, con

un picco nell’attività riproduttiva tra il 20 e 30 novembre. Alcuni maschi, detti

territoriali, difendono piccole aree (diametro di 200-500 metri), da cui scacciano

tutti gli altri maschi adulti e subadulti e in cui tentano di mantenere un gruppo di

femmine mediante comportamenti di corteggiamento ritualizzati. I combattimenti

avvengono principalmente fra i giovani maschi vaganti verso la fine del periodo

degli amori, quando i maschi territoriali e dominanti si ritirano. Al termine della

stagione riproduttiva, che giunge circa a metà dicembre, gli animali si spostano

verso le zone di svernamento dove rimarranno fino alla primavera.

32

In figura 1.10 vediamo il ciclo vitale del camoscio. La gestazione dura circa 6

mesi (25-27 settimane). Il parto avviene in zone tranquille, localizzate su versanti

ripidi e scoscesi, quasi sempre al di sotto del limite degli alberi, dove minimi

risultano il disturbo ed il possibile impatto dei predatori. Tra il 10 maggio e il 10

giugno le femmine partoriscono 1, al massimo 2 (anche se raramente) piccoli.

L’allattamento si protrae con regolarità per 2-3 mesi (sino a 6), ma già a 20-30

giorni il capretto comincia a brucare. Il capretto è in grado di seguire la madre

immediatamente dopo il parto.

Figura 1.10 Rappresentazione schematica del ciclo biologico annuale del camoscio

1.3.4 Una malattia parassitaria: la rogna sarcoptica

La rogna o meglio “Le rogne” sono malattie parassitarie sostenute da acari che

colpiscono la maggior parte degli esseri viventi, compresi i rettili e gli uccelli, anche

se, per l’aspetto clinico, di “rogna vera e propria” si può parlare solo quando sono

coinvolti gli acari del genere Sarcoptes, che colpiscono essenzialmente i mammiferi,

compreso l’uomo.

33

Questo genere, infatti, visibile solamente al microscopio ottico, a differenza di

altri che vivono esclusivamente sulla superficie cutanea dell’ospite nutrendosi di

annessi epidermici (penne o pelo) senza creare evidenti lesioni alla pelle, penetra

nello spessore dell’epidermide infilandosi nei canalicoli delle ghiandole sebacee.

Il passaggio degli acari da un animale all’altro della stessa specie avviene per

contatto diretto, che si realizza attraverso le cure parentali, gli accoppiamenti e le

relazioni sociali o più raramente per via indiretta, attraverso la frequentazione di

luoghi comuni contaminati, quali saline e giacigli dove l’acaro può sopravvivere

pochi giorni, in funzione delle condizioni ambientali che trova. Questa seconda

modalità spiega inoltre, la trasmissione tra alcune specie diverse, com’è avvenuto

inizialmente per la rogna del camoscio che ha colpito pesantemente anche lo

stambecco e la capra selvatica. Va comunque precisato che gli acari della rogna

sono essenzialmente specie-specifici, in quanto l’acaro che colpisce il camoscio,

Sarcoptes scabiei var. rupicaprae non può colpire il cinghiale e la volpe, che

vengono parassitati rispettivamente da Sarcoptes scabiei var. suis e Sarcoptes

scabiei var. canis.

Questo dato, supportato da lavori di ricerca scientifica, esclude in maniera

pressochè certa, la possibilità che la volpe possa fungere da serbatoio o

trasmettere la malattia agli ungulati.

I sintomi nel camoscio (lo stambecco presenta un decorso diverso) si

manifestano entro poco tempo dal contagio, da qualche giorno a tre settimane; al

prurito sempre più intenso, gli animali rispondono con evidente nervosismo e

grattamento incoercibile, strofinandosi su qualsiasi superficie ruvida a disposizione.

Successivamente, compaiono l’alopecia (perdita di peli, non sempre visibile) e

lesioni crostose screpolate e maleodoranti (odore di grasso rancido) a partire dal

muso e dal collo in estensione a tutto il corpo.

34

In questa seconda fase, si manifestano lesioni dermatologiche secondarie a

infezioni microbiche, un calo delle difese immunitarie e un conseguente cambio del

comportamento, che porta l’animale ad isolarsi, ad abbassarsi di quota e a perdere

l’appetito, fino a giungere a morte entro 2-4 mesi dal primo contagio.

a b c

Figura 1.11 Camoscio colpito da rogna sarcoptica (a e b foto di Moma Marzio, c di Luca Rossi)

Non tutti però muoiono, alcuni individui (circa il 10%), dotati di resistenza

genetica all’infezione, riescono a superare la malattia andando incontro a

guarigione spontanea, anche se la risposta immunitaria, seppur presente, non

genera nell’animale sufficiente protezione. Nel caso in cui una popolazione vergine

e numericamente consistente di camosci venga parassitata da questo acaro,

(decorso acuto) la mortalità potrà raggiungere valori molto alti (75 – 90%), come

avvenne in alcune zone del tarvisiano negli anni ’90, e si arresterà solamente

quando la densità della popolazione si aggirerà intorno a 1,5 capi/100 ha (soglia

35

dell’estinzione dell’ospite), esaurendosi in genere in 5-7 anni, spontaneamente. La

malattia, una volta divenuta endemica, acquisisce carattere ciclico e tende a

ripresentarsi ogni 7 -12 anni con virulenza via via sempre più attenuata e tassi di

mortalità sempre più ridotti, che si attestano intorno al 10 - 15%.

La specie Sarcoptes scabiei è divisa in varietà indistinguibili morfologicamente

ma che hanno però un alto grado di specificità verso l’ospite (Berrilli et al. 2002).

Non esiste una vera e propria tassonomia tra i vari tipi di acaro che infettano diversi

ospiti, ma vengono identificate diverse varianti per la specie che infettano in

maniera predominante. Ad esempio, l’acaro che infetta il camoscio viene detto S.

scaibei var. rupicaprae (Pence & Ueckermann 2002).

L’acaro Sarcoptes scabiei (Fig. 1.12) possiede quattro paia di zampe, e riesce ad

invadere gli strati più superficiali dell’epidermide, formando gallerie che si

estendono a volte fino allo strato granuloso e che appaiono in rilievo e grigi per le

feci del parassita che vi si accumulano. Le femmine a temperature superiori ai 20-

25 °C sono particolarmente mobili e sono quindi capaci di penetrare

nell’epidermide in appena 20 minuti, per una profondità di 2,5-3 cm.

L’accoppiamento avviene in superficie; il maschio muore subito dopo senza

penetrare nel derma, le femmine fecondate restano in superficie fino a quando le

uova sono quasi mature. Ciascuna femmina depone dalle due alle quattro uova al

giorno. Dopo circa sette giorni fuoriescono le larve (larve d’acaro); queste ultime

subiscono tre mute prima di trasformarsi in elementi adulti, capaci di accoppiarsi

ed iniziare così di nuovo la deposizione delle uova. Il ciclo vitale è di 6 settimane

(De Carneri 1997). Gli acari sopravvivono per poco tempo al di fuori dell’ospite

naturale; la trasmissione avviene per contatto diretto da animale infettato ad

animale sano, oppure per contatto indiretto in quanto i parassiti possono vivere

per un certo periodo di tempo fuori dai loro ospiti, magari nei luoghi di riposo

(Pence & Ueckermann 2002).

36

Figura 1.12 Femmina di Sarcoptes scabiei e sezione di derma di animale colpito da rogna sarcoptica

La rogna sarcoptica nei camosci delle Alpi venne descritta in letteratura, per la

prima volta, in Austria e nelle Alpi Bavaresi all’inizio del XIX secolo. La malattia si

diffuse più tardi nelle regioni più a sud dell’Austria e dal 1949 raggiunse le Alpi

orientali italiane (Alpi Carniche in Provincia di Udine). Da qui si sviluppò poi, sia

verso est che verso ovest lungo tutte l’arco alpino.

Il primo evento epizootico successivo a quello avvenuto nelle Alpi Carniche si

ebbe nel Sud Tirolo (Provincia di Bolzano) nel 1976 (Gagliardi et al. 1985); la

malattia colpì molto duramente le popolazioni di camoscio e stambecco presenti a

nord del fiume Rienza. Dopo quattro anni, nel 1980, il secondo evento di diffusione

della malattia partì dalla Slovenia e colpì le Alpi Giulie, in Provincia di Udine (Rodolfi

1990; Rossi et al. 1995).

L’epidemia di rogna che ha interessato e sta tuttora colpendo la Provincia di

Belluno è iniziata nel 1995, facendo registrare i primi casi in Val Cengia e Val

Marzòn, a sud delle Tre Cime di Lavaredo (Dolomiti di Sesto). Due anni dopo la

37

malattia si allargò anche verso nord colpendo la Provincia di Bolzano. In seguito,

tutte le Dolomiti bellunesi, dove erano presenti grandi popolazioni di camoscio,

vennero colpite, e nel 2001 la malattia raggiunse anche la Provincia di Trento (Fig.

1.13). Finora, in 10 anni di malattia, sono stati registrati più di 1800 ce (Progetto

Rogna Sarcoptica, 2001-2005). L’evoluzione della malattia dal 1995 al 2005, anno

per anno, è riportata nell’Allegato 1.

Figura 1.13 In colore scuro l’area interessata dall’epidemia di rogna sarcoptica tra il 1976 e il 1996; in colore chiaro l’area colpita fino al 2005

1.3.5 Breve introduzione alla genetica della conservazione

La genetica della conservazione è una disciplina delineatasi all’inizio degli anni

’80 (Schonewald-Cox et al. 1983; Falk & Holsinger 1991; Ellstrand & Elam 1993) e

consiste nell’applicazione delle tecniche genetiche molecolari e della genetica delle

popolazioni per aiutare la gestione e la conservazione della specie come entità

dinamiche capaci di sopravvivere e far fronte ai cambiamenti ambientali.

Comprende principalmente la gestione genetica di piccole popolazioni, la

risoluzione di incertezze tassonomiche, la definizione di un’unità all’interno delle

38

specie e la comprensione della biologia e dell’evoluzione delle specie (Frankham et

al. 2004).

Scendendo più nel particolare questa disciplina si occupa di:

Ridurre il rischio di estinzione minimizzando l’inbreeding

(accoppiamento di consanguinei) che porterebbe alla diminuzione

della fecondità e della sopravvivenza (inbreeding depression);

Studiare la perdita di diversità genetica e quindi dell’abilità ad

evolvere in risposta ai cambiamenti ambientali;

Studiare la frammentazione delle popolazioni e la riduzione del

flusso genico, processi che generalmente aumentano il rischio di

estinzione;

Considerare l’adattamento genetico alla cattività e i suoi effetti

avversi sul successo delle reintroduzioni;

Utilizzare le analisi genetiche molecolari in studi forensi soprattutto

per identificare il bracconaggio ed il commercio di specie protette.

Nell’ultimo secolo, i cambiamenti ambientali associati alle trasformazioni sociali

ed economiche hanno causato distruzione, degradazione e frammentazione di una

gran parte degli habitat naturali. Come conseguenza, i tassi di estinzione sono

destinati ad aumentare considerevolmente. La durata media della vita di una

specie animale nei record fossili, dall’origine all’estinzione, è di circa 1-10 milioni di

anni; per uccelli e mammiferi il tasso di estinzione documentato nel secolo passato

corrisponde alla durata della vita di una specie di 10.000 anni e se il trend continua

diventerà 200-400 anni (Frankham et al. 2004). I piani di conservazione operano a

molti livelli, partendo dagli interi ecosistemi e comunità fino al livello di singoli

individui; ad ognuno di questi livelli le tecniche di genetica molecolare possono

essere utilizzate per valutare meglio i processi e per sviluppare nuove strategie.

39

Approcci di genetica molecolare sono molto utili, ad esempio per identificare

eventuali divisioni biogeografiche che esistono all’interno delle specie, e

proteggere separatamente i diversi gruppi. Inoltre, a livello di individuo le tecniche

di genetica molecolare possono essere usate per dedurre la discendenza in

popolazioni selvatiche e in cattività se vengono campionati tutti i potenziali genitori

e la loro prole. Anche in popolazioni per le quali sono disponibili poche

informazioni, si possono fare inferenze da dati genetici e molecolari riguardo alla

struttura di accoppiamento.

La quantità totale di DNA richiesto per le analisi molecolari può essere minima

e può provenire da peli, siero, pelle mutata, penne, feci, campioni di museo o

archeologici di pelle o osso; possono essere quindi usati metodi non invasivi, che

evitano di disturbare gli animali, essenziale precauzione quando si studiano specie

a rischio (Frankham et al. 2004).

1.3.6 L’importanza della genetica per la conservazione delle popolazioni di

camoscio

Sebbene il camoscio non sia una specie minacciata o in pericolo di estinzione è

comunque elencato nell’appendice n. 3 (1979) della Convenzione per la

Conservazione della Fauna Selvatica e degli Ambienti Naturali Europei, che implica

di seguire particolari misure di protezione per gestire le popolazioni. Il

miglioramento della politica di conservazione delle popolazioni di camoscio viene

riposta sull’identificazione di aree sensibili, e sulla definizione di eventuali strategie

di reintroduzione o traslocazioni di individui. Le popolazioni di camoscio sono in

gran parte soggette a prelievo venatorio e questo le rende una specie a cui

l’opinione pubblica è particolarmente sensibile. Quando inoltre, si presenta una

grave patologia come la rogna sarcoptica, entra in gioco il pericolo di estinzioni

locali e quindi nasce un interrogativo sulla corretta gestione venatoria da attuare.

40

Quindi per rispondere a questi programmi di conservazione è importante usare

anche approcci di genetica molecolare e lavorare a due livelli: la stima della

variabilità genetica delle popolazioni analizzate e relazioni genetiche tra queste

popolazioni, come già accennato nel paragrafo 1.3.1.

In questa tesi, per rispondere alle domande della genetica di conservazione del

camoscio, abbiamo affrontato lo studio di marcatori dei processi adattativi che

vede il complesso maggiore di istocompatibilità quale indicatore ottimale delle

risposte alle pressioni selettive patogeno mediate.

1.4 Obiettivi della ricerca

Questa tesi fa parte di un progetto di ricerca iniziato dal Parco Nazionale delle

Dolomiti Bellunesi che ha lo scopo di valutare la struttura e la variabilità genetica

delle popolazioni di camoscio alpino all’interno di questa area protetta. La presente

ricerca, si pone come obiettivo primario la comprensione delle dinamiche che

agiscono nel mantenimento di una elevata variabilità genetica, utilizzando markes

adattativi, quali il locus MHC, codificante per proteine coinvolte nella risposta

immunitaria. Inoltre, ci si pone lo scopo di cercare di comprendere, attraverso lo

studio dei meccanismi a favore della variabilità genetica, l’evoluzione delle MHC a

livello inter ed intra specifico del genere Rupicapra limitatamente alle specie di

camoscio alpino e pirenaico.

Obiettivi specifici sono pertanto quelli di (1) analizzare la variabilità genetica

nell’MHC di classe II in popolazioni di camoscio caratterizzati da diversa pressione

selettiva da parte di parassiti con diverso effetto patogeno quali gli acari agenti

eziologici della rogna sarcoptica (Sarcoptes scabiei); (2) utilizzare i dati ottenuti

come marcatori del differenziamento genetico tra le diverse popolazioni di

41

camoscio da località alpine diverse; (3) osservare la variabilità genetica tra

popolazioni di camoscio alpino e pirenaico soggette a parassitosi;

I campioni sono stati raccolti in modo da rappresentare meta-popolazioni 1)

provenienti da una zona dove non è nota la presenza di Sarcoptes; 2) affetti da

rogna sarcoptica, con effetto patogeno basso sulla popolazione di camosci e basse

percentuali di mortalità (meta-popolazioni resistenti); 3) pesantemente colpiti da

rogna sarcoptica, con significativo effetto patogeno sulla popolazione di camosci ed

elevate percentuali di mortalità (meta-popolazioni sensibili); 4) altamente sensibili,

ma attualmente in fase di ripresa numerica post-epidemia; in modo tale da poter

confrontare se effettivamente a livello genetico mutazioni abbiano indotto

resistenza a parassitosi del portatore aumentandone la fitness.

I risultati ottenuti sulle popolazioni di camoscio alpino prelevati dalla Provincia

di Belluno sono stati confrontati con i dati rilevati da popolazioni di camoscio alpino

provenienti dalla Provincia di Lecco e con popolazioni di camoscio pirenaico

provenienti dalla regione nord-orientale dei Pirenei spagnoli in modo da analizzare

l’evoluzione delle MHC a livello inter ed intra specifico.

43

MATERIALI E METODI

2.1 Campioni analizzati

I campioni delle Alpi Orientali sono stati raccolti grazie alla cooperazione

dei cacciatori e degli Agenti del Corpo Forestale dello Stato, sotto la supervisione

delle amministrazioni locali, come l’Ufficio Caccia e Pesca della Provincia di Belluno

ed il Parco Nazionale delle Dolomiti Bellunesi. La raccolta dei campioni è stata

gestita da una collaborazione tra l’Università degli Studi di Ferrara e l’Università

degli Studi di Torino.

I camosci provenienti dalla Provincia di Lecco sono stati reperiti grazie alla

collaborazione con il Prof. Paolo Lanfranchi dell’Università di Milano sempre in

accordo con i cacciatori e le autorità locali di gestione delle popolazioni di

camoscio.

Per quel che riguarda i campioni di camoscio pirenaico gli individui sono stati

prelevati dalle riserve di caccia nazionali e sono stati fatti pervenire dalla Spagna

grazie ad una collaborazione con il Prof. Jorge Ramon Lopez Olvera dell’Università

Autonoma di Barcellona.

Il numero complessivo di campioni analizzati è di 182.

I campioni provenienti dalla Provincia di Belluno sono stati prelevati durante

l’attività venatoria nelle riserve alpine di caccia. Interessante per questo lavoro è la

disponibilità di due gruppi di campioni che derivano dalla stessa riserva alpina di

caccia. Uno comprende campioni di camoscio prelevati nel 1997/98 e che

corrispondono ad animali trovati morti a causa dell’epidemia di rogna sarcoptica.

L’altro invece è costituito da animali cacciati durante la stagione venatoria del

44

2004/05, e quindi sono animali che hanno resistito all’epidemia oppure sono i figli

dei sopravvissuti.

I campioni provenienti dalla Provincia di Lecco sono stati prelevati durante la

stagione venatoria del 2004. Gli individui sono stati campionati prima e dopo un

evento epidemico di polmonite che ha pesantemente colpito le popolazioni di

camoscio di questa Provincia.

I camosci pirenaici, infine, sono stati prelevati tra il 1991 ed il 2009 durante

diverse stagioni venatorie. Gli individui sono risultati sani o affetti da diverse

patologie o da pestivirus.

La localizzazione geografica ed il numero di campioni delle varie popolazioni è

riportata nelle figure e nelle tabella seguenti. (Fig. 2.1a,b,c; Tab. 2a,b,c)

45

Figura 2.1a Localizzazione geografica dei siti di campionamento di Rupicapra r. rupicapra della Provincia di Belluno

46

Figura 2.1b Localizzazione geografica dei siti di campionamento di Rupicapra r. rupicapra della Provincia di Lecco

47

Figura 2.1c Localizzazione geografica dei siti di campionamento di Rupicapra p. pyrenaica della regione Dei Pirenei spagnoli

48

Derivazione Sigla Anno di

campionamento Malattia

Campioni analizzati

Provenienza

Auronzo di Cadore

AU97/98 Sito A

1997/98 Affetti da

rogna 25

Dolomiti di Sesto (Val Mazon)

Auronzo di

Cadore

AU

Sito B

2004/05

Individui sani

20

Dolomiti di Sesto,

Monte Cristallo

Calalzo di Cadore

CA

Sito C

2004/05

Individui sani

28

Marmarole

Livinallongo del

Col di Lana

Li

Sito D

2004

Alcuni

individui presentano lesioni da

rogna

11 Migogn

Rocca Pietore

RP Sito D

2004 Individui sani 2 Migogn

Totale Individui campionati 86

Tabella 2a Numero degli individui campionati di Rupicapra r. rupicapra della Provincia di Belluno



Campioni analizzati

Provenienza

Provincia di Lecco

SitoE

2004

Individui pre e post il crash epidemico

della polmonite

8 Pizzo Cavallo

SitoE 10 Val Marcia

SitoE 17 Campelli-Maesimo

SitoE 6 non

specificato


Tabella 2b Numero degli individui campionati di Rupicapra r. rupicapra della Provincia di Lecco

49



Campioni analizzati

Provenienza

Pirenei Spagnoli Sito 1 1991/2007

Pestivirus ed

altre patologie

17 Cadì, Cadì-Be

Pirenei Spagnoli Sito 2 2001/08

Pestivirus ed

altre patologie

21 APA, PN, Pallars,

Aran

Pirenei Spagnoli Sito 3 1996-2007/08

Individui sani,

affetti da pestivirus e/o da altre patologie

13 Freser

Pirenei Spagnoli Sito 4 2005 Affetti da Pestivirus

4 Cerdanya


Tabella 2c Numero degli individui campionati di camoscio pirenaico della Regione Pirenaica Spagnola nord-orientale

Per maggiori informazioni sui campioni, vedere l’allegato 2.

2.2 L’area di studio

2.2.1 La Provincia di Belluno

La Provincia di Belluno fa parte del Veneto, confina con la Provincia Autonoma

di Bolzano e con l’Austria a nord, le province di Udine e Pordenone ad est, la

Provincia di Treviso a sud, la Provincia di Vicenza e quella autonoma di Trento a

ovest. Con tutte queste entità, la Provincia condivide alcune delle popolazioni di

camoscio.

50

L’idrografia della Provincia è dominata dal fiume Piave, che forma l’omonima

valle, e da tutti i suoi affluenti. Questi creano delle vallate che sono dei fattori di

divisione per le popolazioni di camoscio che trovano difficile attraversarli. L’intera

Provincia è suddivisa in 68 riserve alpine di caccia, corrispondenti

fondamentalmente alla suddivisione politica del territorio in comuni.

Per quanto riguarda il camoscio, la distribuzione nel territorio varia molto,

poiché è una specie con particolari esigenze ecologiche e richiede particolari

caratteristiche ambientali rispetto agli altri ungulati. Il camoscio, infatti, è

distribuito nella parte alta della Provincia, dove l’ambiente è definito esalpico ed

endalpico, riferiti a temperature inferiori ai 13-14°C e a vegetazione di latifoglie e

conifere (Provincia di Belluno e Università di Padova, 2003). Qui, le popolazioni di

camoscio (Fig. 2.2 le varie unità di popolazione) sono demograficamente in declino

a causa dell’epidemia di rogna sarcoptica che le sta colpendo, mentre nel settore

meridionale della Provincia le popolazioni stanno aumentando come quantità di

individui. Le densità dell’ultimo censimento parlano di una media per riserva di 1-

30 capi/100 ha (Provincia di Belluno e Università di Padova, 2003). I campioni da

me analizzati derivano da quattro riserve alpine di caccia del nord della Provincia,

che sono:

Auronzo di Cadore: è la riserva più grande, confinante con la riserva di Calalzo

di Cadore, comprende le unità di popolazione della parte meridionale del gruppo

delle Dolomiti di Sesto, la parte orientale del gruppo del Monte Cristallo, e una

parte del Gruppo delle Marmarole. Da questa riserva sono stati forniti 21 campioni

di camoscio raccolti nella stagione venatoria 2004/05 (sigla AU), mentre sono stati

analizzati anche 26 campioni provenienti da questa riserva ma raccolti nel 1997/98

(sigla AU97/98), anni in cui l’epidemia di rogna sarcoptica ha colpito più duramente

questa zona (Tab. 2.a).

51

Calalzo di Cadore: comprende l’unità di popolazione del Gruppo delle

Marmarole, che condivide con la riserva di Auronzo di Cadore. Di questa riserva

sono stati analizzati 28 campioni di camoscio, 16 prelevati nel 2004 e 12 nel 2005 a

seguito dell’attività venatoria dei cacciatori attivi in questa zona (sigla CA).

Livinallongo del Col di Lana: è la riserva alpina confinante con Rocca Pietore, e

comprende le unità di popolazione del gruppo Fanes-Tofane, del gruppo del Sella e

quello del Viel del Pan-Migogn. Erano disponibili 10 campioni derivanti dall’attività

venatoria 2004 di questa riserva (sigla LI).

Rocca Pietore: è la riserva a confine con Livinallongo del Col di Lana, con cui

condivide le unità di popolazione del gruppo Viel del Pan-Migogn, oltre a

comprendere anche il Gruppo della Marmolada-Monzoni. Di questa riserva è stato

possibile analizzare solo 2 campioni (sigla RP).

Figura 2.2 Distribuzione delle unità di popolazione di camoscio tra le province di Belluno, Bolzano e Trento

52

2.2.2 La Provincia di Lecco

La Provincia di Lecco è situata nella Regione Lombardia e si estende attorno al

ramo orientale del lago di Como. Confina a nord con la Provincia di Sondrio, a nord-

ovest con la Provincia di Como, ad est con la Provincia di Bergamo ed a sud con la

Provincia di Monza-Brianza.

La Provincia di Lecco è quasi interamente collinare e montuosa, come

abbarbicata sulle ripide sponde del lago di Como.

L’aumento delle aree boscate ed arbustive, la riduzione delle aree pascolate ed

aperte di alta quota ha ridotto l’estensione dell’areale disponibile per il camoscio

nella Provincia, soprattutto per le zone a media vocazionalità. Di fatto, però, ad

oggi, la Provincia di Lecco sembra essere, rispetto a quanto rilevato nel 2000 dai

censimenti, la zona in cui la popolazione di camoscio ha la maggior densità

relativamente al suo areale di distribuzione dell’arco alpino (10 capi/Km2).

2.2.3 La Spagna pirenaica

I campioni pervenuti per il presente studio sono stati prelevati da aree incluse

nelle riserve di caccia del National Hunting Riserve dei Pirenei della Catalogna. Le

popolazioni presenti in queste aree sono state pesantemente colpite da epidemie

da pestivirus e da altri tipi di malattie che hanno causato pesanti crolli demografici

delle popolazioni colpite.

2.3 Il campionamento

Per quanto riguarda i camosci derivanti dalle riserve alpine di caccia, i campioni

sono stati raccolti dai cacciatori e dagli Agenti del Corpo Forestale dello Stato,

53

durante la normale attività venatoria ovvero trovati morti a seguito di infestazioni

da rogna sarcoptica. Nel momento in cui un cacciatore ha prelevato un animale, ha

tagliato un frammento di muscolo sottopelle, in genere dalla coscia, di circa 1 cm3 e

lo ha posto in una provetta eppendorf e lo ha conservato poi in congelatore a –20°.

Successivamente, al termine della stagione venatoria, secondo gli accordi presi con

l’Università di Torino e di Ferrara, i frammenti giunti negli Atenei sono stati divisi in

provette più piccole, messi in etanolo assoluto ed assicurato il mantenimento dei

campioni a lungo termine grazie ad un continuo ricambio di etanolo ogni 6 mesi. I

campioni da analizzare mi sono stati fatti pervenire per posta grazie alla

collaborazione con il Prof. Luca Rossi dell’Università di Torino. Una parte dei

campioni, identificati con la sigla AU97/98 sono stati prelevati personalmente dal

Prof. Luca Rossi da animali malati di rogna sarcoptica e trovati morti in Val Marzòn,

nella riserva alpina di caccia di Auronzo di Cadore. Qui si ebbe il primo focolaio

della malattia negli anni 1995/96.

I campioni provenienti dalla Provincia di Lecco, invece, sono stati prelevati

grazie ad una collaborazione con gli enti forestali locali e cacciatori da individui sani

o trovati morti a seguito di una epidemia di polmonite. Anche in questo caso i

campioni mi sono stati fatti pervenire grazie al coordinamento con il Prof. Luca

Rossi ed alla collaborazione con il Prof. Paolo Lanfranchi dell’Università di Milano.

I frammenti di pelle di camoscio pirenaico, sono giunti al Laboratorio di

Parassitologia del Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica della Sapienza

Università di Roma, a seguito di un accordo con il Prof. Jorge Ramon Lopez Olvera

dell’Università Autonoma di Barcellona. Si tratta sempre di frammenti cutanei di

individui cacciati e trovati sani o affetti da pestivirus o da altre parassitosi.

54

2.4 Caratterizzazione molecolare

Come già accennato, nello studio della variabilità genetica e nella genetica

della conservazione, si utilizza un approccio di tipo molecolare. Questo è reso

possibile da una tecnica ampiamente utilizzata in tutte le analisi di laboratorio, la

reazione polimerasica a catena (PCR, Mullis et al. 1986), che permette di copiare ed

amplificare specifiche sequenze di DNA scelto di una lunghezza massima di 1

kilobase. Per usare questo metodo è necessario conoscere la sequenza

fiancheggiante il tratto di DNA scelto che si sceglie di amplificare in quanto le due

sequenze (una all’estremità 5’ del filamento senso e una all’estremità 3’ del

filamento anti-senso) servono da stampo per costruire i primers, che sono degli

oligonucleotidi a singola catena su cui l’enzima deputato alla replicazione del DNA,

la polimerasi, si attacca per copiare il tratto di DNA scelto. La reazione consiste in

cicli ripetuti di denaturazione (DNA melting), appaiamento (DNA annealing) ed

estensione (DNA synthesis), caratterizzati da una specifica temperatura e durata.

Per far questo l’enzima DNA polimerasi ha bisogno di una certa quantità di

ossiribonucleotidi trifosfato (dNTP) e di un buffer di reazione specifico contenente

magnesio.

Reazioni di amplificazione

Per le singole reazioni di PCR sono state utilizzate provette da 200 µl; 4 µl di

DNA genomico di ogni esemplare, sono stati amplificati, ciascuno in 50 µl di volume

finale di reazione, contenente oltre il templato, i due oligonucleotidi che servono

da primers, e definiscono i punti d’inizio della sintesi di DNA, la DNA polimerasi,

Cloruro di Magnesio, un buffer di amplificazione ed infine i quattro nucleotidi

precursori, con le seguenti quantità:

30,5 µl di acqua distillata sterile.

55

5 µl di GeneAmp 10x PCR Buffer II (100mM Tris- HCl, pH 8.3, 500mM

KCl; Applied Biosystems)

5 µl di MgCl2, 25mM (Applied Biosystems)

4 µl della soluzione contenente NTP’s (dCTP, dGTP, dATP, dTTP)

ciascuno alla concentrazione di 2mM. Commercialmente (Promega)

ogni deossinucleoside trifosfato è disponibile in una soluzione

100mM con 10mM di Tris-HCl, pH7.5. Quindi, una volta diluiti, sono

stati suddivisi in aliquote da 500 µl in Eppendorf sterili e conservati a

–20°C;

0.3 µl di primer 1 (forward), 0.5 µM (MWG-Biotech)

0.3 µl di primer 2 (reverse), 0.5 µM (MWG-Biotech)

0.4 µl di AmpliTaq Gold polimerasi, 5U/ µl (Applied Biosystems)

Tutti i reagenti sono conservati a -20°C

2.4.1 Estrazione ed isolamento del DNA

L’estrazione del DNA è stata effettuata su campioni di diaframma e/o di cute

conservati in alcool al 70%. Dai campioni sopra citati sono state prelevate porzioni

della grandezza di circa un 1 cm3, le quali sono state sminuzzate con bisturi e

forbicine ed inserite in provette eppendorf sterili da 1.5 ml. Successivamente i

campioni sono stati posti in azoto liquido per alcuni secondi, per facilitare la rottura

delle membrane cellulari, ed omogeneizzati mediante pestelli sterili.

Wizard Genomic Dna-purification kit (PROMEGA)

Per ogni campione in esame è stato preparato un mix composto da 120 µl di

EDTA 0.5 M (pH 8.0) e 500 ml di Nuclei Lysis Solution in una provetta mantenuta in

ghiaccio per 5 minuti. Di questo mix sono stati prelevati 600 µl e aggiunti ad ogni

campione insieme a 17.5 µl di Proteinasi K 20 mg/ml. I campioni sono stati poi

56

incubati per tre ore a 55°C in un bagnetto termico. Dopo l'incubazione, 3 µl di

RNase Solution sono stati aggiunti al lisato nucleare, i campioni invertiti più volte,

sono stati posti per 30 minuti in una camera termica a 37°C. Dopo 5 minuti, utili per

riportare i campioni a temperature ambiente, sono stati aggiunti 200 µl di Protein

Precipitation Solution per consentire la precipitazione delle proteine e vortexando

vigorosamente ad alta velocità per 20 secondi. Le provette sono state mantenute in

ghiaccio per 5 minuti e sottoposte a centrifugazione per 4 minuti a 14000 giri. Le

proteine precipitate formano un pellet biancastro sul fondo delle provette. Il

surnatante contenente il DNA è stato accuratamente rimosso e trasferito in una

nuova eppendorf da 1.5 ml contenente 600 µl di isopropanolo a temperatura

ambiente. Invertendo delicatamente più volte le eppendorf compare una massa

visibile di DNA. Dopo una seconda centrifugazione a 14000 giri per 1 minuto, il DNA

decantato è riconoscibile come un piccolo pellet bianco. Eliminato il surnatante, al

pellet sono stati aggiunti 600 ml di etanolo al 70% e le provette agitate per

sciacquare il DNA. Dopo questa operazione è stato allontanato l'etanolo e l’eccesso

di alcool è stato fatto evaporare tenendo i tappi delle eppendorf aperti a

temperatura ambiente per circa 45 minuti. Infine il DNA è stato risospeso in 100 µl

di DNA Rehydration Solution ed incubato a 65°C per 1 ora (nel caso in cui si è voluti

procedere subito all’amplificazione del DNA), oppure reidratato incubando la

soluzione per una notte a temperatura ambiente o a +4°C. Il DNA è stato poi

conservato a -20°C.

2.4.2 Amplificazione dell’esone 2 delle MHC di classe II

La regione di nostro interesse è nel genoma nucleare, e in particolare si tratta

della regione dell’esone 2 del gene DRB che deve fungere da marcatore genetico

per studiare il livello di variabilità inter ed intra specifica in relazione a pressioni di

tipo parassitologico. L’amplificazione dell’esone 2 del gene DRB è stata effettuata

utilizzando due primers caratterizzati nei bovini e che hanno già dimostrato la loro

efficacia nel camoscio (Schaschal et al. 2004). Allo scopo, inoltre, di aumentare la

57

specificità dell’amplificazione, una PCR semi-nested con condizioni altamente

stringenti è stata messa a punto utilizzando un primer nested.

Condizioni di amplificazione

La sequenza di DNA dell’esone 2 del gene DRB è stata amplificata utilizzando la

macchina da PCR Perkin Elmer – Gene Amp PCR System 2400, con le seguenti

condizioni:

prima amplificazione - 10 minuti a 95°C (denaturazione iniziale, separazione

dei due filamenti del DNA stampo) seguiti da 10 cicli di 1 minuto a 95°C

(denaturazione completa del DNA), 1 minuto a 60°C (annealing, appaiamento dei

primers alle sequenze bersaglio sul filamento stampo), 1 minuto e 30 sec. a 72°C

(estensione dei primers da parte dalla polimerasi, quindi polimerizzazione), seguiti

da 6 min a 72°C (allungamento finale); primers utilizzati:

HL030 for- 5’-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3’ ,

HL031 rev- 5’-TTTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3’;

seconda amplificazione - 10 minuti a 95°C, seguiti da 25 cicli di 1 minuto a

95°C, 30 sec. a 65°C, 1 minuto a 72°C, seguiti da 10 min a 72°C; primers utilizzati:

HL030 for- 5’-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3’ ,

HL032 rev- 5’-TCGCCGCTGCACAGTGAAACTCTC-3’.

Elettroforesi su gel

Terminata la seconda reazione di amplificazione (Fig.2.3), i prodotti di

amplificazione di ciascun campione sono stati sottoposti a corsa elettroforetica su

gel d'agarosio. Il gel è stato ottenuto sciogliendo agarosio all'1% in tampone TBE

58

0.5X. A questa soluzione è stato aggiunto bromuro di etidio, 2 µl alla

concentrazione di 0,5 µg/ml. La miscela è stata versata in una vaschetta per

elettroforesi al cui apice è stato posto un pettinino con lo scopo di generare nel gel

dei pozzetti (in numero di 15). Si è atteso circa 1 ora per consentire la gelificazione

della soluzione. Rimosso il pettinino sono stati caricati nei pozzetti i prodotti di

amplificazione.

Figura 2.3 Risultato della seconda amplificazione visualizzato su gel di agarosio.

Il bromuro di etidio è il colorante più usato per la colorazione del DNA poiché si

intercala tra le coppie di basi nucleotidiche e quando il gel viene illuminato con luce

ultravioletta il bromuro fa in modo che le bande di DNA siano visibili, rendendole

fluorescenti.

Il DNA migra sul gel nel momento in cui viene applicata una differenza di

potenziale agli elettrodi dell' apparato di elettroforesi perché questa

macromolecola è carica negativamente e quindi migra verso il catodo con una

velocità inversamente proporzionale alle sue dimensioni; in questo modo si

separano i diversi frammenti. Dopo 20 min di corsa a 110V con macchina ESP 200 –

Pharmacia Biotech Electrophoresis Power Supplay, questi frammenti amplificati

500 pb

59

sono stati visualizzati esponendo il gel sotto la luce ultravioletta. Per l’osservazione

e la catalogazione delle immagini ottenute dall’esposizione alla luce ultravioletta è

stato usato il programma MULTI-ANALIST (versione 1.1-BIORAD).

Purificazione dei prodotti di PCR.

I prodotti di PCR sono stati preparati per il sequenziamento mediante

purificazione su colonna usando il kit Nucleo-spin extract 2 in 1 della MACHEREY-

NAGEL. Il buffer NT2 è stato aggiunto a 45 µl del prodotto di PCR e trasferiti nella

colonna di purificazione contenuta in un tubo da 2 ml. Mediante centrifugazione

per 1 minuto a 14000 giri il DNA viene trattenuto dalla colonna; è stato gettato via

il precipitato e, aggiunti 600 µl di buffer NT3 è stata effettuata una nuova

centrifuga di un minuto. Gettato via nuovamente il precipitato e aggiunti altri 200

µl di NT3 il DNA è stato sottoposto ad una nuova centrifuga per 2 minuti. A questo

punto per eliminare un possibile residuo di etanolo (contenuto nell' NT3), che

potrebbe inibire le seguenti reazioni, le provette sono state poste aperte, per 4

minuti, in bagnetto a 70°C in modo da fare evaporare l'etanolo. Dopo questo

tempo le colonne sono state trasferite in eppendorf da 1.5 ml , aggiunti 30

microlitri di elution buffer NE e dopo avere lasciato a temperatura ambiente per un

minuto, una nuova centrifuga di un minuto ha permesso la precipitazione del DNA

purificato.

Sequenziamento

I frammenti di PCR della regione in esame, purificati col metodo sopra

descritto, sono stati sequenziati dall'MWG-BIOTECH che mi hanno inoltrato in

formato elettronico i dati grezzi letti dal sequenziatore, che sono costituiti da 4

serie di picchi di fluorescenza parzialmente risolti, uno per ciascuna delle 4 basi.

Ciascun picco corrisponde al segnale emesso da un frammento di DNA che termina

con un ddNTP marcato con il fluorocromo. Un algoritmo di processamento del

60

segnale separa i singoli picchi, procede allo shift delle 4 serie di picchi l'uno rispetto

all'altro e attribuisce una base a ciascun picco. Si ottiene così un elettroferogramma

(Fig. 2.4) nel quale i diversi picchi sono colorati nel modo seguente:.

verde per una adenina (A);

rosso per una timida (T);

blu per una citosina (C);

nero per una guanina (G).

Figura 2.4 Elettroferogramma di una parte dell’esone 2 DRB MHC di classe II (le frecce rosse indicano gli individui eterozigoti

2.5 Analisi dei dati

2.5.1 Codifica delle sequenze

Le sequenze espresse dagli elettroferogrammi, trasformati in formati

compatibili con i programmi di analisi delle sequenze scelti, sono state allineate

utilizzando il programma CLUSTAL W v. 2.0 Multiple Sequence Allignments web

server (Larkin et al. 2007) usufruibile sul sito. Ottenuto l’allineamento si è reso

comunque necessario un controllo dettagliato degli elettroferogrammi utilizzando

il programma CHROMAS LITE V. 2.0 (Technelysium Pty Ltd, Australia), per correggere

gli errori risultati dal sequenziatore ed individuare i siti di eterozigosi. Lo scopo

61

dell'allineamento è di posizionare i nucleotidi che si ritengono omologhi nella

stessa colonna così da confrontare immediatamente le diverse sequenze ed

evidenziare i siti variabili (Fig. 2.4). Le sequenze in cui si è verificata la presenza di

picchi doppi, sono quelle in cui la sequenza dei due alleli non è conosciuta

("unphased genotype data”) e vengono determinate grazie all’aiuto delle

successive analisi.

2.5.2 Ricostruzione degli aplotipi con metodi statistici

Per determinare le sequenze degli aplotipi di ogni individuo eterozigote è stato

utilizzato il programma HAP (Haplotype Reconstruction using Phylogeny, Halperin

& Eskin 2004) che ipotizza un modello probabilistico per la ricostruzione degli

aplotipi. Il programma genera aplotipi doppi (diplotipi) per ogni filamento di DNA,

per cui si otterrà un numero doppio di sequenze rispetto agli individui analizzati.

Allineamento degli aplotipi ricostruiti e confronti con quelli in letteratura

Gli aplotipi ricostruiti con il software HAP (Halperin & Eskin 2004) sono stati

analizzati mediante DnaSP v. 5 (Librado & Rozas 2009) in modo da evidenziare

eventuali corrispondenze tra gli aplotipi trovati nelle popolazioni di camoscio alpino

e pirenaico, ma anche per evidenziare un eventuale variabilità genetica inter e tra

popolazioni di camoscio. DnaSP v. 5 quantifica il numero dei siti variabili e delle

mutazioni in corrispondenza del frammento di DNA analizzato, la diversità

nucleotidica ed aplotipica, la quantità in GC, la frequenza delle sostituzioni

sinonime e non sinonime.

Gli aplotipi una volta ricostruiti sono stati allineati con le sequenze presenti in

letteratura e pubblicate da Schaschal nel 2004, 2005 (Ruru-DRB*01 - 40 per quanto

riguarda il camoscio alpino e Rupy-DRB*01 – 13 per la specie Rupicapra pyrenaica).

Diversità genetica entro popolazioni

62

I classici parametri genetici di popolazione per la diversità genetica vengono

stimati per ogni popolazione usando il software ARLEQUIN v. 3.1 (Excoffier et al

2005). Questi parametri sono:

le frequenze alleliche

l’eterozigosità osservata (HO)

l’eterozigosità attesa (HE).

Diversità genetica tra popolazioni

1. Analisi basate sui dati genotipici degli individui. La differenziazione genetica

tra popolazioni è stata testata usando il “test esatto di differenziazione dei

campioni basato sulla frequenza allelica” (Raymond & Rousset 1995), integrato da

ARLEQUIN v. 3.1. È stato anche possibile calcolare l’indice di fissazione FST (Wright

1951) che quantifica la diversità delle popolazioni. Usando questo software FST è

stimato con un’analisi della varianza (Weir & Cockerham 1984).

FST indica la frazione della variabilità totale dovuta alle differenze tra le

popolazioni. Il valore di tale indice varia tra 0 ed 1: più tale valore si avvicina ad 1

più le popolazioni sono diverse tra loro.

FST è definito anche come la devianza standardizzata delle frequenze alleliche

delle popolazioni in esame dalla frequenza allelica media, che dovrebbe

rispecchiare la frequenza allelica della popolazione ancestrale da cui queste hanno

origine. FST misura quindi la correlazione tra coppie di geni omologhi all’interno

delle sottopopolazioni, in relazione a coppie di geni presi a caso dalla popolazione

totale.

2. Analisi basate sui dati aplotipici degli individui. L’analisi della varianza

molecolare (AMOVA) per definire la struttura genetica del campione è stata

condotta utilizzando il software ARLEQUIN v. 3.1. Per applicare questo tipo di

63

analisi è necessario strutturare gli individui da analizzare in popolazioni e gruppi di

ordine gerarchico superiore. Nel nostro caso sono stati applicati due criteri di

divisione: il primo criterio è stato quello geografico, ovvero si sono divisi i campioni

in due gruppi principali (camosci italiani appartenenti alla specie R. r. rupicapra e

camosci spagnoli appartenenti alla specie R. p. pyrenaica) e all’interno di ogni

gruppo è stata fatta un’ulteriore divisione in popolazioni a seconda della località di

provenienza; il secondo criterio di divisione è stato quello di considerare gruppi di

camosci sottoposti a pressione selettiva da patogeno. Gli individui delle popolazioni

di camosci spagnoli sono stati suddivisi in ndividui sani ed affetti da pestivirus e/o

da altre patologie, mentre gli individui delle popolazioni italiane sono stati suddivisi

in sani, morti per rogna sarcoptica, resistenti alla rogna perché individui

sopravvissuti ad un evento epidemico oppure perché appartenenti a popolazioni di

figli di individui precedentemente affetti, inoltre una ulteriore suddivisione è stata

fatta per le popolazione di camoscio alpino analizzati prima e dopo il crash

epidemico della polmonite.

Questo tipo di approccio gerarchico per l’analisi della varianza molecolare

consente di dividere la varianza totale in componenti di covarianza, dovute alle

differenze intra-individuali, intra-popolazione e inter-gruppi. Da un confronto tra

queste quantità è possibile stimare due componenti della varianza, che

rappresentano l’effetto della variabilità interna (varintra) e della suddivisione in

popolazioni (vartra). La percentuale di varianza interna alle popolazioni e tra le

popolazioni è quindi calcolata come:

% di varianza entro popolazioni = varintra / vartot

% di varianza tra popolazioni = vartra / vartot

64

Questo tipo di analisi essenzialmente è simile agli altri tipi di approcci basati

sull’analisi della varianza della frequenza genica, ma tiene in conto il numero delle

mutazioni fra gli aplotipi (Excoffier et al 2005).

La significatività degli indici di fissazione è valutata usando l’approccio di

permutazione non parametrica (1000 repliche).

Alberi Neighbor-Joining

Uno dei metodi classici per analizzare le relazioni tra popolazioni, espressa in

forma di matrici di distanze, è rappresentato dai cladogrammi o alberi. Si tratta di

un metodo descrittivo che permette di visualizzare i rapporti di somiglianza

esistenti e che rappresenta anche i successivi eventi di divergenza tra gruppi.

Utilizzando l’algoritmo di Neighbor-Joining (Saitou & Nei 1987) costruisce un

albero per gli alleli MHC (o per gli aplotipi) basato sulle sequenze nucleotidiche,

mediante l’utilizzo del programma MEGA v. 4.0 (Tamura et al. 2007). La robustezza

dell’albero NJ ottenuto è stata testata mediante una tecnica statistica di

ricampionamento casuale con rimpiazzo nota con il termine di bootstrap 1000

replicati. Gli aplotipi presenti in letteratura sono stati inclusi in questa analisi.

65

RISULTATI

La caratterizzazione genetica dell’esone 2 del gene DRB del complesso

maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II è stata eseguita su 182 campioni; le

sequenze ottenute sono state 86 per i campioni di camoscio alpino provenienti

dalla Provincia di Belluno ed esposti alla rogna sarcoptica, 41 provenienti dalla

Provincia di Lecco ed esposti alla polmonite e 55 campioni di camoscio pirenaico

provenienti dal versante spagnolo dei Pirenei orientali. I prodotti di amplificazione,

ottenuti utilizzando i primers HL030 ed HL031 ed il nested primer HL032, hanno

fornito un frammento costituito da circa 300 paia di basi, in cui è inclusa la regione

dell’esone 2 del DRB dell’MHC di classe II.

3.1 Polimorfismo dell’esone 2 delle MHC di classe locus DRB

Gli ampliconi, una volta sequenziati, sono stati allineati mediante CLUSTAL W,

implementato in MEGA v. 4.0. L’allineamento è stato effettuato separatamente per

le specie di camoscio analizzate. L’allineamento ottenuto (Allegato 3a e 3b),

modificato manualmente per migliorare l’omologia delle regioni meno conservate,

è costituito da sequenze complessivamente di 206 nucleotidi di lunghezza.

L’allineamento delle sequenze di R. r. rupicapra ha evidenziato 31 siti polimorfici

(vedi Fig. 3.1 a e b per l’allineamento dei soli siti variabili), mentre in R. pyrenaica è

stato possibile evidenziare 24 siti polimorfici. Negli allineamenti sono state

comprese anche le sequenze di camoscio, alpino e pirenaico, disponibili in

GenBank. Osservando le singole sequenze e i singoli elettroferogrammi è stato

possibile identificare, in corrispondenza dei siti polimorfici, dei picchi indicativi di

eterozigosi. Abbiamo, perciò, utilizzato i seguenti codici IUPAC per evidenziare i siti

eterozigoti: R (A/G), Y (C/T), M (A/C), S (C/G) e W (A/T).

66

111111 1111111111 1

11155578 8899012334 4445557889 9

7845628906 7907469013 5681463581 7

Ruru-DRB*01 CAGCGTGACT GTGGAACGAC ACGGCCAGGG C

Ruru-DRB*02 ......T... .......... ......G... .

Ruru-DRB*03 AC........ .......... GA..T..... .

Ruru-DRB*04 AG........ .....T.... GA..T...A. .

Ruru-DRB*05 .G......T. .....TT... GA..T...A. .

Ruru-DRB*06 .......... .....T.... GA..T...A. .

Ruru-DRB*07 .......... C....T.... ........A. .

Ruru-DRB*08 .......... .......... ........A. .

Ruru-DRB*09 .G...C..TA CC.A...... GA..T..A.. .

Ruru-DRB*10 .G......TA CC.A...... GA..T...A. .

Ruru-DRB*11 AG.....GTA CCCAG....G GAC....AC. .

Ruru-DRB*12 AG......TA CC.A.....G GAA....ACA .

Ruru-DRB*13 AG......TA CC.A.....G GA.....AC. .

Ruru-DRB*14 AG..A...TA CG.A.....G GA.C...AC. .

Ruru-DRB*15 ........TA CC.A...... GA..T..AC. .

Ruru-DRB*16 A.......T. ...A...... GA..T..A.. .

Ruru-DRB*17 .......... C..A...... G......A.. A

Ruru-DRB*18 AG........ .......... .......AC. .

Ruru-DRB*19 ACAA...... .......... .......AC. .

Ruru-DRB*20 .....C..TA CC.A...... GA..T..A.. .

Ruru-DRB*21 ........TA CC.A...... .......AC. .

Ruru-DRB*22 ........T. C..A...... G......A.. A

Ruru-DRB*23 .......... C......... G....G.... .

Ruru-DRB*24 .......... C......... G....G.... .

Ruru-DRB*25 .......... .......... ....T..... .

Ruru-DRB*26 .......... .......... .......AC. .

Ruru-DRB*27 .......... .........G GA........ .

Ruru-DRB*28 .G......TA CC.A...... GA..T..AC. .

Ruru-DRB*29 .G........ .......... .......AC. .

Ruru-DRB*30 .G........ .....T.... GA..T...A. .

Ruru-DRB*31 .G........ .....T.... G...T...A. .

Ruru-DRB*32 A.......TA CC.A.....G GA.....AC. .

Ruru-DRB*33 A.AA...... .......... .......AC. .

Ruru-DRB*34 ACAA...... .......... .......A.. .

Ruru-DRB*35 AG...C..TA CC.A...... GA..T..A.. .

Ruru-DRB*36 AG...C..TA CC.A...... GA..T..... .

Ruru-DRB*37 AG...C..TA CC.A...... ....T..A.. .

Ruru-DRB*38 AG......TA CC.A.....G GA.....AC. .

Ruru-DRB*39 AG........ .......... .......... .

Ruru-DRB*40 AG........ .....T.... GA......A. .

1SUSCET .......... .......... .......... .

0)SUSCET MMRM...... .......... .......RS. .

0+SUSCETT MSRM.Y..YW SY.R...... RM..Y..AS. .

122SUSCET .......... .......... .......... .

123SUSCET .......... .......... R......... .

128SUSCET .......... .......... .......... .

129SUSCET MR........ .....T.... GM..Y...R. .

130SUSCET .......... .........S RM........ .

132SUSCET M.RM...... .......... .......RS. .

135SUSCET MR........ .......... .......RS. .

190897SUS MR........ .....T.... RM..Y...R. .

2aaf98SUS .......... .......... .......... .

2aam97SUS .......... .......... .......... .

3aaf97SUS .......... .........S RM........ .

3aaf98SUS .......... .........S RM........ .

3aam97SUS .......... S..A...... G......A.. A

3aam98SUS MGRM...... .....W.... RM..Y..RY. .

4aaf98SUS M.RA...... .......... .......RS. .

5aaf98SUS MMRM...... .......... .......AS. .

5aam97SUS .......... .......... .......... .

67

6aaSUSCET MR........ .......... .......AS. .

7aaf98SUS .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

9aam97SUS .......... .......... .......... .

9mSUSCETT ASRM...... .......... .......AC. .

AU1SOPRAV MMRM...... .......... .......RS. .

AU2SOPRAV MMRM...... .......... .......RS. .

AU3SOPRAV .......... .......... .......... .

CA1RESIST MSRM.Y..YW SY.R...... RM..Y..AS. .

CA10RESIS .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

CA11RESIS .......... .......... .......... .

CA12RESIS MMRM...... .......... .......AS. .



CA15RESIS .......... .......... .......... .

CA16RESIS MR........ .....W.... RM..Y...R. .

CA19RESIS MMRM...... .......... .......RS. .

CA2RESIST MG...Y..YW SY.R.W.... GA..T..RR. .

CA20RESIS .......... .......... .......... .

CA21RESIS .......... .......... .......... .




CA25RESIS MR......YW SY.R.....S RM.....AS. .

CA26RESIS .......... S..R...... R......R.. M

CA27RESIS MSRM.Y..YW SY.R...... RM..Y..AS. .

CA28RESIS MR........ .....W.... RM..Y...R. .

CA29RESIS ASRM...... .....W.... RM..Y..RM. .

CA3RESIST .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

CA30RESIS MR........ .....W.... RM..Y...R. .

CA4RESIST .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

CA5RESIST MR........ .....W.... RM..Y...R. .

CA6RESIST .R......YW SY.R...... RM..Y..RS. .

CA8RESIST .R......YW SY.R...... RM..Y..RS. .

CA7RESIST ACAA...... .......... .......AC. .

CA9RESIST MG...Y..YW SY.R.W.... GA..T..RR. .

Li1RESIST MMRM...... .......... .......RS. .

Li13RESIS MR......YW SY.R.....S RM.....RS. .

Li10RESIS .......... .......... .......... .

Li11RESIS .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

Li14RESIS .......... .......... .......... .

Li2RESIST MG...Y..YW SY.R...... RM..Y..AS. .

Li5RESIST .......... .......... .......... .

Li6RESIST .R...Y..YW RY.R...... RM..Y..R.. .

Li7RESIST ASRM...... .....W.... RM..Y..RM. .

Li8RESIST .......... S..R...... R......R.. M

Li9RESIST .......... .......... .......... .

NSSUSCETT .......... .......... .......... .

RP1RESIST MG...Y..TA CC.A.....S GA..Y..AS. .

RP4RESIST .......... .......... .......... .

Au22RESIS MR........ .......... .......RS. .

Au23RESIS MR.Y...... .......... .......RS. .

Au24RESIS .......... .......... .......... .

Au25RESIS .M...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

Au26RESIS .......... .......... .......... .

Au27RESIS .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

Au28RESIS M.RM...... .......... .......RS. .

Au29RESIS .......... .......... .......... .

Au30RESIS .......... .......... .......... .

Au31RESIS .......... .......... .......... .

Au32RESIS MR........ .....W.... RM..Y...R. .

Au33RESIS AG........ .....T.... GA..T...A. .

Au34RESIS .......... S..R...... R......R.. M

Au35RESIS .......... S..R...... R......R.. M

Au36RESIS .......... .......... .......... .

68

Au37RESIS .R...Y..TA CC.A...... RM..Y..AS. .

Au38RESIS .......... S..R...... R......R.. M

4359cavPOST MSRA.?..YW SY.R...... RM..Y..AS. .

4360cavaPRE MR......YW SW.R.....S RS.....RS. .

4373cavPOST .......... .......... .......... .

4402cavaPRE AG...Y..TA CC.A.....S GA..Y..AS. .

4403cavaPRE .......... .......... .......... .

4405cavaPRE ........YW SY.R...... .......RS. .

4409cavPOST .......... .......... .......... .

4410cavaPRE MS......YW SY.R.....S RM.....RS. .

4486marPOST .......... .......... .......... .

4487marPOST MR........ .......... .......RS. .

4488marCPRE .......... .......... .......... .

4489marPOST MR........ .....W.... RM..Y...R. .

4493marPOST .......... .......... .......... .

4503marPOST .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

4504marPOST .......... .......... .......... .

4505marPOST MR........ .......... .......RS. .

4506marcPRE .......... .......... .......... .

4507marCPRE .......... .......... .......... .

4542campPOS .......... .......... .......... .

4544campPOS .......... .......... .......... .

4547campPOS .......... .......... .......... .

4548campPOS .......... .......... .......... .

4553campPOS MR......YW SY.R.....S RM.....RS. .

4554campPOS .......... .......... .......... .

4555campPOS .......... .......... .......... .

4556campPOS AG...Y..TA CC.A.....S GA..Y..AS. .

4557campPOS .R...Y..YW SY.R...... RM..Y..A.. .

4562campPRE .......... .......... .......... .

4564campPOS .......... .......... .......... .

4564age3camPO .......... .......... .......... .

4571campPOS .......... .......AG. .......... .

4572mcamPRE MR...Y..YW SY.R...... RM..Y..S.. .

4572fcamPOS MR...Y..YW SY.R...... RM..Y..R.. .

4573campPRE .......... .......... .......... .

4575campPRE ........YW SY.R...... .......RS. .

PN62POSTOUT MMRM...... .......... .......RS. .

PN81POSTOUT AG...C..TA CC.A...... GA..T..A.. .

PN123OUTBRE .......... .......... .......... .

PN323OUTBRE .......... .......... .......... .

PN331OUTBRE .......... .......... .......... .

PP1355OUTBR MR......YW SY.R.....S RM.....RS. .

Figura 3.1 a Siti variabili presenti nell’allineamento dei campioni italiani a confronto con le sequenze depositate in GenBank di R. rupicapra (Schaschal et al 2004). Si evidenziano le sequenze omozigoti.

69

11111111 1111

11567888 8914445588 8999

7845250678 9763564656 8017

Rupy-DRB1*01A CAGCTACTCG TAACACCCAG GCGA

Rupy-DRB1*02A ........G. .G......G. ...C

Rupy-DRB1*03A AG..C.TA.. C......... ....

Rupy-DRB1*04A AG....TA.. C..GGA.... C..C

Rupy-DRB1*05A ACAA...... .G.GGA.... C...

Rupy-DRB1*06A .....TTA.C ....GA.... C..C

Rupy-DRB1*07A ACAA...... .G..GAT.G. C...

Rupy-DRB1*08A AG..C.TA.. C...GAT... ...C

Rupy-DRB1*09A AG........ .GT.G..GG. ....

Rupy-DRB1*10A ........G. .G......GA ...C

Rupy-DRB1*11A AG..C.TA.. C......... ...C

Rupy-DRB1*12A .......... .G..G..GG. ...C

Rupy-DRB1*13A ......TA.. C...GAT... C..C

16.06.HL032 .G........ .......... ...C

15.06 .G....T.G. ........R. ...C

18.06 .G....T.G. ........R. ...C

RP02.08 ........G. .G......G. ...C

RP2.96 ........G. ...G....R. S..C

RP03.04 .G....T.G. ........R. ...C

RP3.08 ........G. .G......G. ...C

RP3.99 AG..C.TA.. C......... ...C

RP4.03 ........G. .G......G. ...C

RP05.05 ........G. .G......G. ...C

RP5.99 ........G. .G......G. ...C

RP06.05 ........G. .G......G. ...C

RP06.07 AG..C.TA.. C......... ...C

38.07 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

12.07 ........G. .G......G. ...C

RP33.07 AG..C.TA.. C......... ...C

RP34.07 AG..C.TA.. C......... ...C

RP35.07 MR....YWS. YR.SRM..R. S..C

RP36.07 MR....YWS. YR.SRM..R. SGCC

RP37.07 ........G. .G......G. ...C

RP38.06 ........G. .G......G. ...C

RP48.06 MR....YWS. YR.SRM..R. ...C

RP7.01 ........G. .G......G. ...C

RP10.02 AG..C.TA.. C......... ...C

RP10.03 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

RP12.08 ........G. .G......G. ...C

RP13.02 ........G. .G......G. ...C

RP13.03 MR..Y.YWS. YR......G. ...C

RP13.07 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

RP14.02 ........G. .G......G. ...C

RP15.02 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

RP4.HL032 AG..Y.TA.. C..SRM.... S..C

RP23.HL032 AG..Y.TA.. C..SRM.... S..C

RPC20.HL032 ........G. .G......G. ...C

RP708.HL032 ........G. .G......G. ...C

RP808.HL032 MR....YWS. YR.SRM..R. S..C

RP09.03 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

RPC8 MR....YWS. YR.SRM..R. S..C

RP19.06 ----Y.YWS. YR......R. ...C

RP22.07 ----....G. .G......G. ...C

35.05 ........G. .G......G. ...C

26.05 ........G. .G......G. ...C

1.04 ........G. .G......G. ...C

39.06 AG..C.TA.. C......... ...C

12.05 AG..C.TA.. C......... ...C

15.02 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

30.05 AG..Y.TA.. C..SRM.... S..C

70

01.09 ........G. .G......G. ...C

19.06 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

05.06 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

12.06 ........G. .G......G. ...C

49.05 ........G. .G......G. ...C

04.04 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

05.04 ........G. .G......G. ...C

06.05 MR..Y.YWS. YR......R. ...C

Figura 3.1 b Siti variabili emersi dal confronto delle sequenze dei campioni spagnoli e di quelle depositate in GenBank per R. pyrenaica. Evidenziate in grigio, le 31 sequenze in omozigosi.

Tra le 127 sequenze analizzate di camoscio alpino, le sequenze omozigoti

risultano essere 46 (sequenze evidenziate nella Fig.3.1a).

Dei 31 siti variabili, il sito in posizione 7 risulta polimorfico in 42 sequenze, otto

sequenze, inoltre, hanno una adenina in tale sito invece della citosina. In posizione

8, risultano polimorfiche 55 sequenze, di cui: 9 mostrano eterozigosi tipo M (A/C)

ed 8 mostrano eterozigosi tipo S (C/G), 38 sequenze invece mostrano eterozigosi

tipo R (A/G). Le posizioni 14 e 15 sono polimorfiche, entrambe i siti sono

contemporaneamente polimorfici (RM) in 17 sequenze. Nel sito 14 abbiamo

eterozigosi adenina-guanina e nel sito 15 abbiamo eterozigosi adenina-citosina. In

posizione 52, 26 sequenze rivelano eterozigosi timina-citosina, una sola sequenza

ha in questa posizione una citosina invece di una timina. In posizione 70, 32

sequenze rilevano eterozigosi timina-citosina, in questo sito variabile, 5 sequenze

hanno la timina, tutte le altre presentano la citosina. 33 sequenze rivelano

eterozigosi contemporaneamente nelle posizioni 86, 87, 89, e 97 rispettivamente

per i nucleotidi adenina-timina, guanina-citosina, citosina-timina, guanina-adenina;

contemporaneamente nelle posizione 87 e 97 altre 5 sequenze mostrano

eterozigosi tipo S (C/G) e R (A/G). La posizione 116 rivela eterozigosi timina-adenina

in 11 campioni, solo 3 sequenze hanno in questa posizione una timina, tutte le altre

hanno l’adenina. Per le posizioni 130 e 131 solo una sequenza presenta in

entrambe i siti una variazione, una adenina al posto di una guanina ed una guanina

al posto di una adenina, rispettivamente. I siti 143, 145, 146 e 154 risultano

71

variabili. In particolare 8 sequenze mostrano contemporaneamente eterozigosi tipo

S (C/G), R (A/G), ed M (A/C) in 143, 145 e 146; nei siti 145, 146 e 154, 35 sequenze

presentano contemporaneamente eterozigosi tipo R (A/G), M (A/C) ed Y (C/T). 6

campioni hanno eterozigosi in posizione 143. I siti 185 e 188 sono polimorfici. In

entrambe i siti 185 e 188, 23 sequenze sono eterozigoti tipo R (A/G) per la

posizione 185 ed S (C/G) per la posizione 188; il sito 188 risulta molto variabile

rivelando per 36 volte eterozigosi tipo S (C/G), 9 volte mostra eterozigosi tipo R

(A/G), una volta mostra eterozigosi tipo M (A/C) ed una volta tipo Y (C/T). In

posizione 197, 5 sequenze mostrano eterozigosi citosina-adenina, una sola

sequenza mostra una adenina tutte le altre hanno la citosina.

I siti 16, 58, 59, 90, 104 e 129 risultano variabili solo nelle sequenze scaricate da

GenBank ed allineate con i camosci alpini di questa ricerca. Perciò i siti

effettivamente variabili del nostro campione sono 25 (12,1% su 206 nucleotidi).

Le 55 sequenze di camoscio pirenaico, mostrano in totale 24 siti variabili. Le

sequenze omologhe sono in numero di 31 (56,4% ).

Nello specifico, nelle posizioni 7 ed 8, 16 sequenze mostrano eterozigosi per

entrambe i siti di tipo M (A/C) ed R (A/G) rispettivamente. Inoltre, nella posizione 7,

10 sequenze hanno una adenina al posto di una citosina e nella posizione 8, 14

sequenze hanno una guanina al posto di una adenina. Nel sito 52, 7 sequenze

hanno una citosina al posto di una timina e 15 sequenze mostrano eterozigosi di

tipo Y (C/T). I siti 70, 86, 87, 89 e 97 sono contemporaneamente in eterozigosi di

tipo Y (C/T), W (A/T), S (C/G), Y (C/T) ed R (A/G) in 17 sequenze di cui 16 hanno

anche le eterozigosi nelle posizioni 7 ed 8. Inoltre, nelle posizioni 70, 86 e 89, 10

sequenze hanno contemporaneamente una timina al posto di una citosina, una

adenina al posto di una citosina e una citosina la posto di una timina; nella

posizione 70 altre 3 sequenze hanno una timina in sostituzione della citosina; per i

siti 87, 97 e 185, 23 sequenze hanno contemporaneamente e rispettivamente una

72

guanina al posto di una citosina, una guanina al posto di una adenina ed una

guanina invece di una adenina. Altre 3 sequenze hanno in posizione 70 la

variazione guanina al posto di citosina. I siti variabili 143, 145 e 146 sono

eterozigoti contemporaneamente in 8 sequenze. Si hanno rispettivamente

eterozigosi di tipo S (C/G), R (A/G) ed M (A/C). Il sito 185 e variabile ed in 20

sequenze c’è eterozigosi di tipo R (A/G). 8 sequenze sono eterozigoti di tipo S (C/G)

nella posizione 188. Le posizioni 190 e 191 sono variabili in un solo individuo,

mentre per la posizione 197 i camosci analizzati hanno tutti una citosina invece di

una adenina rispetto alle sequenze di camoscio pirenaico, scaricate ed allineate con

i nostri campioni.

I siti 14, 15, 65, 88, 116, 154, 156 e 186 sono variabili solo nelle sequenze

scaricate da GenBank, per cui i siti variabili effettivi del nostro campione è in

numero di 16 (7.8% su 206 nucleotidi).

I siti variabili in comune tra tutti i campioni analizzati sono 19.

Questo polimorfismo corrisponde, in accordo con la ricostruzione aplotipica di

HAP e con l’analisi aplotipica eseguita con i software DnaSP v. 5 e ARLEQUIN v. 3.1,

a 58 aplotipi (Tab. 3). Di questi, due aplotipi sono condivisi tra le popolazioni di

camosci italiani e spagnoli: Hap_1, che corrisponde agli aplotipi depositati Ruru-

DRB*01, Rupy-DRB*02 e Hap_20 che corrisponde a Rupy-DRB*04, Ruru-DRB*13,

Ruru-DRB*38: Questi aplotipi risultano essere trans-specifici, ovvero presenti in

individui di entrambe le specie. Hap_1 è anche l’aplotipo con la frequenza relativa

più alta ed è quindi l’aplotipo più comune.

Gli aplotipi privati degli individui delle popolazioni di camoscio alpino sono in

numero di 42 mentre 12 sono esclusivi delle popolazioni di camoscio pirenaico.

Nove aplotipi sono specifici per le popolazioni del sito di campionamento indicato

con il codice SitoA (Auronzo 97/98; Hap_5,6,8,11,12,29,30,31 e 34); sei aplotipi

73

(Hap_45-50) sono stati riscontrati nelle popolazioni di Auronzo del 2004/05 (SitoB);

quattro aplotipi (Hap_35-36, Hap_39-40) sono riconducibili alle popolazioni

campionate a Calalzo di Cadore (SitoC); un aplotipo (Hap_41) è specifico per il SitoD

(Livinallongo, Rocca Pietore); otto aplotipi (Hap_51-58) sono specifici per i camosci

alpini campionati nella Provincia di Lecco (SitoE).

In merito ai camosci pirenaici 4 aplotipi (Hap_23, 24-26 e 28) sono specifici

della popolazione del Sito 1 (Cadì e Cadì-Be); 5 aplotipi (Hap_17-18,21-22 e 27)

sono specifici delle popolazioni campionate nel Sito 3 (Freser).

Il valore di diversità aplotipica (Hd) è pari allo 0.684 (varianza 0.00078 e

deviazione standard 0.028); il valore di diversità nucleotidica (Pi) è pari a 0,02475; il

numero medio di differenze nucleotidiche (k) è pari a 5.099.

74

Aplotipi

SitoA

(48)

SitoB

(40)

SitoC

(56

SitoD

(28)

SitoE

(82)

Sito1

(34)

Sito2

(42)

Sito3

(24)

Sito4

(10)

Hap_1 22 24 24 17 55 17 26 10 7

Hap_2 3 2 2 1 1 0 0 0 0

Hap_3 1 0 2 0 0 0 0 0 0 Hap_4 1 0 2 0 1 0 0 0 0 Hap_5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_6 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_7 2 1 4 0 1 0 0 0 0 Hap_8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_9 2 1 0 0 0 0 0 0 0

Hap_10 2 1 0 0 2 0 0 0 0 Hap_11 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_12 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_13 1 3 1 1 0 0 0 0 0 Hap_14 0 0 0 0 0 0 2 0 0 Hap_15 0 0 0 0 0 1 2 0 0 Hap_16 0 0 0 0 0 1 2 0 0 Hap_17 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_18 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_19 0 0 0 0 0 6 9 6 3 Hap_20 0 0 1 1 3 1 0 2 0 Hap_21 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_22 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_23 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Hap_24 0 0 0 0 0 0 1 0 0 Hap_25 0 0 0 0 0 3 0 0 0 Hap_26 0 0 0 0 0 3 0 0 0 Hap_27 0 0 0 0 0 0 0 2 0 Hap_28 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Hap_29 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_30 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_31 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_32 2 0 2 0 1 0 0 0 0 Hap_33 1 2 8 2 2 0 0 0 0 Hap_34 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Hap_35 0 0 2 0 0 0 0 0 0 Hap_36 0 0 2 0 0 0 0 0 0 Hap_37 0 1 1 0 0 0 0 0 0 Hap_38 0 1 1 0 0 0 0 0 0 Hap_39 0 2 0 0 0 0 0 0 0 Hap_40 0 2 0 0 0 0 0 0 0 Hap_41 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_42 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_43 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_44 0 1 2 0 0 0 0 0 0 Hap_45 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_46 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_47 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_48 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_49 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_50 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_51 0 0 0 0 1 0 0 0 0 Hap_52 0 0 0 0 1 0 0 0 0 Hap_53 0 0 0 0 2 0 0 0 0 Hap_54 0 0 0 0 2 0 0 0 0 Hap_55 0 0 0 0 1 0 0 0 0 Hap_56 0 0 0 0 2 0 0 0 0 Hap_57 0 0 0 0 4 0 0 0 0 Hap_58 0 0 0 0 1 0 0 0 0

75

Tabella 3 Lista delle frequenze degli aplotipi identificati nel presente lavoro di studio. I siti indicati rappresentano le divisioni delle popolazioni degli individui analizzati in base alla provenienza geografica. Gli aplotipi evidenziati in verde sono condivisi da entrambe le specie (R. rupicapra e R. pyrenaica), mentre quelli evidenziati in giallo e in azzurro sono esclusivi rispettivamente per R. rupicapra e per R. pyrenaica. SitoA: AU97/98; SitoB: AU; SitoC: CA; SitoD: LI e RP; SitoE: Provincia di Lecco; Sito1: Cadì e Cadì-Be; Sito2: Aran, Apa, PN, Pallars; Sito3: Freser; Sito4: Cardanya.

76

Lo studio del polimorfismo, oltre che associato ai siti di campionamento, è stato

anche effettuato per evidenziare eventuali corrispondenze tra gli aplotipi e lo

status degli individui, in relazione ad una pressione selettiva da patogeno. Gli

individui sono stati, perciò, raggruppati in popolazioni come specificato nella

Tabella 4.

77

Aplotipi

morti per

rogna

(50)

rogna soprav.

(42)

rogna resist

(82)

polm. preout

(34)

polm. post

(48)

spagna pestvirus

(26)

spagna altre

malattie

(40)

spagna sani

(44)

Hap_1 24 24 39 20 35 15 21 24

Hap_2 3 2 3 1 0 0 0 0

Hap_3 1 0 2 0 0 0 0 0 Hap_4 1 1 2 0 1 0 0 0 Hap_5 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_6 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_7 2 1 0 0 1 0 0 0 Hap_8 3 0 4 0 0 0 0 0 Hap_9 2 1 0 0 0 0 0 0

Hap_10 2 1 0 0 2 0 0 0 Hap_11 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_12 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_13 1 3 2 0 0 0 0 0 Hap_14 0 0 0 0 0 0 2 0 Hap_15 0 0 0 0 0 0 3 0 Hap_16 0 0 0 0 0 0 3 0 Hap_17 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_18 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_19 0 0 0 0 0 10 6 8 Hap_20 0 0 2 1 2 0 0 3 Hap_21 0 0 0 0 0 0 0 1 Hap_22 0 0 0 0 0 0 0 1 Hap_23 0 0 0 0 0 1 0 0 Hap_24 0 0 0 0 0 0 0 1 Hap_25 0 0 0 0 0 0 1 2 Hap_26 0 0 0 0 0 0 1 2 Hap_27 0 0 0 0 0 0 0 2 Hap_28 0 0 0 0 0 0 1 0 Hap_29 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_30 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_31 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_32 2 2 2 1 0 0 0 0 Hap_33 1 0 10 1 1 0 0 0 Hap_34 1 0 0 0 0 0 0 0 Hap_35 0 0 2 0 0 0 0 0 Hap_36 0 0 2 0 0 0 0 0 Hap_37 0 0 2 0 0 0 0 0 Hap_38 0 0 2 0 0 0 0 0 Hap_39 0 0 2 0 0 0 0 0 Hap_40 0 0 2 1 1 0 0 0 Hap_41 0 0 1 0 0 0 0 0 Hap_42 0 0 1 0 0 0 0 0 Hap_43 0 0 1 0 0 0 0 0 Hap_44 0 0 1 0 0 0 0 0 Hap_45 0 1 0 0 0 0 0 0 Hap_46 0 1 0 0 0 0 0 0 Hap_47 0 1 0 0 0 0 0 0 Hap_48 0 1 0 0 0 0 0 0 Hap_49 0 1 0 0 0 0 0 0 Hap_50 0 1 0 0 0 0 0 0 Hap_51 0 1 0 0 1 0 0 0 Hap_52 0 0 0 1 0 0 0 0 Hap_53 0 0 0 1 1 0 0 0 Hap_54 0 0 0 2 0 0 0 0 Hap_55 0 0 0 1 0 0 0 0 Hap_56 0 0 0 0 2 0 0 0 Hap_57 0 0 0 4 0 0 0 0 Hap_58 0 0 0 0 1 0 0 0

78

Tabella 4 Lista delle frequenze degli aplotipi riscontrati nei gruppi di individui di camoscio alpino identificati come: morti per rogna, sopravvissuti e resistenti all’epidemia (quindi sani), individui prelevati prima e dopo il crash epidemico causato da una epidemia di polmonite nella Provincia di Lecco. I gruppi di individui di camoscio pirenaico identificano i seguenti status: affetti da pesti virus, malati di altre parassitosi, individui sani. Gli aplotipi evidenziati in verde sono condivisi da entrambe le specie (R. r. rupicapra e R. p. pyrenaica), mentre quelli evidenziati in giallo e in azzurro sono esclusivi rispettivamente per R. r. rupicapra e per R. p. pyrenaica.

79

In allegato 5 si fornisce una lista delle corrispondenze fra i 58 aplotipi emersi

dall’analisi della regione esonica del locus DRB del presente studio e la

nomenclatura in uso per la definizione degli aplotipi della medesima regione.

Partendo dai 58 aplotipi, mediante l’uso del programma MEGA v. 4.0, abbiamo

costruito le sequenze degli amminoacidi che corrispondono ai nostri alleli. In totale

(Figure 3.2) da 206 nucleotidi risultano 68 codoni che codificano per 68 aminoacidi.

Dallo studio dell’allineamento risultano 18 siti amminoacidici variabili (26,47% di

siti polimorfici). Nella Figura di seguito vengono, inoltre, evidenziati i codoni

coinvolti nella regione di legame dell’antigene delle MHC di classe II, la regione

PBR, nell’uomo (Brown et al. 1993; Schaschal et al. 2004).

80

+ + + + + + ++ + + ++ + +

* * * * * *** * * * ** *

Hap_1 EYHKSECHFF NGTERVRFLD RYFHNGEELV RFDSDWGEYR AVAELGRPTA EHWNSQKEIL [60]

Hap_2 ..S.K..... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_3 ..P....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_4 ..S.K..... .......L.. ...Y....YA ..N....... ........D. .Y........ [60]

Hap_5 .......... .......... .......... .......... ........A. .......... [60]

Hap_6 .......... .......... .......... ........F. ........A. .......... [60]

Hap_7 ..S....... .......... .......... ........F. ........D. .Y........ [60]

Hap_8 .......... .......... .......... .......... .......RD. .......... [60]

Hap_9 ..N.K..... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_10 ..S....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_11 .......... .......... .......... ........F. .......... .......... [60]

Hap_12 .......... .......... .......... ..N....... ........A. .......... [60]

Hap_13 .......... .......... ........F. ..N....... ........A. .......... [60]

Hap_14 ..R....... .......... ........F. ..N....... .......... .......... [60]

Hap_15 ..R....... .......... ...Y...... ..N....... .......... .......... [60]

Hap_16 ..R....... .......... ...Y...... ..N....... .......... .......... [60]

Hap_17 .......... .......... .......... ..N....... .......R.. .......... [60]

Hap_18 .......... .......... .......... ..N....... .......R.. .......... [60]

Hap_19 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N....... .......... .......... [60]

Hap_20 ..S....... .......... ...Y....YA ..N....... .......RD. .......... [60]

Hap_21 .......... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_22 ..S....... .......... ...Y....YA ..N....... .......RD. .......... [60]

Hap_23 ..S....... .......... ...Y....YA ..N....... .......RD. .......... [60]

Hap_24 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N....... .......... .......... [60]

Hap_25 ..S....... .......... ...Y....YA ..N....... .......... .......... [60]

Hap_26 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N....... .......RD. .......... [60]

Hap_27 .......... .......... .......V.. .......... .......... .......... [60]

Hap_28 .......... .......L.. ...Y....YA ..N....... .......... .......... [60]

Hap_29 ..R....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_30 ..S.K..... .......... .......... ........F. ........D. .Y........ [60]

Hap_31 ....R..... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_32 .......... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_33 ..R....... .......L.. ...Y....YA ..N....... ........D. .Y........ [60]

Hap_34 ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_35 ..R....... .......... .......... .......... ........D. .Y........ [60]

Hap_36 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N.....F. ........D. .Y........ [60]

Hap_37 ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_38 ..S.K..... .......... .......... ........F. ........D. .Y........ [60]

Hap_39 ..R....... .......... ...Y....YA ..N....... ........D. .Y........ [60]

Hap_40 ..T.K..... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_41 ..R....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_42 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N....... ........D. .Y........ [60]

Hap_43 ..R....... .......... ...Y....YA ..N....... ........D. .......... [60]

Hap_44 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N....... .......RD. .Y........ [60]

Hap_45 ..S....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_46 ....R..... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_47 ..S....... .......... .......... ........F. ........D. .Y........ [60]

Hap_48 ..S....... .......... .......... ........F. ........D. .Y........ [60]

Hap_49 .......... .......... ...Y....YA ..N....... .......... .......... [60]

Hap_50 ..R....... .......L.. ...Y....YA ..N....... ........D. .Y........ [60]

Hap_51 ..P.R..... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_52 ..S....... .......... ...Y....YE ..N....... .......RD. .......... [60]

Hap_53 ..S....... .......... ...Y....YA ..N....... ........D. .......... [60]

Hap_54 .......... .......... ...Y....YA ..N....... .......... .......... [60]

Hap_55 ..P....... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

Hap_56 .......... .......... .......... .......... ...R...... .......... [60]

Hap_57 ..S....... .......L.. ...Y....YA ..N....... ........D. .Y........ [60]

Hap_58 A......... .......... .......... .......... .......... .......... [60]

++ +

*** *

Hap_1 ERRRAAVD [68]

Hap_2 .QT..... [68]

Hap_3 .Q...... [68]

Hap_4 .QT..... [68]

Hap_5 ........ [68]

Hap_6 ........ [68]

81

Hap_7 ..K..... [68]

Hap_8 ........ [68]

Hap_9 .QT..... [68]

Hap_10 .QT..... [68]

Hap_11 ........ [68]

Hap_12 .Q...E.. [68]

Hap_13 .Q...E.. [68]

Hap_14 .Q...... [68]

Hap_15 ........ [68]

Hap_16 .Q...... [68]

Hap_17 ........ [68]

Hap_18 .QT..... [68]

Hap_19 .Q...... [68]

Hap_20 .QT..... [68]

Hap_21 ...A.... [68]

Hap_22 .QTA.... [68]

Hap_23 .Q...... [68]

Hap_24 ........ [68]

Hap_25 .Q...... [68]

Hap_26 .QT..... [68]

Hap_27 ........ [68]

Hap_28 .Q...... [68]

Hap_29 ..M..... [68]

Hap_30 .QT..... [68]

Hap_31 ........ [68]

Hap_32 .Q...... [68]

Hap_33 .Q...... [68]

Hap_34 .QT..... [68]

Hap_35 ........ [68]

Hap_36 .QK..... [68]

Hap_37 ........ [68]

Hap_38 .QK..... [68]

Hap_39 .QT..... [68]

Hap_40 .QT..... [68]

Hap_41 .Q...... [68]

Hap_42 .QT..... [68]

Hap_43 .Q...... [68]

Hap_44 .QT..... [68]

Hap_45 ........ [68]

Hap_46 .QT..... [68]

Hap_47 ........ [68]

Hap_48 ..T..... [68]

Hap_49 .Q...... [68]

Hap_50 .QT..... [68]

Hap_51 .Q...... [68]

Hap_52 .QT..... [68]

Hap_53 .Q...... [68]

Hap_54 .QT..... [68]

Hap_55 ........ [68]

Hap_56 ........ [68]

Hap_57 .Q...... [68]

Hap_58 ........ [68]

La regione sequenziata interamente codificante è formata da 68 aminoacidi.

Per i camosci alpini, su 206 nucleotidi, il numero di sostituzioni sinonime è 22 (ds –

tasso medio di sostituzioni sinonime = 0.0053) mentre il numero di sostituzioni non

sinonime è 9 (dn – tasso medio di sostituzioni non sinonime = 0.0532). Il rapporto

dn/ds perciò è pari a 10,04. Per i camosci pirenaici il numero di sostituzioni sinonime

è 20 (ds = 0.0019) mentre il numero di sostituzioni non sinonime è 4 (dn = 0.0532). Il

rapporto dn/ds perciò è pari a 28.

Figura 3.2 Allineamento delle sequenze aminoacidiche derivate dagli aplotipi trovati. Si evidenziano con * i siti polimorfici e con + i siti coinvolti nella codificazione della regione PBR delle molecole delle MHC di

classe II nell’uomo secondo Brown et al. 1993.

82

Considerando l’allineamento nucleotidico dei 58 aplotipi ricostruiti nel

seguente studio, sono state identificate 24 posizioni variabili. Sul totale, 8 variazioni

cadono in prima posizione, 14 in seconda posizione codonica e solo 2 in terza

posizione. L’allineamento nucleotidico genera un insieme di 68 codoni, di cui 18

variabili.

Analizzando invece le variazioni a livello aminoacidico, il cambiamento da acido

glutammico ad alanina in posizione 1 comporta un cambiamento di carica, in

quanto il primo è un aminoacido idrofilico contenente il gruppo acido COO- mentre

il secondo è un aminoacido alifatico idrofobico; in posizione 3 si possono ritrovare 6

aminoacidi diversi (istidina, serina, prolina, asparagina, arginina, treonina) di questi,

5 presentano caratteristiche idrofiliche e solo uno, la prolina (presente nell’aplotipo

3, 51 e 55), presenta invece caratteristiche idrofobiche. In posizione 5 sono

presenti la serina (contenente il gruppo OH-), la lisina e l’arginina (contenenti il

gruppo NH3+), tutti con caratteristiche idrofiliche. In posizione 18 ritroviamo due

aminoacidi: la fenilalanina e la leucina, il primo aromatico e il secondo alifatico, ma

entrambi con caratteristiche idrofobiche. In posizione 24 sono presenti 2

aminoacidi, istidina e tirosina, il primo idrofilico il secondo idrofobico. In posizione

28 sono presenti l’acido glutammico e la valina, e come nel caso della posizione 1 e

della posizione 24 ritroviamo che la sostituzione aminoacidica comporta un

cambiamento totale delle caratteristiche di legame dell’aminoacido (il primo acido

e idrofilico, il secondo alifatico e idrofobico). Nella posizione successiva, 29,

ritroviamo 3 aminoacidi variabili: la leucina, la fenilalanina e la tirosina; i primi due,

sebbene abbiano strutture chimiche diverse mantengono entrambi caratteristiche

di idrofobicità, mentre l’ultimo è idrofilico. In posizione 30 si ritrovano di nuovo 3

aminoacidi variabili: valina, alanina e acido glutammico. In posizione 33 sono

presenti l’acido aspartico e l’asparagina, il primo spiccatamente acido e idrofilico, il

secondo moderatamente idrofilico e senza una carica netta. In posizione 39 sono

presenti la fenilalanina e la tirosina; in posizione 44 sono presenti l’acido

83

glutammico e l’arginina ed in posizione 48 ritroviamo la prolina e l’arginina: in tutti i

casi ritroviamo aminoacidi con caratteristiche opposte. In posizione 49 sono

presenti tirosina, acido aspartico e alanina tutti e tre con caratteristiche diverse fra

loro; in posizione 52 sono presenti istidina e tirosina, con caratteristiche diverse; in

posizione 62 ritroviamo arginina e glutammina, la prima idrofilia e carica

positivamente, la seconda senza una carica netta. In posizione 63 ritroviamo 4

aminoacidi diversi: arginina, lisina, treonina e metionina; in posizione 64 sono

presenti arginina e alanina e in ultima posizione variabile ritroviamo alanina e acido

glutammico.

Come si evince da questi risultati, i cambiamenti aminoacidici dovuti alla

grande variazione presente in prima e seconda posizione codonica

dell’allineamento nucleotidico, comportano di solito cambiamenti significativi nella

struttura chimica e nelle caratteristiche di idrofobicità e idrofilicità degli aminoacidi

in questione. Essendo una regione interamente codificante, inclusa la regione che

lega il peptide (PBR), tali cambiamenti rappresentano una diversa capacità di

discriminare epitopi di antigeni di agenti patogeni molto diversi fra loro.

3.2 Diversità genetica intra-popolazioni

Per le popolazioni campionate nei diversi siti (SitoA, B, C, D, E, 1, 2, 3, 4), le

frequenze relative alleliche e gli indici di diversità genetica (Nei 1987, nA, H0, He) e

gli indici di diversità molecolare secondo (Ewens 1972; Zouros 1979; Tajima 1983;

Nei 1987; Tajima 1993) sono elencati nella tabella 5.

84

Alleli SiteA SiteB SiteC SiteD SiteE Site1 Site2 Site3 Site4

(48) (40) (56) (28) (82) (34) (42) (24) (10)

Ruru-DRB*01,

Rupy-DRB*02 Hap_1 0.458 0.6 0.429 0.607 0.671 0.5 0.619 0.417 0.7

Ruru-DRB*41 Hap_2 0.0625 0.05 0.0357 0.0357 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*42 Hap_3 0.0208 0 0.0357 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*43 Hap_4 0.0208 0 0.0357 0 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*44 Hap_5 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*45 Hap_6 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*04 Hap_7 0.0417 0.025 0.0714 0 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*27 Hap_8 0.0625 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*33 Hap_9 0.0417 0.025 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*18 Hap_10 0.0417 0.025 0 0 0.0244 0 0 0 0

Ruru-DRB*46 Hap_11 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*47 Hap_12 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*17 Hap_13 0.0208 0.075 0.0179 0.0357 0 0 0 0 0

Rupy-DRB*14 Hap_14 0 0 0 0 0 0 0.0476 0 0

Rupy-DRB*15 Hap_15 0 0 0 0 0 0.0294 0.0476 0 0

Rupy-DRB*16 Hap_16 0 0 0 0 0 0.0294 0.0476 0 0

Rupy-DRB*17 Hap_17 0 0 0 0 0 0 0 0.0417 0

Rupy-DRB*18 Hap_18 0 0 0 0 0 0 0 0.0417 0

Rupy-DRB*11 Hap_19 0 0 0 0 0 0.176 0.214 0.25 0.3

Rupy-DRB*04,

Ruru-DRB*13,

Ruru-DRB*38 Hap_20 0 0 0.0179 0.0357 0.0366 0.0294 0 0.0833 0

Rupy-DRB*19 Hap_21 0 0 0 0 0 0 0 0.0417 0

85

Rupy-DRB*20 Hap_22 0 0 0 0 0 0 0 0.0417 0

Rupy-DRB*21 Hap_23 0 0 0 0 0 0.0294 0 0 0

Rupy-DRB*22 Hap_24 0 0 0 0 0 0 0.0238 0 0

Rupy-DRB*23 Hap_25 0 0 0 0 0 0.0882 0 0 0

Rupy-DRB*24 Hap_26 0 0 0 0 0 0.0882 0 0 0

Rupy-DRB*25 Hap_27 0 0 0 0 0 0 0 0.0833 0

Rupy-DRB*26 Hap_28 0 0 0 0 0 0.0294 0 0 0

Ruru-DRB*48 Hap_29 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*49 Hap_30 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*50 Hap_31 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*51 Hap_32 0.0417 0 0.0357 0 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*09 Hap_33 0.0208 0.05 0.143 0.0714 0.0244 0 0 0 0

Ruru-DRB*52 Hap_34 0.0208 0 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*53 Hap_35 0 0 0.0357 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*54 Hap_36 0 0 0.0357 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*55 Hap_37 0 0 0.0179 0.0357 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*56 Hap_38 0 0 0.0179 0.0357 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*28 Hap_39 0 0 0.0357 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*57 Hap_40 0 0 0.0357 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*58 Hap_41 0 0 0 0.0357 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*59 Hap_42 0 0 0 0.0357 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*60 Hap_43 0 0 0 0.0357 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*61 Hap_44 0 0 0 0.0357 0.0244 0 0 0 0

Ruru-DRB*39 Hap_45 0 0.025 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*62 Hap_46 0 0.025 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*63 Hap_47 0 0.025 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*64 Hap_48 0 0.025 0 0 0 0 0 0 0

86

Ruru-DRB*65 Hap_49 0 0.025 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*66 Hap_50 0 0.025 0 0 0 0 0 0 0

Ruru-DRB*67 Hap_51 0 0 0 0 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*68 Hap_52 0 0 0 0 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*69 Hap_53 0 0 0 0 0.0244 0 0 0 0

Ruru-DRB*21 Hap_54 0 0 0 0 0.0244 0 0 0 0

Ruru-DRB*70 Hap_55 0 0 0 0 0.0122 0 0 0 0

Ruru-DRB*71 Hap_56 0 0 0 0 0.0244 0 0 0 0

Ruru-DRB*35,

Rupy-DRB*08 Hap_57 0 0 0 0 0.0488 0 0 0 0

Ruru-DRB*72 Hap_58 0 0 0 0 0.0122 0 0 0 0

N 24 20 28 13 41 17 21 13 4

nA 19 13 15 11 17 9 6 8 2

H0 media 0,786 0,639 0,793 0,637 0,548 0,720 0,577 0,775 0,466

ds (±0,016) (±0,016) (±0,049) (±0,105) (±0,067) (±0,071) (±0,105) (±0,066) (±0,131) He media 0,227 0,250 0,361 0,299 0,266 0,422 0,418 0,370 0,466

ds 0,134 0,092 0,150 0,130 0,133 0,119 0,045 0,138 0,000

transiz. 10 10 10 10 12 7 6 7 6

trasvers 10 8 10 10 11 6 3 9 3

sostituz. 20 18 20 10 20 13 9 16 9

Tabella 5 Frequenze relative degli aplotipi dei campioni esaminati divisi per sito di campionamento. Gli alleli che corrispondono a sequenze presenti in letteratura (Schaschal et al. 2004) sono sottolineate. N=numero di campioni esaminati per sito di campionamento; nA= numero di alleli per sito; H0= eterozigosità media osservata; He= eterozigosità media attesa; ds= deviazione standard; divesità genetica; numero di transizioni, trasversioni e sostituzioni osservato.

87

Possiamo notare che l’allele Ruru-DRB01 è presente in tutti i campioni con una

frequenza molto alta (circa 50%). Tutti i restanti alleli sono presenti con una

frequenza ridotta, con un range che va da 1,22% a 30%.

La variabilità genetica ha un valore piuttosto elevato, con una eterozigosità

media attesa He che va da un valore di 0,227 per i camosci alpini di Auronzo morti

per rogna sarcoptica a 0,466 per il Sito4, per i camosci pirenaici.

Considerando le popolazioni raggrupppate secondo lo status possiamo evidenziare

altre caratteristiche di variabilità (Tab. 6). L’eterozigosi osservata, in questo caso

presenta valori H0 da 0,469 a 0,766.

88

Haplotype: rogna_morti rogna_soprav. rogna_res. sp_pest+ sp_altremal. sp_sani pol_preout polm_postout

(50) (42) (82) (26) (40) (44) (34) (48)

Hap_1 0.48 0.571 0.476 0.577 0.525 0.545 0.588 0.729

Hap_2 0.06 0.0476 0.0366 0 0 0 0.0294 0

Hap_3 0.02 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_4 0.02 0.0238 0.0244 0 0 0 0 0.0208

Hap_5 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_6 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_7 0.04 0.0238 0.0488 0 0 0 0 0.0208

Hap_8 0.06 0 0 0 0 0 0 0

Hap_9 0.04 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_10 0.04 0.0238 0 0 0 0 0 0.0417

Hap_11 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_12 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_13 0.02 0.0714 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_14 0 0 0 0 0.05 0 0 0

Hap_15 0 0 0 0 0.075 0 0 0

Hap_16 0 0 0 0 0.075 0 0 0

Hap_17 0 0 0 0 0.025 0 0 0

Hap_18 0 0 0 0 0.025 0 0 0

Hap_19 0 0 0 0.385 0.15 0.182 0 0

Hap_20 0 0 0.0244 0 0 0.0682 0.0294 0.0417

Hap_21 0 0 0 0 0 0.0227 0 0

Hap_22 0 0 0 0 0 0.0227 0 0

Hap_23 0 0 0 0.0385 0 0 0 0

Hap_24 0 0 0 0 0 0.0227 0 0

89

Hap_25 0 0 0 0 0.025 0.0455 0 0

Hap_26 0 0 0 0 0.025 0.0455 0 0

Hap_27 0 0 0 0 0 0.0455 0 0

Hap_28 0 0 0 0 0.025 0 0 0

Hap_29 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_30 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_31 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_32 0.04 0 0.0244 0 0 0 0.0294 0

Hap_33 0.02 0.0476 0.122 0 0 0 0.0294 0.0208

Hap_34 0.02 0 0 0 0 0 0 0

Hap_35 0 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_36 0 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_37 0 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_38 0 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_39 0 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_40 0 0 0.0244 0 0 0 0 0

Hap_41 0 0 0.0122 0 0 0 0 0

Hap_42 0 0 0.0122 0 0 0 0 0

Hap_43 0 0 0.0122 0 0 0 0 0

Hap_44 0 0 0.0122 0 0 0 0.0294 0.0208

Hap_45 0 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_46 0 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_47 0 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_48 0 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_49 0 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_50 0 0.0238 0 0 0 0 0 0

Hap_51 0 0.0238 0 0 0 0 0 0.0208

90

Hap_52 0 0 0 0 0 0 0.0294 0

Hap_53 0 0 0 0 0 0 0.0294 0.0208

Hap_54 0 0 0 0 0 0 0.0588 0

Hap_55 0 0 0 0 0 0 0.0294 0

Hap_56 0 0 0 0 0 0 0 0.0417

Hap_57 0 0 0 0 0 0 0.118 0

Hap_58 0 0 0 0 0 0 0 0.0208

Indici rogna morti r-soprav. r-rest. sp-pest+ sp-altre sp-sani pol-pre pol-post

N 25 21 41 13 20 22 17 24

nA 19 15 19 3 10 9 17 11

H0 media 0,766 0,674 0,757 0,538 0,703 0,672 0,649 0,469

ds ±0,063 ±0,082 ±0,048 ±0,056 ±0,072 ±0,069 ±0,091 ±0,089

He media 0,210 0,275 0,346 0,399 0,340 0,343 0,351 0,179

ds 0,131 0,094 0,142 0,186 0,165 0,157 0,138 0,094

transiz. 11 10 10 7 7 7 9 12

trasvers 10 9 10 5 6 9 9 10

sostituz. 21 19 20 12 13 16 18 22

Tabella 6 Frequenze relative degli aplotipi dei campioni esaminati divisi per status. N=numero di campioni esaminati per sito di campionamento; nA= numero di alleli per sito; H0= eterozigosità media osservata; He= eterozigosità media attesa; ds= deviazione standard; divesità genetica; numero di transizioni, trasversioni e sostituzioni osservato.

91

3.3 Diversità genetica tra-popolazioni

L’analisi della varianza molecolare (AMOVA), è stata condotta utilizzando il

software ARLEQUIN 3.1. Per applicare questo tipo di analisi è necessario

strutturare gli individui da analizzare in popolazioni e gruppi di ordine gerarchico

superiore. Nel nostro caso sono stati applicati due criteri di divisione: il primo

criterio è stato quello geografico (Tab. 7), ovvero si sono divisi i campioni in due

gruppi principali (camosci italiani appartenenti alla specie R. r. rupicapra e camosci

spagnoli appartenenti alla specie R. p. pyrenaica) e all’interno di ogni gruppo è

stata fatta un’ulteriore divisione in popolazioni a seconda della località di

provenienza; il secondo criterio di divisione è stato quello di considerare gruppi di

camosci sottoposti a pressione selettiva da patogeno (Tab. 8). Alcuni individui delle

popolazioni di camosci spagnoli sono stati affetti da Pestivirus e da altre patologie,

mentre gli individui delle popolazioni italiane sono stati affetti da rogna sarcoptica

e da polmonite.

Questo tipo di approccio gerarchico per l’analisi della varianza molecolare

consente di dividere la varianza totale in componenti di covarianza, dovute alle

differenze intra-individuali, intra-popolazione e inter-gruppi.

Questo tipo di analisi essenzialmente è simile agli altri tipi di approcci basati

sull’analisi della varianza delle frequenze genotipiche, ma tiene in conto il numero

delle mutazioni fra gli aplotipi (Excoffier et al. 2005).

La significatività degli indici di fissazione è valutata usando l’approccio di

permutazione non parametrica (1000 repliche).

92

Source of Sum of Variance Percentage

variation d.f. squares components of variation

-----------------------------------------------------------------------

Among

species 1 2.344 0.01195 Va 3.42

Among

populations

within

species 7 3.537 0.00439 Vb 1.26

Within

populations 355 118.322 0.33330 Vc 95.33

----------------------------------------------------------------------

Total 363 124.203 0.34964

----------------------------------------------------------------------

Fixation Index

FST : 0.04674

----------------------------------------------------------------------

Significance tests (1023 permutations)

SiteA SiteB SiteC SiteD SiteE Site1 Site2 Site3 Site4

SiteA 0.00000

SiteB 0.00386 0.00000

SiteC 0.00265 0.01833 0.00000

SiteD 0.00568 -0.01750 0.01174 0.00000

SiteE 0.03451 0.00237 0.05269 -0.00612 0.00000

Site1 0.02229 0.02904 0.03519 0.02325 0.04900 0.00000

Site2 0.04725 0.03205 0.06491 0.02768 0.03821 0.00245 0.00000

Site3 0.03460 0.05942 0.04285 0.05143 0.08974 -0.00312 0.02112 0.00000

Site4 0.05135 0.03214 0.07002 0.02816 0.03461 -0.00834 -0.04474 0.00439 0.00000

Tabella 7 – Valori di Fst in gruppi divisi per regione geografica di provenienza.

La variabilità genetica dipende in particolar modo dalle differenze che si

riscontrano a livello individuale (95,33%), all’interno di una popolazione. L’indice di

fissazione della variabilità è piuttosto basso (Fst = 0,0467). Se si considera che valori

prossimi a 1 caratterizzano le popolazioni significativamente diverse, appare

evidente che non ci sono indicazioni per una sottodivisione della popolazione in

base a caratteristiche sia geografiche, sia di pressione selettiva dei patogeni.

93

----------------------------------------------------------------------

Source of Sum of Variance Percentage

variation d.f. squares components of variation

----------------------------------------------------------------------

Healthy/

sick 2 3.544 0.01170 Va 3.36

Among

populations

within

above groups 5 2.065 0.00176 Vb 0.50

Within

populations 358 119.893 0.33490 Vc 96.14

----------------------------------------------------------------------

Total 365 125.503 0.34835

----------------------------------------------------------------------

Fixation Indices

FST : 0.03862

----------------------------------------------------------------------

Significance tests (1023 permutations)

------------------

Rogna

morti

Rogna

Spravv.

Rogna

Resist.

Spagna

Pestivirus

Spagna

malattie

Spagna

sani

Polmonite

Preout.

Polm.

Postout.

Rogna

morti

0.00000

Rogna

Spravv

-0.0043 0.00000

Rogna

Resist.

0.00105 0.00169 0.00000

Spagna

Pest.

0.09031 0.09228 0.09587 0.00000

Spagna

malattie

0.01769 0.01703 0.02636 0.02711 0.00000

Spagna

sani

0.02514 0.02229 0.03148 0.01413 -0.00484 0.00000

Polmonite

Preout.

0.00810 -0.00037 0.01327 0.09955 0.02215 0.02430 0.00000

Polmointe

Postout.

0.04364 0.01469 0.04824 0.13307 0.05185 0.04796 0.01707 0.00000

Tabella 8 Valori di Fst in gruppi sottoposti a pressioni selettive da patogeno.

La percentuale di variabilità riscontrata nei gruppi costituiti a seconda dello

status degli individui rispetto alla pressione da patogeno dipende soprattutto dalla

diversità presente tra gli individui stessi (96,14%), l’indice di fissazione della

variabilità è pari a Fst = 0,0386.

Di seguito si schematizza il valore della diversità genetica tra le diverse

polazioni campionate raggruppate per sito di campionamento e per status (Tab. 9 e

Fig. 3.3a e b).

94

Gene diversity SiteA SiteB SiteC SiteD SiteE Site1 Site2 Site3 Site4

0.7863 0.6397 0.7935 0.6376 0.5483 0.7201 0.5772 0.7754 0.4667

Gene diversity

Rogna morti

Rogna Spravv.

Rogna Resist.

Spagna Pestivirus

Spagna altre malattie

Spagna sani

Polmonite Preout.

Polmointe Postout.

0.7665 0.6736 0.7573 0.5385 0.7026 0.6723 0.6488 0.4699

Tabella 9 Risultati della variabilità genetica in gruppi suddivisi per siti di campionamento e per status

a

b

Fig. 3.3 Istogrammi rappresentanti la variabilità genetica in gruppi suddivisi per sito di campionamento (a) e sottoposti a pressioni selettive da patogeno (b).

0 0,2 0,4 0,6 0,8

SiteA

SiteB

SiteC

SiteD

SiteE

Site1

Site2

Site3

Site4

Serie1

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Rogna morti

Rogna soprav

Rogna resist

Polmonite pre

Polmonite post

Pestivirus

Altre patolog

Sani

Serie1

95

3.4 Alberi fenetici secondo il metodo Neighbor-Joining

Per evidenziare le relazioni tra i 58 aplotipi evidenziati nelle due specie di

camoscio è stato realizzato un albero NJ (Saitou & Nei 1987) basato sulle sequenze

nucleotidiche dell’esone 2 locus DRB delle MHC di classe II (Fig. 3.4). Le distanze

evolutive sono state calcolate con il metodo Kimura 2-parameters (Kimura 1980).

Le analisi sono state condotte utilizzando il programma MEGA v. 4.0. Va ricordato

che l’albero ottenuto si riferisce agli aplotipi evidenziati e non agli individui

analizzati. Le sequenze dei diversi campioni sono distribuite in modo eterogeneo

tra i principali gruppi.

96

Figura 3.3 Albero NJ basato sulle sequenze nucleotidiche dell’esone 2 locus DRB di MHC di classe II (1000 repliche di bootstrap). Nel riquadri rossi sono evidenziate le sequenze condivisi da tutti camosci alpini e pirenaici. Nei riquadri azzurri sono evidenziate le sequenze specifiche dei camosci pirenaici

97

DISCUSSIONE DEI DATI E CONSIDERAZIONI

Il camoscio è una specie di grande importanza in Italia e nei Paesi in cui si

espande il suo areale, sia per il fatto che è molto abbondante, sia perché è soggetto

a prelievo venatorio. La presenza di parchi naturali e oasi di rifugio, di riproduzione

e sosta, in cui gli animali non possono essere cacciati, permettono di mantenere

queste specie in diverse aree a buoni livelli di densità, anche se tale densità è

piuttosto variabile da zona a zona.

Questo studio è stato effettuato nella Provincia di Belluno, zona dolomitica in

cui il camoscio è una delle specie più diffuse e rappresentative, nella Provincia di

Lecco in cui vi sono numerose aree protette e zone adibite alla caccia, e nel

versante spagnolo dei Pirenei. In tutte queste zone le popolazioni di camoscio siano

esse di camoscio alpino o piraneaico sono continuamente minacciate da parassitosi

ed epidemie di vario genere che causano ciclicamente pesanti perdite di individui,

ed anche se il camoscio non è una specie in pericolo di estinzione certamente la

drastica diminuzione della sua densità in determinate aree, potrebbe implicare

problematiche relativamente alla politica di conservazione ed all’interesse

venatorio a cui è soggetta questa specie.

Le popolazioni di camoscio alpino sono state soggette ciclicamente (ogni 15

anni circa) a drastiche riduzioni della densità di popolazione a causa in particolar

modo della rogna sarcoptica (Guberti & Zamboni 2000), infestazione che ha

pesantemente colpito le popolazioni della Provincia di Belluno.

La comprensione dei processi di generazione e mantenimento della variabilità

genetica con l’individuazione di markers che forniscono ai portatori una resistenza

98

a specifici patogeni, potrebbe risultare fondamentale nella gestione delle risorse e

nel controllo sanitario delle popolazioni di camoscio.

Questo studio perciò si colloca in una serie di ricerche che sono cominciate, in

Italia, a seguito del primo evento di rogna sarcoptica nel Bellunese che nel 1995

provocò un collasso demografico di camosci alpini pari all’80% degli individui delle

popolazioni colpite, e che hanno il fine di comprendere il livello e la distribuzione

della variabilità genetica adattativa nei camosci.

Nel corso dello studio, si sono aggiunti alla ricerca campioni provenienti da altre

regioni e sottoposti ad altri agenti patogeni, offrendo a possibilità di studiare in

modo più approfondito la variabilità a livello intra popolazioni e inter specifico.

Gli scopi di questa tesi di dottorato sono volti a ottenere informazioni sulla

variabilità genetica e sulla struttura delle popolazioni di camoscio alpino della

Provinica di Belluno e della Provincia di Lecco, e delle popolazioni di camoscio

pirenaico del versante spagnolo dei Pirenei utilizzando un gene codificante per

proteine del complesso maggiore di istocompatibilità coinvolto nella risposta

immunitaria e quindi sicuramente sottoposto a processi selettivi adattativi.

4.1 Variabilità genetica delle popolazioni di camoscio

La variabilità dei geni del sistema MHC è un indicatore per la resistenza a

parassiti e patogeni che a turno possono influenzare la probabilità di sopravvivenza

a lungo termine delle popolazioni. Il polimorfismo del locus MHC si pensa sia

mantenuto dalla selezione bilanciante (Hedrick & Thompson 1987), che può essere

il risultato di una superiorità degli eterozigoti oppure di un vantaggio per gli alleli

rari (Hughes & Yeage, 1998). La prima ipotesi prevede una selezione a favore degli

eterozigoti rispetto agli individui omozigoti, per il fatto che i primi potrebbero

99

essere più resistenti a diversi patogeni grazie alla possibilità di disporre di differenti

arrangiamenti di MHC adatti a presentare un maggior numero di antigeni ai

linfociti. La seconda ipotesi prevede che gli alleli rari siano selezionati

positivamente (per il fatto che i patogeni sono adattati a sfuggire alle forme più

frequenti di molecole MHC), e che quindi si instauri un classico ciclo ospite-

parassita di selezione frequenza dipendente.

I risultati della presente ricerca hanno evidenziato come in generale le

sequenze analizzate hanno un elevato valore di variabilità a livello aplotipico, ma

certamente interessante risulta essere una differenza tra la variabilità attesa e

quella osservata nei camosci di Auronzo morti per rogna. Le analisi degli aplotipi

mostrano infatti un valore di eterozigosità osservata piuttosto elevato H0 = 0,7863,

con un cospicuo numero di alleli (19).

La selezione non sembrerebbe favorire gli eterozigoti ma in questo caso

sembrerebbero selezionati positivamente più gli individui portatori di un allele raro.

Inoltre, si potrebbe pensare che per un camoscio possedere l’allele più frequente

(Ruru-DRB*01), forse già selezionato in precedenti episodi epidemici e ancora

efficiente contro il parassita, potrebbe aver conferito una maggiore resistenza. Ma

analizzando il genotipo si è riscontrato che questo aplotipo è frequente in

omozigosi tra gli individui morti di rogna. Al contrario, è il genotipo Ruru-DRB*01-

Ruru-DRB (non 01), ovvero il genotipo eterozigote per l’allele Ruru-DRB*01 in

combinazione con un qualsiasi altro allele, che nel campione di animali ammalati

risulta in numero inferiore (Tab. 10).

100

Codice Genotipo

1(rr1) Ruru-DRB*01

0(rr2) Ruru-DRB*01/ Ruru-DRB*41

0+(rr3) Ruru-DRB*42/ Ruru-DRB*43

122/97(rr4) Ruru-DRB*01

123/97(rr5) Ruru-DRB*01/ Ruru-DRB*44

128/98(rr6) Ruru-DRB*01





19/08/1997(rr11) Ruru-DRB*04/ Ruru-DRB*46

2aaf(rr12) Ruru-DRB*01

2aam(rr13) Ruru-DRB*01

3aaf97(rr14) Ruru-DRB*01/ Ruru-DRB*27

3aam98(rr15) Ruru-DRB*01/ Ruru-DRB*27





6aam98(rr20) Ruru-DRB*01



9aam97(rr23) Ruru-DRB*01

9m(rr24) Ruru-DRB*41/ Ruru-DRB*52

NS(rr67) Ruru-DRB*01

Tabella 10 Individui omozigoti prelevati da Auronzo 1997/98 morti per rogna sarcoptica e relatipo genotipo

Sebbene ulteriori analisi siano necessarie, anche attraverso l’utilizzo di

campioni più numerosi, questo risultato è molto interessante, in quanto

sembrerebbe indicare che gli animali meglio resistenti all’epidemia del 1997/98

sono stati quelli eterozigoti che possedevano però un allele Ruru-DRB*01. Quindi,

si tratterebbe di un processo di selezione a favore di uno specifico set di

eterozigoti, che sarebbero in grado di garantire una maggiore possibilità di

riconoscimento dell’antigene, ma anche, grazie alla presenza di uno specifico

aplotipo (Ruru-DRB*01 nel nostro caso), di resistere ad una malattia prevalente. La

complessità della relazione tra variabilità del sistema MHC e diversità dei ceppi

patogeni è confermata da diversi studi (Paterson et al., 1998; Langefors et al.,

2001; Bernatchez & Landry 2003), e quindi sarebbe molto interessante

101

approfondire meglio l’ipotesi avanzata in questa tesi sulla situazione del camoscio

alpino.

Altro punto da discutere è il risultato della diversità genetica riscontrata nel

campione della Provincia di Lecco relativa agli individui prelevati successivamente

all’epidemia di polmonite che colpi questa regione nel 2004. Gli individui

sopravvissuti hanno un valore di H0 = 0,469, inferiore alla diversità genetica

riscontrata nelle popolazioni campionate prima dell’epidemia di polmonite della

stessa regione (H0 = 0,6488) e delle popolazioni sopravvissute (H0 = 0,674) e

resistenti (H0 = 0,757) alla rogna sarcoptica della Provincia di Belluno. Un’ipotesi

plausibile potrebbe essere l’effetto del collo di bottiglia post epidemico. L’epidemia

avrebbe causato la perdita di variabilità genetica e quindi di eterozigosi, In questo

campione, infatti, si riscontra il più alto numero di omozigosi (13) rispetto al

campione prelevato prima del crash epidemico (9) e agli altri campioni della

Provincia di Belluno (tra 1 e 8). Questo dato concorda con i risultati di altri Autori

(Hedrick et al. 2000; Mikko & Andersson 1995; Mikko et al. 1999; Schmulder et al.

2003; Schaschal et al. 2005).

A livello inter specifico si è notata una maggiore variabilità genetica per il

camoscio alpino rispetto al camoscio pirenaico. Questo risultato è in accordo con

altri Autori (Alvarez-Busto et al. 2007) ma è probabilmente anche connesso alla

dimensione del campione esaminato (127 individui italiani contro 55 individui

spagnoli). La ridotta variabilità genetica delle MHC è stata riscontrata anche in studi

su altri ungulati a seguito di colli di bottigli (Ellegren et al. 1993; Mikko & Andersson

1995, Mikko et al. 1999).

Gli aplotipi Ruru-DRB*01- Rupy-DRB*02, infine, oltre a risultare i più comuni tra

gli individui campionati, vengono condivisi dalle due specie esaminate sulla base

dei 206 nucleotidi esaminati nel presente studio. Si tratta, probabilmente, di un

102

gene ancestrale ereditato dalle due specie a seguito di selezione conservativa come

suggerito da Doxiadis et al 2006.

4.2 Variabilità nucleotidica delle popolazioni di camoscio

La selezione positiva dell’esone 2 delle MHC è determinante per entrambe le

specie esaminate. La variabilità dei riarrangiamenti amminoacidici corrispondenti al

sito di legame della regione PBR dell’MHC che permette il riconoscimento di

antigeni provenienti da patogeni, è fondamentale per il persistere di una

popolazione. Maggiore è la variabilità di questa regione maggiore è la possibilità di

rispondere a patogeni diversi.

Tra i 58 aplotipi trovati, tutti codificanti, sono state identificate 24 posizioni

variabili. Sul totale, 8 variazioni cadono in prima posizione codonica, 14 in seconda

posizione codonica e solo 2 in terza posizione codonica. Questa disposizione dei siti

variabili nelle prime due posizioni delle triplette codoniche è piuttosto inusuale

nelle sequenze codificanti. Nelle regioni genomiche che codificano per proteine, la

variabilità genetica si accumula in genere nella terza posizione del codone, poiché

le variazioni nella prima e seconda posizione della tripletta viene in genere

selezionata negativamente, in quanto in grado di alterare la funzionalità della

proteina codificata. Al contrario nella regione del gene DRB, la variazione

nucleotidica che altera la sequenza aminoacidica codificata viene selezionata

positivamente (Yang & Bielawski 2000; Hughes & Nei 1988, 1989; Bergstrom &

Gyllensten 1995; Bernatchez & Landry 2003), poiché essa corrisponde a una

maggiore possibilità di riconoscere antigeni diversi e per questo motivo contribuire

a una maggiore efficienza nel riconoscimento di patogeni diversi e/o di varianti

dello stesso organismo patogeno.

103

L’analisi condotta mediante AMOVA (Analysis of MOlecular VAriance) permette

di collegare la variazione genica con caratteristiche biologiche scelte volta per

volta. Nel corso del presente studio le popolazioni sono state suddivise in due

gruppi, quelle sensibili agli eventi epidemici, sia da rogna sarcoptica sia da

polmonite dalla Provincia di Lecco, e quelle in qualche modo considerate resistenti,

includendo anche quella popolazione di camoscio sopravvissuta all’epidemia di

polmonite. I risultati di tale analisi, non hanno evidenziato un differenziamento

significativo nell’AMOVA. Tuttavia, i valori di varianza molecolare osservati nel

confronto sani/malati (3,36 della percentuale di varianza) è maggiore della varianza

tra popolazioni nell’ambito dei due gruppi sopra citati (0,5). Questo dato, sebbene

preliminare, non permette di rifiutare l’ipotesi che i dati in nostro possesso

possano evidenziare una varianza molecolare significativa tra le popolazioni

resistenti e quelle suscettibili.

Inoltre, i dati indicherebbero un sostanziale e significativo differenziamento

genetico della popolazione resistente di Calalzo.

105

CONCLUSIONI

Lo studio condotto ha permesso di analizzare in profondità la struttura genetica

di diverse popolazioni di camoscio provenienti dal Parco delle Dolomiti Bellunesi,

anche a confronto con popolazioni provenienti dalla Provincia di Lecco, prima e

dopo un evento epidemico di polmonite. In più ha contribuito alla maggiore

conoscenza della variabilità genetica delle MHC della specie Rupicapra p.

pyrenaica.

Sebbene l’analisi effettuata non abbia permesso di individuare con certezza

aplotipi e/o domini caratteristici delle popolazioni resistenti, e che pertanto

potessero essere utilizzati come markers per la resistenza agli organismi patogeni, i

risultati ottenuti hanno condotto a una definizione della struttura genetica delle

popolazioni di camoscio caratterizzate da un diverso rapporto con le infestazioni

dovute all’agente eziologico della rogna sarcoptica, Sarcoptes scabiei. Di particolare

utilità è stato il confronto con le popolazioni di camoscio dalla Provincia di Lecco, in

quanto campionate in due momenti diversi, prima e dopo un’epidemia di

polmonite e con le popolazioni di camoscio pirenaico affette da pestivirus e da altre

patologie.

Numerosi autori hanno evidenziato che lo studio della variabilità genetica nelle

popolazioni ospiti fornisce spesso indicazioni contrastanti, dipendenti dal modello

ospite-parassita, dalla possibilità di co-infezioni simultanee e dalla variabilità

genetica della popolazione parassita. Alcuni patogeni di origine virale e batterica

possono indurre, grazie alla loro variabilità, un aumento dell’eterozigosi, in

considerazione del fatto che gli individui eterozigoti dimostrerebbero un vantaggio

106

selettivo nella risposta al patogeno. Questo vantaggio dell’eterozigote non è stato

però confermato in sistemi ospite/parassita dove il patogeno era un organismo

pluricellulare, complesso.

Le infestazioni da rogna sarcoptica, provocando un’elevata mortalità,

potrebbero vanificare l’effetto del vantaggio conferito agli individui e alle

popolazioni più variabili, poiché il collo di bottiglia determinato dalla mortalità degli

individui porta necessariamente a una riduzione sensibile della variabilità genetica.

Si ritiene fondamentale un monitoraggio continuato nel tempo, che possa

evidenziare cambiamenti nella struttura genetica delle popolazioni e il selezionarsi

di individui capaci di resistere alle infezioni parassitarie, a confronto con la

dinamica delle popolazioni, con l’andamento demografico e con altri fattori (clima,

altitudine, effetti dell’attività dell’uomo) che possano influenzarne le

caratteristiche.

107

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Allegati

Allegato 1: Evoluzione della Rogna sarcoptica nelle Dolomiti. In nero gli

individui ritrovati morti, in azzurro quelli malati che sono stati avvistati.

Nel 1995 si registrano i primi casi di Rogna nella riserva di Auronzo (Valarzon); fino al 1996 la malattia rimane circoscritta alla Provincia di Belluno.

Tra il 1997 e il 1999 l’epidemia si estende alla provincia di Bolzano (gruppo del Monte Cristallo al gruppo delle Marmarole)

Nel 2000 viene registrato un notevole balzo verso ovest con la comparsa della Rogna a Livinallongo e in Alta Badia. Nel 2001 l’epidemia raggiunge il gruppo della Sella

Nel 2002 si allarga l’area colpita dall’epidemia e i maggiori focolai tendono ad unirsi, la malattia infatti colpisce il gruppo delle Tofane.

126

Nel 2003 l’area maggiormente colpita si trova tra il gruppo delle Tofane e quello della Croda Rossa (colpendo il Parco Regole d’Ampezzo). Inoltre l’epidemia trapassa il fiume Piave.

Nel 2004 l’epidemia colpisce fortemente le province di Bolzano e Trento, mentre in provincia di Belluno sono interessate due nuove zone: il versante sud del gruppo delle Marmarole e il gruppo della Marmolada.

127

Allegato 2a: Caratteristiche specifiche dei campioni esaminati prelevati dalla

Provincia di Belluno

protocollo Codice

campione Provenienza Località sito data sesso età Status

1 rr1

Auronzo di Cadore 97/98

Dolomiti di Sesto

Val Marzon

06/01/1997

morti di rogna

O rr2 30/01/1997 M O

0+ rr3 03/03/1998 F 0+

122/97 rr4 1997

123/97 rr5 1997

128/98 rr6 1998

129/98 rr7 1998

130/98 rr8 1998

132/98 rr9 1998

135/98 rr10 1998

19/08/1997 rr11 19/08/1997 M ?

2aaf rr12 20/03/1998 F 2

2aam rr13 05/11/1997 M 2

3aaf97 rr14 08/01/1997 F 3

3aaf98 rr15 16/03/1998 F 3

3aam97 rr16 06/12/1997 M 3

3aam98 rr17 15/03/1998 M 3

4aaf98 rr18 22/03/1998 F 4

5aaf98 rr19 22/03/1998 F 5

5aam97 rr20 20/11/1997 M 5

6aam98 rr21 26/03/1998 M 5

7aaf98 rr22 12/03/1998 F 7

9aam97 rr23 18/12/1997 M 9

9m rr24 08/03/1998 F 9mesi

NS rr67 np

m NON SEQ. 12/11/1998 M

AU1 rr25

Auronzo di Cadore

Dolomiti di Sesto

Tre Cime 6/11/2004 0

sopravvissuti AU2 rr26 Maraia 12/12/2004 0

AU3 rr27 Gravasecca 18/11/2004 M

CA1 rr28

Calalzo di Cadore

Marmarole

26/9/2004 F 1 resistenti

CA2 rr37 27/11/2004 M 3

CA3 rr48 27/11/2004 F 0

CA4 rr50 4/12/2004 F 1

CA5 rr51 3/11/2004 M 2

CA6 rr52 30/9/2004 F 2

CA7 rr54 24/11/2004 M 0

CA8 rr53 Col Piccolo 16/10/2004 F 1

CA9 rr55 4/12/2004 F 1

CA10 rr29 21/11/2004 F

128

CA11 rr30 4/12/2004 M 2

CA12 rr31 8/12/2004 F 5

CA13 rr32 18/11/2004 F

CA14 rr33 5/12/2004 M 1

CA15 rr34 18/11/2004 F

CA16 rr35 Col Gran 9/10/2004 F 11

Li1 rr56

Livinallongo del Col di

Lana Migogn

Forfes 7/11/2004 M 2 resistenti

Li2 rr61 Ossario Pordoi 13/11/2004 M 2

Li6 rr63 Col Sentil Boè 19/9/2004 F 1

Li5 rr62 Gruppo di Sella 25/10/2004 M 11

Li7 rr64 Pale Monte Ornella 25/9/2004 F 9 affetto da rogna

Li8 rr65 Pizac 26/9/2004 M 1 resistenti

Li9 rr66 Pala Cuzinela 7/11/2004 M 3

Li10 rr58 Pale Monte Ornella 25/9/2004 F 1

Li11 rr59 Pale Pizac 14/10/2004 F 12

Li13 rr57 Bec De Le Forfes 17/10/2004 M 5

Li14 rr60 Selegacia Monte Foppa 4/11/2004 M 6

RP1 rr68 Rocca Pietore

Migogn Marmolada-Monzoni 23/10/2004 resistenti

RP4 rr69 6/11/2004

Au22 rr70

Auronzo di Cadore

Dolomiti di Sesto

Aiarnola 17-nov-05 F 1 post epidemico

Au23 rr71 Cengia 20-nov-05 F 2

Au24 rr72 Monte Cristallo

Pausa Marza 14-dic-05 M 0

Au25 rr73 Pausa Marza 30-nov-05 M 2

Au26 rr74

Dolomiti di Sesto

Arghena 05-nov-05 M 1

Au27 rr75 Carpi 06-nov-05 F 3

Au28 rr76 Monte Piana 19-nov-05 M 8 sopravvissuto

Au29 rr77 Pian Cavallo 12-nov-05 M 9

Au30 rr78 Ciadin Verde 16-nov-05 M 2 post epidemico

Au31 rr79 Monte

Cristallo Popena 20-nov-05

F 2

Au32 rr80

Dolomiti di Sesto

Carpi 24-nov-05 F 1

Au33 rr81 Carpi 19-nov-05 M 2

Au34 rr82 Cengia 10-dic-05 M 1

Au35 rr83 Tre Cime 07-dic-05 F 2

Au36 rr84 Cengia 09-nov-05 M 11 sopravvissuto

Au37 rr85 Monte Cristallo

Pausa Marza 23-nov-05 M 8

Au38 rr86 Pausa Marza 12-dic-05 F 2 post epidemico

Au39 NON SEQ. Dolomiti di

Sesto Cadini Misurina 31-ott-05 F 1

CA19 rr36

Calalzo di Cadore

Marmarole

Pis 10-dic-05 M 3 resistenti

CA20 rr38 Col Gran 25-set-05 F 1

CA21 rr39 Col Gran 07-dic-05 F 2

CA22 rr40 Scotter 19-nov-05 M 0

CA23 rr41 Col Gran 08-dic-05 M 5

129

CA24 rr42 Pociaval 15-set-05 F 1

CA25 rr43 Vanedel 24-set-05 F 1

CA26 rr44 Pedolas 10-dic-05 F 8

CA27 rr45 Pociaval 13-nov-05 M 3

CA28 rr46 Pociaval 12-dic-05 M 3

CA29 rr47 Pociaval 13-nov-05 M 2

CA30 rr49 Tiesse 17-nov-05 F 6

Allegato 2b: Caratteristiche specifiche dei campioni prelevati dalla Provincia di

lecco

protocollo codice

campione sito di

campionamento sesso età

Data di campionamento

Status

4359 rr87

Pizzo Cavallo

F 1 2004 post-outbreak

4360 rr88 F 7 2004 pre-outbreak

4373 rr89 F 1 2004 post-outbreak


4403 rr91 M 10 2004 pre-outbreak


4409 rr93 M 3 2004 post-outbreak


4486 rr95

Val Marcia

M 0 2004 post-outbreak





4497 M 5 2004 pre-outbreak non seq






4542 rr105

Campelli-Maesimo

M 3 2004 post-outbreak






130


4556 rr112 ignoto 0 2004 post-outbreak


4558 ignoto 1 2004 post-outbreak non seq

4559 M 5 2004 pre-outbreak non seq






4572 rr119 M 4 2004 pre-outbreak non seq



PN62/2002 rr122

Provincia di Lecco

M adulto 2004 pre-outbreak

PN81/2002 rr123 M 5 2004 pre-outbreak

PN123/2002 rr124 M 1 2004 post-outbreak

PN322/2000 M 3 2004 pre-outbreak non seq

PN323/2000 rr125 F 3 2004 pre-outbreak

PN331/2000 rr126 F piccolo 2004 post-outbreak

PP1355/2000 rr127 piccolo 2004 post-outbreak

Allegato 2c: Caratteristiche specifiche dei campioni pervenuti dalla regione

spagnola dei Pirenei (S= individui sani; M= individui parassitati; P= individui

affetti da pestivirus)

PROTOCOLLO CODICE AREA SEX YEAR HEALTH STATUS

RP-04 rp45 CADÍ F 1991 S

RP-23 rp46 CADÍ F 1991 M

RP-02/96 rp18 FRESER F 1996 M

RP-03/99 rp21 CADÍ F 1999 S

RP-05/99 rp24 CADÍ F 1999 M

RP-C-8 rp51 CADÍ M 2000 S

RP-07/01 rp36 APA F 2001 P

RP-C-20 rp47 CADÍ F 2001 S

RP-10/02 rp37 APA F 2002 P

RP-13/02 rp40 CADÍ F 2002 M

131

RP-14/02 rp43 PN F 2002 M

RP-15/02 rp44 ARAN M 2002 M

RP-15/02 rp59 ARAN M 2002 M

RP-04/03 rp22 APA M 2003 M

RP-09/03 rp50 APA F 2003 M

RP-10/03 rp38 CADÍ F 2003 S

RP-13/03 rp41 ARAN M 2003 S

RP-01/04 rp56 ARAN M 2004 S

RP-03/04 rp19 ARAN M 2004 M

RP-04/04 rp66 ARAN M 2004 M

RP-05/04 rp67 ARAN F 2004 S

RP-05/05 rp23 CERDANYA M 2005 P




RP-26/05 rp55 ARAN F 2005 P

RP-30/05 rp60 CADÍ M 2005 S

RP-35/05 rp54 CADÍ F 2005 M

RP-49/05 rp65 ARAN M 2005 S

RP-05/06 rp63 APA F 2006 M

RP-12/06 rp64 ARAN M 2006 M

RP-15/06 rp15 APA M 2006 M

RP-16/06 rp14 APA F 2006 M

RP-18/06 rp16 CADÍ F 2006 M

RP-19/06 rp52 CADÍ-Be M 2006 M

RP-19/06 rp62 CADÍ-Be M 2006 M

RP-38/06 rp34 CADÍ-Be M 2006 P

RP-39/06 rp57 CADÍ M 2006 P

RP-48/06 rp35 CADÍ F 2006 P

RP-06/07 rp26 APA F 2007 P

RP-12/07 rp28 ARAN F 2007 M

RP-13/07 rp42 FRESER M 2007 P

RP-22/07 rp53 CADÍ M 2007 P

RP-33/07 rp29 FRESER F 2007 S

RP-34/07 rp30 FRESER M 2007 S




132







RP-12/08 rp39 PALLARS F 2008 P

133

Allegato 3a: Allineamento nucleotidico delle sequenze dei campioni italiani e di

quelle depositate in GenBank per R. r. rupicapra

Ruru-DRB*01 GAG TAT CAT AAG AGC GAG TGT CAT TTC TTC AAC GGG ACC GAG CGG GTG CGG TTC CTG GAC [ 60]

Ruru-DRB*02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. [ 60]

Ruru-DRB*03 ... ... AC. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*04 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*05 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*07 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*08 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*09 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Ruru-DRB*10 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*11 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. [ 60]

Ruru-DRB*12 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*13 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*14 ... ... AG. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*15 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*16 ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*17 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*18 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*19 ... ... AC. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Ruru-DRB*21 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*22 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*23 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*24 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*25 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*26 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*27 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*28 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*29 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*30 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*31 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*32 ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*33 ... ... A.. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*34 ... ... AC. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*35 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Ruru-DRB*36 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Ruru-DRB*37 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Ruru-DRB*38 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*39 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Ruru-DRB*40 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

1SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

0)SUSCET ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

0+SUSCETT ... ... MS. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

122SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

123SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

128SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

129SUSCET ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

130SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

132SUSCET ... ... M.. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

135SUSCET ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

190897SUS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

2aaf98SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

2aam97SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

3aaf97SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

3aaf98SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

3aam97SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

3aam98SUS ... ... MG. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4aaf98SUS ... ... M.. ... .RA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

5aaf98SUS ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

5aam97SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

6aaSUSCET ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

7aaf98SUS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

9aam97SUS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

9mSUSCETT ... ... AS. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

AU1SOPRAV ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

AU2SOPRAV ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

AU3SOPRAV ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA1RESIST ... ... MS. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA10RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA11RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA12RESIS ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA13RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA14RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA15RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA16RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA19RESIS ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA2RESIST ... ... MG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA20RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA21RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

134

CA22RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA23RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA24RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA25RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA26RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA27RESIS ... ... MS. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA28RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA29RESIS ... ... AS. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA3RESIST ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA30RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA4RESIST ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

CA5RESIST ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA6RESIST ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA8RESIST ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA7RESIST ... ... AC. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

CA9RESIST ... ... MG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Li1RESIST ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li13RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li10RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li11RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Li14RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li2RESIST ... ... MG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Li5RESIST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li6RESIST ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Li7RESIST ... ... AS. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li8RESIST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Li9RESIST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

NSSUSCETT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

RP1RESIST ... ... MG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

RP4RESIST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au22RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au23RESIS ... ... MR. ... ..Y ... ... ... ..Y ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au24RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au25RESIS ... ... .M. ... ... ... ... ... ..Y ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Au26RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ..Y ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au27RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Au28RESIS ... ... M.. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au29RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au30RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au31RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au32RESIS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au33RESIS ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au34RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au35RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au36RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ..Y ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Au37RESIS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Au38RESIS ... ... ... ... ... ... ... ... ..Y ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4359cavPOST ... ... MS. ... .RA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ?.. ... ... [ 60]

4360cavaPRE ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4373cavPOST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4402cavaPRE ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

4403cavaPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4405cavaPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4409cavPOST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4410cavaPRE ... ... MS. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4486marPOST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4487marPOST ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4488marCPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4489marPOST ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4493marPOST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4503marPOST ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

4504marPOST ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4505marPOST ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4506marcPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4507marCPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4542campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4544campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4547campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4548campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4553campPOS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4554campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4555campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4556campPOS ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

4557campPOS ... ... .R. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

4562campPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4564campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4564age3camPO ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4571campPOS ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4572mcamPRE ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

4572fcamPOS ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

4573campPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

4575campPRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

PN62POSTOUT ... ... MM. ... .RM ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

PN81POSTOUT ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

PN123OUTBRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

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135

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138

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PN331OUTBRE ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

PP1355OUTBR ... ... ... ... ... ... ... .S. RM. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Ruru-DRB*01 GAG CGG AGG CGG GCC GCG GTG GAC A [205]

Ruru-DRB*02 ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*03 ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*04 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*05 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

139

Ruru-DRB*06 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*07 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*08 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*09 ... .A. ... ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*10 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*11 ... .A. .C. ... ... ... ... ... . [205]

Ruru-DRB*12 ... .A. .C. .A. ... ... ... ... . [205]

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Ruru-DRB*18 ... .A. .C. ... ... ... ... ... . [205]

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Ruru-DRB*21 ... .A. .C. ... ... ... ... ... . [205]

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Ruru-DRB*40 ... ... .A. ... ... ... ... ... . [205]

1SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

0)SUSCET ... .R. .S. ... ... ... ... ... . [205]

0+SUSCETT ... .A. .S. ... ... ... ... ... . [205]

122SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

123SUSCET ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

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190897SUS ... ... .R. ... ... ... ... ... . [205]

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7aaf98SUS ... .R. ... ... ... ... ... ... . [205]

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9mSUSCETT ... .A. .C. ... ... ... ... ... . [205]

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AU3SOPRAV ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

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140

CA6RESIST ... .R. .S. ... ... ... ... ... . [205]

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PN62POSTOUT ... .R. .S. ... ... ... ... ... . [205]

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PN123OUTBRE ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

PN323OUTBRE ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

PN331OUTBRE ... ... ... ... ... ... ... ... . [205]

PP1355OUTBR ... .R. .S. ... ... ... ... ... . [205]

Allegato 3b: Allineamento nucleotidico delle sequenze dei campioni spagnoli e di quelle depositate in GenBank per R. p. pyrenaica

141

Rupy-DRB1*01A GAG TAT CAT AAG AGC GAG TGT CAT TTC TTC AAC GGG ACC GAG CGG GTG CGG TTC CTG GAC [ 60]

Rupy-DRB1*02A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*03A ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*04A ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*05A ... ... AC. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*06A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*07A ... ... AC. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*08A ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*09A ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*10A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*11A ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

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16.06.HL032 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

15.06 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

18.06 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

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35.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

26.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

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39.06 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

12.05 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

15.02 ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

30.05 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

01.09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

19.06 ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

05.06 ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

12.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

49.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

04.04 ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

05.04 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

06.05 ... ... MR. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Y.. ... ... [ 60]

Rupy-DRB1*01A AGA TAC TTC CAT AAT GGA GAA GAG TTC GTG CGC TTC AAC AGC GAC TGG GGC GAG TAC CGG [120]

Rupy-DRB1*02A ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

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16.06.HL032 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

15.06 ... ... ... T.. ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

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142

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35.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

26.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

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39.06 ... ... ... T.. ... ... ... ... .A. .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

12.05 ... ... ... T.. ... ... ... ... .A. .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

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01.09 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

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05.06 ... ... ... Y.. ... ... ... ... .WS .Y. ... ... R.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

12.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

49.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

04.04 ... ... ... Y.. ... ... ... ... .WS .Y. ... ... R.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

05.04 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

06.05 ... ... ... Y.. ... ... ... ... .WS .Y. ... ... R.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Rupy-DRB1*01A GCG GTG GCC GAG CTG GGG CGG CCG ACC GCC GAG CAC TGG AAC AGC CAG AAG GAG ATT CTG [180]

Rupy-DRB1*02A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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Rupy-DRB1*12A ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Rupy-DRB1*13A ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

16.06.HL032 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

15.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

18.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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RP06.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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38.07 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

12.07 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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RP34.07 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

RP35.07 ... ... ... ... ... ... ... .S. RM. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

RP36.07 ... ... ... ... ... ... ... .S. RM. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

RP37.07 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

RP38.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

143

RP48.06 ... ... ... ... ... ... ... .S. RM. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

RP7.01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

RP10.02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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RP12.08 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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RPC20.HL032 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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RP09.03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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RP19.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

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35.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

26.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

1.04 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

39.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

12.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

15.02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

30.05 ... ... ... ... ... ... ... .S. RM. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

01.09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

19.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

05.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

12.06 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

49.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

04.04 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

05.04 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

06.05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Rupy-DRB1*01A GAG CAG AGG CGG GCC GAG GTG GAC AC [206]

Rupy-DRB1*02A ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

Rupy-DRB1*03A ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

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Rupy-DRB1*07A ... .G. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

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Rupy-DRB1*12A ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

Rupy-DRB1*13A ... ... .C. ... ... .C. ... ... .. [206]

16.06.HL032 ... ... ... ... ... .C. ... ... .. [206]

15.06 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

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RP4.HL032 ... ... .S. ... ... .C. ... ... .. [206]

RP23.HL032 ... ... .S. ... ... .C. ... ... .. [206]

RPC20.HL032 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

RP708.HL032 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

RP808.HL032 ... .R. .S. ... ... .C. ... ... .. [206]

RP09.03 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

RPC8 ... .R. .S. ... ... .C. ... ... .. [206]

144

RP19.06 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

RP22.07 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

35.05 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

26.05 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

1.04 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

39.06 ... ... ... ... ... .C. ... ... .. [206]

12.05 ... ... ... ... ... .C. ... ... .. [206]

15.02 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

30.05 ... ... .S. ... ... .C. ... ... .. [206]

01.09 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

19.06 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

05.06 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

12.06 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

49.05 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

04.04 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

05.04 ... .G. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

06.05 ... .R. ... ... ... .C. ... ... .. [206]

145

Allegato 4: Allineamento nucleotidico dei 58 aplotipi ricostruiti per R. r. rupicapra e R. p. pyrenaica. Il risultato ottenuto dalla ricostruzione degli aplotipi (diplotipi) mediante HAP (A e B indicano i 2 aplotipi ottenuti per ogni individuo analizzato) e dall’analisi degli aplotipi mediante DnaSP5. La ricostruzione aplotipica è stata condotta mediante confronto con gli aplotipi depositati in GenBank in riferimento alle due specie R. r. rupicapra e R. p. pyrenaica (Rispettivamente RuruDRB*01-RuruDRB*40 e RupyDRB*01-RupyDRB*13). In base agli aplotipi doppi ottenuti per ogni individuo è stato creato il file in DnaSP che ha permesso l’analisi degli aplotipi stessi (assegnando gli individui agli aplotipi ottenuti) e successivamente è stato creato il file input per l’analisi di popolazione con Arlequin.

(Hap_n= nome dell’aplotipo assegnato da DnaSP; il numero dopo i due punti indica quanti individui hanno quell’aplotipo; nelle parentesi ci sono gli individui in riferimento all’aplotipo) Quando è indicato un aplotipo depositato in parentesi dopo l’aplotipo ricostruito significa che c’è identità fra i due aplotipi.

Hap_1 GAG TAT CAT AAG AGC GAG TGT CAT TTC TTC AAC GGG ACC GAG CGG GTG CGG TTC CTG GAC [ 60]

Hap_2 ... ... AG. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_3 ... ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_4 ... ... AG. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_7 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_8 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_9 ... ... A.. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_10 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_11 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_13 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_14 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_15 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_16 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_17 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_19 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_20 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_21 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_22 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_23 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_24 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_25 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_26 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_27 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_28 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_29 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_30 ... ... AG. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_31 ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_32 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_33 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_34 ... ... AC. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_35 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_36 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_37 ... ... AC. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_38 ... ... AG. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_39 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_40 ... ... AC. ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_41 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_42 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_43 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_44 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_45 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_46 ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_47 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_48 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_49 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_50 ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_51 ... ... .C. ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_52 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_53 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_54 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

146

Hap_55 ... ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_56 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_57 ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... [ 60]

Hap_58 .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]

Hap_1 AGA TAC TTC CAT AAT GGA GAA GAG TTG GTG CGC TTC GAC AGC GAC TGG GGC GAG TAC CGG [120]

Hap_2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_4 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_8 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_9 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_10 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_11 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_13 ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_14 ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_15 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_16 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_17 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_19 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_20 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_21 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_22 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_23 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_24 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_25 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_26 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_27 ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_28 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_29 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_30 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_31 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_32 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_33 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_35 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_36 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_38 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_39 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_40 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_41 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_42 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_43 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_44 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_45 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_46 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_47 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_48 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... [120]

Hap_49 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_50 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_51 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_52 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .A. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_53 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_54 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_55 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_56 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_57 ... ... ... T.. ... ... ... ... .AC .C. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_58 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]

Hap_1 GCG GTG GCC GAG CTG GGG CGG CCG ACC GCC GAG CAC TGG AAC AGC CAG AAG GAG ATT CTG [180]

Hap_2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_4 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_5 ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_6 ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_7 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_8 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_9 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_10 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_11 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_12 ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_13 ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_14 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_15 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_16 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_17 ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_18 ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_19 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_20 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_21 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_22 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

147

Hap_23 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_24 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_25 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_26 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_27 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_28 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_29 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_30 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_31 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_32 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_33 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_35 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_36 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_38 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_39 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_40 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_41 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_42 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_43 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_44 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_45 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_46 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_47 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_48 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_49 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_50 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_51 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_52 ... ... ... ... ... ... ... .G. GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_53 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_54 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_55 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_56 ... ... ... AG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_57 ... ... ... ... ... ... ... ... GA. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_58 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]

Hap_1 GAG CGG AGG CGG GCC GCG GTG GAC AC [206]

Hap_2 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_3 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_4 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_5 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_6 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_7 ... ... .A. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_8 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_9 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_10 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_11 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_12 ... .A. ... ... ... .A. ... ... .. [206]

Hap_13 ... .A. ... ... ... .A. ... ... .. [206]

Hap_14 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_15 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_16 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_17 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_18 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_19 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_20 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_21 ... ... ... GC. ... ... ... ... .. [206]

Hap_22 ... .A. .C. GC. ... ... ... ... .. [206]

Hap_23 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_24 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_25 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_26 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_27 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_28 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_29 ... ... .T. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_30 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_31 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_32 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_33 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_34 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_35 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_36 ... .A. .A. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_37 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_38 ... .A. .A. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_39 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_40 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_41 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_42 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_43 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_44 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_45 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_46 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_47 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_48 ... ... .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_49 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

148

Hap_50 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_51 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_52 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_53 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_54 ... .A. .C. ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_55 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_56 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_57 ... .A. ... ... ... ... ... ... .. [206]

Hap_58 ... ... ... ... ... ... ... ... .. [206]

149

Allegato 5: Lista delle corrispondenze fra i 58 aplotipi emersi dall’analisi della regione esonica del locus DRB nel presente studio e la nomenclatura in uso per la definizione degli aplotipi della medesima regione. Gli aplotipi che vanno da Ruru-DRB*01 a Ruru-DRB*40 e da Rupy-DRB*01 a Rupy-DRB*13 sono depositati in GenBank, gli aplotipi da Rupy-DRB*14 a Rupy-DRB*26 sono stati identificati nello studio di Lopez-Olvera J.R. et al (2009). (Riferimento del poster: Characterization of MHC class II DRB1 allelic diversity in Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) Jorge Ramón López-Olvera, Stefano D’Amelio, Ignasi Marco, Serena Cavallero, Laura Fernández, Santiago Lavín). Tali aplotipi sono stati utilizzati come confronto per la ricostruzione degli aplotipi degli individui appartenenti alle popolazioni di camosci italiani e come confronto per le successive analisi di popolazione. Hap_1: Ruru-DRB*01, Rupy-DRB*02 Hap_2: Ruru-DRB*41 Hap_3: Ruru-DRB*42 Hap_4: Ruru-DRB*43 Hap_5: Ruru-DRB*44 Hap_6: Ruru-DRB*45 Hap_7: Ruru-DRB*04 Hap_8: Ruru-DRB*27 Hap_9: Ruru-DRB*33 Hap_10: Ruru-DRB*18 Hap_11: Ruru-DRB*46 Hap_12: Ruru-DRB*47 Hap_13: Ruru-DRB*17 Hap_14: Rupy-DRB*14 Hap_15: Rupy-DRB*15 Hap_16: Rupy-DRB*16 Hap_17: Rupy-DRB*17 Hap_18: Rupy-DRB*18 Hap_19: Rupy-DRB*11 Hap_20: Rupy-DRB*04, Ruru-DRB*13, Ruru-DRB*38 Hap_21: Rupy-DRB*19 Hap_22: Rupy-DRB*20 Hap_23: Rupy-DRB*21 Hap_24: Rupy-DRB*22 Hap_25: Rupy-DRB*23 Hap_26: Rupy-DRB*24 Hap_27: Rupy-DRB*25 Hap_28: Rupy-DRB*26 Hap_29: Ruru-DRB*48 Hap_30: Ruru-DRB*49

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Hap_31: Ruru-DRB*50 Hap_32: Ruru-DRB*51 Hap_33: Ruru-DRB*09 Hap_34: Ruru-DRB*52 Hap_35: Ruru-DRB*53 Hap_36: Ruru-DRB*54 Hap_37: Ruru-DRB*55 Hap_38: Ruru-DRB*56 Hap_39: Ruru-DRB*28 Hap_40: Ruru-DRB*57 Hap_41: Ruru-DRB*58 Hap_42: Ruru-DRB*59 Hap_43: Ruru-DRB*60 Hap_44: Ruru-DRB*61 Hap_45: Ruru-DRB*39 Hap_46: Ruru-DRB*62 Hap_47: Ruru-DRB*63 Hap_48: Ruru-DRB*64 Hap_49: Ruru-DRB*65 Hap_50: Ruru-DRB*66 Hap_51: Ruru-DRB*67 Hap_52: Ruru-DRB*68 Hap_53: Ruru-DRB*69 Hap_54: Ruru-DRB*21 Hap_55: Ruru-DRB*70 Hap_56: Ruru-DRB*71 Hap_57: Ruru-DRB*35, Rupy-DRB*08 Hap_58: Ruru-DRB*72

variabilità genetica di mhc di classe ii locus drb in...

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