van staal tot protocol: wat zegt het apd resultaat? · 2018-05-24 · stalen •biopsies...
TRANSCRIPT
Van staal tot protocol: wat zegt het APD resultaat?
Liesbeth Ferdinande
Dienst Pathologische Anatomie Laboratorium voor kankerdiagnostiek en pathologie
• Stalen en klinische vraagstelling
• Verwerken van stalenRoutine
Vriescoupe
Cytologie
• Bijkomende analysesImmuunhistochemie
FISH
• Kwaliteitszorg
STALEN
• Biopsies
• Chirurgische resectiestukken
• Cytologische stalen
• Autopsies
• Consulten UZ Gent 201721766 biopten/resecties (incl. consulten)3093 cytologiestalen5538 cervixuitstrijkjes58 autopsies
KLINISCHE VRAAGSTELLING
• Diagnostiek• Oncologisch
• Diagnostiek, staging, prognostische en predictieve biomerkers
• Inflammatoir
• Functioneel
• Medicolegaal
• Kwaliteitscontrole
Biopten
• Oppervlakkige biopten• (Punch)biopten van huidafwijkingen• Wegname van kleine huidletsels
• Endoscopische biopten• Laryngoscopie, bronchoscopie, gastroscopie, coloscopie, colposcopie• Biopten van mucosale afwijkingen of tumoren• Wegname van kleine letsels, vb. darmpoliepen
• Naald-, cilinder- en truecutbiopten• Lever(tumoren), nier, longtumoren (transthoracaal), borsttumoren• Aanprikken van oppervlakkige letsels • Onder echo- of CT-geleide van diepere letsels
• Chirurgische biopten• Incisiebiopten, vb. open longbiopsie• Excisiebiopten, vb. wigresectie van longnodule
Chirurgische resectiestukken
• Macroscopie!
Cytologische stalen
• Cervixuitstrijkjes
• Urine
• Ascitesvocht, pleuravocht, cystevocht, cerebrospinaal vocht…
• Fine Needle Aspiration Cytology (FNAC): • Percutaan aanprikken van lymfeklieren of letsels
• Oppervlakkig
• Onder echo- of CT-geleide
• Transoesofagaal (EUS=esophageal ultrasound)/transrectaal/transbronchiaal(EBUS=endobronchial ultrasound) aanprikken van lymfeklieren of letsels (echo-endoscopie)
VERWERKEN VAN STALEN
• Staalontvangst en registratie in LIMS (Laboratory Information Management System)
• Fixatie in formol
• Macroscopie
• Dehydrateren en inbedden in paraffine
• Snijden en kleuren van paraffinecoupes
• Evaluatie van coupes door patholoog
• Eventueel bijkomende analyses
• Protocol maken in LIMS
• Export van protocol naar EPD
Staalontvangst en registratie
• Order met klinische informatie noodzakelijk!• Voor correcte registratie
• Voor correcte verwerking van staal
• Uniek registratienummer in LIMS per patiënt per ingreep
Fixatie in formol• ‘Time to fixation’ tot een minimum beperken
• Staal onmiddellijk in formol • Eventueel in frigo• Problemen met bijkomende analyses
• Voldoende formol (ideaal: verhouding 1/10)• Fixatiesnelheid formol: 1-2mm/uur• Fixatieduur van cruciaal belang:
• Ideaal: 6-72h (24h)• Niet lang genoeg = onderfixatie:
• Morfologie van weefsel niet goed bewaard• Problemen met technicering (weefsel moeilijk te snijden)• Problemen met bijkomende analyses
• Te lang = overfixatie: • Problemen met bijkomende analyses
impact van te lange ‘time to fixation’ op oestrogeenreceptor immuunhistochemie
in borsttumoren
Qiu et al. Am J Clin Pathol 2010
impact van fixatieduur op PD-L1 immuunhistochemie
Ilie et al. Virchows Arch 2016
3h 8h
48h24h
72h 96h
Macroscopie
• Beschrijven van het staal en in genummerde cassettes steken
• Grote biopten of stukken: versnijden en gericht nemen van prelevementenvoor microscopisch onderzoek
• Door patholoog en/of bevoegde macroscopie-assistent
• Volgens orgaan- en/of pathologiespecifieke richtlijnen
• Voor of na fixatie
• Gebruik van inkt voor snijvlakken
Gebruik van inkt voor snijvlakken
facies costalis = zwart
mediaal = rood
pericard = geel
diafragma = groen
- weeg en meet de resectie- inkt het parenchymale snijvlak- lamelleer loodrecht op dit snijvlak- meet en beschrijf de tumor(en), noteer de afstand tot het snijvlak en het kapsel-neem prelevementen van de tumor(en) :
•naar het parenchymaal snijvlak•naar het kapsel
- neem een prelevement van het niet-tumorale leverparenchym
Partiële hepatectomie
BlokkensleutelC1: tumor naar snijvlakC2: tumor naar kapselC3: lever at random
TNM classificatie
• T : tumor
• N : lymfeklieren
• M : metastase
• klinisch : cTNM
• pathologisch : pTNM
= bepalen van de uitgebreidheid van de ziekte : prognostisch en therapeutisch belang!
R status: volledigheid van resectie
• R2 = macroscopisch onvolledige resectie
• R1 = macroscopisch volledige resectie, maar microscopisch onvolledige resectie
• R0 = macroscopisch en microscopisch volledige resectie
Dehydrateren en inbedden in paraffine
• Cassettes in tissue processor
• Overnacht dehydratie en impregneren met paraffine
• Maken van paraffineblokken
Snijden en kleuren van paraffinecoupes
• Dikte van paraffinecoupes: 1,5 – 4 µm dik
• Op glaasjes met uniek registratienummer: 1-6 coupes op 1 draagglaasje per paraffineblok
• Standaardkleuring voor routinediagnostiek: hematoxyline-eosine kleuring
Evaluatie van coupes door patholoog
Eventueel bijkomende analyses
• Aanvraag via LIMS
• Status te volgen via LIMS
Protocol maken in LIMS
• Klinische informatie
(EPD order)
• Macroscopie
• Microscopie
• Conclusie
Oncologisch protocol• Procedure• Type tumor• Differentiatiegraad• Grootte / diepte-invasie• Snijvlakken• Aan/afwezigheid van lymfovasculaire invasie• Aan/afwezigheid van perineurale invasie• Therapie-effect • Resultaten bijkomende analyses voor prognostische/predictieve merkers• Lymfeklieren• pTNM• R status
Voorbeeld: Coloncarcinoom
Tumortype
• Adenocarcinoma
• Mucineus adenocarcinoom
• Zegelringcelcarcinoom
• Medullair carcinoom
• Serrated adenocarcinoma
• …
Differentiatiegraad
• goed gedifferentieerd: >95% klierbuizen
• matig gedifferentieerd: 50-95% klierbuizen
• weinig gedifferentieerd: 0-49% klierbuizen
laaggradig
hooggradig
Diepte-invasie
Diepte-invasie
Snijvlakken
Lymfovasculaire invasie
immuunhistochemische kleuring voor podoplanine = D2-40: merker voor lymfevaten
Perineurale invasie
immuunhistochemische kleuring voor S100: merker voor zenuwen
Therapie-effect: regressiegraad
Lymfeklieren
VRIESCOUPE
• Dringende evaluatie nodig (+/- 30min na ontvangst staal):• Peroperatoir:
vraag naar evaluatie van snijvlakken of diagnostiek die verder verloop van operatie zullen beïnvloeden
• Transplantatiepathologie:
vraag naar geschiktheid van donororgaan voor transplantatie
vraag naar rejectie van transplantorgaan
• Weefsel wordt niet gefixeerd, maar onmiddellijk ingevroren
• Snijden van vriescoupes met manueel uitvoeren van hematoxyline-eosinekleuring
VERWERKEN VAN CYTOLOGIESTALEN• Uitstrijkje
• Dunnelaagcytologie (liquid based cytology)
• Celblokje
Uitstrijkje
Dunnelaagcytologie
Celblokje
BIJKOMENDE ANALYSES
• Histochemische kleuringen
• Immuunhistochemische kleuringen
• Immuunfluorescentie
• Elektronenmicroscopie
• Fluorescente In Situ Hybridisatie (FISH)
• Chromogene In Situ Hybridisatie (CISH)
• Mutatie-analysemoleculaire pathologie
Histochemische kleuringen
• Op basis van chemische reacties tussen kleurstoffen en weefsel- of celcomponenten
• (Beperkte) rol in diagnostiek:• Opsporen van gisten/schimmels/zuurvaste staven (PAS kleuring, Grocott
kleuring, Ziehl-Neelsen kleuring)
• Mucus aantonen in cellen (PAS kleuring)
• Aantonen van amyloïddeposities (Kongorood)
• Aantonen van elastine in bloedvaten, pleura (orceïnekleuring)
• …
Grocott kleuring: schimmelorganismen
Ziehl-Neelsen: zuurvaste staven
Immuunhistochemische kleuringen
muis IgG
anti-humaan A
DAB
DAB
antigen A
gebiotinyleerd
schaap IgG
anti-muis IgG
avidine-
horse radish peroxidase
complex
HRP
• Aanwezigheid van eiwitten in het weefsel aantonen door middel van specifieke antilichamen
• Belangrijke rol in dagelijkse diagnostiek
• Rol in farmacodiagnostiek
nucleaire aankleuringmembranaire aankleuring
cytoplasmatische aankleuring
Immuunhistochemische kleuringen
Diagnostiek:
• Bevestigen van morfologische diagnose
vb. S100, melan A, HMB45, SOX10 in melanomen
• Typeren van morfologisch moeilijk herkenbare cellen of weefsel
vb. gecrushte cellen in kleine biopsie: tumor of immuuncellen?
• Metastasen van tumoren van ongekende oorsprong
vb. cytokeratine 7 / cytokeratine 20 profiel in epitheliale tumoren
• Aantonen van specifieke bacteriële of virale infecties
vb. Helicobacter pylori, CMV, …
Metastasen van carcinomen van ongekende oorsprong
antilichaam primaire origine
CDX2 gastrointestinaal
cytokeratine 7 / cytokeratine 20 TABEL
ER / PR borst, gynaecologisch
GATA-3 borst, blaas
PAX8 nier, schildklier, gynaecologisch
PSA / PSAP prostaat
SATB2 colorectaal, appendix
TTF-1 long, schildklier
WT-1 mesotheel, ovarium
Conner et al. Adv Anat Pathol 2015
Immuunhistochemische kleuringen
Farmacodiagnostiek:
Selectie van kankerpatiënten die in aanmerking komen voor ‘targeted therapy’
• Oestrogeen- en progesteronreceptor (ER/PR) in borsttumoren
→ tamoxifen (Nolvadex)
• HER2Neu prescreening in borst- en maagtumoren
→ trastuzumab (Herceptine)
• EGFR in longtumoren
→ erlotinib (Tarceva) in tweede lijn
• PD-L1 in longtumoren
→ pembrolizumab (Keytruda)
• ALK en ROS1 prescreening in longtumoren
→ crizotinib (Xalkori)
In situ hybridisatie
• Chromogeen (CISH): • Chromogeen gelabelde probes binden op specifieke DNA sequenties van
viraal (humaan papillomavirus, Epstein-Barr virus) DNA
• Aflezen met gewone lichtmicroscoop: positief of negatief
• Aankleuring = aanwezigheid van viraal DNA
• Fluorescent (FISH): • Met rode of groene fluoroforen gelabelde probes binden op specifieke DNA
sequenties
• Aflezen met fluorescentiemicroscoop: signalen en/of signaalpatronen tellen
• Verschillende signaalpatronen en/of cut-offs voor verschillende testen
HPV CISH
FISH
Aantonen van amplificaties of rearrangements van bepaalde genen
normaal
amplificatie
normaal
fusie
normaal
split
vb. Her2Neu amplificatie vb. BCL2 rearrangement vb. ALK rearrangement
FISH
Her2Neu FISH: amplificatie ALK FISH: rearrangement (split)
FISHDiagnostiek van sarcomen en lymfomen:
bevestigen van diagnose gesteld dmv morfologie en immuunhistochemie
vb. MDM2 amplificatie in liposarcomenvb. EWS rearrangement in Ewing sarcomenvb. BCL2 rearrangement in folliculaire lymfomen
Farmacodiagnostiek• HER2Neu amplificatie in borst- of maagtumoren
→ trastuzumab (Herceptine)• ALK rearrangement in longtumoren
→ crizotinib (Xalkori) • ROS1 rearrangement in longtumoren
→ crizotinib (Xalkori)
prescreening met immuunhistochemie
(sneller en goedkoper)
Mutatie-analyse
• Technieken: • PCR-gebaseerde technieken
• Next Generation Sequencing (NGS): multiplex assay (MDG platform)
• DNA isolatie uit paraffinemateriaal
• Macrodissectie voor aanrijking van tumorcelpercentage
Mutatie-analyse
Farmacodiagnostiek: • EGFR mutatie-analyse in longtumoren
→ erlotinib (Tarceva) en gefitinib (Iressa)
• KRAS en NRAS mutatie-analyse in colorectale tumoren
→ GEEN cetuximab (Erbitux)
• BRAF mutatie-analyse in melanomen
→ vemurafinib (Zelboraf)
• c-kit en PDGFRα mutatie-analyse in Gastro-Intestinale Stromale Tumoren (GIST)
→ imatinib (Gleevec)
KWALITEITSZORG
• Accreditatie volgens ISO15189
• Via BELAC op basis van externe audits van het labo
www.apd-uzg.be