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HYWRE CESAR DE BRITO PINTO
VALIDAÇÃO ANALÍTICA DO MÉTODO DE DOSAGEM POR HPLC DE
trans-DESIDROCROTONINA APLICADO A NANOCÁPSULAS
CONVENCIONAIS E FURTIVAS
RECIFE
2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
HYWRE CESAR DE BRITO PINTO
VALIDAÇÃO ANALÍTICA DO MÉTODO DE DOSAGEM POR HPLC DE trans-
DESIDROCROTONINA APLICADO A NANOCÁPSULAS CONVENCIONAIS E
FURTIVAS
Dissertação de Mestrado defendida e aprovada, por decisão unânime, em 26 de fevereiro de 2010 pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas na área de concentração: Fármacos e Medicamentos, linha de pesquisa: Produção e Controle de Qualidade de Medicamentos.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Nereide Stela Santos Magalhães
Co-Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida M. Maciel
RECIFE
2010
Pinto, Hywre Cesar de Brito
Validação analítica do método de dosagem por HPLC de trans-desidrocrotonina aplicado a nanocápsulas convencionais e furtivas / Hywre Cesar de Brito Pinto. – Recife: O Autor, 2010.
90 folhas: il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia, apêndice e anexos.
1. Trans-desidrocrotonina. 2. Validação de método analítico. 3. Cromatografia líquida de alta eficiência. 4. Sistemas de liberação de fármacos. I. Título.
615.15 CDU (2.ed.) UFPE 615.1901
CDD (20.ed.) CCS2010-111
Aos meus pais Idalmo e Edileuza e a minha irmã
Hyanne, por me ensinarem os valores que carrego.
As minhas tias Graça, Nazaré e Terezinha, pelo
apoio ímpar em todos os momentos; apoio
compartilhado também por todos os demais
membros da minha família.
E a, minha razão de existir, Olga, por fazer parte de
minha vida.
Dedico
AGRADECIMENTOS
Como toda jornada é difícil, a minha não seria diferente. Vim de longe, saí de casa para
conquistar um sonho, ser alguém na vida e escrever meu nome nas estrelas. No entanto, não
tendo acesso egoísta, não digo que essa conquista é apenas minha, mas ela é parte do trabalho
e da dedicação de diferentes pessoas que cruzaram meu caminho nessa minha jornada que só
está começando. Sendo assim agradeço a estas várias pessoas tão diferentes e especiais, pois
sem elas eu não estaria aqui e não teria cumprido parte da minha missão.
Agradeço primeiramente a Deus, pois foi Nele que depositei minha fé e esperança tanto nas
horas difíceis quanto nas horas felizes. Agradeço aos meus adorados pais por terem me dado a
vida, pela força, pelo carinho e pelo amor que une nossa família, agradeço também a minha
irmã por ser minha amiga e a melhor madrinha do mundo. Aos meus avós, por me ensinarem
os valores da vida. Aos meus familiares, tios, primos, por terem me dado o alicerce para que
eu me tornasse uma pessoa melhor a cada dia.
Agradeço, especialmente, a minha querida tia Graça, por ter me iluminado quando eu estava
na escuridão, ela foi uma das principais responsáveis por eu estar aqui hoje. Também a tia
Nazaré e a tia Terezinha, por me ampararem e me darem conselhos valiosos.
Agradeço a minha querida orientadora Prof.ª Dra. Nereide Stela Magalhães, por ter me aberto
as portas e por ter me dado a chance da minha vida. E a Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida M.
Maciel pela tão valiosa t-DCTN.
Também agradeço aos meus queridos e eternos professores da graduação em Farmácia da
UFRN, Prof.ª Dina Maria de Araújo e o Prof. Marco Vinícius Monteiro Navarro.
Agradeço aos meus ótimos professores do Mestrado da UFPE: A Prof.ª Dra. Beate e seus
orientandos Cleiton e Julio Cesar, pelas dicas muito valiosas. Ao Prof. Dr. Pedro Rolim, por
ter me dito o não que eu precisava. E ao Prof. Dr. Gildo Lima, por ter me ensinado que a
excelência é algo que se aprende duramente. Agradeço, ainda, ao Professor Dr. Haroudo
Sátiro Xavier, por ter me mostrado que a vida acadêmica tem seus encantos e que às vezes
vale a pena não levá-la tão a sério. E a professora Ivone Batista da disciplina de Oncologia
por sua disciplina não ter o crédito que me restava, aprendi que há males que vem para o bem.
Agradeço a Profª Dra. Maria Nelly Caetano por ter me aceitado na disciplina dela isso fez
com que eu me aproximasse do amor da minha vida. Agradeço a Querida Professora Elba
Lucia, pelas conversas que tanto clarearam minha vida. A minha querida professora Elizabete
Chavez, por ter facilitado tanto minha vida, me ajudando com o HPLC, a Susan por ter me
dado as primeiras dicas, ao Professor José Luiz pela autorização.
Aos Funcionários do LIKA, Felipe, Rafael Padilha, Maria Helena, Kilma e “Seu” Otaviano
pelo auxílio técnico;
Agradeço meus colegas de mestrado e a equipe do SLC (Milena Sales, Mariane Lira,
Waldenice Morais, Taciana, Islene, Isabela, Rafaela, Catarine, Rosana, Mirela, Marcileide,
Jéssica, Rebeca, Larissa, André, Vinícius, Elizângela) e do LIKA (Ricardo, Adriana,
Humberto, Natalia, “Mari” Cabrera, Luiza, Amanda, Lúcia, Sinara, Larissa, Camila, Roziana
e Vanessa).
A Família Ajinomoto por terem trazido o Lamén do Japão para o Brasil, sem o qual não
estaria aqui!
Agradeço também ao fomento que me foi dado pelo CNPq.
Agradeço muitíssimo a Sra. Lúcia e Sr. Paulo Freitas, por me tratarem como um filho. E a Iris
por me fazer sentir em casa.
Agradeço também a todos aqueles que me ajudaram direta e indiretamente para a conclusão
desse trabalho, pois plantei uma pequena semente com a ajuda de um milhão de jardineiros,
desejo então que essa planta floresça para que eu possa dar um milhão de flores.
E Finalmente e não menos importante, mas muitíssimo importante, agradeço a Olga Paula de
Freitas, meu amor que tanto se esforçou e em momentos difíceis abdicou do nosso tempo
juntos para que eu pudesse sorver a ciência. Meu muito obrigado!
"A mente que se abre a uma nova idéia, jamais
voltará ao seu tamanho original"
Albert Einstein
RESUMO
A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é um diterpeno presente nas cascas da espécie Croton
cajucara Benth (Euphorbiaceae) sendo atribuídas atividades hipoglicemiante,
antiinflamatória, antiestrogênica, antiulcerogênica e principalmente antitumoral, a qual
demonstrou grande atividade contra Carcinoma de Erlich e Sarcoma 180. Apesar da
expressiva atividade da t-DCTN, tem sido descrito o aumento do número de casos de hepatite
tóxica relacionadas ao uso da infusão das cascas desta planta em altas concentrações. Os
efeitos tóxicos da substância no organismo podem ser evitados pelo uso de formas
farmacêuticas de liberação controlada. Nanocápsulas são preparações de diâmetro
nanométrico que contêm uma fina camada polimérica envolvendo um núcleo líquido ou semi-
sólido. Esses sistemas têm a capacidade de encapsular diferentes fármacos em seu interior,
promovendo uma liberação controlada dentro de uma faixa terapêutica, reduzindo os picos
plasmáticos, e, consequentemente, proporcionando uma melhoria de sua biodisponibilidade.
Além disso, esses sistemas diminuem a toxicidade dos fármacos encapsulados e ainda, os
protegem contra fatores externos melhorando a estabilidade do bioativo. Para caracterizar
esses sistemas é de extrema importância quantificar o fármaco e determinar a sua eficiência
de encapsulação nas nanopartículas. Desta forma, se faz necessária a utilização de
metodologia validada, a fim de se alcançar resultados confiáveis. O objetivo desse trabalho foi
preparar e caracterizar nanocápsulas contendo t-DCTN e validar um método de quantificação
por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A validação do método cromatográfico
seguiu os protocolos de validação preconizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
e pela International Conference on Harmonisation. A validação da metodologia analítica se
mostrou exata, precisa, sensível e reprodutível, sendo possível determinar quantitativamente a
t-DCTN em nanocápsulas convencionais e furtivas. Os resultados revelaram que foi possível
preparar nanocápsulas contendo 1,0 mg.mL-1 de t-DCTN com uma eficiência de encapsulação
superior a 97% em ambos os sistemas poliméricos. Desta forma, foi possível obter
nanocápsulas contendo t-DCTN e desenvolver um método analítico validado para
quantificação do bioativo em nanocápsulas convencionais e furtivas de modo confiável.
Palavras-chave: trans-desidrocrotonina. Validação de método analítico. Cromatografia líquida
de alta eficiência. Sistemas de liberação de fármacos. Nanocápsulas. Câncer.
ABSTRACT
Trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a diterpene current in the bark of Croton cajucara Benth
(Euphorbiaceae) species, and assigned activities as hypoglycemic, anti-inflammatory,
antiestrogenic, anti-ulcer and antitumor mainly, which showed high activity against Ehrlich
carcinoma and Sarcoma 180. Despite the substantial activity of t-DCTN diterpene, has been
described to increase the cases of toxic hepatitis related to the use of bark’s infusion of this
plant in high concentrations. The toxic effects of the substance in the body can be avoided by
using of controlled release dosage forms. Nanocapsules are formulations nanometric that
contains a thin polymer layer surrounding a liquid core or semi-solid. These systems have
presented the ability to encapsulate different drugs, promoting a controlled release within a
therapeutic range, reducing the peak plasma levels, and thus providing an improved
bioavailability. Moreover, these systems reduce the toxicity of encapsulated drugs and also
protect them against external factors improving the stability of the bioactive. To characterize
these systems, it is extremely important to quantify the drug and determine its nanoparticles
encapsulation efficiency. Thus, it is necessary to use validated methodology, in order to
achieve reliable results. The aim of this work was to prepare and characterize nanocapsules
containing t-DCTN and validate a quantification method by high performance liquid
chromatography (HPLC). The validation of chromatographic method followed the validation
protocols recommended by the National Agency of Sanitary Surveillance and the
International Conference on Harmonization. The validation of analytical methodology proved
to be accurate, precise, sensitive and reproducible; it is possible to quantify the t-DCTN in
conventional and stealth nanocapsules. The results showed that it was possible to prepare
nanocapsules containing 1.0 mg.mL-1 t-DCTN with encapsulation efficiency above 97% in
both polymer systems. Thus, it was possible to obtain nanocapsules containing t-DCTN and
develop a validated analytical method to quantify the bioactive in conventional and stealth
nanocapsules reliably.
Keywords: trans-dehydrocrotonin. Analytical Method validation. High performance liquid
chromatography. Drug delivery systems. Nanocapsules. Cancer.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Padrões de distribuição de Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) no Brasil.........21
Figura 2. Metabólitos secundários encontrados nas folhas e caule do Croton cajucara
Benth.........................................................................................................................................23
Figura 3. Estrutura química (A) e estrutura tridimensional (B) da trans-desidrocrotonina. A
barra mostra a escala em Angstrom..........................................................................................24
Figura 4. Perfil farmacocinético de formas farmacêuticas de liberação controlada (A) e
convencionais (B).....................................................................................................................26
Figura 5. Fórmula estrutural do ácido polilático e do ácido poliglicólico................................29
Figura 6. Esquema de preparação de nanocápsulas por nanoprecipitação (A), emulsificação –
difusão (B), emulsificação – coarcervação (C), emulsão múltipla (D), revestimento polimérico
(E) e camada por camada (F)....................................................................................................31
Figura 7. Esquema mostrando as forças envolvidas na fase de formação das emulsões (A) e a
acomodação do sistema durante a formação das nanocápsulas pela remoção do solvente
(B).............................................................................................................................................32
Figura 8. Espectro de massa da t-DCTN (Peso molecular = 314) no modo positivo (na fração
do tempo de retenção = 18 – 20 min.).......................................................................................73
Figura 9. Espectro de massa da t-DCTN (Peso molecular = 314) no modo negativo (na fração
do tempo de retenção = 18 – 20 min.).......................................................................................73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Comparação entre os sistemas de liberação controlada de fármacos........................27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAA – Ácido acetil aleuritólico
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CLAE/HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência
DL50 – Dose letal que mata 50% dos indivíduos
FDA – Food and Drug Administration
ICH - International Conference on Harmonization
LLOD – Limite de detecção / Lower limit of detection
LLOQ – Limite de Quantificação / Lower limit of quantification
NC – Nanocápsulas
PEG – Polietilenoglicol
PGA – Polímero de ácido glicólico
pH – Potencial hidrogeniônico
PLA – Polímero de ácido láctico
PLGA – Copolímero de ácido láctico e glicólico
SFM – Sistema fagocitário mononuclear
t-CTN – trans-crotonina
t-DCTN – trans-desidrocrotonina
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
UFPA – Universidade Federal do Pará
UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro
UV – Espectrofotometria em ultravioleta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................... 15
2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 19
2.1 GERAIS........................................................................................................................ 19
2.2 ESPECÍFICOS................................................................................................................ 19
3 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................. 21
3.1 TRANS-DESIDROCROTONINA........................................................................................ 21
3.1.1 Fitoquímica................................................................................................................ 21
3.1.2 Química...................................................................................................................... 23
3.2 NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA............................................................................ 25
3.2.1 Sistemas Nanoparticulados Poliméricos.................................................................... 27
3.2.1.1 Nanocápsulas.............................................................................................................. 30
3.2.1.2 Métodos de preparação.............................................................................................. 30
3.2.1.3 Métodos de caracterização......................................................................................... 33
3.3 VALIDAÇÃO ANALÍTICA............................................................................................... 34
4 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 38
5 PERSPECTIVAS....................................................................................................... 40
REFERÊNCIAS....................................................................................................................... 42
APÊNDICE A – ARTIGO....................................................................................................... 51
ANEXO A – ESPECTRO DE MASSA DA t-DCTN.............................................................. 73
ANEXO B – GUIA PARA AUTORES................................................................................... 74
14
INTRODUÇÃO
15
1 INTRODUÇÃO
O gênero Croton é o segundo maior da família das Euforbiáceas. Dentre as espécies
desse gênero se destaca a Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), vulgarmente conhecida
por “Sacaca”. Essa espécie é originária da região amazônica, porém não é exclusiva do
território brasileiro. A infusão das cascas do caule da C. cajucara é amplamente utilizada na
medicina popular, principalmente no estado do Pará, contra diversas afecções como, diarréia,
malária, febre, problemas estomacais, inflamações do fígado, rins, vesícula, no controle do
diabetes e de índices elevados de colesterol. Por outro lado, as folhas são utilizadas para
auxílio da digestão (CAMPOS et al., 2002; MACIEL et al., 2002), onde são preparadas
infusões, decoctos ou cápsulas a partir das cascas do caule da planta. A triagem dos
compostos dessa planta atenta para a classe dos diterpenos do grupo dos clerodanos, além de
flavonóides e esteróides (MACIEL et al., 2000).
Dentre os vários compostos da classe dos diterpenos pertencentes à espécie C.
cajucara destacam-se como o composto mais ativo a trans-desidrocrotonina (t-DCTN). A t-
DCTN apresenta atividades hipoglicemiante, hipolipidêmica e antiinflamatória (SILVA et al.,
2001), antiestrogênica, antiulcerogênica (MELO et al., 2003) e principalmente antitumoral
(GRYNBERG et al., 1999), o que demonstra um interesse maior de estudo dessa substância.
Na atividade antitumoral, a t-DCTN demonstra grande atividade contra Carcinoma de Erlich e
Sarcoma 180 nas doses de 80 e 120 mg/kg (CARVALHO et al., 1996; GRYNBERG et al.,
1999; MACIEL et al., 2000). A citotoxicidade contra o Carcinoma de Erlich é de 16 mM para
t-DCTN, bem eficiente quando comparado a outros metabólitos que tem sua atividade
antitumoral já conhecida, como é o caso do flavonóide Quercetina, que tem citotoxicidade de
44 mM, todos em 48 horas de cultura celular (MACIEL et al., 2000). Uma atividade
significante de TNF-α foi detectada sugerindo assim uma ação de aumento na função imune
(GRYNBERG et al., 1999). Apesar da expressiva atividade da t-DCTN, tem sido descrito o
aumento do número de casos de usuários do Norte-Nordeste que desenvolveram hepatite
tóxica pelo uso de folhas em concentrações elevadas por longos períodos de tempo (MACIEL
et al., 2002; VEIGA JR; PINTO; MACIEL, 2005).
Os efeitos tóxicos induzidos pela t-DCTN podem ser evitados pelo uso de formas
farmacêuticas de liberação controlada que permitem a manutenção da concentração
16
plasmática na faixa terapêutica, alterando sua biodisponibilidade (BRANNON-PEPPAS;
BIRNBAUM; KOSMALA, 1997; DUNNE et al., 2003).
A nanotecnologia farmacêutica tem como um dos objetivos desenvolver sistemas
coloidais de liberação controlada para a veiculação de agentes ativos e vacinas na forma de
nanodispositivos, que podem oferecer entre outras vantagens um melhor controle da
administração de fármacos, atribuída pelo aumento da eficácia terapêutica; liberação
progressiva e controlada do fármaco; manutenção de níveis plasmáticos do fármaco no sítio
de ação em concentrações terapêuticas; diminuição da instabilidade e decomposição dos
fármacos sensíveis; redução da flutuação da concentração plasmática ou picos plasmáticos
com expressiva diminuição da toxicidade ou efeitos adversos; possibilidade de
direcionamento a alvos específicos como, por exemplo, tumores ou tecidos; possibilidade de
incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas nos diversos sistemas; menor
necessidade de administrações e quantidade de fármaco por administração; otimização do uso
do fármaco culminando em uma maior conveniência para o paciente, aumento da adesão do
paciente ao tratamento e redução global dos custos à saúde (BRANNON-PEPPAS;
BIRNBAUM; KOSMALA, 1997; DUNNE et al., 2003).
Dentre os sistemas de liberação controlada, encontram-se as nanocápsulas. Trata-se
de sistemas que possuem uma fina camada polimérica envolvendo um núcleo líquido ou
semi-sólido. Esse núcleo pode ser de natureza oleosa ou aquosa, dependendo das
características que se quer proporcionar ao núcleo para uma melhor solubilização de fármacos
lipofílicos ou hidrofílicos, respectivamente. As nanocápsulas se destacam por serem formas
farmacêuticas versáteis, possuindo diversas vantagens sobre outros sistemas de liberação
como: alta eficiência de encapsulação, isso advindo da alta solubilidade do fármaco no núcleo
delineado; baixo conteúdo polimérico, diminuindo com isso os custos ao se utilizar os
polímeros; maior proteção do fármaco, devido à degradação do polímero ocorrer apenas por
via hidrofílica e do núcleo ser protegido do conteúdo externo por essa camada polimérica é
que o fármaco se torna mais protegido de fatores externos como luz (fotólise), pH, enzimas,
agentes oxidantes e outros agentes agressivos ao princípio ativo; redução da irritação tecidual,
devido ao uso de polímeros biocompatíveis (VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009).
Entre as técnicas de preparação das nanocápsulas, a desenvolvida por Fessi (FESSI et
al., 1989) difere das demais técnicas por possuir um procedimento muito simples de
preparação, ausência de reações químicas durante a formação, reprodutível, adequação do
17
método aos diversos tipos de polímeros, rápido, econômico e facilmente transposto para
escala industrial, sendo uma técnica importante para indústria farmacêutica, sendo possível
encontrar produtos comerciais contendo nanocápsulas na indústria nacional. O método baseia-
se na emulsificação espontânea de uma solução orgânica contendo solvente orgânico,
polímeros pré-formados, o óleo e a substância ativa que será vertida cuidadosamente numa
fase aquosa constituída de tampão fosfato. A escolha do solvente orgânico se dá pela
miscibilidade em água e a facilidade de remoção por evaporação (LEGRAND et al., 2007). O
uso de surfactantes ou copolímeros com características anfifílicas permite uma melhor
estabilidade física das suspensões formadas quando estocadas por longos períodos de tempo,
evitando a agregação (MOSQUEIRA et al., 2001). As nanopartículas, com diâmetro médio
entre 150 a 250 nm, formam-se imediatamente quando se verte a fase orgânica na fase
aquosa; isso se deve a rápida difusão do solvente na água (ANTON; BENOIT; SAULNIER,
2008).
Caracterizações físico-químicas nos sistemas desenvolvidos são fatores importantes
para a melhoria das características dessas formulações farmacêuticas. Dentre os parâmetros
físico-químicos utilizados para caracterização, estão o doseamento e a eficiência de
encapsulação, ambos por meio de validação analítica do método de quantificação. O método
de doseamento por espectrofotometria por ultravioleta não permite o medição inequívoca da
quantidade de fármaco contida no interior dos sistemas de liberação, devido à interferência
dos constituintes da formulação. Com isso, a validação por cromatografia líquida de alta
eficiência é imprescindível nesses sistemas.
O objetivo desse trabalho foi preparar e caracterizar nanocápsulas contendo t-DCTN
e validar um método de quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A
validação do método cromatográfico seguiu os protocolos de validação preconizados pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária e pela International Conference on Harmonisation.
A validação da metodologia analítica se mostrou exata, precisa, sensível e reprodutível, sendo
possível determinar quantitativamente a t-DCTN em nanocápsulas convencionais e furtivas.
Os resultados revelaram que foi possível preparar nanocápsulas contendo 1,0 mg.mL-
1 de t-DCTN com uma eficiência de encapsulação superior a 97% em ambos os sistemas
poliméricos. Dessa forma, obteve-se nanocápsulas contendo t-DCTN e desenvolver um
método analítico validado para quantificação do bioativo nos sistemas convencionais e
furtivos de modo confiável.
18
OBJETIVOS
19
2 OBJETIVOS
2.1 GERAIS
Desenvolver e validar um método analítico de doseamento de trans-desidrocrotonina
em nanocápsulas convencionais e furtivas que apresente precisão, exatidão, linearidade,
especificidade e robustez.
2.2 ESPECÍFICOS
a. Desenvolver e validar um método analítico de doseamento de trans-desidrocrotonina
utilizando cromatografia líquida de alta eficiência;
b. Desenvolver nanocápsulas convencionais e furtivas contendo trans-desidrocrotonina;
c. Avaliar a interferência dos constituintes da formulação através do método validado;
d. Efetuar o doseamento de trans-desidrocrotonina em nanocápsulas utilizando o método
cromatográfico validado;
e. Determinar a eficiência de encapsulação de trans-desidrocrotonina em nanocápsulas.
20
REVISÃO DA LITERATURA
21
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 TRANS-DESIDROCROTONINA
3.1.1 Fitoquímica
O gênero Croton é o segundo maior da família das Euforbiáceas. Dentre as espécies
desse gênero, se destaca a Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), vulgarmente conhecida
por “Sacaca”. Essa espécie é originária da região amazônica, porém não é exclusiva do
território brasileiro (Figura 1). Classificada como megatérmica, por ser uma espécie de maior
representatividade em regiões tropicais, ela é facilmente encontrada também na Venezuela,
Peru e Bolívia e tem como área de distribuição as bordas das florestas de terra firme
(CARUSO; CORDEIRO, 2008).
Figura 1. Padrões de distribuição de Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) no Brasil (CARUSO; CORDEIRO, 2008).
22
A infusão das cascas do caule da C. cajucara é amplamente utilizada na medicina
popular, principalmente no estado do Pará, contra diversas afecções como, diarréia, malária,
febre, problemas estomacais, inflamações do fígado, rins, vesícula, no controle do diabetes e
de índices elevados de colesterol; como também, as folhas são utilizadas para auxílio da
digestão (MACIEL et al., 2000). Além de infusões, são preparadas decoctos ou cápsulas a
partir das cascas do caule da planta. A triagem Fitoquímica dessa planta permite observar a
classe dos diterpenos do grupo dos clerodanos, além de flavonóides e esteróides (CAMPOS et
al., 2002; MACIEL et al., 2002).
A classe dos metabólitos secundários diterpenos tem como função primordial na
planta a proteção contra ataque de insetos e fungos (COLE et al., 1991). Recentemente, tem-
se aumentado o interesse pela classe dos diterpenos clerodanos, que incluem mais de 800
compostos de importância biológica (HAGIWARA; INOME; UDA, 1995). Os diterpenos
clerodanos são encontrados em um importante número de espécies e têm-se intensificado seus
estudos devido as suas diversas funções biológicos, tais como, inseticida, antifúngica,
antitumoral (MCCHESNEY; CLARK; SILVEIRA, 1991; SIDDIQUI; MUNESADA; SUGA,
1992; COLL; TANDRÓN, 2005), antiinflamatória (ICHIHARA et al., 1992; CARVALHO et
al., 1996), antiestrogênica (CARVALHO et al., 1996), hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997),
antiulcerogênica (KITAZAWA; SATO; TAKAHASHI, 1980; HIRUMA-LIMA et al., 1999),
alucinógena (TEKSIN et al., 2009). No entanto, é também atribuída a classe do clerodanos
hepatotoxicidade e, devido a essa propriedade, alguns produtos derivados de plantas com altos
teores desses metabólitos mantiveram seu uso restringido ou foram proibidas, como é o caso
do gênero Teucrin sp., que está proibida na França desde 1992 (MOSTEFA-KARA et al.,
1992).
Dentre os vários compostos da classe dos diterpenos pertencentes à espécie Croton
cajucara Benth, destacam-se a trans-desidrocrotonina (t-DCTN), trans-crotonina (t-CTN),
cis-cajucarina B, cajucarina A, cajucarinolida, trans-cajucarina B e sacacarina, sendo o
clerodano majoritário a t-DCTN, podendo ser encontrada em um teor de 1,4% nas cascas de
plantas, na faixa de 4 a 6 anos de idade, enquanto que, em plantas de 3 anos, esse teor é de
apenas 0,26%. Isso indica fortemente que esse metabólito secundário está ligado à maturidade
do vegetal. Em plantas com até 18 meses, a t-DCTN não foi encontrada, sendo nessa idade o
metabólito majoritário o triterpeno ácido acetil aleuritólico (AAA) (MACIEL et al., 2000).
23
A t-DCTN está presente, além do caule, nas raízes e nas folhas; porém ainda não foi
esclarecido o teor da molécula nessas outras partes da planta. Na triagem feita a partir das
folhas da Croton cajucara Benth, encontraram-se três esteróides: β-sitosterol, stigmasterol e
sotosterol-3,o,β-glucosideo; dois flavonóides: Kaempferol 3,4,7 trimetil éter e Kaempferol 3,7
dimetil éter e o clerodano Cajucarinolide (Figura 2) (MACIEL et al., 2000).
Figura 2. Metabólitos secundários encontrados nas folhas e caule do Croton cajucara Benth (MACIEL et al., 2000).
3.1.2 Química
A espécie química (2'R,3R,4a'R,5R,8a'S)-5-(3-furil)-2',5'-dimetil-4,4',4a',5,8',8a'-
hexahidro-2'H-espiro[furano-3,1'-naftaleno]-2,7'(3'H)-diona (ROYAL SOCIETY OF
CHEMISTRY, 2010) ou simplesmente trans-desidrocrotonina possui uma estrutura química e
uma estrutura tridimensional que está representada na Figura 3. A t-DCTN é o mais ativo
composto, dentre os isolados da Croton cajucara Benth, sendo atribuídas a esse diterpeno as
atividades de hipoglicemiante, hipolipidêmica e antiinflamatória (SILVA et al., 2001),
antiestrogênica, antiulcerogênica (MELO et al., 2003) e principalmente antitumoral
(GRYNBERG et al., 1999), o que demonstra um maior interesse nessa substância.
24
Figura 3. Estrutura química (A) e estrutura tridimensional (B) da trans-desidrocrotonina. A barra mostra a escala em Angstrom (THOMPSON, 2004).
Quanto à atividade antiulcerogênica, alguns autores supõem que sua atividade pode ser
de citoproteção ou através da supressão da secreção do ácido gástrico (HCl) e aumento da
produção de prostaglandinas E2 (HIRUMA-LIMA et al., 1999), o que sugere uma ação na
bioquímica das ciclooxigenases (MELO et al., 2003). A DL50 atribuída a t-DCTN é de 555
mg/kg, sendo considerada um composto seguro quando administrada por via oral por um
curto período de tempo (SOUZA BRITO et al., 1998) e mostrou atividade hipolipidêmica na
dose de 50 mg/kg e hipoglicêmica na dose de 25 mg/kg (CARVALHO et al., 1996; FARIAS
et al., 1997).
Na atividade antitumoral, a t-DCTN demonstrou grande atividade contra Sarcoma 180
e Carcinoma de Erlich nas doses de 80 e 120 mg/kg, respectivamente (CARVALHO et al.,
1996; GRYNBERG et al., 1999; MACIEL et al., 2000). A citotoxicidade contra o Carcinoma
de Erlich foi de 16 mM para t-DCTN, bem eficiente quando comparado a outros metabólitos
que tem sua atividade antitumoral já conhecida, como é o caso do flavonóide Quercetina, que
tem citotoxicidade de 44 mM, todos em 48 horas de cultura celular (MACIEL et al., 2000).
Uma atividade significante de TNF-α foi detectada, demonstrando assim uma ação de
aumento na função imune (GRYNBERG et al., 1999).
O uso de folhas em concentrações elevadas e em tratamentos prolongados tem
vitimado usuários no Norte e Sudeste do país em consequência de uma hepatite tóxica.
25
Muitos desses usuários fazem uso da planta sem recomendação e desconhecem
completamente os seus efeitos colaterais. No Hospital Universitário da Universidade Federal
do Rio de Janeiro (UFRJ), há um relato de falecimento por causa hepática, em 2001 e em
Belém/PA, no período de 1990, muitos casos de hepatite tóxica foram registrados; ocorrendo
relatos populares de falecimentos (MACIEL et al., 2002). O Hospital Universitário da
Universidade Federal do Pará (UFPA) possui um histórico significativo de pessoas vitimadas
por doenças do fígado, as quais faziam uso indevido das folhas em dietas de emagrecimento
(VEIGA JR; PINTO; MACIEL, 2005).
Estudo realizado em pacientes da Região Amazônica, que faziam uso da sacaca
registrou 25 casos de hepatotoxicidade atribuídos à sacaca, tendo sido evidenciado que 21
pessoas tiveram hepatite aguda, três de hepatite crônica e uma hepatite fulminante (PEREIRA
SOARES, 2004).
Contrariando os relatos toxicológicos descritos, outros estudos de atividade e
toxicidade não descreveram os mesmos adversos. Essa contradição é explicada pela utilização
da planta em períodos de tempo e dosagem menores daquelas observadas no uso popular. O
estudo sugere que o uso indevido da planta, principalmente das folhas, em tratamento
prolongado (chás ou cápsulas) é o responsável pela hepatite tóxica atribuída a sacaca
(MACIEL et al., 2002). Através de um estudo multidisciplinar, esse grupo de pesquisa, isolou
das cascas do caule, e testou em ensaios farmacológicos pré-clínicos, a substância majoritária
clerodânica trans-desidrocrotonina (t-DCTN). Outros metabólitos secundários minoritários,
todos de natureza química clerodânica isolados das cascas do caule de Croton cajucara,
também foram testados e mostraram serem menos ativos do que a t-DCTN (MACIEL et al.,
2000).
3.2 NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA
A Nanotecnologia Farmacêutica é uma ciência multidisciplinar que envolve áreas
como a física, química, matemática, farmacologia, e que se preocupa em buscar soluções
tecnológicas para veicular fármacos ao sítio de ação de modo eficiente. Ela ainda se preocupa
26
em funcionalizar materiais que se localizam na escala nanométrica para alcançar objetivos
como a saúde do paciente (BRANNON-PEPPAS; BIRNBAUM; KOSMALA, 1997).
A Nanotecnologia Farmacêutica tem como um dos objetivos desenvolver sistemas
coloidais de liberação controlada para a veiculação de agentes ativos e vacinas na forma de
nanodispositivos, que podem oferecer, entre outras vantagens, um melhor controle da
administração de fármacos. Isso é atribuído pelo aumento da eficácia terapêutica; liberação
progressiva e controlada do fármaco; manutenção de níveis plasmáticos do fármaco no sítio
de ação em concentrações terapêuticas; diminuição da instabilidade e decomposição dos
fármacos sensíveis; redução da flutuação da concentração plasmática ou picos plasmáticos
(Figura 4) com expressiva diminuição da toxicidade ou efeitos adversos; possibilidade de
direcionamento a alvos específicos como, por exemplo, tumores ou tecidos; possibilidade de
incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas nos diversos sistemas; menor
necessidade de administrações e quantidade de fármaco por administração; otimização do uso
do fármaco culminando em uma maior conveniência para o paciente, aumento da adesão do
paciente ao tratamento, promovendo uma redução dos custos à saúde (BRANNON-PEPPAS;
BIRNBAUM; KOSMALA, 1997; DUNNE et al., 2003).
Figura 4. Perfil farmacocinético de formas farmacêuticas de liberação controlada (A) e convencionais (B).
Dentre os sistemas de liberação controlada, existem aqueles de escala nanométrica os
quais apresentam características bem distintas quanto à natureza dos constituintes e a
disposição do fármaco na partícula (Tabela 1). Para fármacos lipofílicos, é comum a
27
distribuição homogênea na matriz polimérica de nanoesferas. Em nanocápsulas contendo
núcleo oleoso, o fármaco lipofílico se distribui facilmente no óleo. Mas em lipossomas, a
preferência é pela bicamada lipídica.
Tabela 1. Comparação entre os sistemas de liberação controlada de fármacos.
Sistema de Liberação
Nanocápsulas Nanoesferas Lipossomas
Característica Principal
Fina camada polimérica envolvendo núcleo líquido ou semi-sólido
Massa sólida de polímeros
Vesículas aquosas compostas por uma ou mais bicamadas de fosfolipídios
Disposição do fármaco
Na sua maioria, dissolvido no núcleo
Disperso na matriz polimérica
Depende da solubilidade do fármaco: lipofílico na bicamada lipídica e hidrofílico no compartimento interno.
Vantagens Liberação mais gradual do fármaco
Possibilidade de encapsular fármacos lipofílicos e hidrofílicos
Possui características mais próximas das membranas biológicas
Desvantagens Utilização de solventes orgânicos no método de preparação
Limitação da dispersão da droga apenas a matriz polimérica; Uso de solventes orgânicos.
Sensibilidade dos fosfolipídios da membrana e liberação rápida da droga pela bicamada
Fonte: NISHIOKA; YOSHINO, 2001; VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009; GRIT et al., 1989; TORCHILIN, 2007
3.2.1 Sistemas Nanoparticulados Poliméricos
As nanopartículas poliméricas têm sido extensivamente estudadas como carreadores
de drogas no campo farmacêutico. Uma das características principais das nanopartículas é
apresentar o tamanho variando entre 1 a 1000 nm, embora, geralmente, sejam obtidas
partículas com diâmetro variando entre 100 a 500 nm. As nanopartículas são consideradas
importantes sistemas para liberação de fármacos devido às vantagens como a capacidade de
liberação controlada do princípio ativo, possibilidade de liberação no sítio de ação, esse
direcionamento do fármaco é a grande promessa de diminuição dos efeitos adversos dos
medicamentos pela utilização de quantidades menores do princípio ativo. Outras vantagens
pertencentes aos sistemas nanoparticulados são: biodegradabilidade, não permitindo a
acumulação no organismo de metabólitos secundários; uma menor quantidade de polímero em
28
sua constituição diminuindo os custos de utilização de polímeros com alto grau de pureza;
aumento dos benefícios terapêuticos por apresentar uma menor quantidade de administrações
e, com isso, uma maior adesão do paciente ao tratamento (KREUTER, 1991; 1994).
O progresso na química de polímeros foi determinante para o surgimento de
nanopartículas com propriedades físico-químicas bem definidas que se aproximam dos
objetivos da vetorização de fármacos (BRAUNECKER; MATYJASZEWSKI, 2007). Apesar
dos avanços na química dos polímeros, existe somente um número limitado de polímeros que
podem ser utilizados no desenvolvimento dessas formas farmacêuticas. Isso se deve ao fato de
que, para ser utilizado in vivo, o polímero precisa cumprir alguns requisitos. Entre eles estão:
ser biodegradável, poder ser removido completamente dos sistemas biológicos, possibilitando
repetidas administrações sem o risco de acúmulo no organismo; atóxico e não-imunogênico.
O polímero e seus metabólitos não podem agredir o organismo ou produzir reações de
anafilaxia e, por fim, deve apresentar propriedades bem definidas e alto grau de pureza, para
que não prejudique as características das nanopartículas ou afete os objetivos de vetorização
dos fármacos (VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009).
Muitas vezes, devido a problemas de pureza, de necessidade de reticulação
polimérica ou de incompatibilidades com os fármacos, no que diz respeito às limitações dos
polímeros naturais, polímeros sintéticos biodegradáveis vêm sendo bastante utilizados para o
encapsulamento de fármacos nas últimas décadas, alguns poucos são aceitos pelas autoridades
sanitárias para a administração parenteral, outros são apenas liberados para uso tópico ou em
preparações orais (HANS; LOWMAN, 2002).
Portanto, apenas alguns poucos polímeros podem ser utilizados como recurso para
delineamento de nanocápsulas. Os poliésteres como o poliácido láctico (PLA), o poliácido
glicólico (PGA) e seus copolímeros (PLGA) (Figura 5) despertam grande interesse devido à
excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade. O uso do PLGA é bastante difundido em
processos de micro e nanoencapsulamento (SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000;
BIRNBAUM; BRANNON-PEPPAS, 2003). Os sistemas particulados produzidos podem ser
delineados para um perfil de liberação específico pela modificação de propriedades (como o
grau de cristalinidade) dos polímeros, das razões monoméricas e condições de polimerização,
produzindo-se sistemas de liberação para meses e até anos (BRANNON-PEPPAS, 1995). Por
exemplo, pode-se aumentar a taxa de degradação do sistema, aumentando a razão de PLA
(hidrofóbico) em relação à de PGA (hidrofílico) (HANS; LOWMAN, 2002).
29
Figura 5. Fórmula estrutural do ácido polilático e do ácido poliglicólico (Adaptado de ATHANASIOU; NIEDERAUER; AGRAWAL, 1996).
Na obtenção desses sistemas nanoparticulados, podem ser utilizados polímeros
naturais (proteínas ou polissacarídeos) e sintéticos, como polímeros simples, copolímeros,
blendas (mistura física de polímeros). Durante a última década, um grande número de
polímeros surgiu em consequência da necessidade de alterar as características de superfície
dos sistemas poliméricos ou modificar as interações com proteínas do corpo ou com o sistema
imunológico. O desenvolvimento de polímeros, principalmente os de Polietilenoglicol (PEG),
se mostrou eficientes como estabilizantes, suprimindo a necessidade de surfactante adicional
(DES RIEUX et al., 2006).
O PEG é utilizado por ser biodegradável, biocompatível, não-tóxico, flexível e
hidrofílico, tendo sido autorizado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o uso
interno no organismo humano (BRANNON-PEPPAS, 1995; KUMAR; RAVIKUMAR;
DOMB, 2001). A incorporação do PEG torna esses polímeros mais hidrofílicos, o que permite
diminuir o reconhecimento pelas opsoninas e captura pelos macrófagos do organismo. Essas
partículas são, então, denominadas “furtivas” (Stealth®) ou de “longa circulação”. Trabalhos
recentes mostram a habilidade de micropartículas e nanopartículas de PEG-PLA e PEG-
PLGA de perdurarem o tempo na circulação sanguínea e de melhorarem a estabilidade no
trato gastrintestinal (GREF et al., 2001).
Monômero de ácido láctico Monômero de ácido glicólico
30
3.2.1.1 Nanocápsulas
Nanocápsulas são partículas de diâmetro nanométrico que contêm uma fina camada
polimérica envolvendo um núcleo líquido ou semisólido. Esses sistemas têm a capacidade de
encapsular diferentes fármacos em seu interior, dependendo da natureza do núcleo.
Inicialmente, as nanocápsulas possuíam um núcleo composto de óleo ou misturas oleosas;
mas, com o desenvolvimento tecnológico, é possível, atualmente, produzir nanocápsulas com
núcleo aquoso e, dessa forma, melhor solubilizar fármacos mais hidrofílicos (VAUTHIER;
BOUCHEMAL, 2009).
As nanocápsulas são formas farmacêuticas versáteis (no delineamento de formas
farmacêuticas), pois o núcleo pode se adequar às necessidades de solubilidade dos fármacos.
Outra vantagem de sistemas nanocápsulas, como carreadores de fármacos, é a alta eficiência
de encapsulação, otimizada pela solubilidade do núcleo, baixo conteúdo de polímero
comparado a outros sistemas nanoparticulados; além da proteção do fármaco de fatores de
degradação como pH, luz e redução da irritação tecidual devido à cobertura polimérica
(TORCHILIN, 2007).
3.2.1.2 Métodos de preparação
Os principais métodos de preparação das nanocápsulas estão esquematizados abaixo
(Figura 6). Atualmente, existem seis métodos de preparação de nanocápsulas:
nanoprecipitação, emulsificação-difusão, emulsão-coarcervação, emulsão múltipla,
revestimento polimérico e camada por camada.
31
Figura 6. Esquema de preparação de nanocápsulas por nanoprecipitação (A), emulsificação – difusão (B), emulsificação – coarcervação (C), emulsão múltipla (D), revestimento polimérico (E) e camada por camada (F) (adaptado de MORA-HUERTAS et al., 2010).
O método de preparação das nanocápsulas se baseia em duas principais etapas: a
primeira é a preparação de um sistema emulsionado, que normalmente determina o tamanho
final da nanopartícula; e a segunda fase é a formação propriamente dita na nanocápsulas. Essa
última fase, que normalmente leva o nome do método, pode se basear na precipitação,
geleificação dos polímeros, ou ainda, na polimerização de monômeros (Figura 7). Em alguns
casos, a formação das nanopartículas ocorre ao mesmo tempo em que a emulsificação do
sistema. Poucos métodos não requerem uma emulsificação anterior; esses métodos se baseiam
na espontânea precipitação do polímero ou pela formação de nanogéis ou complexos
polieletrólitos (MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010).
32
Figura 7. Esquema mostrando as forças envolvidas na fase de formação das emulsões (A) e a acomodação do sistema durante a formação das nanocápsulas pela remoção do solvente (B) (Adaptado de VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009).
No método de extração de solvente, a remoção da solução orgânica promove a
formação da nanopartícula. Existem diversas formas de extrair a fase orgânica que dissolve o
polímero, entre elas está a: rotaevaporação do solvente, rápida difusão do mesmo para o
solvente aquoso e o método de salting out. O que vai determinar se haverá um núcleo ou não
é a adição de óleo a solução polimérica ou a formação de uma emulsão múltipla. Essa última
produziria nanocápsulas com um núcleo aquoso, mas possuem a desvantagem de produzir
nanocápsulas de tamanho maior (BILATI; ALLÉMANN; DOELKER, 2005).
As nanocápsulas desenvolvidas por Fessi (FESSI et al., 1989) diferem das demais
por um procedimento simples de preparação de nanopartículas. Além de simples, é
reprodutível, rápido, econômico e a facilidade de transposição para escala industrial. A
técnica baseia-se na emulsificação espontânea de uma solução orgânica contendo polímeros
pré-formados e óleo que irá compor o núcleo, e uma solução aquosa. A escolha do solvente se
dá pela miscibilidade em água e a facilidade de remoção por evaporação. Com isso, é
frequente a escolha da acetona como solvente orgânico nesse método (LEGRAND et al.,
2007). As nanocápsulas formam-se imediatamente quando se verte a fase orgânica na fase
aquosa, isso se deve a rápida difusão da acetona na água. Nanocápsulas formadas por esse
método geralmente possuem tamanho médio entre 150 a 250 nanômetros com uma
distribuição Gaussiana estreita (baixo índice de polidispersão). O uso de surfactantes ou
copolímeros com características anfifílicas permite uma melhor estabilidade física das
suspensões formadas quando estocadas por longos períodos de tempo, evitando a agregação
(MOSQUEIRA et al., 2001).
33
Outras vantagens desse método de nanoprecipitação incluem, por exemplo, a
ausência de reações químicas, quando comparado com outros métodos como a polimerização
interfacial, adequação de vários tipos polímeros ao método. Mas a utilização de solventes
orgânicos, ainda que completamente retirado pela rotaevaporação, continua sendo a principal
limitação do método (ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008).
3.2.1.3 Métodos de caracterização
Caracterizações físico-químicas nos sistemas desenvolvidos são fatores importantes
para a melhoria das características das formulações farmacêuticas. Dentre os parâmetros
físico-químicos utilizados para caracterização, estão o doseamento e a eficiência de
encapsulação.
A eficiência de encapsulação e a quantificação do fármaco podem ser determinadas
por dissolução do sistema polimérico numa solução orgânica adequada para que seja possível
a extração do conteúdo das nanocápsulas. Solventes, tais como diclorometano, acetonitrila,
metanol e tetra-hidrofurano são comumente utilizados na extração da molécula bioativa
contida nas nanocápsulas poliméricas. Contudo, metodologias para uma quantificação
adequada do fármaco encapsulado são desenvolvidas através de técnicas como, por exemplo,
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou espectrofotometria por ultravioleta (UV).
Mas quando a formulação em questão são nanocápsulas o método espectrofotométrico pode
não ser o mais adequado. Isso ocorre devido à interferência dos componentes da formulação
no mesmo comprimento de onda de absorção máxima do fármaco e, com isso, métodos por
HPLC/CLAE se tornam mais adequados. Para se ter uma metodologia confiável, é importante
que se faça validação por cromatografia líquida de alta eficiência. Desse modo, consegue-se
determinar corretamente parâmetros quantitativos, como, por exemplo, a eficiência de
encapsulação do processo (SANTOS et al., 2005).
34
3.3 VALIDAÇÃO ANALÍTICA
Para o desenvolvimento de uma validação analítica, se faz necessário cumprir certos
requisitos convenientemente descritos no Guia de Validação de Procedimentos Analíticos. A
linearidade é uma delas; ela consiste na comprovação de que um procedimento analítico
habilitado pode obter resultados diretamente proporcionais a concentração da substância à ser
analisada numa amostra (ICH, 1996).
A linearidade pode ser determinada diretamente pela substância a ser analisada por
diluições de uma solução padrão ou por pesagens isoladas de misturas sintéticas dos
componentes (ICH, 1996). No caso de haver uma correlação linear, os dados devem ser
avaliados através de métodos estatísticos e, nos casos em que não houver, a amostra deve ser
descrita por uma função adequada à concentração da substância analisada na amostra. Para o
estabelecimento da linearidade, é recomendada a análise de pelo menos cinco níveis de
concentrações diferentes. O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser
0,99 (ANVISA, 2002; BAKSHI; SINGH, 2003).
Outro importante fator é a especificidade de uma amostra. Trata-se de um termo
analítico que consiste na capacidade de avaliar de forma precisa uma substância na presença
de outros componentes que pode eventualmente compartilhar de um mesmo meio numa
amostra. Esses podem ser: impurezas, produtos de degradação, matriz ou simplesmente os
componentes da formulação. Tal definição tem como base a identificação, de modo
inequívoco, do analito em questão (LI, 2008).
A exatidão de um procedimento analítico expressa o grau de concordância entre o
valor que é aceito como verdadeiro ou um valor de referência aceito. Isso às vezes é chamado
de rigor e, é normalmente esse valor é expresso em porcentagem. Precisão é um procedimento
analítico que expressa o grau de concordância entre uma série de medições obtidas por uma
amostragem múltipla de uma mesma amostra. Para se considerar a precisão de um método,
são necessárias três determinações: a repetitibilidade que expressa à precisão nas condições de
funcionamento em um curto espaço de tempo; a precisão intermediária, que é demonstrada
em situações distintas como: dias diferentes, analistas diferentes e equipamentos diferentes; e,
por ultimo, a reprodutibilidade, que exprime, sobretudo, a precisão entre laboratórios, sendo
esse último mais utilizado em validações que se pretende indexar em farmacopéias
35
(DEJAEGHER; VANDER HEYDEN, 2006). A precisão de um método analítico pode ser
expressa como o desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de uma
série de medidas. A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo ou coeficiente de
variação, segundo a fórmula 1,
DPR x100 (1)
em que, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada. O valor
máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração
do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores
superiores a 5%.
O limite de detecção (LD) de um método analítico consiste em um processo
individual de análises, onde se determina a menor quantidade da substância analisada que
pode ser detectada. No entanto, ela pode não ser quantificada. O limite de quantificação (LQ)
consiste na detecção precisa e exata da menor quantidade de uma substância que se encontra
numa amostra. Esse método é empregado para ensaios quantitativos em que há baixos níveis
de compostos nas matrizes. E é utilizado para determinação de impurezas e produtos de
degradação que venham a estar na amostra. Os limites de detecção e de quantificação são
expressos pelas equações 2 e 3 abaixo, onde “σ” é o desvio padrão da resposta e “S” é o
slope, ou inclinação da curva de calibração (RIBANI et al., 2004).
LD 3,3 (2)
10 (3)
A robustez deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento do método e
depende do tipo de procedimento em estudo. Deve expressar a confiabilidade da análise
quando submetido a variações deliberadas nos parâmetros do método, se as medições são
susceptíveis a variações nas condições analíticas. As condições analíticas devem ser
adequadamente controladas ou uma declaração de precaução deve ser incluída no
procedimento. Exemplos de variações típicas são: a estabilidade das soluções analíticas,
tempo de extração, a influencia do pH na fase móvel, diferentes colunas (lotes e/ ou
fornecedores), influencia na composição da fase móvel, temperatura, entre outras (ICH,
1996).
36
Todos os dados devem utilizar testes estatísticos que comprovem a fiabilidade dos
dados, no nível de confiança de 95%. Com base nesses parâmetros, é possível se validar
analiticamente qualquer composto e com isso ter uma ferramenta hábil para a determinação de
compostos em diversas matrizes (ANVISA, 2002).
37
CONCLUSÕES
38
4 CONCLUSÕES
O presente trabalho permitiu o desenvolvimento e validação de um método
analítico de quantificação da trans-desidrocrotonina sem a interferência da
matriz analítica;
O método de dosagem t-DCTN utilizando cromatografia líquida de alta
eficiência foi assaz aplicado em nanocápsulas convencionais e furtivas;
O método cromatográfico utilizou um simples processo de solubilização dos
constituintes da formulação;
O método obtido se mostrou seletivo, sensível, preciso, reprodutível, com
limites de detecção e quantificação abaixo da faixa de trabalho e com baixa
interferência da matriz;
O estudo demonstrou que as nanocápsulas contendo trans-desidrocrotonina
obtidas pelo método de nanoprecipitação possuíam uma eficiência de
encapsulação superior a 97%.
O estudo ainda permitiu observar que as formulações de nanocápsulas
continham valores superiores a 1,0 mg.mL-1 de t-DCTN.
39
PERSPECTIVAS
40
5 PERSPECTIVAS
Tem-se a perspectiva de produzir um artigo sobre os nanosistemas utilizados no
presente trabalho. Para isso, deve-se caracterizar físico-quimicamente o sistema
nanoparticulados obtido; determinar a cinética de liberação in vitro da t-DCTN a partir das
nanocápsulas; analisar o comportamento dos nanossistemas em sistemas biológicos (in vivo) e
verificar uma possível diminuição da toxicidade da t-DCTN após a utilização dos sistemas
nanoparticulados.
41
REFERÊNCIAS
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REFERÊNCIAS
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50
APÊNDICE A – ARTIGO
51
A validated HPLC method for determining trans-dehydrocrotonin in 1
PLGA- and PEGylated PLGA-based nanocapsules 2
3
Hywre C. B. Pinto1, Milena S. Ferraz1, Waldenice A.Morais1, Maria Aparecida M. Maciel2, 4
Nereide S. Santos-Magalhães1 5
6
1Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco, 7
Recife, PE, Brazil 8
2Laboratório de Tecnologia de Tensoativos (LTT), Departamento de Química, Universidade 9
Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil 10
11
12
* Corresponding author: 13
Nereide Stela Santos-Magalhães 14
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) 15
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) 16
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária, 50670-901, Recife, PE, Brazil. 17
Tel.: +55 81 21268484; fax: +55 81 21268485 18
E-mail: [email protected] (N.S. Santos-Magalhães) 19
20
21
22
23
24
25
52
Abstract 26
A specific and responsive high-performance liquid chromatography (HPLC) method 27
was developed and validated for trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) determination in PLGA- 28
and PEGylated-based nanocapsules. The analysis was performed using a C18 analytical 29
column and isocratic elution with acetonitrile:water (50:50, v/v) as mobile phase at the flow 30
rate of 0.3 mL/min. The lower limits of quantification and detection were 0.181 µg/mL and 31
0.060 µg/mL, respectively. The calibration curve of t-DCTN was linear [t-DCTN] = (0.056 – 32
area)/1.739 over the range of 0.5-20 µg.mL-1 (r2 = 0,999). Intra- and inter-day assay variations 33
were <5%. The accuracy values were between -2.29 and 2.48% relative error (RE%). Sample 34
preparation of nanocapsules involved a dilution with acetonitrile:methanol (50:50, v/v) and 35
subsequent dilution with a mobile phase. The recovery and the encapsulation efficiency of t-36
DCTN in conventional PLGA nanocapsules were 101.17 0.73% and 97.8 2.66%, 37
respectively, while in furtive PEG-PLGA nanocapsules were 96.68 3.46% and 98.9 38
1.66%, respectively. A sensitive analytical HPLC method was thus provided to determine t-39
DCTN and was successfully applied to quantify t-DCTN efficiency encapsulation into PLGA 40
and PEG-PLGA nanocapsules. 41
42
43
44
Keywords: trans-dehydrocrotonin, HPLC, validation, nanocapsules, drug 45
encapsulation efficiency 46
47
48
49
50
53
1. Introduction 51
52
Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) is a large tree from the Amazon region of 53
Brazil. Chemical investigations on the bark have led to the isolation of several clerodane 54
diterpenes, including trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) [1]. Terpenes are a wide class of 55
secondary metabolites of plants presenting multiple biological activities, especially against 56
cancer, such as diterpene Taxol [2]. t-DCTN, a 19-nor-clerodane diterpene (Figure 1), is the 57
most active compound extracted from C. cajucara with a wide pharmacological profile that 58
includes anti-inflammatory, antinoceptive [3], antiulcerogenic [4], hypoglycemic [5], 59
hypolipidemic [6], antiestrogenic [7], vasorelaxant [8], cytotoxicity [9] and anti-tumor [10] 60
activities. 61
Despite the biological activities, a related hepatotoxicity of t-DCTN has been reported 62
[11]. To overcome this issue t-DCTN has been encapsulated in drug delivery systems such as 63
microspheres [12] and nanoparticles [13]. In the present report, we introduce new 64
formulations of t-DCTN encapsulated into conventional and long-circulating nanocapsules 65
prepared with a copolymer of lactic and glycolic acids (PLGA) or its pegylated derivative 66
(PEG-PLGA), respectively. 67
Recently, t-DCTN was quantified in PLGA microspheres [12] and L-ascorbic-6-68
sterate functionalized PLGA nanoparticles [13] using UV spectroscopy at 238 nm and 230 69
nm, respectively. However, UV spectroscopy is not a suitable method for determining t-70
DCTN in PLGA-based nanocapsules, due to the interference of their matrix constituents. The 71
aim of this study was thus, to develop and validate a sensitive and reproducible method of 72
high performance liquid chromatography to quantify t-DCTN in PLGA and PEG-PLGA 73
nanocapsules without interference from their constituents, such as soybean oil, polymers and 74
surfactants. 75
54
76
2. Experimental 77
78
2.1. Chemicals 79
All solvents used were of HPLC quality or analytical grade and were filtrated through 80
a 0.22 µm nylon membrane (Millipore, Bedford, MA, USA). Water was previously purified 81
and deionized using a Milli-Q water purification system (Millipore, Bedford, MA, USA). 82
Acetonitrile was purchased from Fisher Scientific (Pittsburg, PA, USA). Trans-83
dehydrocrotonin (purity >99.5%) was supplied by Dr. Maciel from Laboratory of Technology 84
of Surfactants (Natal, Brazil). Poloxamer® 188 and soybean oil were supplied by Sigma-85
Aldrich (St. Louis, MO, USA). Soybean phosphatidylcholine (Epikuron® 200) was obtained 86
from Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Germany). Poly (D,L-lactic acid-co-glycolic acid) 87
(PLGA 50/50, inherent viscosity 0.57 dl/g) was purchased from Birmingham Polymers 88
(Pelham, AL, USA). Poly [(D,L-lactide-co-glycolide)-co-poly(ethylene glycol)] diblock 89
copolymer (PLGA-PEG, Resomer® RGP d50105; PLGA 50/50, MW 45 kDa, containing 90
approximately 10% PEG covalently grafted with an Mw 5kDa) was provided by Boehringer 91
Ingelheim GmbH (Ingelheim am Rhein, Germany). 92
93
2.2. Equipment and chromatographic conditions 94
The chromatographic system used to develop and validate the HPLC method was an 95
AKTA™ Purifier system equipped with an autosampler A-900, a monitor UPC-900 96
controller, and a multiple wavelength detector (GE-Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, 97
USA) operating at 240 nm. UNICORN TM v. 4.11 for instrumental control and 98
chromatographic data collection was used. For robustness studies a LC-MS-IT-TOF 99
(Shimadzu, Japan) equipped with a photodiode array detector (SPD-M20A), two pumps (LC-100
55
20AD e LC-20AD) and an auto-sampler SIL-20AD assembled with a communication module 101
(CBM – 20 A) was used. 102
UV-HPLC quantification of t-DCTN was performed on a SPHERISORB ODS2 C18 103
(150 mm x 4.6 mm, 5 µm, Endcapped) column (Waters®, Milford, MA, USA), using an 104
isocratic elution with a mobile phase of acetonitrile:water (50:50, v/v) at a flow rate of 0.3 105
mL/min. The validation and application of the method were performed at 25C with injection 106
volume of samples set at 50 µL. 107
108
2.3. Preparation of t-DCTN standard solutions 109
A stock solution of t-DCTN (100 µg/mL) was prepared by dissolving an accurately 110
weighed amount in acetonitrile. Calibration standard solutions of t-DCTN were then prepared 111
by serial dilution of aliquots of the stock standard solution with the mobile phase (acetonitrile-112
water 50:50, v/v) to final concentrations of 0.5, 2, 5, 10, 15 and 20 µg/mL. 113
114
2.4. Preparation of t-DCTN-loaded PLGA and PEG-PLGA nanocapsules 115
PLGA and PEG-PLGA nanocapsules containing t-DCTN were prepared by the 116
interfacial polymer deposition method followed by removal of solvent [15]. First, an organic 117
phase consisting of the polymer (0.15 g), soybean phosphatidylcholine (0.15 g), soybean oil 118
(0.10 g) and t-DCTN (0.01 g) dissolved in acetone (15 mL) was prepared. This organic phase 119
was then added to an aqueous phase consisting of the Poloxamer® 188 in 45 ml of 0.2 M 120
phosphate buffer solution (pH 7.4) under magnetic agitation. After stirring at 150 rpm for 30 121
min, the acetone was removed by evaporation under reduced pressure. Finally, the colloidal 122
suspension was concentrated to the desired final volume (10 mL) by removal of water under 123
reduced pressure to obtain t-DCTN-loaded nanocapsules at 1.0 mg/mL. 124
125
56
2.5. Sample preparation of t-DCTN-loaded nanocapsules for HPLC analysis 126
The samples of t-DCTN-loaded nanocapsules for HPLC analysis were prepared by 127
diluting 1000 µL of the nanocapsule suspension with 10 mL of acetonitrile-methanol (50:50, 128
v/v). The mixture was vigorously shaken in a vortex mixer for 3 minutes and then sonicated 129
for 3 minutes. An aliquot of 1000 µL of this organic solution was diluted with 10 mL of 130
mobile phase and vigorously shaken for 3 minutes. Finally, the sample was filtrated into an 131
autosampler vial and 50 µL aliquot was injected into the HPLC system. 132
133
2.6. Method validation 134
The optimized method was then validated for specificity, linearity, accuracy and 135
precision following ICH guidelines [14]. The specificity of the method was checked by 136
comparing the chromatograms of t-DCTN solution with unloaded PLGA- and PEG-PLGA-137
based nanocapsules and a corresponding sample of t-DCTN-loaded PLGA- and PEG-PLGA-138
based nanocapsules. Each sample was tested using the chromatographic conditions described 139
above, to ensure that the nanocapsule matrix did not interfere with the determination of t-140
DCTN. 141
The method linearity was verified by preparing nine calibration curves at six 142
concentration levels of t-DCTN (0.5, 2, 5, 10, 15 and 20 μg/mL). The calibration curves were 143
plotted as a function of t-DCTN peak area versus t-DCTN concentration and data were fitted 144
using linear regression analysis. In addition, a residual analysis was performed using residual 145
scatterplots, which provide a visual examination of the assumptions of normality, linearity 146
and homoscedasticity between the predicted dependent variable scores and the errors of 147
prediction. 148
The limits of detection and quantification of t-DCTN were determined using the 149
standard curve resulting from the average of seven calibration curves used in the linearity of 150
57
the method. The calculation to determine the values corresponding to the lowest limit of 151
quantification (LLOQ) and the lowest limit of detection (LLOD) is based on the residual 152
standard deviation of the response (SD) and its relationship to the slope (α) of the standard 153
curve: LLOQ = (SD×10)/α and LLOD = (SD× 3.3)/α. 154
The repeatability and intermediate precision of the method were evaluated by two 155
analysts on three different days. Samples of t-DCTN were analyzed at three concentration 156
levels (5, 10 and 20 μg/mL) in triplicate. The precision was calculated using the relative 157
standard deviations (R.S.D.%). Statistical analysis (F-test) of the deviation of the results was 158
performed. 159
To evaluate the method accuracy, samples of unloaded PLGA and PEG-PLGA 160
nanocapsules were spiked with t-DCTN at three concentration levels (5, 10 and 15 μg/mL) 161
and analyzed in triplicate. Accuracy is defined as the deviation from the calculated value (E) 162
and the true value (T) of the drug recovery, expressed as a percentage of the residual errors 163
(RE%), and was calculated as RE% = (E - T)/T × 100. 164
The robustness of the method was evaluated by changing the HPLC equipment and 165
analyzing t-DCTN standard solutions at three concentration levels (0.5, 10 and 20 μg/mL). 166
The data variations found as a result of using two different HPLC chains were analyzed using 167
the F-test. 168
169
2.7. Content and encapsulation efficiency of t-DCTN into PLGA and PEG-PLGA 170
nanocapsules 171
First, the content of t-DCTN in PLGA and PEG-PLGA nanocapsules was determined, 172
after sample preparation as described in section 2.5. To determine encapsulation efficiency 173
samples of nanocapsules were submitted to ultra-filtration/centrifugation using Microcon® 174
filter units (Millipore, Bedford, MA, USA). After sample centrifugation (Ultracentrifuge KT-175
58
20000, Kubota, Japan) at 10,000 rpm for 1 h at 4°C, the supernatant was diluted to a 176
theoretical concentration of 1.5 μg/mL and the concentration of t-DCTN determined as 177
described above. Encapsulation efficiency was thus calculated by the difference of t-DCTN 178
concentrations in nanocapsules and the supernatant, the latter being considered as the non-179
encapsulated drug. Assays were performed in triplicate and results expressed as percentages. 180
181
3. Results and discussion 182
183
3.1. Chromatographic optimization 184
For the selection of the wavelength to detect the t-DCTN, a scanning of t-DCTN in 185
acetonitrile at different wavelengths was performed using UV spectroscopy. The maximum 186
absorption of t-DCTN was found at 240 nm. In order to obtain a reproducible relationship 187
between absorbance and t-DCTN concentrations, the wavelength of maximum absorbance 188
was considered for the method developing. As the absorbance variation per concentration unit 189
is more noticeable at this point (240 nm), maximum sensitivity is assured. Furthermore, the 190
interference of oily constituents of formulations, which absorption is about 220 nm, is 191
avoided. Then, taking into account the variations result from the use of two different HPLC 192
chains, three wavelengths were chosen near the maximum absorption peak. Injections of t-193
DCTN solutions were repeated to select the wavelength that provided the best signal to noise 194
ratio in the chromatogram. 195
Based on the results of the separation of neo-clerodane diterpenoids from Teucrium 196
chamaedrys and T. canadense using UV HPLC method [16], different mobile phase 197
constitutions were tested in order to optimize chromatographic conditions, through a number 198
of attempts to reach a suitable retention time, sensitivity and specificity for t-DCTN detection 199
at 240 nm. Thus, different acetonitrile:water ratios and the flow rate of the mobile phase were 200
59
evaluated to obtain the best sensitivity, asymmetry factor (As10), capacity factor (k´) and 201
number of theoretical plates per meter (NPT/m) used to calculate height equivalent to 202
theoretical plates (HEPT) of t-DCTN chromatogram. The results showed that the factors 203
associated with the peak resolution, and as a result the asymmetry, were the parameters most 204
influenced by a change in the flow rate (Table 1). In general, the best response of the 205
equipment is due to a low value of HETP and a high NPT/m. For t-DCTN, these optimal 206
conditions were achieved for the mobile phase consisting of acetonitrile:water (50:50, v/v) at 207
a flow rate of 0.3 mL.min-1. In these conditions As10=1.35 was found, which meeting the 208
criteria for symmetrical peaks (As=0.8–1.5) according to EP [17]. The average peak capacity 209
(k´) was 3.75 and HEPT=0.018, which are fully acceptable by general recommendations. 210
Given that a broad peak or a peak with a tail is not desirable for t-DCTN, the pH of the 211
mobile phase was varied by replacing water by buffer solutions at pH 3.8, 5.0 and 7.4. 212
Chromatographic profiles of t-DCTN were similar for all tested pH (results not shown); 213
indicating that detection of t-DCTN was not influenced by the variation in the pH of the 214
mobile phase. Since the presence of buffer solutions in the mobile phase always reduces the 215
lifetime of the chromatographic column, water was chosen to prepare the mobile phase. In 216
addition, methanol was also used to replace acetonitrile in the mobile phase, but no well-217
defined peaks of t-DCTN were obtained. 218
Taking into account all these findings, the optimal conditions for chromatographic 219
analysis of t-DCTN were established as a mobile phase consisting of acetonitrile:water 220
(50:50, v/v) at a flow rate of 0.3 mL/min, in which the retention time of t-DCTN was about 20 221
min. Therefore, the method provides sufficient resolution, but is time-consuming. This result 222
is agreement with those of Sundaresan and collaborators [16] for HPLC analysis of others 223
neo-clerodane diterpenoids, when the retention time varied from 12 to 45 minutes for a 25 224
cm-C12 column. 225
60
226
3.2. Method validation 227
3.2.1. Specificity 228
The method specificity was evaluated by analyzing unloaded PLGA and PEG-PLGA 229
nanocapsules from three different batches. No interference from formulation components at 230
the retention time of t-DCTN was found in any of the samples analyzed. The elution length of 231
t-DCTN was about 6 mL. Typical chromatograms of a t-DCTN, unloaded and loaded PLGA- 232
and PEG- PLGA-based nanocapsules are shown in Figure 2. 233
234
3.2.2. Linearity 235
This method exhibited a linear response over the selected t-DCTN concentration range 236
of 0.5–20 µg.mL-1. The representative standard curve was described by the equation: [t-237
DCTN] = (0.056 – area)/1.739, r2 = 0.9999 (n=7). The residual analysis of the t-DCTN 238
standard curves performed using residual scatterplots showed that residuals are placed 239
between the acceptable ranges of +2 and -2. This indicates a homoscedasticity between the 240
predicted dependent variable scores and the errors of prediction, confirming that the linear 241
model can be used for data fitting. However, a tendency towards augmentation of the 242
scattering plot was found for higher concentrations of t-DCTN. 243
244
3.2.3. Limits of detection and quantification 245
The LLOQ and LLOD of t-DCTN were determined as 0.181 µg.mL-1 and 0.060 246
µg/mL, respectively, being therefore, appropriate, as they are below the selected 247
concentration of 0.5 µg/mL. 248
249
3.2.4. Accuracy 250
61
The method accuracy was evaluated by the recovery of t-DCTN in unloaded PLGA 251
and PEG-PLGA nanocapsule samples spiked with t-DCTN at three concentration levels (5, 10 252
and 15 µg/mL). The recovery of t-DCTN ranged from 97.8 to 100.8% in PLGA nanocapsules 253
(RE% = 0.27 - 2.29%). In PEG-PLGA nanocapsules the recovery of t-DCTN was 102% with 254
a RE% ranging from 2.20 to 2.48% (Table 2). These results are satisfactory and proved the 255
accuracy of the proposed method for determining t-DCTN in nanocapsules. 256
257
3.2.4. Repeatability and intermediate precision 258
The repeatability and intermediate day-to-day and analyst-to-analyst precision of the 259
HPLC method for determining t-DCTN at 0.5, 10 and 20 µg/mL concentrations is shown in 260
Table 3. The method repeatability was confirmed with a RSD% less than 3%. The inter-day 261
and analyst-to-analyst precision for t-DCTN at 0.5, 10 and 20 µg/mL concentrations provided 262
calculated F-values (0.41 – 4.62) less than the critical F-value (7.71) and revealed the good 263
method precision. 264
265
3.2.5. Robustness 266
The robustness of the HPLC method for determining t-DCTN at 0.5, 10 and 20 µg/mL 267
concentration levels was confirmed using two different HPLC chains. Calculated F-values 268
(0.22 – 2.32) were less than the critical F-value (7.71) for all tested samples (Table 4). 269
270
3.3. Encapsulation efficiency of t-DCTN into nanocapsules 271
The validated method was applied to quantify t-DCTN concentration in PLGA- and 272
PEGylated PLGA-based nanocapsules. The content of t-DCTN in PLGA nanocapsules was 273
101.17 0.73% (1.01 0.00 µg/mL) with an encapsulation efficiency of 97.8 2.66%, while 274
in PEG-PLGA nanocapsules, the t-DCTN content and encapsulation efficiency were 96.68 275
62
3.46% (0.97 0.03 µg/mL) and 98.9 1.66%, respectively. These results showed that the t-276
DCTN was satisfactorily encapsulated into both conventional and pegylated PLGA-based 277
nanocapsules. Furthermore, the results of t-DCTN recovery from nanocapsules with relative 278
error of less than 5% in all determinations confirmed the accuracy and precision of the 279
method. 280
281
4. Conclusions 282
283
In this study, a UV-HPLC method was developed and validated to quantify t-DCTN in 284
PLGA- and PEG-PLGA-based nanocapsules containing t-DCTN using a simple extraction 285
procedure. The proposed UV-HPLC method provided greater selectivity, sensitivity, 286
repeatability, precision and robustness. This method was successfully applied to determine the 287
content and encapsulation efficiency of t-DCTN in PLGA- and PEG-PLGA-based 288
nanocapsules. 289
290
Acknowledgements 291
292
This research project was funded by the Brazilian Council for Scientific and 293
Technological Development (Grant # 474071/2007-3). 294
295
Reference 296
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332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
345
346
347
348
349
350
65
Table 1 351
Optimization of chromatographic conditions of flow rate and mobile phase in the analysis of 352
t-DCTN using asymmetry factor (As10), Capacity factor (k´) and height equivalent to 353
theoretical plates (HEPT). 354
Chromatographic conditions Parameters
Flow rate (mL.min-1) Mobile phase [ACN:water] (v/v) As10 k´ HEPT
0.3 1.35 0.03
3.75
0.018 0.002
0.5 50:50 1.73 0.01 0.019 0.001
1.0 1.70 0.01 0.019 0.001
0.3 1.60 0.06
2.15
0.053 0.000
0.5 60:40 1.76 0.06 0.052 0.000
1.0 1.81 0.18 0.052 0.003
0.3 1.55 0.12
1.30
0.077 0.034
0.5 70:30 1.73 0.10 0.099 0.000
1.0 1.80 0.17 0.101 0.005
355
356
357
358
359
360
361
362
363
364
365
66
Table 2 366
The accuracy of the HPLC method of t-DCTN analysis in unloaded PLGA and PEG-PLGA 367
nanocapsules spiked with t-DCTN. 368
Spiked
t-DCTN (µg/mL) PLGA NC PEG-PLGA NC
Concentration found
(mean S.D., µg/mL) RE%
Concentration found
(mean S.D., µg/mL) RE%
5 4.89 0.22 -2.29% 5.12 0.08 2.48%
10 10.08 0.10 0.84% 10.22 0.15 2.20%
15 15.04 0.23 0.27% 15.37 0.13 2.45% RE% = relative error; SD = standard deviation (n=3); PLGA NC= unloaded PLGA nanocapsules spiked with t-DCTN; PEG-PLGA NC= 369
unloaded PEG-PLGA nanocapsules spiked with t-DCTN 370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
380
381
382
67
Table 3 383
The repeatability and intermediate day-to-day and analyst-to-analyst precision of the HPLC 384
method for determining t-DCTN. 385
t-DCTN
(µg/mL)
Repeatability Intermediate precision
Inter-day Inter-analysts
R.S.D.% Day 1 Day 2 Fcalc A B Fcalc
0.5 0.49 ± 0.01 1.66 0.49 ± 0.00 0.49 ± 0.00 1.94 0.49 ± 0.01 0.50 ± 0.01 2.06
10 10.19 ± 0.17 1.89 10.10 ±0.23 9.91 ± 0.34 1.10 9.89 ± 0.36 10.37 ± 0.15 4.62
20 20.43 ± 0.25 2.16 20.29 ± 0.35 20.17 ± 0.10 0.41 19.98 ± 0.49 20.22 ± 0.24 0.57*Inter-day precision (3 days; n=3); Fcritical = 7.71 386
387
388
389
390
391
392
393
394
395
396
397
398
399
400
401
402
68
Table 4 403
The robustness of the HPLC method for determining t-DCTN. 404
Theoretical t-DCTN (µg.mL-1) Equipment A Equipment B Fcalc
Concentration found
(mean S.D., µg.mL-1)
Concentration found
(mean S.D., µg.mL-1)
0.5
10
0.49 0.00
10.18 0.17
0.47 0.00
10.29 0.12
2.32
0.22
20 20.49 0.25 19.45 0.67 1.19 Critical F-value = 7.71 (n=3). 405
406
407
408
409
410
411
412
413
414
415
416
417
418
419
420
421
422
423
69
List of Figures 424
425
Figure 1. Chemical structure of trans-dehydrocrotonin (t-DCTN). 426
427
Figure 2. Chromatograms of t-DCTN (DCTN), unloaded PLGA-based nanocapsules (NC 428
PLGA), unloaded PEGylated PLGA-based nanocapsules (NC PEG), t-DCTN-loaded PLGA-429
nanocapsules (NC PLGA DCTN) and t-DCTN-loaded PEGylated PLGA-nanocapsules (NC 430
PEG DCTN). 431
432
433
434
435
436
437
438
439
440
441
442
443
444
70
445
446
Fig. 1 447
71
448
449
Fig. 2 450
72
ANEXOS
73
ANEXO A – ESPECTRO DE MASSA DA t-DCTN
2 1 7 ,0 2 1 6
2 3 7 ,1 1 4
2 7 1 ,1 3 3 3
3 1 3 ,1 4 4 33 3 1 ,1 5 3 5
2 0 0 2 4 0 2 8 0 3 2 0 3 6 00
5 0
1 0 0
m /z
Figura 8. Espectro de massa da t-DCTN (Peso molecular = 314) no modo positivo (na fração do tempo de retenção = 18 – 20 min.).
2 2 5 ,1 2 4
2 5 1 ,1 4 0 9
2 6 9 ,1 4 9 8
3 1 5 ,1 5 6 2
2 0 0 2 4 0 2 8 0 3 2 0 3 6 00
5 0
1 0 0
m /z
Figura 9. Espectro de massa da t-DCTN (Peso molecular = 314) no modo negativo (na fração do tempo de retenção = 18 – 20 min.).
74
ANEXO B – GUIA PARA AUTORES
Guide for Authors – Journal of Chromatography A
ISSN: 0021-9673 Imprint: ELSEVIER
Journal of Chromatography A provides a forum for the publication of
original research and critical reviews on all aspects of fundamental and
applied separation science. The scope of the journal includes
chromatography and related techniques, electromigration techniques (e.g. electrophoresis,
electrochromatography), hyphenated and other multi-dimensional techniques, sample
preparation, and detection methods such as mass spectrometry. Contributions consist mainly
of research papers dealing with the theory of separation methods, instrumental developments
and analytical and preparative applications of general interest.
Journal of Chromatography A welcomes the submission of research papers which
report on studies concerning the development of new and significant advances in separation
science. Manuscripts detailing fundamental research on all aspects of separation science
theory and methodology are especially encouraged. In determining the suitability of submitted
articles for publication, particular scrutiny will be placed on the degree of novelty and
significance of the research and the extent to which it adds to existing knowledge in
separation science. Papers describing the use of routine separation methods or straightforward
extensions of these methods to new sample matrices will normally not be published unless
new developments are described which are demonstrated to give clear and considerable
advantages over existing methods. As part of the Introduction section to each manuscript,
authors must address the question of how their proposed methodology compares with
previously reported methods and this comparison must show that significant advances are
proposed.
Where new analytical methods are described, authors are encouraged to apply these
methods to a sample matrix of suitable analytical complexity. In such cases appropriate
validation of the method should be provided, together with proper statistical treatment of data.
75
Analytical performance characteristics of new methods should be given, including sensitivity,
tested limits of detection or quantification, accuracy, precision, and specificity.
Journal of Chromatography A applies the same criteria for acceptance of manuscripts
to all types of submissions, irrespective of whether these are submitted for regular issues,
special issues, or symposium issues.
Types of paper
The following types of papers are published in the Journal of Chromatography A:
Regular research papers (full-length), Review articles, Short Communications, Discussions
and Letters to the Editor. Short Communications are usually descriptions of short
investigations, or they can report minor technical improvements of previously published
procedures; they reflect the same quality of research as full-length articles, but should
preferably not exceed five printed pages (typically no more than 2850 words, with a
maximum of five figures panels and/or tables). Discussions (one or two pages) should
explain, amplify, correct or otherwise comment substantively upon an article recently
published in the journal.
Review articles are invited by the editors or may be proposed in writing to the editors
or the editorial office, who welcome suggestions for review topics. Potential authors will be
asked to provide a brief outline of the subject matter of the proposed review. Review articles
should be sufficiently broad in scope to appeal to a wide cross-section of the journal's
readership, but should be specific enough to permit discussion at an appropriate depth. Above
all, reviews should be critical rather than enumerative and should provide the reader with
expert opinion regarding the relative merits of the various published approaches to the topic
under review. Figures and Tables are encouraged in review articles.
Ethics in Publishing
For information on Ethics in Publishing and Ethical guidelines for journal publication
see http://www.elsevier.com/publishingethics and
http://www.elsevier.com/ethicalguidelines.
76
Conflict of interest
All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest
including any financial, personal or other relationships with other people or organizations
within three years of beginning the submitted work that could inappropriately influence, or be
perceived to influence, their work. See also http://www.elsevier.com/conflictsofinterest.
Submission declaration
Submission of an article implies that the work described has not been published
previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic
thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is
approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work
was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere including
electronically in the same form, in English or in any other language, without the written
consent of the copyright-holder.
Copyright
Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing
Agreement' (for more information on this and copyright see
http://www.elsevier.com/copyright. Acceptance of the agreement will ensure the widest
possible dissemination of information. An e-mail will be sent to the corresponding author
confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a
link to the online version of this agreement.
Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for
internal circulation within their institutions. Permission of the Publisher is required for resale
or distribution outside the institution and for all other derivative works, including
compilations and translations (please consult http://www.elsevier.com/permissions). If
excerpts from other copyrighted works are included, the author(s) must obtain written
permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has
preprinted forms for use by authors in these cases: please consult
http://www.elsevier.com/permissions.
77
Retained author rights
As an author you (or your employer or institution) retain certain rights; for details you
are referred to: http://www.elsevier.com/authorsrights.
Role of the funding source
You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the
research and/or preparation of the article and to briefly describe the role of the sponsor(s), if
any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the
report; and in the decision to submit the paper for publication. If the funding source(s) had no
such involvement then this should be stated. Please see http://www.elsevier.com/funding.
Funding body agreements and policies
Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose
articles appear in journals published by Elsevier, to comply with potential manuscript
archiving requirements as specified as conditions of their grant awards. To learn more about
existing agreements and policies please visit http://www.elsevier.com/fundingbodies.
Language and language services
Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not
a mixture of these). Authors who require information about language editing and copyediting
services pre- and post-submission please visit http://www.elsevier.com/languageediting or
our customer support site at http://epsupport.elsevier.com for more information.
Submission
Submission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise
through the creation and uploading of your files. The system automatically converts source
files to a single PDF file of the article, which is used in the peer-review process. Please note
that even though manuscript source files are converted to PDF files at submission for the
78
review process, these source files are needed for further processing after acceptance. All
correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes
place by e-mail removing the need for a paper trail.
Every paper must be accompanied by a letter from the senior author, stating that
he/she is submitting the paper for publication in Journal of Chromatography A.
Please submit your article via http://www.elsevier.com/locate/jchroma
Referees
Please submit, with the manuscript, the names, addresses and e-mail addresses of 3
potential referees. Note that the editor retains the sole right to decide whether or not the
suggested reviewers are used.
A working e-mail address for each reviewer is essential for rapid review. You may
also suggest reviewers you do not want to review your manuscript, but please state your
reasons for doing so.
Use of wordprocessing software
It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used.
The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possible.
Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular,
do not use the wordprocessor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use
bold face, italics, subscripts, superscripts etc. Do not embed "graphically designed" equations
or tables, but prepare these using the wordprocessor's facility. When preparing tables, if you
are using a table grid, use only one grid for each individual table and not a grid for each row.
If no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns. The electronic text should be
prepared in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Guide to
Publishing with Elsevier: http://www.elsevier.com/guidepublication). Do not import the
figures into the text file but, instead, indicate their approximate locations directly in the
electronic text and on the manuscript. See also the section on Electronic illustrations.
79
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spell-check" and
"grammar-check" functions of your wordprocessor.
Article structure
Subdivision - numbered sections
Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be
numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section
numbering). Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to "the
text". Any subsection may be given a brief heading. Each heading should appear on its own
separate line.
Introduction
State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a
detailed literature survey or a summary of the results.
Material and methods
Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already
published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be described.
Theory/calculation
A Theory section should extend, not repeat, the background to the article already dealt
with in the Introduction and lay the foundation for further work. In contrast, a Calculation
section represents a practical development from a theoretical basis.
Results
Results should be clear and concise.
80
Discussion
This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A
combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive citations and
discussion of published literature.
Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,
which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion
section.
Appendices
If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae
and equations in appendices should be given separate numbering: Eq. (A.1), Eq. (A.2), etc.; in
a subsequent appendix, Eq. (B.1) and so on.
Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems.
Do not include abbreviations or trade names in the title.
Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a
double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses (where the
actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript
letter immediately after the author's name and in front of the appropriate address. Provide the
full postal address of each affiliation, including the country name, and, if available, the e-mail
address of each author.
Corresponding author. Clearly indicate who is willing to handle correspondence at all
stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone and fax
numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail address
and the complete postal address.
Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the
article was done, or was visiting at the time, a "Present address"' (or "Permanent address")
may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which the author actually
did the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals
are used for such footnotes.
81
Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the purpose
of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often presented
separately from the article, so it must be able to stand alone. For this reason, References
should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or
uncommon abbreviations should be avoided, but if essential they must be defined at their first
mention in the abstract itself.
Keywords
Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American
spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for example,
"and", "of"). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly established in the field
may be eligible. These keywords will be used for indexing purposes.
Acknowledgements
Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the
references and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title or
otherwise. List here those individuals who provided help during the research (e.g., providing
language help, writing assistance or proof reading the article, etc.).
Nomenclature and units
Widely accepted symbols, abbreviations and units (SI) should be used. Symbols and
abbreviations that need not be defined are listed in Appendix 1. For all other symbols and
abbreviations, the full expression followed by the abbreviation should be given the first time
it appears in the text. Abbreviations used in tables and figures should be explained in the
captions. In general, the recommendations of the International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) should be followed (see http://www.iupac.org) and attention should be
given to the recommendations of the Analytical Chemistry Division in the journal Pure and
Applied Chemistry: Nomenclature for Chromatography, Pure Appl. Chem.,65 (1993) 819-
82
872. Special attention should be given to the use of the terms repeatability and
reproducibility; these are often confused.
Decimal points should be indicated by full stops. All decimal numbers smaller than
unity should include a leading zero (e.g. 0.11). Company-specific research codes for
compounds should not be used; after a full definition of the compound (possibly including
such codes) in the Introduction, it may be further indicated by a bold-face Roman or Arabic
numeral.
Appendix 1: Abbreviations and symbols that may be used without definition
Math formulae
Present simple formulae in the line of normal text where possible and use the solidus
(/) instead of a horizontal line for small fractional terms, e.g., X/Y. In principle, variables are
to be presented in italics. Powers of e are often more conveniently denoted by exp. Number
consecutively any equations that have to be displayed separately from the text (if referred to
explicitly in the text).
Footnotes
Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the
article, using superscript Arabic numbers. Many wordprocessors build footnotes into the text,
and this feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of footnotes in
the text and present the footnotes themselves separately at the end of the article. Do not
include footnotes in the Reference list.
Table footnotes
Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.
Artwork
Electronic artwork
General points
83
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.
• Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.
• Only use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times, Symbol.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide captions to illustrations separately.
• Produce images near to the desired size of the printed version.
• Submit each figure as a separate file.
A detailed guide on electronic artwork is available on our website:
http://www.elsevier.com/artworkinstructions
You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are
given here.
Formats
Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalized, please
"save as" or convert the images to one of the following formats (note the resolution
requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below):
EPS: Vector drawings. Embed the font or save the text as "graphics".
TIFF: color or grayscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi.
TIFF: Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi.
TIFF: Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale): a minimum of 500
dpi is required.
DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft
Office applications please supply "as is".
Please do not:
• Supply embedded graphics in your wordprocessor (spreadsheet, presentation)
document;
• Supply files that are optimized for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the
resolution is too low;
84
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
Simple straight-line graphs (such as calibration lines) are not acceptable, because they
can readily be described in the text by means of an equation or a sentence. Claims of linearity
should be supported by regression data that include slope, intercept, standard deviations of the
slope and intercept, standard error and the number of data points; correlation coefficients are
optional. Standard symbols should be used in line drawings; the following are available to the
typesetters and can also be used in the legends: filled or open squares, triangles, circles or
diamonds, + or x.
Color artwork
Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF, EPS or MS
Office files) and with the correct resolution. If, together with your accepted article, you
submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these
figures will appear in color on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of
whether or not these illustrations are reproduced in color in the printed version. For color
reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier
after receipt of your accepted article. Please indicate your preference for color in print or on
the Web only. For further information on the preparation of electronic artwork, please see
http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Please note: Because of technical complications which can arise by converting color
figures to "gray scale" (for the printed version should you not opt for color in print) please
submit in addition usable black and white versions of all the color illustrations.
Figure captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to
the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a description
of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum but explain all
symbols and abbreviations used.
85
Tables
Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place
footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters.
Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in
tables do not duplicate results described elsewhere in the article.
References
Citation in text
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list
(and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. Unpublished
results and personal communications are not recommended in the reference list, but may be
mentioned in the text. If these references are included in the reference list they should follow
the standard reference style of the journal and should include a substitution of the publication
date with either "Unpublished results" or "Personal communication" Citation of a reference as
"in press" implies that the item has been accepted for publication.
Reference management software
This journal has standard templates available in key reference management packages
EndNote ( http://www.endnote.com) and Reference Manager ( http://www.refman.com).
Using plug-ins to wordprocessing packages, authors only need to select the appropriate
journal template when preparing their article and the list of references and citations to these
will be formatted according to the journal style which is described below.
Reference Style
Text: Indicate references by number(s) in square brackets in line with the text. The
actual authors can be referred to, but the reference number(s) must always be given.
Example: "..... as demonstrated [3,6]. Barnaby and Jones [8] obtained a different result
...."
86
List: Number the references (numbers in square brackets) in the list in the order in
which they appear in the text.
Examples:
Reference to a journal publication:
[1] J. van der Geer, J.A.J. Hanraads, R.A. Lupton, J. Sci. Commun. 163 (2000) 51.
Reference to a book:
[2] W. Strunk Jr., E.B. White, The Elements of Style, Macmillan, New York, 3rd ed.,
1979.
Reference to a chapter in an edited book:
[3] G.R. Mettam, L.B. Adams, in: B.S. Jones, R.Z. Smith (Eds.), Introduction to the
Electronic Age, E-Publishing, New York, 1994, pp. 281.
Journal abbreviations source
Journal names should be abbreviated according to
Index Medicus journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html;
List of serial title word abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-
online.php;
CAS (Chemical Abstracts Service): http://www.cas.org/sent.html
Video data
Elsevier accepts video material and animation sequences to support and enhance your
scientific research. Authors who have video or animation files that they wish to submit with
their article are strongly encouraged to include these within the body of the article. This can
be done in the same way as a figure or table by referring to the video or animation content and
noting in the body text where it should be placed. All submitted files should be properly
labeled so that they directly relate to the video file's content. In order to ensure that your video
or animation material is directly usable, please provide the files in one of our recommended
file formats with a maximum size of 30 MB and running time of 5 minutes. Video and
animation files supplied will be published online in the electronic version of your article in
Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. Please
supply 'stills' with your files: you can choose any frame from the video or animation or make
a separate image. These will be used instead of standard icons and will personalize the link to
87
your video data. For more detailed instructions please visit our video instruction pages at
http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Note: since video and animation cannot be
embedded in the print version of the journal, please provide text for both the electronic and
the print version for the portions of the article that refer to this content.
Supplementary data
Elsevier accepts electronic supplementary material to support and enhance your
scientific research. Supplementary files offer the author additional possibilities to publish
supporting applications, high-resolution images, background datasets, sound clips and more.
Supplementary files supplied will be published online alongside the electronic version of your
article in Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In
order to ensure that your submitted material is directly usable, please provide the data in one
of our recommended file formats. Authors should submit the material in electronic format
together with the article and supply a concise and descriptive caption for each file. For more
detailed instructions please visit our artwork instruction pages at
http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Submission checklist
It is hoped that this list will be useful during the final checking of an article prior to
sending it to the journal's Editor for review. Please consult this Guide for Authors for further
details of any item.
Ensure that the following items are present:
One Author designated as corresponding Author:
• E-mail address
• Full postal address
• Telephone and fax numbers
All necessary files have been uploaded
• Keywords
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes)
88
Further considerations
• Manuscript has been "spellchecked" and "grammar-checked"
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources
(including the Web)
• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the Web
(free of charge) and in print or to be reproduced in color on the Web (free of charge) and in
black-and-white in print
• If only color on the Web is required, black and white versions of the figures are also
supplied for printing purposes
For any further information please visit our customer support site at
http://epsupport.elsevier.com.
Use of the Digital Object Identifier
The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic
documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character string which is assigned to
a document by the publisher upon the initial electronic publication. The assigned DOI never
changes. Therefore, it is an ideal medium for citing a document, particularly 'Articles in press'
because they have not yet received their full bibliographic information. The correct format for
citing a DOI is shown as follows (example taken from a document in the journal Physics
Letters B):
doi:10.1016/j.physletb.2003.10.071
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