UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

A hot interaction between immune cells and adipose tissue

van den Berg, S.M.

Link to publication

Creative Commons License (see https://creativecommons.org/use-remix/cc-licenses):Other

Citation for published version (APA):van den Berg, S. M. (2017). A hot interaction between immune cells and adipose tissue.

General rightsIt is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s),other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulationsIf you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, statingyour reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Askthe Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam,The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.

Download date: 22 May 2020

 

 

 

 

A hot interaction between immune  

cells and adipose tissue 

 Susanna Maria van den Berg 

 

                     A hot interaction between immune cells and adipose tissue 

PhD thesis, University of Amsterdam, the Netherlands 

ISBN: 978‐94‐6299‐591‐8 

 

Cover design: Emily van ‘t Wout and Susan van den Berg 

Lay‐out: Susan van den Berg 

Printing: Ridderprint BV 

Copyright 2017 © S.M. van den Berg 

  

 

 

 

 

A hot interaction between immune  

cells and adipose tissue  

 

 

 

 

 

ACADEMISCH PROEFSCHRIFT 

 

 

ter verkrijging van de graad van doctor 

aan de Universiteit van Amsterdam 

op gezag van de Rector Magnificus 

prof. dr. ir. K.I.J. Maex 

ten overstaan van een door het College voor Promoties ingestelde commissie, 

in het openbaar te verdedigen in de Agnietenkapel 

op vrijdag 2 juni 2017, te 14:00 uur 

door Susanna Maria van den Berg 

geboren te Leiden 

Promotiecommissie:   

Promotores:     Prof. Dr. E. Lutgens      AMC‐Universiteit van Amsterdam 

      Prof. Dr. M.P.J. de Winther     AMC‐Universiteit van Amsterdam  

Copromotor:     Prof. Dr. P.C.N. Rensen      Universiteit Leiden 

 

Overige leden:    Prof. Dr. N. Zelcer       AMC‐Universiteit van Amsterdam 

      Prof. Dr. M. Nieuwdorp     AMC‐Universiteit van Amsterdam 

      Prof. Dr. R.P.J. Oude Elferink     AMC‐Universiteit van Amsterdam 

      Prof. Dr. R. Shiri‐Sverdlov    Universiteit van Maastricht 

Dr. B.G.A. Guigas       Universiteit Leiden 

Dr. R.H.L. Houtkooper      AMC‐Universiteit van Amsterdam 

 

 

Faculteit der Geneeskunde  

 

                             Financial  support  by  the  Dutch  Heart  Foundation  for  the  publication  of  this  thesis  is  gratefully acknowledged.   Further financial support for printing this thesis was kindly provided by Special Diets Services.  

  

  

  

  

Table of contents 

 

Chapter 1  General introduction………………………………………………………………………………………… 9 

 

Chapter 2   Immune modulation of brown(ing) adipose tissue in obesity……………………………. 15 

 

Chapter 3  Diet‐induced obesity induces rapid inflammatory changes in brown  

adipose tissue in mice…………………………………………………………….……………..…………. 49 

 

Chapter 4  Type 2 inflammatory response by helminth‐derived antigens induces  

beiging of white adipose tissue in mice…………………………………………………………….. 65 

 

Chapter 5  Diet‐induced obesity in mice diminishes hematopoietic stem and progenitor  

cells in the bone marrow………………………………………………………………………………….. 81 

 

Chapter 6  Blocking CD40‐TRAF6 interactions by small‐molecule inhibitor 6860766  

ameliorates the complications of diet‐induced obesity in mice………………………… 101 

 

Chapter 7  General discussion……………………………………………………………………………………………. 121 

 

Appendix  I. Summary…………………………………………………….…………………………………………………  133 

    II. Samenvatting……………………………………………………………………………………………….. 137 

    III. PhD Portfolio………………………………………………………………………………………….……. 141 

 

Dankwoord  …………………………………………………………………………………………………………………………. 147 

 

 

 

1 

 

BattlingobesityGeneralintroduction

Chapter 1 

10  

 

General introduction 

11  

Battling obesity

Cookies,  candy  and  chocolate  are  found  at  every  counter, hamburgers  and  cola  are  the  cheapest 

items on the menu and exercising takes too much time and effort; it is so easy to become fat. It has 

come  to  a  point  where  obesity  rates  worldwide  are  ridiculously  high;  39%  of  the  world’s  adult 

population  is  overweight,  of  which  13%  is  obese  [World  Health  Organization]. We  love  to  eat, 

especially when it is cheap, greasy, sweet and fast. 

 

Willingness  to  eat  is  of  course  essential  to  survive  but  this  is  becoming  a  problem when  food  is 

everywhere. Why is being overweight or obese a bad thing? Obesity is linked with high risks of type 2 

diabetes (T2D), fatty liver disease, cardiovascular disease (CVD), and cancer [1]. Chronic obesity may 

shorten healthy  lifespan by 5‐20 years, which  results  in a  tremendous  socio‐economic burden  [2]. 

When energy  intake exceeds energy expenditure, white adipose tissue stores excessive  lipids. With 

the  accumulation  of  lipids,  adipocytes  enlarge  and  the  tissue  becomes  hypoxic.  Dysfunctional 

adipocytes  secrete  adipokines,  cytokines  and  chemokines  that  recruit  inflammatory  cells,  which 

results in a state of chronic low‐grade inflammation [3]. 

 

In the current era of scientific research, we are stepping in and manipulate our survival mechanisms 

by  finding  strategies  that  limit  the damage of our unhealthy eating  life  style. This  thesis describes 

three  approaches  that  contribute  to  the  battle  against  obesity‐associated  diseases.  First,  we 

hypothesize  that  obesity  induces  immunological  changes  in  brown  adipose  tissue  (BAT),  which 

affects brown adipocyte activity. Our second hypothesis  is that the chronic  low‐grade  inflammatory 

state in obesity and the continuous recruitment of immune cells affects hematopoietic stem cells in 

the bone marrow. Lastly, we hypothesize that inhibiting the interaction between the co‐stimulatory 

molecule CD40 and  its adaptor protein TRAF6 using a  small‐molecule  inhibitor will  improve white 

adipose  tissue  inflammation  and  the  associated metabolic dysfunction  in  a model of diet‐induced 

obesity. 

Brown adipose tissue burns fat 

One intriguing target to reduce excessive energy storage in obesity is BAT. BAT is involved in adaptive 

thermogenesis. Cold exposure activates  the production of heat by brown adipocytes using glucose 

and fat as fuel [4]. Chapter 2 of this thesis elaborates on how BAT is regulated, describes that brown 

adipocytes  can  occur  within  white  adipose  tissue,  describes  how  different  components  of  the 

immune system are altered  in obese adipose  tissue, and extensively discusses  recent data on how 

immune cells contribute to the regulation of brown and beige adipocyte activity. 

 

The underlying key component of adverse effects in obesity is inflammation. Although this has been 

extensively studied in white adipose tissue, effects of obesity on the inflammatory status in BAT are 

still  largely  unknown.  In  chapter  3 we  explored what  inflammatory  changes  occur  in  BAT  in  the 

course  of  obesity.  In  chapter  4 we  apply  a model  of  helminth  antigens, which  induces  a  type  2 

immune  response,  to  study  whether  skewing macrophages  to  a  Th2  and M2  anti‐inflammatory 

phenotype affects brown(ing) adipose tissue in a setting of high‐fat diet. 

Chapter 1 

12  

Does diet‐induced chronic inflammation affect hematopoietic stem cells? 

Hematopoietic stem cells and progenitor cells (HSPCs) are the most primitive precursors of immune 

cells and are mostly present  in the bone marrow. Their most  important feature  is that they have a 

self‐renewal  capacity. HSPCs generally  remain quiescent but can generate an appropriate  immune 

response when needed [5]. Homeostasis of the system  is disturbed after chronic  immune stressors, 

creating a dysbalance  in different  immune cell  lineages. Activation of HSPCs  leads  to proliferation, 

differentiation and mobilization which upon prolonged  stimuli  can even  lead  to exhaustion of  the 

stem cell pool [6]. Dysregulation of the earliest hematopoietic stem cells can have major effects on 

later lineages. 

 

Obesity  is  characterized  by  an  ongoing  inflammatory  response  [3]. Due  to  the  chronic  nature  of 

obesity,  immune  cells  are  continuously  recruited  from  the  bone marrow.  In  chapter  5 we  study 

whether the immune system suffers from chronic activation by looking at HSPCs in the bone marrow 

after different durations of HFD. 

Targeting  the  co‐stimulatory  molecule  CD40  to  improve  metabolism  in 

obesity 

Co‐stimulatory molecules have a central role in inflammation in which they help with the activation 

of immune cells. Antigen presenting cells (APCs) activate T cells by presenting an antigen to the T cell 

receptor,  secondly,  the  interaction between  co‐stimulatory molecules  then provides  an  additional 

stimuli  to  activate  the APC  and  the  T  cell  [7].  Co‐stimulatory molecules  can  also  directly  activate 

other cell  types  including monocytes and granulocytes but also adipocytes or endothelial cells. An 

important co‐stimulatory dyad is CD40‐CD40L, which is involved in the activation of APCs and T cells, 

the  induction of  cytokine production, but also B  cell  isotype  switching as well as  the activation of 

endothelial cells and the migration of monocytes [8, 9]. 

 

CD40  is  involved  in mediating a wide variety of  immune responses. However,  it cannot signal on  its 

own  and upon binding of CD40L,  it  recruits  adaptor proteins, TNFR‐associated  factors  (TRAFs)  for 

signal transduction. CD40 has different binding sites for TRAF 2/3/5 and for TRAF6. This allows CD40 

to activate different signalling pathways depending on which adaptor protein binds, which cell type is 

involved and other local conditions [9]. 

 

The  CD40‐CD40L  dyad  has  an  important  role  in  obesity.  Interactions  between  CD40‐CD40L  on 

adipocytes and immune cells promote adipose tissue inflammation [10, 11]. In diet‐induced obesity, 

CD40‐/‐ mice  have  increased  insulin  resistance, more  adipose  tissue  inflammation  and  enhanced 

hepatosteatosis  compared  to  wild‐type  mice.  CD40‐TRAF2/3/5  deficient  mice  exhibit  a  similar 

phenotype,  however,  deficient  CD40‐TRAF6  signalling  does  not  result  in  insulin  resistance  but 

reduces adipose  tissue  inflammation and hepatosteatosis  in diet‐induced obesity.  In chapter 6 we 

approach  the  diet‐induced  inflammatory  response  in  adipose  tissue  by  targeting  CD40‐TRAF6 

interactions using a small molecule inhibitor, previously designed in our lab. 

General introduction 

13  

References 

[1]  Berrington de Gonzalez A, Hartge P, Cerhan JR, Flint AJ, Hannan L, MacInnis RJ et al. 2010. Body‐Mass Index and Mortality among 1.46 Million White Adults. New England Journal of Medicine 363(23):2211‐2219. 

[2]  Kanneganti T‐D, Dixit VD. 2012. Immunological complications of obesity. Nat Immunol 13(8):707‐712. [3]  Lumeng  CN,  Saltiel  AR.  2011.  Inflammatory  links  between  obesity  and metabolic  disease.  Journal  of  Clinical 

Investigation 121(6):2111‐2117. [4]  Kajimura  S,  Spiegelman  Bruce M,  Seale  P.  2015.  Brown  and  Beige  Fat:  Physiological  Roles  beyond  Heat 

Generation. Cell Metabolism 22(4):546‐559. [5]  Mendelson  A,  Frenette  PS.  2014.  Hematopoietic  stem  cell  niche  maintenance  during  homeostasis  and 

regeneration. Nat Med 20(8):833‐846. [6]  King KY, Goodell MA. 2011. Inflammatory modulation of HSCs: viewing the HSC as a foundation for the immune 

response. Nat Rev Immunol 11(10):685‐692. [7]  Zirlik  A,  Lutgens  E.  2015.  An  inflammatory  link  in  atherosclerosis  and  obesity.  Co‐stimulatory  molecules. 

Hämostaseologie 35(3):272‐278. [8]  Seijkens T, Kusters P, Chatzigeorgiou A, Chavakis T, Lutgens E. 2014. Immune Cell Crosstalk in Obesity: A Key Role 

for Costimulation? Diabetes 63(12):3982. [9]  Engel D, Seijkens T, Poggi M, Sanati M, Thevissen L, Beckers L et al. 2009. The  immunobiology of CD154–CD40–

TRAF interactions in atherosclerosis. Semin Immunol 21(5):308‐312. [10]  Poggi M, Jager J, Paulmyer‐Lacroix O, Peiretti F, Gremeaux T, Verdier M et al. 2009. The  inflammatory receptor 

CD40  is  expressed  on  human  adipocytes:  contribution  to  crosstalk  between  lymphocytes  and  adipocytes. Diabetologia 52(6):1152‐1163. 

[11]  Poggi M,  Engel D, Christ A, Beckers  L, Wijnands  E, Boon  L  et al.  2011. CD40L Deficiency Ameliorates Adipose Tissue Inflammation and Metabolic Manifestations of Obesity in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 31(10):2251‐2260. 

 

Chapter 1 

14  

 

 

2 

 

Immunemodulationofbrown(ing)adiposetissueinobesity

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

Susan M. van den Berg1, Andrea D. van Dam2,3, Patrick C.N. Rensen2,3, Menno P.J. de Winther1,4,*, 

Esther Lutgens1,4,* 

 1Department of Medical Biochemistry, Subdivision of Experimental Vascular Biology, Academic Medical Centre, University 

of Amsterdam, The Netherlands. 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands. 3Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands. 4Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig Maximilians University of Munich, Munich, Germany. 

 

*these authors contributed equally to this work. 

 

Endocrine Reviews 2017 38(1): 46‐68 

Chapter 2 

16  

Abstract 

Obesity is associated with a variety of medical conditions such as type 2 diabetes and cardiovascular 

diseases  and  is  therefore  responsible  for  high  morbidity  and  mortality  rates.  Increasing  energy 

expenditure by brown adipose tissue (BAT) is a current novel strategy to reduce the excessive energy 

stores in obesity. Brown adipocytes burn energy to generate heat and are mainly activated upon cold 

exposure. As prolonged cold exposure is not a realistic therapy, researchers worldwide are searching 

for novel ways to activate BAT and/or  induce beiging of WAT. Recently the contribution of  immune 

cells in the regulation of brown adipocyte activity and beiging of WAT has gained increased attention, 

with  a  prominent  role  for  eosinophils  and  alternatively  activated macrophages.  This  review  will 

discuss  the  re‐discovery of BAT, present an overview of modes of activation and differentiation of 

beige and brown adipocytes and describe the recently discovered  immunological pathways that are 

key  in mediating brown/beige adipocyte development and function. Interventions  in  immunological 

pathways  harbour  the  potential  to  provide  novel  strategies  to  increase  beige  and  brown  adipose 

tissue activity as therapeutic target for obesity. 

Immune regulation in adipose tissue 

17  

Introduction 

According  to  the  latest  statistics  of  the  world  health  organization,  the  worldwide  prevalence  of 

obesity, defined as a BMI>30, has nearly doubled since 1980 and at least 2.8 million people die each 

year as a result of obesity. This number is expected to further increase over the next decade. Obesity 

leads  to  adverse  effects  on  blood  pressure,  plasma  lipid  levels  and  insulin  resistance.  Health 

problems related to these adverse effects include coronary artery disease, atherosclerosis, fatty liver 

disease, type 2 diabetes, cancer and degenerative diseases [1]. The immune system plays a key role 

in the pathogenesis of obesity, and extensive research is ongoing to identify critical players involved 

to  find  novel  therapeutic  targets  to  combat  obesity.  Currently,  adequate  treatment  options  are 

limited. Interestingly, recent studies show that the activation of beige or brown adipocytes and the 

subsequent  increase  in energy expenditure can  lower body  fat mass and potentially  lower adipose 

tissue inflammation [2]. Moreover, there is increasing evidence that brown and beige adipose tissue 

function is subject to immune regulation [3‐6]. Brown and beige adipose tissue are therefore of great 

interest as a novel therapeutic target for obesity. 

Brown adipose tissue 

BAT regulates adaptive thermogenesis by mitochondrial uncoupling Whereas white adipose  tissue  (WAT)  is  specialized  in  the  storage of energy, brown adipose  tissue 

(BAT) plays a central role in energy expenditure. Brown adipocytes convert energy from glucose and 

fatty acids into heat via non‐shivering thermogenesis, which contributes to the maintenance of body 

temperature [7]. The regulation of body temperature is crucial to ensure that cellular functions and 

physiological processes continue in cold environments [8]. This regulation is particularly important in 

small organisms with a relatively large surface area. Even new‐borns of large organisms have distinct 

depots of BAT that regress with increasing age. BAT in adult humans is most commonly present in the 

supraclavicular and neck region, but also along the vertebrae and aorta and near the kidneys (Figure 

1) [9]. In rodents, the major BAT depot is found in the interscapular region, whereas smaller depots 

include axillary BAT, cervical BAT and perirenal and periaortic BAT (Figure 1) [10, 11]. 

 

BAT  is highly  innervated by  the  sympathetic nervous  system and a well‐structured  vascularization 

enables  the  supply of oxygen and  transport of heat. Brown adipocytes have numerous  small  lipid 

droplets  for  fast  energy  supply  and  a  large  number  of mitochondria  that  can  produce  heat  via 

mitochondrial  uncoupling.  The wealth  of mitochondria  and  the  extensive  vascularization  pattern 

account for their dark colour and hence its name: brown adipose tissue. 

 

Cold  activates  the  hypothalamus, which  induces  sympathetic  outflow  towards  BAT  and  results  in 

release of noradrenaline by efferent sympathetic nerve endings. Noradrenaline binds to β‐adrenergic 

receptors present on brown, but also on white adipocytes [12, 13]. Cold‐induced adrenergic‐receptor 

stimulation has both acute and chronic effects on BAT [14]. Acute thermogenesis results in lipolysis, 

degradation of  fatty  acids,  glucose uptake  and  activation of uncoupling protein‐1  (UCP1). Chronic 

activation  leads  to  increased  gene  transcription  of  UCP1  and mitochondrial  biogenesis  [14].  BAT 

expresses  substantial amounts of UCP1, an  inner‐membrane mitochondrial protein  that uncouples 

oxidative phosphorylation from ATP synthesis, resulting  in dissipation of energy  into heat (Figure 2) 

[15]. 

Chapter 2 

18  

Figure 1. BAT  locations Human new‐borns have a distinct  interscapular BAT depot which regresses with age. Human adults have supraclavicular BAT and BAT depots in the neck region. Smaller depots are found along the aorta, vertebrae and  kidneys.  In mice,  cervical  BAT  is  located  underneath  the muscles  running  from  the  back  of  the  head  to  the interscapular area. Ventrolateral of the scapulae is an axillary BAT depot. The major BAT depot is found interscapular, but also around the aorta and the hilum of the kidneys. 

 

 

β‐adrenergic  receptors  signal  via  cAMP,  leading  to  activation  of  protein  kinase  A  (PKA)  and  p38 

mitogen‐activated  protein  kinase  (MAPK)  [16,  17].  Eventually,  this  results  in  phosphorylation  of 

relevant  transcription  factors,  including  cAMP‐response  element  binding  protein  (CREB),  which 

control the expression of genes involved in BAT activation, such as peroxisome proliferator‐activated 

receptor γ co‐activator 1α (PGC‐1α). PGC‐1α is a transcriptional cofactor that increases mitochondrial 

biogenesis and induces expression of UCP1 [15, 18, 19]. 

White, beige and brown adipocytes 

Currently,  two distinct  types of brown adipocytes, each of a different origin, have been described. 

The  classical  brown  adipocyte, which  is  found  at  distinct  anatomical  sites  in mice,  including  the 

interscapular, perirenal and axillary BAT depots, and the so‐called ‘brite’ or ‘beige’ adipocytes which 

are found within WAT [20].  Inducing these beige adipocytes  in WAT  is referred to as  ‘browning’ or 

‘beiging’. Because humans  lack a  large classical BAT depot,  it  is attractive to  identify approaches to 

stimulate  formation  of  beige  cells within WAT  that  share  functional  characteristics with  classical 

brown  adipocytes.  An  important  difference  between  the  two  cell  types  is  that  classical  brown 

adipocytes constitutively express UCP1, while beige adipocytes only do so upon appropriate stimuli, 

such as cold and β‐adrenergic receptor stimulation [21‐23]. Increased biogenesis of beige adipocytes 

may  contribute  to  increased  energy  expenditure,  improved metabolic  parameters  and  improved 

tolerance to cold. 

 

Cervical

InterscapularPeriaorticPerirenal

Axillary

Interscapular

Supraclavicular

Periaortic

Perirenal

Paravertebral

Neck

Immune regulation in adipose tissue 

19  

Figure 2. Activation of brown adipocytes by cold. Cold activates the hypothalamus in the brain, which activates the SNS and results  in the release of noradrenaline that binds to β‐adrenergic receptors on brown adipocytes. The acute  result  is  intracellular  lipolysis, degradation of  fatty acids via beta‐oxidation and activation of UCP1. Other effects of activated β‐adrenergic receptors occur via cAMP, PKA, CREB and p38 mitogen‐activated protein kinase.  Oxidative  phosphorylation  in  mitochondria  drives  protons  from  the  mitochondrial  matrix  into  the intermembrane  space,  generating  an  electrochemical  gradient  by  which  protons  flow  back  into  the mitochondrial matrix  via  ATP  synthase,  activating  ATP  synthesis  in  e.g.  heart  and  skeletal muscle.  In  brown adipocytes, UCP1  is  found  on  the  inner‐mitochondrial membrane where  it  causes mitochondrial  uncoupling. UCP1 increases the permeability of the inner mitochondrial membrane and thus causes a reflux of protons into the mitochondrial matrix, bypassing ATP synthase. This proton leakage leads to dissipation of energy into heat. ADP; adenosine diphosphate, ATP; adenosine  triphosphate,  cAMP;  cyclic adenosine monophosphate, CREB;  cAMP‐response element  binding  protein,  FFA;  free  fatty  acids,  P38;  p38  mitogen‐activated  protein  kinase,  PKA;  protein  kinase  A,  SNS; sympathetic nervous system, UCP1; uncoupling protein 1. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Chapter 2 

20  

Microarray  analysis  as  well  as  in  vivo  lineage  tracing  studies  showed  a  common  developmental 

ancestry  between  the  classical  brown  adipocyte  and  skeletal muscle  cells,  in which  the  common 

progenitor is myogenic factor 5 (Myf5)‐expressing muscle precursor cell [20, 24]. Whereas myogenin 

stimulates  myocyte  development,  transcriptional  regulator  PR  domain  zinc  finger  protein  16 

(Prdm16) regulates the developmental switch to brown adipocytes. PRDM16 forms a transcriptional 

complex  with  activated  transcription  factor  CCAAT/enhancer‐binding  protein  β  (C/EBPβ),  which 

enables the switch  from a myogenic precursor to a brown adipocyte  [25]. This  in turn  leads to the 

expression  of  Peroxisome  proliferator‐activated  receptor  γ  (Pparγ)  and  Pgc‐1α,  which  are  key 

regulators  of  brown  adipocyte  differentiation,  and  BAT  associated  genes  such  as  Ucp1,  Cidea, 

Cox7α1, Cox8β, Elovl3 and Cpt1b. PPARγ itself can stimulate brown adipocyte differentiation as well. 

Indeed,  continuous  treatment  with  a  PPARγ  agonist,  rosiglitazone,  enhances  brown  adipocyte 

differentiation in vitro [26]. Although the Myf5 expressing precursors were assumed to be precursors 

of brown adipocytes and muscle cells only, recent  lineage studies contradict this.  It was found that 

Myf5+  precursor  cells  can  also  give  rise  to  unilocular  white  adipocytes  in  subcutaneous  and 

retroperitoneal WAT  [21,  27‐29].  In  classic myogenic  transcription, Myf5  is  thought  to  function 

downstream or simultaneously with paired box 3 (Pax3) and upstream of myogenic differentiation 1 

(MyoD1). Indeed, expression of Myf5 and Pax3, not MyoD1, overlaps  in adipocyte progenitors. This 

holds true for most adipose tissue depots, but not in perigonadal WAT, indicating depot and gender 

differences [28]. Although all brown adipocytes in interscapular BAT descend from Myf5+ precursors, 

only  a  subset  of  classical  brown  adipocytes  in  cervical  and  no  brown  adipocytes  in  perirenal  or 

periaortic BAT could be  traced back  to a Myf5+ precursor,  suggesting a  large heterogeneity within 

and between adipose tissue depots [28]. Other markers for committed brown adipocyte precursors 

that differentiate into mature brown adipocytes are early B‐cell factor 2 (EBF2) and platelet‐derived 

growth factor receptor‐α (PDGFRα) (Figure 3) [30].  

 

Beige  cells are present within WAT and, when present  in  sufficient quantity,  significantly  increase 

energy expenditure and thereby are thought to contribute to a reduction in body fat [31‐34]. In mice, 

cold  exposure  and  β‐adrenergic  receptor  agonist  treatment  increases  Ucp1  gene  expression  and 

mitochondrial biogenesis in WAT, which increases the presence of beige cells within WAT [35]. Beige 

cells are mostly present in subcutaneous WAT. Adipocyte‐specific PRDM16 transgenic mice are able 

to  induce  the  development  of  beige  cells  in  subcutaneous WAT  and  have  an  increased  energy 

expenditure, are resistant to weight gain and show improved glucose tolerance on a HFD [36]. Other 

stimuli  that  can  induce  beige  adipogenesis  include  noradrenaline  [5,  37],  lactate  [38],  irisin  [39], 

fibroblast growth factor (FGF) 21 [40], BMP (bone morphogenetic protein) 4 [41] and BMP7 [42]. 

 

Beige  adipocytes  arise  from  white  (i.e.  unilocular  and  Ucp1  negative)  adipocytes,  via 

transdifferentiation. The transdifferentiation hypothesis is based on experiments in rodents in which 

beige adipogenesis was  induced and examined by microscopy [33, 43, 44], analysis of DNA content 

and  labelling  with  bromodeoxyuridine  [32,  45,  46]  and  UCP1‐Cre  reporter  mice,  which  allows 

inducible permanent  labelling of Ucp1+ cells and tracing of white, beige and brown adipocytes [47]. 

However, other studies show that beige adipocytes can arise de novo from specific precursor cells. 

Using  AdipoChaser mice, which  have  an  inducible  adipocyte‐tagging  system with  an  adiponectin 

promoter‐driven  tetracycline‐on  (Tet)  transcription  factor,  a  Tet  responsive  Cre  (activated  by 

doxycycline)  and  a  Rosa26  promoter‐driven  loxP‐stop‐loxP‐β‐galactosidase.  Upon  doxycycline 

treatment, all adipocytes become positive for β‐galactosidase (β‐gal). Upon induction of beige  

Immune regulation in adipose tissue 

21  

Myf5-Pax3-

Precursor

Myf5+Pax3+

Precursor

Whitening

Myf5+Pax3+

Precursor

Transdifferentiation

Dedifferentiation

Beige adipocyte

Brown

adipocyteWhite

adipocyte

Myocyte

Myogenin

De novo adipogenesis

Inguinal subcutaneous white adipose tissue Interscapular brown adipose tissue

EBF2+PDGFRα+

Preadipocyte

PRDM16

PPARγ

EBF2+PDGFRα+

Preadipocyte

Figure  3.  Beige  and  brown  adipogenesis.  Model  showing  beige  and  brown  adipocyte  development  in  inguinal subcutaneous  adipose  tissue  and  interscapular  brown  adipose  tissue.  White  adipocytes  can  derive  from  both Myf5+Pax3+  as  well  as  Myf5‐Pax3‐  precursors.  Beige  adipocytes  can  either  transdifferentiate  from  mature  white adipocytes or directly differentiate from EBF2+PDGFRα+ preadipocytes, called de novo adipogenesis. EBF2 is a selective marker  for brown  and beige preadipocytes.In  interscapular BAT, brown  adipocytes  are derived  from  a multipotent Myf5

+Pax3+ expressing precursor population. When these precursors are exposed to myogenin they will develop into myocytes.  PRDM16  and  PPARy  promote  brown  adipocyte  differentiation.  Brown  adipocytes  in  BAT  can  undergo whitening upon exposure  to  thermoneutrality, obesity, ageing or  sympathetic denervation.  EBF2;  early B‐cell  factor 2, Myf5; myogenic factor 5, MyoD1; myogenic differentiation 1, Pax3; paired box 3, PDGFRα; platelet‐derived growth factor receptor‐α, PPARγ; peroxisome proliferator‐activated receptor γ, PRDM16; transcriptional regulator PR domain zinc finger protein 16. 

Chapter 2 

22  

adipogenesis  by  cold  exposure  or  β3  adrenergic  receptor  agonist  treatment,  β‐gal  negative  beige 

adipocytes  appear  in  subcutaneous WAT  [48, 49]. As  in  interscapular BAT,  Ebf2  expression marks 

beige adipocytes, regardless of their developmental origin [30] (Figure 3). These discrepant  insights 

might result from technical restraints, or the fact that transdifferentiation and de novo adipogenesis 

occur  simultaneously,  maybe  depending  on  whether  adipocytes  have  experienced  beige  stimuli 

before  [47].  Formerly  beige,  dedifferentiated  white  adipocytes  might  be  capable  of 

transdifferentiation  into beige adipocytes whereas a  first encounter with beige  stimuli  induces de 

novo  development.  Alternatively,  pre‐encoded  beige  adipocytes  may  exist  disguised  as  white 

adipocytes and only develop their beige phenotype upon the adequate stimuli. 

 

The  vasculature may  be  another  important mediator  of  beiging,  as  BAT  is  highly  vascularized  to 

enable a fast supply of oxygen and nutrients and transport of generated heat [50]. In WAT, exercise, 

as well as treatment with a β3‐adrenergic receptor agonist or a PPARγ  ligand such as rosiglitazone, 

not  only  induces  beiging  but  also  increases  angiogenesis. Overexpression  of  Vegf  increases WAT 

vascularization and  induces  increased gene expression of Ucp1 and Pgc‐1a  in  retroperitoneal WAT 

[51]. The importance of VEGF as an essential downstream target in the process of beiging was further 

confirmed by administration of an anti‐VEGF antibody, which reduced both angiogenesis and beiging 

in WAT [51]. 

 

Contrary  to  beiging  of  WAT,  whitening  of  BAT  also  occurs.  Sympathetic  denervation, 

thermoneutrality,  ageing  and  excessive  energy  supplies  in obesity  causes BAT  to  accumulate  lipid 

droplets,  resulting  in  whitening  of  the  tissue  [52,  53].  This  is  accompanied  by  decreased 

vascularization, hypoxia and mitochondrial dysfunction. A whitened phenotype of BAT  in obesity  is 

therefore predictive of   decreased BAT activity and  is associated with complications such as  insulin 

resistance  [50]. Although  the mechanisms of BAT whitening  are  largely unknown, VEGF‐mediated 

vascularization  seems  to play an  important  role; obesity  reduces Vegfa expression and deletion of 

Vegfa in adipose tissue results in whitened BAT [50].  

 

Immune regulation in adipose tissue 

23  

BAT activity and obesity: what we have learned from mouse models 

Much of our current knowledge on  the role of BAT  in obesity  is derived  from experimental animal 

studies, often including genetically modified mice that were subjected to different models of obesity. 

In these studies, decreased BAT activity was associated with aggravated metabolic dysfunction and 

an increase in obesity, whereas increased BAT activity was associated with improved metabolism.  

 

Over  the  years,  several  experimental  animal  studies  have  been  published  in  which  the  relation 

between  obesity  and  BAT  was  studied  (Table  1).  BAT  activity  is  dependent  on  environmental 

temperature and therefore, housing temperature has major metabolic consequences. Mice housed 

at  room  temperature  (18‐22°C)  are  thermally  stressed,  leading  to  increased  metabolism  and 

activated BAT to maintain their body temperature. Elimination of thermal stress  is accomplished by 

thermoneutral housing conditions of 30°C.  It  is  important to realize that  in some experimental set‐

ups,  it  is  thus  appropriate  to  house  mice  under  thermoneutral  conditions,  for  example  when 

comparing  studies  to  thermoneutral  conditions  in  humans  (i.e.  25°C)  or  to  distinguish  central 

mediated effects from direct activation of BAT. 

 

Genetic models of decreased BAT activity 

Energy expenditure and heat production  in BAT occurs via UCP1 and mice  lacking UCP1 are  indeed 

unable  to  maintain  their  body  temperature  when  exposed  to  acute  cold.  However,  at  room 

temperature, the decreased ability to dissipate energy into heat does not result in increased obesity 

neither on chow nor upon high‐fat diet (HFD) feeding [54], however, UCP1 knockout mice are more 

susceptible to develop obesity with age [55]. Strikingly, when UCP1 knockout mice are housed under 

thermoneutral conditions (30°C), they do develop more severe obesity on a HFD and also gain slightly 

more weight when on chow diet [56]. 

 

Other studies in mice have revealed that besides UCP1 deficiency, additional models with decreased 

BAT activity also suffer from cold intolerance and display an obesity‐sensitive phenotype, as listed in 

Table  1.  Genetic  ablation  of  BAT  function  via  expression  of  a  diphtheria  toxin  A‐chain  driven  by 

regulatory elements of the Ucp1 gene (UCP‐DTA) decreased the UCP1 content in BAT, which resulted 

in a reduction in non‐shivering thermogenesis and obesity. Consequently, these mice did not show a 

thermogenic  response  upon  treatment  with  a  β3‐adrenergic  receptor  agonist  [57].  β‐adrenergic 

receptor  knockout mice  lacking  all  three  known  β‐adrenergic  receptors,  as well  as  dopamine  β‐

hydroxylase deficient mice, which fail to convert dopamine into noradrenaline, both present inactive 

BAT and are sensitive to cold [58, 59]. Furthermore, β‐adrenergic receptor knockout mice are slightly 

obese on a low fat diet and develop massive obesity on a HFD [59]. Leptin‐deficient ob/ob mice also 

have reduced Ucp1 expression in BAT and, similar to UCP1 knockout mice, are cold sensitive, but will 

survive when  they are gradually exposed  to extreme cold  (4°C). However, mice  lacking both UCP1 

and leptin do not survive temperatures below 12°C. These models show that alternative mechanisms 

for maintaining body  temperatures do exist, but  that  these are only effective within  certain  limits 

[60]. 

 

Increasing BAT activity improves metabolism in mice 

The  disruption  of  BAT  activation  results  in  an  obesity‐prone  phenotype  in  mice.  Conversely, 

increasing  the  amount  and/or  function  of  BAT  can  induce  a  healthy metabolic  phenotype.  Cold 

exposure and β3‐adrenergic receptor agonist treatment increase Ucp1 expression, mitochondrial  

Chapter 2 

24  

Table 1. Experimental animal studies showing the metabolic effects of increasing or decreasing BAT 

activity. 

Model  Effect  Reference 

Decreased BAT activity 

UCP1‐/‐ 

Room temperature (18‐22°C) 

Chow diet 

Cold sensitive  Enerbäck 1997 [54] 

Room temperature (18‐22°C) 

HFD Increased susceptibility to obesity with age 

Kontani 2005 [55] 

Thermoneutral housing (30°C) 

Chow diet 

Obese  Feldmann 2009 [56] 

UCP‐DTA Reduction in NST Obese phenotype 

Lowell 1993 [57] 

β‐adrenergic receptor‐/‐ 

Chow diet 

Slightly obese Bachman 2002 [59] 

HFD  Severe obesity 

Dopamine β‐hydroxylase‐/‐ Inactive BAT Cold sensitive Slightly obese 

Thomas 1997 [58] 

ob/ob Obese Cold sensitive 

Ukropec 2006 [60] 

UCP1‐/‐ ob/ob Obese Extremely cold sensitive 

Ukropec 2006 [60] 

FABP4/5‐/‐  Cold sensitive Syamsunarno 2014 [61] 

Adipocyte specific p62 Decreased BAT activity Obese 

Muller 2013 [62] 

Increased BAT activity     

Cold exposure Increases UCP1 expression Increases thermogenic capacity Accelerates atherosclerosis 

Ravussin 2014 [63] Bartelt 2011 [64] Dong 2013 [65] 

β3‐ adrenergic receptor agonist treatment 

Increases UCP1 expression Increases thermogenic capacity Reduces body weight Reduces atherosclerosis 

Himms‐Hagen 1994 [66] Barbatelli 2010 [43] Berbée 2015 [35] 

Constitutive UCP1 expression in adipocytes 

Prevents obesity  Kopecky 1995 [67] 

Increased expression of UCP1 by FOXC2 overexpression on HFD 

Less adiposity Improved glucose tolerance 

Cederberg 2001 [68] Kim 2005 [69] 

Increased BAT activity in Cidea‐/‐  Prevents obesity  Zhou 2003 [70] 

BAT transplantation  Reversal obese phenotype Gunawarda 2012 [71] Stanford 2013 [72] Zhu 2014 [73] 

P53 Prevents obesity Increases energy expenditure 

Al‐Massadi 2016 [74] 

USF1  Prevents obesity  Laurila 2016 [75] 

 

 

Immune regulation in adipose tissue 

25  

Table 1. continued 

Model  Effect  Reference 

Immune cell models 

16 weeks HFD Increases inflammatory markers in BAT 

Roberts‐Toler 2015 [76] 

Cancer‐associated cachexia Increases M2 macrophage markers in beiging WAT 

Petruzelli 2014 [77] 

Macrophage depletion  Cold sensitive  Nguyen 2011 [3] 

Cold exposure Increases M2 macrophages in WAT and BAT 

Nguyen 2011 [3] 

Il‐4/IL‐13‐/‐ 

STAT6‐/‐ 

IL‐4R‐/‐ 

4get‐ΔdblGATA‐/‐ (lacking eosinophils) CCR2‐/‐ 

Impairs cold induced beiging  Qiu 2014 [5] 

IL‐4 injections Reduces body weight Improves insulin sensitivity Increases beiging 

Qiu 2014 [5] 

IL‐33‐/‐ Obesity‐prone on a HFD Less beige adipocytes in WAT 

Brestoff 2015 [6] 

IL‐33 injections Increases energy expenditure Increases beiging 

Lee 2015 [4] 

Treg depletion Increased inflammation in BAT Cold sensitive 

Medrikova 2015 [78] 

Adiponectin‐/‐  Impairs cold induced beiging  Hui 2015 [79] 

Germ‐free mice Antibiotic‐depleted gut microbiota 

Increases Eosinophils, type 2 cytokines and M2 macrophages Improves insulin sensitivity Increases beiging 

Suarez‐Zamorano 2015 [80] Chevalier 2015 [81] 

Macrophage depletion Decreases inflammation in WAT Lowers body weight Decreases glucose levels 

Sakamoto 2016 [82] 

IL‐6 injections  Increases Ucp1 in WAT  Knudsen 2014 [83] 

Anti‐IL‐6 antibody  Decreases Ucp1 in WAT  Petruzelli 2014 [77] 

IL‐6‐/‐ Reduces energy expenditure Cold sensitive 

Knudsen 2014 [83] 

Adipocyte specific CXCR4‐/‐ Severe obesity upon HFD Increased inflammation in WAT Cold sensitive 

Yao 2014 [84] 

BAT: brown adipose  tissue, HFD: high  fat diet,  IL:  interleukin, NST: non‐shivering  thermogenesis, ob/ob:  leptin deficient mice, Treg: regulatory T cells, UCP1: uncoupling protein 1, UCP‐DTA: expression of a diphtheria toxin A‐chain on regulatory elements of the Ucp1 gene, USF1: upstream stimulatory factor 1, WAT: white adipose tissue. 

Chapter 2 

26  

biogenesis and differentiation of brown adipocytes. This results in BAT hyperplasia and an increased thermogenic  capacity,  ultimately  leading  to  a  reduction  in  body weight  [34,  43,  63,  66,  85].  BAT activation also  increases  the  influx of nutrients  into brown adipocytes,  including glucose and  fatty acids. Glucose  is  taken up by GLUT1/4  receptors  [86,  87]  and  (triglyceride‐derived)  fatty  acids by CD36 and LPL [64], which is regulated by Angptl4 [88]. Whether BAT takes up TRL‐derived fatty acids by  holoparticle  uptake  of  TRL  or  after  lipolysis  of  TRLs  is  under  debate  [89],  although  current evidence points  to uptake of  fatty acids derived  from  triglycerides after  lipolysis  [90]. By  taking up substrates, BAT activation  leads to  lowering of plasma glucose and triglyceride  levels and can even attenuate hypercholesterolemia by indirectly enhancing hepatic clearance of TRL remnants [35, 89].  

Whereas UCP1  knockout mice  are more prone  to  develop obesity,  constitutive overexpression of 

UCP1  in adipocytes prevents obesity  in mice [67] (Table 1). Transgenic mice with adipocyte‐specific 

overexpression of winged helix/forkhead transcription factor (Foxc2), which plays a regulatory role in 

adipocyte metabolism, have an enhanced sensitivity of the β‐adrenergic/cAMP/PKA pathway and an 

increased expression of Ucp1. These mice develop adiposity and display improved glucose tolerance 

following a HFD compared to wild‐type mice [68, 69]. BAT mitochondria express high  levels of cell‐

death activator CIDE‐A (Cidea), that also plays a role in energy homeostasis. Mice deficient for CIDE‐A 

have an  increased amount of BAT and are protected  from diet‐induced obesity  (DIO)  [70]. Loss of 

Cidea  stabilizes  the  AMP‐activated  protein  kinase  (AMPK)  complex, which  enhances  basal  AMPK 

activity  leading  to  elevated  fatty  acid  oxidation  and  energy  expenditure  [91].  In  line  with  this, 

treatment of mice with the AMPK activator metformin enhances BAT activity [92]. Fatty acid binding 

proteins  (s)  are  also  largely  involved  in  energy metabolism. Mice with mutations  in  two  related 

adipocyte FABPs, aP2 and mal1, are protected  from DIO and exhibit  increased energy expenditure 

[93]. Moreover, FABP4/5 knockout mice have a severely impaired thermogenesis during fasting due 

to the depletion of energy storage and reduced energy supply in BAT and skeletal muscle [61]. 

 

Three research groups have been able to  increase the amount of BAT by successfully transplanting 

BAT  in  diabetic  or  obese mice  and  observed  a  reversal  of  their  obese  phenotype  [71‐73].  These 

studies  thus  suggest  that  increasing  BAT  activity  has  a  great  potential  as  treatment  to  reverse 

obesity. 

 

BAT activation and atherosclerosis  

An interesting therapeutic effect of activating BAT includes the reduction of dyslipidemia‐ associated 

atherosclerosis.  In  APOE*3‐Leiden.CETP  mice,  which  have  a  human‐like  lipoprotein  metabolism 

through  expression  of  a  mutated  variant  of  the  human  APOE*3  gene  combined  with  human 

cholesteryl ester  transfer protein  (CETP), BAT activation by  β3‐adrenergic  receptor  stimulation was 

shown  to  be  protective  against  diet‐induced  atherosclerosis  [35].  β3‐adrenergic  receptor  agonist 

treatment decreased plasma triglyceride and cholesterol levels [35]. Notably, using ApoE knockout or 

LDLR knockout mice, β3‐adrenergic receptor agonist treatment similarly reduced plasma triglycerides 

but did not affect plasma  cholesterol  levels or atherosclerosis  [35].  In  fact, cold exposure of ApoE 

knockout  or  LDLR  knockout mice  increased  plasma  levels  of  small  low‐density  lipoprotein  (LDL) 

remnants,  leading  to  unfavourable  plasma  lipid  levels  and  even  accelerated  development  of 

atherosclerotic  lesions  [65].  These  findings  show  that  in  the  presence  of  an  intact  ApoE‐LDLR 

clearance  pathway,  as  is  present  in  APOE*3‐Leiden.CETP  mice,  BAT‐mediated  local  lipolysis  of 

triglyceride‐rich  lipoproteins stimulates the hepatic clearance of  lipoprotein remnants via ApoE and 

Immune regulation in adipose tissue 

27  

the  LDLR.  As  a  result,  BAT  activation  reduces  atherosclerotic  lesion  size  and  severity  in  APOE*3‐

Leiden.CETP mice but not in mice lacking ApoE or the LDL receptor [35].  

BAT and obesity in humans 

Presence of active BAT in human adults 

In humans, BAT was initially considered to be only present in new‐borns, but was recently detected 

to  be  still  present  in  adults  as well  [9,  94,  95].  Simultaneous  examinations  of  positron‐emission 

tomographic  (PET)  and  X‐ray  computed  tomography  (CT)  revealed  sites  in  human  adult  adipose 

tissue with  increased  18F‐fluorodeoxy‐glucose  (FDG)  uptake,  indicating metabolically  active  tissue. 

Tissue biopsies confirmed  that  the FDG‐intense  tissue was  indeed composed of brown adipocytes, 

and thus could be classified as BAT [95]. In humans, cold exposure  increases glucose uptake rate  in 

BAT by 12‐15‐fold compared to thermoneutral conditions [95, 96]. This was reflected by an increased 

FDG  uptake,  as  well  as  by  an  increased  fatty  acid  uptake  and  a  higher  activation  of  oxidative 

metabolism, which was demonstrated by  subsequent  studies  in which humans were  subjected  to 

cold [95, 97]. The β‐adrenergic blocker propranolol reduces uptake of FDG in BAT depots in humans 

[98]  and  treatment  with  mirabegron,  a  β3‐adrenergic  receptor  agonist  approved  to  treat  the 

overactive bladder,  increases  the metabolic activity of BAT evidenced by  increased FDG uptake  in 

healthy male subjects [99]. 

 

Studies  in humans comparing gene expression profiles of white, beige and brown adipocytes claim 

that BAT  in  adult humans  is mainly  composed of beige  adipocytes  [21‐23, 100, 101] while others 

have  found markers  for  classical  BAT  in  humans  [102].  Controversy  exists  on  brown  and  beige 

markers  and  further  studies will  be  needed  to  unequivocally  characterize  BAT  in  humans. Other 

discrepancies  can be  caused by  sampling bias  (i.e.  variations  in  location where  the biopsies were 

taken) and differences  in age or body mass  index of  the  studied population.  It  is  likely  that beige 

adipocytes remain present in the adult state when hypothermia is a less frequent threat than in new‐

borns  or  rodents.  The  capability  of  beige  cells  to  switch  between  a  state  of  energy  storage  and 

energy dissipation is intriguing and further studies on how this switch works are needed.  

BAT activity and obesity 

Along with  the discovery of BAT  in adult humans by PET/CT  studies,  it also became clear  that  the 

presence of BAT, visualized through FDG uptake, showed a negative correlation with BMI and body 

fat percentage [9, 94]. A study of 2000 randomly selected PET/CT scans showed a higher frequency of 

functionally active BAT  in females than  in males and a negative correlation with age, BMI, but also 

beta‐blocker use, outdoor temperature at the time of the scan and season [103, 104]. Interestingly, 

recent  data  show  that  cold‐induced  fatty  acid  uptake  by BAT  is  similar  in  individuals with  type  2 

diabetes,  age‐matched  controls  and  in  healthy  young  controls  [105],  suggesting  that  previous 

conclusions based on FDG uptake may also reflect altered  insulin sensitivity of BAT rather than BAT 

activity. 

 

Since stimulating BAT results in enhanced energy expenditure, it is an intriguing target for the control 

of whole‐body energy balance, adiposity and obesity. The first  indication that BAT activity could be 

increased  in  humans was  shown  in  a  PET/CT  study, where  ten morbidly  obese  patients with  an 

average  BMI  of  42 were  scanned  before  and  1  year  after  bariatric  surgery.  Before  surgery,  FDG 

Chapter 2 

28  

uptake by BAT was seen  in only two patients, whereas 1 year after surgery, when the average BMI 

was 30, active BAT was present in five patients [106]. Interestingly, also repeated cold exposure can 

increase  BAT  activity  in  humans.  Successful  cold  acclimation  protocols  include  6  hours  of  cold 

exposure for 10 consecutive days or daily exposure (17°C) for 2 hours during 6 weeks [2, 107]. Using 

these protocols, it was possible to increase BAT volume by 37% or increase FDG uptake by 60% and 

decrease fat mass in humans [2]. 

 

Although  still  scarce, more  and more  studies  on  human  brown  or  beige  adipocyte  development, 

function and how they are modulated are published. Min et al. reported that pro‐angiogenic factors 

drive  the proliferation of human beige adipocyte progenitors and activate beige adipocytes which, 

when  transplanted  in  mice,  improves  systemic  glucose  turnover  [108].  Accordingly,  human 

individuals with a higher abundance of BAT have  lower blood glucose  levels and glucose uptake  in 

BAT  is associated with  improvements  in  systemic glucose homeostasis and  insulin  sensitivity  [109, 

110].  Increased  supraclavicular  BAT  activity  in  humans  is  inversely  associated  with  arterial 

inflammation  and  reduced  risk  of  cardiovascular  events  [111].  Interestingly,  South‐Asians  have  a 

higher prevalence of hyperglycemia, dyslipidemia and cardiovascular disease and a lower amount of 

BAT [112]. Glucose uptake by BAT in humans is associated with heat production following a circadian 

rhythm in which BAT may buffer glucose fluctuations and maintain whole‐body glucose homeostasis 

over  time  [113].  In  another  study,  48‐60  hrs  of  fasting  induced  insulin  resistance  resulted  in  a 

considerable  decrease  in  BAT  glucose  uptake  and  non‐shivering  thermogenesis  during  cold 

stimulation  [114]. The effects of anti‐obesity  treatments on human BAT have not been  studied  in 

detail but mouse studies suggest a mechanism mediated by BAT for some treatments. Compounds 

used in humans to improve dyslipidemia, hyperglycemia and/or lower plasma triglyceride levels such 

as  metformin,  rimonabant,  salsalate  and  activation  of  the  glucagon‐like  peptide  1  receptor  all 

activate BAT in mice [92, 115‐117]. 

Chronic low‐grade inflammation in obesity 

Dysfunctional adipocytes in WAT attract immune cells 

In obesity, excessive energy intake is accompanied by an increased storage of lipids in adipose tissues 

leading to hypertrophy of adipocytes, hypoxia, and cell death, causing WAT dysfunction and fibrosis. 

Dysfunctional adipocytes change  the  local microenvironment with  leakage of  fatty acids and other 

products  resulting  from adipocyte cell death. This causes a  release of adipokines, chemokines and 

cytokines by WAT and subsequent recruitment of  inflammatory cells [118, 119]. The chronic nature 

of obesity affects steady‐state homeostasis and leads to continuous activation of the immune system 

[118].  Due  to  the  extensive  communication  between  adipocytes  and  immune  cells,  chronic 

inflammation  disturbs  the  homeostatic  regulation  of  insulin  signalling  and  adipogenesis  in white 

adipocytes,  leading  to  reduced  insulin  sensitivity  and development of  type  2 diabetes  [118,  120]. 

Thus, by  increasing circulating cytokines and attracting immune cells, WAT contributes to metabolic 

dysfunction. 

Immune regulation in adipose tissue 

29  

Inflammation in obese white adipose tissue 

Myeloid cell recruitment into WAT 

The  first  proof  that  inflammation  is  important  in  the  pathogenesis  of  obesity  and  the  resulting 

metabolic dysfunction was provided by Hotamisligil et al [121]. The pro‐inflammatory cytokine tumor 

necrosis  factor‐α  (TNF) was  found  to be present  in WAT  and  correlated with  insulin  resistance  in 

humans and mice [121]. It became evident that the infiltration of pro‐inflammatory macrophages in 

WAT plays a central role in the inflammatory response as a dominant source of TNF [122]. In WAT of 

lean mice, 10‐15% of the cells are macrophages, whereas obese WAT contains 45‐60% macrophages 

[122].  Resident  macrophages  in  lean  WAT  have  a  predominant  anti‐inflammatory  phenotype, 

whereas  in  obesity,  inflammatory  Ly6ChighCCR2+  monocytes  are  recruited  to  WAT,  where  they 

differentiate, acquire a pro‐inflammatory or M1 phenotype and  form  the majority of macrophages 

[120, 122‐127]. Anti‐inflammatory or M2 macrophages depend on the cytokines  IL‐4 and  IL‐13 and 

require STAT6 to maintain their alternative activation state [6]. Other myeloid cells that play a role in 

WAT  include  neutrophils  and  eosinophils.  Neutrophils  are  very  short‐lived  cells  that  are  already 

present  in WAT within 3 days of HFD [128, 129].  In contrast, the amount of eosinophils  is  inversely 

correlated with adiposity, and exhaustion of eosinophils  in mice  results  in  increased body weight, 

glucose  intolerance  and  insulin  resistance  [130].  Both  type  2  innate  lymphoid  cells  (ILC2s)  and 

eosinophils have only  recently been  shown  to be  an  important  cell population  in WAT  and  are  a 

predominant source of  IL‐4 and  IL‐13,  the cytokines  required  for  the  induction of M2 macrophage 

polarization [130, 131]. 

Lymphoid cell infiltration in WAT 

T cells are also a component of  the  repertoire of  immune  cells  found  in WAT. Ten percent of  the 

stromal vascular fraction of lean WAT consists of T cells. A large part of these are CD4+ T‐helper cells, 

of which approximately 50% are regulatory T cells (Tregs). In humans, the number of T cells in WAT 

correlates with BMI  [132].  In mice, the amount of T cells  in WAT  increases within 2 weeks of HFD. 

There  are  only  a  few  CD8+  cytotoxic  T  cells  and  CD4+  effector  T  cells  in  lean  WAT,  but  both 

populations  increase drastically  in an obese state, whereas CD4+ Tregs decrease  [133]. Similarly, as 

the  ratio between M1 and M2 macrophages  increases  in obese WAT,  the Th1 and Th2 T cell  ratio 

does  as well.  This  results  in  a  decrease  in  Th2  derived  cytokines  such  as  IL‐4  and  IL‐13,  thereby 

reducing M2 macrophage  polarization.  An  increase  in  Th1  T  cells  and  cytotoxic  T  cells  results  in 

excessive  secretion  of  TNF  and  IFNγ,  which  polarizes macrophages  to  a  pro‐inflammatory  state, 

resulting in increased inflammation in obese WAT [130, 134‐136]. 

 

The chronic  low‐grade  inflammation  in obese WAT also  includes the recruitment of B cells, natural 

killer (NK) cells and mast cells [137, 138]. NK cells are activated by recognition of  lipid antigens and 

mast cells contain granules  that can  release a variety of mediators,  including histamine,  serotonin 

and cytokines, which also promote recruitment of inflammatory cell types [139]. 

 

Overall, a variety of  immune cells  infiltrate WAT  in DIO,  inducing a switch from a homeostatic anti‐

inflammatory environment to a state of chronic low‐grade inflammation. 

Chapter 2 

30  

The immune system in brown and beige adipose tissue 

In  contrast  to  the  established  role  of  the  different  immune  cells  in WAT,  the  contribution  of  the 

immune system to the development, function and activity of BAT  is still  largely unknown. However, 

we do know that obese  individuals have a decreased amount of active BAT, based on FDG uptake, 

which  is  related  to  their  low‐grade  inflammatory  state. Moreover,  an  inactive  brown  adipocyte 

accumulates  lipids,  similar  to  a white  adipocyte  and  ablation  of  noradrenergic  input  by  selective 

sympathetic denervation of BAT indeed results in a ‘whitened’ appearance of brown adipocytes with 

large  intracellular vacuoles [53]. Since the recruitment of macrophages  into WAT  is correlated with 

lipolysis of stored triglycerides [120], it is likely that release of fatty acids also induces recruitment of 

immune cells in BAT. However, whether this is indeed the case is still unknown.  

 

In diet‐induced obesity (DIO), thermoneutral housing leads to an additive increase in inflammation in 

white adipose  tissue and  in  the vasculature compared  to normal housing conditions. Although not 

causing  increased  insulin  resistance,  the  increase  in  vascular  inflammation  does  cause  enhanced 

progression  of  atherosclerosis  [140],  indicating  that  BAT  protects  against  obesity‐induced 

atherosclerosis.  In  another  study,  a  similar  phenomenon  was  observed.  Immune  compromised 

C57Bl/6 nude mice experience cold stress when housed at 23°C which modulates energy and body 

weight  homeostasis  and  are  therefore  protected  from DIO. However,  at  thermoneutrality  (33°C), 

they  do  develop  DIO  with  increased  adiposity,  hepatic  triglyceride  accumulation,  increased 

inflammatory markers  and  glucose  intolerance  [141],  showing  that  BAT  activity  protects  against 

metabolic disarray and adipose tissue inflammation. 

 

Besides  environmental  temperature,  other  incentives  such  as  the  biological  clock  [53,  142], 

hormones  [143, 144] and food  intake not only modulate energy expenditure via the hypothalamus 

but  also  affect  inflammation.  For  instance,  time‐restricted  feeding  of  a  HFD  for  8  hours  per  day 

increases BAT activity and reduces adipocyte hypertrophy and inflammation in WAT compared to ad 

libitum HFD‐fed mice  [145]. Gut  hormones  such  as GLP‐1 mediate  effects on  food  intake,  energy 

expenditure and inflammation. GLP‐1 receptor signalling activates BAT and promotes beiging of WAT 

[117,  146] while GLP‐1  also  reduces macrophage  infiltration  and  inflammatory  signalling  in white 

adipocytes  and macrophages  [147,  148]. Other hormonal  changes  such  as menopause  also  affect 

energy metabolism. Estradiol  inhibits AMPK  in the hypothalamus, which activates thermogenesis  in 

BAT  [143].  Indeed, ovariectomised mice with reduced estradiol  levels gain more weight  than sham 

operated  mice  and  have  reduced  energy  expenditure  and  increased  WAT  inflammation  [144]. 

Currently, many other factors that affect both BAT activity and  inflammation, such as p53 [74] and 

USF1 [75] are being investigated (Table 1). As described below, reports have also provided evidence 

that immune cells are directly involved in regulating the activity of brown as well as beige adipocytes. 

Inflammatory mediators in BAT 

Remarkably,  Roberts‐Toler  et  al.  [76]  discovered  that  feeding mice  a HFD  for  16 weeks  not  only 

reduced  insulin signalling, but also  increased mRNA  levels of markers of  inflammation  in both WAT 

and BAT, including Tnf and the macrophage marker F4/80. Microarrays of interscapular BAT showed 

an upregulation of  immune  response  gene networks  after 24 weeks of HFD,  including  genes  that 

indicate  infiltration  of  leukocytes,  monocytes  and  macrophages  (CD44,  CD52,  CD68  and  CD84). 

Furthermore, after 2, 4 and 8 weeks of HFD,  immune gene networks were upregulated,  including 

Immune regulation in adipose tissue 

31  

genes responsive to  IFNγ;  immunity‐related GTPase  family M member 2  (Irgm2), guanylate binding 

protein 4 (Gbp4) and interferon gamma induced GTPase (Igtp) [149]. These gene expression profiles 

hint towards the presence of immune cell trafficking, leukocyte activation and lymphocyte activation 

in BAT. 

 

In another study, gene expression analysis  in BAT of obese mice showed an upregulation of genes 

encoding the inflammatory cytokines TNF, IL‐6, CCL2 and CCL5 [150]. Furthermore, activation of the 

pattern recognition receptors (PRRs), nucleotide‐oligomerization domain‐containing protein (NOD) 1, 

Toll‐like  receptor  (TLR)  2  and  TLR4  in  brown  adipocytes  induces  a  pro‐inflammatory  response 

through NF‐κB  and MAPK  signalling  pathways.  PRRs  are  receptors  responsible  for  the  sensing  of 

invading  pathogens  and  can  activate  specific  signalling  pathways  leading  to  distinct  inflammatory 

responses.  Enhanced  PRRs  expression  decreased  UCP1  expression  as  well  as  mitochondrial 

respiration in brown adipocytes [150]. 

 

Another factor affecting BAT function and BAT inflammation is p62, a protein involved in cell growth 

and  differentiation,  energy metabolism  and  inflammation.  Global  ablation,  as  well  as  adipocyte 

specific  ablation  of  p62  results  in  obesity  and  insulin  resistance.  Moreover,  these  mice  have 

decreased  non‐shivering  thermogenesis  and  a  lower metabolic  rate, which  is  caused  by  impaired 

mitochondrial  function  in  brown  adipocytes,  due  to  decreased  activation  of  p38α MAPK  and  its 

downstream  regulators  of  thermogenesis,  including  UCP1,  PGC‐1α  and  CREB.  Furthermore,  gene 

expression of obese BAT  in adipocyte‐specific p62‐deficient mice  reveals  induction of pathways of 

inflammation and increased macrophage infiltration in BAT [62] (Table 1). 

BAT activation and beiging of WAT: Role of the immune system 

Macrophages  have  been  shown  to  play  a  role  in  adaptive  thermogenesis.  Nguyen  et  al.  [3] 

demonstrated that short term  (6 h) cold exposure  increases M2 macrophage markers  in both WAT 

and  interscapular BAT  in mice.  Furthermore, absence of M2 macrophages blunts BAT activity and 

induces  cold‐intolerance  in  DIO  mice.  Acute  cold  exposure  stimulates  anti‐inflammatory  M2 

macrophages  to produce  tyrosine hydroxylase  (TH), a catecholamine‐synthesizing enzyme, via  IL‐4‐

STAT6  signalling.  This  results  in  the  release  of  noradrenaline,  which  binds  to  the  β3‐adrenergic 

receptor  on  the  brown  adipocyte membrane.  Consequently,  BAT  is  activated,  evidenced  by  the 

induction of Ucp1 and other  thermogenic gene expression,  such as Pgc‐1α and acyl‐CoA  synthase 

long‐chain family member 1 (Acsl1). An acute cold‐induced increase of M2 macrophages in BAT and 

WAT was not observed  in  Il‐4/Il‐13  and  Stat6  knockout mice,  indicating  that  the  IL‐4/IL‐13‐STAT6 

pathway  is  crucial  to  increase  the  amount  of M2 macrophages  in  interscapular  BAT  after  a  cold 

challenge  [3]. However, other  reports  show  that upon prolonged, 72h cold exposure, depletion of 

macrophages by clodronate or deficiency of CCR2 does not affect adaptive thermogenesis in classical 

BAT, but induces beiging of WAT. This suggests a less pronounced role for macrophages in adaptive 

thermogenesis  in  BAT,  but  rather  an  involvement  in  beiging  of WAT.  Especially M2 macrophages 

have been shown to  induce beiging of subcutaneous WAT. Impaired monocyte recruitment  in CCR2 

knockout mice results in decreased biogenesis of beige adipocytes upon cold exposure, proving that 

CCR2  is  responsible  for  cold‐induced monocyte  recruitment  [5]. Moreover, beiging of WAT  is also 

observed when M1 to M2 polarization is enhanced through lowering of Receptor Interacting Protein 

140 (RIP140) [151]. 

Chapter 2 

32  

Not  only  can  macrophages  produce  TH,  they  are  also  capable  of  producing  the  catecholamine 

noradrenaline  [152,  153]  and  express  β2‐adrenergic  receptors.  Binding  of  noradrenaline  to  β2‐

adrenergic  receptors  promotes M2  polarization,  enabling  a  paracrine  loop  and  suggesting  auto‐

regulation of catecholamine levels [154]. Protein expression of the catecholamine producing enzyme 

TH  increases  upon  cold  exposure  in  BAT  as well  as  subcutaneous WAT  and  epididymal WAT  [5]. 

Interestingly, myeloid  specific  TH  deficient mice  have  impaired  cold‐induced  biogenesis  of  beige 

adipocytes,  but  exhibit  normal BAT  activity. BAT  is  highly  innervated  by  the  sympathetic  nervous 

system,  along  with  a  constitutively  high  expression  of  catecholamine  synthesizing  enzymes.  The 

contribution of noradrenaline production by macrophages may therefore be less crucial in BAT then 

in the far less innervated WAT, which has a low basal TH expression [5]. 

 

Cold‐induced  remodelling  of  subcutaneous  WAT  into  thermogenic  beige  fat  by  noradrenaline 

producing macrophages  was  shown  to  be  induced  by  eosinophils,  via  IL‐4,  IL‐13  and  STAT6  [5]. 

Mouse models  with  a  genetic  loss  of  Il‐4/Il‐13,  Il‐4Rα,  Stat6  or  IL‐4‐producing  eosinophils  have 

impaired  cold‐induced biogenesis of beige  adipocytes.  In  addition,  administration of  IL‐4  into DIO 

mice  at  thermoneutrality  reduces  body weight,  improves  insulin  sensitivity  and  increases  protein 

expression of UCP1  in  subcutaneous WAT, but not  in classical  interscapular BAT  [5]. Meteorin‐like 

(Metrnl) hormone was found to be responsible for inducing IL‐4 secretion by eosinophils [37]. Metrnl 

is a target of PGC‐1α4 and is released by skeletal muscle during exercise and by adipose tissue upon 

cold exposure.  It does not have a direct effect on brown adipocytes, but stimulates eosinophils  to 

produce IL‐4 which promotes activation of M2 macrophages and causes the increased expression of 

thermogenic and anti‐inflammatory gene programs [37]. 

 

Besides macrophages,  ILC2s are  important mediators of beiging of WAT  (Figure 4). This subtype of 

innate lymphoid cells controls eosinophil and M2 macrophage responses by secreting IL‐5 and IL‐13, 

initiates  type 2  immune  responses and  is designed  to protect against helminth  infections but also 

promote  allergies  [155].  In humans  and mice  suffering  from obesity, decreased numbers of  ILC2s 

have been detected  in subcutaneous WAT  [6]. The cytokine  IL‐33  is critical  for  the maintenance of 

ILC2s and experimental mouse studies have shown that IL‐33 limits the development of spontaneous 

obesity. IL‐33 deficient mice gain more weight on a HFD, have a reduced number of ILC2s and exhibit 

decreased numbers of beige adipocytes  in WAT. Administration of IL‐33  increases numbers of ILC2s 

and eosinophils  in subcutaneous WAT,  leading to  increased energy expenditure  in mice by  inducing 

beiging of WAT [4, 6]. IL‐33 induced beiging is a result of proliferation and differentiation of PDGFRα+ 

adipocyte precursor cells. PDGFRα+ pre‐adipocytes do not express receptors required for signalling by 

IL‐33 (IL1RL1) or  IL‐5  (IL‐5Rα), but they do express  IL‐4Rα, which  is required for both  IL‐4 and  IL‐13 

signalling  [4].  Therefore,  beiging  of WAT  is  also  dependent  on  IL‐4/IL‐13  signalling  in  adipocyte 

precursor  cells,  and  not  necessarily  solely  on  signalling  of  these  cytokines  in  myeloid  cells  [4]. 

Furthermore,  IL‐33 sensing  ILC2s could be dysregulated  in  the setting of  increased adiposity  [156]. 

The presence of  ILC2s and eosinophils  in BAT and WAT  in mice and the decrease  in  ILC2s and  IL‐33 

upon high‐fat feeding and leptin deficiency‐induced obesity was confirmed by Ding et al [157]. Again, 

administration of IL‐33 increased the number of ILC2s, eosinophils and induced Ucp1 and TH in WAT, 

but not BAT, of HFD‐fed mice, resulting  in beiging of subcutaneous WAT. In addition, cold‐exposure 

increased  IL‐33  levels  as  well  as  the  numbers  of  ILC2s  and  eosinophils  in  subcutaneous  WAT. 

Denervation of  subcutaneous WAT by  injection of 6‐hydroxydopamine  (6‐OHDA)  suppressed basal 

and cold‐induced IL‐33 levels and lowered the ILC2 and eosinophil fraction. Sympathetic denervation 

did not alter CD206+ M2 macrophages, showing  the  importance of catecholaminergic  regulation  in 

the IL‐33‐ILC2‐eosinophil axis. 

Immune regulation in adipose tissue 

33  

IL-5

IL-13

Eosinophil

IL-4

IL-33

Metrnl

CCR2+ monocyte

Macrophage

M2

NA

UCP1

ILC2MetEnk

Treg

 

 

Interestingly,  Brestoff  et  al.  [6]  demonstrated  that  beige  adipocytes  can  also  develop  via  an 

alternative mechanism, independently of IL‐4, IL‐13, eosinophils or macrophages. DblGata1 knockout 

mice, which  lack eosinophils,  IL‐4Rα knockout mice, which do not have  IL‐4 and  IL‐13 signalling, or 

ILC2‐sufficient Rag2 knockout mice, which lack mature lymphocytes but have reconstituted ILC2s, still 

exhibit beiging of WAT, although all factors combined most likely contribute to optimal beiging. ILC2s 

produce an opioid‐like peptide, methionine‐enkephalin (MetEnk) peptide, which upregulates UCP1 in 

subcutaneous WAT and  induces beiging of adipocytes without affecting  IL‐4 or  IL‐13  levels or  the 

number  of  eosinophils  or  macrophages  in  WAT  [6].  This  mechanism  was  only  restricted  to 

subcutaneous WAT. MetEnk  receptors MetEnk  receptor  δ1  opioid  receptor  (Oprd1)  and MetEtnk 

receptor  Opioid  growth  factor  receptor  (Ogfr)  were  differentially  expressed  in  WAT  and  BAT, 

explaining these tissue‐specific effects [6].  

 

These  two  different  mechanisms  as  to  how  ILC2s  control  beiging  of  WAT;  PDGFRα+  adipocyte 

precursor  cell  proliferation  and  differentiation  and  MetEnk  production,  might  synergize  in  the 

generation of beige  adipocytes.  The previously unrecognized  feature of  ILC2s  to produce MetEnk 

would need  to be  confirmed  in  future  studies, as well as  the  role  for beige adipocyte precursors. 

Further studies are needed to determine the relative contribution of IL‐4, IL‐13 and MetEnk to beige 

Figure  4.  Cold‐induced  remodelling  of  subcutaneous white  adipose  tissue  into  thermogenic  beige  adipocytes  via immune cells.  ILC2s are  important players  in beiging of white adipocytes.  ILC2s are maintained by  IL‐33 and produce MetEnk peptide, which upregulates UCP1  in white adipose tissue.  IL‐33 also  increases the percentage of regulatory T cells  in WAT,  the  T  cell  fraction  contributing  to  glucose  homeostasis.  ILC2s  secrete  IL‐5  and  IL‐13, which  stimulate eosinophils  to  produce  IL‐4.  IL‐4  can  directly  cause  beiging  or  act  via M2‐macrophages  that  induce  beiging  by  the production of noradrenaline. The  increased number of macrophages upon cold exposure  is dependent on monocyte recruitment via CCR2. Eosinophil‐dependent IL‐4 secretion can also occur via Metrnl hormone, released by the adipose tissue upon cold exposure. IL; interleukin, ILC2s; group 2 innate lymphoid cells, MetEnk; methionine‐enkephalin, Metrnl; meteorin‐like, NA; noradrenaline Treg; regulatory T cells, UCP1; uncoupling protein 1. 

Chapter 2 

34  

adipogenesis. It would also be interesting to determine the source of IL‐33 production, the cytokine 

that puts the ILC2 pathway in motion.  

 

Improved metabolic health by caloric restriction in mice also indicates that type 2 cytokine signalling 

is  important  in  beiging  of WAT.  Caloric  restriction  increases  the  amount  of  eosinophils,  type  2 

cytokines and M2 macrophages in WAT, but does not affect the number of ILC2s, and consequently 

promotes beiging. The development of beige adipocytes upon caloric restriction  is ablated  in Stat6 

knockout and IL4R knockout mice, suggesting that type 2 cytokines play an important role in beiging 

of WAT [158].  

 

Toll‐like  receptors  (TLRs)  respond  to  various  pathogen‐associated molecules,  including  saturated 

fatty acids, by  inducing signal  transduction and  transcription of various chemokines and cytokines, 

and  are  predominantly  found  on  cells  of  the  innate  immune  system.  However,  adipocytes  also 

express  several  TLRs  (TLR3  and  TLR4)  and  contain  relevant  downstream  signalling  elements. 

Members of the interferon regulatory factor (IRF) family regulate both immune cell activation as well 

as adipocyte differentiation, via TLR3 and TLR4. HFD‐fed  IRF3 deficient mice have  improved  insulin 

sensitivity, reduced adipose‐ and systemic inflammation and enhanced beiging of subcutaneous WAT 

[159]. TLR4 activation in obesity or by lipopolysaccharide indeed suppresses beiging of subcutaneous 

WAT  and  causes  defective  BAT.  In  human  primary  white  adipocytes,  TLR4  activation  by  LPS 

suppresses UCP1  induction [160]. Irf4flox/flox;UCP1‐Cre mice,  lacking IRF4 specifically  in UCP1 positive 

cells, are more obese on a HFD. IRF4 is induced by cold, promotes energy expenditure and increases 

thermogenic gene expression, including PGC1α and PRDM16 [161]. IRF4 was also shown to be a key 

transcription  factor  in  controlling  M2  polarization  [162].  These  data  indicate  that  TLRs  in  both 

immune cells and adipocytes play a role in adaptive thermogenesis. 

 

The circuit  in which metabolic  improvements are associated with beige adipogenesis and mediated 

by  eosinophils,  type  2  cytokines  and M2 macrophages  is  also  linked  with  the  status  of  the  gut 

microbiome  [80].  Germ‐free mice,  or mice  with  antibiotic‐depleted microbiota  have more  beige 

adipocytes in both lean and obese WAT, leading to improved glucose tolerance and insulin sensitivity 

mediated by eosinophils,  type 2 cytokines and M2 macrophages  [80]. Cold exposure alters  the gut 

microbiota by remodelling of  the  intestine and adipose  tissue,  increasing  the absorptive surface of 

the  gut.  Transfer of  cold‐adapted microbiota  improves  insulin  sensitivity  and  enhances  beiging of 

WAT [81]. With the current high prevalence of human obesity and the frequent use of antibiotics, the 

relation between beiging and microbiome is an interesting topic of future research.  

 

Another player related to beiging of WAT by M2 macrophages is adiponectin, an adipokine regulating 

glucose levels and fatty acid degradation. Adiponectin can promote the polarization of macrophages 

towards  an M2  phenotype,  correcting  obesity‐induced macrophage  infiltration  and  inflammation. 

Hui  et  al.  show  that  cold  exposure  induces  elevated  gene  expression  and  protein  levels  of 

adiponectin  in subcutaneous WAT, and, using adiponectin knockout mice, show that adiponectin  is 

essential  for  beiging  of  the  subcutaneous  adipose  tissue  via M2 macrophage  proliferation  [79]. 

Adiponectin deficiency has no effect on ILC2s or type 2 cytokines, suggesting that these are not the 

downstream effectors of adiponectin during cold‐induced beiging [79]. 

 

Immune regulation in adipose tissue 

35  

Increased  numbers  of  M1  macrophages  in  obese  WAT  suppress  cold‐induced  beiging  of 

subcutaneous WAT  in mice. Depletion of macrophages, using clodronate  liposomes, eliminates  the 

suppressive effects of M1 macrophages on UCP1  induction and  reduces  the  level of TNF  in obese 

WAT. Cold exposure  in clodronate  treated obese mice has metabolic benefits,  such as  lower body 

weight  and  decreased  plasma  glucose  levels.  Mitochondrial  biogenesis  is  not  the  underlying 

mechanism by which M1 macrophages suppress UCP1, since this was not affected by clodronate nor 

intraperitoneal TNF injections [82]. 

 

Interestingly, IL‐33 also increases the percentage of Tregs in WAT, the T cell fraction contributing to 

glucose homeostasis [6]. Medrikova et al. [78] performed a microarray on sorted Tregs from BAT and 

identified  a  BAT‐specific  subset  of  Tregs,  which  contribute  to  metabolic  control  of  BAT.  Upon 

depletion  of  Tregs,  the  tissue  exerted  an  increased  inflammatory  state  with  an  increase  in 

macrophages,  resulting  in mice  that were more  sensitive  to  cold  [78]. However,  nude mice  on  a 

C57Bl/6 background, which  lack mature  T  cells,  experience  cold  stress  at  23°C  and  are  protected 

from DIO  by  increased  thermogenesis  and  energy  expenditure.  This  suggests  that  T  cells  are  not 

required for adaptive thermogenesis in C57Bl/6 nude mice. At thermoneutrality, C57Bl/6 nude mice 

are susceptible to DIO and associated increased inflammatory markers in adipose tissues [141]. 

Cytokines 

Besides the effects of IL‐4 and IL‐33, which induce beiging as described above, other cytokines have 

also  been  shown  to  play  a  role  in  thermogenesis.  Adipose  tissue  becomes  hypoxic  in  the 

development of obesity, which contributes to the inflammatory state and the induction of TNF. This 

cytokine further affects adipocyte homeostasis by reducing expression of Pgc‐1α and Pparγ  in both 

white  and  brown  adipocytes  [163].  The  induction  of  beige  adipocytes  in  vitro  by  a  β‐adrenergic 

receptor agonist  is blunted upon stimulation with TNF or pro‐inflammatory cytokines derived  from 

LPS‐activated‐macrophages. TNF  is also  involved  in apoptosis of brown adipocytes as shown  in TNF 

receptor deficient ob/ob mice [164]. Furthermore, TNF impairs mitochondrial biogenesis in WAT, BAT 

and muscle of ob/ob and DIO mice, and leptin receptor‐deficient Zucker fa/fa rats [165]. Extracellular 

signal‐related kinase (ERK), which mediates the induction of inflammatory cytokines, has been shown 

to be an  important factor  in the suppression of UCP1 transcriptional activation  in white adipocytes 

and  activated macrophages  [166].  Together,  these  data  indicate  that  cytokines  can  also  directly 

influence BAT activity. 

 

Moisan  et  al.  performed  a  small‐molecule  screen  to  find  pathways  that  induce  a  brown‐like 

thermogenic program in human adipocytes in vitro [167]. They identified tofacitinib and R406 which 

both  target  the  JAK‐STAT1/3 pathway  in adipocytes, with R406 having additional  targets  including 

AKT and ERK1/2. TNF  can  signal  through  JAK‐STAT and ERK pathways and although TNF  represses 

Ucp1 expression,  simultaneous  stimulation with TNF and  the  compounds  (partially)  restored Ucp1 

levels  [167].  Furthermore,  IFNγ  treatment  reduces  Ucp1  expression  in  human  brown  adipocytes. 

Interferons  (α/β/γ)  bind  to  JAKs  and  activate  STAT1/2/3  and  repression  of  IFN  signalling  by  JAK 

inhibition contributes to the upregulation of Ucp1 and promotes the metabolic beiging of adipocytes 

[167]. 

 

Another major cytokine in regulating inflammatory responses in obesity is IL‐6, although it is unclear 

yet  whether  IL‐6  serves  a  harmful  or  a  protective  role.  IL‐6  has  a  homeostatic  role  in  limiting 

Chapter 2 

36  

inflammation but can also have pro‐inflammatory effects [168]. This leads to controversial results in 

studies on IL‐6 in obesity. Plasma IL‐6 levels increase in obesity and correlate with C‐reactive protein 

levels [169] and  infusion of  IL‐6  immediately  impairs  insulin sensitivity  in mice [170]. However,  IL‐6 

deficiency  results  in more  obese mice  [171],  but  not  in  all models  [172]. Myeloid  specific  IL‐6R 

inactivation  leads  to  a  greater  propensity  to  develop  obesity‐induced  inflammation  and  glucose 

intolerance.  IL‐6  induces  the  IL‐4  receptor  and  is  therefore  an  important  determinant  in  M2 

macrophage  polarization  [168].  With  respect  to  BAT,  IL‐6  deficient  mice  have  reduced  energy 

expenditure and fatty acid oxidation at room temperature. Housed at 4°C, IL‐6 deficient mice have a 

lower core body temperature than WT mice [173]. Knudsen et al. [83] gave daily i.p. injections of IL‐6 

for 7 days which  increased Ucp1 mRNA but not UCP1 protein  levels  in  inguinal WAT  (iWAT). Cold 

exposure  increases  iWAT Ucp1 mRNA content similarly  in  IL‐6 deficient as WT mice, while exercise 

training  (which  induces the release of  IL‐6  from contracting muscle)  increases  iWAT Ucp1 mRNA  in 

WT but not  in  IL‐6 deficient mice. Taken together, the appropriate cytokine stimulation can  induce 

beiging of WAT, which could be a potential mechanism to increase energy expenditure in obesity.  

 

Beiging of WAT is also found in cancer‐associated cachexia (wasting syndrome), where β‐adrenergic 

activation  and/or  inflammatory  cytokine‐induced  lipolysis  cause  WAT  atrophy.  These  beige 

adipocytes are present within WAT and cause  increased  lipid mobilization and energy expenditure 

[77].  The  cytokine  IL‐6  increases  Ucp1  expression  in  WAT,  whereas  silencing  IL‐6,  an  anti‐IL‐6 

antibody,  the  nonsteroidal  anti‐inflammatory  drug  sulindac  or  β3‐adrenergic  blockade  in  mice 

reduces WAT beiging and ameliorates the severity of cachexia. This is also observed in patients [77].  

 

The  involvement  of  the  sympathetic  nervous  system  in  BAT  also  contributes  to  a  homeostatic 

cytokine environment. Surgical denervation of BAT or β‐adrenergic antagonist propranolol treatment 

upregulates gene expression of Tnf,  ll‐6 and Ccl2, without a change  in F4/80 expression,  indicating 

that the SNS and β‐adrenergic signalling are necessary to maintain an anti‐inflammatory state in BAT 

[174]. 

Chemokines  

Chemokines  and  chemokine  receptors  regulate  leukocyte  influx  into  obese  WAT.  Chemokine 

receptors on  immune cells  in WAT and serum chemokine  levels are  increased  in obese versus  lean 

individuals  [175].  Chemokines  secreted  by  the  stromal  vascular  fraction  (SVF)  and/or  white 

adipocytes include CCL5, CCL20, CXCL10 and CXCL12, which promote the accumulation of leukocytes 

into WAT through binding to their receptors CCR5, CCR6, CXCR3 and CXCR4, respectively [119, 176, 

177]. 

 

The  regulation  of  BAT  homeostasis  and  leukocyte  influx  by  chemokines  is  scarcely  studied.  DIO 

adipocyte‐specific  CXCR4  knockout  mice  develop  severe  obesity  upon  HFD  feeding,  have  an 

increased  pro‐inflammatory  leukocyte  content  in WAT  and  exhibit  reduced  thermogenic  capacity 

when exposed to cold. This reveals that CXCR4 prevents  inflammatory  leukocyte  influx  in WAT and 

that adipocyte Cxcr4 expression  is required for the thermogenic capacity of BAT, thereby  increasing 

overall energy expenditure and decreasing susceptibility to DIO [84]. 

Lipokines 

Besides metabolic effects, lipids have inflammatory signalling properties. While saturated fatty acids 

promote adipose  tissue  inflammation and  insulin  resistance  through TLR  signalling  [178], n‐3  fatty 

Immune regulation in adipose tissue 

37  

acids [179] and palmitic acid esters of hydroxyl‐stearic acids (PAHSAs) [180] have anti‐inflammatory 

and anti‐diabetic effects. The  lipokine palmitoleate supresses cytokine expression  in adipocytes and 

reverses high fat‐induced proinflammatory macrophage polarization [181]. Palmitoleate and PAHSAs 

are  synthesized endogenously  in  the adipose  tissue  from  fatty acids  [180, 182, 183] and n‐3  fatty 

acids  are  derived  from  diet,  although  palmitoleate  is  also  present  in  food  [183].  Interestingly, 

adipocyte‐specific  LPL  knockout  mice  have  increased  de  novo  lipogenesis,  particularly  of 

palmitoleate.  However,  this  did  not  increase  BAT  activation,  WAT  beiging  or  amelioration  of 

inflammation  in  these mice  [184]. PAHSAs and n‐3  fatty acids were shown  to exert  their beneficial 

metabolic and anti‐inflammatory effects via G protein‐coupled receptor 120 (GPR120), a receptor for 

long chain fatty acids that is present in the gut, adipose tissue, pancreas and immune cells [180, 185]. 

Intriguingly, PAHSA  levels  in mice are  the highest  in BAT and WAT  [180] and GPR120 expression  is 

abundant  in BAT and WAT which  increases upon  β3‐adrenergic  receptor  stimulation or  cold  [186]. 

Given  the abundance of  these metabolically advantageous and anti‐inflammatory  lipokines  in BAT 

and WAT,  future  research  is  needed  to  unravel  the  thermogenic  effects  of  lipokines  and  lipid‐

activated GPRs. 

Concluding remarks and future perspectives 

Translational challenges from mice to men 

Extensive studies in mouse models have shown that there is a relation between BAT and obesity, and 

that the  immune system plays an  important role  in regulating BAT activity and beiging of WAT, but 

whether  this  is  the  case  in  humans  still  needs  to  be  investigated.  Although  increasing  energy 

expenditure by activating BAT or inducing beiging of WAT prevents diet‐induced or genetic obesity in 

mice,  results  from  different  mouse  models  are  not  always  relevant  to  the  human  situation. 

Interscapular  classical  BAT  in mice  does  not  regress  with  age  whereas  adult  humans  no  longer 

possess this classical BAT depot. Another difficulty  in extrapolating mouse data to the human  is the 

difference  in  thermoneutral  temperature  and  the  activity  of BAT  at  room  temperature  (18‐22°C). 

Housing mice in their thermoneutral condition (30°C) would be comparable to the human situation, 

which is not always acknowledged.  

 

Many studies have shown that BAT activity in humans is thermoresponsive, and have suggested that 

obesity  is  associated  with  a  decrease  in  [18F]FDG  uptake  in  BAT,  which  may  be  related  to 

inflammation. As described, BAT activity in humans is mostly measured by [18F]FDG uptake. However, 

the  signal  generated  by  [18F]FDG  in  PET‐CT  studies  likely  underestimates  the  activity  of  BAT  as  it 

utilizes  both  glucose  and  fatty  acids  as  fuel  [105,  187].  Furthermore,  insulin  resistance  reduces 

glucose  uptake  by  BAT  leaving  the  uptake  of  fatty  acids  and  oxidative  capacity  unaffected  [105]. 

Therefore, it has been postulated that the use of the fatty acid tracer [18F]FTHA is preferred over the 

use of  [18F]FDG  [187].  It would even be better to develop a  triglyceride with  labelled  fatty acids as 

tracer,  since BAT mostly  takes up  fatty acids derived  from TRLs  in an LPL‐dependent manner  [89]. 

Besides alternative methods to quantify BAT activity independent of insulin sensitivity, identification 

of specific circulating markers for activated human BAT is highly desired.  

 

Interestingly, mechanisms of beiging of WAT display more  similarities between both  species. Mice 

have a large beiging capacity, especially of the subcutaneous WAT. Although beiging capacity and its 

Chapter 2 

38  

contribution to energy expenditure in humans still needs to be determined in detail, studies support 

a  similar mechanism. A 6‐weeks 2‐hour daily  cold  exposure procedure  results  in  the  reduction of 

body  fat  [2]  and  beiging  of WAT  in  patients with  pheochromocytoma,  a  catecholamine‐secreting 

tumor, leads to increased metabolism [188]. Hormones, immune cells or cytokines that induce beige 

adipocytes in mice and are also present in humans, suggesting that beiging via those mechanisms can 

also occur in humans. For example, Brestoff et al. confirm presence of ILC2s in human adipose tissue, 

suggesting that the circuit of  ILC2s, eosinophils, type 2 cytokines and M2 macrophages that  induce 

beiging in mice, is also operational in human beiging [6]. 

Speculation on human BAT from an evolutionary perspective 

BAT  evolved  as  a  natural  defence  system  against  hypothermia  in  mammals,  increasing  the 

adaptability  to  explore  colder  environments  [189].  Major  threats  besides  cold  in  the  course  of 

evolution include limited food supply and infections. Cold challenges were accompanied by a limited 

food supply, making BAT a possible survival organ, enabling efficient  food hunting  in a subthermal 

environment [113]. 

 

Formerly common helminth and parasite  infections elicit an M2  immune response which appear to 

be  important regulators of beige adipocytes [6]. Along with the migration to colder areas, both the 

helminth and host could potentially benefit from  increased WAT beiging by promoting host survival 

in  cold  climates  [190].  Immunity  and  cold  adaptation  are  therefore  connected.  Furthermore,  as 

starvation and infection co‐occurred, chemokine secretion by adipose tissue could be an evolutionary 

advantage in which a beneficial genotype to combat infection and higher amounts of adipose tissue 

promotes  survival.  Another  adaptive  conservative  trait  is  infection  induced  insulin  resistance, 

enabling nutrient supply to immune cells [191]. 

 

Although BAT  seems  to have  lost part of  its  function  for  evolutionary  reasons,  young people  and 

possibly also adults may still benefit from it. BAT participates in glucose and fatty acid clearance and 

may  still  serve  as  a  nutrient  buffering  system  [105,  113].  The  role  of  thermogenesis  in  handling 

excessive energy was already  shown  in a  study  in 1979, during which diet‐induced  thermogenesis 

limited weight gain after a high caloric meal [192]. 

Therapeutic potential  

Potential  human  drugs  that  induce  beiging  of  WAT  are  currently  being  tested  in  the  clinic,  as 

reviewed by Giordano et al [193]. A possible target would be the β3‐adrenergic receptor, although it 

is  not  specific  for  brown  adipocytes  and  is  expressed  in  a  variety  of  organs.  Unfortunately,  β‐

adrenergic receptor agonists have so far not been shown to have major effects on energy balance. A 

latest  generation  β‐adrenergic  receptor  agonist,  mirabegron  (approved  to  treat  the  overactive 

bladder),  increases the metabolic activity of BAT evidenced by  increased [18F]FDG uptake  in healthy 

male subjects [99].  In mice, mirabegron also has anti‐inflammatory effects [76]. Aside from directly 

activating brown adipocytes or  inducing beiging of WAT with β3‐adrenergic receptor agonists, anti‐

inflammatory  drugs  may  induce  expansion  of  BAT  and  beiging  of  WAT  and  promote  energy 

expenditure as an anti‐obesity treatment,  including salsalate or amlexanox  [116, 193]. A  few drugs 

with high potential  for human drug development  target  factors downstream of  the  β3‐adrenergic 

receptor,  such as C/EPBβ and PRDM16 and have extensively been  studied  in mice, and proven  to 

induce differentiation of beige and brown adipocytes in mice [193]. 

 

Immune regulation in adipose tissue 

39  

Besides  receptor  targeted  drugs,  diet  and  nutritional  components  as  ways  to  modulate 

thermogenesis and inflammation can be considered as an alternative strategy. Although it is known 

that brown, beige and white adipocytes are fuelled by glucose and fatty acids, large knowledge gaps 

exist. We  still  do  not  know whether  different  types  of  dietary  fatty  acids  or  carbohydrates  elicit 

distinct  effects  on  thermogenesis  and  inflammation.  Whereas  saturated  fatty  acids  promote 

inflammation and are detrimental  for metabolic health  [178], n‐3  fatty acids are anti‐inflammatory 

and act beneficially [179]. Whether dietary n‐3 fatty acids activate BAT or promote beiging remains 

to  be  investigated.  An  interesting  target  would  be  PPARγ,  which  can  be  activated  by  these 

polyunsaturated  fatty acids and plays a  role  in both beige and brown adipogenesis as  in M2 anti‐

inflammatory macrophage activation [194]. As for specific carbohydrates, hardly anything  is known 

about  their  effects  on  BAT  activity  or  beiging.  Almost  30  years  ago, Walgren  et  al.  showed  that 

dietary carbohydrates increased noradrenaline turnover in heart and/or BAT in rats, unrelated to the 

type of carbohydrate (i.e. fructose, sucrose, dextrose, corn starch) [195]. More recent investigations 

have  not  looked  into  the  effects  of  specific  carbohydrates  on  BAT  activation  or  beiging.  Future 

research might shed light on this underexposed aspect of modulating thermogenesis.  

Conclusion 

Excessive energy  intake  results  in  increased  storage of  lipids  in both white and brown adipocytes, 

which  challenges  the  function  of  these  cells.  Immune  cells  and  signals  in  WAT  and  BAT  are 

indispensable for the homeostasis of the tissue and contribute to the efflux of lipids stored in white 

adipocytes and to high rates of oxidation in brown and beige adipocytes.  

 

Immune cells, including eosinophils and alternatively activated macrophages, have regulatory roles in 

metabolic  homeostasis  of  both WAT  and  BAT  and  research  to  identify  immunological  players  is 

ongoing.  If  the mechanism  is  unravelled  in  detail,  immune  regulation  is  an  intriguing  therapeutic 

target in increasing energy expenditure to reduce weight gain. Notably, the numbers of immune cells 

in  lean  as well  as obese BAT  are much  lower  than  in WAT,  indicating  that BAT  is  relatively more 

resistant to diet induced inflammation, but increased tissue inflammation in BAT does occur upon a 

positive energy balance. The challenge  is to  identify the metabolic crosstalk between  immune cells 

and  brown,  beige  and  white  adipocytes  and  the  order  of  events  that  occur  during  obesity 

development. BAT  regulation by  the  immune system will not come down  to an  individual  immune 

cell  type and will  involve  significant crosstalk between different cell  types.  Important questions  to 

further address  include: What are  the  immune  regulatory effector molecules  that are  secreted by 

brown  adipocytes  (or  a  pre‐beige  adipocyte  or  a  white‐wanting‐to‐become‐beige  adipocyte)  to 

attract or regulate  immune cells? How  is BAT activity regulated  in obesity? What  is  the role of the 

sympathetic nerve system? And how does BAT activity change during aging? 

 

In  conclusion,  the  presence  of  BAT  in  humans  and  the  potential  activation  of  resident  BAT  or 

induction of beige adipocytes in WAT is an interesting target to treat or even prevent obesity‐related 

disorders.  Cold  is  still  by  far  the  strongest  sympathetic  signal  to  activate  BAT,  but  the  quest  for 

identifying  biochemical  and  immunological  pathways  that  are  responsible  for  BAT  activation,  and 

thereby can bypass prolonged cold exposure, is ongoing. The recent finding on the role for immune 

cells  in  brown  and  beige  adipocyte  development  and  physiology  harbours  a  great  potential  to 

increase BAT activity and beneficially alter energy metabolism by interfering in immune responses.  

Chapter 2 

40  

Corresponding author Esther Lutgens, Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Centre, University 

of Amsterdam, Meibergdreef 15, 1105 AZ, Amsterdam, The Netherlands. Tel. +31 (0)20 5 66 33 80. e.lutgens@amc.uva.nl 

Disclosure statement The authors have nothing to disclose. 

Acknowledgements We  acknowledge  the  support  from  the Netherlands Organization  for  Scientific  Research  (NWO)(VICI  grant  to  E.L.),  the 

Rembrandt  Institute of Cardiovascular Science  (RICS),  the Netherlands CardioVascular Research  Initiative  (CVON2011‐19), 

the Deutsche  Forschungsgemeinschaft  (DFG)  (SFB1123‐A5  to  E.L)  and  the  European Research Council  (ERC  consolidator 

grant to E.L.). 

Immune regulation in adipose tissue 

41  

References 

[1]  Berrington de Gonzalez A, Hartge P, Cerhan JR, Flint AJ, Hannan L, MacInnis RJ et al. 2010. Body‐Mass Index and Mortality among 1.46 Million White Adults. New England Journal of Medicine 363(23):2211‐2219. 

[2]  Yoneshiro T, Aita S, Matsushita M, Kayahara T, Kameya T, Kawai Y et al. 2013. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation 123(8):3404‐3408. 

[3]  Nguyen KD, Qiu Y, Cui X, Goh YPS, Mwangi J, David T et al. 2011. Alternatively activated macrophages produce catecholamines to sustain adaptive thermogenesis. Nature 480(7375):104‐108. 

[4]  Lee M‐W, Odegaard  JI, Mukundan  L, Qiu  Y, Molofsky  AB, Nussbaum  JC  et  al.  2015.  Activated  Type  2  Innate Lymphoid Cells Regulate Beige Fat Biogenesis. Cell 160(1–2):74‐87. 

[5]  Qiu Y, Nguyen Khoa D, Odegaard  Justin I, Cui X, Tian X, Locksley Richard M et al. 2014. Eosinophils and Type 2 Cytokine Signaling in Macrophages Orchestrate Development of Functional Beige Fat. Cell 157(6):1292‐1308. 

[6]  Brestoff JR, Kim BS, Saenz SA, Stine RR, Monticelli LA, Sonnenberg GF et al. 2015. Group 2 innate lymphoid cells promote beiging of white adipose tissue and limit obesity. Nature 519(7542):242‐246. 

[7]  Warwick  PM,  Busby  R.  1990.  Influence  of mild  cold  on  24  h  energy  expenditure  in  ‘normally’  clothed  adults. British Journal of Nutrition 63(03):481‐488. 

[8]  Ivanov  KP.  2000.  Physiological  blocking  of  the  mechanisms  of  cold  death:  theoretical  and  experimental considerations. Journal of Thermal Biology 25(6):467‐479. 

[9]  van Marken Lichtenbelt WD, Vanhommerig  JW, Smulders NM, Drossaerts  JMAFL, Kemerink GJ, Bouvy ND et al. 2009. Cold‐Activated Brown Adipose Tissue in Healthy Men. New England Journal of Medicine 360(15):1500‐1508. 

[10]  Smith RE. 1964. Thermoregulatory and Adaptive Behavior of Brown Adipose Tissue. Science 146(3652):1686. [11]  de Jong JMA, Larsson O, Cannon B, Nedergaard J. 2015. A stringent validation of mouse adipose tissue  identity 

markers. American Journal of Physiology ‐ Endocrinology And Metabolism 308(12):E1085. [12]  Nakamura K, Morrison SF. 2008. A thermosensory pathway that controls body temperature. Nature Neuroscience 

11(1):62‐71. [13]  Morrison  SF,  Nakamura  K,  Madden  CJ.  2008.  Central  control  of  thermogenesis  in  mammals.  Experimental 

Physiology 93(7):773‐797. [14]  Lowell  BB,  Spiegelman  BM.  2000.  Towards  a  molecular  understanding  of  adaptive  thermogenesis.  Nature 

404(6778):652‐660. [15]  Cannon  B,  Nedergaard  J.  2004.  Brown  Adipose  Tissue:  Function  and  Physiological  Significance.  Physiological 

Reviews 84(1):277‐359. [16]  van Marken  Lichtenbelt WD.  2012.  Brown  adipose  tissue  and  the  regulation  of  nonshivering  thermogenesis. 

Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care 15(6):547‐552. [17]  Cao W, Daniel KW, Robidoux  J, Puigserver P, Medvedev AV, Bai X  et al. 2004. p38 Mitogen‐Activated Protein 

Kinase  Is  the Central Regulator of Cyclic AMP‐Dependent Transcription of  the Brown Fat Uncoupling Protein 1 Gene. Molecular and Cellular Biology 24(7):3057‐3067. 

[18]  Puigserver  P,  Spiegelman  BM.  2003.  Peroxisome  Proliferator‐Activated  Receptor‐γ  Coactivator  1α  (PGC‐1α): Transcriptional Coactivator and Metabolic Regulator. Endocrine Reviews 24(1):78‐90. 

[19]  Lidell ME,  Enerback  S.  2010.  Brown  adipose  tissue  ‐  a  new  role  in  humans?  Nature  Reviews  Endocrinology 6(6):319‐325. 

[20]  Timmons JA, Wennmalm K, Larsson O, Walden TB, Lassmann T, Petrovic N et al. 2007. Myogenic gene expression signature establishes  that brown and white adipocytes originate  from distinct  cell  lineages. Proceedings of  the National Academy of Sciences 104(11):4401‐4406. 

[21]  Liu W, Shan T, Yang X, Liang S, Zhang P, Liu Y et al. 2013. A heterogeneous lineage origin underlies the phenotypic and molecular differences of white and beige adipocytes. Journal of Cell Science 126(16):3527‐3532. 

[22]  Sharp  LZ,  Shinoda  K,  Ohno  H,  Scheel  DW,  Tomoda  E,  Ruiz  L  et  al.  2012.  Human  BAT  Possesses Molecular Signatures That Resemble Beige/Brite Cells. PLoS ONE 7(11):e49452. 

[23]  Wu J, Boström P, Sparks Lauren M, Ye L, Choi Jang H, Giang A‐H et al. 2012. Beige Adipocytes Are a Distinct Type of Thermogenic Fat Cell in Mouse and Human. Cell 150(2):366‐376. 

[24]  Seale P, Bjork B, Yang W, Kajimura S, Chin S, Kuang S et al. 2008. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature 454(7207):961‐967. 

[25]  Kajimura S, Seale P, Kubota K, Lunsford E, Frangioni  JV, Gygi SP et al. 2009.  Initiation of myoblast to brown  fat switch by a PRDM16–C/EBP‐β transcriptional complex. Nature 460(7259):1154‐1158. 

[26]  Petrovic N, Shabalina IG, Timmons JA, Cannon B, Nedergaard J. 2008. Thermogenically competent nonadrenergic recruitment  in  brown  preadipocytes  by  a  PPARγ  agonist. American  Journal  of  Physiology  ‐  Endocrinology  and Metabolism 295(2):E287‐E296. 

[27]  Sanchez‐Gurmaches  J, Hung C‐M, Sparks Cynthia A, Tang Y, Li H, Guertin David A. 2012. PTEN Loss  in  the Myf5 Lineage Redistributes Body Fat and Reveals Subsets of White Adipocytes  that Arise  from Myf5 Precursors. Cell Metabolism 16(3):348‐362. 

[28]  Sanchez‐Gurmaches  J, Guertin DA. 2014. Adipocytes arise  from multiple  lineages  that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications 5. 

Chapter 2 

42  

[29]  Shan  T,  Liang X, Bi P,  Zhang P,  Liu W, Kuang  S. 2013. Distinct populations of  adipogenic  and myogenic Myf5‐lineage progenitors in white adipose tissues. Journal of Lipid Research 54(8):2214‐2224. 

[30]  Wang W, Kissig M, Rajakumari S, Huang L, Lim H‐w, Won K‐J et al. 2014. Ebf2 is a selective marker of brown and beige adipogenic precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 111(40):14466‐14471. 

[31]  Cousin B, Cinti S, Morroni M, Raimbault S, Ricquier D, Penicaud L et al. 1992. Occurrence of brown adipocytes in rat white adipose tissue: molecular and morphological characterization. Journal of Cell Science 103(4):931‐942. 

[32]  Himms‐Hagen J, Melnyk A, Zingaretti MC, Ceresi E, Barbatelli G, Cinti S. 2000. Multilocular fat cells in WAT of CL‐316243‐treated rats derive directly from white adipocytes. The American Journal of Physiology  ‐ Cell Physiology 279(3):C670‐C681. 

[33]  Granneman  JG, Li P, Zhu Z, Lu Y. 2005. Metabolic and cellular plasticity  in white adipose  tissue  I: effects of β3‐adrenergic  receptor  activation.  American  Journal  of  Physiology  ‐  Endocrinology  and Metabolism  289(4):E608‐E616. 

[34]  Yoneshiro  T,  Saito M.  2014.  Activation  and  recruitment  of  brown  adipose  tissue  as  anti‐obesity  regimens  in humans. Annals of Medicine:1‐9. 

[35]  Berbée JFP, Boon MR, Khedoe PPSJ, Bartelt A, Schlein C, Worthmann A et al. 2015. Brown fat activation reduces hypercholesterolaemia and protects from atherosclerosis development. Nature Communications 6. 

[36]  Seale P, Conroe HM, Estall J, Kajimura S, Frontini A, Ishibashi J et al. 2011. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation 121(1):96‐105. 

[37]  Rao RR, Long JZ, White JP, Svensson KJ, Lou J, Lokurkar I et al. 2014. Meteorin‐like Is a Hormone that Regulates Immune‐Adipose Interactions to Increase Beige Fat Thermogenesis. Cell 157(6):1279‐1291. 

[38]  Carrière A, Jeanson Y, Berger‐Müller S, André M, Chenouard V, Arnaud E et al. 2014. Browning of White Adipose Cells by  Intermediate Metabolites: An Adaptive Mechanism  to Alleviate Redox Pressure. Diabetes 63(10):3253‐3265. 

[39]  Bostrom P, Wu  J,  Jedrychowski MP, Korde A, Ye L, Lo  JC et al. 2012. A PGC1‐a‐dependent myokine  that drives brown‐fat‐like development of white fat and thermogenesis. Nature 481(7382):463‐468. 

[40]  Fisher fM, Kleiner S, Douris N, Fox EC, Mepani RJ, Verdeguer F et al. 2012. FGF21 regulates PGC‐1α and browning of white adipose tissues in adaptive thermogenesis. Genes & Development 26(3):271‐281. 

[41]  Qian S‐W, Tang Y, Li X, Liu Y, Zhang Y‐Y, Huang H‐Y et al. 2013. BMP4‐mediated brown fat‐like changes  in white adipose  tissue  alter  glucose  and  energy  homeostasis.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences 110(9):E798–E807. 

[42]  Boon MR, van den Berg SAA, Wang Y, van den Bossche J, Karkampouna S, Bauwens M et al. 2013. BMP7 Activates Brown Adipose Tissue and Reduces Diet‐Induced Obesity Only at Subthermoneutrality. PLoS ONE 8(9):e74083. 

[43]  Barbatelli G, Murano  I, Madsen L, Hao Q, Jimenez M, Kristiansen K et al. 2010. The emergence of cold‐induced brown  adipocytes  in  mouse  white  fat  depots  is  determined  predominantly  by  white  to  brown  adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology ‐ Endocrinology and Metabolism 298(6):E1244‐E1253. 

[44]  Cinti  S.  2002.  Adipocyte  differentiation  and  transdifferentiation:  Plasticity  of  the  adipose  organ.  Journal  of Endocrinological Investigation 25(10):823‐835. 

[45]  Lee  Y‐H,  Petkova  Anelia P, Mottillo  Emilio P,  Granneman  James G.  2012.  In Vivo  Identification  of  Bipotential Adipocyte Progenitors Recruited by β3‐Adrenoceptor Activation and High‐Fat Feeding. Cell Metabolism 15(4):480‐491. 

[46]  Lee Y‐H, Petkova AP, Konkar AA, Granneman JG. 2015. Cellular origins of cold‐induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal 29(1):286‐299. 

[47]  Rosenwald  M,  Perdikari  A,  Rülicke  T,  Wolfrum  C.  2013.  Bi‐directional  interconversion  of  brite  and white adipocytes. Nature Cell Biology 15(6):659‐667. 

[48]  Wang QA, Tao C, Gupta RK, Scherer PE. 2013. Tracking adipogenesis during white adipose  tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine 19(10):1338‐1344. 

[49]  Ye R, Wang QA, Tao C, Vishvanath L, Shao M, McDonald JG et al. 2015. Impact of tamoxifen on adipocyte lineage tracing: Inducer of adipogenesis and prolonged nuclear translocation of Cre recombinase. Molecular Metabolism 4(11):771‐778. 

[50]  Shimizu I, Aprahamian T, Kikuchi R, Shimizu A, Papanicolaou KN, MacLauchlan S et al. 2014. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation 124(5):2099‐2112. 

[51]  During MJ, Liu X, Huang W, Magee D, Slater A, McMurphy T et al. 2015. Adipose VEGF Links the White‐to‐Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli  in Male Mice. Endocrinology 156(6):2059‐2073. 

[52]  Hung C‐M, Calejman Camila M, Sanchez‐Gurmaches J, Li H, Clish Clary B, Hettmer S et al. 2014. Rictor/mTORC2 Loss  in  the Myf5 Lineage Reprograms Brown Fat Metabolism and Protects Mice against Obesity and Metabolic Disease. Cell Reports 8(1):256‐271. 

[53]  Kooijman S, van den Berg R, Ramkisoensing A, Boon MR, Kuipers EN, Loef M et al. 2015. Prolonged daily  light exposure  increases  body  fat mass  through  attenuation  of  brown  adipose  tissue  activity.  Proceedings  of  the National Academy of Sciences 112(21):6748‐6753. 

[54]  Enerback S, Jacobsson A, Simpson EM, Guerra C, Yamashita H, Harper M‐E et al. 1997. Mice lacking mitochondrial uncoupling protein are cold‐sensitive but not obese. Nature 387(6628):90‐94. 

Immune regulation in adipose tissue 

43  

[55]  Kontani  Y, Wang  Y,  Kimura  K,  Inokuma  KI,  Saito M,  Suzuki‐Miura  T  et  al.  2005.  UCP1  deficiency  increases susceptibility to diet‐induced obesity with age. Aging Cell 4(3):147‐155. 

[56]  Feldmann HM, Golozoubova V, Cannon B, Nedergaard J. 2009. UCP1 Ablation Induces Obesity and Abolishes Diet‐Induced  Thermogenesis  in Mice  Exempt  from  Thermal  Stress  by  Living  at  Thermoneutrality.  Cell Metabolism 9(2):203‐209. 

[57]  Lowell BB, S‐Susulic V, Hamann A, Lawitts  JA, Himms‐Hagen  J, Boyer BB et al. 1993. Development of obesity  in transgenic mice after genetic ablation of brown adipose tissue. Nature 366(6457):740‐742. 

[58]  Thomas SA, Palmiter RD. 1997. Thermoregulatory and metabolic phenotypes of mice  lacking noradrenaline and adrenaline. Nature 387(6628):94‐97. 

[59]  Bachman ES, Dhillon H, Zhang C‐Y, Cinti S, Bianco AC, Kobilka BK et al. 2002.  β‐AR Signaling Required  for Diet‐Induced Thermogenesis and Obesity Resistance. Science 297(5582):843‐845. 

[60]  Ukropec  J,  Anunciado  R,  Ravussin  Y,  Kozak  L.  2006.  Leptin  Is  Required  for Uncoupling  Protein‐1‐Independent Thermogenesis during Cold Stress. Endocrinology 147(5):2468‐2480. 

[61]  Syamsunarno MRAA, Iso T, Yamaguchi A, Hanaoka H, Putri M, Obokata M et al. 2014. Fatty Acid Binding Protein 4 and  5  Play  a  Crucial  Role  in  Thermogenesis  under  the  Conditions  of  Fasting  and  Cold  Stress.  PLoS  ONE 9(3):e90825. 

[62]  Muller  TD,  Lee  SJ,  Jastroch M,  Kabra  D,  Stemmer  K,  Aichler M  et  al.  2013.  p62  Links  β‐adrenergic  input  to mitochondrial function and thermogenesis. The Journal of Clinical Investigation 123(1):469‐478. 

[63]  Ravussin Y, Xiao C, Gavrilova O, Reitman ML. 2014. Effect of Intermittent Cold Exposure on Brown Fat Activation, Obesity, and Energy Homeostasis in Mice. PLoS ONE 9(1):e85876. 

[64]  Bartelt A, Bruns OT, Reimer R, Hohenberg H,  Ittrich H,  Peldschus K  et al.  2011. Brown  adipose  tissue  activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine 17(2):200‐205. 

[65]  Dong M, Yang X, Lim S, Cao Z, Honek J, Lu H et al. 2013. Cold Exposure Promotes Atherosclerotic Plaque Growth and Instability via UCP1‐Dependent Lipolysis. Cell Metabolism 18(1):118‐129. 

[66]  Himms‐Hagen J, Cui J, Danforth EJ, Taatjes D, Lang S, Waters B et al. 1994. Effect of CL‐316,243, a thermogenic beta  3‐agonist,  on  energy  balance  and  brown  and  white  adipose  tissues  in  rats.  The  American  Journal  of Physiology 266(4 pt 2):1371‐1382. 

[67]  Kopecky  J,  Clarke  G,  Enerback  S,  Spiegelman  B,  Kozak  LP.  1995.  Expression  of  the mitochondrial  uncoupling protein  gene  from  the  aP2  gene  promoter  prevents  genetic  obesity.  The  Journal  of  Clinical  Investigation 96(6):2914‐2923. 

[68]  Cederberg A, Grønning LM, Ahrén B, Taskén K, Carlsson P, Enerbäck S. 2001. FOXC2 Is a Winged Helix Gene that Counteracts Obesity, Hypertriglyceridemia, and Diet‐Induced Insulin Resistance. Cell 106(5):563‐573. 

[69]  Kim JK, Kim H‐J, Park S‐Y, Cederberg A, Westergren R, Nilsson D et al. 2005. Adipocyte‐Specific Overexpression of FOXC2  Prevents  Diet‐Induced  Increases  in  Intramuscular  Fatty  Acyl  CoA  and  Insulin  Resistance.  Diabetes 54(6):1657‐1663. 

[70]  Zhou Z, Yon Toh S, Chen Z, Guo K, Peng Ng C, Ponniah S et al. 2003. Cidea‐deficient mice have lean phenotype and are resistant to obesity. Nature Genetics 35(1):49‐56. 

[71]  Gunawardana SC, Piston DW. 2012. Reversal of Type 1 Diabetes  in Mice by Brown Adipose Tissue Transplant. Diabetes 61(3):674‐682. 

[72]  Stanford KI, Middelbeek RJW, Townsend KL, An D, Nygaard EB, Hitchcox KM et al. 2013. Brown adipose  tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. The Journal of Clinical Investigation 123(1):215‐223. 

[73]  Zhu Z, Spicer EG, Gavini CK, Goudjo‐Ako AJ, Novak CM, Shi H. 2014. Enhanced sympathetic activity  in mice with brown adipose tissue transplantation (transBATation). Physiology & Behavior 125(0):21‐29. 

[74]  Al‐Massadi  O,  Porteiro  B,  Kuhlow  D,  Köhler  M,  Gonzalez‐Rellan  MJ,  Garcia‐Lavandeira  M  et  al.  2016. Pharmacological  and Genetic Manipulation of p53  in Brown  Fat  at Adult But Not  Embryonic  Stages Regulates Thermogenesis and Body Weight in Male Mice. Endocrinology 157(7):2735‐2749. 

[75]  Laurila P‐P, Soronen J, Kooijman S, Forsström S, Boon MR, Surakka I et al. 2016. USF1 deficiency activates brown adipose tissue and improves cardiometabolic health. Science Translational Medicine 8(323):323ra13‐323ra13. 

[76]  Roberts‐Toler  C, O'Neill  BT,  Cypess AM.  2015. Diet‐induced  obesity  causes  insulin  resistance  in mouse  brown adipose tissue. Obesity 23(9):1765‐70. 

[77]  Petruzzelli M, Schweiger M, Schreiber R, Campos‐Olivas R, Tsoli M, Allen  J et al. 2014. A Switch  from White  to Brown Fat Increases Energy Expenditure in Cancer‐Associated Cachexia. Cell Metabolism 20(3):433‐447. 

[78]  Medrikova D, Sijmonsma TP, Sowodniok K, Richards DM, Delacher M, Sticht C et al. 2015. Brown Adipose Tissue Harbors a Distinct Sub‐Population of Regulatory T Cells. PLoS ONE 10(2):e0118534. 

[79]  Hui  X,  Gu  P,  Zhang  J,  Nie  T,  Pan  Y,  Wu  D  et  al.  2015.  Adiponectin  Enhances  Cold‐Induced  Browning  of Subcutaneous Adipose Tissue via Promoting M2 Macrophage Proliferation. Cell Metabolism 22(2):279‐290. 

[80]  Suarez‐Zamorano  N,  Fabbiano  S,  Chevalier  C,  Stojanovic  O,  Colin  DJ,  Stevanovic  A  et  al.  2015.  Microbiota depletion promotes browning of white adipose tissue and reduces obesity. Nature Medicine 21(12):1497‐1501. 

[81]  Chevalier  C,  Stojanović  O,  Colin  Didier J,  Suarez‐Zamorano  N,  Tarallo  V,  Veyrat‐Durebex  C  et  al.  2015.  Gut Microbiota Orchestrates Energy Homeostasis during Cold. Cell 163(6):1360‐1374. 

[82]  Sakamoto  T, Nitta  T, Maruno  K,  Yeh  YS,  Kuwata H,  Tomita  K  et  al.  2016. Macrophage  infiltration  into  obese adipose  tissues  suppresses  the  induction  of  UCP1  expression  in  mice.  American  Journal  of  Physiology  ‐ Endocrinology and Metabolism 310:E676‐E687. 

Chapter 2 

44  

[83]  Knudsen JG, Murholm M, Carey AL, Biensø RS, Basse AL, Allen TL et al. 2014. Role of IL‐6 in Exercise Training‐ and Cold‐Induced UCP1 Expression in Subcutaneous White Adipose Tissue. PLoS ONE 9(1):e84910. 

[84]  Yao  L,  Heuser‐Baker  J,  Herlea‐Pana  O,  Zhang  N,  Szweda  LI,  Griffin  TM  et  al.  2014.  Deficiency  in  adipocyte chemokine receptor CXCR4 exacerbates obesity and compromises thermoregulatory responses of brown adipose tissue in a mouse model of diet‐induced obesity. The FASEB Journal. 

[85]  Ursino MG, Vasina V, Raschi E, Crema F, De Ponti F. 2009. The β3‐adrenoceptor as a therapeutic target: Current perspectives. Pharmacological Research 59(4):221‐234. 

[86]  Labbé SM, Caron A, Bakan  I, Laplante M, Carpentier AC, Lecomte R et al. 2015.  In vivo measurement of energy substrate contribution to cold‐induced brown adipose tissue thermogenesis. The FASEB Journal 29(5):2046‐2058. 

[87]  Nikami H, Shimizu Y, Endoh D, Yano H, Saito M. 1992. Cold exposure  increases glucose utilization and glucose transporter  expression  in  brown  adipose  tissue.  Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications 185(3):1078‐1082. 

[88]  Dijk W, Heine M, Vergnes L, Boon MR, Schaart G, Hesselink MKC et al. 2015. ANGPTL4 mediates shuttling of lipid fuel to brown adipose tissue during sustained cold exposure. eLife 4:e08428. 

[89]  Hoeke G, Kooijman S, Boon MR, Rensen PCN, Berbée JFP. 2016. Role of brown fat in lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Circulation Research 118(1):173‐82. 

[90]  Khedoe PPSJ, Hoeke G, Kooijman S, Dijk W, Buijs JT, Kersten S et al. 2015. Brown adipose tissue takes up plasma triglycerides mostly after lipolysis. Journal of Lipid Research 56(1):51‐59. 

[91]  Qi J, Gong J, Zhao T, Zhao J, Lam P, Ye J et al. 2008. Downregulation of AMP‐activated protein kinase by Cidea‐mediated ubiquitination and degradation in brown adipose tissue. The EMBO Journal 27(11):1537‐1548. 

[92]  Geerling JJ, Boon MR, van der Zon GC, van den Berg SAA, van den Hoek AM, Lombès M et al. 2014. Metformin Lowers Plasma Triglycerides by Promoting VLDL‐Triglyceride Clearance by Brown Adipose Tissue in Mice. Diabetes 63(3):880‐891. 

[93]  Maeda K, Cao H, Kono K, Gorgun CZ, Furuhashi M, Uysal KT et al. 2005. Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes. Cell Metabolism 1(2):107‐119. 

[94]  Saito M, Okamatsu‐Ogura Y, Matsushita M, Watanabe K, Yoneshiro T, Nio‐Kobayashi J et al. 2009. High Incidence of Metabolically Active Brown Adipose Tissue  in Healthy Adult Humans: Effects of Cold Exposure and Adiposity. Diabetes 58(7):1526‐1531. 

[95]  Virtanen KA, Lidell ME, Orava J, Heglind M, Westergren R, Niemi T et al. 2009. Functional Brown Adipose Tissue in Healthy Adults. New England Journal of Medicine 360(15):1518‐1525. 

[96]  Orava J, Nuutila P, Lidell Martin E, Oikonen V, Noponen T, Viljanen T et al. 2011. Different Metabolic Responses of Human Brown Adipose Tissue to Activation by Cold and Insulin. Cell Metabolism 14(2):272‐279. 

[97]  Ouellet  V,  Labbé  SM,  Blondin DP,  Phoenix  S, Guérin  B, Haman  F  et  al.  2012.  Brown  adipose  tissue  oxidative metabolism  contributes  to  energy  expenditure  during  acute  cold  exposure  in  humans.  The  Journal  of  Clinical Investigation 122(2):545‐552. 

[98]  Parysow O, Mollerach AM, Jager V, Racioppi S, Roman JS, Gerbaudo VH. 2007. Low‐Dose Oral Propranolol Could Reduce  Brown  Adipose  Tissue  F‐18  FDG  Uptake  in  Patients  Undergoing  PET  Scans.  Clinical  Nuclear Medicine 32(5):351‐357. 

[99]  Cypess AM, Weiner  LS, Roberts‐Toler C,  Elía  EF, Kessler  SH, Kahn PA  et al.  2015. Activation of Human Brown Adipose Tissue by a β3‐Adrenergic Receptor Agonist. Cell Metabolism 21(1):33‐38. 

[100]  Xue R, Lynes MD, Dreyfuss JM, Shamsi F, Schulz TJ, Zhang H et al. 2015. Clonal analyses and gene profiling identify genetic  biomarkers  of  the  thermogenic  potential  of  human  brown  and white preadipocytes. Nature Medicine 21(7):760‐768. 

[101]  Shinoda K, Luijten IHN, Hasegawa Y, Hong H, Sonne SB, Kim M et al. 2015. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine 21(4):389‐394. 

[102]  Cypess AM, White AP, Vernochet C, Schulz TJ, Xue R, Sass CA et al. 2013. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nature Medicine 19(5):635‐639. 

[103]  Cypess AM,  Lehman S, Williams G, Tal  I, Rodman D, Goldfine AB et al. 2009.  Identification and  Importance of Brown Adipose Tissue in Adult Humans. New England Journal of Medicine 360(15):1509‐1517. 

[104]  Au‐Yong ITH, Thorn N, Ganatra R, Perkins AC, Symonds ME. 2009. Brown Adipose Tissue and Seasonal Variation in Humans. Diabetes 58(11):2583‐2587. 

[105]  Blondin DP, Labbé SM, Noll C, Kunach M, Phoenix S, Guérin B et al. 2015. Selective Impairment of Glucose but Not Fatty  Acid  or  Oxidative  Metabolism  in  Brown  Adipose  Tissue  of  Subjects  With  Type  2  Diabetes.  Diabetes 64(7):2388. 

[106]  Vijgen G, Bouvy N, Teule G, Brans B, Hoeks J, Schrauwen P et al. 2012. Increase in Brown Adipose Tissue Activity after Weight Loss  in Morbidly Obese Subjects. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 97(7):E1229‐E1233. 

[107]  van der Lans AAJJ, Hoeks J, Brans B, Vijgen GHEJ, Visser MGW, Vosselman MJ et al. 2013. Cold acclimation recruits human brown  fat and  increases nonshivering  thermogenesis. The  Journal of Clinical  Investigation 123(8):3395‐3403. 

[108]  Min SY, Kady  J, Nam M, Rojas‐Rodriguez R, Berkenwald A, Kim  JH et al. 2016. Human  'brite/beige' adipocytes develop  from  capillary  networks,  and  their  implantation  improves  metabolic  homeostasis  in  mice.  Nature Medicine 22(3):312‐318. 

Immune regulation in adipose tissue 

45  

[109]  Chondronikola M, Volpi  E,  Børsheim  E,  Porter  C, Annamalai  P,  Enerbäck  S  et  al.  2014.  Brown Adipose  Tissue Improves Whole‐Body Glucose Homeostasis and Insulin Sensitivity in Humans. Diabetes 63(12):4089‐4099. 

[110]  Lee P, Smith S, Linderman J, Courville AB, Brychta RJ, Dieckmann W et al. 2014. Temperature‐Acclimated Brown Adipose Tissue Modulates Insulin Sensitivity in Humans. Diabetes 63(11):3686‐3698. 

[111]  Takx R,  Ishai A, Truong QA, MacNabb MH, Scherrer‐Crosbie M, Tawakol A. 2016. Supraclavicular Brown adipose tissue FDG uptake and cardiovascular disease. Journal of Nuclear Medicine 57(8):1221‐1225. 

[112]  Boon MR,  Bakker  LEH,  van  der  Linden  RAD,  van  Ouwerkerk  AF,  de  Goeje  PL,  Counotte  J  et  al.  2015.  High prevalence of cardiovascular disease  in South Asians: Central  role  for brown adipose  tissue? Critical Reviews  in Clinical Laboratory Sciences 52(3):150‐157. 

[113]  Lee  P,  Bova  R,  Schofield  L,  Bryant W, Dieckmann W,  Slattery  A  et  al.  2016.  Brown  Adipose  Tissue  Exhibits  a Glucose‐Responsive Thermogenic Biorhythm in Humans. Cell Metabolism 23(4):602‐609. 

[114]  Hanssen MJW, Wierts R, Hoeks J, Gemmink A, Brans B, Mottaghy FM et al. 2015. Glucose uptake in human brown adipose tissue is impaired upon fasting‐induced insulin resistance. Diabetologia 58(3):586‐595. 

[115]  Boon MR, Kooijman S, van Dam AD, Pelgrom LR, Berbée JFP, Visseren CAR et al. 2014. Peripheral cannabinoid 1 receptor blockade activates brown adipose  tissue and diminishes dyslipidemia and obesity. The FASEB  Journal 28(12):5361‐5375. 

[116]  van Dam AD, Nahon KJ, Kooijman S, van den Berg SM, Kanhai AA, Kikuchi T et al. 2015. Salsalate Activates Brown Adipose Tissue in Mice. Diabetes 64(5):1544‐1554. 

[117]  Kooijman  S, Wang  Y,  Parlevliet  ET,  Boon MR,  Edelschaap  D,  Snaterse  G  et  al.  2015.  Central  GLP‐1  receptor signalling accelerates plasma clearance of triacylglycerol and glucose by activating brown adipose tissue in mice. Diabetologia 58(11):2637‐2646. 

[118]  Lumeng  CN,  Saltiel  AR.  2011.  Inflammatory  links  between  obesity  and metabolic  disease.  Journal  of  Clinical Investigation 121(6):2111‐2117. 

[119]  Ouchi N, Parker JL, Lugus JJ, Walsh K. 2011. Adipokines  in  inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology 11(2):85‐97. 

[120]  Chawla A, Nguyen KD, Goh YPS. 2011. Macrophage‐mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology 11(11):738‐749. 

[121]  Hotamisligil G, Shargill N, Spiegelman B. 1993. Adipose expression of tumor necrosis  factor‐alpha: direct role  in obesity‐linked insulin resistance. Science 259(5091):87‐91. 

[122]  Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M,  Leibel RL, Ferrante AW,  Jr. 2003. Obesity  is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation 112(12):1796‐1808. 

[123]  Mathis D. 2013. Immunological Goings‐on in Visceral Adipose Tissue. Cell Metabolism 17(6):851‐859. [124]  Lumeng  CN,  Bodzin  JL,  Saltiel  AR.  2007.  Obesity  induces  a  phenotypic  switch  in  adipose  tissue macrophage 

polarization. The Journal of Clinical Investigation 117(1):175‐184. [125]  Gregor  MF,  Hotamisligil  GS.  2011.  Inflammatory  Mechanisms  in  Obesity.  Annual  Review  of  Immunology 

29(1):415‐445. [126]  Perreault M, Marette A. 2001.  Targeted disruption of  inducible nitric oxide  synthase protects  against obesity‐

linked insulin resistance in muscle. Nature Medicine 7(10):1138‐1143. [127]  Patsouris D, Li P‐P, Thapar D, Chapman J, Olefsky JM, Neels JG. 2008. Ablation of CD11c‐Positive Cells Normalizes 

Insulin Sensitivity in Obese Insulin Resistant Animals. Cell Metabolism 8(4):301‐309. [128]  Elgazar‐Carmon V, Rudich A, Hadad N, Levy R. 2008. Neutrophils transiently infiltrate intra‐abdominal fat early in 

the course of high‐fat feeding. Journal of Lipid Research 49(9):1894‐1903. [129]  Talukdar S, Oh DY, Bandyopadhyay G, Li D, Xu J, McNelis J et al. 2012. Neutrophils mediate  insulin resistance  in 

mice fed a high‐fat diet through secreted elastase. Nature Medicine 18(9):1407‐1412. [130]  Wu D, Molofsky AB, Liang H‐E, Ricardo‐Gonzalez RR, Jouihan HA, Bando JK et al. 2011. Eosinophils Sustain Adipose 

Alternatively Activated Macrophages Associated with Glucose Homeostasis. Science 332(6026):243‐247. [131]  Odegaard JI, Ricardo‐Gonzalez RR, Goforth MH, Morel CR, Subramanian V, Mukundan L et al. 2007. Macrophage‐

specific PPARγ controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature 447(7148):1116‐1120. [132]  Duffaut  C,  Zakaroff‐Girard A, Bourlier V, Decaunes  P, Maumus M,  Chiotasso  P  et  al.  2009.  Interplay Between 

Human Adipocytes and T Lymphocytes in Obesity: CCL20 as an Adipochemokine and T Lymphocytes as Lipogenic Modulators. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 29(10):1608‐1614. 

[133]  Feuerer M, Herrero L, Cipolletta D, Naaz A, Wong J, Nayer A et al. 2009. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine 15(8):930‐939. 

[134]  Nishimura S, Manabe I, Nagasaki M, Eto K, Yamashita H, Ohsugi M et al. 2009. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine 15(8):914‐920. 

[135]  Chatzigeorgiou  A,  Karalis  KP,  Bornstein  SR,  Chavakis  T.  2012.  Lymphocytes  in  obesity‐related  adipose  tissue inflammation. Diabetologia 55(10):2583‐2592. 

[136]  Winer S, Chan Y, Paltser G, Truong D, Tsui H, Bahrami  J et al. 2009. Normalization of obesity‐associated  insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine 15(8):921‐929. 

[137]  Winer  S,  Winer  DA.  2012.  The  adaptive  immune  system  as  a  fundamental  regulator  of  adipose  tissue inflammation and insulin resistance. Immunology & Cell Biology 90(8):755‐762. 

[138]  Winer DA, Winer S, Shen L, Wadia PP, Yantha J, Paltser G et al. 2011. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine 17(5):610‐617. 

Chapter 2 

46  

[139]  Liu  J,  Divoux  A,  Sun  J,  Zhang  J,  Clement  K, Glickman  JN  et  al.  2009. Genetic  deficiency  and  pharmacological stabilization of mast cells reduce diet‐induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine 15(8):940‐945. 

[140]  Tian Xiao Y, Ganeshan K, Hong C, Nguyen Khoa D, Qiu Y, Kim  J et al. 2016. Thermoneutral Housing Accelerates Metabolic Inflammation to Potentiate Atherosclerosis but Not Insulin Resistance. Cell Metabolism 23(1):165‐178. 

[141]  Stemmer K, Kotzbeck P, Zani F, Bauer M, Neff C, Muller TD et al. 2015. Thermoneutral housing is a critical factor for immune function and diet‐induced obesity in C57BL/6 nude mice. International Journal of Obesity 39(5):791‐797. 

[142]  Orozco‐Solis R, Aguilar‐Arnal L, Murakami M, Peruquetti R, Ramadori G, Coppari R et al. 2016. The Circadian Clock in the Ventromedial Hypothalamus Controls Cyclic Energy Expenditure. Cell Metabolism 23(3):467‐478. 

[143]  Martínez de Morentin Pablo B, González‐García I, Martins L, Lage R, Fernández‐Mallo D, Martínez‐Sánchez N et al. 2014.  Estradiol  Regulates  Brown  Adipose  Tissue  Thermogenesis  via  Hypothalamic  AMPK.  Cell  Metabolism 20(1):41‐53. 

[144]  Rogers NH, Perfield  JW, Strissel KJ, Obin MS, Greenberg AS. 2009. Reduced Energy Expenditure and  Increased Inflammation Are Early Events in the Development of Ovariectomy‐Induced Obesity. Endocrinology 150(5):2161‐2168. 

[145]  Hatori M, Vollmers C, Zarrinpar A, DiTacchio L, Bushong Eric A, Gill S et al. 2012. Time‐Restricted Feeding without Reducing Caloric Intake Prevents Metabolic Diseases in Mice Fed a High‐Fat Diet. Cell Metabolism 15(6):848‐860. 

[146]  Beiroa D, Imbernon M, Gallego R, Senra A, Herranz D, Villarroya F et al. 2014. GLP‐1 Agonism Stimulates Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Browning Through Hypothalamic AMPK. Diabetes 63(10):3346. 

[147]  Lee YS, Park MS, Choung JS, Kim SS, Oh HH, Choi CS et al. 2012. Glucagon‐like peptide‐1  inhibits adipose tissue macrophage infiltration and inflammation in an obese mouse model of diabetes. Diabetologia 55(9):2456‐2468. 

[148]  Wang  Y,  Parlevliet  ET, Geerling  JJ,  van  der  Tuin  SJL,  Zhang H, Bieghs V  et  al.  2014.  Exendin‐4  decreases  liver inflammation  and  atherosclerosis  development  simultaneously  by  reducing  macrophage  infiltration.  British Journal of Pharmacology 171(3):723‐734. 

[149]  McGregor RA, Kwon EY, Shin SK, Jung UJ, Kim E, Park JHY et al. 2013. Time‐course microarrays reveal modulation of developmental, lipid metabolism and immune gene networks in intrascapular brown adipose tissue during the development of diet‐induced obesity. International Journal of Obesity 37(12):1524‐1531. 

[150]  Bae  J,  Ricciardi  CJ,  Esposito  D,  Komarnytsky  S,  Hu  P,  Curry  BJ  et  al.  2014.  Activation  of  pattern  recognition receptors  in  brown  adipocytes  induces  inflammation  and  suppresses  uncoupling  protein  1  expression  and mitochondrial respiration. American journal of physiology cell physiology 306(10):C918‐C930. 

[151]  Liu P‐S, Lin Y‐W, Burton FH, Wei L‐N. 2015. M1‐M2 balancing act in white adipose tissue browning – a new role for RIP140. Adipocyte 4(2):146‐148. 

[152]  Brown SW, Meyers RT, Brennan KM, Rumble JM, Narasimhachari N, Perozzi EF et al. 2003. Catecholamines  in a macrophage cell line. Journal of Neuroimmunology 135(1–2):47‐55. 

[153]  Stanojević  S, Dimitrijević M,  Kuštrimović N, Mitić  K, Vujić V,  Leposavić G.  2013. Adrenal hormone  deprivation affects macrophage catecholamine metabolism and β2‐adrenoceptor density, but not propranolol stimulation of tumour necrosis factor‐α production. Experimental Physiology 98(3):665‐678. 

[154]  Grailer  JJ,  Haggadone MD,  Sarma  JV,  Zetoune  FS, Ward  PA.  2014.  Induction  of M2  Regulatory Macrophages through the β2‐Adrenergic Receptor with Protection during Endotoxemia and Acute Lung Injury. Journal of Innate Immunity 6(5):607‐618. 

[155]  Brestoff JR, Artis D. 2015.  Immune Regulation of Metabolic Homeostasis  in Health and Disease. Cell 161(1):146‐160. 

[156]  Flach M, Diefenbach A. 2015. Adipose Tissue: ILC2 Crank Up the Heat. Cell Metabolism 21(2):152‐153. [157]  Ding X, Luo Y, Zhang X, Zheng H, Yang X, Yang X et al. 2016. IL‐33‐driven ILC2/eosinophil axis in fat is induced by 

sympathetic tone and suppressed by obesity. Journal of Endocrinology 231(1):35‐48. [158]  Fabbiano S, Suárez‐Zamorano N, Rigo D, Veyrat‐Durebex C, Stevanovic Dokic A, Colin Didier J et al. 2016. Caloric 

Restriction  Leads  to  Browning  of White  Adipose  Tissue  through  Type  2  Immune  Signaling.  Cell Metabolism 24(3):434‐446. 

[159]  Kumari M, Wang X, Lantier L, Lyubetskaya A, Eguchi J, Kang S et al. 2016.  IRF3 promotes adipose  inflammation and insulin resistance and represses browning. The Journal of Clinical Investigation 126(8):2839‐2854. 

[160]  Okla M, Wang W, Kang  I, Pashaj A, Carr T, Chung S. 2015. Activation of Toll‐like Receptor 4  (TLR4) Attenuates Adaptive Thermogenesis via Endoplasmic Reticulum Stress. Journal of Biological Chemistry 290(44):26476‐26490. 

[161]  Kong X, Banks A,  Liu T, Kazak  L, Rao Rajesh R, Cohen P et al. 2014.  IRF4  Is a Key Thermogenic Transcriptional Partner of PGC‐1α. Cell 158(1):69‐83. 

[162]  Satoh T, Takeuchi O, Vandenbon A, Yasuda K, Tanaka Y, Kumagai Y et al. 2010. The Jmjd3‐Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection. Nature Immunology 11(10):936‐944. 

[163]  Bhattacharya I, Domínguez AP, Drägert K, Humar R, Haas E, Battegay EJ. 2015. Hypoxia potentiates tumor necrosis factor‐α  induced  expression  of  inducible  nitric  oxide  synthase  and  cyclooxygenase‐2  in  white  and  brown adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 461(2):287‐292. 

[164]  Nisoli E, Briscini L, Giordano A, Tonello C, Wiesbrock SM, Uysal KT et al. 2000. Tumor necrosis factor α mediates apoptosis of brown adipocytes and defective brown adipocyte  function  in obesity. Proceedings of  the National Academy of Sciences 97(14):8033‐8038. 

Immune regulation in adipose tissue 

47  

[165]  Valerio A, Cardile A, Cozzi V, Bracale R, Tedesco L, Pisconti A et al. 2006. TNF‐α downregulates eNOS expression and  mitochondrial  biogenesis  in  fat  and  muscle  of  obese  rodents.  The  Journal  of  Clinical  Investigation 116(10):2791‐2798. 

[166]  Sakamoto  T,  Takahashi N,  Sawaragi  Y, Naknukool  S,  Yu  R, Goto  T  et  al.  2013.  Inflammation  induced  by  RAW macrophages suppresses UCP1 mRNA induction via ERK activation in 10T1/2 adipocytes. The American Journal of Physiology ‐ Cell Physiology 304(8):C729‐C738. 

[167]  Moisan A, Lee Y‐K, Zhang JD, Hudak CS, Meyer CA, Prummer M et al. 2015. White‐to‐brown metabolic conversion of human adipocytes by JAK inhibition. Nature Cell Biology 17(1):57‐67. 

[168]  Mauer J, Chaurasia B, Goldau J, Vogt MC, Ruud J, Nguyen KD et al. 2014. Signaling by  IL‐6 promotes alternative activation of macrophages to limit endotoxemia and obesity‐associated resistance to insulin. Nature Immunology 15(5):423‐430. 

[169]  Weiss  R, Dziura  J,  Burgert  TS,  Tamborlane WV,  Taksali  SE,  Yeckel  CW  et  al.  2004. Obesity  and  the Metabolic Syndrome in Children and Adolescents. New England Journal of Medicine 350(23):2362‐2374. 

[170]  Kim H‐J, Higashimori T, Park S‐Y, Choi H, Dong J, Kim Y‐J et al. 2004. Differential Effects of Interleukin‐6 and ‐10 on Skeletal Muscle and Liver Insulin Action In Vivo. Diabetes 53(4):1060‐1067. 

[171]  Wallenius V, Wallenius K, Ahren B, Rudling M, Carlsten H, Dickson  SL  et al. 2002.  Interleukin‐6‐deficient mice develop mature‐onset obesity. Nature Medicine 8(1):75‐79. 

[172]  Di Gregorio GB, Hensley L, Lu T, Ranganathan G, Kern PA. 2004. Lipid and carbohydrate metabolism in mice with a targeted  mutation  in  the  IL‐6  gene:  absence  of  development  of  age‐related  obesity.  American  Journal  of Physiology ‐ Endocrinology and Metabolism 287(1):E182‐E187. 

[173]  Wernstedt  I, Edgley A, Berndtsson A, Fäldt  J, Bergström G, Wallenius V et al. 2006. Reduced  stress‐ and  cold‐induced  increase  in  energy  expenditure  in  interleukin‐6‐deficient  mice.  American  Journal  of  Physiology  ‐ Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 291(3):R551‐R557. 

[174]  Tang L, Okamoto S, Shiuchi T, Toda C, Takagi K, Sato T et al. 2015. Sympathetic Nerve Activity Maintains an Anti‐Inflammatory  State  in  Adipose  Tissue  in  Male  Mice  by  Inhibiting  TNF‐α  Gene  Expression  in  Macrophages. Endocrinology 156(10):3680‐3694. 

[175]  Anderson  EK,  Gutierrez  DA,  Hasty  AH.  2010.  Adipose  tissue  recruitment  of  leukocytes.  Current  Opinion  in Lipidology 21(3):172‐177. 

[176]  Sengenès C, Miranville A, Maumus M, de Barros S, Busse R, Bouloumié A. 2007. Chemotaxis and Differentiation of Human  Adipose  Tissue  CD34+/CD31−  Progenitor  Cells:  Role  of  Stromal Derived  Factor‐1  Released  by  Adipose Tissue Capillary Endothelial Cells. Stem Cells 25(9):2269‐2276. 

[177]  Herder  C, Hauner H,  Kempf  K,  Kolb H,  Skurk  T.  2006.  Constitutive  and  regulated  expression  and  secretion  of interferon‐[gamma]‐inducible protein 10  (IP‐10//CXCL10)  in human adipocytes.  International  Journal of Obesity 31(3):403‐410. 

[178]  Shi H, Kokoeva MV, Inouye K, Tzameli I, Yin H, Flier JS. 2006. TLR4  links  innate  immunity and fatty acid–induced insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation 116(11):3015‐3025. 

[179]  Lee  JY, Plakidas A, Lee WH, Heikkinen A, Chanmugam P, Bray G et al. 2003. Differential modulation of Toll‐like receptors  by  fatty  acids:  preferential  inhibition  by  n‐3  polyunsaturated  fatty  acids.  Journal  of  Lipid  Research 44(3):479‐486. 

[180]  Yore Mark M, Syed I, Moraes‐Vieira Pedro M, Zhang T, Herman Mark A, Homan Edwin A et al. 2014. Discovery of a Class of Endogenous Mammalian Lipids with Anti‐Diabetic and Anti‐inflammatory Effects. Cell 159(2):318‐332. 

[181]  Cao H, Gerhold K, Mayers JR, Wiest MM, Watkins SM, Hotamisligil GS. 2008. Identification of a Lipokine, a Lipid Hormone Linking Adipose Tissue to Systemic Metabolism. Cell 134(6):933‐944. 

[182]  Kuda O, Brezinova M, Rombaldova M, Slavikova B, Posta M, Beier P et al. 2016. Docosahexaenoic Acid–Derived Fatty Acid Esters of Hydroxy Fatty Acids (FAHFAs) With Anti‐inflammatory Properties. Diabetes 65(9):2580. 

[183]  Hodson L, Karpe F. 2013.  Is there something special about palmitoleate? Current Opinion  in Clinical Nutrition & Metabolic Care 16(2):225‐231. 

[184]  Bartelt A, Weigelt C, Cherradi ML, Niemeier A, Tödter K, Heeren  J et al. 2013. Effects of adipocyte  lipoprotein lipase on de novo lipogenesis and white adipose tissue browning. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) ‐ Molecular and Cell Biology of Lipids 1831(5):934‐942. 

[185]  Oh DY, Talukdar S, Bae EJ, Imamura T, Morinaga H, Fan W et al. 2010. GPR120 Is an Omega‐3 Fatty Acid Receptor Mediating Potent Anti‐inflammatory and Insulin‐Sensitizing Effects. Cell 142(5):687‐698. 

[186]  Rosell M, Kaforou M, Frontini A, Okolo A, Chan Y‐W, Nikolopoulou E et al. 2014. Brown and white adipose tissues: intrinsic differences in gene expression and response to cold exposure in mice. American Journal of Physiology ‐ Endocrinology And Metabolism 306(8):E945. 

[187]  Schilperoort  M,  Hoeke  G,  Kooijman  S,  Rensen  PCN.  2016.  Relevance  of  lipid  metabolism  for  brown  fat visualization and quantification. Current Opinion in Lipidology 27(3):242‐248. 

[188]  Frontini A, Vitali A, Perugini J, Murano I, Romiti C, Ricquier D et al. 2013. White‐to‐brown transdifferentiation of omental adipocytes in patients affected by pheochromocytoma. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) ‐ Molecular and Cell Biology of Lipids 1831(5):950‐959. 

[189]  Sidossis  L, Kajimura S. 2015. Brown and beige  fat  in humans:  thermogenic adipocytes  that  control energy and glucose homeostasis. The Journal of Clinical Investigation 125(2):478‐486. 

Chapter 2 

48  

[190]  Guigas B, Molofsky AB. 2015. A worm of one's own: how helminths modulate host adipose tissue  function and metabolism. Trends in Parasitology 31(9):435‐441. 

[191]  Odegaard  JI,  Chawla  A.  2013.  Pleiotropic  Actions  of  Insulin  Resistance  and  Inflammation  in  Metabolic Homeostasis. Science 339(6116):172‐177. 

[192]  Rothwell  NJ,  Stock  MJ.  1979.  A  role  for  brown  adipose  tissue  in  diet‐induced  thermogenesis.  Nature 281(5726):31‐5. 

[193]  Giordano  A,  Frontini  A,  Cinti  S.  2016.  Convertible  visceral  fat  as  a  therapeutic  target  to  curb  obesity. Nature Reviews Drug Discovery advance online publication. 

[194]  Varga  T,  Czimmerer  Z,  Nagy  L.  2011.  PPARs  are  a  unique  set  of  fatty  acid  regulated  transcription  factors controlling both lipid metabolism and inflammation. Biochimica et Biophysica Acta 1812(8):1007‐1022. 

[195]  Walgren MC,  Young  JB, Kaufman  LN,  Landsberg  L. 1987.  The effects of  various  carbohydrates on  sympathetic activity in heart and interscapular brown adipose tissue of the rat. Metabolism 36(6):585‐594. 

 

 

3 

 

Diet‐inducedobesityinducesrapidinflammatorychangesinbrownadiposetissueinmice

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Susan  M.  van  den  Berg1,  Andrea  D.  van  Dam2,3,  Tom  T.P.  Seijkens1,  Pascal  J.H.  Kusters1,  Linda 

Beckers1, Myrthe den Toom1, Ntsiki M. Held4, Saskia van der Velden1, Jan Van den Bossche1, Mariëtte 

R. Boon2,3, Patrick C.N. Rensen2,3, Esther Lutgens*,1,5, Menno P.J. de Winther*,1,5  

1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, 

the Netherlands 2Department of Medicine, Division Endocrinology, Leiden University Medical Center, Leiden, the Netherlands 3Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden, the Netherlands 4Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, University of Amsterdam, The Netherlands 5Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig Maximilian’s University, Munich, Germany 

 

*these authors contributed equally to this work. 

 

Submitted 

Chapter 3 

50  

Abstract 

Brown adipose tissue (BAT) contributes to non‐shivering thermogenesis by burning glucose and fat to 

produce  heat.  Obesity  is  associated with  a  loss  of  BAT  activity.  In  obesity, white  adipose  tissue 

inflammation  contributes  to metabolic  disorders. We  aimed  to  investigate  if  diet‐induced  obesity 

also  induces  inflammation  in BAT and  if this affects brown adipocyte activity. We performed a time 

course of diet‐induced obesity ranging from 1 day to 18 weeks by feeding mice a 45% high fat diet 

and subsequently analysed BAT biology. Furthermore, we stimulated a brown adipocyte cell line with 

the cytokines TNF, IFNγ, and LPS to mimic a pro‐inflammatory environment. BAT rapidly accumulated 

lipids after short term high‐fat diet (3 days). Macrophage numbers as well as cytokine and chemokine 

gene  expression  in  BAT  increased  along  with  this  increased  lipid  storage.  Surprisingly,  brown 

adipocytes  in  vitro  were  very  capable  of  producing  a  variety  of  chemokines  in  response  to 

inflammatory  stimuli.  BAT  is  a  very  plastic  tissue, which  is  rapidly  remodelled  upon  diet‐induced 

obesity. This  remodelling  is  characterized by a  swift  recruitment of macrophages and  induction of 

inflammatory mediators. Moreover, brown adipocytes themselves may be cytokine producers in the 

inflammatory profile of BAT.  

 

 

Brown adipose tissue in obesity 

51  

Introduction 

Brown  adipose  tissue  (BAT)  contributes  to  adaptive  thermogenesis  by  burning  glucose  and  fat  to 

produce heat [1]. Brown adipocytes have many small lipid droplets and numerous mitochondria that 

contain  large  amounts  of  uncoupling  protein  1  (UCP1).  This  protein  mediates  the  thermogenic 

function by increasing the permeability of the inner mitochondrial membrane, which causes protons 

to flux back into the mitochondrial matrix, bypassing ATP synthesis, ultimately resulting in generation 

of heat [2]. Cold activates the hypothalamus in the brain, which stimulates the sympathetic nervous 

system (SNS) to produce noradrenaline. In turn, noradrenaline activates brown adipocytes by binding 

to β3‐adrenergic receptors on their surface [3]. 

 

BAT was previously known to be present  in human new‐borns and rodents, but  interest  in BAT has 

rapidly  increased  since  active  BAT  depots  were  visualized  in  human  adults.  Cold‐activated 

metabolically‐active  adipose  tissue  was  shown  by  18F‐fluorodeodeoxy‐glucose  positron  emission 

tomography computed tomography  ([18F]FDG‐PET/CT)  imaging, mostly  in the supraclavicular region 

[4‐6].  Furthermore,  repeated  cold  exposure  as  well  as  a  single  oral  dose  of  mirabegron,  a  β3‐

adrenergic receptor agonist,  increases  the uptake of  [18F]FDG  in  the supraclavicular region  [4, 7‐9]. 

Mouse models  with  genetically  decreased  BAT  activity  often  show  a  cold  sensitive‐  but  also  an 

obesogenic phenotype [10]. Examples  include UCP1 knockout mice,  leptin‐deficient ob/ob mice and 

mice that lack all three β‐adrenergic receptor knockout mice [11‐13]. 

 

White  adipose  tissue  (WAT)  stores  energy,  whereas  active  BAT  increases  energy  expenditure. 

Intriguingly, BAT activity, measured by [18F]FDG uptake, is inversely correlated with body mass index 

[4]. Since obesity is one of the most prevalent chronic disorders worldwide and increases the risk of a 

variety  of  comorbidities  including  insulin  resistance  and  cardiovascular  disease,  it  could  be 

therapeutically beneficial to increase the amount and activity of BAT, which would result in increased 

energy expenditure and reduce body fat. 

 

Adipose  tissue  contains a variety of  immune  cells,  including macrophages, eosinophils and T  cells, 

which  contribute  to  tissue homeostasis  [14].  In obesity, hypertrophy of white  adipocytes  leads  to 

hypoxia, cell death and tissue dysfunction. This causes recruitment of a variety of immune cells and 

interferes  with  tissue  homeostasis  [15].  Inflammation  is  a  key  feature  of  obesity  and  insulin 

resistance [16]. The recruitment of pro‐inflammatory macrophages  is a critical event  in obese WAT 

inflammation  [14, 17, 18]. Macrophages  in  lean healthy WAT mainly exhibit  an  anti‐inflammatory 

phenotype,  whereas  in  obese  WAT,  the  number  of  pro‐inflammatory  “classically‐activated” 

macrophages  increases  [14].  Adipocytes  as  well  as  immune  cells  in  obese  WAT  produce  pro‐

inflammatory cytokines, including TNF, IL‐6, CCL2 (Mcp‐1), CCL4 (Mip‐1b) and CXCL12 (SDF‐1), which 

further propagate the ongoing  inflammatory response, both within the tissue and systemically [19‐

23]. 

 

Whether and how  immune cells play a role  in (obese) BAT  is  largely unknown [10]. Similar to WAT, 

obese  BAT  shows  decreased  insulin  signalling  and  increased  gene  expression  of  the macrophage 

marker Adgre1  (encoding  F4/80),  and  gene  expression  of  cytokines  Tnf,  Il6  and  Ccl2  increases  in 

obese  BAT  in mice  [21,  24,  25].  The  pro‐inflammatory  cytokine  TNF  suppresses  UCP1  in  brown 

Chapter 3 

52  

adipocytes,  suggesting a decreased activity of BAT  in an obese environment  [25‐28]. Furthermore, 

anti‐inflammatory  macrophages  were  shown  to  contribute  to  BAT  activation  as  cold  exposure 

increased macrophage markers  in  both WAT  and  BAT  in mice,  and  absence  of  anti‐inflammatory 

macrophages blunted BAT activity and  induced cold  intolerance  [29]. However, subsequent studies 

showed no effect on adaptive thermogenesis upon depletion of macrophages in BAT [30]. 

 

As BAT activation can be beneficial  in combatting obesity,  it  is critical to understand what underlies 

BAT function in an obese state. Here, we determined whether and when the immune system in BAT 

is  affected by  a high‐fat diet  (HFD), by  studying  a  time  course  of HFD  in which  8  groups of mice 

received a HFD ranging from 1 day to 18 weeks. We studied short‐term and long‐term immunological 

adipose  tissue  changes  upon  a HFD  and  compared WAT  and  BAT. Additionally, we  tested  brown 

adipocyte functioning in vitro under inflammatory conditions. 

Materials and methods 

Mice 

Age‐matched male wild‐type C57Bl/6 mice (Charles River) received different durations of HFD (45% 

kcal fat, 35% kcal carbohydrate, 20% kcal protein, Special Diets Services, Witham, United Kingdom). 

All mice were  included  in  the experiments at  the age of 7 weeks and were given a HFD  in a  time 

course ranging from 1 day up to 18 weeks before being sacrificed at the age of 25 weeks (8 groups of 

n=10‐11). Mice had ad libitum access to food and water and were maintained under a 12 hour light‐

dark  cycle. Mice  were  fasted  overnight,  weighed  and  subsequently  euthanized  using  0.25 mg/g 

ketamine  and  0.05  mg/g  xylazine.  Glucose  levels  were  measured  from  whole  blood  using  a 

glucometer (Bayercontour, Basel, Switzerland). Blood was obtained by cardiac puncture using EDTA‐

filled syringes and  liver, spleen,  interscapular BAT, epididymal WAT  (EpAT) and subcutaneous WAT 

(ScAT)  were  dissected  and  weighed.  All  experimental  procedures  were  approved  by  the  Animal 

Experimentation Ethics Committee of the University of Amsterdam. 

Histology 

Tissues  were  collected,  fixed  in  4%  paraformaldehyde  and  embedded  in  paraffin.  The  area  of 

intracellular lipid vacuoles in BAT was quantified on a haematoxylin and eosin staining using ImageJ 

software  (NIH,  USA).  Immunohistochemistry  on  EpAT  and  ScAT  was  performed  for  CD45  (clone 

30F11, BD Biosciences, Breda,  the Netherlands). Frozen BAT sections were stained  for CD68  (clone 

FA‐11, Bio‐Rad, Veenendaal, the Netherlands) and quantified in ImageJ (NIH, USA).

Real‐time PCR 

Total RNA was extracted using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and reverse transcribed with an 

iScript  cDNA  synthesis  kit  (Bio‐Rad,  Veenendaal,  the  Netherlands).  The  quantitative  PCR  was 

performed using a SYBR green PCR kit and a ViiA7 RT‐PCR system (Applied Biosystems, Leusden, the 

Netherlands). Expression was normalized to the housekeeping genes Rplp0, β‐Actin and cycloA. The 

results are expressed as relative to the control group, which was assigned a value of 1. 

Culture and differentiation of brown adipocytes  

T37i cells were kindly provided by Marc Lombès [31] and cultured in DMEM‐F12 Glutamax, 10% FCS, 

penicillin  (100 U/ml)  and  streptomycin  (100 µg/ml)  (ThermoFisher  Scientific, Waltham, MA, USA). 

Brown adipose tissue in obesity 

53  

After  growing  confluent,  cells were  differentiated  by  adding  2  nM  Triiodothyronine  (T3)  (Sigma‐

Aldrich, Zwijndrecht,  the Netherlands) and 112 ng/ml  insulin  (Sigma‐Aldrich)  to  the media. After 9 

days  of  differentiation,  the  cells were  stimulated with  10  ng/ml  TNF  (Invitrogen),  100 U/ml  IFNγ 

(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) or 20 ng/ml LPS (Sigma) for 24 hours. Supernatant was collected for 

ELISA and cells were harvested for RNA analysis. 

Transwell migration assay 

RAW264.7 macrophages (5x104) were seeded in a 24‐well transwell migration assay with 8 µm pores 

(Sigma‐Aldrich)  and  incubated  for  3  hours  with  supernatant  from  differentiated  T37i  brown 

adipocytes. Macrophages were fixed with 4% formaldehyde, washed and stained with 5% toluidine 

blue. Non‐migrated cells were swiped with a cotton tip and migrated cells counted  in  ImageJ  (NIH, 

USA). 

ELISA 

IL‐6  (Invitrogen)  and  CXCL1  (R&D  systems, Minneapolis, MN,  USA)  were  quantified  by  ELISA  in 

accordance to the suppliers’ protocols. 

Statistics  

Results are presented as mean ± SEM. Analysis between more than two groups  in  the  time course 

experiments were done by a one‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group 

was expressed relative to the control group. Analysis between two groups was done by a Student’s t 

test. Statistics were calculated in GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). P‐

values <0.05 were considered significant. 

Results 

Adipose tissue changes in a HFD‐time course  

Eight  groups  of  mice  were  fed  a  HFD  for  different  durations  in  time  (Figure  1A).  Body  weight 

increased after  two weeks of HFD and  continued  to  increase  throughout  the experiment, without 

major changes in liver or spleen weight (Table 1). Blood glucose levels already increased after 1 day 

of HFD and remained high in all HFD groups (Table 1). 

Table 1. General characteristics of mice in the course of DIO    Weeks of HFD 

Mean ± SEM (p)a 

  0  1d  3d  1w  2w  4w  10w  18w 

Body weight 

(g) 

27.3  ± 0.6 

29.5  ± 0.6 

31.1  ± 0.8 

31.5  ± 0.5 

34.4  ± 0.9 (***) 

36.5  ± 1.2 (***) 

38.1  ± 0.9 (***) 

41.3  ± 2.0  (***) 

Glucose 

(mg/dl) 

69  

± 3 

130  

± 15 

(***) 

118  

± 7  

(**) 

123  

± 4 

(***) 

104  

± 5  

(*) 

91  

± 4 

112  

± 9  

(**) 

124  

± 7  

(***) 

Liver (g)  1.21 ± 

0.05 

1.30 ± 

0.05 

1.32 ± 

0.05 

1.24 ± 

0.03 

1.22 ± 

0.02 

1.19 ± 

0.04 

1.11 ± 

0.04 

1.39 ± 0.09 

Spleen (mg)  83.6 ± 5.7  71.7 ± 3.3  87.3 ± 3.4  88.0 ± 7.5  85.3 ± 3.3  94.6 ± 7.2  82.6 ± 5.9  106.2 ± 5.1 aData  in  this  table  is analysed by a one‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and  the  change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group. n=10‐11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001. 

Chapter 3 

54  

Figure  1.  Lipid uptake  in BAT occurs  early  in  time  after  initiation of  high‐fat  diet  feeding. A.  Study  outline.  Eight different groups of mice were subjected to a 45% HFD for different times (1 day (d) to 18 weeks (w)) and sacrificed at the same age. B.  Interscapular BAT was removed after sacrifice and  its weight was determined. C. The percentage of lipid as measured on an H&E stained BAT section. D. EpAT and (E) ScAT were removed after sacrifice and weighed. n=10‐11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Upon HFD  feeding, an  increase  in BAT weight was already present after 3 days of HFD  (Figure 1B). 

Histological  analysis  showed  that  the  lipid  content  in  brown  adipocytes  rapidly  increased  and 

plateaued after 3 days of HFD and remained high until 18 weeks of HFD (Figure 1C),  indicating that 

BAT  accumulates  lipids  very  rapidly.  In  contrast,  the  increase  in  EpAT  and  ScAT weight  reached 

significance after 2 weeks of HFD and kept rising during the entire duration of the experiment (Figure 

1D and E). 

High-fat diet

Chow diet

18w 12w 4w 2w 1w 3d 1d

BAT

HFD

gram

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

**

***

BAT

HFD

% li

pid

drop

lets

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

20

40

60

80

*** **** *

**

EpAT

HFD

gram

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

1

2

3

***

****** ***

ScAT

HFD

gram

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*****

***

***

A

B C

D E

Brown adipose tissue in obesity 

55  

Obesity associated inflammation in BAT 

Obese WAT  is associated with  leukocyte  infiltration with a prominent role for macrophages, as the 

number of AT macrophages correlates with the extent of metabolic dysfunction [14, 18]. In BAT, we 

observed rapid changes in lipid uptake and increased brown adipocyte size after the start of HFD, and 

we wondered whether macrophages also  infiltrate BAT  in the course of diet‐induced obesity (DIO). 

We  histologically  analysed  BAT  macrophages  in  situ  by  CD68  staining  and  observed  increased 

macrophage  counts  again  already  after  three  days  upon  induction  of  DIO  (Figure  2A,B).  Gene 

expression of the macrophage‐specific marker F4/80 also increased rapidly and reached significance 

after 1 week of HFD  (Figure 2C). Additional markers  for  classical pro‐inflammatory  (Nos2)  vs anti‐

inflammatory  (CD301,  Arg1)  macrophages  hinted  towards  an  increase  in  pro‐inflammatory 

macrophages rather than in anti‐inflammatory macrophages (Figure 2C). 

Figure  2.  Increased  macrophage  numbers  in  obese  BAT.  A.  Representative  image  of  a  CD68+  macrophage immunohistochemical staining on  frozen BAT sections. B. Quantified  immunohistochemical staining of  relative  to  the number of adipocytes. C. Gene expression analysis of BAT showing the macrophage gene Adgre1 (encoding F4/80) and in  the pro‐inflammatory macrophage marker Nos2  (iNOS) and anti‐inflammatory macrophage marker genes Clec10a (CD301/Mgl1) and Arg1. D. CD45

+ leukocyte counts relative to the number of adipocytes in EpAT after 18 weeks of HFD counted on paraffin  immunohistochemical  stainings  and  (E)  leukocyte  count upon  a HFD  in  ScAT.  n=10‐11,  *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis). 

A

C

BAT macrophages

HFD

# CD

68+ /a

dipo

cyte

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0.00

0.01

0.02

0.03

* *** *

***

01d3d1w2w4w10w18wRe

lativ

e ex

pres

sion

Adgre1 Nos2 Clec10a Arg10.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

****

** * *

EpAT leukocytes

HFD

# CD

45 /a

dipo

cyte

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5***

B

ScAT leukocytes

HFD

# CD

45 /a

dipo

cyte

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0.00

0.05

0.10

0.15

*

D E

+ +

100 μm

Chapter 3 

56  

Total  leukocytes  (CD45+  cells)  in  EpAT  increased  with  more  established  obesity  (Figure  2D). 

Furthermore, we observed that EpAT was more prone to obesity associated inflammation than ScAT; 

EpAT displays an  increase  in  leukocytes after 18 weeks of HFD (Figure 2D), whereas ScAT  leukocyte 

counts did not increase within this time frame (Figure 2E). 

Increased cytokine expression in BAT upon HFD 

In obese WAT, adipocytes and immune cells secrete a variety of cytokines that recruit inflammatory 

cells and propagate the inflammatory profile of the tissue [15]. To study whether factors secreted by 

brown adipocytes can affect macrophage migration, we performed an in vitro macrophage migration 

assay  in which RAW264.7 macrophages were seeded on a transwell membrane and  incubated with 

supernatant  from  a  differentiated  brown  adipocyte  cell  line  (T37i).  Interestingly,  macrophage 

migration massively  increased  in  the presence of  T37i  supernatant  compared  to  the  spontaneous 

migration using medium only  (Figure 3A), suggesting that chemoattractants are secreted by brown 

adipocytes. We  then  studied alterations  in  cytokine and  chemokine expression  in BAT  in  vivo and 

found  that  the expression of cytokines occurs simultaneously with  the  increase  in  lipid uptake and 

macrophage numbers  in BAT. Gene expression of Tgfb1,  Il6, Tnf, Ccl2, Ccl4, Ccl7, Cxcl1 and Cx3cl1 

was  increased after 18 weeks of HFD, with a rapid  increase already starting after 3 days of HFD for 

most  mediators  (Figure  3B‐I).  The  increase  in  pro‐inflammatory  cytokines,  including  Tnf,  was 

relatively higher  than  the  increase  in macrophage  F4/80  expression,  again  suggesting  a  shift  to  a 

more pro‐inflammatory phenotype of the macrophages. 

 

After 18 weeks of HFD we found  large  increases  in gene expression of the cytokines Tnf, Ccl2, Ccl4 

and Ccl5 in EpAT. Interestingly, relative to the gene expression in EpAT of chow‐fed mice, obese BAT 

also displayed an  inflammatory cytokine environment  in which Tnf, Ccl2 and Ccl4  increased  to  the 

same  extent  as  in obese EpAT, whereas  Il6  and Cx3cl1  specifically  increased  in BAT  and Ccl5 was 

specifically induced in EpAT (Figure 3J‐O). 

Brown adipocytes are regulated by pro‐ inflammatory cytokines in vitro 

We next studied the effects of  inflammatory stimuli on brown adipocyte function  in vitro. A brown 

adipocyte cell line (T37i) was stimulated for 24 hours with pro‐inflammatory cytokines TNF and IFNγ, 

and  lipopolysaccharide  (LPS), which  is  a  surface membrane  component of  gram‐negative  bacteria 

and allows cells to recognize bacterial  invasion via Toll‐like receptor 4 (TLR4) (Figure 4A). All stimuli 

lowered  Ucp1  gene  expression,  which  suggests  inhibition  of  thermogenic  function  (Figure  4B). 

Furthermore, the expression of Ppargc1a, a gene regulating mitochondrial biogenesis, was decreased 

after TNF and LPS stimulation (Figure 4B). The cytokine stimulations TNF and  IFNγ also  lowered the 

expression  of  the  fatty  acid  receptor  Cd36  and  all  stimulations  decreased  gene  expression  of 

lipoprotein lipase (Lpl), suggesting that pro‐inflammatory stimuli also inhibit fatty acid uptake by the 

cells (Figure 4B). 

 

The HFD rapidly increased cytokine and chemokine gene expression in BAT (Figure 3) but it is unclear 

which  cell  type  is  responsible  for  this production. Although macrophages as  immune  cells are key 

candidates to produce these inflammatory mediators we also examined expression of these genes in 

brown  adipocytes  in  vitro.  In  the  brown  adipocytes  that were  stimulated with  pro‐inflammatory 

cytokines  TNF  and  IFNγ,  and  LPS, we  analysed  gene  expression  of  a  set  of  relevant  chemokines. 

Interestingly, all  three  conditions were able  to  induce a variety of  chemokines,  including  Il6, Ccl2, 

Ccl3, Ccl4, Ccl5, Ccl7, Cxcl1, Cxcl12 and Cx3cl1  (Figure 4C,DI). Even more  intriguing,  IL‐6 and CXCL1 

were also secreted in the supernatant in nanogram quantities, confirming secretion of relevant levels 

Brown adipose tissue in obesity 

57  

of these inflammatory mediators by brown adipocytes (Figure 4E). Altogether, the brown adipocytes 

themselves likely also contribute to the inflammatory signals within BAT upon a HFD challenge. 

Figure  3.  Increased  cytokine  expression  in  obese  BAT. A.  The migration  of  RAW264.7 macrophages  in  vitro when incubated with supernatant from a brown adipocyte cell line (T37i). B. BAT gene expression of Tgfb1, (C) Il6, (D) Tnf, (E) Ccl2, (F) Ccl4,  (G) Ccl7,  (H) Cxcl1 and (I) Cx3cl1. J‐O. Comparison of gene expression  in EpAT and BAT, expression was calculated  relative  to  the  chow  EpAT  group  for  (J)  Tnf,  (K)  Il‐6,  (L) Ccl2,  (M) Ccl4,  (N) Ccl5    and  (O) Cx3cl1.  n=10‐11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (A, J‐O Student t‐test, B‐I 1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis). 

Ccl7

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

2

4

6

8

10

** **

Cxcl1

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

5

10

15

*

***

Cx3cl1

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

1

2

3

4

*** ***

****** ***

A CB

D E

G IH

F

J LK

M ON

Tgfb1

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0.0

0.5

1.0

1.5 * ** *

Tnf

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

2

4

6**

Il6

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

1

2

3

4*

Ccl2Re

lativ

e ex

pres

sion

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

5

10

15

*****

Ccl4

Rela

tive

expr

essi

on

0 1d 3d 1w 2w 4w 10w 18w0

2

4

6

8

***

# m

igra

ted

RAW

cel

ls

Control T37i Supernatant0

50

100

150****

Tnf

Rela

tive

expr

essi

on

Chow 18w HFD Chow 18w HFD0

5

10

15

***

**

Il6

Rela

tive

expr

essi

on

Chow 18w HFD Chow 18w HFD0

1

2

3

4

5*

*

Ccl4

Rela

tive

expr

essi

on

Chow 18w HFD Chow 18w HFD0

2

4

6

8**

**

Ccl5

Rela

tive

expr

essi

on

Chow 18w HFD Chow 18w HFD0

2

4

6

8

10** **

**Cx3cl1

Rela

tive

expr

essi

on

Chow 18w HFD Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5

***

*

Ccl2

Rela

tive

expr

essi

on

Chow 18w HFD Chow 18w HFD0

5

10

15

***

**

***

BAT

EpAT

Chapter 3 

58  

 

Figure 4.  Inflammatory  stimuli  reduce Ucp1 expression and  increase  chemokine  secretion by brown adipocytes  in vitro  A. In vitro model of brown adipocyte cell line (T37i) stimulations. B. Gene expression of Ucp1, Ppargc1a, Cd36 and Lpl after 24 hours of  stimulation with TNF,  IFNγ or  LPS. C, D. Gene expression of Ccl2, Ccl3, Ccl4, Ccl5, Ccl7, Cxcl12, Cx3cl1, Il6 and Cxcl1 upon pro‐inflammatory stimuli. E. ELISA measurements of the supernatant showing secretion of IL‐6 and CXCL1 upon pro‐inflammatory stimuli. n=4, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (Students t‐test). 

A B

D E

TNF

IFNγ

LPS

TNF

FNγ

LPS

24h

Differentiated T37i

brown adipocytes

ng/m

l

IL-6 CXCL10

1

2

3

4

5

6121220

-TNFIFNLPS

***

***

*

***

***

Rela

tive

expr

essi

on

Il6 Cxcl10

3

6

9

122060

100100200 -

TNFIFNLPS***

***

******

***

***

Rela

tive

expr

essi

onCxcl12 Cx3cl1

0

1

2

3

4 -TNFIFNLPS***

***

***

Rela

tive

expr

essi

on

Ccl2 Ccl3 Ccl4 Ccl5 Ccl70

2

4

6

8101214 ***

******

* *

***

******

***

***

******

***

Rela

tive

expr

essi

onUcp1 Ppargc1a Cd36 Lpl

0.0

0.5

1.0

1.5 -TNFIFNLPS

** ***

** ** *****

***** *

C

Brown adipose tissue in obesity 

59  

Discussion 

Obesity  is associated with a chronic state of  inflammation  in WAT and a reduction  in BAT function. 

Our  study  shows  that  BAT  of mice  subjected  to  diet‐induced  obesity  undergoes  tissue  expansion 

within 3 days of HFD. A rapid  increase  in BAT weight and  lipid droplet size after the start of a HFD 

suggests that BAT  is an extremely plastic tissue that adapts to changes  in dietary conditions. These 

increases  in BAT weight and  lipid content plateaued after 3 days of dietary challenge and was only 

further  increased  in  the  18 weeks HFD  group. Within  the  first week  of HFD,  the  expanding  BAT 

attracted immune cells associated with increased cytokine and chemokine gene expression, although 

the highest levels of inflammation were measured in the 18 weeks of HFD group. In vitro data using a 

brown adipocyte cell  line showed that a pro‐inflammatory environment decreases Ucp1 expression 

in brown adipocytes and that brown adipocytes themselves are capable of producing and secreting 

inflammatory cytokines and chemokines, and increases macrophage migration. 

 

Within the expanding BAT we observed an  increase  in macrophages, with a more pro‐inflammatory 

phenotype  as  evidenced  by  higher  expression  of  Nos2  and  increased  inflammatory  cytokines 

including  Tnf  and  Il6.  Inflammatory  stimuli  also  enhance  the  release  of  TNF  and  IL‐6  from  pro‐

inflammatory macrophages. However, in adipose tissue, IL‐6 is not necessarily pro‐inflammatory and 

may mediate anti‐inflammatory macrophage polarization by inducing the IL‐4 receptor [32]. We also 

observed  increased expression of Ccl2, Ccl4, and Ccl7, which are chemotactic signals for monocytes 

and macrophages. Cxcl1, a neutrophil chemokine, and especially Cx3cl1 also rapidly increased in BAT 

after the start of HFD. CX3CL1, also known as fractalkine, recruits monocytes and macrophages and 

loss of CX3CL1‐CX3CR1 signalling was previously shown to reduce macrophage accumulation in WAT 

as well as BAT and to reduces development of DIO [33]. 

 

We  show  that  pro‐inflammatory  signals  associated  with  obesity  affects  brown  adipocytes.  By 

mimicking  a pro‐inflammatory  environment  in  an  in  vitro model  in which brown  adipocytes were 

stimulated with TNF, IFNγ and LPS we found decreased Ucp1 and Ppargc1a expression. This is in line 

with  reports by others who  show  that TNF  suppresses Ucp1 expression and  impairs mitochondrial 

biogenesis in brown adipocytes [25‐28]. These data thus suggest decreased brown adipocyte activity 

upon  inflammatory  signals,  which  could  be  a  mechanism  behind  the  well‐established  obesity‐

associated decreased BAT activity. 

 

White  adipocytes  secrete  many  adipokines,  including  leptin  and  adiponectin  but  also  (adipo‐) 

cytokines,  including  IL‐6  and  CCL2  [34].  Furthermore,  under  inflammatory  (i.e.  LPS  stimulated) 

conditions,  white  adipocytes  secrete  TNF,  IL‐6,  CCL3,  CCL4  and  CXCL12  [35].  Brown  adipocytes 

secrete  “BATokines” as well, which  can act  in a paracrine or autocrine manner  [36]. For example, 

thermogenic  active  brown  and/or  beige  adipocytes  secrete  factors  that  promote  hypertrophy, 

hyperplasia, vascularization and innervation including irisin, metrnl, FGF21, neuregulin 4 and also IL‐6 

[36].  Interestingly,  we  observed  that,  especially  upon  pro‐inflammatory  stimuli  in  vitro,  brown 

adipocytes themselves express a variety of cytokines and chemokines  including Il‐6, Ccl2, Ccl3, Ccl4, 

Ccl5,  Ccl7,  Cxcl1,  Cxcl12  and  Cx3cl1  and  probably  others.  These  data  indicate  that  the  brown 

adipocytes themselves may be an  important source of  inflammatory signals within BAT upon a HFD 

challenge. 

 

Chapter 3 

60  

Our study further shows that BAT stores excessive lipids, in which the accumulation of lipids gives the 

tissue a ‘whitened’ phenotype. Others have shown that ‘whitening’ of BAT in mice is characterized by 

hypoxia,  mitochondrial  dysfunction  and  decreased  SNS  innervation  [37].  One  mechanism 

contributing  to  immune  regulation  in  BAT  could  be  the  SNS.  Surgical  denervation  of  BAT  and 

treatment with  the β‐adrenergic antagonist propranolol upregulate gene expression of Tnf,  ll6 and 

Ccl2, without a change  in F4/80 expression. This shows  that  the SNS  is  involved  in maintaining  the 

anti‐inflammatory  state  in  BAT  and  decreased  SNS  signalling  disturbs  the  anti‐inflammatory 

environment  [38]. Future  research should  further examine  the contribution of  the SNS  to  immune 

regulation of obese BAT. 

 

In mice, cold exposure  increases markers for anti‐inflammatory macrophages  in BAT and beiging  in 

ScAT, and macrophage depletion decreases BAT activity. Anti‐inflammatory macrophages are  thus 

important  stimuli  of  adaptive  thermogenesis.  They  release  noradrenaline,  via  the  production  of 

tyrosine‐hydroxylase, a catecholamine‐synthesizing enzyme, and  IL‐4‐STAT6  signalling  [29, 30]. Not 

only  brown  adipocytes  express  β‐adrenergic  receptors;  macrophages  also  express  β2‐adrenergic 

receptors,  enabling  a  complex  auto‐  and  paracrine  loop  [39,  40].  Although  literature  states  an 

important  link  between  anti‐inflammatory macrophages  and  BAT  functioning,  our  data  does  not 

support  a  loss  of  anti‐inflammatory  macrophages  in  obese  BAT  but  rather  an  increase  in  pro‐

inflammatory macrophages. This would imply that a disturbed mechanism of BAT activation by anti‐

inflammatory macrophages is not the major cause of obesity associated dysfunctional BAT. 

 

Insulin resistance that accompanies obesity is partly attributable to changes in adipokine secretion by 

WAT. BAT is highly vascularized to supply the adipocytes with substrate and oxygen for oxidation and 

enable efficient distribution of heat [1]. Therefore, the cytokines and chemokines produced by brown 

adipocytes in obesity might be transported out of the tissue and thereby also contribute to systemic 

inflammation.  However,  it  will  be  challenging  to  determine  the  relative  contribution  of  BAT  to 

increased circulating cytokine levels and insulin resistance. 

 

We found many  inflammatory signals and a rapid  increase  in macrophages  in BAT of HFD‐fed mice, 

although we cannot exclude the possibility that other immune cell types play a role as well. Our study 

shows  that  brown  adipocytes  produce  inflammatory  mediators,  which  likely  mediate  crosstalk 

between adipocytes and macrophages. Future studies will be needed to elucidate on the complete 

spectrum  of  BAT  regulation  by  immune  cells.  Furthermore,  the  contribution  of  immune  cells  to 

differentiation, proliferation and activation of beige adipocytes within WAT and possible overlapping 

mechanisms with classical BAT will be of great interest. Although dysfunctional BAT in obesity likely 

results  from  combined  physiological  alterations  at  multiple  sites,  we  have  shown  that  the 

immunological signals are one important regulatory factor. 

 

Brown adipose tissue in obesity 

61  

Corresponding author Prof. Menno  P.J.  de Winther.  Department  of Medical  Biochemistry,  Experimental  Vascular  Biology,  Academic Medical 

Center,  University  of  Amsterdam,  Meibergdreef  9,  1105  AZ,  Amsterdam,  The  Netherlands.  +31  (0)20  5  66  6762. 

m.dewinther@amc.uva.nl 

Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. 

Acknowledgements We acknowledge the support from the Rembrandt Institute of Cardiovascular Science (PR, MdW, EL) and the Netherlands 

CardioVascular  Research  Initiative:  “the  Dutch  Heart  Foundation,  Dutch  Federation  of  University Medical  Centres,  the 

Netherlands Organisation for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences" for the 

GENIUS project “Generating the best evidence‐based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011‐19). This work 

was  supported  by  the  Netherlands  Organization  for  Scientific  Research  (NWO)  (VENI  to  JVdV,  VICI  grant  to  EL),  the 

Netherlands Heart Foundation (Dr E. Dekker grant to TS and junior postdoc grant to JVdB), the European Research Council 

(ERC con grant to EL) and Horizon 2020 (REPROGRAM to EL and MdW). 

Chapter 3 

62  

References 

[1]  Kajimura  S,  Spiegelman  Bruce M,  Seale  P.  2015.  Brown  and  Beige  Fat:  Physiological  Roles  beyond  Heat Generation. Cell Metabolism 22(4):546‐559. 

[2]  Cannon  B,  Nedergaard  J.  2004.  Brown  Adipose  Tissue:  Function  and  Physiological  Significance.  Physiological Reviews 84(1):277‐359. 

[3]  Kooijman  S,  van  den  Heuvel  JK,  Rensen  PCN.  2015.  Neuronal  Control  of  Brown  Fat  Activity.  Trends  in Endocrinology & Metabolism 26(11):657‐668. 

[4]  Cypess AM,  Lehman S, Williams G, Tal  I, Rodman D, Goldfine AB et al. 2009.  Identification and  Importance of Brown Adipose Tissue in Adult Humans. New England Journal of Medicine 360(15):1509‐1517. 

[5]  Saito M, Okamatsu‐Ogura Y, Matsushita M, Watanabe K, Yoneshiro T, Nio‐Kobayashi J et al. 2009. High Incidence of Metabolically Active Brown Adipose Tissue  in Healthy Adult Humans: Effects of Cold Exposure and Adiposity. Diabetes 58(7):1526‐1531. 

[6]  Nedergaard  J,  Bengtsson  T,  Cannon  B.  2007.  Unexpected  evidence  for  active  brown  adipose  tissue  in  adult humans. American Journal of Physiology ‐ Endocrinology and Metabolism 293(2):E444‐E452. 

[7]  van Marken Lichtenbelt WD, Vanhommerig  JW, Smulders NM, Drossaerts  JMAFL, Kemerink GJ, Bouvy ND et al. 2009. Cold‐Activated Brown Adipose Tissue in Healthy Men. New England Journal of Medicine 360(15):1500‐1508. 

[8]  Virtanen KA, Lidell ME, Orava J, Heglind M, Westergren R, Niemi T et al. 2009. Functional Brown Adipose Tissue in Healthy Adults. New England Journal of Medicine 360(15):1518‐1525. 

[9]  Cypess AM, Weiner  LS, Roberts‐Toler C,  Elía  EF, Kessler  SH, Kahn PA  et al.  2015. Activation of Human Brown Adipose Tissue by a β3‐Adrenergic Receptor Agonist. Cell Metabolism 21(1):33‐38. 

[10]  van den Berg SM, van Dam AD, Rensen PCN, de Winther MPJ, Lutgens E. 2016. Immune modulation of brown(ing) adipose tissue in obesity. Endocrine Reviews:er.2016‐1066. 

[11]  Feldmann HM, Golozoubova V, Cannon B, Nedergaard J. 2009. UCP1 Ablation Induces Obesity and Abolishes Diet‐Induced  Thermogenesis  in Mice  Exempt  from  Thermal  Stress  by  Living  at  Thermoneutrality.  Cell Metabolism 9(2):203‐209. 

[12]  Bachman ES, Dhillon H, Zhang C‐Y, Cinti S, Bianco AC, Kobilka BK et al. 2002.  β‐AR Signaling Required  for Diet‐Induced Thermogenesis and Obesity Resistance. Science 297(5582):843‐845. 

[13]  Ukropec  J,  Anunciado  R,  Ravussin  Y,  Kozak  L.  2006.  Leptin  Is  Required  for Uncoupling  Protein‐1‐Independent Thermogenesis during Cold Stress. Endocrinology 147(5):2468‐2480. 

[14]  Chawla A, Nguyen KD, Goh YPS. 2011. Macrophage‐mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology 11(11):738‐749. 

[15]  Lumeng  CN,  Saltiel  AR.  2011.  Inflammatory  links  between  obesity  and metabolic  disease.  Journal  of  Clinical Investigation 121(6):2111‐2117. 

[16]  Hotamisligil GS. 2006. Inflammation and metabolic disorders. Nature 444(7121):860‐867. [17]  Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M,  Leibel RL, Ferrante AW,  Jr. 2003. Obesity  is associated with 

macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation 112(12):1796‐1808. [18]  Osborn O, Olefsky JM. 2012. The cellular and signaling networks  linking the  immune system and metabolism  in 

disease. Nat Med 18(3):363‐374. [19]  Hotamisligil G, Shargill N, Spiegelman B. 1993. Adipose expression of tumor necrosis  factor‐alpha: direct role  in 

obesity‐linked insulin resistance. Science 259(5091):87‐91. [20]  Pradhan  AD, Manson  JE,  Rifai  N,  Buring  JE,  Ridker  PM.  2001.  C‐reactive  protein,  interleukin  6,  and  risk  of 

developing type 2 diabetes mellitus. JAMA 286(3):327‐334. [21]  Kanda  H,  Tateya  S,  Tamori  Y,  Kotani  K,  Hiasa  K‐i,  Kitazawa  R  et  al.  2006. MCP‐1  contributes  to macrophage 

infiltration  into  adipose  tissue,  insulin  resistance,  and  hepatic  steatosis  in  obesity.  The  Journal  of  Clinical Investigation 116(6):1494‐1505. 

[22]  Ognjanovic S,  Jacobs DR, Steinberger  J, Moran A, Sinaiko AR. 2013. Relation of chemokines  to BMI and  insulin resistance at ages 18‐21. Int J Obes 37(3):420‐423. 

[23]  Kim  D,  Kim  J,  Yoon  JH,  Ghim  J,  Yea  K,  Song  P  et  al.  2014.  CXCL12  secreted  from  adipose  tissue  recruits macrophages and induces insulin resistance in mice. Diabetologia 57(7):1456‐1465. 

[24]  Roberts‐Toler  C, O'Neill  BT,  Cypess AM.  2015. Diet‐induced  obesity  causes  insulin  resistance  in mouse  brown adipose tissue. Obesity 23(9):1765‐70. 

[25]  Sakamoto  T, Nitta  T, Maruno  K,  Yeh  Y‐S,  Kuwata H,  Tomita  K  et  al.  2016. Macrophage  infiltration  into  obese adipose tissues suppresses the  induction of UCP1  level  in mice. American Journal of Physiology  ‐ Endocrinology And Metabolism 310(8):E676. 

[26]  Nisoli E, Briscini L, Giordano A, Tonello C, Wiesbrock SM, Uysal KT et al. 2000. Tumor necrosis factor α mediates apoptosis of brown adipocytes and defective brown adipocyte  function  in obesity. Proceedings of  the National Academy of Sciences 97(14):8033‐8038. 

[27]  Valladares A, Roncero C, Benito M, Porras A. 2001. TNF‐α inhibits UCP‐1 expression in brown adipocytes via ERKs: Opposite effect of p38MAPK. FEBS Letters 493(1):6‐11. 

Brown adipose tissue in obesity 

63  

[28]  Sakamoto  T,  Takahashi N,  Sawaragi  Y, Naknukool  S,  Yu  R, Goto  T  et  al.  2013.  Inflammation  induced  by  RAW macrophages suppresses UCP1 mRNA induction via ERK activation in 10T1/2 adipocytes. The American Journal of Physiology ‐ Cell Physiology 304(8):C729‐C738. 

[29]  Nguyen KD, Qiu Y, Cui X, Goh YPS, Mwangi J, David T et al. 2011. Alternatively activated macrophages produce catecholamines to sustain adaptive thermogenesis. Nature 480(7375):104‐108. 

[30]  Qiu Y, Nguyen Khoa D, Odegaard  Justin I, Cui X, Tian X, Locksley Richard M et al. 2014. Eosinophils and Type 2 Cytokine Signaling in Macrophages Orchestrate Development of Functional Beige Fat. Cell 157(6):1292‐1308. 

[31]  Zennaro MC, Le Menuet D, Viengchareun S, Walker F, Ricquier D, Lombès M. 1998. Hibernoma development  in transgenic mice  identifies brown adipose  tissue as a novel  target of aldosterone action. The  Journal of Clinical Investigation 101(6):1254‐1260. 

[32]  Mauer J, Chaurasia B, Goldau J, Vogt MC, Ruud J, Nguyen KD et al. 2014. Signaling by  IL‐6 promotes alternative activation of macrophages to limit endotoxemia and obesity‐associated resistance to insulin. Nature Immunology 15(5):423‐430. 

[33]  Polyák Á, Winkler  Z, Kuti D,  Ferenczi  S, Kovács KJ. 2016. Brown adipose  tissue  in obesity:  Fractalkine‐receptor dependent  immune  cell  recruitment  affects metabolic‐related  gene  expression.  Biochimica  et  Biophysica Acta (BBA) ‐ Molecular and Cell Biology of Lipids 1861(11):1614‐1622. 

[34]  Ouchi N, Parker JL, Lugus JJ, Walsh K. 2011. Adipokines  in  inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology 11(2):85‐97. 

[35]  Chirumbolo  S,  Franceschetti G,  Zoico  E, Bambace C, Cominacini  L,  Zamboni M.  2014.  LPS  response pattern of inflammatory adipokines in an in vitro 3T3‐L1 murine adipocyte model. Inflammation Research 63(6):495‐507. 

[36]  Villarroya F, Cereijo R, Villarroya J, Giralt M. 2016. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol advance online publication. 

[37]  Shimizu I, Aprahamian T, Kikuchi R, Shimizu A, Papanicolaou KN, MacLauchlan S et al. 2014. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation 124(5):2099‐2112. 

[38]  Tang L, Okamoto S, Shiuchi T, Toda C, Takagi K, Sato T et al. 2015. Sympathetic Nerve Activity Maintains an Anti‐Inflammatory  State  in  Adipose  Tissue  in  Male  Mice  by  Inhibiting  TNF‐α  Gene  Expression  in  Macrophages. Endocrinology 156(10):3680‐3694. 

[39]  Stanojević  S, Dimitrijević M,  Kuštrimović N, Mitić  K, Vujić V,  Leposavić G.  2013. Adrenal hormone  deprivation affects macrophage catecholamine metabolism and β2‐adrenoceptor density, but not propranolol stimulation of tumour necrosis factor‐α production. Experimental Physiology 98(3):665‐678. 

[40]  Grailer  JJ,  Haggadone MD,  Sarma  JV,  Zetoune  FS, Ward  PA.  2014.  Induction  of M2  Regulatory Macrophages through the β2‐Adrenergic Receptor with Protection during Endotoxemia and Acute Lung Injury. Journal of Innate Immunity 6(5):607‐618. 

 

Chapter 3 

64  

 

  

4 

 

Helminthantigenscounteractarapidhigh‐fatdietinduceddropineosinophilsinadepotspecificmannerinmice

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Susan M.  van  den  Berg1,  Andrea D.  van Dam2,3,  Pascal  J.H.  Kusters1,  Linda  Beckers1, Myrthe  den 

Toom1, Saskia van der Velden1, Jan Van den Bossche1, Irma van Die4, Mariëtte R. Boon2,3, Patrick C.N. 

Rensen2,3, Esther Lutgens*,1,5, Menno P.J. de Winther*,1,5 

 1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, 

the Netherlands 2Department of Medicine, Division Endocrinology, Leiden University Medical Center, Leiden, the Netherlands 3Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden, the Netherlands 4Department  of Molecular  Cell  Biology  and  Immunology,  Neuroscience  Campus  Amsterdam,  Vrije  Universiteit Medical 

Center, Amsterdam, the Netherlands 5Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig Maximilian’s University, Munich, Germany 

 

*these authors contributed equally to this work. 

 

Submitted 

Chapter 4 

66  

Abstract 

Brown  adipose  tissue  (BAT)  activation  or white  adipose  tissue  (WAT) beiging  can  increase  energy 

expenditure  and  reduce  obesity‐associated  diseases.  The  immune  system  is  a  potential  target  in 

mediating brown and beige adipocyte activation. Homeostasis of  lean WAT  is maintained by type 2 

and anti‐inflammatory immune cells, in which eosinophils produce interleukin (IL)‐4 and sustain anti‐

inflammatory macrophage activation. In obesity, WAT shows a decreased number of eosinophils and 

an  increased  infiltration of pro‐inflammatory  immune cells. We studied eosinophil numbers  in BAT, 

epididymal WAT (EpAT) and subcutaneous WAT (ScAT) after 1 day, 3 days or 1 week of high‐fat diet 

(HFD)  in C57Bl/6 mice. Helminth antigens  induce a type 2  immune response and can be protective 

against metabolic defects in obesity. We hypothesized that this phenotype involves activation of BAT 

or beige adipogenesis. Therefore, 1 week HFD‐fed mice were  injected with helminth antigens from 

Schistosoma mansoni and Trichuris suis. After 1 day of HFD, eosinophils started  to decline  in EpAT 

and BAT, and after 3 days  in ScAT, along with a decrease  in the eosinophil chemoattractant Ccl3  in 

EpAT and ScAT and Ccl5 and Ccl11 in BAT. Furthermore, macrophages increased after 3 days of HFD 

in  EpAT.  Interestingly,  IL‐4  stimulation  of  brown  adipocytes  in  vitro  resulted  in  increased  Ucp1 

expression  and  the  production  of  CCL11  (26‐fold  increase,  p<0.0001).  Treatment  with  helminth 

antigens resulted  in high numbers of eosinophils, macrophages and T cells  in EpAT. However, there 

were almost no effects of the helminth antigens on ScAT and BAT immune cells and no activation of 

BAT or beiging of WAT. Adipose tissue eosinophils decline rapidly after starting a HFD in mice. Short‐

term treatment with helminth antigens results in an adipose depot specific type 2 immune response 

which does not affect BAT activation or beiging of WAT.  

 

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

67  

Introduction 

Brown adipose  tissue  (BAT)  contributes  to  the  control of body  temperature, by  the production of 

heat  in  response  to  cold. Brown adipocytes have numerous mitochondria  that express uncoupling 

protein 1 (UCP1). Activation of UCP1 by noradrenaline results in uncoupling of the respiratory chain, 

bypassing ATP synthesis and  the dissipation of energy  into heat  [1]. Rodents as well as new‐borns 

from  larger organisms,  including humans, have  interscapular BAT depots. In humans, BAT regresses 

with  age  but  can  still  be  found  supraclavicular  and  in  the  neck  region,  but  also  periaortic, 

paravertebral and perirenal [2]. BAT activity can be detected using a positron‐emission tomographic 

and  X‐ray  computed  tomography  (PET/CT)‐scan  and  18F‐fluorodeoxy‐glucose  ([18F]FDG)  uptake,  in 

which cold exposure increases the uptake of glucose [3]. Interestingly, [18F]FDG uptake  is negatively 

correlated with BMI, suggestive of decreased BAT activity in obesity [3]. 

 

Brown‐like  or  ‘beige/brite’  adipocytes  can  also  be  present within white  adipose  tissue  (WAT)  [4]. 

These  beige  adipocytes  display  similar  characteristics  as  classical  brown  adipocytes,  including  a 

multilocular appearance and Ucp1 expression. They are present at low quantities but can be induced 

by cold or  β3‐adrenergic  receptor agonists. The  inguinal  subcutaneous adipose  tissue  (ScAT) depot 

has the highest beiging potential after cold exposure [5], although the thermogenic capacity  is only 

10%  of  that  of  interscapular  BAT  [6].  Activation  of  BAT  and  the  induction  of  beige  adipocytes, 

beneficially increases energy expenditure and therefore has the potential to reduce excessive energy 

stores in obesity [7]. 

 

Homeostasis  of  adipose  tissue  is maintained  by  immune  cells,  in  which  lean WAT  and  BAT  are 

characterized by  an  anti‐inflammatory  immune  cell  composition  [8]. The  stromal  vascular  fraction 

(SVF)  has  high  numbers  of  anti‐inflammatory macrophages,  eosinophils,  CD4+  T  helper  cells  and 

regulatory T cells. Anti‐inflammatory macrophages are sustained by Th2‐type cytokines, such as IL‐4. 

In adipose  tissue,  the majority of  IL‐4  secreting cells are eosinophils  [9].  In obesity,  increased  lipid 

uptake, hypertrophic adipocytes and  leakage of fatty acids causes recruitment of pro‐inflammatory 

immune cells. Obese WAT and BAT to a lower extent, is infiltrated by pro‐inflammatory macrophages 

[10, 11]. Interestingly, eosinophil numbers in WAT are inversely correlated with body weight in mice 

and  absence of  eosinophils  results  in  increased body weight,  impaired  glucose  tolerance  and  less 

cold‐induced  beige  adipogenesis  [9,  12]. Anti‐inflammatory macrophages  have  been  implicated  in 

BAT  activation  and  beiging  of WAT,  in which  they  release  noradrenaline  and  activate  brown  and 

beige adipocytes [12, 13]. Furthermore, administration of IL‐4 in mice reduces body weight, improves 

insulin  sensitivity  and  promotes  beiging  of WAT  [12].  Thus,  BAT  activation  and WAT  beiging  is 

promoted  by  eosinophils  that  produce  IL‐4,  which  stimulates  anti‐inflammatory macrophages  to 

release  noradrenaline,  resulting  in  activation  and  increased  expression  of  UCP1.  Decreased  BAT 

activity  in obesity and a decrease of both eosinophils and anti‐inflammatory macrophages  in obese 

WAT suggests that this immunological circuitry is disturbed in an obese state. 

 

Helminths  are  parasitic worms  that  induce  a  type  2  immune  response  in  their  host,  including  a 

massive increase in eosinophils. Interestingly, this type 2 response induced by Schistosoma mansoni‐

soluble  egg  antigens  (SEA)  or  Nippostrongylus  brasiliensis  can  be  protective  against  metabolic 

disorders [9, 14, 15]. Furthermore, soluble products of the whipworm Trichuris suis (TsSP) also induce 

Chapter 4 

68  

a  type  2  response  and  are  proven  to  be  beneficial  in  autoimmune  diseases,  including multiple 

sclerosis [16]. How TsSP affects adipose tissue immune cells is unknown.  

 

The  type  2  immune  response  induced  by  helminth  antigens  has  already  been  shown  to  be 

metabolically beneficial and we hypothesized  that  this phenotype could be  related  to activation of 

BAT  and/or  beiging  of  WAT.  Therefore,  we  first  determined  how  a  high‐fat  diet  (HFD)  affects 

eosinophils  in BAT,  epididymal WAT  (EpAT)  and  ScAT using  a  short  time  course of HFD. We  then 

studied how 1 week of SEA and TsSP alters the  immune composition of these three adipose tissues 

and whether this resulted in BAT activation and beiging of EpAT and ScAT. 

Materials and methods 

Mice 

Male wild‐type C57Bl/6 mice (Charles River) were given a HFD (45% kcal fat, 35% kcal carbohydrate, 

20% kcal protein, Special Diets Services, Witham, United Kingdom) for 1 day, 3 days or 1 week at the 

age  of  16 weeks  (4  groups  of  n=11).  For  the  SEA  and  TsSP  studies, male wild‐type  C57Bl/6 mice 

(Charles River) were given a HFD  for 1 week and received 4  intraperitoneal  injections every 3 days 

with PBS, 50 µg SEA or 50 µg TsSP starting 3 days before the diet (3 groups of n=12). Mice had ad 

libitum  access  to  food  and water  and were maintained  under  a  12h  light‐dark  cycle. Mice were 

euthanized  using  0.25 mg/g  ketamine  and  0.05 mg/g  xylazine.  Epididymal  adipose  tissue  (EpAT), 

subcutaneous  inguinal adipose tissue (ScAT) and  interscapular BAT were dissected and weighed. All 

experimental procedures were  approved by  the Animal  Experimentation  Ethics Committee of  the 

University of Amsterdam. 

SEA and TsSP preparation 

Schistosoma mansoni‐soluble  egg  antigens  (SEA)  was  kindly  provided  by  Fred  Lewis  (Biomedical 

Research Institute, Rockville, MD, USA) and prepared as described previously [17]. Soluble products 

of Trichuris suis (TsSP) was kindly provided by Irma van Die and prepared as described in [18]. 

Flow cytometry 

Adipose tissues were collected in PBS, transferred to DMEM‐20 mM HEPES (ThermoFisher Scientific, 

Waltham, MA, USA)  and minced  into  small pieces. Digestion was done using 0.25 mg/ml  liberase 

(Roche,  Basal,  Switzerland)  in DMEM‐20 mM HEPES  for  45 minutes  at  37°C. Digested  tissue was 

passed through a 70 µm nylon mesh (BD Biosciences) and centrifuged at 1250 rpm for 6 minutes. The 

adipocyte fraction was removed and the pellet containing the SVF was resuspended  in FACS buffer 

(0.5% BSA in PBS). Cell suspensions were incubated with an Fc‐receptor blocking antibody to prevent 

non‐specific binding and a biotin‐PE‐dump antibody mix (BioLegend and eBioscience, San Diego, CA, 

USA) followed by a staining using the antibodies: CD45, CD68 (BioLegend), CD11b, SiglecF, Ly6G (BD 

Biosciences, Breda,  the Netherlands), CD3, MHCII, F4/80  (eBioscience). Stainings were analysed by 

FACS (LSR Fortessa, BD Biosciences) and FlowJo software (Tree star). 

Histology 

Tissues  were  collected,  fixed  in  4%  paraformaldehyde  and  embedded  in  paraffin. 

Immunohistochemistry on EpAT and ScAT was performed for UCP1 (Sigma‐Aldrich, Zwijndrecht, the 

Netherlands). The presence of beige adipocytes, defined by a multilocular appearance and positive 

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

69  

for UCP1 was scored by M.T., who was blinded for the experimental conditions. When present, the 

quantity was expressed as + being a few cells, ++ a few areas and +++ when the section was full of 

beige adipocytes. 

Real‐time PCR 

Total RNA was extracted using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and reverse transcribed with an 

iScript  cDNA  synthesis  kit  (Bio‐Rad,  Veenendaal,  the  Netherlands).  The  quantitative  PCR  was 

performed using a SYBR green PCR kit and a ViiA7 RT‐PCR system (Applied Biosystems, Leusden, the 

Netherlands). The results are expressed as relative to the control group, which was assigned a value 

of 1. 

Culture and differentiation of brown adipocytes  

T37i cells were kindly provided by Marc Lombès [19] and cultured in DMEM‐F12 Glutamax, 10% FCS, 

penicillin  (100  U/ml)  and  streptomycin  (100  µg/ml)  (ThermoFisher  Scientific).  After  growing 

confluent,  cells were differentiated by adding 2 nM Triiodothyronine  (T3)  (Sigma‐Aldrich) and 112 

ng/ml insulin (Sigma‐Aldrich) to the media. After 9 days of differentiation, the cells were stimulated 

with 20 ng/ml  IL‐4  (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) for 24 hours. Supernatant was collected for the 

quantification  of  CCL11  (R&D  systems,  Minneapolis,  MN,  USA)  by  ELISA  in  accordance  to  the 

suppliers’ protocols. 

Statistics  

Results are presented as mean ± SEM. Analysis between more than two groups  in  the  time course 

experiments were done by a one‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group 

expressed relative to the control group. Analysis between two groups was done by a Student’s t test 

or a chi‐square test. Statistics were calculated  in GraphPad Prism 5.0    (GraphPad Software,  Inc., La 

Jolla, CA, USA). P‐values <0.05 were considered significant. 

Results 

Eosinophils rapidly decrease in adipose tissue upon HFD 

We  were  interested  in  how  a  HFD  affects  eosinophil  numbers  in  adipose  tissue.  Because  we 

previously observed how only one week of HFD  induces rapid  inflammatory changes  in BAT related 

to cytokine and chemokine expression, we included very short time points of HFD; 1 day, 3 days and 

1 week. Furthermore, others have described an  important  role  for eosinophils  in adipose  tissue  in 

which  they are  involved  in  the  regulation of brown adipocyte activity and beige adipogenesis. We 

determined  eosinophil  numbers  in  age‐matched  HFD‐fed  C57Bl/6  wild‐type mice  and  compared 

them  to mice on a  chow diet  (Fig.1A). Analysis of  adipose  tissue  immune  cells by  flow  cytometry 

revealed  that already after 1 day of HFD  the numbers of eosinophils decline  in EpAT and BAT and 

after 3 days in ScAT as well (Fig.1B). Particularly in BAT, eosinophils dramatically dropped by 65%. In 

EpAT, this was 35%. In the EpAT, we also observed an  increase  in macrophages after 3 days of HFD 

(Fig.1C). These data show us that before the onset of obesity, a HFD has rapid effects on the immune 

cell composition of brown and white adipose tissues. 

Chapter 4 

70  

 

To determine how a HFD can cause such rapid changes in eosinophil numbers, we started by looking 

at  the  expression  of  key  chemokines  that  are  known  to  attract  eosinophils,  Ccl3,  Ccl5  and  Ccl11. 

Although the expression of these chemokines was  indeed downregulated, this differed per adipose 

tissue  depot.  In  EpAT  and  ScAT,  especially  Ccl3  was  downregulated  in  the  groups  of mice  that 

received a HFD for 1 day or more (Fig.2A, B), and in BAT the expression of Ccl5 and Ccl11 was lower in 

the HFD groups (Fig.2B). 

IL‐4 induced brown adipocyte activation and CCL11 production in vitro 

The immunological circuit of BAT activation and beiging of WAT is via IL‐4 producing eosinophils that 

stimulate  anti‐inflammatory  macrophages  to  produce  noradrenaline  which  activates  brown 

adipocytes  and  induces  beiging  of  WAT  [9,  20].  To  study  the  effects  of  such  a  type  2  anti‐

inflammatory cytokine environment  in vitro, we  stimulated a brown adipocyte cell  line  (T37i) with 

the cytokine  IL‐4  for 24 hours.  Interestingly,  IL‐4 upregulated Ucp1 expression, suggesting  that  IL‐4 

alone  already has  a direct  effect on  the  activation of brown  adipocytes, without  the necessity of 

noradrenalin‐secreting macrophages (Fig.2C). Furthermore, to have an indication on how CCL11, the 

most  important chemoattractant  for eosinophils,  is  regulated  in BAT, we  found  that stimulation of 

the brown adipocytes with  IL‐4 massively  increased the expression and secretion of CCL11 (Fig.2D). 

Altogether,  these data  suggest a mechanism  in which a HFD  suppresses  the activation of BAT and 

possibly the beiging potential of WAT by a decrease in IL‐4 producing eosinophils. 

Figure 1. A  rapid decline  in adipose  tissue eosinophils upon a  short  time high‐fat diet  in mice A. Schematic  study outline. B. Flow cytometry analysis of the stromal vascular fraction of EpAT, ScAT and BAT showing a decrease  in the percentage of eosinophils (SiglecF

+ leukocytes) after 1 day of HFD in EpAT, 3 days of HFD in ScAT and 1 day of HFD in BAT. C. The percentage of macrophages (F4/80+ leukocytes), which start to increase of 3 days of HFD in EpAT and not in ScAT and BAT. n=11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001  (1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and  the  change per  group expressed relative to the 0 weeks of HFD group). 

1w 3d 1d 0

A B C

45% HFD

4 groups of mice

- No HFD

- 1 day

- 3 days

- 1 week

Eosinophils

No HFD 1d 3d 1w0

10

20

30

40

*****

***

Sigl

ecF+

(% o

f CD

11b+ )

Macrophages

No HFD 1d 3d 1w0

20

40

60

80

** **

F4/8

0+ (%

of C

D11

b+ )

Macrophages

No HFD 1d 3d 1w0

20

40

60

80

Macrophages

No HFD 1d 3d 1w0

10

20

30

Eosinophils

No HFD 1d 3d 1w0

5

10

15

***** *

Eosinophils

No HFD 1d 3d 1w0

10

20

30

** ***

Sigl

ecF+

(% o

f CD

11b+ )

F4/8

0+ (%

of C

D11

b+ )

Sigl

ecF+

(% o

f CD

11b+ )

F4/8

0+ (%

of C

D11

b+ )

EpAT

ScAT

BAT

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

71  

Figure 2. A HFD decreases gene expression of eosinophil chemoattractants in adipose tissues  A.  In ScAT, the chemoattractant Ccl3 decreased after 1 day of HFD, whereas  in (B) BAT the chemoattractant Ccl5 and Ccl11 were downregulated upon a HFD. C. A brown adipocyte cell line (T37i) was stimulated with the cytokine IL‐4 for 24 hours. This upregulated Ucp1,  indicating  that  IL‐4 has a direct effect  ‐4 on  the activation of brown adipocytes. D. Both gene expression of Ccl11 and the presence of CCL11 in the supernatant as assessed by ELISA was increased by IL‐4 stimulation. n=11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001  (A,B: 1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group. C,D: Student’s t test).  

EpAT

Ccl3 Ccl5 Ccl110

1

2

3

* *

**01d3d1w

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

ScAT

Ccl3 Ccl5 Ccl110.0

0.5

1.0

1.5

2.001d3d1w

***** **

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

BAT

Ccl3 Ccl5 Ccl110.0

0.5

1.0

1.5

2.0

* **

****

01d3d1w

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

Ccl110

50

100

150

200-***

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

Ucp10.0

0.5

1.0

1.5

2.0-IL-4*

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

D E

CCL110

1000

2000

3000

4000 -IL-4

***

pg/m

l

A

B

C

IL-4

Chapter 4 

72  

Figure 3. No changes in body weight after short‐term treatment with SEA and TsSP A. Schematic study design. B. Body weight and the weight of three adipose tissue depots, EpAT, ScAT and BAT, did not differ between the groups. n=12 

A

B

1 week 45% HFD

Day -3 Day 0 Day 3 Day 6

†

Control SEA TsSP0

20

40

60

80

BA

T (m

g)

Control SEA TsSP0

200

400

600

EpA

T (m

g)

Control SEA TsSP0

100

200

300

400

ScA

T (m

g)

Control SEA TsSP0

10

20

30

Bod

y w

eigh

t (g)

Adipose tissue depot‐specific effects of helminth antigen induced type 2 immune responses 

We wondered if we could rescue the HFD‐induced decrease in adipose tissue eosinophils in mice by 

the  administration  of  the  helminth  antigens  SEA  and  TsSP, which  are  known  to  induce  a  type  2 

immune  response. We  subjected C57Bl/6 wild‐type mice  (n=12)  to a HFD  for 1 week and  injected 

them with the helminth antigens SEA and TsSP (Fig.3A). These treatments did not cause changes  in 

body weight or BAT, EpAT and ScAT weight (Fig.3B). Flow cytometry of the adipose tissues revealed 

major effects on  immune  cell  composition of  the EpAT  in  the SEA and TsSP groups  (Fig.4A). Total 

leukocyte  numbers  (CD45+  cells)  were  6.4‐fold  and  4.0‐fold  increased  in  SEA  and  TsSP  groups, 

respectively. High counts of adipose tissue eosinophils (SiglecF+ cells) were observed by SEA, +34‐fold 

difference  and  +23‐fold  difference  by  TsSP.  The  number  of  macrophages  (CD68+MHCII+  cells) 

increased  by  5.8‐fold  and  5.2‐fold  in  the  SEA  and  TsSP  groups  respectively.  Furthermore,  SEA 

increased  T  cell numbers  (CD3+  cells)  12.3‐fold,  and  TsSP  7.6‐fold. Neutrophil  counts  (Ly6G+  cells) 

were unaffected by the treatments. However, the effects of the helminth antigens on ScAT and BAT 

were minor  compared  to  EpAT with  slightly more  T  cells  (+3.3‐fold  difference)  and macrophages 

(+2.4‐fold difference) by TsSP  in  the ScAT and no changes  in BAT  (Fig.4B,C). Gene expression data 

confirmed increased macrophages and eosinophils in EpAT by Cd68 and Ccr3 expression respectively 

(Fig.4D).  Furthermore,  the  chemokines  responsible  for  attracting  eosinophils  Ccl3,  Ccl5  and  Ccl11 

were  indeed upregulated  in EpAT (Fig.4D). In ScAT and BAT, no alterations  in gene expression were 

observed (Fig.4E,F). 

 

Helminth antigen treatment does not cause beiging in WAT 

As  especially  ScAT  is  prone  to  beiging,  we  wondered  whether  the  small  change  in  leukocyte 

composition in ScAT altered the presence of beige adipocytes. We performed immunohistochemistry 

for  UCP1  on  ScAT  and  scored  the  occurrence  of  UCP1  positive  areas  in  a  blinded  fashion.  This 

quantification showed a small trend towards a higher presence of beige adipocytes  in ScAT of mice 

treated with the helminth antigens SEA, and not in the TsSP group (Table 1, Fig.5A). Furthermore, we 

did not observe any beige adipocytes in EpAT and thus the major increase in eosinophils in EpAT did 

not  result  in  beige  adipogenesis  in  this  adipose  tissue  depot  (data  not  shown).  In  BAT,  Ucp1 

expression was unaffected by either SEA or TsSP treatment (Fig.5B). 

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

73  

Figure 4. Helminth antigens induce an adipose depot specific type 2 immune response A. Injections with SEA and TsSP resulted in a large increase in the number of total EpAT leukocytes (CD45+), T cells (CD3+), Macrophages (CD68+MHCII+), Eosinophils (SiglecF

+) and not in neutrophils (Ly6G+). B. In ScAT, only TsSP showed a significant induction of T cells and macrophages. C. No changes in immune cell composition in BAT were observed after SEA and TsSP treatment. D. Gene expression  analysis  showing  that macrophage marker  Cd68,  eosinophil marker  Ccr3  and  chemokines  Ccl3,  Ccl5  and Ccl11 were all increased in EpAT of SEA and TsSP treated mice. E,F. No effects of the treatments were observed in ScAT and BAT. n=12, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (Student’s t test between the control group and either SEA or TsSP) 

EpAT

Cd68 Ccr3 Ccl3 Ccl5 Ccl110

2

4

6

8 CtrlSEATsSP

*** **

*** ***

***

** *

*** **

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

ScAT

Cd68 Ccr3 Ccl5 Ccl110

1

2

3CtrlSEATsSP

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

BAT

Cd68 Ccr3 Ccl3 Ccl5 Ccl110.0

0.5

1.0

1.5

2.0 CtrlSEATsSP

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

D E

A EpAT

B ScAT

C BAT

F

Leukocytes

Control SEA TsSP0

1000

2000

3000

4000

****

****

CD

45+ (

#/g)

T cells

Control SEA TsSP0

50

100

150

200***

****

CD

3+ (#/

g)

Eosinophils

Control SEA TsSP0

500

1000

1500

****

****

Sigl

ecF+ (

#/g)

Neutrophils

Control SEA TsSP0

2

4

6

8

10

Ly6G

+ (#/

g)

Macrophages

Control SEA TsSP0

100

200

300

400

500

*** **

CD

68+ M

HC

II+ (#/

g)

Leukocytes

Control SEA TsSP0

200

400

600

800

1000

CD

45+ (

#/g)

T cells

Control SEA TsSP0

20

40

60*

CD

3+ (#/

g)

Eosinophils

Control SEA TsSP0

10

20

30

40

50

Sigl

ecF+ (

#/g)

Neutrophils

Control SEA TsSP0

5

10

15

Ly6G

+ (#/

g)

Macrophages

Control SEA TsSP0

20

40

60

80 *

CD

68+ M

HC

II+ (#/

g)

Leukocytes

Control SEA TsSP0

50

100

150

200

250

CD

45+ (

#/g)

T cells

Control SEA TsSP0

5

10

15

20

CD

3+ (#/

g)

Eosinophils

Control SEA TsSP0

5

10

15

Sigl

ecF+ (

#/g)

Neutrophils

Control SEA TsSP0

5

10

15

20

25

Ly6G

+ (#/

g)

Macrophages

Control SEA TsSP0

2

4

6

CD

68+ M

HC

II+ (#/

g)

Chapter 4 

74  

Figure 5. No effects on thermogenic capacity by helminth antigen treatment A. Scoring of presence of beige adipocytes in ScAT. Beige adipocytes were defined by a multilocular appearance and positive for UCP1. When present, the quantity was expressed as +: a few cells, ++: a few areas and +++ when the section was full of beige adipocytes. B. Gene expression of Ucp1  in BAT was not different upon SEA or TsSP treatment. n=12 

 

Table 1. Presence of beiging in ScAT after helminth treatment.  

       

    

  

    ‐  + ++  +++ p‐value

Ctrl  9  2  0  1   

SEA  3  1  4  2  0.056 

TsSP  6  2  1  2  0.59 

Values represent the number of mice within the groups that were scored on no  (‐) or a  few beige adipocytes  (+), a  few beige areas  (++) or many beige areas (+++) in ScAT. P‐value as determined by a Chi‐square test. n=10‐12 

 

A ScAT

B BAT

Ucp1

Ctrl SEA TsSP0.0

0.5

1.0

1.5

mR

NA

exp

ress

ion

(AU

)

Control SEA TsSP

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

75  

Discussion 

Immune cells contribute to activation of BAT and beiging of WAT, via IL‐4 producing eosinophils that 

stimulate anti‐inflammatory macrophages to secrete noradrenaline [9, 13]. In the current study, we 

show that short‐term HFD causes a rapid decline in eosinophils in EpAT, ScAT and BAT, along with a 

decrease in chemotactic signals for eosinophils. We also show that the anti‐inflammatory cytokine IL‐

4  can  directly  activate  brown  adipocytes  in  vitro  and  that  brown  adipocytes  themselves  are 

extremely  capable  of  producing  and  secreting  CCL11,  the  chemokine  that  recruits  eosinophils. 

Altogether,  these  findings  indicate  that  a  type  2  and  anti‐inflammatory  environment  in  adipose 

tissues and the associated beige/brown adipocyte activation or beige adipogenesis could beneficially 

alter metabolism  in obesity. Therefore, we administrated helminth antigens  from SEA and TsSP  to 

mice on a HFD  for 1 week  to  induce a  type 2  immune  response. We observed very depot‐specific 

effects of SEA and TsSP in which EpAT was massively infiltrated with eosinophils, macrophages and T 

cells  whereas  almost  no  differences  were  found  in  ScAT  and  BAT.  Furthermore,  SEA  and  TsSP 

treatments  did  not  result  in  increased  thermogenic  energy  expenditure,  as  we  did  not  observe 

alterations in BAT activity or beiging of the WAT depots. 

 

Eosinophil numbers depend on signals that affect recruitment, survival and/or cell death. Our data 

suggests  that  the  recruitment of  eosinophils  is  indeed  altered,  as we observe  a decrease  in  gene 

expression of  the  chemotactic  signals Ccl3, Ccl5 and Ccl11. Eosinophils greatly depend on  survival 

signals, including IL‐3, IL‐5 and granulocyte macrophage colony‐stimulating factor (GM‐CSF), of which 

IL‐5 is the most important [21]. IL‐5 in turn is produced by group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) [22]. 

Eosinophils have a short half‐life, reports vary between 3 to 18 hours  in blood and up to 6 days  in 

tissues, with a great tissue‐dependent variety [21‐23]. In lean adipose tissue, eosinophils have a low 

turnover  (10%  in  3  days)  [22],  suggesting  that  a  lean  state  contains  high  survival  signals.  Factors 

related  to  obesity  and  potentially  involved  in  reducing  eosinophil  numbers  include  the  pro‐

inflammatory cytokines TNF, which can induce eosinophil apoptosis [21] and IFNγ, which can inhibit 

differentiation and migration of eosinophils [24]. Furthermore, TGFβ has been suggested to block the 

survival effects of IL‐5 on eosinophils [25], although TGFβ expression also correlates with an increase 

in eosinophils in airways of asthma patients [26]. TGFβ is a multifunctional cytokine that possibly has 

diverse effects in different tissues. Eosinophil degranulation can also result in cell death [27]. 

 

As  eosinophils  have  a  short  half‐life,  a withdrawal  of  survival  signals  and/or  increased  apoptotic 

factors while  chemoattractants  are  decreased  can  result  in  a  rapid  decline.  To  unravel  a  genuine 

mechanism behind  this  fast drop  in  adipose  tissue  eosinophils upon  a HFD,  future  studies  should 

address which signals cause chemokines to decrease, determine whether IL‐5 and ILC2s are affected 

by  short‐term  HFD  and  find  correlations  between  apoptotic  factors  and  eosinophil  numbers  in 

adipose tissues. Eosinophils migrate via vascular cell adhesion molecule‐1 (VCAM‐1) and intercellular 

cell adhesion molecule‐1 (ICAM‐1) through α4 and αL integrins expressed on eosinophils, as integrin 

antibodies block eosinophil accumulation in adipose tissue [9]. This makes VCAM‐1 and ICAM‐1 also 

interesting targets to study if eosinophil migration is affected in obese adipose tissues. 

 

Our results are in line with others who found that WAT of obese mice has a reduction in eosinophils 

[9]. We further state that eosinophils  immediately decline shortly after the start of a HFD. The next 

Chapter 4 

76  

important step would be  to confirm  these  immunological changes  in human adipose  tissue, as  the 

physiological  resemblance  for  a  shift  from  chow  food  to  1  day  of  HFD  in  mice  is  difficult  to 

conceptualize.  To  further  improve  the  translational  relevance  of  these  findings,  it would  be  very 

interesting  to  determine  whether  increased  lipid  uptake  of  adipocytes  or  a  specific  dietary 

component is responsible for the rapid immune response in adipose tissue. 

 

Others have shown that chronic SEA treatment and the associated  increase  in type 2  immunity can 

be protective in the pathogenesis of metabolic disorders [14]. We hypothesized that these metabolic 

improvements were  related  to BAT activity and beiging of WAT.  In our  study,  the  type 2  immune 

response  induced by helminth antigens  from both SEA as well as TsSP was very depot specific and 

was only full blown present in EpAT. Surprisingly, an extreme increase in EpAT eosinophils (+34‐fold 

by SEA and +23‐fold by TsSP) did not  cause beige adipogenesis. This might be explained by a  low 

beiging capacity of EpAT [5]. Therefore, we speculate that BAT activation or WAT beiging  is not the 

mechanism that is causing the metabolic effects that others have seen upon a chronic infection with 

SEA. Beiging predominantly occurs in ScAT, possibly due to differences in a precursor population for 

beige adipocytes [28], which is an interesting topic for future research. 

 

Administration of IL‐4 for 10 days in vivo induces beiging of ScAT [12], indicating that this mechanism 

could take place  in this time frame.  In our study, although 10 days of treatment with SEA and TsSP 

was  enough  to  induce  a massive  immune  response  in  EpAT, we did not observe  effects on body 

weight or adipose tissue weight. Therefore, this short‐term study might not have been long enough 

to observe either metabolic effects or BAT activation and beige adipogenesis. 

 

With  the  use  of  helminth  antigens, we wanted  to  reverse  the  effects  of  a  drop  in  eosinophils  in 

adipose tissue caused by a HFD. The mice in this experiment were therefore given a HFD during the 

treatment. In ScAT and BAT, the effect of HFD might have caused a larger decline in eosinophils then 

the SEA and TsSP could restore. Therefore, with the HFD, we might have decreased the capacity to 

activate BAT and the beiging potential of ScAT and we could have seen effects when performing the 

study under chow conditions. 

 

Helminths  express  a  wide  variety  of  protein‐  and  lipid  linked  glycans  and  it  is  unknown  which 

molecular mechanisms  are  responsible  for  the  immune modulating  effects  [29].  In  our  study, we 

observe similar effects from SEA and TsSP,  indicating that they have a common parasitic signal that 

exerts  the effects  in adipose  tissue. Before helminth antigens could be a  therapeutically applied,  it 

will be needed to  identify which parasitic signal causes the metabolically beneficial type 2  immune 

response. 

 

In healthy adipose tissue, a type 2 immunological circuitry contributes to tissue homeostasis, by IL‐4 

producing  eosinophils  that  sustain  anti‐inflammatory macrophages  [9].  Our  data  shows  that  Il‐4 

probably has a bigger  role  in adipose  tissue  than only  the polarization of macrophages with also a 

direct effect on brown adipocytes. A HFD disturbs  the homeostatic  type 2  immunological circuitry, 

and cannot be reversed by a helminth‐induced type 2 response. The crosstalk between immune cells 

and adipocytes and how they regulate tissue homeostasis  is more complex than previously thought 

with many questions that remain. 

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

77  

Corresponding author Prof. Menno  P.J.  de Winther.  Department  of Medical  Biochemistry,  Experimental  Vascular  Biology,  Academic Medical 

Center,  University  of  Amsterdam,  Meibergdreef  9,  1105  AZ,  Amsterdam,  The  Netherlands.  +31  (0)20  5  66  6762. 

m.dewinther@amc.uva.nl 

Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. 

Acknowledgements We acknowledge  the support  from  the Rembrandt  Institute of Cardiovascular Science  (PR, MW, EL) and  the Netherlands 

CardioVascular  Research  Initiative:  “the  Dutch  Heart  Foundation,  Dutch  Federation  of  University Medical  Centres,  the 

Netherlands Organisation for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences" for the 

GENIUS project “Generating the best evidence‐based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011‐19). This work 

was supported by the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) (VICI grant to EL), the Netherlands Heart (Dr 

E. Dekker grant to TS) and the European Research Council (ERC con grant to EL). 

Chapter 4 

78  

References 

[1]  Cannon  B,  Nedergaard  J.  2004.  Brown  Adipose  Tissue:  Function  and  Physiological  Significance.  Physiological Reviews 84(1):277‐359. 

[2]  van Marken Lichtenbelt WD, Vanhommerig  JW, Smulders NM, Drossaerts  JMAFL, Kemerink GJ, Bouvy ND et al. 2009. Cold‐Activated Brown Adipose Tissue in Healthy Men. New England Journal of Medicine 360(15):1500‐1508. 

[3]  Saito M, Okamatsu‐Ogura Y, Matsushita M, Watanabe K, Yoneshiro T, Nio‐Kobayashi J et al. 2009. High Incidence of Metabolically Active Brown Adipose Tissue  in Healthy Adult Humans: Effects of Cold Exposure and Adiposity. Diabetes 58(7):1526‐1531. 

[4]  Sanchez‐Gurmaches  J, Hung  C‐M, Guertin DA.  2016.  Emerging  Complexities  in Adipocyte Origins  and  Identity. Trends in Cell Biology 26(5):313‐326. 

[5]  Waldén  TB,  Hansen  IR,  Timmons  JA,  Cannon  B,  Nedergaard  J.  2011.  Recruited  vs.  nonrecruited  molecular signatures  of  brown,  “brite,”  and white  adipose  tissues.  American  Journal  of  Physiology  ‐  Endocrinology  And Metabolism 302(1):E19. 

[6]  Shabalina Irina G, Petrovic N, de Jong Jasper MA, Kalinovich Anastasia V, Cannon B, Nedergaard J. 2013. UCP1 in Brite/Beige Adipose Tissue Mitochondria Is Functionally Thermogenic. Cell Reports 5(5):1196‐1203. 

[7]  Yoneshiro  T,  Saito M.  2015.  Activation  and  recruitment  of  brown  adipose  tissue  as  anti‐obesity  regimens  in humans. Annals of Medicine 47(2):133‐141. 

[8]  Lumeng  CN,  Bodzin  JL,  Saltiel  AR.  2007.  Obesity  induces  a  phenotypic  switch  in  adipose  tissue macrophage polarization. The Journal of Clinical Investigation 117(1):175‐184. 

[9]  Wu D, Molofsky AB, Liang H‐E, Ricardo‐Gonzalez RR, Jouihan HA, Bando JK et al. 2011. Eosinophils Sustain Adipose Alternatively Activated Macrophages Associated with Glucose Homeostasis. Science 332(6026):243‐247. 

[10]  Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M,  Leibel RL, Ferrante AW,  Jr. 2003. Obesity  is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation 112(12):1796‐1808. 

[11]  Roberts‐Toler  C, O'Neill  BT,  Cypess AM.  2015. Diet‐induced  obesity  causes  insulin  resistance  in mouse  brown adipose tissue. Obesity 23(9):1765‐70. 

[12]  Qiu Y, Nguyen Khoa D, Odegaard  Justin I, Cui X, Tian X, Locksley Richard M et al. 2014. Eosinophils and Type 2 Cytokine Signaling in Macrophages Orchestrate Development of Functional Beige Fat. Cell 157(6):1292‐1308. 

[13]  Nguyen KD, Qiu Y, Cui X, Goh YPS, Mwangi J, David T et al. 2011. Alternatively activated macrophages produce catecholamines to sustain adaptive thermogenesis. Nature 480(7375):104‐108. 

[14]  Hussaarts  L, García‐Tardón N,  van Beek  L, Heemskerk MM, Haeberlein  S,  van der  Zon GC et al. 2015. Chronic helminth  infection  and  helminth‐derived  egg  antigens  promote  adipose  tissue M2 macrophages  and  improve insulin sensitivity in obese mice. The FASEB Journal 29(7):3027‐3039. 

[15]  Wolfs IMJ, Stöger JL, Goossens P, Pöttgens C, Gijbels MJJ, Wijnands E et al. 2014. Reprogramming macrophages to an  anti‐inflammatory  phenotype  by  helminth  antigens  reduces  murine  atherosclerosis.  The  FASEB  Journal 28(1):288‐299. 

[16]  Kooij G, Braster R, Koning  JJ, Laan LC, van Vliet SJ, Los T et al. 2015. Trichuris suis  induces human non‐classical patrolling  monocytes  via  the  mannose  receptor  and  PKC:  implications  for  multiple  sclerosis.  Acta Neuropathologica Communications 3(1):45. 

[17]  Boros DL, Warren KS. 1970. Delayed hypersensitivity‐type granuloma formation and dermal reaction induced and elicited  by  a  soluble  factor  isolated  from  Schistosoma mansoni  eggs.  The  Journal  of  Experimental Medicine 132(3):488. 

[18]  Klaver EJ, Kuijk LM, Laan LC, Kringel H, van Vliet SJ, Bouma G et al. 2013. Trichuris suis‐induced modulation of human dendritic cell function is glycan‐mediated. International Journal for Parasitology 43(3–4):191‐200. 

[19]  Zennaro MC, Le Menuet D, Viengchareun S, Walker F, Ricquier D, Lombès M. 1998. Hibernoma development  in transgenic mice  identifies brown adipose  tissue as a novel  target of aldosterone action. The  Journal of Clinical Investigation 101(6):1254‐1260. 

[20]  Lee M‐W, Odegaard  JI, Mukundan  L, Qiu  Y, Molofsky  AB, Nussbaum  JC  et  al.  2015.  Activated  Type  2  Innate Lymphoid Cells Regulate Beige Fat Biogenesis. Cell 160(1–2):74‐87. 

[21]  Park  YM,  Bochner  BS.  2010.  Eosinophil  Survival  and  Apoptosis  in  Health  and  Disease.  Allergy,  Asthma  & Immunology Research 2(2):87‐101. 

[22]  Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang H‐E, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A et al. 2013. Innate lymphoid type 2 cells  sustain  visceral  adipose  tissue  eosinophils  and  alternatively  activated  macrophages.  The  Journal  of Experimental Medicine 210(3):535. 

[23]  Wen T, Besse JA, Mingler MK, Fulkerson PC, Rothenberg ME. 2013. Eosinophil adoptive transfer system to directly evaluate pulmonary eosinophil trafficking in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences 110(15):6067‐6072. 

[24]  Ochiai K,  Iwamoto  I, Takahashi H, Yoshida S, Tomioka H, Yoshida S. 1995. Effect of  IL‐4 and  interferon‐gamma (IFN‐gamma)  on  IL‐3‐  and  IL‐5‐induced  eosinophil  differentiation  from  human  cord  blood mononuclear  cells. Clinical and Experimental Immunology 99(1):124‐128. 

Type 2 immunological effects of HFD and helminth antigens on adipose tissue 

79  

[25]  Alam  R,  Forsythe  P,  Stafford  S,  Fukuda  Y.  1994.  Transforming  growth  factor  beta  abrogates  the  effects  of hematopoietins on eosinophils and induces their apoptosis. The Journal of Experimental Medicine 179(3):1041. 

[26]  Tirado‐Rodriguez B, Ortega E, Segura‐Medina P, Huerta‐Yepez S. 2014. TGF‐β: An Important Mediator of Allergic Disease and a Molecule with Dual Activity in Cancer Development. Journal of Immunology Research 2014:318481. 

[27]  Rosenberg HF, Dyer KD, Foster PS. 2013. Eosinophils: changing perspectives in health and disease. Nature reviews. Immunology 13(1):9‐22. 

[28]  Sanchez‐Gurmaches  J, Guertin DA. 2014. Adipocytes arise  from multiple  lineages  that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications 5. 

[29]  Kuijk LM, van Die  I. 2010. Worms to the rescue: Can worm glycans protect from autoimmune diseases?  IUBMB Life 62(4):303‐312. 

 

Chapter 4 

80  

 

  

5 

 

Diet‐inducedobesityinmicediminisheshematopoieticstemandprogenitorcellsinthebonemarrow

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Susan M.  van  den  Berg1,*,  Tom  T.P.  Seijkens1,*,  Pascal  J.H.  Kusters1,  Linda  Beckers1, Myrthe  den 

Toom1, Esther Smeets1, Johannes Levels2, Menno P.J. de Winther1 and Esther Lutgens1,3 

 1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Centre, University of Amsterdam, 

the Netherlands 2Department of Experimental Vascular Medicine, Academic Medical Centre, University of Amsterdam, the Netherlands  3Institute for Cardiovascular Prevention, Ludwig Maximilians University, Munich, Germany 

 

*theseauthorscontributedequallytothiswork.

 

The FASEB Journal 2016; 30(5):1779‐1788 

Chapter 5 

82  

Abstract 

Obesity  is  associated  with  chronic  low‐grade  inflammation,  characterized  by  leukocytosis  and 

inflammation  in  the  adipose  tissue. Continuous  activation of  the  immune  system  is  a  stressor  for 

hematopoietic stem‐ and progenitor cells  (HSPCs)  in  the bone marrow  (BM). Here we studied how 

diet‐induced obesity (DIO) affects HSPC population dynamics in the BM. Eight groups of age‐matched 

C57Bl/6 mice received a high fat diet  (HFD; 45% kcal from fat) ranging from 1 day up to 18 weeks. 

The obesogenic diet caused decreased proliferation of lineage‐Sca‐1+c‐Kit+ (LSK) cells in the BM and a 

general  suppression  of  progenitor  cell  populations  including  common  lymphoid  progenitors  and 

common myeloid progenitors. Within the LSK population, DIO  induced a shift  in stem cells that are 

capable  of  self‐renewal  towards maturing multipotent  progenitor  cells.  The  higher  differentiation 

potential  resulted  in  increased  lymphoid  and  myeloid  ex  vivo  colony  forming  capacity.  In  a 

competitive  BM  transplantation,  BM  from  obese  animals  showed  impaired  multilineage 

reconstitution when transplanted into chow fed mice. Our data demonstrate that obesity stimulates 

the  differentiation  and  reduces  proliferation  of  HSPCs  in  the  BM,  leading  to  a  decreased  HSPC 

population.  This  implies  that  the  effects  of  obesity  on HSPCs  hampers  proper  functioning  of  the 

immune system. 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

83  

Introduction 

Obesity and obesity‐associated complications such as cardiovascular diseases and type 2 diabetes are 

responsible  for  high morbidity  and mortality  rates worldwide. Obesity  is  characterized  by  a  pro‐

inflammatory activation status of immune cells within the adipose tissue, but also in liver, pancreas, 

muscle and hypothalamus  [1]. Cells  from both  the  innate and adaptive  immune  system, especially 

adipose  tissue macrophages, but also CD8+, CD4+ effector and  regulatory T cells, are crucial  in  the 

pathogenesis of obesity and its metabolic complications [1, 2]. Interestingly, in experimental‐ as well 

as human obesity,  an  increase  in  the  circulating pool of  these  (activated)  immune  cells has been 

observed [3‐5]. 

 

The  primary  site  of  immune  cell  production  is  the  bone marrow  (BM), where  the most  primitive 

precursors,  the  hematopoietic  stem  and  progenitor  cells  (HSPCs),  reside.  These  cells,  defined  as 

lineage‐Sca‐1+c‐Kit+  (LSK)  cells,  are  located  in  a  specialized  BM microenvironment, which  critically 

regulates self‐renewal, quiescence, differentiation and mobilization of the HSPCs via growth factors 

(including  stem  cell  factor;  SCF,  macrophage‐,  granulocyte  macrophage‐,  granulocyte‐,  colony 

stimulating  factor; M‐CSF, GM‐CSF, G‐CSF),  chemokines,  cytokines  (including  TNF,  IFNγ,  IL‐6),  cell 

cycle  regulators  (cyclins  and  tumor  suppressor  genes)  and  adhesion  signals  [6,  7].  Hence,  HSPC 

quiescence and proliferation  is  tightly  regulated  to prevent  stem cell exhaustion,  thereby ensuring 

lifelong hematopoiesis [8]. 

 

The most primitive hematopoietic stem cells are defined by the cell surface marker CD150 and can 

give rise to an active self‐renewing HSPC population [9]. The acquisition of CD34 is one of the earliest 

events during activation of HSPCs from their dormant state. Further differentiation is marked by loss 

of  CD150  and  gain  of  CD135,  resulting  in  differentiating  progenitor  cells  [9,  10].  Loss  of  CD150 

expressing cells is therefore functionally associated with less self‐renewal capacity. 

 

Hematopoietic stressors, such as  inflammation, affect HSPC homeostasis. HSPCs directly respond to 

cytokines, such as IFNγ, TNF, IL‐1 and IL‐6 [11‐16]. For example, Escherichia coli infection leads to an 

expansion of  the HSPC population via LPS‐induced TNF and NF‐κB  signaling  [17, 18]. Furthermore, 

pseudomonas aeruginosa and mycobacterium avium  infections are associated with defective  stem 

cell activity and BM  from  infected mice does not engraft well after  transplantation  [14, 19]. These 

studies  suggest  that  immune‐mediated  BM  exhaustion  can  result  from  persistent  activation  of 

quiescent HSPCs, thus depleting the total HSPC population over time. 

 

Besides  acute  inflammation  during  infection,  chronic  inflammatory  conditions  also  alter  HSPC 

biology. We and others have  reported  that atherosclerosis, a  chronic  inflammatory disease of  the 

arteries,  is associated with hypercholesterolemia‐driven expansion of the HSPC population  in BM of 

LDLr‐/‐  mice,  especially  of  the  myeloid  population  [20,  21].  Mouse  models  of  extreme  obesity, 

including  leptin deficient Ob/Ob mice, as well as C57Bl/6 mice on a 60% high  fat diet  (HFD), also 

present with an increase in progenitor cells in the BM [5, 22]. However, the precise effects of obesity 

on  the HSPC population  remain elusive. We  therefore  investigated how an obesogenic diet affects 

the HSPC population in the BM over the course of 18 weeks, using a relatively mild model (45% kcal 

from fat) of diet‐induced obesity (DIO) in mice. 

Chapter 5 

84  

Materials and methods 

Animals Age‐matched male C57Bl/6 mice  (Charles River) were  included  in  the experiments at  the age of 7 

weeks, at which  time  the  first group of mice received a HFD  (45% kcal  fat, 35% kcal carbohydrate, 

20% kcal protein, Special Diets Services, Witham, United Kingdom) and all other groups were kept on 

a chow diet. All mice were given a HFD  in a time course ranging from 1 day up to 18 weeks before 

sacrifice. All mice were sacrificed at the age of 25 weeks, regardless of the length of obesogenic diet. 

Mice had ad  libitum access  to  food and water and were maintained under a 12h  light‐dark  cycle. 

Mice were fasted overnight and subsequently euthanized. Glucose levels were measured from whole 

blood  using  a  glucometer  (Bayercontour,  Basel,  Switzerland).  Blood  was  obtained  by  cardiac 

puncture  using  EDTA‐filled  syringes  and  organs  (BM  and  epididymal  adipose  tissue;  EpAT)  were 

dissected and processed for flow cytometric analysis. All experimental procedures were approved by 

the Animal Experimentation Ethics Committee of the University of Amsterdam. 

Hematological and lipoprotein measurements 

Hematological analysis was performed on a ScilVet abc plus+ (ScilVet, Oostelbeers, The Netherlands). 

Plasma  triglyceride  and  cholesterol  levels  were  measured  by  fast‐performance  liquid 

chromatography, as described previously [20]. 

Flow cytometry 

BM was harvested  in  cold PBS. BM  cell  suspension was passed  through a 70 µm nylon mesh  (BD 

Biosciences,  Breda,  the Netherlands).  Lineage  depletion was  performed  for  the  HSPC  analysis  by 

magnetic  bead  isolation  according  to  the manufacturer’s  instructions  (Lineage  Cell  Depletion  Kit; 

Miltenyi Biotec, Teterow, Germany). EpAT was rinsed in PBS, minced into small pieces, digested in a 

collagenase mixture  (DMEM‐20 mM HEPES,  Collagenase  I  and  XI,  Sigma‐Aldrich,  Zwijndrecht,  the 

Netherlands)  for  45 minutes  at  37°C,  passed  through  a  70  µm  nylon mesh  (BD  Biosciences)  and 

centrifuged at 1,250 rpm for 6 minutes. The pelleted SVF was resuspended in FACS buffer (0.5% BSA 

in PBS). Blood and BM cell suspensions were  incubated with hypotonic  lysis buffer (8.4 g NH4Cl and 

0.84  g NaHCO3 per  liter  distilled water)  to  remove  erythrocytes. Cell  suspensions were  incubated 

with an Fc‐receptor blocking antibody to prevent non‐specific binding. CD3, CD8, CD25, FoxP3, F4/80, 

CD11b,  CD11c,  Gr‐1,  CD45.1,  B220  (eBioscience,  San  Diego,  CA,  USA),  CD4  (BD  Biosciences)  and 

CD45,  Ly6G, CD206  (Biolegend, San Diego, CA, USA) antibodies were  incubated with  the  indicated 

tissues. BM cells were characterized using antibodies for CD5, CD11b, Ter119, Sca‐1, CD34, CD16/32, 

CD127 (eBioscience), B220 (BD Biosciences) and Ly6G, c‐Kit, CD150, CD135 (Biolegend). Staining was 

analyzed by FACS (FACSCanto II, BD Biosciences) and FlowJo software version 7.6.5. (Tree star). 

 

FACS  analysis  on mature  hematopoietic  cells  in  blood  started  by  first  gating  on  the  total  CD45+ 

leukocyte  population.  Myeloid  cells  were  selected  on  CD11b+.  Within  the  CD11b+  population, 

monocytes were  selected  by  excluding  Ly6G+  neutrophils  and  pro‐inflammatory monocytes were 

then defined by the remaining Gr1+ population, as Gr1 binds both Ly6C as Ly6G. Lymphoid cells were 

selected on CD3+,  then gated  for CD8+CD4‐  (cytotoxic T cells) and CD8‐CD4+  (T helper cells). Within 

this T helper cell population we characterized regulatory T cells by CD25+FoxP3+. 

 

 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

85  

BrdU labelling 

Mice were  injected  intraperitoneally with 0.2 mg/g BrdU. BM was collected 16 hours  later, and Lin‐ 

cells  were  isolated.  BrdU  incorporation  was  determined  by  intracellular  staining  with  anti‐BrdU 

antibodies, using the FITC BrdU Flow Kit (BD Biosciences). 

Propidium iodide (PI) staining 

For cell‐cycle analysis, Lin‐ BM cells were stained with the primary antibodies, fixed  in 70% ethanol 

for 48 hours, and treated with PI RNase buffer (BD Biosciences). 

Colony‐forming unit (CFU) assays 

BM  was  isolated  and  1x104  BM  cells  were  cultured  in  2  ml  semisolid  methylcellulose  medium 

supplemented with growth factors (MethoCult; Stem Cell Technologies, Grenoble, France) at 37°C in 

98% humidity and 5% CO2 for 7 days. The amount of lymphoid‐, myeloid‐, granulocyte‐ and monocyte 

colonies was counted by T.S., who was blinded for the experimental conditions. 

Competitive Bone Marrow Transplantation (cBMT) 

C57Bl/6  CD45.2  recipient mice  were  housed  in  filter‐top  cages  and  received  antibiotics  in  their 

drinking water (60 U/ml polymyxin B sulfate, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA and 100 g/ml neomycin, 

Sigma) 1 week pre‐BMT and 5 weeks post‐BMT. The mice received 2x6 Gy total body  irradiation on 

two  consecutive days. BM was  isolated  from  age‐matched donor C57Bl/6 CD45.1 mice  fed  either 

chow or 45% HFD for 10 weeks, and mixed 2:1 with BM from donor C57Bl/6 CD45.2 chow fed mice. 

Donor BM was injected intravenously. Starting 4 weeks post‐BMT, blood samples were taken every 3 

weeks to analyze the reconstitution of peripheral blood leukocytes by flow cytometry. 

Quantitative PCR 

Total  RNA  was  extracted  using  TRIzol  (Invitrogen)  and  reverse  transcribed  with  an  iScript  cDNA 

synthesis kit  (Bio‐Rad, Veenendaal,  the Netherlands). The quantitative PCR was performed using a 

SYBR green PCR kit and a ViiA7 RT‐PCR system (Applied Biosystems, Leusden, the Netherlands). The 

result is expressed as relative to the control group, which was assigned a value of 1.  

Statistics 

Results are presented as mean ± SEM. Analysis between two groups was done by a Student’s t test, 

more than two groups by a one‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group 

expressed  relative  to  the  control group. The  repeated measures on blood  leukocytes  in  the  cBMT 

experiments were  analyzed by  a  two‐way ANOVA with matched  values  and  a bonferroni multiple 

comparison test. Statistics were calculated in GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, 

CA, USA). P‐values <0.05 were considered significant. 

Results 

A 45% obesogenic diet induces a pro‐inflammatory immune cell profile in the peripheral blood  

Eight groups of age‐matched C57Bl/6 mice were subjected to different durations of obesogenic diet 

(Fig.  1A  for  a  graphic  study design). Body weight  increased  after  2 weeks  of  the obesogenic diet 

(Table 1). Blood glucose levels increased in the HFD groups (Table 1). Total plasma cholesterol levels 

(in VLDL, LDL and HDL) increased after 3 days, and plasma triglyceride levels (in VLDL) were elevated 

after 2 weeks of HFD feeding (Table 1) compared to the 0 days HFD group. 

Chapter 5 

86  

Table 1. General characteristics of mice in the course of DIO    Weeks of HFD 

Mean ± SEM (p)a 

  0  1/7  3/7  1  2  4  10  18 

Body weight, g  27.3  ± 0.6 

29.5  ± 0.6 

31.1  ± 0.8 

31.5  ± 0.5 

34.4  ± 0.9(***) 

36.5  ± 1.2(***) 

38.1  ± 0.9(***) 

41.3  ± 2.0 (***) 

Glucose, mg/dl  69  ± 3 

130  ± 15 (***) 

118  ± 7 (**) 

123  ± 4 (***) 

104  ± 5 (*) 

91  ± 4 

112  ± 9 (**) 

124  ± 7 (***) 

Triglycerides, µM  203  ± 19 

253  ± 51 

405  ± 87 

343  ± 60 

508  ± 71 (**) 

810  ± 82 (***) 

535  ± 28 (**) 

603  ± 47 (***) 

  VLDL  100  ± 15 

133  ± 17 

283  ± 56 

253  ± 61 

408  ± 55 (**) 

668  ± 90 (***) 

423  ± 24 (***) 

473  ± 46 (***) 

  LDL  90  ± 10 

110  ± 30 

103  ± 27 

75  ± 3 

88  ± 14 

128  ± 26 

95  ± 10 

112  ± 6 

  HDL  13  ± 2 

10  ± 4 

20  ± 7 

15  ± 5 

13  ± 3 

15  ± 3 

18  ± 5 

18  ± 2 

Cholesterol, mM  1.75  ± 0.13 

2.40  ± 0.17 

2.92  ± 0.18 (***) 

2.88  ± 0.26 (***) 

2.83  ± 0.13 (**) 

2.87  ± 0.27 (***) 

3.27  ± 0.08 (***) 

3.32  ± 0.08 (***) 

  VLDL  0.02  ± 0.004 

0.02  ± 0.003 

0.03  ± 0.009 

0.03  ± 0.008 

0.05  ± 0.007 

0.09  ± 0.020 (***) 

0.06  ± 0.005  (*) 

0.06  ± 0.006  (*) 

  LDL  0.27  ± 0.03 

0.42  ± 0.03 

0.81  ± 0.11 (**) 

0.68  ± 0.08  (*) 

0.74  ± 0.13 (**) 

0.76  ± 0.14 (**) 

0.89  ± 0.09 (***) 

1.00  ± 0.06 (***) 

  HDL  1.46  ± 0.13 

1.97  ± 0.14 

2.07  ± 0.16 (*) 

2.17  ± 0.19 (**) 

2.05  ± 0.08  (*) 

2.03  ± 0.15 (*) 

2.32  ± 0.08 (***) 

2.26  ± 0.04 (***) 

aData  in  this  table  is analyzed by a one‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and  the  change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group. n=10‐11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001.   

 

Total  blood  leukocyte  counts  did  not  differ  between  the  groups  (Fig.  1B).  The  percentage  of 

CD11b+Ly6G‐ monocytes as well as the percentage of CD3+ T cells was not affected by the obesogenic 

diet  (Fig.  1C,D).  However,  both  the myeloid  and  lymphoid  fraction  showed  a  pro‐inflammatory 

profile. Starting at 4 weeks of HFD, the number of pro‐inflammatory Gr1high monocytes (Fig. 1E) and 

number of cytotoxic CD8+ T cells, the T cell fraction considered to induce AT inflammation and insulin 

resistance [23], had increased (Fig. 1F). This was accompanied by a relative decrease in CD4+ T helper 

cells  (Fig. 1G). The regulatory T cell  fraction showed a slight  increase during  the  first  few weeks of 

HFD, but decreased  again with more  advanced obesity  (Fig. 1H).  Similar  results were obtained  in 

spleen (Supplemental Fig. 1). 

An obesogenic diet causes a switch from quiescent to differentiating LSK cells  

Since the obesogenic diet affects the mature immune cell populations, we investigated the effects of 

an obesogenic diet on HSPC biology. HSPCs were defined as Lin‐Sca‐1+c‐Kit+ (LSK) cells and within this 

LSK population we studied different subsets;  long‐term hematopoietic stem cells  (LT‐HSCs; Lin‐Sca‐

1+c‐Kit+CD150+CD34‐),  short‐term  hematopoietic  stem  cells  (ST‐HSCs;  Lin‐Sca‐1+c‐Kit+CD150+CD34+), 

as  well  as  the  early  multipotent  progenitors  (E‐MPPs;  Lin‐Sca‐1+c‐Kit+CD150‐CD135‐),  and  late 

multipotent progenitors (L‐MPPs; Lin‐Sca‐1+c‐Kit+CD150‐CD135+)(Fig. 2A for an overview) [20]. 

 

Interestingly, within the LSK population, the obesogenic diet relatively decreased the ST‐HSCs after 4 

weeks whereas  the  percentage  of  LT‐HSC  fraction was  not  affected  (Fig.  2B,C).  Remarkably,  the 

percentage of E‐MPPs was increased already after 3 days of HFD feeding and remained increased  

 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

87  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

over the course of obesity (Fig. 2D). We also observed a small decrease in percentage of L‐MPP after 

10 weeks of HFD (Fig. 2E). LT‐ and ST‐HSCs are capable of self‐renewal, however, this characteristic is 

lost when they mature and differentiate to multipotent progenitors. Our data thus  indicate that an 

obesogenic diet shifts the characteristics of early HSPCs from a quiescent population capable of self‐

renewal, towards a more mature HSPC population with increased differentiation potential. 

 

 

Figure 1. Pro‐inflammatory immune cell profile in peripheral blood by FACS in a time course of DIO. (a) Study design. (b) No changes in total blood leukocyte counts or (c) percentage of CD11b+Ly6G‐ monocytes and (d) CD3+ T cells of the total  leukocyte  population  (CD45+).  (e)  After  4 weeks  of  the  obesogenic  diet,  pro‐inflammatory  Gr1high monocytes increased,  as  well  as  (f)  CD8+  cytotoxic  T  cells.  (g)  CD4+  T  helper  cells  decreased,  whereas  (h)  the  regulatory CD4

+CD25+FoxP3+ T  cells  increased  after 1 week of HFD but  stabilized  again  in  the  course of DIO.  n=10‐11,  *=P<0.05, **=P<0.01 (1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group). 

AWeeks of HFD

0

1/7

3/7

1

2

4

10

18

HFD

Chow

†

7 weeks 25 weeksAge

Monocytes

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

5

10

15

20

Weeks of HFD

% C

D11

b+ Ly6

G- (

of C

D45

+ )

Pro-inflammatory monocytes

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

2

4

6

8

* *

Weeks of HFD

% G

r1hi

gh (o

f CD

45+ )

Blood leukocyte count

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

1

2

3

4

5

Weeks of HFD

WB

C 1

09 /l

T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40

Weeks of HFD

% C

D3+ (

of C

D45

+ )

Helper T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40

50

**

** **

Weeks of HFD

% C

D4+ (

of C

D45

+ CD

3+ )

Cytotoxic T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40 * *

Weeks of HFD

% C

D8+ (

of C

D45

+ CD

3+ )

Regulatory T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

5

10

15

**

Weeks of HFD

% C

D25

+ Fox

P3+ (

of C

D4+ )

C D

E F

G

B

H

Chapter 5 

88  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

When  culturing  BM  from  the  obesogenic  fed  mice  in  a  CFU  assay  ex  vivo,  the  increase  in 

differentiation potential further pushed the cells towards differentiation, as indicated by an increase 

in  lymphoid  colony  forming  potential  of  the BM  of mice  receiving  an  obesogenic  diet which was 

already  increased after 3 days and  continued  to  increase over  the course of obesity  (Fig. 2F). The 

myeloid  colony  forming  potential  of  BM  cells  increased  after  a more  prolonged  duration  of  the 

obesogenic diet, resulting in an increase in myeloid and monocyte forming colonies after 18 weeks of 

HFD feeding, when obesity was established (Fig. 2G‐I). 

HSPCs of obesogenic mice exhibit decreased proliferation 

Differentiating LSK cells  loose Sca‐1 (LK cells) and/or c‐Kit (LS cells) and start to express markers for 

common  myeloid  progenitors  (CMPs;  Lin‐Sca‐1‐c‐Kit+CD34+CD16/32low)  or  common  lymphoid 

progenitors (CLP; Lin‐Sca‐1+c‐Kit‐CD127+) (Fig. 3A for an overview) [10, 20].  

 

Granulocytes

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

5

10

15

20

Weeks of HFD

Colo

nies

(n)

Monocytes

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

20

40

60 *

Weeks of HFDCo

loni

es (n

)

Myeloid

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

20

40

60

80

100*

Weeks of HFD

Colo

nies

(n)

Lymphoid

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

50

100

150

*

*****

*

Weeks of HFD

Colo

nies

(n)

L-MMPs in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40

*

Weeks of HFD

% C

D150

- CD13

5+ (of L

SK)

E-MMPs in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

20

40

60

80

* *

******

***

Weeks of HFD

% C

D150

- CD13

5- (of L

SK)

ST-HSCs in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

1

2

3

4

5

****** **

Weeks of HFD

% C

D150

+ CD34

+ (o

f LSK

)

LT-HSCs in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40

Weeks of HFD

% C

D150

+ CD34

- (of L

SK)

A B C

D E

F G IH

LT- HSC

ST-HSC

E-MPP

L-MPP

CD150+CD34-

CD150+CD34+

CD150-CD135-

CD150-CD135+

Prim

itivity

Figure 2. DIO shifts early HSPCs  towards a more mature HSPC population with higher differentiation potential.  (a) Schematic overview of HSPC maturation in the BM. (b) FACS data of LT‐HSC, (c) ST‐HSC, (d) E‐MMP, (e) L‐MMP of all LSK cells showing a decrease of ST‐HSC after 4, 10 and 18 weeks of the obesogenic diet, together with an increase in E‐MMP cells after 3 days, and 2 to 18 weeks of HFD. (f‐i) CFU assays of BM from mice on an obesogenic diet showing increased potential to form lymphoid and myeloid colonies. n=10‐11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group). 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

89  

Figure  3.  LSK  cell maturation  in  BM  of  obesogenic mice.  (a)  Schematic  overview  of  LSK  cell maturation.  (b)  The percentage LSK cells of all Lin‐ cells in the BM did not differ in the course of DIO. (c) Decreased myeloid progenitors (LK cells) after 4, 10 and 18 weeks and (d) a decrease in lymphoid progenitors (LS cells) after 18 weeks of obesogenic diet. (e) A decrease  in CMP was seen after 18 weeks and (f) a decrease  in CLP after 10 weeks. n=10‐11, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001 (1‐way ANOVA followed by Tukey post‐test analysis and the change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group). 

LSK cells in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Weeks of HFD

% S

ca-1

+ c-Ki

t+ (of l

in- )

LS cells in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

1

2

3

4

*

Weeks of HFD

% S

ca-1

+ (of l

in- )

LK cells in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40

50

** *

***

Weeks of HFD

% c

-Kit+ (o

f lin

- )

CMP cells in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

*

Weeks of HFD

% C

D34+ CD

16/3

2+ (of L

K ce

lls)

CLP cells in BM

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

5

10

15

***

Weeks of HFD

% C

D127

+ (of L

SK c

ells

)

A B

C D

E F

LSK

CLPCMP

LSLK

Lin-Sca-1+c-Kit+

Lin-Sca-1+Lin-c-Kit+

CD127+CD34+CD16/32+

Prim

itivity

Chapter 5 

90  

Although we observed a shift within the total LSK population from early HSPC populations towards a 

more differentiation‐  capable progenitor  cell, which we  confirmed by  the  increased  lymphoid and 

myeloid CFU potential,  the  fraction of LSK, LK and LS cells, as well as  the  fraction of CLP and CMP 

remained stable or even decreased over the course of obesity (Fig. 3B‐F). This observation made us 

hypothesize that although the HSPCs show an increased differentiation into mature immune cells,  

they  may  suffer  from  exhaustion  in  an  obesogenic  environment.  We  therefore  analyzed  the 

proliferative and reconstitution capacity of HSPCs primed by an obesogenic diet. 

 

BrdU uptake in LSK cells in the BM was measured in mice that received the 45% obesogenic diet or a 

chow diet for 18 weeks. Interestingly, Lin‐, LSK as well as LK cells exhibited a lower proliferation rate 

in the HFD group compared to chow diet (Fig. 4A‐D). Furthermore, PI staining of Lin‐ cells in the BM 

showed that in the obesogenic diet group, a higher percentage of cells was in the G0/G1 phase of the 

cell cycle (Fig. 4e), and a lower percentage of cells was in the M phase (Fig. 4F,G). 

 

Figure 4. Decreased proliferation of HSPCs in BM of obese mice after 18 weeks of obesogenic diet. FACS data showing a  decrease  in  BrdU  labelled  (a)  Lin‐  cells,  (b)  LSK  cells  and  (c)  LK  cells,  but  no  differences  in  (d)  LS  cells  between obesogenic and chow fed mice. (e) Schematic overview of different phases in cell division. (f) Cell cycle analysis of the BM by DNA staining showing a higher percentage of cells in the G0/G1 resting phase and a lower percentage of cells in the G2/M dividing phase of the cell cycle in the HFD group compared to a chow diet. (g) A representative PI staining of the two experimental groups. n=9‐10, *=P<0.05, **=P<0.01 (Student’s t tests). 

% proliferating LK cells

Chow 18w HFD0

10

20

30

40

50

**

% B

rdU+ c

ells

(of L

K ce

lls)

% proliferating LS cells

Chow 18w HFD0

20

40

60

80

100

% B

rdU+ c

ells

(of L

S ce

lls)

% proliferating lin- cells

Chow 18w HFD0

20

40

60

80

**

% B

rdU+

cel

ls (o

f Lin

- )

% proliferating LSK cells

Chow 18w HFD0

5

10

15

20

25

*

% B

rdU+ c

ells

(of L

SK)

A B C

D E

F

S G1

G2

M

Gap 1

DNA

synthesis

Gap 2

Mitosis

GGGChow

18w HFD

G0/G1 S/G2 M0

20

40

60

80Chow18w HFD

*

*

% o

f cel

ls

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

91  

Gene expression of cell cycle regulators, Cyclin D2, E1 and A2, which regulate G1 progression, G1‐S 

transition and S phase progression respectively [24‐27], were decreased in obesogenic BM cells (Fig. 

5A‐C). In line with this, tumor suppressor genes p15 and p27, which prevent cdk4 and cdk2 activation 

via  cyclin  D  and  cyclin  E  interactions,  were  upregulated  in  the  obesogenic  BM,  all  reflecting 

suppression  of  proliferation  (Fig.  5D,E).  Furthermore,  cytokines  Tnf,  Il‐1β  and  Il‐6  (but  not  Ifnγ), 

factors  that have been shown  to suppress HSPC proliferation  [16], were  increased  in  the HFD BM, 

indicating alterations in the BM microenvironment that affect the proliferation of the HSPCs (Fig. 5F‐

I). We did not observe differences in Scf, M‐csf, Gm‐csf or G‐csf or their receptors (Fig. 5J,K), although 

our data does suggest a slight increase in these growth factors upon a HFD, which may be sufficient 

to stimulate differentiation of BM cells. 

 

 

TNF

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5

2.0p=0.07

rela

tive

gene

exp

ress

ion

IL-1b

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5 *

rela

tive

gene

exp

ress

ion

IL-6

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5

2.0*

rela

tive

gene

exp

ress

ion

IFNy

Chow 18w HFD0

1

2

3

rela

tive

gene

exp

ress

ion

Cyclin D2

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5

**

rela

tive

gene

exp

ress

ion

Cyclin E1

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5

**

rela

tive

gene

exp

ress

ion

Cyclin A2

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5

**re

lativ

e ge

ne e

xpre

ssio

n

p15

Chow 18w HFD0

1

2

3 *

rela

tive

gene

exp

ress

ion

p27

Chow 18w HFD0.0

0.5

1.0

1.5 *

rela

tive

gene

exp

ress

ion

F G IH

A B C

D E

SCF M-CSF M-CSFr0.0

0.5

1.0

1.5Chow18w HFD

rela

tive

gene

exp

ress

ion

GM-CSF GM-CSFr G-CSF G-CSFr0

2

4

6

8Chow18w HFD

p=0.05

rela

tive

gene

exp

ress

ion

KJ

Figure 5. An obesogenic diet for 18 weeks induced alterations in cell cycle regulator and cytokine gene expression in the BM.  (a‐c) Gene  expression of  cyclins was  increased  in obesogenic BM  compared  to  chow  fed mice.  (d,e) Gene expression of tumor suppressor genes p15 and p27 was decreased in obesogenic BM. (f‐i) Cytokine gene expression of TNF, IL‐1β and IL‐6, but not IFNγ, was increased in BM from HFD mice. (j,k) Gene expression of SCF, M‐CSF, GM‐CSF or G‐CSF or their receptors were not significantly increased in HFD BM. n=16‐19 *=P<0.05, **=P<0.01 (Student’s t tests). 

Chapter 5 

92  

Obesogenic‐primed HSPCs have decreased reconstitution capacity 

The  increase  in  differentiation  potential  of  HSPCs  in  vivo  in mice  fed  an  obesogenic  diet  and  a 

decreased proliferation capacity  led  to a decrease  in LK and LS cells.  Interestingly,  the decrease  in 

proliferation was lower than the decrease in cells. As the percentage of LSK cells decreased by 29%, 

the proliferation  in  this population was decreased by 25%. For  the LK and LS cells,  the decrease  in 

cells was 52% and 23%, whereas the decrease  in proliferation was 37% and 2.5% respectively. This 

indicates  that  the decrease  in  these progenitor  cell populations  is not  solely due  to a decrease  in 

proliferation.  Therefore,  we  hypothesized  that  an  obesogenic  environment  can  prime  HSPCs 

affecting their potential  to  initiate multilineage reconstitution. To test this hypothesis, a cBMT was 

performed with BM obtained from either HFD or chow fed donor CD45.1 mice, which was mixed with 

BM  obtained  from  chow  fed  donor  CD45.2  mice,  and  then  transplanted  in  chow  fed  CD45.2 

recipients (Fig. 6A). Reconstitution of immune cells was analyzed every three weeks starting 4 weeks 

post‐BMT. We determined the percentage of CD45.1 cells within different  leukocyte subsets, which 

had reconstituted from the BM of mice fed either an obesogenic or chow diet. We observed that the 

percentage of CD45.1 T  cells, B  cells, neutrophils, monocytes, Gr1high and Gr1low monocytes on all 

time points was  lower  in mice that received BM from an obesogenic donor than mice that received 

BM from a chow fed donor (Fig. 6B‐G). Furthermore, upon sacrifice, the percentage of CD8+ cytotoxic 

T  cells,  CD4+CD25+FoxP3+  regulatory  T  cells, monocytes  and  both M1‐  and M2‐like macrophages 

originating from the obesogenic donor BM was lower in EpAT compared to the chow donor BM (Fig. 

6H,I).  This  indicates  that  obesogenic‐primed  BM  is  less  capable  of  immune  cell  reconstitution  in 

blood and tissues. 

 

As  the  recipient  mice  did  not  receive  a  HFD,  these  results  show  that  HSPCs  subjected  to  an 

obesogenic  diet  are  primed  and  have  long‐term  central  effects  on  HSPC  biology.  The  shift  we 

observed  from  an  early  quiescent  self‐renewing  HSPC  population  towards mature  differentiating 

HSPCs, and a decreased potential to initiate multilineage reconstitution implies impaired self‐renewal 

capacity. 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

93  

Figure 6. Less  immune cell reconstitution of obesogenic‐primed BM  in a cBMT. (a) Schematic overview of a cBMT  in which CD45.1 BM from age‐matched 10 weeks HFD or 10 weeks chow fed donor mice was mixed with CD45.2 BM from chow  donor mice  and  transplanted  into  chow  CD45.2  recipients.  (b)  Blood  FACS  data  showing  that  transplanting obesogenic‐primed BM decreased the reconstitution of CD45.1

+ T cells, (c) CD45.1+ B cells, (d) CD45.1+ monocytes, (e) CD45.1

+  neutrophils,  (f)  CD45.1+  inflammatory  Gr1high  monocytes  and  (g)  CD45.1+  Gr1low  monocytes  compared  to transplantation  of  chow  BM.  (h,i)  Reconstitution  of  CD45.1  lymphoid  and  myeloid  cells  in  EpAT.  Mo=monocytes (CD11b

+Ly6G

‐), Ma=macrophages (CD11b

+F4/80

+), M1=M1‐like macrophages (CD11b

+F4/80

+CD11c

+CD206

‐), M2=M2‐like macrophages 

(CD11b+F4/80

+CD11c

‐CD206

+).  n =14 *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P<0.001, ****=P<0.0001 (b‐g: two‐way ANOVA with matched values 

followed by bonferroni multiple comparison test. h,i: Student’s t tests). 

EpAT

CD4+ CD8+ CD25+FoxP3+0

20

40

60

**

*% C

D45

.1

EpAT

Mo Ma M1 M20

20

40

60

80ChowHFD

* * **

% C

D45

.1

4w 6w 9w 12w0

20

40

60

80

* ** ***

**

Time

% C

D45

.1 (o

f CD

3+ B22

0- )

4w 6w 9w 12w0

20

40

60

80ChowHFD

******* ***

**

Time

% C

D45

.1 (o

f CD

11b+ L

y6G

+ )

4w 6w 9w 12w0

20

40

60

80ChowHFD

** ** ***

Time

% C

D45

.1 (o

f CD

11b+ G

r1lo

w)

F

H

A B

D

DonorsBone marrow

mixed 2:1

Recipients

Lean

CD45.1

Lean

CD45.2Lean

CD45.2

Obese

CD45.1

Lean

CD45.2

Lean

CD45.2

+

+

I

4w 6w 9w 12w0

20

40

60

80ChowHFD

************

****

Time

% C

D45

.1 (o

f B22

0+ CD

3- )

4w 6w 9w 12w0

20

40

60

80****

** ***

Time

% C

D45

.1 (o

f CD

11b+ L

y6G

- )

4w 6w 9w 12w0

20

40

60

80

***** ** **

Time

% C

D45

.1 (o

f CD

11b+ G

r1+ )

G

C

E

Chapter 5 

94  

Discussion 

Mild chronic  inflammation associated with obesity  is a stressor for HSPCs  in the BM. Here we show 

that a 45% obesogenic diet causes a switch from quiescent to differentiating HSPCs. The loss of self‐

renewing  characteristics  and  a  decrease  in  proliferation  results  in  impaired  multilineage 

reconstitution, revealing that an obesogenic environment has large effects on HSPC dynamics. 

 

In addition  to  the  traditional comorbidities of obesity, studies  in humans as well as animal models 

have  demonstrated  that  obesity  causes  impaired  immune  function,  leading  to  an  increased 

susceptibility  to  infectious  diseases  [28‐32].  Signals  in  the  BM microenvironment  regulate  HSPC 

dynamics.  The  composition  of  the  BM  is  therefore  essential  for  a  correct  functioning  of  the 

hematopoietic system. An increase in visceral fat in obesity is positively correlated with BM adiposity 

[33].  Consequently,  adipocyte  infiltration  and  accumulation  in  the  BM  can  affect  hematopoietic 

maintenance and differentiation [34]. Mesenchymal stem cells (MSC) in the BM are also involved in 

hematopoietic  niches  and  microenvironments.  A  HFD  induces  alterations  in  MSCs,  including 

increased  production  of  cytokines  IL‐1,  IL‐6,  and  TNF.  These  signals  may  influence  the  BM 

microenvironment  and modulate  hematopoiesis,  and  consequently  hamper  proper  functioning  of 

the immune system [35]. 

 

Besides  dyslipidemia,  cholesterol  and  glucose  metabolism  appear  to  be  critical  for  proper 

maintenance  of  the  HSPC  population. Mice  with  defective  cholesterol  efflux  pathways  due  to  a 

deficiency of  apolipoprotein E or  abca1/abcg1 have  increased  levels of  growth  factors  in  the BM, 

which causes the HSPCs to proliferate and expand, leading to leukocytosis [36‐38]. Interestingly, in a 

previous  study  by  our  group  using  a  model  of  hypercholesterolemia  in  LDLR‐/‐  mice,  we  also 

observed an  increased expression of  inflammatory cytokines  in the BM,  including Tnf,  Il‐1β and  Il‐6 

[20] . However, here we show alterations in the HSPC population in DIO that opposite to our findings 

in hypercholesterolemic LDLR‐/‐ mice. Where the 45% HFD caused decreased proliferation of the LSK 

cells  and  decreased  reconstitution  in  a  cBMT,  hypercholesterolemia  resulted  in  increased 

proliferation and increased reconstitution in a cBMT [20]. Using a highly similar experimental setup in 

the same lab, the major differences are the diet and mouse model with 45% kcal from fat in C57Bl/6 

mice vs a hypercholesterolemic diet,  containing 0.15%  cholesterol,  in  LDLR‐/‐ mice. Full knock out 

models  for  defective  cholesterol  efflux  pathways  have  a  different  lipoprotein metabolism  which 

causes systemic hypercholesterolemia but can also directly affect the HSPCs. Our data show that an 

obesogenic diet  results  in  signals  that  causes HSPCs  to differentiate;  factors  that are  independent 

from  the  genotype  of  the  HSPCs  and  that  are  dominant  over  signals  that  could  stimulate 

proliferation.  Furthermore,  hypercholesterolemia  alone  is  potentially  a  less  severe  stressor 

compared to the systemic inflammation seen in obesity, which does stimulate leukocytosis but does 

not deplete the HSPC pool. 

 

Two models of obesity,  leptin deficient Ob/Ob mice, as well as C57Bl/6 mice on a 60% HFD  for 20 

weeks,  show  a  relative  increase  in  CMP  and  GMPs  in  the  BM, with  Ob/Ob mice  also  having  an 

expanded  HSPC  population  [5].  The  45%  HFD  in  our milder  obesity model  resulted  in  a  relative 

decrease  in CLP and CMP  cells and  their  lymphoid and myeloid progenitors  (LK and  LS  cells). One 

week of 60% HFD has been  shown  to  trigger a  transient depletion of  LT‐HSCs  followed by a  later 

increase  in  LT‐HSCs and MPPs  [22]. The 45% HFD may not have been as  robust as a 60% HFD  to 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

95  

deplete the LT‐HSC pool early in the course of HFD [22]. Furthermore, leukocytosis in our study is less 

severe  than  reported  in Ob/Ob mice or  in C57Bl/6 on a 60% HFD. However,  in our model, after 4 

weeks of HFD, we did observe  a decrease  in hematopoietic  stem  cells, possibly due  to  a  gradual 

depletion of the HSPC pool. Nagareddy et al also show that lowering glucose with a sodium glucose 

cotransporter 2 inhibitor in type 2 diabetic obese mice does not correct leukocytosis, indicating that 

hyperglycemia by  itself  is not  the major driver of  leukocyte production  [21]. Another difference  in 

these diets is the carbohydrate content. As more kcal are coming from fat, the relative carbohydrate 

content  is  less  (35%  in our 45% diet versus 20%  in  the 60% HFD). To distinguish  to contribution of 

different nutrients on HSPC dynamics would be interesting for future studies. 

 

When we transplanted BM from either  lean or obese mice, competitively mixed with BM from  lean 

mice,  into  lean  recipient mice,  the HFD‐primed BM was  less  capable of  systemic as well as  tissue 

leukocyte reconstitution. This indicates that priming of the HSPCs by a HFD cannot be reversed by a 

lean  BM  niche.  In weight  loss  experiments,  returning mice  from  a HFD  to  a  chow  diet  results  in 

normalization of body weight and glucose  tolerance and normalizes  the number of LT‐HSPCs  [22]. 

However, the quantity of granulocyte‐, macrophages progenitors and Lin‐ cells remained elevated in 

the BM, further suggesting long term, persisting, dietary effects on the HSPCs [22]. 

 

Within the LSK population, DIO induces a switch in cells that are capable of self‐renewal (the LT‐ and 

ST‐HSCs)  towards  immune  progenitor  cells with  a  higher  differentiation  potential  (E‐MPP  and  L‐

MPPs), as demonstrated by a  loss of CD150 expression. Our data on a relative  increase  in LSK cells 

with a higher differentiation potential  is  in  line with data  from Singer et al  [22] who  transplanted 

4000  sorted  LSK  cells  from  either  lean  or  obese  donors  in  lean  recipient mice, which  increased 

myelopoiesis  in mice  that  received obese donor  LSK  cells.  This  shows  that when  transplanting  an 

absolute  number  of  LSK  cells,  the  population  also  includes  relatively more  cells with maturation 

potential leading to an increased mature leukocytes in the circulation [22]. 

 

We observed an increase in ex vivo lymphoid and myeloid colony forming potential in the course of 

DIO. Taking cells out of their obesogenic BM environment possibly removes the suppressive effects 

on proliferation leaving the increased potential to differentiation, resulting in an increased number of 

colonies  in our CFU assays. This  increased differentiation combined with decreased proliferation  in 

vivo,  leads  to  a  decreased  supply  and  a  reduction  in  progenitor  cell  populations.  Interestingly, 

transplantation  of  obesogenic  BM  into  a  normolipidemic  environment  revealed  a  decrease  in 

multilineage  reconstitution  of  obesogenic  primed HSPCs, most  likely  resulting  from  the  increased 

quiescence of the HSPC. However, as we observed that the decrease  in progenitor cell populations 

was not solely due  to a decrease  in proliferation,  the additional effects observed after obesogenic 

diet priming may still result in an increased differentiation potential of the HSPCs. 

 

Our results and that of others show that the BM pool is altered in the low‐grade inflammatory state 

associated with obesity. Different nutritional and/or genetic models can  induce a variety and even 

opposing effects on the HSPCs. Signals from different tissues act on the hematopoietic system, which 

are  influenced by hypercholesterolemia, dyslipidemia  and hyperglycemia. Which model or dietary 

component contains the most dominant signals remains to be determined and should be taken into 

account when speculating on a potential therapy in humans.  

 

Chapter 5 

96  

The  present  study  demonstrates  that  an  obesogenic  diet  induces  long‐term  alterations  in  the 

hematopoietic system  including  loss of stemcellness and  loss of self‐renewal, which may result  in a 

depletion  of  the  most  primitive  HSPCs.  This  may  consequently  cause  disturbed  immunological 

responses  to  infections  and  contribute  to  the  persistence  and/or  progression  of  chronic 

inflammatory  diseases.  Furthermore,  as  an  obesogenic  diet  induces  long‐term,  cell‐intrinsic 

alterations  in  HSPCs,  obesity may  hamper  proper  functioning  of  the  immune  system,  even  after 

successful weight loss.  

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

97  

Corresponding author Prof.  Esther  Lutgens,  Department  of Medical  Biochemistry,  Experimental  Vascular  Biology,  Academic Medical  Centre, 

University  of  Amsterdam,  Meibergdreef  9,  1105  AZ,  Amsterdam,  The  Netherlands.  +31  (0)20  5  66  33  80. 

e.lutgens@amc.uva.nl 

Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. 

Acknowledgements We  acknowledge  the  support  from  the Netherlands Organization  for  Scientific  Research  (NWO)(VICI  grant  to  E.L.),  the 

Rembrandt  foundation  (S.B., M.W., E.L.),  the Dutch Heart Foundation  (Dr. E. Dekker MD‐grant  to T.S.),  the Netherlands 

CardioVascular Research  Initiative  (CVON2011‐19) and  the Deutsche Forschungsgemeinschaft  (DFG)  (SFB1054‐B04  to E.L. 

and SFB1123‐A5 to E.L.). 

Chapter 5 

98  

References 

[1]  Lumeng  CN,  Saltiel  AR.  2011.  Inflammatory  links  between  obesity  and metabolic  disease.  Journal  of  Clinical Investigation 121(6):2111‐2117. 

[2]  Ferrante AW. 2013. The immune cells in adipose tissue. Diabetes Obes Metab 15(s3):34‐38. [3]  Ouchi N, Parker JL, Lugus JJ, Walsh K. 2011. Adipokines  in  inflammation and metabolic disease. Nature Reviews 

Immunology 11(2):85‐97. [4]  Odegaard JI, Chawla A. 2011. Alternative Macrophage Activation and Metabolism. Annu Rev Pathol 6(1):275‐297. [5]  Nagareddy Prabhakara R, Kraakman M, Masters Seth L, Stirzaker Roslynn A, Gorman Darren J, Grant Ryan W et al. 

2014. Adipose Tissue Macrophages Promote Myelopoiesis and Monocytosis in Obesity. Cell Metab 19(5):821‐835. [6]  King KY, Goodell MA. 2011. Inflammatory modulation of HSCs: viewing the HSC as a foundation for the  immune 

response. Nat Rev Immunol 11(10):685‐692. [7]  Mendelson  A,  Frenette  PS.  2014.  Hematopoietic  stem  cell  niche  maintenance  during  homeostasis  and 

regeneration. Nat Med 20(8):833‐846. [8]  Wilson A, Laurenti E, Oser G, van der Wath RC, Blanco‐Bose W, Jaworski M et al. 2008. Hematopoietic Stem Cells 

Reversibly Switch from Dormancy to Self‐Renewal during Homeostasis and Repair. Cell 135(6):1118‐1129. [9]  Wilson A, Oser GM, Jaworski M, Blanco‐Bose WE, Laurenti E, Adolphe C et al. 2007. Dormant and Self‐Renewing 

Hematopoietic Stem Cells and Their Niches. Ann N Y Acad Sci 1106(1):64‐75. [10]  King KYG, Margaret A. 2011. Inflammatory modulation of HSCs: viewing the HSC as a foundation for the immune 

response. Nat Rev Immunol 11(10):8. [11]  Essers MAG, Offner S, Blanco‐Bose WE, Waibler Z, Kalinke U, Duchosal M et al. 2009.  IFNα activates dormant 

haematopoietic stem cells in vivo. Nature 458(7240):5. [12]  Zeng W, Miyazato A, Chen G, Kajigaya S, Young NS, Maciejewski JP. 2006. Interferon‐γ‐induced gene expression in 

CD34 cells: identification of pathologic cytokine‐specific signature profiles. Blood 107(1):167‐175. [13]  Selleri C, Sato T, Anderson S, Young N, Maciejewski  J. 1995.  Interferon‐γ and  tumor necrosis  factor‐α suppress 

both early and late stages of hematopoiesis and induce programmed cell death. J Cell Physiol 165(3):538‐46. [14]  Baldridge MT,  King  KY,  Boles NC, Weksberg DC, Goodell MA.  2010. Quiescent  haematopoietic  stem  cells  are 

activated by IFN‐γ in response to chronic infection. Nature 465(7299):5. [15]  Moldenhauer  A, Genter G,  Lun  A,  Bal G,  Kiesewetter H,  Salama  A.  2008. Hematopoietic  progenitor  cells  and 

interleukin‐stimulated endothelium: expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunol 9(1):56. [16]  Mirantes C, Passegué E, Pietras EM. 2014. Pro‐inflammatory cytokines: Emerging players regulating HSC function 

in normal and diseased hematopoiesis. Exp Cell Res 329(2):248‐254. [17]  Shahbazian LM, Quinton LJ, Bagby GJ, Nelson S, Wang G, Zhang P. 2004. Escherichia coli pneumonia enhances 

granulopoiesis  and  the mobilization  of myeloid  progenitor  cells  into  the  systemic  circulation.  Crit  Care Med 32(8):1740‐1746. 

[18]  Quinton LJ, Nelson S, Boé DM, Zhang P, Zhong Q, Kolls JK et al. 2002. The Granulocyte Colony‐Stimulating Factor Response after Intrapulmonary and Systemic Bacterial Challenges. J Infect Dis 185(10):1476‐1482. 

[19]  Rodriguez S, Chora A, Goumnerov B, Mumaw C, Goebel WS, Fernandez L et al. 2009. Dysfunctional expansion of hematopoietic stem cells and block of myeloid differentiation in lethal sepsis. Blood 114(19):4064‐4076. 

[20]  Seijkens  T, Hoeksema MA,  Beckers  L,  Smeets  E, Meiler  S,  Levels  J  et  al.  2014. Hypercholesterolemia‐induced priming of hematopoietic stem and progenitor cells aggravates atherosclerosis. FASEB J 28(5):2202‐2213. 

[21]  Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, Miller RG et al. 2013. Hyperglycemia promotes myelopoiesis and impairs the resolution of atherosclerosis. Cell metab 17(5):695‐708. 

[22]  Singer K, DelProposto J, Lee Morris D, Zamarron B, Mergian T, Maley N et al. 2014. Diet‐induced obesity promotes myelopoiesis in hematopoietic stem cells. Mol Metab 3(6):664‐675. 

[23]  Kanneganti T‐D, Dixit VD. 2012. Immunological complications of obesity. Nat Immunol 13(8):707‐712. [24]  Sherr CJ, Roberts JM. 1995. Inhibitors of mammalian G1 cyclin‐dependent kinases. Genes Dev 9(10):1149‐1163. [25]  Ando  K,  Ajchenbaum‐Cymbalista  F,  Griffin  JD.  1993.  Regulation  of  G1/S  transition  by  cyclins  D2  and  D3  in 

hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90(20):9571‐9575. [26]  Burger  C, Wick M, Muller  R.  1994.  Lineage‐specific  regulation  of  cell  cycle  gene  expression  in  differentiating 

myeloid cells. J Cell Sci 107(7):2047‐2054. [27]  Sherr CJ, Roberts JM. 1999. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1‐phase progression. Genes Dev 

13(12):1501‐1512. [28]  Dixit  VD.  2008.  Adipose‐immune  interactions  during  obesity  and  caloric  restriction:  reciprocal  mechanisms 

regulating immunity and health span. J Leukoc Biol 84(4):882‐892. [29]  Strandberg L, Verdrengh M, Enge M, Andersson N, Amu S, Önnheim K et al. 2009. Mice Chronically Fed High‐Fat 

Diet Have Increased Mortality and Disturbed Immune Response in Sepsis. PLoS ONE 4(10):e7605. [30]  Falagas ME, Kompoti M. 2006. Obesity and infection. Lancet Infect Dis 6(7):438‐446. [31]  Huttunen R, Syrjanen J. 2013. Obesity and the risk and outcome of infection. Int J Obes (Lond) 37(3):333‐340. [32]  Adler BJ, Kaushansky K, Rubin CT. 2014. Obesity‐driven disruption of haematopoiesis and the bone marrow niche. 

Nat Rev Endocrinol 10(12):737‐748. 

DIO in mice decreases HSPCs in the BM 

99  

[33]  Bredella MA, Torriani M, Ghomi RH, Thomas BJ, Brick DJ, Gerweck AV et al. 2011. Vertebral Bone Marrow Fat Is Positively  Associated With  Visceral  Fat  and  Inversely  Associated With  IGF‐1  in Obese Women. Obesity  (Silver Spring) 19(1):49‐53. 

[34]  Naveiras O, Nardi V, Wenzel PL, Hauschka PV,  Fahey  F, Daley GQ. 2009. Bone‐marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature 460(7252):259‐263. 

[35]  Cortez M, Carmo L, Rogero M, Borelli P, Fock R. 2013. A High‐Fat Diet Increases IL‐1, IL‐6, and TNF‐α Production by Increasing NF‐κB  and Attenuating  PPAR‐γ  Expression  in  Bone Marrow Mesenchymal  Stem  Cells.  Inflammation 36(2):379‐386. 

[36]  Yvan‐Charvet L, Pagler T, Gautier EL, Avagyan S, Siry RL, Han S et al. 2010. ATP‐Binding Cassette Transporters and HDL Suppress Hematopoietic Stem Cell Proliferation. Science 328(5986):1689‐1693. 

[37]  Murphy AJ, Akhtari M,  Tolani  S, Pagler  T, Bijl N, Kuo C‐L  et al.  2011. ApoE  regulates hematopoietic  stem  cell proliferation,  monocytosis,  and  monocyte  accumulation  in  atherosclerotic  lesions  in  mice.  J  Clin  Invest 121(10):4138‐4149. 

[38]  Feng  Y,  Schouteden  S,  Geenens  R,  Van  Duppen  V,  Herijgers  P,  Holvoet  P  et  al.  2012.  Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Proliferation and Differentiation Is Differentially Regulated by High‐Density and Low‐Density Lipoproteins in Mice. PLoS ONE 7(11):e47286. 

Chapter 5 

100  

Monocytes

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

20

40

60

Weeks of HFD

% C

D11

b+ Ly6

G- (

of C

D45

+ )

Pro-inflammatory monocytes

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

2

4

6

8

Weeks of HFD

% G

r1hi

gh (o

f CD

45+ )

T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

20

40

60

Weeks of HFD

% C

D3+ (

of C

D45

+ )

Helper T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

20

40

60

Weeks of HFD

% C

D4+ (

of C

D45

+ CD

3+ )

Cytotoxic T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

10

20

30

40**

Weeks of HFD

% C

D8+ (

of C

D45

+ CD

3+ )

Regulatory T cells

0 1/7 3/7 1 2 4 10 180

5

10

15

* * *

Weeks of HFD

% C

D25

+ Fox

P3+ (

of C

D4+ )

A

C D

E F

B

Supplementary data 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure 1. Spleen immune cell profile by FACS in a time course of DIO. (a) No changes in percentage of CD11b+Ly6G‐ monocytes and (b) CD3+ T cells of the total leukocyte population (CD45+). (c) The pro‐inflammatory Gr1high monocytes were unchanges  in  the  spleen after an obesogenic diet.  (d) After 18 weeks of  the obesogenic diet CD8

+ cytotoxic T cells were increased. (e) CD4

+ T helper cells were unaltered, whereas (f) the regulatory CD4+CD25+FoxP3+ T cells decreased only after short term HFD. n=10‐11, *=P<0.05 (1‐way ANOVA with Tukey post‐test analysis and the change per group expressed relative to the 0 weeks of HFD group). 

 

  

6 

 

BlockingCD40‐TRAF6interactionsbysmallmoleculeinhibitor6860766amelioratesthecomplicationsofdiet‐inducedobesityinmice

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Susan  M.  van  den  Berg*,1,  Tom  T.P.  Seijkens*,1,  Pascal  J.H.  Kusters1,  Barbara  Zarzycka2,  Linda 

Beckers1, Myrthe  den  Toom1, Marion  J.J. Gijbels1,3,4, Antonios  Chatzigeorgiou5,  Christian Weber2,6, 

Menno P.J. de Winther1, Triantafyllos Chavakis5, Gerry A.F. Nicolaes2, Esther Lutgens1,6 

 1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Centre, University of Amsterdam, 

The Netherlands. email: e.lutgens@amc.uva.nl 2Department of Biochemistry, University of Maastricht, Maastricht, The Netherlands 3Department of Pathology, Maastricht University, Maastricht, The Netherlands 4Department of Molecular Genetics, Maastricht University, The Netherlands 5Department of Clinical Pathobiochemistry and  Institute  for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Medical Faculty, 

Technische Universität Dresden, Dresden, Germany  6Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig Maximilian’s University, Munich, Germany 

 

* these authors contributed equally to this work. 

 

International Journal of Obesity 2015; 39(5):782‐790

Chapter 6 

102  

Abstract Immune processes contribute  to  the development of obesity and  its complications, such as  insulin 

resistance,  type  2  diabetes  mellitus  and  cardiovascular  disease.  Approaches  that  target  the 

inflammatory response are promising therapeutic strategies for obesity. In this context, we recently 

demonstrated  that  the  interaction  between  the  co‐stimulatory  protein  CD40  and  its  downstream 

adaptor protein Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor (TRAF) 6 promotes adipose tissue 

inflammation,  insulin resistance and hepatic steatosis  in mice  in the course of diet‐induced obesity. 

Here, we evaluated  the effects of a  small‐molecule  inhibitor  (SMI) of  the CD40‐TRAF6  interaction, 

SMI 6860766, on the development of obesity and  its complications  in mice that were subjected to 

diet‐induced obesity (DIO). Treatment with SMI 6860766 did not result in differences in weight gain, 

but  improved glucose  tolerance. Moreover, SMI 6860766  treatment reduced  the amount of CD45+ 

leukocytes  in  the epididymal adipose  tissue by 69%. Especially  the number of adipose  tissue CD4+ 

and  CD8+  T  cells  and macrophages were  significantly  decreased.  Our  results  indicate  that  small‐

molecule mediated  inhibition of the CD40‐TRAF6  interaction  is a promising therapeutic strategy for 

the treatment of metabolic complications of obesity by improving glucose tolerance, by reducing the 

accumulation of  immune cells to the adipose tissue as well as by skewing of the  immune response 

towards a more anti‐inflammatory profile. 

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

103  

Introduction 

Obesity  and  its  associated  conditions,  including  insulin  resistance,  type  2  diabetes mellitus,  and 

cardiovascular diseases  (CVD),  affect more  than 1000 million people worldwide,  a number  that  is 

increasing and  is expected to do so for the next decades [1, 2]. Chronic caloric excess may shorten 

healthy lifespan of humans by 5‐20 years, which results in a tremendous socio‐economic burden [1]. 

Hence  the  development  of  novel  therapeutic  strategies  for  obesity  and  its  related  disorders  is  a 

public health priority. 

 

Over  the past decades,  chronic  inflammation has been  identified  as  the pathological  substrate of 

obesity  and  its  complications  [1, 3, 4].  Elevated plasma  levels of  cytokines,  such  as  TNF  and  IL‐6, 

characterize obese subjects and show a positive correlation with the extent of metabolic dysfunction 

[5‐9]. Obese  adipose  tissue  (AT) exhibits hallmarks of  an ongoing  inflammatory  response,  such  as 

immune cell  infiltration and activation, as well as  the presence of pro‐inflammatory cytokines and 

adipokines including TNF, IL‐6, and leptin [5‐9]. Moreover, chronic inflammation has a pivotal role in 

the development of obesity‐associated diseases, such as hepatic steatosis, type 2 diabetes mellitus 

and  CVD  [5‐10].  Strategies  that  modulate  the  inflammatory  response  are  therefore  promising 

therapeutic modalities for obesity and its complications. 

 

The co‐stimulatory dyad CD40 and  its  ligand CD40L (CD154) have a well‐known role  in  immune cell 

activation and inflammation [11]. After binding of CD40L, CD40 recruits adaptor proteins, the Tumor 

necrosis factor Receptor Associated Factors (TRAFs) [11]. The  intracellular domain of CD40 contains 

two binding  sites  for  these proteins: a proximal  site  that binds TRAF2/3/5 and a distal  site, which 

binds TRAF6 [11]. After binding of the TRAF proteins to CD40, signal transduction is initiated, which 

eventually results in the expression of inflammatory mediators [11]. Mice with a genetic deficiency in 

the  CD40‐TRAF6  interaction,  but  not  the  CD40‐TRAF2/3/5  interaction,  are  protected  against  the 

development  of  neointima  formation  and  atherosclerosis,  both  exponents  of  an  ongoing 

inflammatory condition of the arterial wall [12, 13]. 

 

Accumulating evidence  indicates that the CD40‐CD40L dyad has an  important role  in obesity [6, 14‐

17].  For  example,  plasma  levels  of  soluble  CD40L  correlate  with  the  body mass  index  in  obese 

subjects  and  decrease  after  bariatric  surgery  [14].  CD40‐CD40L‐mediated  interactions  between 

adipocytes and AT immune cells, including T cells and macrophages, promote the expression of pro‐

inflammatory cytokines and chemokines that increase the recruitment of other inflammatory cells to 

the AT [15, 16]. Ligation of CD40 on adipocytes promotes insulin resistance by decreasing IRS‐1 and 

GLUT4 expression [15, 16]. Genetic deficiency or antibody‐mediated inhibition of CD40L reduced the 

inflammatory  and  metabolic  complications  of  diet‐induced  obesity  (DIO)  [15,  16].  In  contrast, 

deficiency  of  CD40  aggravates  the  complications  of  DIO  [18‐20].  To  understand  these  opposing 

effects  of  CD40L  and  CD40, we  previously  investigated  the  role  of  different  downstream  adaptor 

proteins  of  the  CD40‐CD40L  pathway. We  found  that  deficiency  of  CD40‐TRAF2/3/5  interactions 

increased metabolic  and  inflammatory  complications  of  DIO,  whereas  deficiency  of  CD40‐TRAF6 

interactions  rather  improved AT  inflammation  and  insulin  resistance  in DIO mice. Based on  these 

data, we developed a small molecule inhibitor (SMI) against CD40‐TRAF6 interactions, and we could 

show  that  treatment  with  SMI  6877002  improved  insulin  resistance,  hepatic  steatosis  and  M1 

Chapter 6 

104  

macrophage  accumulation  into  the  epididymal AT  (EpAT), when  treatment was  initiated  6 weeks 

after  the beginning of  the diet  [19]. Thus,  inhibition of  the CD40‐TRAF6  interaction  is a promising 

therapeutic strategy for obesity. 

 

Here we performed a more thorough analysis of the effects of SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition 

in DIO. We investigated the effects of SMI 6860766, an analogue of 6877002 with a lower IC50 [19], 

in DIO.  In addition, we here administered the CD40‐TRAF6  inhibitor after 12 weeks of high  fat diet 

(HFD), when obesity was much more progressed and continued diet and  treatment until week 18. 

Our  data  suggest  that  SMI‐mediated  CD40‐TRAF6  inhibition  is  a  promising  novel  therapeutic 

approach in DIO‐related metabolic dysregulation. 

Materials and methods 

TRAF 6 C‐domain expression, purification and binding analysis 

His‐tagged TRAF6 C‐domain (residues 346‐504) was expressed in E. Coli using the pET21d expression 

vector  (Novagen).  Protein  was  purified  by  affinity  chromatography,  followed  by  gel  filtration  in 

running buffer (25 mM TRIS, 200mM NaCl and 0.5 mM TCEP). The direct binding between the TRAF6 

C‐domain and SMI 6860766 was measured by Surface Plasmon Resonance  (SPR)  (Biacore T200, GE 

Healthcare).  TRAF6  C‐domain  was  immobilized  on  Sensor  Chip  CM5  using  the  amine  coupling 

method. This reached a density of approximately 12,000 and 7,500 RU. SMI 6860766 was dissolved in 

PBS buffer containing 5% v/v DMSO. All measurements were carried out at 25°C and with a flow rate 

of 50 ul min‐1  in SPR  running buffer  (PBS, 0.05% Tween20, 5% DMSO, pH=7.4). Sensorgrams were 

corrected by  subtracting  the  initial  level of SPR  signal before  injection of  the SMI or  the TRAF6 C‐

domain. Data were  analysed  using  the  BIAevaluation  software.  Equilibrium  dissociation  constants 

(Kd) were determined from a model of the steady state affinity (3 independent runs were averaged). 

In vitro macrophage culture 

Bone marrow (BM) cells were  isolated from CD40+/+, CD40‐/‐ mice (C57Bl/6 background)[21] as well 

as mice containing site directed mutagenesis for the respective CD40‐TRAF binding domains (CD40‐

Twt, CD40‐TRAF2/3/5‐/‐ and CD40‐TRAF6‐/‐) [22] and cultured  in RPMI supplemented with 15% L929 

conditioned  medium  to  generate  BM‐derived  macrophages.  BM‐derived  macrophages  were 

activated with an agonistic CD40 antibody  cocktail  FGK45 and 5D12  (both 25 µg/ml, Bioceros BV) 

overnight, incubated with SMI 6860766 for 1 hour and frozen for real time PCR analysis. 

Mice 

Male C57Bl/6 mice (n=24) were purchased from Charles River and maintained at the animal facility of 

the University of Amsterdam. Mice received a HFD  (35% kcal carbohydrate, 45% kcal  fat, 20% kcal 

protein,  Special Diets  Services, Witham, United Kingdom)  for 18 weeks  from  the  age of 7 weeks. 

After 12 weeks of HFD, mice were  treated daily with SMI 6860766  (10µmol kg‐1)(n=12), or vehicle 

(0.05% tween80, 5% DMSO in PBS) [19] (n=12) for 6 weeks. Mice had ad libitum access to food and 

water  and were maintained under  a 12 hour  light‐dark  cycle.  Food  intake  and body weight were 

measured weekly. After the experimental procedure, mice were fasted overnight and subsequently 

euthanized. Blood was collected and organs were dissected and processed for flow cytometric and 

histological  analysis.  All  experimental  procedures were  approved  by  the  Animal  Experimentation 

Ethics Committee of the University of Amsterdam. 

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

105  

Haematology and biochemical measurements 

Blood  was  obtained  by  cardiac  puncture  with  EDTA‐filled  syringes.  Haematological  analysis  was 

performed on a ScilVet abc plus+ (ScilVet, Oostelbeers, The Netherlands). 

Insulin assay and calculation of HOMA‐IR 

Fasting  insulin  was  measured  in  plasma  by  enzyme‐linked  immunoabsorbent  assay  (Mercodia, 

Uppsala,  Sweden)  following manufacturers'  protocol.  Glucose  levels were measured  from whole 

blood upon sacrifice using a glucometer (Bayercontour, Basel, Switzerland). The homeostasis model 

assessment of  insulin resistance (HOMA‐IR) was calculated using the following formula: HOMA‐IR = 

fasting glucose (mmol/l) × fasting insulin (mU/l)/22.5. 

Glucose tolerance test 

One week before  and  3  and  6 weeks  after  the  initiation of  SMI  6860766 or  vehicle  treatment,  a 

glucose tolerance test (GTT) was performed. 12h fasted mice were injected i.p. with glucose (1mg g‐1, 

Sigma‐Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands). Glucose levels were measured from whole blood using 

a glucometer (Bayercontour, Basel, Switzerland) at times indicated in the figures. 

Real‐time PCR 

Total RNA was extracted using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and reverse transcribed with an 

iScript cDNA synthesis kit (Bio‐Rad, Veenendaal, the Netherlands). qPCR was performed using a SYBR 

green  PCR  kit  (Applied  Biosystems,  Leusden,  the  Netherlands)  on  a  ViiA7  real‐time  PCR  system 

(Applied Biosystems). The result  is expressed as relative to the control group, which was assigned a 

value of 1. 

Flow cytometry  

EpAT and subcutaneous AT (ScAT) were removed, rinsed in PBS and minced into small pieces. Tissues 

were  digested  in  a  collagenase mixture  (DMEM‐20mM  HEPES,  Collagenase  I  and  Collagenase  XI, 

Sigma‐Aldrich,  Zwijndrecht,  the Netherlands)  for  45 minutes  at  37°C.  The  digested  samples were 

passed through a 70 µm nylon mesh (BD Biosciences, Breda, the Netherlands). The suspension was 

centrifuged at 1250 rpm for 6 minutes and the pelleted SVF was resuspended in FACS buffer.  

 

Erythrocytes  in blood were  removed by  incubation with hypotonic  lysis buffer  (8.4 g of NH4Cl and 

0.84 g of NaHCO3 per liter of distilled water). To prevent non‐specific binding of antibodies to the Fc 

receptor, all cell suspensions were  incubated with a CD16/32 antibody prior to  labelling. CD3, CD8, 

CD25, FoxP3, F4/80, CD11b, CD11c, Gr‐1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) CD4, Ly6G (BD, Breda, the 

Netherlands)  and  CD206  (Biolegend,  San  Diego,  CA,  USA)  antibodies  were  incubated  with  the 

indicated tissues. Staining was analysed by flow cytometry (FACSCanto II, BD Biosciences, Breda, The 

Netherlands) and FlowJo software version 7.6.5. (Tree star). 

Histology 

Tissues were collected, fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin. Liver steatosis and 

inflammation  were  graded  on  4  μm  thick  haematoxylin‐eosin  (H&E)  stained  sections. 

Immunohistochemistry  on  liver,  EpAT  and  ScAT  was  performed  for  CD45  (BD,  Breda,  the 

Netherlands) and on EpAT for CD68 (Bio‐rad). Five μm frozen sections of the liver were stained with 

Oil  red  O  (Sigma‐Aldrich,  Zwijndrecht,  the  Netherlands).  Organs were  analysed  by  H&E  staining. 

Morphometric analyses were performed using the Las4.1 software (Leica, Rijswijk, the Netherlands) 

Chapter 6 

106  

and  ImageJ  software.  Analyses  were  performed  by  an  observer  who  was  blinded  for  the 

experimental conditions. 

Statistical analysis 

Results are presented as mean ± SEM. Data were analysed by a Student’s t test or Chi‐squared test 

using GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). P‐values <0.05 were 

considered significant. 

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

107  

Results 

Characterization of SMI 6860766 

The CD40‐TRAF6 SMI 6860766 is specifically modelled for the CD40‐TRAF6 binding site on the TRAF6 

molecule, the molecular structure of SMI 6860766 is shown in Figure 1a. Biacore analysis shows that 

SMI 6860766 binds well to the part of the TRAF6 molecule in which the CD40‐binding site is present 

(Figure 1b). In vitro, SMI 6860766 dose‐dependently suppressed CD40‐induced gene expression of IL‐

1β and  IL‐6 cytokines  in BM‐derived macrophages  (Figure 1c). Further  functional specificity can be 

deducted from the following experiment: BM‐derived macrophages from CD40+/+, CD40‐/‐, CD40‐Twt, 

CD40‐TRAF2/3/5‐/‐  and  CD40‐TRAF6‐/‐ mice  (mice  that  contain  a  site  directed mutagenesis  in  the 

CD40 gene for the respective TRAF binding domain on CD40) were activated with the CD40‐agonistic 

antibodies 5D12 and FGK45. When stimulating these macrophages overnight, CD40+/+, CD40‐Twt and 

CD40‐TRAF2/3/5‐/‐ macrophages display a high expression of CCL2, whereas CCL2 was  significantly 

reduced  in  CD40‐/‐  and  CD40‐TRAF6‐/‐  macrophages,  proving  that  CD40‐TRAF6  interactions  are 

responsible  for  the decrease  in CCL2  levels. When  adding  SMI  6860766,  together with  the CD40‐

activating  antibody,  CCL2  levels  were  also  reduced  in  CD40+/+,  CD40‐Twt  and  CD40‐TRAF2/3/5‐/‐ 

macrophages,  suggesting  that  the  CD40‐TRAF6  inhibiting  SMI  6860766  is  specific  for  CD40‐TRAF6 

interactions (Figure 1d). 

Figure  1.  Characterization  of  SMI  6860766.  (a)  Molecular structure  of  SMI  6860766.  (b)  Surface  plasmon  resonance sensogram of SMI 6860766 which confirmed the direct binding of  SMI  6860766  to  immobilized  TRAF6  C‐domain.  Data represent  the  average  of  three  independent  experiments.  (c) Dose dependent inhibition of IL‐1β and IL‐6 gene expression in FGK45  (agonistic  CD40‐antibody)  stimulated  bone  marrow derived  macrophages.  (d)  CCL2  gene  expression  in  bone marrow  derived  macrophages  of  the  respective  genotypes stimulated with the CD40 agonistic antibody FGK45 and 5D12. n =6 per group, **=p<0.01, ***=p<0.001. 

A

D

B

C

IL1

0.001 0.01 0.1 1 10 1000.0

0.5

1.0

1.5

Concentration (μM)

rela

tive

gene

exp

ress

ion

IL6

0.001 0.01 0.1 1 10 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Concentration (μM)

rela

tive

gene

exp

ress

ion

CCL2

C57Bl6

CD40-/-

CD40-T

wt

CD40-T

2/2/5-

/-

CD40-T

6-/-

0

5

10

15 ***** *** Ctrl

6860766

rela

tive

gene

exp

ress

ion

6860766

Chapter 6 

108  

Small molecule treatment did not result in side effects 

We previously developed small molecule inhibitors of the CD40‐TRAF6 interaction [19], and found no 

side effects  for SMI 6877002.  In  the present study, we administered SMI 6860766, an analogue of 

6877002 with a  lower  IC50,  in a more progressed model of DIO where  treatment with  the CD40‐

TRAF6 inhibitor was started after 12 weeks of HFD and continued until week 18 of HFD. We did not 

observe any side effects. Daily treatment with SMI 6860766 for the last 6 weeks of 18 weeks of HFD 

did  not  result  in  any  changes  in  peripheral  blood  leukocyte  counts  or  cell‐composition 

(Supplementary figure 1a‐f). Macroscopic and histopathological analysis revealed no abnormalities of 

the SMI  treatment  in more than 20 organs analysed, which  included spleen, colon, small  intestine, 

stomach, kidney, lung, heart and muscle. 

Alterations in adipocyte size in the adipose tissue 

During the course of DIO, both groups showed a significant gain in body weight (Figure 2a). However, 

there were  no  differences  in  body weight  gain  or  food  intake  between  the  experimental  groups 

(Figure 2a,  Table 1).  SMI  6860766  treatment did not  affect  EpAT,  ScAT or BAT weights  (Table 1). 

Because SMI 6860766 binds to CD40‐TRAF6 we confirmed presence of CD40  in the adipose tissues 

and  found an 11  fold higher expression of CD40  in EpAT  compared  to  ScAT  in  the  control group, 

indicating that the SMI can exert larger effects in EpAT (Figure 2b). Interestingly, although the weight 

of adipose depots did not differ, the number of adipocytes per field in EpAT of mice treated with SMI 

6860766 was increased by 15.3% revealing that SMI treatment decreased adipocyte size, suggesting 

less lipid storage and improved metabolic function (Figure 2c,d) [23]. A slight increase in number of 

adipocytes per field in ScAT did not reach statistical significance (Figure 2c). 

SMI 6860766 improved glucose tolerance in DIO 

Next,  we  evaluated  the  effect  of  SMI  6860766  treatment  on  glucose  sensitivity.  Basal  levels  of 

glucose and plasma insulin did not differ between the experimental groups and the HOMA‐IR indices 

were not different (Table 1). Glucose tolerance tests (GTT) were performed before and after 3 and 6 

weeks  of  treatment.  No  differences  between  the  groups  were  observed  before  treatment  was 

initiated  (data  not  shown).  However,  three  weeks  of  treatment  with  SMI  6860766  resulted  in 

improved  glucose  sensitivity,  compared with  vehicle  treated mice  and  an  even more pronounced 

effect on glucose sensitivity was seen after 6 weeks of treatment (Figure 2e). These data indicate that 

SMI 6860766 improves glucose sensitivity in DIO. 

   CTRL  6860766 

Food intake (g/wk)  20.9 ± 0.6  22.5 ± 1.1 

EpAT (g)  1.8 ± 0.2  1.4 ± 0.2 

ScAT (g)  1.1 ± 0.2  0.8 ± 0.1 

BAT (mg)  142 ± 10  136 ± 14 

Glucose (mg/dl)  153 ± 6.6  157 ± 5.4 

Insulin (mU/l)  11.0 ± 1.0  11.1 ± 1.0 

HOMA‐IR  4.2 ± 0.4  4.2 ± 0.4 

Table 1. Characteristics of mice who received a HFD 

for 18 weeks and were treated with vehicle or SMI 

6860766  after  12  weeks  of  HFD  and  continued 

treatment until week 18. 

n=12, *=p<0.05. 

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

109  

Figure 2. Daily  treatment with SMI 6860766 during  the  last 6 weeks of 18 weeks HFD  reduced adipocyte  size and improved glucose sensitivity in mice. (a) Treatment with SMI 6860766 did not result in differences in body weight gain. (b) Gene expression of CD40 showing a higher expression of CD40 in EpAT compared to ScAT. (c) Adipocyte size of EpAT and  ScAT  showing  a  15.3%  decrease  in  epididymal  adipocyte  size  of  SMI  6860766  treated mice  as  indicated  by  an increase in adipocyte numbers per field. n=12 per group. (d) H&E staining illustrating that epididymal adipocyte size was decreased in SMI 6860766 treated mice compared to vehicle. (e) GTT of mice fed a HFD for 15 weeks with 3 weeks of SMI 6860766 treatment and GTT of mice fed a HFD for 18 weeks with 6 weeks of treatment showing improved glucose sensitivity in mice treated with SMI 6860766 compared to vehicle. n =6 per group, *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. 

D

C

2 4 6 8 10 12 14 16 1820

25

30

35

40CTRL6860766

Weeks of HFD

Bod

y w

eigh

t (g)

3 weeks of SMI treatment

0 15 30 45 75 1200

100

200

300

400

*

time (min)

% o

f ini

tial b

lood

glu

cose

6 weeks of SMI treatment

0 15 30 45 75 1200

100

200

300

400CTRL6860766

** ******

***

time (min)

% o

f ini

tial b

lood

glu

cose

E

0

20

40

60

80

100*

# ad

ipoc

ytes

/fie

ld

EpAT ScAT

0

50

100

150CTRL6860766

# ad

ipoc

ytes

/fie

ld

CD40

CTRL 6860766 CTRL 68607660

5

10

15

20

***

ScAT EpAT

rela

tive

gene

exp

ress

ion

A B

Ctrl 686076650 μm50 μm

Chapter 6 

110  

SMI 6860766 does not induce differences in hepatosteatosis 

As  liver  steatosis  is  an  important  metabolic  complication,  we  assessed  liver  weights,  hepatic 

inflammation and degree of  steatosis. However,  in  this  relatively mild model of DIO  (45%  calories 

from  fat) we did not observe differences  in  liver weight between  the groups  (Figure 3a) or severe 

inflammation  in either group  (Figure 3b,c). Furthermore,  there were no differences  in hepatic  lipid 

content and the degree of steatosis (Figure 3d‐f).  

 

 

 

 

 

Amelioration of adipose tissue inflammation after compound treatment  

As CD40  is  important  in  inflammation and AT  inflammation has a  key  role  in  the development of 

insulin  resistance, we analysed  immune cell composition by  flow cytometry. We observed a 68.5% 

decrease  in number of total  leukocytes (CD45+ cells)  in the EpAT of mice treated with SMI 6860766 

(Figure  4a).  Leukocyte  subset  analysis  revealed  that  T  helper  cell  numbers  (CD3+CD4+  cells) were 

decreased  by  50.4%  and  cytotoxic  T  cell  numbers  (CD3+CD8+  cells)  were  decreased  by  61.6%, 

whereas  the numbers of  regulatory T  cells  (CD3+CD4+CD25+FoxP3+  cells) were not affected  (Figure 

4b‐d). No differences in ScAT T cell numbers were observed (Supplemental Figure 2a‐d). 

 

Additionally,  the number of EpAT macrophages  (CD11b+Ly6G‐F4/80+ cells) was decreased by 81.7% 

by  SMI  6860766  (Figure  4e).  Macrophage  subset  analysis  showed  that  pro‐inflammatory  M1 

macrophages  (CD11b+Ly6G‐F4/80+CD11c+CD206‐  cells)  were  decreased  by  80.8%  and  anti‐

inflammatory M2 macrophages  (CD11b+Ly6G‐F4/80+CD11c‐CD206+ cells) by 70.5%  (Figure 4f,g). The 

pro‐inflammatory M1‐macrophages showed a larger decrease than the M2‐macrophages, therefore, 

the  ratio between M1 and M2 macrophages was 2.4  in  the  control group whereas  the  treatment 

resulted in a ratio 1.5, suggesting a more anti‐inflammatory profile of the epididymal adipose tissue 

depot (Figure 4h). No aberrations in ScAT macrophage numbers were observed (Supplemental Figure 

2e‐g). 

Figure 3. No liver abnormalities were seen in vehicle or SMI 6860766 treated groups. (a) Liver weights did  not  differ.  (b)  Immunohistochemical  leukocyte  (CD45)  staining  and  (c)  scoring  of  hepatic inflammation  by  H&E  staining  did  not  show  significant  differences  between  the  two  experimental groups.  (d)  Oil  red  O  staining  of  liver  sections  and  (e,f)  scoring  of  hepatosteatosis  did  not  show differences in degree of steatosis ‐or lipid content. n=12 per group. 

CTRL 68607660

500

1000

1500

2000

Liver weight

wei

ght (

mg)

Macro steatosis

CTRL 68607660

50

100-+/-++++++

% o

f mic

e

Micro steatosis

CTRL 68607660

50

100- +/-++++++

% o

f mic

e

Leukocytes

0

5

10

15

20

# C

D45

+ ce

lls /f

ield

CTRL 6860766

Lipid content

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Oil

red

O-s

tain

ed a

rea

(%)

CTRL 6860766

Inflammation

CTRL 68607660

50

100- +/-++++++

% o

f mic

e

CA B

D E F

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

111  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Furthermore,  immunohistochemical  analysis  of  the  immune  cells  in  EpAT  showed  decreased 

amounts of leukocytes (CD45+) in the SMI 6860766 treated group, which was not seen in ScAT (Figure 

5a,b). Additionally, we observed a reduction in macrophage number (CD68+) relative to the number 

of  adipocytes  in  EpAT  of  the  SMI  6860766  treated  group  (Figure  5c,d).  Together  our  data 

demonstrate that treatment with SMI 6860766 ameliorated diet‐induced AT inflammation. 

Figure  4.  Flow  cytometric  analysis  demonstrates  that  SMI  6860766  treatment reduces  AT  leukocyte  count.  (a)  Flow  cytometry  showed  decreased  leukocyte numbers  (CD45

+  cells)  in  the EpAT of  SMI 6860766  treated mice.  (b)  Lymphocyte subset analysis revealed  that especially T helper  (CD3

+CD4+) cells and  (c) cytotoxic (CD3+CD4‐CD8+) T cells were decreased, whereas (d) regulatory (CD4+CD25+FoxP3+) T cells were not affected. (e) The number of total macrophages (CD11b+F4/80+), as well  as  (f)  pro‐inflammatory  M1  (CD11b+F4/80+CD11c+CD206‐)  and  (g)  anti‐inflammatory  M2  (CD11b+F4/80+CD11c‐CD206+)  macrophages  was  decreased  by treatment with  SMI  6860766.  (h)  The  ratio  between M1‐  and M2 macrophages. n=12 per group, *=p<0.05, **=p<0.01.  

EpAT Leukocytes

0

100000

200000

300000

400000

*#

of C

D45

+ ce

lls

Macrophages

0

100000

200000

300000

**

# of

CD

11b+

F4/8

0+ c

ells

M1 macrophages

0

20000

40000

60000

80000

100000

*

# of

F4/

80+C

D11

c+C

D20

6- c

ells

M2 macrophages

0

10000

20000

30000

40000

50000

*

# of

F4/

80+C

D11

c-C

D20

6+ c

ells

Ratio M1:M2 macrophages

0

1

2

3

4

M1:

M2

ratio

Regulatory T cells

0

500

1000

1500

2000

# of

CD

4+C

D25

+Fox

P3+

cells

T helper cells

0

10000

20000

30000

40000

50000

**

CTRL6860766

# of

CD

3+C

D4+

cel

ls

Cytotoxic T cells

0

2000

4000

6000

8000

10000

*

# of

CD

3+C

D8+

cel

ls

C

A B

D

E F

G H

Chapter 6 

112  

 

Figure 5. Immunohistochemical assessment of adipose tissue leukocytes demonstrating reduced infiltration of total leukocytes and macrophages  into AT of SMI 6860766 treated mice. (a)  Immunohistochemical analysis of EpAT and ScAT by  leukocyte  (CD45) staining showing a decreased amount of  leukocytes  in  the EpAT of SMI 6860766  treated mice. No differences were seen in leukocyte counts in ScAT of SMI 6860766 treated mice. (b) CD45 staining of EpAT illustrating  the  decreased  amount  of  CD45

+  cells  in  SMI  6860766  treated  mice  compared  to  vehicle.  (c) Immunohistochemical analysis by macrophage (CD68) staining showing a decreased amount of macrophages  in the EpAT of SMI 6860766 treated mice. (d) Pictures of a CD68 staining of EPAT to illustrate the decrease in CD68+ cells in SMI 6860766 treated mice. n=12 per group,**=p<0.01.  

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

113  

Discussion 

Immune cell activation and inflammation within the visceral adipose tissue play a pivotal role in the 

pathogenesis of obesity and obesity‐associated insulin resistance [1, 3, 4]. During the development of 

obesity,  the  number  of  inflammatory  cells,  especially  T  cells  and  macrophages,  increases  and 

correlates with  the extent of metabolic dysfunction  [5, 24, 25].  Interactions between adipocytes, T 

cells and macrophages result  in the secretion of pro‐inflammatory mediators, such as TNF and IL‐6, 

which directly  interfere with  insulin signalling and promote  insulin resistance [5, 24, 25]. Strategies 

that deplete AT immune cells restore insulin sensitivity [5, 24, 25]. Skewing of immune cells towards 

their pro‐inflammatory  subsets,  such as M1 macrophages,  is known  to aggravate AT  inflammation 

and  insulin  resistance  [25,  26].  These  events  change  the  AT  into  an  insulin  resistant,  pro‐

inflammatory environment that propagates ongoing local and systemic metabolic deterioration. 

 

Co‐stimulatory molecules  are  known  to efficiently propagate  and mediate  immune  reactions,  and 

emerging  evidence  obtained  from  experiments  in  gene‐deficient  and  transgenic  mouse  models 

suggests that co‐stimulatory molecules are an  interesting therapeutic target to combat obesity and 

the metabolic syndrome [15, 17‐20, 27‐30]. The therapeutic propensity of co‐stimulatory molecules 

has been explored by treating DIO mice with antibodies against the CD28‐CD80/86 and CD40L‐CD40 

system [15, 20, 30]. 

 

Simultaneous blocking of CD80 and CD86 by antibodies in DIO mice resulted in an improved glucose 

tolerance  and  in  an  increase  in  insulin  sensitivity.  Moreover,  AT  inflammation  and  hepatic 

inflammation were significantly reduced upon antibody treatment [30]. Similar results were obtained 

when CD40L was blocked using an anti‐CD40L antibody  in DIO mice. Weight gain was only slightly 

reduced,  but  glucose  tolerance  and  insulin  sensitivity  did  improve  upon  treatment,  as  did  AT 

inflammation: less CD4+ T cells and macrophages were present in the visceral adipose tissue [15]. As 

genetic  deficiency  of  CD40,  the  receptor  for  CD40L,  aggravates  obesity  [18‐20,  28],  Wolf  et  al 

administered agonistic CD40 antibodies  to DIO mice, and  found  that HFD  induced weight gain was 

abolished, glucose tolerance and insulin sensitivity had improved, and inflammatory cell recruitment 

(CD4+ T cells and M1 macrophages)  in the visceral adipose tissue was halted [20]. These data show 

that  antibody‐mediated  targeting  of  co‐stimulation  in  obesity  is  a  powerful  approach  to  improve 

inflammation‐associated  metabolic  deterioration.  However,  although  the  results  of  antibody 

treatment are positive,  long‐term use of antibodies blocking co‐stimulatory  receptors or  ligands  is 

likely  to  result  in unwanted  side  effects  as  long‐term dysfunction of  the CD40L‐CD40 pathway or 

CD80/86 pathway will result in immune‐system derangements.  

 

In the present study we therefore chose to block the CD40‐CD40L system with a novel SMI that was 

generated  to  target  the  interaction between CD40  and  TRAF6,  and, we were  able  to  successfully 

improve  AT  inflammation  and metabolic  dysfunction.  The  small molecule  inhibitor  approach  has 

several advantages. By blocking only parts of the CD40 signal transduction pathway, and not CD40 or 

CD40L  itself, severe  immune suppression will be prevented. Moreover, our SMIs are selected using 

the FAF‐Drugs2  filter and  the ADME/tox  filter  to obtain  the most optimal administration, delivery, 

metabolism,  extraction  and  toxicology  profile  [31,  32],  and  in  addition,  compounds  containing 

reactive or  toxic groups were  rejected. This  screening process  selected  lead SMIs  that  successfully 

blocked  inflammation  and  are  very  suitable  for  further  drug  development  [19].  Although  the 

Chapter 6 

114  

modelling and structure‐based virtual ligand screening and validation was performed with great care, 

it cannot be ruled out that our SMI is able to bind to other proteins.  

 

In  a  previous  paper, we  reported  that we  could  improve  insulin  sensitivity, AT  inflammation  and 

hepatosteatosis  by  administering  our  lead  compound  6877002  (IC50=  15.9 μM)  during  the  last  6 

weeks of  the experiment  in a model of DIO  in which mice  received a 60% HFD  for 12 weeks  [19]. 

Here, we used an optimized SMI, derived  from our  lead  compound, with an  IC50 of 0.3  μM  (SMI 

6860766)  [19],  and used  a milder, but  a more prolonged model of DIO  (45% HFD  for  18 weeks), 

which  is more  representative  for  the  clinical problem of obesity  induced metabolic  complications. 

Treatment was started after 12 weeks of diet, when obesity was already evident, and was continued 

for 6 weeks. Remarkably, we saw a massive decrease in adipose tissue inflammation, with less influx 

of CD4+ and CD8+ T cells, and macrophages. This decrease was more pronounced than we observed 

after  SMI  6877002  treatment,  where  we  only  found  a  decrease  in  the  accumulation  of  M1 

macrophages. Because obese visceral adipose  tissue exhibits  increased  inflammation  compared  to 

the subcutaneous adipose depot [33] and CD40 has a  low expression  in ScAT, the CD40‐TRAF6 SMI 

did  not  affect  ScAT  to  the  same  extend  as  EpAT.  SMI  6860766  treatment  prevented  adipocyte 

hypertrophy,  suggesting  less  adipocyte  dysfunction,  improved  glucose  tolerance,  and  slightly 

ameliorated hepatic  inflammation. However, we did not observe an effect on hepatic steatosis, as 

we observed with SMI 6877002. These differences could be due to the experimental set‐up, where 

45% HFD used in the present study did not induce hepatic steatosis.  

 

The beneficial effects of  small molecule mediated  inhibition of  the CD40‐TRAF6  interaction  in DIO 

appears to be more pronounced than the effects observed  in mice with a genetic deficiency of the 

CD40‐TRAF6 interaction, which may be explained by the genetic constitution of the transgenic mice. 

In a previous study we  investigated the role of CD40‐TRAF6  interactions  in the development of DIO 

on  leukocytes,  and  not  in  non‐hematopoietic  cells  such  as  adipocytes  and  hepatocytes.  We 

demonstrated  that  deficiency  of  CD40‐TRAF6  interactions  in MHCII+  cells modestly  improved  AT 

inflammation and metabolic and hepatic complications of DIO. However, CD40‐induced signalling in 

non‐hematopoietic cells may also be  involved  in DIO. For example,  ligation of CD40 on adipocytes 

results  in  the secretion of pro‐inflammatory cytokines and decreased  insulin sensitivity  [16].  In  the 

present  study  we  inhibited  the  CD40‐TRAF6  interaction  in  both  hematopoietic  and  non‐

hematopoietic cells, which may explain  the more pronounced beneficial effects of small molecule‐

mediated  inhibition  compared  to  the  effects  that we  previously  reported  in  the  transgenic mice. 

Another explanation  could be  that our SMI has other, not yet  identified, beneficial effects on  the 

inhibition of inflammation. 

 

In conclusion, we have shown that SMI 6860766  improves obesity‐associated glucose sensitivity by 

reducing  AT  inflammation.  SMIs  that  block  the  pro‐inflammatory  CD40‐TRAF6  interaction  are  a 

promising therapeutic strategy. Additional development and refinement of the inhibitors, as well as 

optimized delivery methods such as nanoparticle mediated drug delivery are required before these 

SMIs can be utilized in humans. 

 

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

115  

Corresponding author Prof.  Esther  Lutgens,  Department  of Medical  Biochemistry,  Experimental  Vascular  Biology,  Academic Medical  Centre, 

University  of  Amsterdam,  Meibergdreef  9,  1105  AZ,  Amsterdam,  The  Netherlands.  +31  (0)20  5  66  33  80. 

e.lutgens@amc.uva.nl 

Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. 

Acknowledgements We acknowledge the support from the Netherlands CardioVascular Research Initiative: “the Dutch Heart Foundation, Dutch 

Federation of University Medical Centres,  the Netherlands Organisation  for Health Research  and Development  and  the 

Royal Netherlands  Academy  of  Sciences"  for  the GENIUS  project  “Generating  the  best  evidence‐based  pharmaceutical 

targets  for  atherosclerosis”  (CVON2011‐19).  This  work  was  supported  by  the  Netherlands  Organization  for  Scientific 

Research  (NWO)(VICI  grant  to  EL,    and  CW,  medium  investment  grant  to  GN),  the  Netherlands  Heart  Foundation 

(Established investigator grant to EL, MW, Dr E. Dekker grant to TS), the Rembrandt foundation (SB, MW, EL), the Deutsche 

Forschungsgemeinschaft (DFG FOR809: LU1643/1‐2, SO876/3‐1, WE1913/11‐2, SFB914‐B08 and SFB 1054 and SFB‐1123 to 

EL, CW, CH279/5‐1 to TC), European Research Council Grants (N°281296 to TC and ERC AdG °249929 to CW), a grant from 

the Else‐Kroner‐Fresenius‐Stiftung (to TC) and by a grant from the German Federal Ministry of Education and Research to 

the German Center for Diabetes Research (DZD e.V.) (to TC) and DZHK (German Centre for Cardiovascular Research, MHA 

VD1.2  to CW),  the Cardiovascular Research  Institute Maastricht  (to GN),  the EU  (grant KBBE‐2011‐5 289350  to GN),  the 

Transnational University Limburg (to GN) and Cyttron II (FES0908 to GN).  

Chapter 6 

116  

References 

[1]  Kanneganti T‐D, Dixit VD. 2012. Immunological complications of obesity. Nat Immunol 13(8):707‐712. [2]  Wang YC, Colditz GA, Kuntz KM. 2007. Forecasting  the Obesity Epidemic  in  the Aging U.S. Population. Obesity 

15(11):2855‐2865. [3]  Ferrante AW. 2013. The immune cells in adipose tissue. Diabetes Obes Metab 15(s3):34‐38. [4]  Winer  S,  Winer  DA.  2012.  The  adaptive  immune  system  as  a  fundamental  regulator  of  adipose  tissue 

inflammation and insulin resistance. Immunology & Cell Biology 90(8):755‐762. [5]  Anderson  EK,  Gutierrez  DA,  Hasty  AH.  2010.  Adipose  tissue  recruitment  of  leukocytes.  Current  Opinion  in 

Lipidology 21(3):172‐177. [6]  Chatzigeorgiou A, Phieler  J, Gebler  J, Bornstein  SR, Chavakis T. 2013. CD40L  Stimulates  the Crosstalk Between 

Adipocytes and Inflammatory Cells. Horm Metab Res 45(10):741‐747. [7]  Ouchi N, Parker JL, Lugus JJ, Walsh K. 2011. Adipokines  in  inflammation and metabolic disease. Nature Reviews 

Immunology 11(2):85‐97. [8]  Surmi  B,  Hasty  A.  2008. Macrophage  infiltration  into  adipose  tissue:  initiation,  propagation  and  remodeling. 

Future Lipidol 3(5):545‐556. [9]  Xu H, Barnes GT, Yang Q, Tan G, Yang D, Chou CJ et al. 2003. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the 

development of obesity‐related insulin resistance. J Clin Invest 112(12):1821‐1830. [10]  Seijkens  T,  Kusters  P,  Engel D,  Lutgens  E.  2013.  CD40–CD40L:  Linking  pancreatic,  adipose  tissue  and  vascular 

inflammation in type 2 diabetes and its complications. Diabetes Vasc Dis Re 10(2):115‐122. [11]  Engel D, Seijkens T, Poggi M, Sanati M, Thevissen L, Beckers L et al. 2009. The  immunobiology of CD154–CD40–

TRAF interactions in atherosclerosis. Semin Immunol 21(5):308‐312. [12]  Donners M, Beckers L, Lievens D, Munnix  I, Heemskerk J, Janssen B et al. 2008. The CD40‐TRAF6 axis  is the key 

regulator of the CD40/CD40L system in neointima formation and arterial remodeling. Blood 111(9):4596‐4604. [13]  Lutgens E, Lievens D, Beckers L, Wijnands E, Soehnlein O, Zernecke A et al. 2010. Deficient CD40‐TRAF6 signaling 

in  leukocytes prevents atherosclerosis by  skewing  the  immune  response  toward an antiinflammatory profile.  J Exp Med 207(2):391‐404. 

[14]  Baena‐Fustegueras JA, Pardina E, Balada E, et al. 2013. Soluble cd40  ligand  in morbidly obese patients: Effect of body mass index on recovery to normal levels after gastric bypass surgery. JAMA Surg 148(2):151‐156. 

[15]  Poggi M,  Engel D, Christ A, Beckers  L, Wijnands  E, Boon  L  et al.  2011. CD40L Deficiency Ameliorates Adipose Tissue Inflammation and Metabolic Manifestations of Obesity in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 31(10):2251‐2260. 

[16]  Poggi M, Jager J, Paulmyer‐Lacroix O, Peiretti F, Gremeaux T, Verdier M et al. 2009. The  inflammatory receptor CD40  is  expressed  on  human  adipocytes:  contribution  to  crosstalk  between  lymphocytes  and  adipocytes. Diabetologia 52(6):1152‐1163. 

[17]  Seijkens T, Kusters P, Chatzigeorgiou A, Chavakis T, Lutgens E. 2014. Immune cell crosstalk in obesity: a key role for co‐stimulation? Diabetes, in Press (will be published Dec 2014). 

[18]  Guo  C‐A,  Kogan  S,  Amano  SU,  Wang  M,  Dagdeviren  S,  Friedline  RH  et  al.  2013.  CD40  deficiency  in  mice exacerbates obesity‐induced adipose tissue inflammation, hepatic steatosis, and insulin resistance. Journal Article 304(9):951‐963. 

[19]  Chatzigeorgiou A,  Seijkens  T,  Zarzycka B,  Engel D, Poggi M,  van den Berg  S  et al.  2014. Blocking CD40‐TRAF6 signaling  is a  therapeutic  target  in obesity‐associated  insulin  resistance. Proc Natl Acad Sci U S A 111(7):2686‐2691. 

[20]  Wolf D, Jehle F, Michel NA, Bukosza EN, Rivera J, Chen YC et al. 2014. Coinhibitory Suppression of T Cell Activation by CD40 Protects Against Obesity and Adipose Tissue Inflammation in Mice. Circulation 129(23):2414‐2425. 

[21]  Kawabe T. 1994. The  immune  responses  in CD40‐deficient mice:  impaired  immunoglobulin class  switching and germinal center formation. Immunity 1:167–178. 

[22]  Ahonen C. 2002. The CD40‐TRAF6 axis controls affinity maturation and the generation of long‐lived plasma cells. Nat Immunol 3:451–456. 

[23]  Lafontan M. 2014. Adipose tissue and adipocyte dysregulation. Diabetes Metab 40(1):16‐28. [24]  Osborn O, Olefsky JM. 2012. The cellular and signaling networks  linking the  immune system and metabolism  in 

disease. Nat Med 18(3):363‐374. [25]  Chmelar J, Chung KJ, Chavakis T. 2013. The role of innate immune cells in obese adipose tissue inflammation and 

development of insulin resistance. Thromb Haemost 109(3):399‐406. [26]  Sell H, Habich C, Eckel J. 2012. Adaptive immunity in obesity and insulin resistance. Nat Rev Endocrinol 8(12):709‐

716. [27]  Wolf D, Jehle F, Ortiz Rodriguez A, Dufner B, Hoppe N, Colberg C et al. 2012. CD40L Deficiency Attenuates Diet‐

Induced Adipose Tissue Inflammation by Impairing Immune Cell Accumulation and Production of Pathogenic IgG‐Antibodies. PLoS ONE 7(3):e33026. 

[28]  Yi  Z,  Stunz  L,  Bishop  G.  2014.  CD40‐mediated  maintenance  of  immune  homeostasis  in  the  adipose  tissue microenvironment. Diabetes. 

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

117  

[29]  Zhong J, Rao X, Braunstein Z, Taylor A, Narula V, Hazey J et al. 2014. T‐cell costimulation protects obesity‐induced adipose inflammation and insulin resistance. Diabetes 63(4):1289‐1302. 

[30]  Chatzigeorgiou A, Chung K‐J, Garcia‐Martin R, Alexaki V‐I, Klotzsche‐von Ameln A, Phieler J et al. 2014. Dual role of B7  costimulation  in  obesity‐related  non‐alcoholic  steatohepatitis  (NASH)  and  metabolic  dysregulation. Hepatology. 

[31]  Lagorce D,  Sperandio O, Galons H, Miteva M, Villoutreix B. 2008.  FAF‐Drugs2:  Free ADME/tox  filtering  tool  to assist drug discovery and chemical biology projects. BMC Bioinformatics 9(1):396. 

[32]  Miteva MA, Violas S, Montes M, Gomez D, Tuffery P, Villoutreix BO. 2006. FAF‐Drugs: free ADME/tox filtering of compound collections. Nucleic Acids Res 34(suppl 2):W738‐W744. 

[33]  Nishimura S, Manabe  I, Naga  iR. 2009. Adipose  tissue  inflammation  in obesity and metabolic syndrome. Discov Med 8(41):55‐60. 

Chapter 6 

118  

Supplementary data 

 

Supplementary  figure  1.  SMI  6860766  treatment  did  not  cause  hematologic abnormalities.  (a)  Peripheral  blood  total  leukocyte  counts,  (b)  lymphocyte,  (c) monocyte, (d) granulocyte, (e) erythrocyte and (f) platelet numbers. n=12 per group.   

 

0

1

2

3

4

5Le

ukoc

ytes

(109 /L

)

0.0

0.1

0.2

0.3

Mon

ocyt

es (1

09 /L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Gra

nulo

cyte

s (1

09 /L)

0

5

10

15

Eryt

hroc

ytes

(1012

/L)

0

200

400

600

800

1000

Plat

elet

s (1

09 /L)

0

1

2

3CTRL6860766

Lym

phoc

ytes

(109 /L

)

C

A

E

B

D

F

SMI‐mediated CD40‐TRAF6 inhibition in obesity 

119  

 

Supplementary figure 2. Flow cytometry showed no significant changes in ScAT leukocyte count after SMI 6860766  treatment.  (a) The number of  (CD3

+) T  cells,(b)  (CD3+CD4+) T helper  cells,  (c)  cytotoxic (CD3+CD8+)  T  cells  and  (d  regulatory  (CD4+CD25+FoxP3+)  T  cells  were  not  different  in  ScAT  of  SMI 6860766  treated  mice.  (e)  The  number  of  total  macrophages  (CD11b+F4/80+),  as  well  as  (f)  pro‐inflammatory  M1  (CD11b+F4/80+CD11c+CD206‐)  and  (g)  anti‐inflammatory  M2  (CD11b+F4/80+CD11c‐

CD206+) macrophages were not significantly different after treatment with SMI 6860766. n=12 per group. 

0

5000

10000

15000

20000ScAT T cells

# of

CD

3+ c

ells

M2 macrophages

0

5000

10000

15000

20000

25000

# of

F4/

80+C

D11

c-C

D20

6+ c

ells

M1 macrophages

0

1000

2000

3000

4000

5000

# of

F4/

80+C

D11

c+C

D20

6- c

ells

Macrophages

0

10000

20000

30000

40000

# of

CD

11b+

F4/8

0+ c

ells

Cytotoxic T cells

0

500

1000

1500

2000

# of

CD

3+C

D8+

cel

ls

Regulatory T cells

0

100

200

300

# of

CD

4+C

D25

+Fox

P3+

cells

T helper cells

0

2000

4000

6000

8000CTRL6860766

# of

CD

3+C

D4+

cel

ls

C

A

E

B

D

F

G

Chapter 6 

120  

 

  

7 

 

Generaldiscussion 

Chapter 7 

122  

General discussion 

123  

What to do against obesity‐associated diseases? 

The  obesity  ‘epidemic’, with  39%  of  the world’s  adult  population  overweight  and  13%  obese,  is 

increasing at an alarming rate with numbers that have doubled in the last 30 years (WHO). Although 

it is known that limiting energy intake and engaging in regular physical activity prevents obesity, the 

numbers  are  still  increasing  and  leading  to  higher  incidences  of  type  2  diabetes,  cardiovascular 

diseases, fatty liver disease (NASH) and cancer. We approached the problem by studying the immune 

system,  as  chronic  inflammation  is  an  important  underlying  mechanism  in  the  pathogenesis  of 

obesity. This thesis describes three targets to battle obesity‐associated diseases. First, we studied the 

link  between  inflammation,  adaptive  thermogenesis  and  obese  white  adipose  tissue  (WAT)  and 

brown  adipose  tissue  (BAT).  Second, we  evaluated  how  obesity  affects  hematopoietic  stem‐  and 

progenitor cells in the bone marrow. Third, we studied the effects of administration of a CD40‐TRAF6 

blocking compound (SMI 6860766) in obesity.  

The crosstalk between brown adipocytes and immune cells 

An  important  reason  that obesity  leads  to  insulin  resistance  and  cardiovascular disease  is  chronic 

inflammation.  Pro‐inflammatory  immune  cells  infiltrate  obese  WAT  which  affects  steady‐state 

homeostasis  of  insulin  signalling  and  adipogenesis  [1].  The  immune  system  in WAT  is  therefore 

widely studied. The other hot topic of interest in obesity research is BAT. BAT uses glucose and fat as 

fuel  to  produce  heat  and  provides  a  potential  counterbalance  against  excessive  energy  stores  in 

obesity [2]. Brown‐like or beige adipocytes can also be  induced within WAT, called beiging [3]. This 

occurs upon cold exposure, β3‐adrenergic receptor agonist treatment or by immunological signals [4‐

8]. Our data  in chapter 3 provides evidence that  inflammation also plays a role  in obese BAT.  In an 

18‐week time course of diet‐induced obesity in mice, 3 days of high‐fat diet (HFD) already resulted in 

the accumulation of lipids  in BAT. Interestingly, within this time frame, BAT macrophages as well as 

cytokine and chemokine gene expression  increased. Together with the HFD‐induced  increased pro‐

inflammatory environment in BAT we also found a rapid decrease in WAT and BAT eosinophils. This 

confirms previous results by others who have shown that eosinophils play a large role in maintaining 

immune homeostasis in WAT [9]. Eosinophils are part of an immunological circuitry of BAT activation 

and beiging of WAT as IL‐4 producing cells that stimulate anti‐inflammatory macrophages to secrete 

noradrenaline, which  activates  brown  adipocytes  and  induces  beiging  of WAT  thereby  increasing 

energy expenditure  [9, 10]. HFD‐induced  tissue  remodelling and a  shift  from an anti‐inflammatory 

towards  a  pro‐inflammatory  environment  already  occurs  before  the  onset  of weight  gain.  These 

rapid changes show that a HFD disturbs the homeostatic adipose tissue environment, which suggests 

that the thermogenic capacity of adipose tissues is decreased. 

 

In vitro experiments in chapter 3 and 4 further unravel a crosstalk between immune cells and brown 

adipocytes. Both pro‐ and anti‐inflammatory  cytokines affect brown adipocytes and  regulate  their 

activity as well as the production of chemoattractants for a variety of immune cells. A direct effect of 

IL‐4 on brown  adipocytes  implies  an  important  role  for  IL‐4  and  therefore  also  for  IL‐4 producing 

eosinophils. 

Chapter 7 

124  

When we established that immune cells and signals were involved in obese BAT and that short‐term 

HFD caused a decline in eosinophils, we decided to increase eosinophils by using a model of helminth 

antigens, known to  induce a type 2  immune response [11]. Chapter 4 describes how administration 

of Schistosoma mansoni‐soluble egg antigens  (SEA) and  soluble products of Trichuris  suis  (TsSP)  in 

HFD‐fed mice resulted in a massive induction of eosinophils, macrophages and T cells in epididymal 

WAT. However, we observed fat‐depot specific responses in which subcutaneous WAT and BAT were 

almost unaffected by the helminth antigens. Others have shown that a helminth infection in obesity 

is  protective  against  body weight  gain  and  insulin  resistance  via  a  type  2  immune  response  [12]. 

However, within the 10 days of our study we did not observe changes in body weight, nor did any of 

the  adipose  tissues  that we  studied  have  alterations  in  their  thermogenic  activation.  These  data 

suggest that different adipose tissue depots have differential roles in adaptive thermogenesis.  

Should we promote helminth infections? 

In  the  course of  evolution, helminth  infections have  shaped our  immune  system. Helminths have 

been able to induce an immune response that promotes their survival and prevents elimination. This 

includes a mode of  tolerance and  the  induction of  immune‐regulatory pathways  in a Th2  immune 

response, characterized by a type 2 anti‐inflammatory environment. Current hygienic standards and 

treatments reduce the exposure to parasites [13], which is suggested to lead to a higher incidence of 

allergy, autoimmune disease, cardiovascular disease and diabetes [14]. Skewing the immune system 

towards type 2 immunity can be protective in all these diseases. A link between type 2 immunity in 

thermogenic adipose tissue might evolutionary have been beneficial when helminth’s host travelled 

and had to adjust to colder climates. 

 

A harmonic co‐existence between helminths and their hosts does not often result  in severe clinical 

symptoms. However, as helminths do live of their host, an infection can cause nutritional and vitamin 

deficiencies,  anaemia,  growth  delays,  increased  intestinal mobility  and  an  increased  risk  of  other 

infectious diseases [11]. Therefore, if we want to use the helminth‐induced type 2 immune response 

therapeutically, we  should  either  find  a  helminth  that  does  not  cause  side‐effects  or  identify  the 

immunomodulatory  components.  The  helminth  Trichuris  suis  is  presumably  transient,  self‐limiting 

and  does  not  cause  adverse  effects  in  healthy  subjects  [13].  Small  scale  human  trials  in  allergy, 

multiple  sclerosis  and  inflammatory  bowel  disease  are  already  performed with  Trichuris  suis  and 

shown to  improve remission [13].  In our study, we did not use  live parasitic worms but the soluble 

egg antigens from Schistosoma mansoni and soluble products of Trichuris suis. This is still a complex 

mixture of protein‐ and  lipid  linked glycans and  knowing which  components and which molecular 

mechanisms  are  responsible  for  the  immune  modulating  effects  will  provide  insight  for  future 

therapeutic possibilities. 

Remaining questions on the immune modulation of brown(ing) adipose tissue 

To  improve  the  translational  value  of  our  data,  there  are  still  a  few  questions  that  need  be 

addressed.  In humans,  the presence of metabolically  active BAT  is  confirmed. However, how  this 

metabolic active tissue resembles pre‐existing classical brown or inducible beige adipocytes in mice is 

still under investigation. To improve our possibilities of increasing energy expenditure in humans via 

General discussion 

125  

BAT activation we need  to determine  the nature of  these cells by  identifying  reliable markers and 

then  confirm  them  in  tissue  biopsies. Defining  the  cell  types  is  important  as  different  precursors 

might require a different stimulation to maximally promote their thermogenic capacity. 

 

That  the  immunological  circuitry  of  ILC2s,  eosinophils  and  anti‐inflammatory macrophages  is  also 

involved in adaptive thermogenesis in humans needs to be confirmed as well as how these immune 

cells  are  affected  by  the  human  diet. Our  data  shows  a  rapid  decrease  in  eosinophil  numbers  in 

adipose  tissue and  it will be  interesting  to extrapolate  the effects of 1 day of HFD  in mice  to  the 

effects  of  a  great  variety  in  the  human  diet.  Therefore, we  need  to  determine  the  physiological 

relevance  of  the  immunological  circuitry  in  human  adipose  tissue  homeostasis,  how  this  changes 

over time after a high‐fat meal and whether different dietary components affect eosinophil numbers.  

 

When we administered helminth antigens to mice we observed adipose tissue depot‐specific effects 

on immune cell infiltration. Although helminth antigens were known to induce a type 2 response in 

WAT, we highlight that this effect is adipose depots specific, and that the immune cell populations in 

ScAT  and  BAT  are  far  less  affected  by  SEA  and  TsSP  than  in  EpAT.  Adipose  depots  differ  in 

morphological,  cellular  and molecular  signature,  as  well  as  in  differences  in  innervation  by  the 

sympathetic nervous system, vascularisation and  immune cell composition [15]. Literature suggests 

that a type 2 immune response would induce beiging of WAT. In our study, the induction of a type 2 

immune response  in EpAT did not result  in beige adipogenesis and, as we did not observe a type 2 

immune  response  in ScAT or BAT, we also did not observe effects on  thermogenesis  there. These 

data  suggest  that not  just any white adipocyte  can  transdifferentiate  into a beige adipocyte upon 

anti‐inflammatory stimuli. As ScAT is close to the body surface, it could be physiologically beneficial 

to have  thermogenic  capacities  that  can  function  as  a  layer of  isolation. Knowing how  to make  a 

beige adipocyte  from a white adipocyte and how  to specifically stimulate  the adipose depots with 

the most energy‐dissipating potential would have a high impact on energy metabolism. 

 

A divergent immune cell composition between lean and obese WAT is well described, and we further 

unraveled HFD‐induced changes  in BAT. However,  it  is still unclear how alterations  in  immune cell 

composition are regulated and how it affects tissue homeostasis. 

 

If  immune  cells are  involved  in  the activation of BAT, one  can hypothesize  that  cold‐exposed BAT 

contains a different composition of immune signals. We would therefore benefit from a comparison 

between  the  immune  cell  components  in  BAT  or  beiging  WAT  at  thermoneutrality  versus  cold 

exposed subjects. 

 

In  humans,  18F‐fluorodeoxy‐glucose  ([18F]FDG)  uptake,  as  measured  with  a  positron‐emission 

tomographic  and  X‐ray  computed  tomography  (PET/CT)‐scan,  is  negatively  correlated  with  BMI, 

which  suggests  that  BAT  activity  is  decreased  in  obesity  [16].  However,  aside  from  glucose,  an 

important  substrate  for  brown  adipocytes  is  fatty  acids. One  study  has  already  shown  that  cold‐

induced fatty acid uptake by BAT is similar in individuals with type 2 diabetes, age‐matched controls 

and  in healthy young controls  [17], suggesting  that previous conclusions based on  [18F]FDG uptake 

may also be due  to  the  insulin resistant state of obese  individuals. Therefore, studies using a  fatty 

acid  tracer are needed  to confirm a  relation between BAT activity and obesity.  It has been  shown 

that the insulin receptor is essential for adipogenesis and it would be interesting to investigate if the 

Chapter 7 

126  

beiging  potential  of  insulin  resistant  adipocytes  is  reduced  in  obesity  [18].  Furthermore,  in  vitro 

substrate studies could explore how and which fuel sources brown adipocytes use exactly. 

 

Surgical  denervation  of BAT  results  in  a  ‘whitened’  phenotype  of BAT  [19].  Furthermore,  surgical 

denervation  of  BAT  or  treatment with  the  β‐adrenergic  antagonist  propranolol  upregulates  gene 

expression of Tnf, Il6 and Ccl2, suggesting that the sympathetic nervous system (SNS) contributes to 

an anti‐inflammatory homeostatic environment within BAT [20]. It would therefore be interesting to 

study the contribution of the SNS in immune regulation of BAT. 

 

It  would  also  be  interesting  to  study  whether  different  types  of  fatty  acids  or  other  dietary 

components  can  activate brown  adipocytes. Different  lipids  can  also have opposing  inflammatory 

signalling  properties,  for  example,  saturated  fatty  acids  can  promote  inflammation  whereas 

unsaturated n‐3  fatty  acids have  anti‐inflammatory effects  [21‐23].  Furthermore,  an example of  a 

dietary component that can affect thermogenesis  is capsaicin, a component of chili peppers, which 

can increase sympathetic nerve activity, thermogenesis and energy expenditure [24].  

Diet‐induced chronic inflammation affects hematopoietic stem cells 

The  most  primitive  precursors  for  immune  cells,  the  hematopoietic  stem‐  and  progenitor  cells 

(HSPCs),  reside  in  the  bone marrow  [25].  The  bone marrow  is  the  primary  site  of  immune  cell 

production  and  activation  of  HSPCs  can  generate  the  desired  immune  response  during  acute 

infection. However, chronic  inflammatory conditions can cause  inappropriate activation. Disturbed 

HSPC homeostasis can affect disease development or progression. In chapter 5, we studied how the 

chronic low‐grade inflammation caused by obesity affects HSPC population dynamics in the BM using 

a time‐course of HFD ranging from 1 day up to 18 weeks. The HFD stimulated the differentiation and 

reduces proliferation of HSPCs  in the BM,  leading to a decreased HSPC population,  including  loss of 

stemcellness and loss of self‐renewal characteristics. In a competitive BM transplantation, chow fed 

mice received BM from obese animals which resulted  in  impaired multi‐lineage reconstitution. This 

suggests long‐term alterations in HSPCs that would persist even after weight loss. 

 

Our data  indicate that the chronic  inflammatory state  in obesity continuously recruits  immune cells 

from  the bone marrow and disturbs HSPC homeostasis.  If obesity  results  in a dysregulation of  the 

earliest hematopoietic stem cells, this can have major effects on later lineages and potentially cause 

disturbed  immunological  responses  to  future  infections.  To  study whether  these  changes hamper 

proper functioning of the immune system, it would be interesting to study different infection models 

in obesity. 

 

Studies  using  varying  nutritional  mouse  models  of  hypercholesterolemia,  dyslipidemia  and 

hyperglycemia  indicate  that  different  dietary  components  can  promote  alternative  immune 

responses  and  can  therefore  also  differentially  alter  HSPC  homeostasis  [26‐28].  To  improve  the 

translational value of our data, it is important to distinguish the contribution of different nutrients on 

HSPC dynamics. 

General discussion 

127  

Inhibition of CD40‐TRAF6 interactions improves metabolism in obesity 

CD40  is a co‐stimulatory molecule and  involved  in mediating a wide variety of  immune  responses. 

Co‐stimulatory molecules have  a  central  role  in  inflammation  in which  they provide  an  additional 

stimuli  to activate antigen presenting  cells and T  cells  [29]. They  can also activate monocytes and 

granulocytes as well as adipocytes or endothelial cells [30, 31]. CD40 recruits adaptor proteins, TNFR‐

associated factors (TRAFs) for signalling transduction. The different binding sites for TRAF2/3/5 and 

for TRAF6  allows CD40 to activate different signalling pathways depending on which adaptor protein 

binds, which cell type and other local conditions [31]. 

 

In obesity, CD40 deficiency  increases metabolic  and  inflammatory  complications  in mice  [32,  33]. 

Interestingly,  CD40‐TRAF2/3/5  deficient  mice  resemble  this  phenotype,  whereas  CD40‐TRAF6 

deficiency  improves  WAT  inflammation,  insulin  resistance  and  protects  against  obesity  and 

atherosclerosis  [32,  33].  This  reveals  a  differential  involvement  of  TRAF  adapter  proteins  in  the 

actions of CD40, making inhibition of CD40 and TRAF6 interaction a potential target in inflammatory 

diseases. The  Lutgens  lab previously designed  a  small molecule  inhibitor  (SMI)  for  the  interaction 

between CD40 and TRAF6. In chapter 6, we applied this CD40‐TRAF6 SMI in a model of diet‐induced 

obesity in mice and successfully improved WAT inflammation and metabolic dysfunction. 

 

Our data show that small‐molecule mediated inhibition of the CD40‐TRAF6 interaction is a promising 

therapeutic strategy against type 2 diabetes and adipose tissue inflammation in diet‐induced obesity. 

A major advantage of this approach is that using a small molecule inhibitor which blocks only part of 

the CD40 signal transduction pathway prevents severe immune suppression. 

 

The beneficial effects on  inflammation and metabolism of  the CD40‐TRAF6 SMI  seems  to be even 

more pronounced  then  the  genetic models of CD40‐TRAF6  deficiency.  This  is  possibly due  to  the 

genetic model, which was specific  for MHCII+ cells, and  the SMI might also  target other cell  types. 

Therefore,  future studies could  further  identify whether and how other cell  types use CD40‐TRAF6 

interactions  and  if  the  SMI  effects  on  those  cell  types  also  contribute  to  a metabolic  beneficial 

phenotype.  In  general,  insight  in  cell  type  specific  CD40  signalling  will  contribute  to  future 

improvements to CD40 targeted therapies. 

 

The SMI was virtually modelled  to have a well drug‐like profile, based on absorption, distribution, 

metabolism, excretion and  toxicity values using  the FAF‐Drugs2  filter and  the ADME/tox  filter  [34, 

35].  However, we  cannot  exclude  the  possibility  that  the  SMI  is  able  to  bind  to  other  proteins. 

Further  pharmacological  analysis  is  needed  before  pre‐clinical  trials  and  a  safe  application  to 

humans. 

Three potential targets in battling obesity 

This  thesis  describes  three  targets  to  battle  chronic  inflammation  in  obesity‐associated  diseases. 

First, we studied  inflammation  in obese white‐ and brown adipose tissue and whether the  immune 

system contributes to adaptive thermogenesis. Next, we explored how obesity affects hematopoietic 

Chapter 7 

128  

stem‐ and progenitor cells  in mice. Third, we studied CD40‐TRAF6  inhibition  in diet‐induced obese 

mice. 

 

Our main findings are: 

 

‐ Short‐term  HFD  leads  to  an  accumulation  of  lipids,  macrophages  infiltration  and  pro‐

inflammatory cytokines and chemokines in brown adipose tissue 

‐ White‐ and brown adipose tissue eosinophils rapidly decline upon a HFD 

‐ A  crosstalk  between  immune  cell  cytokines  and  brown  adipocyte  derived  chemokines  is 

involved in the regulation of brown adipocyte activity 

‐ Short‐term  treatment with  helminth  antigens  of HFD‐fed mice  induces  an  adipose  depot‐

specific type 2 immune response which does not contribute to thermogenic activation 

‐ Obesity  induces  long‐term  alterations  on  hematopoietic  stem  cells  including  loss  of 

stemcellness, increased differentiation potential and reduced proliferation 

‐ Small molecule  inhibition of CD40‐TRAF6  improves  glucose  tolerance  and  reduces  adipose 

tissue immune cells in diet‐induced obese mice 

 

As discussed  in previous  sections, all  three approaches  require additional  research before humans 

can profit from it. 

 

Different  cold‐exposure  protocols  have  been  successful  in  increasing  BAT  activity  in  humans.  In 

theory,  every  individual  has  the  tool  to  stimulate  their  energy  expenditure,  contributing  to  a 

metabolically beneficial phenotype. Easy, non‐invasive ways include taking a cold shower every day, 

swim  in  the ocean all year round or  just turn down the  thermostat. Using biochemical compounds 

would avoid uncomfortable methods.  

 

Although our data on the  interaction between  immune cells and BAT  in obesity does not  lead to a 

direct  therapeutic  application, we  show  that BAT  is  affected by  a pro‐inflammatory  state  in diet‐

induced obesity and  that  there  is an  important  crosstalk between brown adipocytes and  immune 

cells. When aiming to stimulate beiging of WAT, our experiments suggest that it is essential to induce 

an  immunological stimulus  in adipose depots with the most energy‐dissipating potential. Before we 

start manipulating the immune system to induce brown or beige adipocyte activation, further studies 

are  needed  to  clarify  the  exact  relation  between  the  immune  system  and  loss  of  BAT  activity  in 

obesity. 

 

An  important  conclusion  from  our  data  on  hematopoietic  stem  cells  is  that  diet‐induced  obesity 

results  in  long‐term effects on  the  immune system, which highlights  the  importance of preventing 

obesity  instead  of  treating  the  consequences.  It will  be  even more  interesting  to  determine  how 

different dietary components affect the immune system and HSPCs.  

 

In terms of therapeutic applications, our research showing metabolic beneficial effects of  inhibiting 

CD40‐TRAF6 interactions without finding any side effects has the highest potential. Long‐term effects 

and pre‐clinical research to block CD40‐TRAF6 interactions is ongoing and seems very promising. 

 

General discussion 

129  

Altogether, this thesis describes three targets  in obesity associated chronic  inflammation,  including 

immuno‐regulation of BAT, alterations in immune cell progenitors in the bone marrow and beneficial 

metabolic effects of a CD40‐TRAF6 blocking compound in obesity. 

Chapter 7 

130  

References 

[1]  Lumeng  CN,  Saltiel  AR.  2011.  Inflammatory  links  between  obesity  and metabolic  disease.  Journal  of  Clinical Investigation 121(6):2111‐2117. 

[2]  Kajimura  S,  Spiegelman  Bruce M,  Seale  P.  2015.  Brown  and  Beige  Fat:  Physiological  Roles  beyond  Heat Generation. Cell Metabolism 22(4):546‐559. 

[3]  Wu J, Boström P, Sparks Lauren M, Ye L, Choi Jang H, Giang A‐H et al. 2012. Beige Adipocytes Are a Distinct Type of Thermogenic Fat Cell in Mouse and Human. Cell 150(2):366‐376. 

[4]  Wang QA, Tao C, Gupta RK, Scherer PE. 2013. Tracking adipogenesis during white adipose  tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine 19(10):1338‐1344. 

[5]  Ye R, Wang QA, Tao C, Vishvanath L, Shao M, McDonald JG et al. 2015. Impact of tamoxifen on adipocyte lineage tracing: Inducer of adipogenesis and prolonged nuclear translocation of Cre recombinase. Molecular Metabolism 4(11):771‐778. 

[6]  Lee M‐W, Odegaard  JI, Mukundan  L, Qiu  Y, Molofsky  AB, Nussbaum  JC  et  al.  2015.  Activated  Type  2  Innate Lymphoid Cells Regulate Beige Fat Biogenesis. Cell 160(1–2):74‐87. 

[7]  Qiu Y, Nguyen Khoa D, Odegaard  Justin I, Cui X, Tian X, Locksley Richard M et al. 2014. Eosinophils and Type 2 Cytokine Signaling in Macrophages Orchestrate Development of Functional Beige Fat. Cell 157(6):1292‐1308. 

[8]  Brestoff JR, Kim BS, Saenz SA, Stine RR, Monticelli LA, Sonnenberg GF et al. 2015. Group 2 innate lymphoid cells promote beiging of white adipose tissue and limit obesity. Nature 519(7542):242‐246. 

[9]  Wu D, Molofsky AB, Liang H‐E, Ricardo‐Gonzalez RR, Jouihan HA, Bando JK et al. 2011. Eosinophils Sustain Adipose Alternatively Activated Macrophages Associated with Glucose Homeostasis. Science 332(6026):243‐247. 

[10]  Nguyen KD, Qiu Y, Cui X, Goh YPS, Mwangi J, David T et al. 2011. Alternatively activated macrophages produce catecholamines to sustain adaptive thermogenesis. Nature 480(7375):104‐108. 

[11]  Guigas B, Molofsky AB. 2015. A worm of one's own: how helminths modulate host adipose tissue  function and metabolism. Trends in Parasitology 31(9):435‐441. 

[12]  Hussaarts  L, García‐Tardón N, van Beek  L, Heemskerk MM, Haeberlein S, van der Zon GC et al. 2015. Chronic helminth  infection  and  helminth‐derived  egg  antigens  promote  adipose  tissue M2 macrophages  and  improve insulin sensitivity in obese mice. The FASEB Journal 29(7):3027‐3039. 

[13]  Leonardi I, Frey I, Rogler G. 2015. Helminth therapy for organic diseases? Translational Research 166(6):586‐601. [14]  Wiria AE, Djuardi Y, Supali T, Sartono E, Yazdanbakhsh M. 2012. Helminth  infection  in populations undergoing 

epidemiological transition: a friend or foe? Seminars in Immunopathology 34(6):889‐901. [15]  Pellegrinelli V, Carobbio  S, Vidal‐Puig A. 2016. Adipose  tissue plasticity: how  fat depots  respond differently  to 

pathophysiological cues. Diabetologia 59(6):1075‐1088. [16]  Saito M, Okamatsu‐Ogura Y, Matsushita M, Watanabe K, Yoneshiro T, Nio‐Kobayashi J et al. 2009. High Incidence 

of Metabolically Active Brown Adipose Tissue  in Healthy Adult Humans: Effects of Cold Exposure and Adiposity. Diabetes 58(7):1526‐1531. 

[17]  Blondin DP, Labbé SM, Noll C, Kunach M, Phoenix S, Guérin B et al. 2015. Selective Impairment of Glucose but Not Fatty  Acid  or  Oxidative  Metabolism  in  Brown  Adipose  Tissue  of  Subjects  With  Type  2  Diabetes.  Diabetes 64(7):2388. 

[18]  Sanchez‐Gurmaches  J, Guertin DA. 2014. Adipocytes arise  from multiple  lineages  that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications 5. 

[19]  Kooijman S, van den Berg R, Ramkisoensing A, Boon MR, Kuipers EN, Loef M et al. 2015. Prolonged daily  light exposure  increases  body  fat mass  through  attenuation  of  brown  adipose  tissue  activity.  Proceedings  of  the National Academy of Sciences 112(21):6748‐6753. 

[20]  Tang L, Okamoto S, Shiuchi T, Toda C, Takagi K, Sato T et al. 2015. Sympathetic Nerve Activity Maintains an Anti‐Inflammatory  State  in  Adipose  Tissue  in  Male  Mice  by  Inhibiting  TNF‐α  Gene  Expression  in  Macrophages. Endocrinology 156(10):3680‐3694. 

[21]  Shi H, Kokoeva MV, Inouye K, Tzameli I, Yin H, Flier JS. 2006. TLR4  links  innate  immunity and fatty acid–induced insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation 116(11):3015‐3025. 

[22]  Lee  JY, Plakidas A, Lee WH, Heikkinen A, Chanmugam P, Bray G et al. 2003. Differential modulation of Toll‐like receptors  by  fatty  acids:  preferential  inhibition  by  n‐3  polyunsaturated  fatty  acids.  Journal  of  Lipid  Research 44(3):479‐486. 

[23]  Yore Mark M, Syed I, Moraes‐Vieira Pedro M, Zhang T, Herman Mark A, Homan Edwin A et al. 2014. Discovery of a Class of Endogenous Mammalian Lipids with Anti‐Diabetic and Anti‐inflammatory Effects. Cell 159(2):318‐332. 

[24]  Saito M, Yoneshiro T, Matsushita M. 2016. Activation and recruitment of brown adipose tissue by cold exposure and food ingredients in humans. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism 30(4):537‐547. 

[25]  Mendelson  A,  Frenette  PS.  2014.  Hematopoietic  stem  cell  niche  maintenance  during  homeostasis  and regeneration. Nat Med 20(8):833‐846. 

[26]  Seijkens  T, Hoeksema MA,  Beckers  L,  Smeets  E, Meiler  S,  Levels  J  et  al.  2014. Hypercholesterolemia‐induced priming of hematopoietic stem and progenitor cells aggravates atherosclerosis. FASEB J 28(5):2202‐2213. 

General discussion 

131  

[27]  Nagareddy Prabhakara R, Kraakman M, Masters Seth L, Stirzaker Roslynn A, Gorman Darren J, Grant Ryan W et al. 2014. Adipose Tissue Macrophages Promote Myelopoiesis and Monocytosis in Obesity. Cell Metab 19(5):821‐835. 

[28]  Singer K, DelProposto J, Lee Morris D, Zamarron B, Mergian T, Maley N et al. 2014. Diet‐induced obesity promotes myelopoiesis in hematopoietic stem cells. Mol Metab 3(6):664‐675. 

[29]  Zirlik  A,  Lutgens  E.  2015.  An  inflammatory  link  in  atherosclerosis  and  obesity.  Co‐stimulatory  molecules. Hämostaseologie 35(3):272‐278. 

[30]  Seijkens T, Kusters P, Chatzigeorgiou A, Chavakis T, Lutgens E. 2014. Immune Cell Crosstalk in Obesity: A Key Role for Costimulation? Diabetes 63(12):3982. 

[31]  Engel D, Seijkens T, Poggi M, Sanati M, Thevissen L, Beckers L et al. 2009. The  immunobiology of CD154–CD40–TRAF interactions in atherosclerosis. Semin Immunol 21(5):308‐312. 

[32]  Chatzigeorgiou A,  Seijkens  T,  Zarzycka B,  Engel D,  Poggi M,  van den Berg  S  et al.  2014. Blocking CD40‐TRAF6 signaling  is a  therapeutic  target  in obesity‐associated  insulin  resistance. Proc Natl Acad Sci U S A 111(7):2686‐2691. 

[33]  Lutgens E, Lievens D, Beckers L, Wijnands E, Soehnlein O, Zernecke A et al. 2010. Deficient CD40‐TRAF6 signaling in leukocytes prevents atherosclerosis by skewing the immune response toward an antiinflammatory profile. J Exp Med 207(2):391‐404. 

[34]  Lagorce D,  Sperandio O, Galons H, Miteva M, Villoutreix B. 2008.  FAF‐Drugs2:  Free ADME/tox  filtering  tool  to assist drug discovery and chemical biology projects. BMC Bioinformatics 9(1):396. 

[35]  Miteva MA, Violas S, Montes M, Gomez D, Tuffery P, Villoutreix BO. 2006. FAF‐Drugs: free ADME/tox filtering of compound collections. Nucleic Acids Res 34(suppl 2):W738‐W744. 

 

Chapter 7 

132  

 

  

 

AppendixI:Summary 

Appendix I 

134  

Summary 

135  

Summary 

Brown adipose tissue (BAT) is involved in adaptive thermogenesis. Especially rodents and new‐borns 

of  larger  organisms,  including  humans,  have  large  BAT  depots,  which  decrease  with  age. 

Furthermore,  brown  adipocytes  have  also  been  identified within white  adipose  tissue  (WAT),  so‐

called beige adipocytes in a process of ‘beiging’ or beige adipogenesis. In humans, glucose uptake in 

BAT  is  negatively  correlated  with  BMI,  suggesting  that  BAT  activity  is  decreased  under  obese 

circumstances.  Obesity  is  characterized  by  a  chronic  state  of  low‐grade  inflammation,  especially 

within  white  adipose  tissue  (WAT).  Chapter  2  provides  an  overview  of  how  BAT  is  regulated, 

summarizes the  immunological adipose tissue alterations  in obesity and describes what  is currently 

known about immune regulation of BAT and beige adipogenesis. 

 

Chapter 3 describes how the inflammatory status of BAT changes in mice that were given a high‐fat 

diet  (HFD)  for  different  durations  in  time,  varying  from  1  day  to  18 weeks.  Comparable  to WAT, 

obese  BAT  accumulates  lipids  and  displays  a  pro‐inflammatory  environment  with  an  increase  in 

macrophage markers and transcripts of cytokines and chemokines. Interestingly, where this increase 

in WAT  is observed after 18 weeks of HFD,  the morphology and  immune  cell  composition of BAT 

changes after 3 days of HFD. In vitro data on a brown adipocyte cell line shows that brown adipocytes 

are highly potent  in producing chemokines  in response to pro‐inflammatory cytokines and provides 

evidence that brown adipocytes affect macrophage migration. The rapid diet‐induced remodelling of 

BAT shows that it is an extremely plastic tissue and that brown adipocytes themselves contribute to 

the inflammatory profile of obese BAT. 

 

In chapter 4 we further study the link between obese adipose tissue, immune cells and thermogenic 

metabolism. The first important finding was a rapid decline in WAT & BAT eosinophils after a HFD in 

mice.  Others  have  shown  that  eosinophils  are  the  main  IL‐4  producing  cells  in  lean WAT,  and 

therefore  contribute  to  tissue homeostasis by  sustaining anti‐inflammatory macrophages. We also 

observe  a  direct  role  for  IL‐4  on  brown  adipocyte  activation  and  their  production  of  eosinophil 

chemoattractant CCL11. To restore this type 2 immunological circuitry in adipose tissue of mice on a 

HFD, we  injected  helminth  antigens  from  Schistosoma mansoni  and  Trichuris  suis.  This  induced  a 

massive increase in type 2 immune cells in the epididymal WAT depot, but not in subcutaneous WAT 

or BAT. We also did not observe any effects on  thermogenic  capacity of  the adipose  tissues. This 

chapter  concludes  that  a  HFD  disturbs  the  homeostatic  type  2  immunological  circuitry  adipose 

tissues which cannot be reversed by a helminth‐induced type 2 response. 

 

Hematopoietic stem‐ and progenitor cells (HSPCs) reside in the bone marrow. In chapter 5 we found 

that  obesity  induces  long‐term  alterations  on  HSPCs  including  a  decreased  HSPC  population, 

increased differentiation potential and reduced proliferation. Transplantation of bone marrow from 

HFD‐fed mice to chow fed mice resulted in impaired multi‐lineage reconstitution, which suggests that 

long‐term  diet‐induced  alterations  in  HSPCs  would  persist  even  after  weight  loss.  This  chapter 

therefore highlights the importance of preventing obesity. 

 

In  chapter 6 we applied a  small molecule  inhibitor  (SMI)  that  targets  the  co‐stimulatory molecule 

CD40  and  its  adaptor protein  TRAF6  in diet‐induced obese mice.  Inhibiting  CD40‐TRAF6  signalling 

Appendix I 

136  

using this SMI, improved glucose tolerance and reduced adipose tissue immune cells in diet‐induced 

obese mice with no side‐effects. Our data show that small‐molecule mediated inhibition of the CD40‐

TRAF6  interaction  is  a  promising  therapeutic  strategy  against  type  2  diabetes  and  adipose  tissue 

inflammation in diet‐induced obesity.  

 

Altogether,  this  thesis  describes  three  targets  in  obesity  associated  chronic  inflammation.  These 

targets were the immune system in BAT, immune cell progenitors in the bone marrow and inhibition 

of  the  interaction  between  the  co‐stimulatory molecule  CD40  and  its  adaptor  protein  TRAF6.  A 

general discussion of our data can be found in chapter 7.  

 

 

 

AppendixII:Samenvatting 

Appendix II 

138  

Samenvatting 

139  

Samenvatting 

Chocola, koekjes en snoepgoed liggen te lonken bij elke kassa, een hamburger met frietjes en cola is 

het goedkoopste menu en regelmatig sporten past niet in ons drukke schema; het is zo makkelijk om 

dik te worden. Overgewicht en obesitas komt steeds meer voor wat ertoe leidt dat cardiovasculaire 

ziektes, diabetes type 2, vervetting van de lever en kanker vaker voorkomen. Door de opeenstapeling 

van vetten in obesitas wordt het immuunsysteem geactiveerd. Inflammatie ligt aan de grondslag van 

obesitas geassocieerde ziekten. In dit proefschrift hebben we vanuit drie verschillende invalshoeken 

onderzocht wat de effecten zijn van een hoog vet dieet op het immuunsysteem en metabolisme. 

 

De eerste benadering was het onderzoeken van de rol van het immuunsysteem in bruin vet. Obesitas 

zorgt voor een verhoging van pro‐inflammatoire  immuuncellen  in wit vet en dat draagt bij aan het 

ontwikkelen van insulineresistentie. Wit vet slaat overtollige energie op terwijl bruin vet juist energie 

verstookt  tot warmte. Bruin vet  is betrokken bij de  regulatie van  lichaamstemperatuur en gebruikt 

vet en glucose om warmte  te produceren.  In hoofdstuk 2 bespraken we hoe bruin vet werkt, hoe 

obesitas de  samenstelling van  immuun cellen  in vetweefsel verandert en hoe het  immuunsysteem 

betrokken  is bij de activatie van bruin vet.  In hoofdstuk 3 hebben we onderzocht of obesitas ook 

zorgt voor inflammatie in bruin vet door 8 verschillende groepen muizen een vetrijk dieet te geven in 

een tijdsreeks variërend van 1 dag tot 18 weken. Evenals wit vet gaat bruin vet overtollig vet opslaan 

en vertoont een pro‐inflammatoir  immunologisch profiel. Echter  treden deze veranderingen  in wit 

vet na 18 weken dieet op  terwijl  in bruin  vet de  veranderingen al na 3 dagen aanwezig  zijn. Ook 

hebben we in zowel hoofdstuk 3 als 4 met behulp van een bruin vet cellijn in kweek aangetoond dat 

bruin vetcellen allerlei chemotactische signalen voor  immuuncellen uitscheiden en de migratie van 

macrofagen  kunnen  beïnvloeden.  In  hoofdstuk  4  hebben we  verder  gekeken  naar  de  link  tussen 

obees vetweefsel, immuun cellen en thermogenese. Een belangrijke bevinding in deze studie was dat 

eosinofielen  snel na de  start  van een  vetrijk dieet  verminderen  in alle  vetdepots. Dit  is belangrijk 

omdat  eosinofielen  betrokken  zijn  bij  een  homeostatische  type  2  immuunomgeving  in  gezond 

vetweefsel  door  het  produceren  van  het  cytokine  IL‐4.  Daarmee  houden  ze  anti‐inflammatoire 

macrofagen  in  stand  die  weer  noradrenaline  produceren  dat  bruin  vetcellen  activeert.  Om  de 

verstoring van het type 2  immuunprofiel in vetweefsel na een vetrijk dieet te herstellen hebben we 

bij muizen  parasitaire  producten  van  Schistosoma mansoni  en  Trichuris  suis  toegediend waarvan 

bekend is dat die zorgen voor een type 2 immuunrespons. Helaas vonden we dat de type 2 respons 

alleen  in  het  epididymale  vet  plaatsvond  en  dat  in  dit  vetdepot  geen  verhoogde  thermogenese 

plaatsvond wat niet bijdroeg aan een metabool gunstig effect. 

 

De  voorloper  cellen  van  immuun  cellen,  hematopoëtische  stamcellen,  bevinden  zich  in  het 

beenmerg. Omdat  obesitas  leidt  tot  een  chronische  ontsteking worden  er  continu  immuuncellen 

geproduceerd en geactiveerd. Daarom hebben we  in hoofdstuk 5 onderzocht wat het effect  is van 

obesitas op hematopoëtische stamcellen. Hierin vonden we dat obesitas lange termijneffecten heeft 

op  de  stamcellen  in  het  beenmerg.  De  hoeveelheid  vermindert,  hun  differentiatie  wordt 

gestimuleerd en de proliferatie vermindert. Het  transplanteren van beenmerg vanuit een muis op 

een vetrijk dieet naar een gezonde muis gaf een verstoorde  reconstitutie van beenmergcellen. De 

stamcellen die  aan  een  vetrijke omgeving waren blootgesteld waren nog  steeds  verstoord  in  een 

Appendix II 

140  

gezonde  omgeving,  wat  laat  zien  dat  lange  termijneffecten  van  obesitas  op  de  stamcellen  niet 

zouden verdwijnen na bijvoorbeeld succesvol gewichtsverlies. 

 

Het co‐stimulatoire molecuul CD40 speelt een belangrijke rol in de activatie van immuun cellen en is 

betrokken bij metabole ziektes. CD40 signaleert o.a. via TRAF6 en in hoofdstuk 6 hebben we muizen 

een vetrijk dieet gegeven en behandeld met een CD40‐TRAF6‐‘small molecule inhibitor’, een stof die 

de interactie tussen CD40 en TRAF6 blokkeert. Deze behandeling zorgde voor een vermindering van 

ontstekingscellen  in het vetweefsel en ook een verbetering  in glucosetolerantie. Hiermee  laten we 

zien  dat  deze  aanpak  een  veelbelovende  therapie  zou  kunnen  zijn  voor  het  verminderen  van 

obesitas‐geassocieerde inflammatie om daarmee metabole complicaties van obesitas te verbeteren. 

 

 

 

AppendixIII:PhDPortfolio 

Appendix III 

142  

 

PhD Portfolio 

143  

Curriculum Vitae 

Susanna Maria van den Berg was born on August 31, 1987 in Leiden, the Netherlands. She obtained 

her  Bachelor  in  Biomedical  Sciences  at  Leiden  University  in  2009.  Before  starting  her  Research 

Master Biomedical Sciences at Leiden University in 2010, she took care of the race‐rowers at student 

rowing club Asopos de Vliet  for one year, as vice‐president and commissioner  race‐rowing. During 

her  master’s  program  she  studied  the  contribution  of  epithelial  mesenchymal  transition  to  the 

resistance to angiogenesis  inhibitors at the Johns Hopkins University  in Baltimore, USA.  In a second 

internship  at  the  Leiden University Medical Center  (LUMC)  she  studied  structural MRI  in patients 

after long‐term remission of Cushing’s disease. She then became a PhD candidate at the department 

of medical biochemistry in the Academic Medical Center, Amsterdam in 2013. The great supervision 

of Prof. Esther Lutgens and Prof. Menno de Winther together with an extensive collaboration with 

Andrea van Dam  in the group of Prof. Patrick Rensen at the division of Endocrinology  in the LUMC 

resulted in this thesis. 

PhD training 

Courses 

‐ Advanced Immunology (VUmc & Sanquin)        2014     3.0 ECTS 

‐ Anatomy of the house mouse  (Tytgat Institute)      2013    1.5 ECTS 

‐ Basic Laboratory Safety (AMC)           2013    0.4 ECTS 

Seminars, workshops 

‐ Medical Biochemistry weekly department seminars      2013‐2017  4.0 ECTS 

‐ EVB weekly seminars              2013‐2017  4.0 ECTS 

‐ Monthly EVB Journal club            2013‐2017  3.0 ECTS 

‐ Ruysch lectures              2013‐2017  1.0 ECTS 

‐ Joseph Tager lectures              2013‐2017  1.0 ECTS 

Presentations and conferences 

‐ Keystone symposium: ‘Obesity and Adipose Tissue Biology’, Banff,   2016    1.0 ECTS 

Canada poster presentation 

‐ Keystone symposium: ‘Beige and Brown fat: basic biology and   2015    1.0 ECTS 

novel therapeutics’, Snowbird, USA poster presentation 

‐ Keystone symposium: ‘Innate Immunity, Metabolism and Vascular   2014    1.0 ECTS 

Injury’, Whistler, Canada poster presentation 

‐ Rembrandt Institute of Cardiovascular Science (RICS),      2014    0.5 ECTS 

Noordwijkerhout, the Netherlands oral presentation 

‐ Cardiovascular Research Conference, Noordwijkerhout    2013    0.5 ECTS 

Supervising student internships 

‐ Lars Larsen                2015    2.0 ECTS 

‐ Gerdien van den Heuvel            2014    2.5 ECTS 

‐ Johanna Sierra              2013    1.0 ECTS 

Appendix III 

144  

Publications 

1. van den Berg, S.M., van Dam, A.D., Seijkens, T.T.P., Kusters, P.J.H., Beckers, L., den Toom, M., Held, 

N.M.,  van  der  Velden,  S.,  Van  den  Bossche,  J.,  Boon, M.R.,  Rensen,  P.C.N.,  Lutgens,  E.,  and  de 

Winther, M.P.J., Diet‐induced obesity induces rapid inflammatory changes in brown adipose tissue in 

mice. Submitted 

 

2. van den Berg, S.M., van Dam, A.D., Kusters, P.J.H., Beckers, L., den Toom, M., van der Velden, S., 

Van  den Bossche,  J.,  van Die,  I., Boon, M.R.,  Rensen,  P.C.N.,  Lutgens,  E.,  and  de Winther, M.P.J., 

Helminth antigens  counteract a  rapid high‐fat diet  induced drop  in eosinophils  in a depot  specific 

manner in mice. Submitted 

 

3. Hoeke, G., Wang, Y., van Dam, A.D., Mol,  I.M., van den Berg, S.M., Groen, A.K., Rensen, P.C.N., 

Berbée, J.F.P., and Boon, M.R., Statin treatment potentiates the  lipid‐lowering and anti‐atherogenic 

effect of BAT activation by accelerating lipoprotein remnant clearance. Submitted 

 

4. van Dam, A.D., van Beek, L., Pronk, A.C.M., van den Berg, S.M., Janssen, G., van Veelen, P., Koning, 

F., van Kooten, C., Rensen, P.C.N., Boon, M.R., Verbeek, S., Willems van Dijk, K., and van Harmelen, 

V.,  IgG  is elevated  in obese white adipose  tissue but  this does not mediate glucose  intolerance via 

Fcγ‐receptor or complement activation. Under Revision 

 

5. van den Berg, S.M., van Dam, A.D., Rensen, P.C.N., de Winther, M.P.J., and Lutgens, E.,  Immune 

modulation of brown(ing) adipose tissue in obesity. Endocrine Reviews, 2017; 38: 46‐69. 

 

6. Van den Bossche, J., Baardman, J., Otto, N.A., van der Velden, S., Neele, A.E., van den Berg, S.M., 

Luque‐Martin,  R.,  Chen,  H.,  Boshuizen,  M.C.S.,  Ahmed,  M.,  Hoeksema,  M.A.,  de Vos,  A.F.,  and 

de Winther,  M.P.J.,  Mitochondrial  Dysfunction  Prevents  Repolarization  of  Inflammatory 

Macrophages. Cell Reports, 2016; 17: 684‐696. 

 

7. van Dam, A.D., Bekkering, S., Crasborn, M., van Beek, L., van den Berg, S.M., Vrieling, F., Joosten, 

S.A.,  van  Harmelen,  V.,  de Winther, M.P.J.,  Lütjohann,  D.,  Lutgens,  E.,  Boon, M.R.,  Riksen,  N.P., 

Rensen, P.C.N., and Berbée,  J.F.P., BCG  lowers plasma cholesterol  levels and delays atherosclerotic 

lesion progression in mice. Atherosclerosis, 2016; 251: 6‐14. 

 

8. van den Berg, S.M.*, Seijkens, T.T.P.*, Kusters, P.J.H., Beckers, L., den Toom, M., Smeets, E., Levels, 

J., de Winther, M.P.J., and Lutgens, E., Diet‐induced obesity  in mice diminishes hematopoietic stem 

and  progenitor  cells  in  the  bone  marrow.  The  FASEB  Journal,  2016;  30:  1779‐1788.  (*Authors 

contributed equally) 

 

9. van Dam, A.D., Nahon, K.J., Kooijman, S., van den Berg, S.M., Kanhai, A.A., Kikuchi, T., Heemskerk, 

M.M., van Harmelen, V., Lombès, M., van den Hoek, A.M., de Winther, M.P.J., Lutgens, E., Guigas, B., 

Rensen, P.C.N., and Boon, M.R., Salsalate Activates Brown Adipose Tissue  in Mice. Diabetes, 2015; 

64: 1544‐1554. 

 

PhD Portfolio 

145  

10. van den Berg, S.M.*, Seijkens, T.T.P.*, Kusters, P.J.H., Zarzycka, B., Beckers,  L., den Toom, M., 

Gijbels, M.J.J., Chatzigeorgiou, A., Weber, C., de Winther, M.P.J., Chavakis, T., Nicolaes, G.A.F., and 

Lutgens, E., Blocking CD40‐TRAF6  interactions by small‐molecule  inhibitor 6860766 ameliorates the 

complications of diet‐induced obesity  in mice.  International  Journal of Obesity, 2015; 39: 782‐790. 

(*Authors contributed equally) 

 

11. Leonhard, W.N., Zandbergen, M., Veraar, K., van den Berg, S., van der Weerd, L., Breuning, M., de 

Heer, E., and Peters, D.J.M., Scattered Deletion of PKD1  in Kidneys Causes a Cystic Snowball Effect 

and Recapitulates Polycystic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology, 2015; 26: 

1322‐1333. 

 

12. Chatzigeorgiou, A., Seijkens, T., Zarzycka, B., Engel, D., Poggi, M., van den Berg, S., van den Berg, 

S., Soehnlein, O., Winkels, H., Beckers, L., Lievens, D., Driessen, A., Kusters, P., Biessen, E., Garcia‐

Martin, R., Klotzsche‐von Ameln, A., Gijbels, M., Noelle, R., Boon, L., Hackeng, T., Schulte, K.‐M., Xu, 

A., Vriend, G., Nabuurs, S., Chung, K.‐J., Willems van Dijk, K., Rensen, P.C.N., Gerdes, N., de Winther, 

M., Block, N.L., Schally, A.V., Weber, C., Bornstein, S.R., Nicolaes, G., Chavakis, T., and Lutgens, E., 

Blocking  CD40‐TRAF6  signaling  is  a  therapeutic  target  in  obesity‐associated  insulin  resistance. 

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014; 111: 2686‐

2691. 

 

13. Andela, C.D., van der Werff, S.J.A., Pannekoek, J.N., van den Berg, S., Meijer, O.C., van Buchem, 

M.A., Rombouts, S.A.R.B., van der Mast, R.C., Romijn,  J.A., Tiemensma,  J., Biermasz, N.R., van der 

Wee, N.J.A.,  and  Pereira, A.M.,  Smaller  grey matter  volumes  in  the  anterior  cingulate  cortex  and 

greater cerebellar volumes in patients with long‐term remission of Cushing's disease: a case–control 

study. European Journal of Endocrinology, 2013; 169: 811‐819. 

 

14. van der Werff, S., van den Berg, S., Pannekoek, J., Elzinga, B., and Van Der Wee, N., Neuroimaging 

resilience to stress: a review. Frontiers in Behavioral Neuroscience, 2013; 7: 39.  

 

15. Fu, C., van der Zwan, A., Gerber, S., van den Berg, S., No, E., C.H.Wang, W., Sheibani, N., Carducci, 

M.A.,  Kachhap,  S.,  and  Hammers,  H.J.,  Screening  assay  for  blood  vessel  maturation  inhibitors. 

Biochemical and Biophysical Research Communications, 2013; 438: 364‐369. 

 

 

Appendix III 

146  

 

 

 

Dankwoord

Dankwoord 

148  

Dankwoord 

149  

Met dit laatste hoofdstuk wil ik graag een hele rits collega’s, familie en vrienden bedanken voor alles 

wat mij heeft geholpen dit proefschrift te schrijven. Van  intellectuele discussies, vroege ochtenden 

op het lab tot zeer gewaardeerde gezelligheid in de kroeg, het was een groot avontuur!  

Mijn grootste dank gaat uit naar Prof. Dr. Menno de Winther en Prof. Dr. Esther Lutgens, het ideale 

duo  dat mij  direct  onder  hun  hoede  nam.  Binnen  onze  groep was  ik  het  gelukkige  biomedische 

onderzoekertje  dat  mocht  genieten  van  de  waardevolle  combinatie  tussen  jullie  biologische  en 

medische  achtergrond  en  daarmee  the‐best‐of‐both‐worlds  kon  meepakken.  Jullie  vullen  elkaar 

perfect aan en de  juiste experimentele condities werden meteen uitgevoerd  in uitgebreide  in vivo 

experimenten. We hadden gezellige werkbesprekingen die met jullie creativiteit en beslisvaardigheid 

altijd weer voor vele nieuwe plannen  zorgden.  Ik besef me goed hoeveel geluk  ik heb gehad met 

twee deuren die altijd open stonden en twee promotoren waar ik altijd op kon rekenen. 

Verder  wil  ik  ook mijn  copromotor  Prof.  Dr.  Patrick  Rensen  bedanken  voor  zijn  begeleiding.  Jij, 

Mariëtte en Andrea vormen een energieke en  creatieve  combinatie die  ik heel erg waardeer, alle 

drie; heel erg bedankt!  Ik ben heel blij met ons grote samenwerkingsproject, dat  ik aanspraak kon 

maken op  jullie uitgebreide bruin vet kennis, kon genieten van onze woest  interessante Rembrandt 

meetings met koekjes en  thee  (of bubbels) en ook  zeker  toen we na een kleine  crisis  in het AMC 

grote experimenten bij jullie konden doen. Lieve hardwerkende Andrea, hoe je het doet weet ik niet 

maar telkens als ik met jou heb gepraat of zelfs maar gemaild, ben ik weer helemaal gerustgesteld en 

enthousiast! 

Ook wil ik graag alle leden van de promotie commissie hartelijk danken voor het beoordelen van mijn 

proefschrift: Prof. Dr. Noam Zelcer, Prof. Dr. Max Nieuwdorp, Prof. Dr. Ronald Oude Elferink, Prof. Dr. 

Ronit Shiri‐Sverdlov, Dr. Bruno Guigas en Dr. Riekelt Houtkooper. 

Ik had niet durven dromen dat  ik  in  zo’n hechte,  sociale groep als bij de experimentele vasculaire 

biologie  terecht  zou  komen. Onze  vele  lab  activiteiten met  borrels,  bbq’s,  bingo,  curling,  karten, 

quizzen  en  natuurlijk  de  skivakantie waren  een  groot  feest. Annette,  jij  bent  de  perfecte  collega; 

behulpzaam, vol ervaring, energiek, slim, ik kan nog wel even doorgaan. Met jou kun je alles delen en 

je vindt het altijd  leuk om op Twan te passen, superfijn! Heel erg bedankt dat  je mijn paranimf wilt 

zijn! Marieke, samen trokken we ten strijde om ons stadje te verdedigen. We deelden lief en leed in 

de trein, bij total‐body‐work‐out of waar het ook uitkwam. Zonder jou was ik nooit bij de EVB terecht 

gekomen,  dus  ik  heb  heel  veel  aan  jou  te  danken!  Sassefras,  je  beweert  een  ochtendhumeur  te 

hebben maar  ik heb er nooit wat van gemerkt! Zelfs niet  toen we vroeg  in de ochtend met onze 

koelboxen naar Leiden scheurden.  Je zorgzame aard houd  je vaak verborgen maar kwam goed van 

pas bij de opvoeding van onze visjes. Tom, wat heb ik van jou veel geleerd; praktisch in het lab, in rap 

tempo onderzoek doen, protocollen goedgekeurd krijgen, alles verwerken en tegelijkertijd weer door 

met  het  volgende  experiment,  heerrlijk!  Linda  en  Myrthe,  het  was  altijd  genieten  als  we  een 

obesitas‐opoffering hadden en twerkend de dagen door gingen. Zeker ook onmisbaar bij het vetjes 

knippen  waren  natuurlijk  gezellig  kamergenootje  Suzanne,  de  getalenteerde  Pascal  en  vele 

studenten.  Marion,  jouw  gezelligheid,  directheid  en  roze  wangetjes  geven  borrels  interessante 

wendingen. Je hebt een gave om andere mensen borrels te  laten plannen wanneer het jou uitkomt 

en  ook  om  zoveel mensen  te  enthousiasmeren mee  te  gaan.  Verder wil  ik  ook Marten,  Jeroen, 

Claudia, Annelie, Quinte, Carlos, Helene, Marnix, Thijs, Ewelina, Oliver, Charo en Koen bedanken voor 

Dankwoord 

150  

alle gezelligheid en hulp op en rond het lab. En zeker ook de studenten die ik heb mogen begeleiden: 

Lars, Gerdien, Johanna en Pascal; bedankt voor jullie bijdrage aan de data in dit proefschrift. 

Ntsiki, met verbazing geef ik je een proefschrift zonder seahorse data of western blots.. Toch wil ik je 

bedanken voor je hulp en geduld als  ik voor de zoveelste keer  langskwam. We hebben veel geleerd 

maar helaas geen figuur kunnen maken, wie weet mogen we voor een revisie nog een keer los. 

Lieve Barbara, Michelle, Emily, Yordi en Annefieke, EJD’08; voor altijd mijn ploeggenootjes. Het is niet 

meer samen knallen in de boot maar gelukkig wel samen knallen in de kroeg of bij een etentje. Ik ben 

heel blij dat wij ooit samen in een boot zijn beland en dat jullie nog steeds altijd voor me klaar staan! 

Emily, bedankt voor het lenen van je camera en fotografie‐skills voor de cover! 

Lieve  Femke,  van  bus‐vakanties  naar  Zuid‐Europa  tot  avonturen  in  Maleisië  en  Cuba,  van 

zaterdagavond biertjes drinken met de band  tot babykleertjes uitzoeken,  tijden veranderen en wij 

veranderen gewoon mee! Een hele waardevolle vriendschap van voor‐, tijdens‐ en na mijn promotie! 

BW‐buddies, Marieke, Sarah, Jessica, Jasmijn, Sabrina, Kimberly en Madelon, als we samen hebben 

afgesproken, ben  ik daarna weer helemaal opgeladen om hardcore de wetenschap aan  te kunnen. 

Eén keer per  jaar  is er zelfs een heel weekend voor nodig, die moeten we er zeker  in houden! Met 

onze vele raakvlakken is het altijd één en al gezelligheid en als we ons vaste lijstje onderwerpen langs 

zijn gegaan is het tijd voor pepernoten, kadootjes en buikpijn van het lachen (of van de kaasfondue).  

Laurens, Yordi, Leonard, Lilian, Ruud en Sam; bedankt dat jullie het gnerk‐gehalte in mijn leven hoog 

houden. Hoe een avond met jullie verloopt is altijd een verrassing, maar gegarandeerd een avontuur!  

Lieve papa en mama, van huis uit kregen wij een grote wetenschappelijke mind‐set mee waardoor ik 

me helemaal  thuis  voelde  in het doen  van onderzoek. We  zijn opgevoed met het gevoel alsof de 

wereld aan onze voeten ligt en we alles konden worden wat we wilden. Jullie hebben ons subtiel en 

met veel vrijheid de goede kant op gestuurd. Heel erg bedankt voor alle steun en goede zorgen. Chris 

en Andrea, heel erg bedankt voor jullie interesse, de oppas‐sessies en de grote gezelligheid met zijn 

allen! Rietske, ik ben heel blij dat papa zo’n leuke vrouw heeft gevonden. Je maakt iedereen gelukkig 

en met jouw energie wordt jullie pensioen één groot feest. Annie en Luc, wat heb  ik een geluk met 

zulke lieve schoonouders, bedankt voor het vele oppassen tijdens het afronden van dit proefschrift. 

Lieve Jan, je hebt mij onbeschrijflijk veel hulp, advies en steun gegeven de afgelopen jaren, zowel op 

het lab als thuis. Je zit altijd bomvol goede ideeën en zo belanden we bij de lekkerste restaurantjes, 

de nieuwste brouwerijen,  in de mooiste natuur en op het meest afgelegen eiland. Verliefd worden 

op jou is het beste wat me ooit is overkomen. Ik vind ons een geweldig team en ik hoop dat we nog 

veel moois gaan meemaken samen!  

Mijn kleine Twan, je hebt nog net niet met een pipet in je handje je eerste experiment gedaan maar 

bent wel  al helemaal  geïntegreerd op het  lab. Terwijl wij  lekker  aan het borrelen waren  lag  jij  te 

sjansen vanuit de kinderwagen of  liet  je  je trucjes zien op tafel;  je sociale vaardigheden zitten er al 

goed in! Ik kan niet zeggen dat je een bijdrage hebt geleverd aan dit proefschrift, integendeel.. Maar 

het is het allemaal waard en je maakt mij intens gelukkig, wat zeker veel dank verdient! 

De  afgelopen  vier  jaar  zijn  oprecht  fantastisch  geweest, maar  ook  aan  dit  goede  komt  een  eind, 

bedankt allemaal!