U.S. Environmental Protection AgencyEndocrine Disruptor Screening Program

Using High Throughput Assays and Using High Throughput Assays and 

p g g

Computational Tools for Endocrine ScreeningComputational Tools for Endocrine Screening

Patience Browne, Ph.D.Senior Scientist, Office of Science Coordination and Policy

Patience Browne, Ph.D.Senior Scientist, Office of Science Coordination and Policy, y

Office of Chemical Safety and Pollution Preventionbrowne.patience@epa.gov

, yOffice of Chemical Safety and Pollution Prevention

browne.patience@epa.gov

*does not necessarily reflect EPA policy*does not necessarily reflect EPA policy

September 18, 2015September 18, 2015

Screening – Tier 1Tier 1 Screening Battery

Endocrine Pathway 

E + E ‐ A + A ‐HPGAxis

HPTAxis

In vitro

ER Bi diER Binding ■ ■

ERα Transcriptional Activation* ■

AR Binding ■ ■

Steroidogenesis H295R* ■ ■ ■ ■

Aromatase Recombinant ■

In vivo

Uterotrophic* ■

Hershberger* ■ ■

Pubertal Male ■ ■ ■ ■ ■ ■

Pubertal Female ■ ■ ■ ■ ■ ■

Amphibian Metamorphosis* ■

Fish Short‐term ReproductionFish Short‐term Reproduction(male & female)*

■ ■ ■ ■ ■

*OECD harmonized guidelines

EDSP List 2

Evolution of EDSP

EDSP Chemical 

EDSP List 2107 Chemicals

Universe10,000 chemicals(FIFRA & SDWA)

EDSP List 167 Chemicals

Based on current pace it could take decades to screen all 10,000 chemicals in EDSP Universe

Use predictive models and high throughput assasy to rapidly screen chemicals for potential bioactivity and exposure

EDSP Goals

Use computational tools and models in the EDSP framework to:1. Contribute to the weight of evidence evaluation of a chemical’s g

potential bioactivity2. Provide alternative data for specific endpoints in the EDSP Tier 1 

battery

Ultimately, these goals are common to the estrogen, androgen and thyroid pathways, however, estrogen bioactivity is the most mature model and is used to demonstrate the proposed approach.  

4

Estrogen Receptor Bioactivity Model

ER bioactivity modelER bioactivity model• 18 HTS assays 

Detect receptor interaction at various Detect receptor interaction at various points along signaling pathway  Use a variety of technologies

• Capable of distinguishing “true” activity from cytotoxicity

Values range from 0 to 1• ER agonists/antagonists

EDSP Tier 1 ER Agonist Assays vs. ToxCast ER Agonist Assays

ToxCast High Throughput Screening ER assaysEDSP Tier 1 assaysAssay Name Biological Process Organism TissueNVS_NR_bER receptor binding bovine uterusNVS_NR_hER receptor binding human NANVS_NR_mERa receptor binding mouse NAOT_ER_ERaERa_0480 protein complementation  human kidney

Assay Name Biological Process Organism Tissue

RUC ER binding receptor binding rat uterus

OT_ER_ERaERa_1440 protein complementation  human kidneyOT_ER_ERaERb_0480 protein complementation  human kidneyOT_ER_ERaERb_1440 protein complementation  human kidneyOT_ER_ERbERb_0480 protein complementation  human kidneyOT_ER_ERbERb_1440 protein complementation  human kidneyOT_ERa_EREGFP_0120 gene expression human cervixOT_ERa_EREGFP_0480 gene expression human cervixATG_ERa_TRANS_up mRNA induction human liverATG_ERE_CIS_up mRNA induction human liverTox21_ERa_BLA_Agonist_ratio gene expression human kidneyT 21 ER LUC BG1 A i i h

ERTA gene expression human Ovary

Cell proliferation/ Tox21_ERa_LUC_BG1_Agonist gene expression human ovaryACEA_T47D_80hr_Positive cell proliferation human breast

Uterotrophic Cell proliferation/organ response

Rodent uterus

ER ModelER Agonism only

(agonism and antagonism)

Judson et al. 2015. Tox Sci

“Integrated Model of Chemical Perturbations of a Biological Pathwayg y

Using 18 In Vitro High Throughput Screening Assays for the Estrogen Receptor"

Kleinstreuer et al. 2015; EHP“A Curated Database of Rodent 

Uterotrophic Bioactivity"

Browne et al. 2015; ES&T

Federal Register Notice, June 2015“EPA Solicits Comments on Use of High‐Throughput 

Assays and Computational Tools in Endocrine Disruptor Screening Program”

http://www.regulations.gov/#!documentDetail;D=EPA‐HQ‐OPPT‐p g g ;2015‐0305‐0001.

EPA is planning to incorporate scientific advancements and new tools l d d h h h h d lincorporating validated high‐throughput assays and a computational 

model as an alternative for some of the current assays in the EDSP Tier 1 battery.

Currently, EPA has partial screening results for over 1,800 chemicals that have been evaluated using the high‐throughput assays and computational model for the estrogen receptor pathway.p g p p y

Performance Based Approach to Establish Scientific ConfidenceScientific Confidence

Reference chemical set that includes a range of e e e ce c e ca set t at c udes a a ge ostructures and potencies that are accurately detected• in vitro reference chemicals• In vivo reference chemicalsN h d d i h h d New methods compared with current methods• Bioactivity model versus Tier 1 results

Evaluated by independent, external peer review• FIFRA Scientific Advisory Panel meetings• FIFRA Scientific Advisory Panel meetings 

ER bioactivity model: in vitro reference chemicals40 i it ER f h i l ith 40  in vitro ER reference chemicals with independently confirmed activity (OECD 2012)

# True Pos 26 (25)# True Neg 11 (11)# False Pos 1 (0)# False Neg 2 (2)Accuracy 0.93 (0.95)Sensitivity 0.93 (0.93)S ifi i 0 92 (1 0)Specificity 0.92 (1.0)

Judson et al. 2015, Tox SciBrowne et al. 2015, ES&T

ER bioactivity model: in vivo reference chemicals

43 in vivo ER reference chemicals with independently confirmed activity (Kleinstreuer et al. 2015)• “Active” >1 POS result• Active  >1 POS result “Inactive” >1 NEG result and no POS result “equivocal” > 1 POS result and >1 NEG result 

# True Pos 29 (29)# True Neg 8 (8)# False Pos 5 (1)# False Pos 5 (1)# False Neg 1 (1)Accuracy 0.86 (0.95)Sensitivity 0.97 (0.97)y ( )Specificity 0.67 (0.89)

Browne et al. 2015, ES&TKleinstreuer et al., 2015, EHP

ER bioactivity model versus Tier 1 ER model performs as well or better than existing methodsER model performs as well or better than existing methods Model evaluated with 45 reference chemicals 

• T1 ER binding: 23 (35% were not were not consistent with expected outcome)• T1 ERTA: 12• T1 UT: 7

ER model in 100% agreement with Tier 1 ER, ERTA, and Uterotrophic results  for List 1 chemicals  (very low or no ER activity)

ER model may be more sensitive than Tier 1 assays due to redundancyER model may be more sensitive than Tier 1 assays due to redundancy

ER Agonist Activity

Path Forward Determine how well existing models predict intact animal results• Comparison to other Tier 1 endpoints• Additional Tier 1 assay substitution?

U dditi l t ti l t l t d l Use additional computational tools to develop Adverse Outcome Pathway models for estrogen, androgen, and thyroid hormones• Integrate more assays• Integrate more key events

Expand reference chemicals with defined potencies Expand reference chemicals with defined potencies for performance based test guidelines incorporating computational tools• Curation of high quality in vivo data from peer reviewed literature

EDSP Tier 1 AR Assays vs. ToxCast AR Assays

ToxCast High Throughput Screening ER assaysEDSP Tier 1 assaysAssay Name Biological Process Organism Tissue

NVS_NR_hAR receptor binding human NANVS_NR_rAR receptor binding rat prostateOT_AR_ARSRC1_0480 protein stabilization human kidneyOT_AR_ARSRC1_0960 protein stabilization human kidney

EDSP Tier 1 assaysAssay Name Biological Process Organism Tissue

RPC AR binding receptor binding rat prostate

ATG_AR_TRANS_up transcription factor human liverTox21_AR_BLA_Agonist_ratio gene expression human kidneyTox21_AR_LUC_MDAKB2_Agonist gene expression human breastTox21_AR_BLA_Antagonist_ratio gene expression human kidneyTox21_AR_LUC_MDAKB2_Antagonist gene expression human breast

Hershberger organ response Rodent AST

AR Model( i / i )

AR Agonism/Antagonism

(agonistm/antagonism)

Evolution of Screening and Testing in the EDSPEDSP Tier 1 Battery of Assays High Throughput Assays and Computationaly y

(current)g g p y p

Model Tier 1 Battery AlternativesEstrogen Receptor (ER) Binding ER Model (alternative)

Estrogen Receptor Transactivation (ERTA) ER Model (alternative)Uterotrophic ER Model (alternative)Uterotrophic ER Model (alternative)

Androgen Receptor (AR) Binding AR Model  (Future)Hershberger AR Model  (Future)Aromatase STR Model (Future)

St id i (STR) STR M d l (F t )Steroidogenesis (STR) STR Model (Future)Female  Rat Pubertal ER, STR , THY Models (Future)Male Rat Pubertal AR, STR , THY Models (Future)

Fish Short Term Reproduction ER, AR, STR Models (Future)Amphibian Metamorphosis THY Model (Future)

EDSP Tier 2 Tests High Throughput Assays and ComputationalModel Tier 2 Battery Alternatives

Rat 2‐gen/EOGRT ER, AR, STR, THY(Future)g / , , , ( )MEOGRT ER, AR, STR (Future)LAGDA THY (Future)Quail ER, AR, STR, THY (Future)

ER = estrogen receptor; AR = androgen receptor; STR = steroidogenesis; THY = thyroid

Metabolism

• Metabolite prediction software Generation of likely metabolites f fi h Ph I bi t f ti t h P450

Parent chemicals run Parent + 1o metabolites + 2ometabolites run through ER

Bioactivity of parent‐metabolite pairs evaluated

for five human Phase I biotransformation cytochrome P450 enzymes (cyps)

through metabolism predictor software•Phase I metabolism only•CYP dependent•Parent‐metabolite pairs identified 

metabolites run through ER QSAR•List QSAR models – trained on  1800 ToxCast ER results•“Reference chemicals” of parent compounds with known estrogenic 

metabolite pairs evaluated•QSAR results from several models normalized and average•Relative predicted estrogen agonist bioactivity examined

in literature used to validate metabolites used to validate

Parent ChemicalParent Chemical

Primary Metabolite(s) 

Secondary Metabolite(s)X

QSAR ER model Prediction of Activity of i b li

Parent compound Estrogenic Metabolite

Estrogenic Metabolites Methoxychlor Mono-hydroxymethoxychlor

HPTEMestranol 17α-ethynylestradiolTrans-stilbene Trans-4-hydroxystilbene

Trans-4,4'-dihydroxystilbeneAzobenzene 4-HydroxyazobenzeneDiphenyl 4-Hydroxydiphenyl

3-Hydroxydiphenyl3-Hydroxydiphenyl4,4'-Dihydroxydiphenyl

Diphenylmethane 4-Hydroxydiphenylmethane4,4'-Dihydroxydiphenylmethane

2,2-Diphenylpropane 2-(4-Hydroxyphenyl)-2-phenylpropane4,4'-Dihydroxydiphenylpropane

Permethrin 3-Phenoxybenzylalcohol3-(4’-Hydroxyphenoxy)-benzyl alcohol3-Phenoxybenzaldehyde

Cypermethrin 3-PhenoxybenzaldehydeBenzo[a]pyrene 3-Hydroxybenzo[a]pyrene

9-Hydroxybenzo[a]pyrene8-Hydroxybenzo[a]pyrene7-Hydroxybenzo[a]pyrene

Benz[a]anthracene 3-Hydroxybenz[a]anthracene4-Hydroxybenz[a]anthracene4-Hydroxybenz[a]anthracene10-Hydroxybenz[a]anthracene

Chrysene 1-Hydroxychrysene2-Hydroxychrysene3-Hydroxychrysene

Fluorene 2-HydroxyfluorenePhenanthrene 2-Phenanthrol

9-PhenanthrolPyrene 1-HydroxypyreneNaphthalene 1-Naphthol

2-NaphtholFluoranthene 3-HydroxyfluorantheneBenzophenone 4-HydroxybenzophenoneBenzophenone 3 2,4-Dihydroxybenzophenone

2,3,4-Trihydroxybenzophenone Metabolites failed to be predicted are indicated in red

Summary Pivot to using high throughput and computational methods in EDSP

Endocrine pathway models will continue to be revised Endocrine pathway models will continue to be revised and improved as more data are available (ER, AR, thyroid…)

id bi i i di i f h d f h i l• Provides bioactivity predictions for thousands of chemicals Allows resources to be focused on chemicals more likely to have endocrine effectsy• List 1 chemicals have limited estrogen and/or androgen receptor‐mediated bioactivity 

• Prioritizes chemicals based on bioactivity (and exposure)Prioritizes chemicals based on bioactivity (and exposure)• Provides alternative to current Tier 1 screening

Multi‐century project becomes multi‐year

Acknowledgements

EPA OSCP• Kristan Markey• Kristan Markey• Caroline Pinto• David Dix• Jane Robbins

EPA ORD• Richard JudsonRichard Judson• Rusty Thomas• John WambaughNIEHS/NICEATM NIEHS/NICEATM• Warren Casey• Nicole Kleinstreuer (NICEATM/ILS)( / )