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POLIMORFISMOS EM GENES ENVOLVIDOS NO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E O RISCO DE
DESENVOLVIMENTO DA LEUCEMIA INFANTIL
RAFAELA MARIA SEABRA SILVA
RECIFE
2010
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UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO
CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS
DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA
PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA EE BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR
DDIISSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MMEESSTTRRAADDOO
POLIMORFISMOS EM GENES ENVOLVIDOS NO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E O RISCO DE DESENVOLVIMENTO DA LEUCEMIA
INFANTIL
RAFAELA MARIA SEABRA SILVA
RECIFE
2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE
Orientador: Dra. Maria Tereza Cartaxo Muniz
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Silva, Rafaela Maria Seabra Polimorfismos em genes envolvidos no metabolismo do ácido fólico e o risco de desenvolvimento da leucemia infantil / Rafaela Maria Seabra Silva. – Recife: O Autor, 2010. 73 folhas : fig., tab.
Orientadora: Rafaela Maria Seabra Silva. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCB. Genética e Biologia molecular, 2010. Inclui bibliografia e anexos.
1. Leucemia 2. Leucemia em crianças 3. Polimorfismo
genético I. Título. 616.99419 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-217
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UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO
PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM
GGEENNÉÉTTIICCAA EE BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR
Parecer da comissão examinadora da dissertação de:
Rafaela Maria Seabra Silva
Intitulada: Polimorfismos em genes envolvidos no metabolismo do ácido fólico e o risco
de desenvolvimento da leucemia infantil
A comissão examinadora considera o presente trabalho [ APROVADA ]
Portanto, cumpridas todas as exigências regimentais, Rafaela Maria Seabra Silva faz jus ao grau de Mestre em Genética e Biologia Molecular pela UFPE.
Recife, 05/03/2010
__________________________________________ 1º Examinador: Antônio Carlos de Freitas
Universidade Federal de Pernambuco __________________________________________
2º Examinador: Neide Santos Universidade Federal de Pernambuco
__________________________________________
3º Examinador: Rita de Cássia de Moura Universidade de Pernambuco
__________________________________________
Orientador: Maria Tereza Cartaxo Muniz Universidade de Pernambuco
5
RREESSUUMMOO Leucemia é a neoplasia hematológica mais comum na infância. Sua etiologia
não está elucidada sendo provável uma interação gene-ambiente. O ácido
fólico é uma vitamina do complexo B transportado para a célula pela proteína
carreadora de folato reduzido. Enzimas importantes no metabolismo do ácido
fólico são: A metilenotetrahidrofolato redutase, metionina sintase, e timidilato
sintase. Este foi um estudo exploratório com caso-controle. A população
amostral foi diferente para cada um dos polimorfismos estudados sendo
constituída de amostras oriundas do CEONHPE/HUOC e INCa. A detecção dos
genótipos foi realizada através PCR–RFLP para os polimorfismos MTHFR 677,
MS 2756 e RFC1, seguida de digestão enzimática, por PCR para as repetições
em tandem no gene TS e PCR alelo-específica para o polimorfismo MTHFR
1298. Não observamos diferença estatisticamente significante na freqüência
genotípica dos polimorfismos A2756G MS e nas repetições em tandem 2R/3R
no promotor do gene TS. O genótipo mutante RFC 80AA foi relacionado a
diminuição do risco de desenvolvimento de leucemias agudas e LLA no
CEONHPE, LMA no INCa e leucemias agudas e LMA, na análise CEONHPE e
INCa. A presença do alelo 677T foi associada ao aumento do risco de
leucemias agudas e LLA. Enquanto a presença do genótipo MTHFR 1298CC
foi associado a uma significativa redução do risco. O resultado deste estudo
sugere a associação dos polimorfismos RFC G80A, MTHFR A1298C e MTHFR
C677T com a susceptibilidade a LA infantil.
Palavras-Chave: Polimorfismo. Leucemia infantil. RFC. MTHFR. TS. MS.
6
ABSTRACT
Leukemia is the most common hematologic malignancy in childhood. Its
etiology is not elucidated and is likely a gene-environment interaction. Folic acid
is a vitamin B complex transported to the cell by binding protein of reduced
folate. Important enzymes in the metabolism of folic acid are: The
methylenetetrahydrofolate reductase, methionine synthase, and thymidylate
synthase. This was an exploratory study with case-control. The sample
population was different for each of the polymorphisms studied was made up of
samples from CEONHPE / HUOC and Cancer Institute. Genotype detection
was performed by PCR-RFLP for the polymorphisms MTHFR 677, MS 2756
and RFC1, followed by enzymatic digestion, by PCR for the tandem repeats in
the TS gene and allele-specific PCR for the MTHFR 1298 polymorphism. No
statistically significant difference in genotype frequency of polymorphisms
A2756G MS and tandem repeats in the 2R/3R TS gene promoter. The mutant
RFC 80AA genotype was related to decreased risk of developing acute
leukemia and in CEONHPE ALL, AML and INCa in acute leukemias and AML,
and the analysis CEONHPE Cancer Institute. The presence of 677T allele was
associated with increased risk of acute leukemia and ALL. While the presence
of the MTHFR 1298CC genotype was associated with a significant reduction in
risk. The result of this study suggests the association of polymorphisms G80a
RFC, MTHFR A1298C and MTHFR C677T with susceptibility to AL's.
Key-words: Acute Leukemia. Polymorphisms. MTHFR. RFC. TS. MS.
7
AAggrraaddeecciimmeennttooss
Agradeço primeiramente e acima de tudo a Deus. Na vida aprendi
muitas coisas, e uma delas foi que acasos e coincidências não existem, o que
há de verdade são momentos e relações, únicos por excelência, que
contribuíram de alguma forma, cada um, para que eu me tornasse o que sou
hoje.
Agradeço, claro, aos meus pais, Rosa e Marcos, e a minha irmã Rebeca
(Bel). A família é o início de tudo, e graças a Deus eu posso dizer que a minha
família é a minha base, minha sustentação, meu alicerce. Sem eles eu não
conseguiria nada, e de fato, nada que eu conquistasse teria sabor de vitória
sem que eles estivessem ao meu lado. São meus amores incondicionais.
Agradeço aos meus Amigos, em especial a Luana Peretti (Lú), Lais
Carvalho (Lala), Alide Lima (Lid), Flavio Ramos (Flavinho) e Renan Carlos. Por
tudo, alegrias, choro, apoio, conversas, discussões, brigas, conciliações,
brincadeiras, conselhos... Mas acima de tudo, pela amizade e afeto que a mim
dedicaram. Aprendi mais com essas cinco pessoas, no “mestrado da vida”, do
que jamais imaginei. Nem preciso dizer que os amo e que para sempre estarão
no meu coração. Obrigada, por ter sido eterno!
Agradeço também aos meus amigos de turma, em especial a Amanda
Arcanjo, Jefferson e Giordani. Pelo companheirismo e apreço. Foi incrível
estudar com vocês.
Agradeço aos meus companheiros de laboratório Maíra (Mah),
Alexandre (Xande), Helker, Elker Lene, Hildson, Felipe, Filipe, Jaqueline,
Karina, Vanessa e Dayse. Em especial a Maíra e ao Hildson. Mas acima de
tudo, a todos, pela paciência e ensinamentos. Foi um prazer trabalhar com
vocês.
Agradeço a minha orientadora Tereza Cartaxo, pela oportunidade, pelos
puxões de orelha, e muito mais por ter acreditado que eu seria capaz.
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pelo auxilio financeiro.
E em especial a alguns professores que despertaram em mim o
verdadeiro espírito científico (Elizabete Malaquias, Raquel Coimbra, Tercilio,
Marcos Morais e Valdir), aqui fica o meu muito obrigado!!!
8
LLiissttaa ddee aabbrreevviiaattuurraass LLiissttaa ddee aabbrreevviiaattuurraass
A Adenina C Citosina CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CEOHNPE Centro de Oncohematologialogia Pediátrica cDNA
Complementar Desoxyribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico complementar
DFH Dihidrofolato DHFR Dihidrofolato redutase DMSO Dimetilsufóxido DNA Desoxiribonucleic Acid
Ácido Desoxirribonucléico dNTP Dinucleotideo Trifosfatado dTMP Timidina monofosfato dUMP Uridina monofosfato EDTA Ácido etilenodiaminotetracético FR Folate Receptors
Receptor de folato G Guanina Hcy Homocisteína HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz IC Intervalo de confiança INCA Instituto Nacional de Câncer Kb kilo bases (mil pares de bases) LA Leucemia Aguda LLA Leucemia Linfóide Aguda LLC Leucemia Linfóide Crônica LMA Leucemia Mielóide Aguda LMC Leucemia Mielóide Crônica
μg Micrograma
L Microlitro
MgCl2 Cloreto de magnésio
MS Metionina sintase MTHFR Metilenotetrahidrofolato redutase NaCl Cloreto de sódio OAT Organic Anion Transporters
Transportadores de Ânions Orgânicos
OR Odds ratio Pb Pares de Bases PCFT Proton-Coupled Folate Transporter
Transportadores de Folato Próton–Associado
PCR Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase
RFC Reduced Folate Carrier Carreador de folato reduzido
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição
9
RNA Ribonucleic Acid Ácido Ribonucléico
SAM S-adenosil metionina
SDS Sodium Dodecyl Sulfate Dodecil Sulfato de Sódio
SHMT Serinahidroximetil transferase
T Timina Taq Thermophylus aquaticus TBE Tris-borato-EDTA THF Tetrahidrofolato TS Timidilato sintase UFPE Universidade Federal de Pernambuco UPE Universidade de Pernambuco UTR Untransleted Region
Região não traduzida UV Ultra-violeta 5-FU 5-fluorouracil
5-metil THF 5-metil tetrahidrofolato
10
LLiissttaa ddee FFiigguurraass
Página Figura 1. Visualização da molécula de ácido fólico com destaque
para as posições N5, N10 nas quais podem existir ligações com os grupos metil (CH3), metileno (CH2), formil (-CHO-) ou formimino (-CHNH-). Adaptado de Assaraf, 2007
11
Figura 2. Via metabólica do ácido fólico em humanos. Adaptado de
Urich et al., 2005. 13
Figura 3. Estrutura esquemática da topologia do Carreador de
Folato Reduzido Humano (RFCh). Matherly. et al., 2007. 16
Figura 4. Estrutura do gene de RFC-1 em humano. Adaptado de
Tolner et al., 1998 16
Figura 5. Esquema estrutural do gene MTHFR e localização das
mutações que provocam diminuição da atividade da enzima. Adaptado de Gos e Szpecht-Potocka 2002.
18
Figura 6. Esquema do gene TS. Adatado de Gibson et al., 2006. 21
11
LLiissttaa ddee TTaabbeellaass
Página Tabela 1. Classificação FAB 09 Tabela 1. Análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg e freqüências
alélicas para os polimorfismos RFC-1 G80A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MS A2756G e para as repetições em tandem no promotor do gene TS.
32
Tabela 2. Características demográficas dos pacientes e controles
analisados para o gene RFC-1. 34
Tabela 3. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
dos pacientes e controles analisados para o gene RFC-1. 35
Tabela 4. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
para controles e pacientes portadores de LLA analisados para o gene RFC-1.
36
Tabela 5. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
para controles e pacientes portadores de LMA analisados para o gene RFC-1.
38
Tabela 6. Características demográficas dos pacientes e controles
analisados para polimorfismo MTHFR C677T. 39
Tabela 7. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
dos pacientes e controles analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.
40
Tabela 8. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
para controles e pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.
41
Tabela 9. Características demográficas dos pacientes e controles
analisados para polimorfismo MTHFR A1298C. 42
Tabela 10. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
dos pacientes e controles analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.
43
Tabela 11. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
para controles e pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.
45
Tabela 12. Características demográficas dos pacientes e controles
analisados para as repetições em tandem no promotor do 46
12
gene TS. Tabela 13. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
dos pacientes e controles analisados para as repetições em tandem no promotor do gene TS.
47
Tabela 14. Qui-quadrado de heterogeneidade dos casos analisados
para as repetições em tandem no promotor do gene TS. 48
Tabela 15. Características demográficas dos pacientes e controles
analisados para o polimorfismo MS A2756G. 48
Tabela 16. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio
dos pacientes e controles analisados para o polimorfismo MS A2756G.
49
13
SUMÁRIO
1 Introdução 15
2 Revisão da Literatura 17
2.1. Leucemia: aspectos gerais 17
2.1.1. Leucemia Linfóide Aguda 19
2.1.2. Leucemia Mielóide Aguda 21
2.2. Ácido fólico 23
2.3. O Carreador de Folato Reduzido humano (RFCh) 28
2.4. A enzima Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR) 31
2.5. A enzima Timidilato Sintase (TS ou TYMS) 34
2.6. A enzima Metionina Sintase (MS ou MTR) 36
3 Objetivos 39
4 Materiais e Métodos 40
4.1. Tipo de estudo 40
4.2. Local do estudo 40
4.3. População do estudo 40
4.4. Critérios de Inclusão 41
4.5. Critérios de exclusão 41
4.6. Considerações éticas 41
4.7. Metodologias para Identificação dos Polimorfismos 42
4.7.1. Extração de material biológico 42
4.7.2. Determinação do polimorfismo RFC G80A 42
4.7.3. Determinação do polimorfismo MTHFR A1298C 43
4.7.4. Determinação do polimorfismo MTHFR C677T 44
4.7.5. Determinação do polimorfismo para TS 44
4.7.6. Determinação do polimorfismo MS A2756G 45
4.7.7. Processamento e análise dos dados 45
5 Resultados 47
5.1 Análise dos dados do gene RFC-1 47
5.2 Análise dos dados do gene MTHFR 52
5.3 Análise dos dados do gene TS 60
14
5.4 Análise dos dados do gene MS 63
6. Discussão 65
7. Conclusões 70
8. Referências 71
9. Anexos 86
15
11..IInnttrroodduuççããoo
As neoplasias hematológicas compreendem um grande número de
distúrbios cujas origens são atribuídas a alterações genéticas de células
hematopoéticas. Estas alterações modificam o padrão de divisão celular,
maturação/diferenciação e apoptose, determinando vantagem proliferativa das
células alteradas. Dentre as neoplasias hematológicas destacam-se as
leucemias nas suas mais variadas formas.
A leucemia é uma desordem no padrão de diferenciação e maturação
das células progenitoras do sistema hematopoiético que modifica o ciclo celular
conferindo às células leucêmicas uma vantagem proliferativa sobre as células
normais. Esta neoplasia corresponde a 30% dos casos de câncer em crianças,
sendo as leucemias agudas responsáveis por 95% dos casos de leucemias
infantis.
Nas últimas décadas, têm sido realizadas inúmeras investigações a fim
de identificar os fatores de risco genéticos e ambientais relacionados ao evento
leucêmico. Alguns destes fatores como radiações ionizantes, agentes químicos
e vírus foram bem descritos e outros, como a deficiência de certos nutrientes
essenciais ao metabolismo normal são alvo de estudos atualmente.
O ácido fólico é uma importante vitamina do complexo B, vital para a
divisão celular e manutenção da homeostase. Produtos do seu metabolismo
participam de processos de metilação gênica, e atuam na síntese e reparo de
DNA, um mecanismo vital para prevenção de rearranjos cromossômicos
comuns em quadros leucêmicos.
Esta vitamina entra na célula via carreador de folato reduzido (RFC) e
estudos recentes sugerem que a alteração no mecanismo de entrada,
resultante de um polimorfismo no loco gênico para o transportador (RFC), pode
contribuir para uma diminuição dos substratos necessários para atividade das
enzimas envolvidas no metabolismo do ácido fólico. A enzima chave nesse
metabolismo é a metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) que converte
irreversivelmente o 5,10 metilenotetrahidrofolato (5,10-MTHF) a 5-
metiltetrahidrofolato (5-MTHF). O loco gênico da MTHFR tem se mostrado
polimórfico exibindo diferentes alelos responsáveis pela diminuição da
16
atividade enzimática e conseqüente acúmulo de 5,10-MTHF. A redução da
atividade enzimática da MTHFR está associada ao aumento do risco de
doenças cardiovasculares, defeitos no tubo neural e desenvolvimento de
determinados tipos de câncer. Em contra partida, esta diminuição da atividade
enzimática da MTHFR também está associada à melhoria da síntese e reparo
do DNA.
Polimorfismos representados por locos que codificam a síntese de
outras enzimas envolvidas no metabolismo de folatos também podem conduzir
a alterações metabólicas significativas, como no caso da metionina sintase
(MS) que é responsável pela remetilação da homocisteína a metionina,
utilizando como co-substrato o 5-MTHF; e da timidilato sintase (TS) que
participa da biossíntese de nucleotídeos e da conversão de dUMP (uridina
monofosfato) a dTMP (timidina monofosfato).
Poucos estudos acerca dos marcadores analisados neste trabalho foram
realizados na população brasileira. Estes trabalhos envolveram doenças como
doença arterial coronariana (Faria- Neto et al., 2006, Muniz et al., 2006),
leucemia linfóide aguda (LLA) (Franco et al., 2001, Pereira et al., 2006,
Zanrosso et al., 2005) e leucemia mielóide aguda (LMA) (da Costa Ramos et
al., 2006). O estudo de polimorfismos em genes envolvidos no metabolismo de
nutrientes essenciais visa contribuir para a identificação de potenciais fatores
de susceptibilidade gênica para o desenvolvimento do câncer. Um maior
conhecimento destes marcadores possibilitará um melhor entendimento dos
mecanismos de metilação, síntese e reparo do DNA. Além disso, contribuirá
para o esclarecimento dos mecanismos que conduzem a rearranjos
cromossômicos, um dos fatores determinantes da leucemogênese.
17
22.. RReevviissããoo ddaa LLiitteerraattuurraa
2.1 Leucemias agudas: aspectos gerais
A hemocitopoese é um processo complexo regulado pela expressão
coordenada de diversos fatores de transcrição, que são ativados ou inibidos
durante o processo. A expressão desregulada e o desequilíbrio desses fatores
resultam em transformações malignas. Em vertebrados, a hemocitopoese é
intensamente ativa durante o desenvolvimento fetal e os primeiros anos de
vida, não sendo surpreendente o fato de ser a leucemia, o principal câncer
infantil (Pui et al., 2004).
O sistema hemocitopoético é composto por células pluripotentes
indiferenciadas que podem originar duas linhagens celulares: a linhagem
linfóide, que irá produzir os linfócitos T e B; e a linhagem mielóide, responsável
pela formação de eritrócitos, plaquetas, monócitos e granulócitos (Colby-
Graham e Chordas, 2003).
As neoplasias hematológicas, decorrentes de proliferação anormal
descontrolada de células indiferenciadas, compreendem um grande número de
distúrbios cujas origens são atribuídas a alterações genéticas de células
hemocitopoéticas, nas quais se destacam as leucemias nas suas mais variadas
formas.
O termo leucemia é originário do grego (leucos = branco, hema =
sangue) e refere-se a um grupo de doenças malignas dos glóbulos brancos
(Colbi-Graham e Chordas, 2003). São subdivididas de acordo com o grau de
diferenciação da célula anormal, em agudas (baixo nível de diferenciação) e
crônicas (alto nível de diferenciação), e considerando a natureza dos blastos,
em linfóide e mielóide. Dentre as neoplasias da linhagem mielóide observa-se
às leucemias mielóides agudas, as mieloproliferações crônicas e as síndromes
mielodisplásicas (pré-leucemias). E entre as neoplasias da linhagem linfóide,
ocorrem as linfoproliferações agudas, os linfomas de células precursoras e as
linfoproliferações crônicas (Cole e Rodu, 2001). As quatro principais formas de
leucemias são, portanto: a leucemia linfóide aguda (LLA) e a leucemia mielóide
aguda (LMA), que correspondem respectivamente a cerca de 80% e 15-20%
18
dos casos de leucemias infantis; e a leucemia linfóide crônica (LLC) e a
leucemia mielóide crônica (LMC) mais comum em adultos (Cole e Rodu, 2001,
Colbi-Graham e Chordas, 2003, Krajinovic et al., 2004a).
Na década de 70 as leucemias agudas foram classificadas levando em
consideração critérios morfológicos determinados pelo comitê FAB (Franco-
Americano-Britânico). Segundo estes critérios a LLA é classificada em L1, L2 e
L3, com base no diâmetro celular, na forma do núcleo, no número e
protuberância dos nucléolos e na quantidade e aspectos relativos do
citoplasma, porém essa classificação não consegue refletir a grande
diversidade biológica da doença; a LMA em M1, M2, M3, M4, M5 e M6, com
base nas características nucleares e citoplasmáticas e no grau de maturação
das células blásticas (Bennett et al., 1997; Bennett et al., 1985a). Em seguida,
foram descritos dois novos grupos de LMA - M0 (definido por marcadores
imunológicos, em pacientes que não apresentam critérios morfológicos) e M7
(Bennet et al., 1985b; Bennet et al., 1991).
O preciso evento patogênico que leva ao aparecimento da leucemia
aguda infantil é desconhecido. Apenas pouco mais de 5% dos casos estão
associados a hereditariedade, predisposições genéticas tais como a síndrome
de Down, síndrome de Bloom, ataxia-telangiectasia, e síndrome de Nijmegen,
ou ainda exposição à radiação ionizante e a drogas quimioterápicas. Dentre os
fatores genéticos, estão associadas às leucemias mais de 200 alterações,
incluindo mutações pontuais, deleções gênicas, e inversões. Como resultado
destas alterações podem surgir alterações cromossômicas numéricas e/ou
estruturais. A ocorrência de anomalias cromossômicas é variável, como o fato
de algumas aberrações serem relacionados a particulares subtipos
morfológicos ou fenotípicos (Lightfoot, 2005). Crianças com desordem
genética, como anemia de Fanconi, tem um aumento do risco para leucemia
aguda. Nos primeiros 5 anos de vida, crianças com síndrome de Down têm 36
vezes maior risco para leucemia (Bjorge et al., 2008). Existe, ainda, uma
extensiva lista de fatores ambientais, que confere aumento do risco de
desenvolvimento da doença, sendo os principais: exposição a pesticidas ou
solventes, exposição a campos magnéticos de alta freqüência, ocupação dos
pais, uso de álcool ou tabaco durante a gestação, dieta e histórico reprodutivo
19
materno, uso de vitaminas pré-natal. (Ahlbom et al., 2000, Hjalgrim et al., 2003,
Buffler et al., 2005).
A observação da media de idade das crianças, quando do surgimento da
doença (de 2 a 5 anos), associado ao aumento da prevalência, principalmente
em áreas de alta renda, possibilitou ao pesquisador M. Greaves, formular uma
hipótese sobre a origem da doença: a hipótese de infecção tardia. Segundo
Greaves 2006, há dois momentos importantes para o surgimento da doença: O
primeiro seria ainda in utero, quando o indivíduo, exposto a fatores de risco,
adquiriria células potencialmente leucêmicas. As linhagens linfóides do fígado e
da medula óssea ficam particularmente susceptíveis devido ao estágio de pré-
diferenciação (Gruhn et al., 2008, Cobaleda e Busslinger 2008). Igualmente, as
células da linhagem mielóide ficam susceptíveis, devido principalmente a
grande quantidade de hormônios e fatores de crescimento, que aumentam o
pool de células tronco, aumentando o número de replicação celular e então, a
possibilidade de conversão dessas células em tumorais (Tower e Spector
2007). Os indivíduos portadores do clone pré-leucêmico teriam pouca ou
nenhuma infecção no início da vida, por viverem em um ambiente rico em
higiene. Tal “isolamento” predisporia o sistema imunológico do indivíduo a
respostas anormais ou patológicas quando este fosse exposto a infecções
comuns da idade (segundo momento). A identificação de fusões gênicas
específicas da leucemia (TEL-AML1, por exemplo), hiperploidia, rearranjos
cromossômicos e estudos sobre a origem das leucemias em gêmeos
monozigóticos indicaram, claramente, a origem pré-natal de algumas leucemias
infantis, e confirmaram a teoria de Greaves (Wiemels et al., 1999, Maia et al.,
2003, Greaves, 2006, Hong et al., 2008).
2.1.1 Leucemia linfóide aguda
A leucemia linfoblástica (ou linfóide) aguda (LLA) é o câncer mais comum
na infância, compreendendo cerca de 30% de todos os cânceres pediátricos e
80% das leucemias infantis (Krajinovic et al., 2004b, Karathanasis et al., 2009).
É mais comum entre os meninos (1,3 masculino : 1 feminino) e 60% dos casos
20
são diagnosticados nos primeiros cinco anos com picos de incidência entre
dois e quatro anos de vida (Parkin et al., 1998, Oliveira et al., 2004).
Atualmente, além dos critérios FAB, as LLA são classificadas segundo a
presença de antígenos de superfície, sendo possível detectar com bastante
precisão: a linhagem celular (T ou B) e o nível de diferenciação em que se
encontra o processo leucêmico (Bene et al., 1995; Cavalcanti Jr., 1997). A LLA
do tipo B ocorre em cerca de 80-85% dos pacientes pediátricos, enquanto a
LLA tipo T representa 15% dos casos (Sinnett et al., 2006).
A leucemia linfóide aguda é uma neoplasia maligna dos linfócitos,
caracterizada pelo acúmulo de células linfóides imaturas na medula óssea. As
aberrações na proliferação e diferenciação destes elementos são comuns e a
hemocitopoese normal é suspensa. Estas células anormais encontram-se
paralisadas em diferentes estágios de maturação (Kebriaei e Larson 2003).
As manifestações clínicas da LLA decorrem da inibição da hematopoiese
pelas células leucêmicas e dos efeitos da infiltração destas células em diversos
órgãos e sistemas. A inibição do crescimento e diferenciação das células
hematopoiéticas normais não ocorre somente pela ocupação física da medula
óssea e competição nutricional por parte das células neoplásicas. Várias
evidências experimentais sugerem que as células neoplásicas secretam
substâncias inibidoras da mielopoiese (Oliveira et al., 2004). A infiltração
tecidual pelas células leucêmicas pode resultar em linfadenomegalias,
esplenomegalia e hepatomegalia, que estão presentes em aproximadamente
50% dos pacientes. Aumento do volume mediastinal é encontrado em 14% dos
casos, principalmente na LLA de células T. A maioria dos pacientes com
leucemia apresenta blastos leucêmicos no sangue periférico e o envolvimento
do baço, fígado e linfonodos. Manifestações com comprometimento do sistema
nervoso central como cefaléia, vômitos, letargia, rigidez de nuca, dentre outros
sintomas neurológicos, são freqüentes em 4-7% dos pacientes (Sinnett et al.,
2006, Pieters e Carroll, 2008).
O diagnostico de LLA é confirmado pela punção aspirativa da medula
óssea. O estudo desse tecido revela a substituição do tecido hematopoiético
normal por células leucêmicas imaturas. O diagnostico é então firmado quando
mais de 25% das células nucleadas são blastos (Oliveira et al., 2004).
21
Apesar de a LLA ser responsável pela maioria dos casos de LA infantil, a
LMA é significativamente mais mortal (Brown e Smith 2008). Porém, ainda que
a taxa de sobrevida livre de evento, para crianças com LLA, seja acima de
80%, quase 20% dos pacientes tratados não respondem ao tratamento e uma
considerável proporção dessas crianças continua recaindo ou morrendo,
durante ou após o fim da terapia (Robien e Ulrich, 2003, Ashton et al., 2009).
Este dado parece estar relacionado à presença de polimorfismos que alteram a
atividade de enzimas responsáveis pelo metabolismo de drogas, influenciando,
dessa forma, a eficácia e a toxicidade do tratamento (Karathanasis et al.,
2009).
Embora os aspectos clínicos, patológicos e imunofenotípicos, da
doença, sejam bem documentados, pouco é conhecido sobre o preciso
mecanismo leucemogênico (Krajinovic et al., 1999). A causa da maioria das
leucemias agudas pediátricas é, portanto, desconhecida. Porém, sabe-se que o
surgimento dessa malignidade hematológica está associado à interação
combinada da susceptibilidade genética à exposição ambiental durante o
desenvolvimento fetal e infância (Krajinovic et al., 2004a, Gemmati et al., 2004).
Alterações cromossômicas e moleculares, tais como translocações, inversões e
deleções em genes reguladores do desenvolvimento celular e homeostase,
também aumentam o risco de desenvolvimento da doença (Little 1999,
Krajinovic et al., 2004b, Gruber et al., 2009). O risco de aberrações
cromossômicas também pode ser aumentado devido à deficiência de folatos,
que vem sendo associada à missincorporação de uracil e a quebra da dupla fita
de DNA durante o mecanismo de excisão e reparo (Giovannucci, 2002).
Defeitos e polimorfismos gênicos em enzima folato-dependentes e deficiência
de micronutrientes vem sendo documentado por influenciar a susceptibilidade
ao câncer (Zingg e Jones, 1997, Lucock, 2000, Kamel et al., 2007).
2.1.2 Leucemia mielóide aguda
A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma desordem hematológica
caracterizada pela aquisição de mutações somáticas em progenitores
hemocitopoéticos que leva a interrupção no processo de diferenciação,
22
resultando no crescimento da população clonal de células neoplásicas, pela
proliferação de células da linhagem mielóide. Esta alteração maligna nas
células tronco hemocitopoéticas leva a perda da função normal
(hemocitopoese), o que, se não tratada, tipicamente acarreta em morte do
indivíduo em poucas semanas ou meses após a apresentação clinica da
doença. A exposição do DNA a agentes danosos exercem um importante papel
na patogênese da LMA, posto que de 10 a 20% dos casos de LMA estão
associados a pacientes que receberam quimio e/ou radioterapia provenientes
do tratamento de outra malignidade anterior (Tenen, 2003, Voso et al., 2007,
Shipley e Butera, 2009).
A LMA é a leucemia aguda mais comum em adultos, sendo
relativamente rara em crianças. Ocorre em aproximadamente um em cada
130.000 indivíduos menor de 20 anos, correspondendo a cerca de 15-17% dos
casos de leucemia infantil (Pui et al., 2004, Da Costa Ramos et al., 2006). Os
subtipos de LMA são caracterizados por alterações genéticas e alterações
cromossômicas, tais como translocações, inversões e deleções (Tenen, 2003).
Todavia, cerca de 40% a 50% dos pacientes com leucemia mielóide aguda
apresenta cariótipo normal, o que representa o maior subgrupo da patologia
(Mrozek e Bloomfield, 2006). Não obstante, nem todos os pacientes neste
subgrupo apresentam a mesma resposta ao tratamento. Sendo esta,
provavelmente uma conseqüência da grande variabilidade das mutações
genéticas e expressão gênica diferenciada nas populações (Shipley e Butera,
2009).
Existem oito diferentes subtipos de LMA, e identificar o tipo é essencial
para prever o curso da doença e tratar o paciente de forma eficaz.
Tradicionalmente, a classificação está baseada na morfologia das células
blásticas, seguindo critérios da classificação Franco-Americano-Britânica (FAB)
(Tabela 1). A imunofenotipagem é considerada essencial para o correto
diagnostico dos subtipos (Bennett et al., 1991). Segundo a classificação FAB,
os subtipos de LMA são igualmente representados através dos grupos étnicos
e raciais, com exceção da leucemia promielocítica aguda (M3), que tem uma
maior incidência entre as crianças de ascendência latina e hispânica (Rubnitz,
2008).
23
Tabela 1. Classificação FAB
Subtipo FAB Descrição
M0 LMA com diferenciação mínima
M1 Leucemia mieloblástica sem maturação
M2 Leucemia mieloblástica com maturação
M3 Leucemia promielocítica aguda
M4 Leucemia mielocítica aguda
M5 Leucemia monoblástica aguda
M6 Leucemia eritroblástica aguda
M7 Leucemia megacarioblástica aguda
Adaptado de Pui et al., 2004
O prognóstico e a genômica tumoral estão intimamente ligados. Da
mesma forma, há uma relação muito próxima entre citogenética e idade ao
diagnóstico. Anomalias citogenéticas aumentam com o aumento da idade. A
estratificação de risco baseada em citogenética divide os pacientes em três
grupos principais, aqueles com citogenética favorável, intermediário e
desfavorável. Dentro do grupo de risco (citogenética desfavorável) prognóstico
e padrão de tratamento pioram com o aumento da idade (Shipley e Butera,
2009).
2.2. Ácido Fólico
Ácido fólico, folato ou folacina é o nome genérico dado a uma família de
compostos, que exibem atividade biológica, derivados do ácido
pteroilglutâmico, a forma mais estável da vitamina B9 (Godbole et al., 2009). O
nome folato surgiu do termo em Latim folium, que significa folha, pois foi
isolada pela primeira vez a partir de folhas verdes (Mitchell et al., 1941). Agem
como co-fatores para síntese de precursores de nucleotídeos (biossíntese de
purinas e pirimidinas), catabolismo de histidina e ácido fórmico, síntese de
aminoácidos (serina, metionina e glicina) nas reações de transferência de um
carbono, assim como para metilação de ilhas CpG do DNA (Stokstad, 1990;
Assaraf, 2007). A recuperação da metionina é importante, porque seu
24
precursor imediato S-adenosilmetionina (SAM) atua como doador universal dos
radicais metil, em várias reações biológicas que envolvem metilação (Selhub e
Miller, 1991; Goyette et al., 1994).
Naturalmente o ácido fólico é composto por três componentes
estruturais: (1) anel de pteridina, (2) p-ácido aminbenzóico e o (3) resíduo
glutamato (Assaraf, 2007) (Figura 1). A forma mais estável dos folatos é o
ácido fólico, porém este não é encontrado naturalmente em tecidos vivos; para
tornar-se biologicamente ativo, é preciso que este seja reduzido in vivo, o que
resulta em dihidrofolato (DHF) e tetrahidrofolato (THF), pela adição de átomos
de hidrogênio no anel pizarina da pteridina, nas posições 7, 8, e 5, 6, 7, e 8
respectivamente (Baluz et al., 2002, Melo, 2004). O ácido fólico, pode ainda se
ligar a unidades de carbono, que inclui grupos metil (CH3), metileno (CH2),
formil (-CHO-) ou formimino (-CHNH-) nas posições N5, N10 ou N5,10 conferindo
ao folato a função de coenzima, em diferentes sistemas enzimáticos, como
carreador dessas unidades de carbono em diferentes graus de oxidação (figura
1).
Figura 1. Visualização da molécula de ácido fólico com destaque para as posições N5, N
10
nas quais podem existir ligações com os grupos metil (CH3), metileno (CH2), formil (-CHO-)
ou formimino (-CHNH-). Adaptado de Assaraf, 2007
Fora da célula, o ácido fólico é transportado sob a forma de 5-metil-
tetrahidrofolato (5-metilTHF), ligado inespecificamente a proteínas ligantes de
baixa afinidade, principalmente a albumina (Baluz et al., 2002) ou ainda (uma
pequena parte do folato plasmático) ligado à proteína ligante específica de alta
anel de pteridina
p-ácido aminobenzóico
resíduo glutamato
Ácido Fólico
25
afinidade (folate binding proteins) (Steinberg, 1984; Brody, 1994) encontradas
no soro, no fluído cérebro-espinhal, no leite e no sangue do cordão umbilical.
Porém, por serem ânios moleculares hidrofílicos não podem cruzar a
membrana plasmática apenas por difusão, necessitando para isso de sistemas
sofisticados de transporte (Matherly et al., 2007), tais como: Receptores de
Folato (FRs – Folate Receptors), que possuem afinidade por folato oxidado;
Famílias de Transportadores de Ânios Orgânicos (OATs – Organic Anion
Transporters); Transportadores de Folato Próton–Associado (PCFT – Proton-
Coupled Folate Transporter) e o Carreador de Folato Reduzido (RFC –
Reduced Folate Carrier) (Matherly e Goldman, 2003).
Os folatos podem ser absorvidos ao longo de todo o intestino delgado,
preferencialmente no jejuno. Para isto, os poliglutamatos precisam ser
hidrolisados a monoglutamatos pela enzima intestinal pteroilpoliglutamato
hidrolase ou glutamil hidrolase, que é uma enzima zinco-dependente (Gómez,
1997). Em seguida são estocados principalmente no fígado sendo
posteriormente secretado na bile, onde a circulação entero-hepática poderá
reabsorvê-lo e reutilizá-lo, minimizando dessa forma as perdas orgânicas e
garantido a manutenção do nível sérico (Lorenzi et al., 2003; Födinger et al.,
2003; Melo, 2004).
Uma vez que as células de mamíferos não podem sintetizar folato de
novo, a assimilação de folatos a partir da dieta é essencial para o crescimento
e regeneração dos tecidos (Sirotnak e Tolner, 1999), pois este componente é
um nutriente indispensável para a manutenção da mecânica celular
(Krumdieck, 1990; Brody, 1994; Mcnulty, 1995).
Estudos epidemiológicos e experimentais indicam que a deficiência de
ácido fólico em seres humanos induz a extensivas quebras cromossômicas
(Menzics et al., 1966), formação de micronúcleos (Everson et al., 1988),
hipometilação genômica (Jacob et al., 1998), diminuição da capacidade de
reparo do DNA (Choi e Manson, 1998), além do aumento dos níveis de uracila
no DNA das células da medula óssea (Wickramasinghe e Fida, 1994). Outros
estudos ainda associam a deficiência de folato com várias neoplasias, tais
como câncer de pulmão, de esôfago, de pâncreas, de mama, de cérebro e
câncer colorretal (Mason e Levesque, 1996; Duthie et al., 2002). Também já foi
verificado que a suplementação de ácido fólico, pode reduzir o risco do
26
aparecimento de defeitos do tubo neural (Berry et al., 1999; Melo, 2004),
retardo mental (Krishnaswamy e Nair, 2001), doenças vasculares (Chen et al.,
2001), câncer (Kim, 2000) e, em especial, leucemia linfóide aguda em crianças
cujas mães fizeram suplementação de ácido fólico durante a gestação
(Krajinovic et al., 2004b). Por outro lado, uma meta-análise realizada na Nova
Zelândia não detectou o efeito protetor do folato para o risco de
desenvolvimento de LLA em crianças (Dockerty et al., 2007).
O ácido fólico é, portanto, essencial para o fornecimento de grupos metil,
e metilação do DNA, que é importante na regulação epigenética e
silenciamento gênico. A conexão entre a metilação do DNA e o risco de câncer
pode ser compreendida da seguinte maneira: metilação do DNA pode ocorrer
em promotores, bem como em seqüências repetitivas do genoma (Laird, 2005).
Este processo de metilação pode hiperexpressar determinados grupos gênicos
quando realizado de forma ineficiente. A hiperexpressão de protooncogenes
poderá conduzir grupos celulares normais a células alteradas, sendo este um
evento crucial para a oncogênese (Ulrich, 2008).
Alterações no suplemento de folato têm sido associadas com errônea
incorporação de uracil no DNA, levando a quebra na dupla fita durante o reparo
por excisão de uracil (Krajinovic et al., 2004a). Estas quebras são resultantes
da ação de enzimas de reparo de DNA, uracil DNA glicosilase (Blount et al.,
1997). Em condições normais, as glicosilases removem a base do nucleotídeo
mal pareado (uracil) na fita de DNA. Após a ação da uracil DNA glicosilase,
enzimas de reparo genômico removem a ribose ainda presa à fita, causando
ruptura transitória na molécula de DNA (Reidy, 1997). Este processo de
reparação do filamento pode levar a deleções de sequências chave no
processo de regulação do metabolismo celular alterando o crescimento, a
divisão e a síntese protéica podendo assim contribuir para o risco de câncer
(Ulrich, 2008).
A recomendação dietética diária de folatos para homens adultos é de
200 μg, mulheres adultas de 180 μg, gestantes de 400 μg e nutrizes de 280 μg.
Os folatos são facilmente destruídos por agentes físicos e químicos, como
oxidação, calor, cozimento e luz ultravioleta (Lorenzi et al., 2003). Porém
baixos níveis no organismo são resultantes de ingesta nutricional insuficiente
ou deficiências da assimilação no seu metabolismo. A Figura 2 mostra as
27
principais etapas do metabolismo do ácido fólico, desde sua assimilação (pelo
carreador de folato reduzido) a sua participação na síntese de purinas e
pirimidinas, assim como no processo de metilação.
Figura 2: Via metabólica do ácido fólico em humanos. Adaptado de Urich et al., 2005.
A partir da figura 2 é possível observar que o ácido fólico intracelular, é
substrato para três importantes processos enzimáticos: Uma das enzimas
envolvidas é a timidilato sintase (TS) que está implicada na biossíntese de
nucleotídeos (pirimidinas) pela conversão de dUMP (uridina monofosfato) a
dTMP (timidina monofosfato). Ela desempenha um papel crítico em manter um
nível equilibrado de desoxinucleotídios, porque esta é a única fonte de novo de
timidilato, uma condição essencial para a biossíntese de DNA. Portanto,
prejuízos à enzima TS têm sido associados com danos nos cromossomos e
indução de sítios frágeis (Ayusawa et al., 1986, Zhuang et al., 2009). Sendo
assim, a TS é uma importante enzima na manuntenção da integridade gênica
(Ulrich et al., 2005).
Outra enzima importante é a metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)
que reduz, irreversivelmente, o 5,10 metilenotetrahidrofolato a 5-metil
tetrahidrofolato (5-metilTHF) (Frosst et al., 1995), tornando este disponível para
a ação de outro processo enzimático mediado pela metionina sintase (MS).
Uma menor disponibilidade de 5-Metil-THF pode diminuir a síntese de
metionina e, conseqüentemente, de S-adenosil metionina (SAM), o principal
doador de radicais metil dos mamíferos.
28
A metionina sintase utiliza o 5-metilTHF como doador de radical metil
para metilação da homocisteína (Hcy) em metionina tendo como co-fator para
esta reação a vitamina B12. Essa reação resulta, também, na produção de S-
adenosilmetionina (SAM) (Ulrich et al., 2000, Goode et al., 2004). Outra
enzima também importante é a dihidrofolato redutase, DHFR, responsável pela
redução, intracelular, do dihidrifolato (DHF) a tetrahidrofolato (THF) (Johnson et
al., 2005).
Sob condições de deficiência de folato, a quantidade de SAM é limitada,
podendo provocar hipometilação genômica. Essa ausência de metilação
conduz à ativação e transcrição inadequada de proto-oncogene e conversão
dos mesmos a oncogenes, iniciando dessa forma o processo carcinogênico
(Zingg e Jones, 1997, Narayanan et al., 2004).
2.3 O Carreador de Folato Reduzido humano (RFCh)
O carreador de folato reduzido humano (RFCh) é expresso em todas as
células e foi caracterizado como principal responsável pelo transporte de ácido
fólico e drogas quimioterápicas antifolato, como o metrotexato (MTX), o
permetrexed (Alimta®) e o raltitrexed (Tomudex®), em células de mamíferos,
mesmo quando múltiplos outros sistemas de assimilação estão presentes
(Sirotnak et al., 1999 e Matherly et al., 2003). Este transporte ocorre
bidirecionalmente através da membrana plasmática, utilizando como carga
negativa o glutamato (Hooijberg et al., 2006, Drodzik et al., 2007).
Esse carreador transporta o ácido fólico reduzido principalmente sob as
formas 5-metil THF e 5-formil THF, necessitando de temperatura ótima, sendo
sódio independente e sensível à inibição competitiva por outros substratos de
RFC (Matherly et al., 2007). Apesar da onipresença do carreador, a absorção
de folato ocorre principalmente no jejuno, através de uma reação dependente
de pH (pH ótimo 5,0) (Melo, 2004).
A proteína carreadora de folato reduzido (RFC) é uma glicoproteína
transmembrana de 65 kDa compreendendo 591 resíduos de aminoácidos,
(Nguyen et al., 1997). O cDNA do gene RFC-1 foi clonado pela primeira vez em
1995 e hoje sabe-se que ele está localizado no cromossomo 21 (21q22.2-
29
q22.3) apresenta 22,5 kb e um cDNA com 1,8 Kb (Chango et al, 2000; Moscow
et al, 1995). Essa localização do gene de RFCh pode, ao menos em parte,
explicar o maior número de casos de toxicidade por MTX em pacientes com
sindrome de Down, pelo aumento do número de copias do gene e consequente
maior expressão do mesmo (Peeters et al., 1987).
O papel fisiológico da glicoproteína RFC pode ser compreendido pela
análise da estrutura da molécula (figura 3). Esta possui 12 domínios
transmembranas (TMD) hélicos (Dixoz et al, 1994) que por sua estrutura
simétrica, apresenta seis segmentos transmembranares em cada uma das
duas metades (Hou et al., 2006), que formam canais na membrana plasmática,
através dos quais o 5-metiltetrahidrofolato atinge o citoplasma da célula
(Hresko et al., 1994). Ambos os domínios, N- e C- terminais, e uma grande
alça, entre os domínios 6 e 7, estão localizados no citoplasma. Os domínios
citoplasmáticos não parecem ser essenciais para o transporte do substrato,
mas são importantes para a biogênese e localização da molécula (Sadlish et
al., 2002, Hou et al., 2006).
Figura 3: Estrutura esquemática da topologia do Carreador de Folato Reduzido
Humano (RFCh). Matherly. et al., 2007.
A partir do gene RFC-1 (figura 4), são gerados transcritos RFC múltiplos,
com terminais UTR (Untransleted Region) 5´heterogêneos. Dos 8 exons
identificados, 5 são primários (2 a 6) e o éxon 1 se apresenta em três formas
30
alternativas distintas (formas 1ª, 1b e 1c), cada qual com um terminal
5´diferente. A ocorrência de formas alternativas do éxon 1, incorporando
diferentes terminais 5´, indica que a transcrição de RFC-1 está sob controle de
múltiplos promotores, o que significa que o gene apresenta vários sítios de
início de transcrição (o principal está numa região de 109 a 135 pb, no início do
exon 1) e os transcritos sofrem splicing alternativos de éxons não codificantes
(Tolner et al, 1998; Williams e Flintoff, 1998; Zhang et al, 1998).
Figura 4: Estrutura do gene de RFC-1 em humano. Adaptado de Tolner et al., 1998.
A região 5´ do gene RFC-1 não apresenta seqüências como TATA box
ou CAAT box. Uma região rica em GC nos éxons 1 alternativos parece
funcionar como promotor e incorpora elementos cis-atuantes envolvidos na
regulação da transcrição. O promotor 1 (éxon 1ª) tem três vezes mais atividade
basal do que o promotor 2 (éxon 1b). As regiões flanqueadoras 5´ dos éxons 1
e 2 são especialmente ricas em GC (Pro-43 = 996pb; Pro32 = 342pb,
respectivamente) (Tolner et al, 1998).
Recente estudo tem investigado o papel funcional da proteína RFC,
assim como caracterizado alterações no gene do carreador de folato reduzido,
e identificado mutações presentes em domínios essenciais. Seqüências
gênicas variantes que resultam em baixos níveis de expressão ou perda da
função de transporte podem exacerbar quadros clínicos associados com a
deficiência de folatos inclusive o câncer (Matherly et al., 2007).
Em 2000, Chango et al. identificaram o polimorfismo G80A no gene
RFC-1. Este, consiste da transição de uma guanina por uma adenina no
nucleotídeo 80 do éxon 2. A substituição promove, então, a troca do
aminoácido arginina (CGC) por uma histidina (CAC), na posição 27 da
proteína. O polimorfismo tem sido associado a concentrações alteradas de
produtos derivados da via metabólica do folato (Fillon-Emery et al., 2004).
Entretanto, a importancia fisiologica e farmacologica do polimorfismo G80A em
31
RFCh permanece obscura, pois achados clinicos e epidemiologicos têm se
mostrados controversos (Chango et al., 2000 e Shaw et al., 2002).
Em relação ao câncer, resultados têm demonstrado aparente associação
do genótipo AA com o aumento do risco de câncer gástrico e esofágico (Wang
et al., 2007) e com aumento do nível de folato plasmático em pacientes com
linfoma não Hodgkin (Skibola et al., 2004). Pacientes LLA pediátricos, tratados
com MTX, portadores do alelo 80A (homozigotos e heterozigotos),
apresentaram maior risco de efeito adverso ao tratamento quando comparados
com pacientes portadores do genótipo 80GG (Laverdiere et al., 2002).
Entretanto, quando o transporte via RFC foi caracterizado, em ensaios usando
a proteína com histidina ou arginina, na posição correspondente ao
polimorfismo, nenhuma alteração significativa do transporte foi observada
(Whetstine et al., 2001).
Por isso, acredita-se que polimorfismos representados por locos que
codificam a síntese de enzimas envolvidas no metabolismo de ácido fólico
podem conduzir a alterações metabólicas significativas. As interações gene-
gene, bem como suas inter-relações com a dieta, exposição ambiental e função
imune individual, podem ser os maiores determinantes na susceptibilidade para
as leucemias.
2.4 A enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)
A metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) é a enzima critica no
metabolismo do ácido fólico (Schnakenberg et al., 2005). Ela pode ser
encontrada no citoplasma sob a forma de estruturas homodiméricas. A proteína
humana tem duas isoformas com peso molecular de 77KDa e 70KDa, sendo a
última forma, apenas observada no tecido do fígado de adultos e nos tecidos
dos rins e do fígado de fetos (Rozen, 1998).
A MTHFR converte, irreversivelmente, o 5,10 metilenotetrahidrofolato
(5,10-metilenoTHF) em 5-metiltetrahidrofolato (5-metilTHF) e dessa forma
fornece radical metil para: 1. Formação do principal doador de metil primário,
nas reações de metilação intracelular, S-adenosilmetionina (SAM); 2. Produção
de metionina a partir de homocisteína (Yi et al., 2002).
32
O gene MTHFR está localizado no cromossomo 1 (1p36.32) e apresenta
11 éxons (figura 5) com tamanhos variando de 103 a 432 pb (Goyette et al.,
1998). A região promotora possui vários sítios de ligação a fatores de
transcrição, mas não apresenta seqüência TATA-Box (Homberger et al., 2000).
A enzima tem dois domínios: o catalítico (N-terminal) que liga FAD-NADPH e
metilenotetrahidrofolato, e o domínio regulatório (C-terminal) (Matthews et al.,
1998).
Figura 5: Esquema estrutural do gene MTHFR e localização das mutações que provocam
diminuição da atividade da enzima. Adaptado de Gos e Szpecht-Potocka 2002.
Dois polimorfismos no gene MTHFR têm sido reportados por reduzirem
a atividade da enzima, um na posição 677 e outro na posição 1298 (Botto e
Yang 2000). Essa menor atividade da enzima MTHFR leva a um aumento dos
níveis plasmáticos de homocisteína e diminuição da formação de 5-metilTHF. E
a redução da disponibilidade de 5-metilTHF contribui para o pool de 5,10-
metilenoTHF, que é doador de radical metil para conversão de dUMP à dTMP
pela timidilato sintase. Por isso acredita-se que a menor atividade da MTHFR
poderia favorecer a síntese de DNA, pela redução da taxa de incorporação de
uracila, uma potencial causa de quebra da dupla fita, durante a excisão de
uracil pelo mecanismo de reparo (Frosst et al., 1995, Blount et al., 1997,
Gemmati et al., 2004, Kim et al., 2004).
O polimorfismo na posição 677 (éxon 4), constitui da transição de uma
citosina por uma timina, o que provoca a substituição de uma alanina por uma
valina no aminoácido 222 do domínio catalítico da enzima (Schwahn et al.,
2001, Castro et al., 2003). Essa substituição altera sítio de ligação para a
33
flavina adenina dinucleotídeo (FAD), um co-fator importante para MTHFR
(Guenther et al., 1999).E pode ser detectada funcionalmente por causa da
redução da estabilidade da enzima durante a incubação, in vitro, de extratos
celulares a 46°C por 5 minutos. Indivíduos que são homozigotos para a
mutação têm uma drástica redução da atividade da enzima, que é menos
estável in vitro, por isso sendo chamada termolabil (Chiusolo et al., 2004).
Indivíduos com o genótipo MTHFR 677TT produzem uma enzima com
30% de atividade enzimática em relação à encontrada nos indivíduos com
genótipo selvagem (677CC), enquanto os indivíduos heterozigotos (CT)
produzem uma enzima com aproximadamente 60% da atividade da dos
homozigotos selvagem (Frosst et al., 1995). Indivíduos com o genótipo TT,
especialmente se combinado com uma dieta deficiente em folato,
apresentaram níveis plasmáticos elevados de homocisteína, ilustrando a
importância fisiológica deste genótipo (Ulrich et al., 2000).
Na posição 1298 (éxon 7), o polimorfismo constitui da transversão de
uma adenina por uma citosina o que determina a substituição de um glutamato
por uma alanina no aminoácido 429, domínio regulatório da enzima
(Homberger et al., 2000). Essa substituição também gera uma enzima com
atividade diminuída. No entanto, em contraste com a variante 677T,
observações bioquímicas indicam que indivíduos homozigotos para o alelo
1298C não parecem ter níveis séricos mais elevados de homocisteína ou
qualquer alteração no status de folato quando comparado com o genótipo
selvagem, provavelmente devido as posições distintas dos dois polimorfismos
(Van Der Put et al., 1998).
Os efeitos da mutação 1298A→C sobre as concentrações plasmáticas
de homocisteína permanecem controversos. Castro et al. (2003) relataram que
esta mutação do gene MTHFR apresentou um efeito significativo sobre os
níveis de homocisteína total no plasma, mas outros não observaram influência
significante dos polimorfismos MTHFR C677T e A1298C com os níveis
plasmáticos de Hcy (Meisel et al., 2001; Biselli et al., 2009).
Estudos da distribuição geográfica e étnica da mutação C677T em 16
áreas do globo, incluindo a Europa, Ásia, Américas, Oriente Médio e Austrália
determinaram uma freqüência para o genótipo TT em torno de 20% na China,
de 20-26% na Itália e 32% no México. A freqüência do genótipo TT foi baixa
34
entre recém-nascidos de Afro descendentes, intermediária entre os recém-
nascidos de origem européia, e alta entre recém-nascidos de ascendência
latino-americanos. Entre os africanos e afro-descendentes a freqüência deste
genótipo é baixa (3%). Na Europa a prevalência do genótipo TT aumenta em
direção ao sul, 4-7% na Finlândia, 16% no Reino Unido, 8-10% na França, 11%
na Alemanha e 20-26% na Itália (Wilcken et al., 2003,Kamel et al., 2007).
O alelo 1298C apresenta faixas de freqüência entre 0,17-0,19 nas
populações asiáticas e entre 0,27-0,36 na Europa Ocidental (Robien and Ulrich
2003). Entre populações da América do Sul, o alelo 1298C apresentou uma
freqüência entre 0,23 – 0,26, e a freqüência alélica para 677T entre 0.30 - 0.31
(Da Costa Ramos et al., 2006).
2.5 A enzima Timidilato sintase (TS ou TYMS)
A Timidilato sintase exerce um importante papel no metabolismo de
nucleotídeos. Esta enzima é requerida para síntese de novo de pirimidinas,
juntamente com o co-fator metil (Candelaria et al., 2005). Ela catalisa a
metilação redutiva de 2’-deoxiuridina 5’-monofosfato (dUMP) em 2’-
deoxitimidina 5’-monofosfato (dTMP) utilizando, o co-fator 5,10-
metilenotetrahidrofolato (CH2H4folato) como doador de metil e hidrato, e
produzindo dihidrofolato (H2folato). É importante observar que há uma
competição entre as enzimas TS e MTHFR pelo 5,10-metilenotetrahidrofolato
como substrato para esta conversão (Jackson et al., 1983). Não obstante, essa
reação é a única fonte de timidilato no interior da célula (Kanaan et al., 2009,
Zhuang et al., 2009). A inibição dessa enzima resulta na diminuição da
quantidade de deoxitimidina trifosfato (dTTP), quebras cromossômicas e morte
celular (Marsh, 2005).
O gene TS (figura7) apresenta um produto de 313 aminoácidos e seu
peso aproximado é de 35,7KD, possui um cDNA com 1,6 Kb de comprimento e
está localizado no braço curto do cromossomo 18 (18p11.32). (Hishida et al.,
2003). O gene possui uma única seqüência repetida em tandem na região
promotora, mais especificamente, na região 5’ não traduzida (5’-UTR),
imediatamente anterior ao códon de iniciação ATG (Kaneda et al., 1987). Tal
35
seqüência tem se mostrado polimórfica consistindo de 28pb repetidos duas
(2R) ou três (3R) vezes (Horie et al., 1995). Existe ainda, uma repetição
invertida a montante da região promotora que parece estar relacionada à
estrutura secundaria do peptídeo (Marsh, 2005).
Figura 6: Esquema do gene TS. Adatado de Gibson et al., 2006.
A variante alélica 3R é mais comum em asiáticos (80%) do que em
caucasianos (60%). E alguns alelos raros contendo quatro (4R), cinco (5R) ou
nove (9R) repetições, também já foram descritos (Marsh et al., 1999, Luo et al.,
2002).
Outros dois polimorfismos também já foram descritos no gene: um
polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na segunda repetição do alelo 3R, G
C. Esse polimorfismo também parece afetar a expressão do gene, pois
provoca a abolição de um sítio de ligação ao fator de transcrição 1 (USF-1)
(Mandola et al., 2003). E uma deleção de 6pb localizada na região 3’ não
traduzida (3’-UTR), 447 pb a jusante do códon de parada. Essa deleção parece
estar relacionada com a diminuição da estabilidade do RNAm de TS e
conseqüente menor disponibilidade do mesmo (Lenz et al., 2002, Mandola et
al., 2004).
Seqüências repetidas na TS são supostamente responsáveis pela auto-
regulação da expressão gênica através da formação de estruturas secundárias
no domínio terminal 5' do seu RNAm, que podem inibir ou acentuar a sua
tradução (Chu e Allegra, 1996; Kawakami et al., 1999). A presença destas
repetições no sítio do promotor pode aumentar a conversão de dUMP a dTMP,
reduzindo a chance de incorporação inadequada de uracila ao DNA (Horie et
al., 1995; Hishida et al., 2003). Teoricamente, isto limitaria o dano ao DNA em
tecidos que se dividem rapidamente, como aqueles envolvidos na
hematopoiese e reduzindo a chance de problemas estruturais nos
36
cromossomos, diminuiria o risco do desenvolvimento leucemia (Skibola, et al.,
2002).
Estudos têm demonstrado que a presença dessas repetições (3R versus
2R) atua como um acentuador da expressão gênica, aumentando
concomitantemente a atividade da enzima (Kawakami et al., 1999, Pullarkat et
al., 2001, Krajinovic et al., 2002). Indivíduos homozigotos 3R/3R, portadores de
câncer colo-retal, apresentaram até 3,6 mais RNAm de TS do que aqueles que
eram homozigotos 2R/2R e 1,7 vezes mais do que os heterozigotos para as
repetições (2R/3R) (Pullarkat et al., 2001).
Danos à enzima TS têm sido associados com quebras cromossômicas e
indução de sítios frágeis (Ayusawa et al., 1986, Zhuang et al., 2009). Pode-se
dizer, portanto, que a enzima é essencial ao metabolismo celular. Por isso, a
TS é também alvo da maioria das drogas quimioterápicas anti-câncer, incluindo
fluoropirimidinas e vários análogos anti-folatos, como o 5-fluor-desoxiuridina (5-
FdUMP), um metabólito ativo do 5-Fluorouracil (5-FU) e MTX (Danenberg,
1977, Costea et al., 2006). O FdUMP tem maior afinidade pelo sítio de ligação
da TS do que o substrato natural dUMP, e ao se ligar à enzima, inibe sua
atividade, bloqueando a síntese de dTMP e conseqüentemente, o fornecimento
de timina (Pinedo e Peters, 1988; Diasio e Harris, 1989; Longley et al., 2003). A
eficácia terapêutica do tratamento de tumores com 5-FU está correlacionada
com o nível de expressão da TS (Takeishi et al., 1989; Hishida et al., 2003,
Zhuang et al., 2009).
Por estar associada à maior disponibilidade da enzima, a presença do
alelo 3R poderia atuar como fator protetor ao desenvolvimento do câncer.
2.6 A enzima Metionina sintase (MS ou MTR)
A enzima metionina sintase (5-metiltetrahidrofolato-homocisteína S-
metiltransferase) é responsável pela remetilação da homocisteína (Hcy) em
metionina utilizando como co-substrato a metilcobalamina (vitamina B12) e o 5-
metiltetrahidrofolato (5-MTHF) que serve como doador de grupamentos metil.
Essa reação produz simultaneamente tetrahidrofolato (THF) que é, então,
37
reduzido novamente pela serinahidroximetil transferase (SHMT) à 5,10
metilenotetrahidrofolato (Li et al., 1996, Nicot et al., 2006).
A atividade da metionina sintase depende da presença de uma segunda
proteína: a metionina sintase redutase (MTRR), que mantém a MS ligada
cobalamina em seu estado ativo totalmente reduzido. Quando a cobalamina
está oxidada, a metionina sintase redutase catalisa a metilação redutiva desta,
utilizando S-adenosilmetionina como um doador de metil, para regenerar
metilcobalamina (Olteanu e Banerjee, 2001).
A metionina sintase é conservada entre diferentes espécies. A forma
humana da enzima apresenta 55% de homologia com a enzima de E. coli e
66% com a proteína de Caenorhabditis elegans (Li et al., 1996). O gene MTR
apresenta um cDNA com 3,8 Kb de comprimento e 33 éxons. Localiza-se na
região telomérica do cromossomo 1 (1p42.3-q43) e codifica uma proteína com
1265 aminoácidos e peso molecular de 140 kDA (Leclerc et al., 1996; Chen, et
al., 1997; Ma et al., 1999; Watkins et al., 2002). A enzima tem três domínios: o
domínio N-terminal, que se liga a substrato na reação, o domínio central,
altamente conservado e onde ocorre a ligação à cobalamina e o domínio C-
terminal que constitui o domínio regulatório da enzima e interage com SAM.
(Chen et al., 1997; Matthews et al., 1998).
A perfeita atividade da enzima é importante para manter os níveis
adequados de metionina e prevenir o acúmulo de homocisteína. Aumento dos
níveis sanguíneos de homocisteína tem sido associado à maior probabilidade
de desenvolver doenças cardiovasculares, defeitos congênitos e síndrome de
Down, além de afetar o desenvolvimento de diversos tipos de câncer (Carmel e
Jacobsen 2001; Watkins et al., 2002). A metionina sintase é também crítica
para o ciclo de metilação, por manter satisfatório, os níveis de S-
adenosilmetionina (SAM) e derivados de metionina. Tais moléculas atuam
como doadora de grupo metil em uma grande variedade de processos
celulares, incluindo a metilação do DNA e RNA e síntese de
neurotransmissores (Watkins et al., 2002).
O polimorfismo mais comum no gene MS é a substituição A2756G, que
acarreta na troca de um ácido aspártico por uma glicina. O ácido aspártico é
um aminoácido fortemente polar e neste caso estaria localizado na α-hélice,
entre os domínios: central (domínio de ligação a cobalamina) e C-terminal
38
(domínio regulatório). Essa região é também responsável por se ligar a
proteínas que reduzem o co-fator. A troca por um aminoácido não polar
(glicina, chamada de quebradora da hélice) leva a perturbações na estrutura
tridimensional e na função da proteína (Leclerc et al., 1996, Chen et al., 1997,
Van der Put et al., 1997).
A freqüência do genótipo GG está em torno de 8% na Holanda, 2% na
Irlanda do Norte e 4% nos Estados Unidos e Canadá. O alelo mutante G varia
entre 15-24% na Europa e 15-18% nos Estados Unidos e Canadá (Watkins et
al., 2002).
Estudos têm relatado um papel controverso dessa transição no
metabolismo celular. Matsuo el al (2001) observou que a mutação A2756G
pode atuar como fator de risco no desenvolvimento de linfomas malignos
enquanto que Skibola et al (2002) sugere que a mutação em questão tem um
efeito protetor ao desenvolvimento de LLA quando os resultados são
analisados simultaneamente com mutações no gene para serina
hidroximetiltransferase (SHMT).
O que se sabe é que, a deficiência severa de vitamina B12 ou de MS
causa hipometioninemia, hiperhomocisteinemia e homocistinúria (Watkins e
Rosenblatt, 1989). Isto pode resultar em acúmulo de 5-metiltetrahidrofolato e
diminuição de derivados intracelulares de folato incluindo, 5,10-
metilenotetrahidrofolato requerido para a biossíntese de timidilato, ocasionando
acúmulo de desoxiuridilato no DNA.
39
33.. OObbjjeettiivvooss
3.1 Geral:
Determinar os polimorfismos MTHFR C677T e A1298C, RFC G80A e
MS A2756G e as repetições em tandem 2R/3R no promotor do gene TS e sua
relação com a etiopatogênese das leucemias agudas (LLA e LMA) da infância,
em pacientes, atendidos no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital
Universitário Oswaldo Cruz - UPE (CEONHPE/HUOC/UPE) e no Instituto
Nacional de Câncer (INCa).
3.2 Específicos:
Determinar as freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos
MTHFR C677T e A1298C, RFC G80A e MS A2756G de pacientes com
LLA, LMA e controles.
Detectar as repetições em tandem 2R e 3R no promotor do gene TS e
determinar as freqüências alélicas e genotípicas de pacientes com LLA,
LMA e controles;
Verificar se existe associação destes polimorfismos com o risco de
desenvolvimento de leucemia aguda;
Estimar o risco conferido por estes polimorfismos caso a relação seja
confirmada.
40
44.. MMaatteerriiaaiiss ee MMééttooddooss
4.1 Tipo de estudo
Estudo exploratório de freqüências alélicas e genotípicas com caso-
controle.
4.2 Local do estudo
O estudo foi realizado no Centro de Oncohematologia Pediátrica do
Hospital Universitário Oswaldo Cruz – CEONHPE/HUOC, da Universidade de
Pernambuco – UPE e no Instituto Nacional do Câncer (INCa).
4.3 População do estudo
Foram incluídos pacientes com diagnóstico de leucemias agudas
atendidos no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital Universitário
Oswaldo Cruz – CEONHPE/HUOC - Recife/PE e no Instituto Nacional de
Câncer (INCa), durante o período de janeiro de 2003 a dezembro de 2009. O
grupo controle foi formado a partir de amostras de DNA obtidas de crianças da
mesma faixa etária oriundas de um laboratório de identificação humana da
cidade do Recife e de crianças sem histórico familiar de câncer, residentes no
estado do Rio de Janeiro.
A população amostral estudada diferiu para cada polimorfismo analisado
como segue na tabela abaixo:
Polimorfismo Casos Controles
CEONHPE INCa Total CEONHPE INCa Total
RFC G80A 118 187 306 93 44 137
MTHFR C677T 182 24 206 111 113 224
MTHFR
A1298C
172 24 196 135 113 248
41
MS A2756G 157 - 157 141 - 141
TS (2R/3R) 176 180 356 208 184 392
4.4 Critérios de Inclusão
Os indivíduos selecionados para a pesquisa estão ou estiveram em
acompanhamento no Centro de Oncohematologia Pediátrico do Hospital
Universitário Oswaldo Cruz e no Instituto Nacional de Câncer (INCa).
Foi considerado caso para inclusão, pacientes com idade igual ou
inferior a dezoito anos ao diagnóstico; diagnosticados para LLA ou LMA,
estabelecido e confirmado através de mielograma, citologia, imunofenotipagem
e características clínicas observadas no atendimento ambulatorial, revisados
pelo hematologista responsável, podendo estar fora de terapia, em tratamento
ou em vias de iniciá-lo.
4.5 Critérios de exclusão
Foram excluídos os pacientes com material biológico inadequado ou
insuficiente ou aqueles que não concordaram em participar do estudo.
4.6 Considerações éticas
Todos os pacientes e/ou responsáveis receberam informações
elucidativas sobre a natureza e objetivos deste estudo, e foram incluídos nele
após consentimento assinado, livre e esclarecido (anexo). Ressalta-se a
adoção de medidas que assegurarão a confidencialidade e a privacidade dos
pacientes, bem como o sigilo e a segurança dos dados obtidos.
Este projeto foi submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa em Seres
Humanos do Hospital Universitário Oswaldo Cruz n° 94 em reunião de 25 de
setembro de 2007.
42
4.7 Metodologias para Identificação dos Polimorfismos
4.7.1 Extração de material biológico
O Material Biológico – DNA de pacientes e controles foi extraído pelo
método Salting Out (Miller et al, 1988) e armazenado a -20 oC no Laboratório
de Biologia Molecular do CEONHPE.
Extração do Material Biológico – Na primeira etapa do processo de
extração, 1mL de solução de lise de membrana plasmática foi adicionada a
300L de sangue total. O material foi homogenizado por inversão do tubo e
incubado a temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente, centrifugou-
se a 13.000 rpm por 4 minutos e em seguida descartou-se o sobrenadante. O
procedimento foi repetido por 2 ou mais vezes, até que o pellet estivesse
translúcido. Na segunda etapa, foi adicionado ao tubo 200L de solução de lise
de núcleo e 50l de dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%, com agitação
vigorosa, incubando durante 10 minutos à temperatura ambiente; após esse
tempo, adicionou-se mais 150L de solução de lise de núcleo. A digestão
protéica foi realizada adicionando-se ao tubo 10L de proteinase K (20mg/mL)
com posterior transferência para banho-maria a 65°C por 2 horas ou a 37°C por
24 horas. Na etapa de precipitação, a amostra foi tratada com 175l de NaCl
5,3M, centrifugada a 13.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido
para outro tubo onde foi adicionado 1.000L de etanol 100%. Foi realizada
homogenização do tubo por inversão e nova centrifugação a 13.000 rpm por 10
minutos. O sobrenadante então, foi descartado e ao pellet de DNA, adicionado
1.000l de etanol 70%, com posterior centrifugação a 13.000 rpm por 5
minutos. Finalmente, descartou-se o sobrenadante e foi adicionado ao pelet
150L de solução de reidratação a base de tris 10mM e 1 mM de EDTA; pH
8,0.
4.7.2 Determinação do polimorfismo RFC G80A
A PCR do DNA genômico foi realizada no volume total de 24L,
contendo 14µL de H2O milliQ autoclavada, 2,5µL de PCR Buffer (10X) [50 mM
kCl, 10 mM Tris-HCl ( pH 8.3)], 1µL de MgCl2 a 50mmol, 2µL de DNTP a
200µmol, 1,5µL de primer forward (5’-AGT GTC ACC TTC GTC CCC TC-3’) e
43
reverse (5’-CTC CCG CGT GAA GTT CTT-3’), 1,3µL de DMSO
(dimetilsufóxido) e 0,2µL da enzima DNA Taq Polimerase (Invitrogen) a 5U/µL,
por amostra. As condições dos ciclos térmicos são: 2 minutos a 94º, seguido
por 37 ciclos de 94º por 30 segundos (para desnaturação da dupla fita de
DNA), 60º por 30 segundos (para o pareamento dos primers), 72º por 45
segundos (para extensão da cadeia nascente de DNA) e uma extensão final de
7 minutos a 72º (Chango, et al., 2000).
Posteriormente, os produtos amplificados foram digeridos pela
endonuclease de restrição HhaI em uma reação contendo todo o produto
amplificado, 2,5 µL do Buffer HhaI e 0,3 µL de HhaI, a 30ºC por 48 horas. O
produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose 3% em
solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com EDTA a 1mmol, corados por
brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à diferença de potencial de 100 v/cm
por 50 minutos e visualizados em transiluminador de ultravioleta (Ultralum).
Os fragmentos resultantes da digestão foram de 125, 62 e 37pb para o
alelo G e de 162 e 62pb para o alelo A. Heterozigotos produzem bandas para
cada alelo.
4.7.3 Determinação do polimorfismo MTHFR A1298C
O polimorfismo A1298C do gene MTHFR foi investigado pela técnica de
PCR alelo-específica. Os componentes e volumes para a amplificação
constaram de 14,2l de água, 3,75l de tampão, 0,75l MgCl2 (50mM), 2,0l
dNTPs (200mol), 2,0l (5pmol) de primers sense e antisense para cada alelo
e 0,3l de taq polimerase, totalizando um volume final de 23,0l em cada
microtubo, acrescentando em média 2l de DNA genômico.
Os primers utilizados foram: (Alelo A) sense 5'- GGA GCT GAC CAG
TGA AGA -3' e anti-sense 5'-TGT GAC CAT TCC GGT TTG -3'; (Alelo C) sense
5'- CTT TGG GGA GCT GAA GGA -3' e anti-sense 5'-AAG ACT TCA AAG ACA
CTT G -3'. A amplificação foi realizada com desnaturação inicial de 2 minutos a
94ºC, seguida de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC e 50
segundos a 72ºC. O produto da amplificação foi separado por eletroforese em
gel de agarose a 4% em uma solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com
EDTA a 1mmol, corados por brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à
44
diferença de potencial de 100 v por trinta minutos e visualizados em
transiluminador de ultravioleta (Ultralum) (Ranjith et al., 2003).
O alelo A apresenta fragmento de 77 pb e o alelo C amplifica um
fragmento de 120 pb.
4.7.4 Determinação do polimorfismo MTHFR C677T
Os componentes e volumes para a amplificação do gene MTHFR,
constarão de 13,5l de água, 2,5l de tampão, 1,0l MgCl2 (50mM), 2,0l
dNTPs (200mol), 1,5l (5pmol) de primers (direto e reverso) e 0,2l de taq
polimerase, totalizando um volume final de 24,2l em cada microtubo, sem
contar com o DNA genômico.
Os primers utilizados para genotipagem do polimorfismo C677T da
MTHFR serão: (forward) 5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3’ e
(reverse) 5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’ O programa de
amplificação consiste em um ciclo de 95ºC por 6 minutos e 40 ciclos de 95ºC
por 1 minuto, 62,5ºC por 1 minuto e 30 segundos, 72ºC por 1 minuto e um ciclo
de 72ºC por 7 minutos. O produto amplificado será digerido pela enzima de
restrição Hinf I (0,3 L da enzima e 1,5 L de seu respectivo tampão na
concentração de 10X), após permanecer em banho-maria a 37ºC por 48 horas
(Frosst et al., 1995).
O produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose
3% em solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com EDTA a 1mmol,
corados por brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à diferença de potencial
de 100 v por 50 minutos e visualizados em transiluminador de ultravioleta
(Ultralum).
O polimorfismo C677T do gene MTHFR apresentou fragmentos, após
digestão enzimática, de 198 pb para o genótipo CC (homozigoto selvagem);
175 pb e 23 pb para o genótipo TT; 198 pb,175 pb e 23 pb para o genótipo CT.
4.7.5 Determinação do polimorfismo para TS
A genotipogem foi feita por PCR. Foram usados 16,8l de água, 2,5l de
tampão, 0,75l de MgCl2 (1,5mM), 0,5l de dNTPs (10mM), 1,25l de DMSO,
1,0l de primers (10pmol) e 0,2l de Taq polimerase, com o microtubo
45
comportando 24l, sem a amostra de DNA. A quantificação de DNA genômico
para a reação foi de 200ng/µl, podendo o volume ter variado para se adequar
ao valor ideal. O par de primers utilizado foi (forward) 5’-CGT GGC TCC TGC
GTT TCC-3’ e (reverse) 5’-GAG CCG GCC ACA GGC AT-3’ em ciclo de 94ºC
por 5 minutos e 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 66ºC por 1 minuto, 72ºC por 2
minutos e um ciclo de 72ºC por 7 minutos. Não foi utilizada enzima de restrição
para identificação das repetições em tandem (Hishida et al., 2003).
Os produtos da amplificação foram separados, eletroforeticamente, em gel
de agarose 3%, usando solução tampão de Tris-Borato a 40 mmol com EDTA a
1mmol, corados por brometo de etídio a 0.5g/ml e visualizados em
transiluminador de ultravioleta (Ultralum).
4.7.6 Determinação do polimorfismo MS A2756G
Para a genotipagem do polimorfismo MS A2756G, foram utilizados os
primers (direto) 5’-TGT TCC CAG CTG TTA GAT GAA AAT C-3’ e (reverse) 5’-
GAT CCAAAG CCT TTT ACA CTC CTC-3’. O programa de amplificação
consiste de um ciclo de 94ºC por 5 minutos, 40 ciclos de 95ºC por 1 minuto,
62ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto e um ciclo de 72ºC por 7 minutos. Os
produtos amplificados foram digeridos pela enzima de restrição HaeIII (0,3 L
da enzima e 1,0 L de seu respectivo tampão na concentração de 10X), depois
de 48 horas em banho-maria a 37ºC (Matsuo et al., 2001).
O produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose
3% em solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com EDTA a 1mmol,
corados por brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à diferença de potencial
de 100 v por 50 minutos e visualizados em transiluminador de ultravioleta
(Ultralum). Os fragmentos resultantes da digestão são de 211 pb para o alelo A
e de 131 e 80 pb para o alelo G. Heterozigotos produzem bandas para cada
alelo.
4.7.7 Processamento e análise dos dados
A análise dos dados foi realizada utilizando o programa BioEstat 5.0. O
estudo foi do tipo caso controle com amostras independentes constando de
dados nominais (genótipo). A influência de cada polimorfismo sobre o risco de
46
leucemias agudas foi estimada pelo teste de Odds Ratio (OR) utilizando
intervalo de confiança de 95% para os parâmetros. O teste de Odds Ratio é um
teste para duas amostras dicotomizadas, mensuradas a nível nominal, o qual
calcula a vantagem (ou desvantagem) de um evento – sucesso – em relação
ao outro. Com esse teste é possível, também, obter a probabilidade de
ocorrência e o intervalo de confiança de 95%. Quando o índice é igual à
unidade não há vantagem para quaisquer dos eventos. Acima de um, é
constatado risco e inferior a um, diz-se que determinado critério “protege” o
desenvolvimento do evento analisado. Para obter o valor da proteção, basta
inverter os valos de “sucesso” e “insucesso”.
A hipótese nula será aceita caso a distribuição genotípica não apresente
diferença significativa ao nível de p = 0,05 nos grupos teste e controle. As
freqüências dos alelos foram estimadas pelo método de contagem gênica.
Através do princípio de Hardy-Weinberg, a estimação das freqüências
genotípicas esperadas pôde ser calculada, determinando-se se há aderência
entre os valores observados e aqueles esperados, com base na determinação
da freqüência gênica. A prevalência dos diferentes genótipos nos pacientes e
controles foi analisada pelo teste do 2 em tabelas de contingência. Este teste
estatístico objetiva verificar se há diferença na distribuição dos genótipos entre
diferentes populações (pacientes e controles). Neste teste é necessário que o
valor de “p” seja inferior ao nível de significância (5%). Isso implica dizer que a
decisão tomada aceita um erro tipo I (rejeitar H0 quando é verdadeira) de no
máximo 5%. Ou seja, o valor de “p” precisa estar abaixo de 0,o5 para que se
possa afirmar, com 95% de certeza, que a distribuição diferencial dos
genótipos entre pacientes e controles é estatisticamente significante.
Todos os cálculos estatísticos foram realizados, nas amostras
provenientes dos ambos os centros de pesquisas, em separado e
conjuntamente.
47
55.. RReessuullttaaddooss
A população amostral analisada foi diferente para cada um dos
polimorfismos estudados. As distribuições alélica de pacientes e controles
mostraram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg .
5.1 Análise dos dados do gene RFC-1
Para o gene RFC-1, foram analisados 306 casos e 137 controles
oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, a saber: 118 e 188
pacientes e 93 e 44 controles atendidos no CEONHPE e no INCa
respectivamente. Dos pacientes, 54% (164, sendo 55 do CEONHPE/HUOC -
Recife/PE e 109 do INCa) eram do sexo masculino e 46% (142, sedo 63 do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 79 do INCa) do sexo feminino (2=1,582;
GL=1; p=0,2085). Dos controles 51% (70, sendo 52 CEONHPE/HUOC -
Recife/PE e 18 do INCa) são do sexo feminino e 49% (67, sendo 41
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 26 do INCa) do sexo masculino (2=0,066;
GL=1; p=0,7977) (Tabela 2). A análise dos grupos de pacientes e controles
quanto ao sexo apresentou 2=0,834; GL=1; p=0,3611. Nesse caso os valores
do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao nível de 5%, tornando
possível afirmar que não há diferença estatisticamente significante, quanto à
distribuição em relação ao sexo, entre pacientes e controles e dentro dos
grupos.
Quanto ao tipo de leucemia dos pacientes analisados para o gene RFC-1,
85% (262, 95 do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 167do INCa) foram
classificados como portadores de leucemia linfóide aguda; 14% (42, 21 do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 21 do INCa) possuía leucemia mielóide aguda
e em 1% dos caso não foi possível estabelecer o diagnóstico específico
(Tabela 2).
48
Tabela 2. Características demográficas dos pacientes e controles analisados para
o gene RFC-1.
Características Casos Controles
CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL
Sexo
Masculino 55 109 164 41 26 67
Feminino 63 79 142 52 18 70
Tipo de leucemia
LLA 95 167 262 - - -
LMA 21 21 42 - - -
Não identificado 2 - 2 - - -
Conjuntamente, as amostras de pacientes e controles do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, apresentaram a distribuição genotípica
condizente com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Contudo, a análise separada
dessas amostras revelou que a população de controles procedente do Instituto
Nacional do Câncer não se adequava ao equilíbrio de Hardy-Weinberg
(2=8.9101; GL=2).
As freqüências obtidas para o alelo mutante (80A) em pacientes,
analisados para o polimorfismo no gene RFC-1, e controles foram 0,52 e 0,44
respectivamente. Porém esse dado não reflete a realidade das duas
populações de forma independente. O alelo mutante foi observado em 43% dos
controles oriundos do CEONHPE e 45% dos controles do INCa e em 58% dos
pacientes atendidos no CEONHPE e 49% dos pacientes do INCa.
Essas discrepâncias são refletidas, diretamente, no teste de qui-quadrado
(de aderência ou heterogeneidade). O teste de X2 (de aderência) das
populações analisadas conjuntamente, para o gene RFC-1, não indicou
diferença estatisticamente significante entre as distribuições dos perfis
genéticos de pacientes e controles (2=0.0852; GL=2; p=4.926). Não sendo,
dessa forma, possível estimar o risco que a presença de determinado alelo
pode conferir para o desenvolvimento da doença.
Todavia, a análise separada das populações revelou que para o grupo
(pacientes e controles) oriundo do CEONHPE existe aderência quanto à
49
distribuição dos genótipos. Ou seja, entre os grupos de pacientes e controles,
há distribuição diferencial do perfil genético (2=8.675; GL=2; p=0.0131).
Esse resultado fornece a base necessária para a estimativa do risco
calculado pelo teste de Odds Ratio (OR) (Tabela 3).
Tabela 3. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e
controles analisados para o gene RFC-1.
Genótipos Variantes
RFC1 G80A
Casos LA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE 118 (100%) 93 (100%)
GG 26 (22,03%) 31 (33,33%) 1 Referência
GA 48 (40,68%) 44 (47,31%) 0,7688 0,3963 – 1,4914 0,5420
AA 44 (37,29%) 18 (19,35%) 0,3431 0,1610 – 0,7312 0,0088*
GA+AA 92 (77,97%) 62 (66,67%) 0,5652 0,3063 – 1,0431 0,0931
INCa 188 (100%) 44 (100%)
GG 54 (28,72%) 18 (40,91%) 1 Referência
GA 84 (44,68%) 12 (27,27%) 0,4286 0,1913 – 0,9600 0,0588
AA 50 (26,6%) 14 (31,82%) 0,8400 0,3784 – 1,8645 0,8209
GA+AA 134 (71,28%) 26 (59,1%) 0,5821 0,2952 – 1,1478 0,1640
CEONHPE + INCa 306 (100%) 137 (100%)
GG 80 (26,14%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 132 (43,14%) 56 (40,87%) 0,6926 0,4314 – 1,1120 0,1609
AA 94 (30,72%) 32 (23,36%) 0,5558 0,3252 – 0,9500 0,0430*
GA+AA 226 (73,86%) 88 (64,23%) 0,6357 0,4125 – 0,9797 0,0515
OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante
O teste de Odds Ratio na população proveniente do CEONHPE revelou
um efeito protetor do genótipo 80AA em relação ao genótipo 80GG da ordem
de 2,9 (OR= 0,34, IC 95%= 0,16 – 0,73; P= 0,0088). A partir desse dado, pode-
se afirmar que indivíduos portadores do genótipo GG têm 2,9 mais chance de
desenvolver a doença do que aqueles que possuem o genótipo AA. Esse efeito
também foi constatado quando analisamos as duas populações (CEONHPE e
INCa), embora da ordem de 1,8 (OR= 0,56; IC 95%= 0,33 – 0,95; p= 0,043).
Contudo, devido à ausência de heterogeneidade na amostra conjunta, não é
50
possível afirmar que o efeito protetor verificado seja estatisticamente
significante.
Quando separados os tipos de leucemia nas populações analisadas para
o gene RFC-1, verificamos que, separadamente, as amostras de pacientes
portadores de LLA se adequavam ao equilíbrio de Hardy-Weinberg. Porém, o
mesmo não foi observado quando analisamos as duas populações
conjuntamente (2=6,0822; GL=2).
O teste de X2 (de aderência) indicou que apenas na amostra proveniente
do CEONHPE havia distribuição diferencial do perfil genético entre os grupos
de pacientes e controles (2=7,525; GL=2; p=0,0232). O teste de Odds Ratio
(tabela 4) indicou que, na população analisada, a presença do alelo 80A no
gene RFC-1 exerce um efeito protetor da ordem de 2 (OR=1,9621; IC
95%=1,0796 – 3,5660; p=0,0372), quando comparado com o genótipo GG e
que indivíduos portadores do genótipo 80AA possuem 2,6 menos chance de
desenvolver a doença do que os portadores do genótipo 80GG (OR= 2,6250;
IC 95%=1,3053 – 5,2789; p= 0,0104).
Tabela 4. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e
pacientes portadores de LLA analisados para o gene RFC-1.
Genótipos Variantes
RFC1 G80A
Casos LLA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE 95 (100%) 137 (100%)
GG 21 (22,11%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 38 (40%) 56 (40,87%) 0,6316 0,3276 - 1,2177 0,2257
AA 36 (37,89%) 32 (23,36%) 0,3810 0,1894 - 0,7661 0,0104*
GA+AA 74 (77,89%) 88 (64,23%) 0,5097 0,2804 - 0,9262 0,0372*
INCa 167 (100%) 137 (100%)
GG 52 (31,14%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 73 (43,71%) 56 (40,87%) 0,8141 0,4826 - 1,3734 0,5236
AA 42 (25,15%) 32 (23,36%) 0,8086 0,4423 - 1,4779 0,5909
GA+AA 115 (68,86%) 88 (64,23%) 0,8121 0,5031 - 1,3109 0,4653
CEONHPE + INCa 262 (100%) 137 (100%)
GG 73 (27,86%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 111 (42,37%) 56 (40,87%) 0,7516 0,4632 - 1,2195 0,3012
51
AA 78 (29,77%) 32 (23,36%) 0,6112 0,3533 - 1,0573 0,1034
GA+AA 189 (72,14%) 88 (64,23%) 0,6937 0,4460 - 1,0788 0,1304
OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante
Para os portadores de LMA o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado
tanto nas amostras analisadas conjunta como separadamente. O X2 (de
aderência) indicou que, diferentemente da população de portadores de LLA,
havia diferença na distribuição de genótipos nas amostras: oriunda do INCa e
na amostra resultante na junção dos dois centros. Ou seja, apenas na
população proveniente do CEONHPE o perfil genético não era diferente, entre
pacientes e controles.
O teste de Odds Ratio confirmou a tendência que foi encontrada quando
analisamos ambos os tipos de leucemia conjuntamente. Isto é, a presença do
alelo 80A confere forte proteção ao indivíduo que o possui (Tabela 5). A análise
da amostra de pacientes de LMA, proveniente do INCa, mostrou que indivíduos
portadores do genótipo 80GG possuem 6 vezes mais chance de desenvolver a
doença do que aqueles cujo genótipo é 80AA (OR=6,125; IC 95%=1,2215 –
30,7122; p=0,036). Quando comparados com portadores do alelo 80A, (80GA +
80AA), indivíduos 80GG apresentam aproximadamente 5 vezes mais chance
de desenvolver leucemia mielóide aguda (OR=5,2898; IC 95%=1,1823 –
23,6680; p=0,032).
A análise da amostra de pacientes de LMA, proveniente de ambos os
centros, revelou ainda que também os indivíduos heterozigotos (80GA)
possuem o efeito protetor conferido pela presença do alelo 80A. Os resultados
indicaram que indivíduos 80GG apresentam 3,1, 3,8 e 3,3 mais chance de
desenvolver a doença do que aqueles com genótipo 80GA (OR=3,0625; IC
95%=1,1437 – 8,2007; p=0,0376), 80AA (OR=3,8281; IC 95%=1,3445 –
10,8995; p=0,0178) e portadores do alelo 80A (GA + AA) (OR=3,3409; IC
95%=1,3152 - 8,4864; p=0,0143), respectivamente.
52
Tabela 5. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e
pacientes portadores de LMA analisados para o gene RFC-1.
Genótipos Variantes
RFC1 G80A
Casos LMA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE 21 (100%) 137 (100%)
GG 4 (19,05%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 10 (47,62%) 56 (40,87%) 0,4571 0,1348 - 1,5504 0,3205
AA 7 (33,33%) 32 (23,36%) 0,3732 0,1010 - 1,3786 0,2323
GA+AA 17 (80,95%) 88 (64,23%) 0,4226 0,1346 - 1,3264 0,2066
INCa 21 (100%) 137 (100%)
GG 2 (9,52%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 11(52,38%) 56 (40,87%) 0,2078 0,0439 - 0,9836 0,0642
AA 8 (38,1%) 32 (23,36%) 0,1633 0,0326 - 0,8187 0,0360*
GA+AA 19 (90,48%) 88 (64,23%) 0,1890 0,0423 - 0,8458 0,0320*
CEONHPE + INCa 42 (100%) 137 (100%)
GG 6 (14,29%) 49 (35,77%) 1 Referência
GA 21 (50%) 56 (40,87%) 0,3265 0,1219 -0,8744 0,0376*
AA 15 (35,71%) 32 (23,36%) 0,2612 0,0917 - 0,7438 0,0178*
GA+AA 36 (85,71%) 88 (64,23%) 0,2993 0,1178 - 0,7603 0,0143*
OR – Odds Ratio IC – Intervalo de confiança * – valor significante
5.2 Análise dos dados do gene MTHFR
Para o gene MTHFR, a população amostral estudada também foi
diferente para cada um dos polimorfismos analisados. Em relação ao
polimorfismo MTHFR C677T foram analisados 206 casos e 224 controles
oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, destes: 182 e 24 pacientes
e 111 e 113 controles atendidos no CEONHPE e no INCa respectivamente.
Quanto ao sexo apenas o grupo de pacientes e controles procedentes do
CEONHPE dispunham dessa informação. Nos pacientes observamos 51% (93)
do sexo feminino e 49% (89) do sexo masculino e entre os controles 55% (61)
do sexo feminino e 45% (50) do sexo masculino (Tabela 6). A análise dos
grupos de pacientes e controles quanto ao sexo mostrou 2=0,411; GL=1;
p=0,5214. Como os valores do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao
53
nível de 5%, pode-se afirmar que não há diferença estatisticamente
significante, quanto à distribuição em relação ao sexo, entre pacientes e
controles no grupo analisado.
Quanto ao critério tipo de leucemia, nos pacientes analisados para o
polimorfismo C677T do gene MTHFR, 79% (162, 144 do CEONHPE/HUOC -
Recife/PE e 18 do INCa) possuía Leucemia linfóide aguda; 19% (39, 33 do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 6 do INCa) foram classificados como
portadores de leucemia mielóide aguda e em 2% (5) dos casos não foi possível
estabelecer o diagnóstico específico (Tabela 6).
Tabela 6. Características demográficas dos pacientes e controles analisados para
polimorfismo MTHFR C677T.
Características Casos Controles
CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL
Sexo
Masculino 89 - - 50 - -
Feminino 93 - - 61 - -
Tipo de leucemia
LLA 144 18 162 - - -
LMA 33 6 39 - - -
Não identificado 5 - 5 - - -
A distribuição genotípica dos pacientes e controles analisados para o
polimorfismo MTHFR C677T está resumida na tabela 8. Na amostra conjunta
(CEONHPE e INCa) foi observado, entre os casos, 111 (53,88%) com
genótipo CC, 82 (39,81%) com genótipo CT e 13 (6,31%) com genótipo TT.
Entre os controles os números foram: 95 (42,41%) 677CC, 108 (48,21%)
677CT e 21 (9,38%) 677TT. A distribuição dos genótipos, nos grupos de
pacientes e controles, provenientes de ambos os centros de pesquisa,
apresentaram-se de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. As
freqüências obtidas para o alelo mutante (677T) em pacientes e controles
foram 0,26 e 0,33 respectivamente.
54
Tabela 7. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e
controles analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.
Genótipos Variantes
MTHFR C677T
Casos LA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE 118 (100%) 93 (100%)
CC 104 (57,14%) 42 (37,84%) 1 Referência
CT 67 (36,81%) 59 (53,15%) 2,1805 1,3214 – 3,5981 0,0032*
TT 11 (6,05%) 10 (9,01%) 2,2511 0,8897 – 5,6959 0,1356
CT+TT 78 (42,86%) 69 (62,16%) 2,1905 1,3513 – 3,5508 0,0020*
INCa 188 (100%) 44 (100%)
CC 7 (29,17%) 53 (46,9%) 1 Referência
CT 15 (62,5%) 49 (43,36%) 0,4314 0,1623 – 1,1469 0,1390
TT 2 (8,33%) 11 (9,74%) 0,7264 0,1327 – 3,9779 0,9238
CT+TT 17 (70,83%) 60 (53,1%) 0,4661 0,1794 – 1,2109 0,1726
CEONHPE + INCa 306 (100%) 137 (100%)
CC 111 (53,88%) 95 (42,41%) 1 Referência
CT 82 (39,81%) 108 (48,21%) 1,5389 1,0348 – 2,2885 0,0421*
TT 13 (6,31%) 21 (9,38%) 1,8874 0,8970 – 3,9717 0,1320
CT+TT 95 (46,12%) 129 (57,59%) 1,5866 1,0838 – 2,3227 0,0225*
OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante
O qui-quadrado de heterogeneidade revelou que apenas na população
oriunda do CEONHPE, a distribuição dos genótipos ocorreu de forma diferente
entre pacientes e controles (2=10,823; GL=2; p=0,0058), Nessa amostra, o
teste de Odds Ratio (Tabela 7) indicou aumento do risco de desenvolvimento
da doença entre indivíduos portadores do genótipo 677CT e entre aqueles
portadores do alelo 677T, da ordem de 2,2 (p= 0,0032 e p=0,002,
respectivamente), quando comparados com indivíduos 677CC. Esse risco
também foi verificado quando procedemos a Análise conjunta dos dados (OR=
1,5389; p= 0,0421 e OR= 1,5866; p= 0,0225, para indivíduos 677CT e
portadores do alelo 677T, respectivamente), porém, da mesma forma como
quando analisamos o polimorfismo RFC-1, esse resultado conjunto não
encontra apoio estatístico devido a falta de aderência entre a distribuição
diferencial de genótipos no grupo de pacientes e controles.
55
A análise, separada, dos tipos de leucemia mostrou que as amostras de
pacientes portadores de LLA, oriundas de ambos os centros, se adequavam ao
equilíbrio de Hardy-Weinberg (conjunta e separadamente). O teste de qui-
quadrado (de aderência) indicou que apenas na amostra proveniente do INCa,
não havia distribuição diferencial do perfil genético entre os grupos de
pacientes e controles (2= 0,501; GL=2; p= 0,7786). Pelo teste de Odds Ratio
(Tabela 8) foi possível observar que, o risco estimado, nas amostras
analisadas, foi estatisticamente significante apenas quando comparamos o
genótipo selvagem (677CC) com o heterozigoto (677CT) e com a presença do
alelo mutante (677CT + 677TT). Na amostra oriunda do CEONHPE esse risco
foi da ordem de 1,8 para indivíduos heterozigotos (OR=1,7589; IC=1,1306 -
2,7364; p= 0,0163) e portadores do alelo mutante (OR=1,7589; IC=1,1306 –
2,7364; p= 0,0163). Na analise da junção das amostras o risco foi da ordem de
1,6 para indivíduos heterozigotos (OR=1,606; IC=1,0506 – 2,4552; p=0,037) e
1,7 para portadores do alelo mutante (OR=1,6555; IC=1,1015 – 2,4882;
p=0,0199).
Tabela 8. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e
pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.
Genótipos Variantes
MTHFR C677T
Casos LLA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE 144 (100%) 224 (100%)
CC 82 (56,94%) 95 (42,41%) 1 Referência
CT 53 (36,81%) 108 (48,21%) 1,7589 1,1306 - 2,7364 0,0163*
TT 9 (6,25%) 21 (9,38%) 2,0140 0,8739 - 4,6415 0,1423
CT+TT 62 (43,06%) 129 (57,59%) 1,7959 1,1763 - 2,7419 0,0089*
INCa 18 (100%) 224 (100%)
CC 7 (38,88%) 95 (42,41%) 1 Referência
CT 10 (55,56%) 108 (48,21%) 0,7958 0,2914 - 2,1729 0,8467
TT 1 (5,56%) 21 (9,38%) 1,5474 0,1806 - 13,2570 0,9385
CT+TT 11 (61,11%) 129 (57,59%) 0,8641 0,3230 - 2,3116 0,9657
CEONHPE + INCa 162 (100%) 224 (100%)
CC 89 (54,94%) 95 (42,41%) 1 Referência
CT 63 (38,89%) 108 (48,21%) 1,606 1,0506 - 2,4552 0,037*
56
TT 10 (6,17%) 21 (9,38%) 1,9674 0,8781 - 4,4077 0,1415
CT+TT 73 (45,06%) 129 (57,59%) 1,6555 1,1015 - 2,4882 0,0199*
OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante
Para os portadores de LMA o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado
tanto nas amostras analisadas conjunta como separadamente. Porém, o X2 (de
aderência) não indicou diferença na distribuição de genótipos em nenhuma das
amostras analisadas. Dessa forma, não foi possível estimar o risco que a
presença de determinado alelo pode conferir para o desenvolvimento da
doença.
Em relação ao polimorfismo MTHFR A1298C foram analisados 194 casos
e 248 controles oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e do Instituto
Nacional do Câncer, destes: 170 e 24 pacientes e 135 e 113 controles
provindos do CEONHPE e do INCa respectivamente.
Quanto ao sexo apenas as amostras (pacientes e controles) procedentes
do CEONHPE dispunham da informação. Nos pacientes observamos 53% (90)
do sexo feminino e 47% (80) do sexo masculino e entre os controles 54% (73)
do sexo feminino e 46% (62) do sexo masculino (Tabela 9). A análise dos
grupos de pacientes e controles quanto ao sexo mostrou 2=0,039; GL=1;
p=0,8438. Os valores do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao nível
de 5%, portanto, podemos afirmar que não há diferença estatisticamente
significante quanto à distribuição em relação entre pacientes e controles nesta
amostra.
Quanto ao critério tipo de leucemia, nos pacientes analisados para o
polimorfismo MTHFR A1298C, 79% (154, 136 do CEONHPE/HUOC -
Recife/PE e 18 do INCa) possuía Leucemia linfóide aguda; 19% (37, 31 do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 6 do INCa) foram classificados como
portadores de leucemia mielóide aguda e em 2% (3) dos caso não foi possível
estabelecer o diagnóstico específico (Tabela 9).
57
Tabela 9. Características demográficas dos pacientes e controles analisados
para polimorfismo MTHFR A1298C.
Características Casos Controles
CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL
Sexo
Masculino 80 - - 62 - -
Feminino 90 - - 73 - -
Tipo de leucemia
LLA 136 18 154 - - -
LMA 31 6 37 - - -
Não identificado 3 - 3 - - -
Os resultados representativos estão ilustrados na tabela 10. Entre os 194
pacientes e 248 controles analisados a freqüência do alelo mutante para o
polimorfismo MTHFR A1298C foi 38% e 24% para pacientes e controles,
respectivamente. A freqüência dos genótipos 1298AA, 1298AC e 1289CC foi
41,75%, 40,21%, 18,04% para o grupo de pacientes e 59,27%, 33,06%, 7,67%
para o grupo de controles, respectivamente. Ambos os grupos se adequaram
ao equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Tabela 10. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e
controles analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.
Genótipos Variantes
MTHFR A1298C
Casos LA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE
AA 69 (40,59%) 81 (60%) 1 Referência
AC 67 (39,41%) 46 (34,07%) 0,5849 0,3569 – 0,9584 0,0443*
CC 34 (20%) 8 (5,93%) 0,2004 0,0870 – 0,4617 0,0001*
AC+CC 101 (59,41%) 54 (40%) 0,4554 0,2873 – 0,7220 0,0011*
INCa
AA 12 (50%) 66 (58,41%) 1 Referência
AC 11 (45,83%) 36 (31,86%) 0,5950 0,2387 – 1,4833 0,3775
58
CC 1 (4,17%) 11 (9,73%) 2,0000 0,2359 – 16,9575 0,8369
AC+CC 12 (50%) 47 (41,59%) 0,7121 0,2944 – 1,7225 0,5972
CEONHPE + INCa
AA 81 (41,75%) 147 (59,27%) 1 Referência
AC 78 (40,21%) 82 (33,06%) 0,5793 0,3837 – 0,8745 0,0123*
CC 35 (18,04%) 19 (7,67%) 0,2991 0,1608 – 0,5566 0,0002*
AC+CC 113 (58,25%) 101 (40,73%) 0,4925 0,3363 – 0,7213 0,0004*
OR – Odds Ratio IC – Intervalo de confiança * – valor significante
Segundo o qui-quadrado de heterogeneidade a distribuição dos genótipos
ocorreu de forma diferente entre as populações de pacientes e controles
(2=17,612; GL=2; p=0,0001) quando analisamos as amostras provenientes do
CEONHPE e do INCa conjuntamente. Esse dado forneceu a evidencia
necessária para estimativa do risco, pelo teste de Odds Ratio.
O teste de Odds Ratio indicou diminuição do risco de desenvolvimento de
leucemia aguda para heterozigotos (1298AC) e homozigotos mutantes
(1298CC), assim como para portadores do alelo mutante (1298AC + 1298CC),
da ordem de 1,7, 3,3 e 2,0, respectivamente (p= 0,0123; p=0,0002; p=0,0004).
Ou seja, indivíduos portadores do genótipo 1298AA têm 1,7 mais chance de
desenvolver a doença do que aquele cujo genótipo é 1298AC ; 3,3 mais
chance do que aqueles cujo genótipo é 1298CC e 2 vezes mais chance do que
os portadores do alelo 1298C em geral.
A mesma tendência de risco foi observada na população do CEONHPE,
com o risco estimado sendo idêntico para indivíduos 1298AA, em relação aos
que possuem o genótipo 1298AC e portadores do alelo 1298C. A diferença
observada foi apenas quanto ao risco apresentado pelos indivíduos 1298AA
em relação aos 1298CC, nos quais o risco estimado para o desenvolvimento
da doença foi aproximadamente 5 vezes maior (OR=4,9891; IC 95%= 2,17 –
11,49; p=0,0001). Isoladamente, a população do INCa não apresentou
distribuição diferencial entre os genótipos de pacientes e controles. Não
sendo, desta forma, estatisticamente significante a estimativa do risco.
Quanto aos diferentes tipos de leucemia as análises revelaram que as
amostras de pacientes portadores de LLA, conjunta e separadamente, oriundas
59
de ambos os centros, se adequavam ao equilíbrio de Hardy-Weinberg. O teste
de qui-quadrado (de aderência) indicou que apenas na amostra proveniente do
INCa, não foi observada distribuição diferencial do perfil genético entre os
grupos de pacientes e controles (2=3,032; GL=2; p= 0,2196). O teste de Odds
Ratio (Tabela 11) nas outras duas amostras mostrou que, como observado na
análise conjunta de ambos os tipos de leucemia, houve a diminuição do risco
de desenvolvimento de leucemia linfóide aguda para indivíduos heterozigotos
(1298AC) e homozigotos mutantes (1298CC), assim como para portadores do
alelo mutante (1298AC + 1298CC), quando comparados com portadores do
genótipo selvagem (1298AA). Esse efeito protetor, na amostra oriunda do
CEONHPE, foi da ordem de 1,7 (OR= 1,7275; IC 95%= 1,0862 – 2,7475;
p=0,0278), 3,9 (OR=3,9388; IC 95%=2,0361 – 7,6193; p=0,0000) e 2,1
(OR=2,1435; IC 95%=1,4 – 3,2818; p=0,0006), para indivíduos heterozigotos,
homozigotos mutantes e portadores do alelo mutante, respectivamente. Na
amostra conjunta, o efeito protetor estimado, foi da ordem de 1,7 (OR= 1,7367;
IC 95%= 1,1167 – 2,7007; p=0,0189), 3,3 (OR=3,3849; IC 95%=1,7629 –
6,4990; p=0,0003) e 2 (OR=2,0467; IC 95%=1,3603 – 3,0794; p=0,0008) para
1298AC, 1298CC e portadores do alelo mutante, respectivamente.
Tabela 11. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e
pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.
Genótipos Variantes
MTHFR A1298C
Casos LA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE 136 (100%) 248 (100%)
AA 55 (40,44%) 147 (59,27%) 1 Referência
AC 53 (38,97%) 82 (33,06%) 0,5789 0,364 - 0,9207 0,0278*
CC 28 (20,59%) 19 (7,67%) 0,2539 0,1312 - 0,4911 0,0000*
AC+CC 81 (59,56%) 101 (40,73%) 0,4665 0,3047 - 0,7143 0,0006*
INCa 18 (100%) 248 (100%)
AA 9 (50%) 147 (59,27%) 1 Referência
AC 9 (50%) 82 (33,06%) 0,5578 0,213 - 1,4607 0,343
CC 0 (%) 19 (7,67%) - - -
AC+CC 9 (50%) 101 (40,73%) 0,6871 0,2636 - 1,7909 0,6005
CEONHPE + INCa 154 (100%) 248 (100%)
60
AA 64 (41,56%) 147 (59,27%) 1 Referência
AC 62 (40,26%) 82 (33,06%) 0,5758 0,3703 - 0,8955 0,0189*
CC 28 (18,18%) 19 (7,67%) 0,2954 0,1539 - 0,5672 0,0003*
AC+CC 90 (58,44%) 101 (40,73%) 0,4886 0,3247 - 0,7351 0,0008*
OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante
Nos portadores de LMA o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado
tanto nas amostras analisadas conjunta como separadamente. Porém, o teste
de qui-quadrado de heterogeneidade não indicou diferença na distribuição dos
perfis genéticos em nenhuma das amostras analisadas. Sendo assim, não foi
possível estimar o risco que a presença de determinado alelo pode conferir
para o desenvolvimento da doença.
5.3 Análise dos dados do gene TS
Para o gene TS, a população amostral constituiu de 351 casos e 390
controles oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, destes: 176 e 175
pacientes e 208 e 182 controles atendidos no CEONHPE e no INCa
respectivamente.
Dos pacientes, 53% (187, dos quais 88 eram provenientes do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 99 do INCa) são do sexo masculino e 47%
(164, sedo 88 do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 76 do INCa) do sexo
feminino (2=1,522; GL=1; p=0,2173). Dos controles 52% (201, sendo 110
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 91 do INCa) foram do sexo feminino e 48%
(184, sendo 98 CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 86 do INCa) do sexo
masculino (2=0,083; GL=1; p=0,7732) (Tabela 12). A análise dos grupos de
pacientes e controles quanto ao sexo apresentou 2=2,209; GL=1; p=0,1372.
Os valores do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao nível de 5%,
tornando possível afirmar que não há diferença estatisticamente significante,
quanto à distribuição em relação ao sexo, entre pacientes e controles e dentro
dos grupos.
Quanto ao tipo de leucemia, 80% (281, 140 do CEONHPE/HUOC -
Recife/PE e 141 do INCa) possuía Leucemia linfóide aguda; 19% (65, 31 do
CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 34 do INCa) foram classificados como
61
portadores de leucemia mielóide aguda e em 1% (5) dos caso não foi possível
estabelecer o diagnóstico específico.
Tabela 12. Características demográficas dos pacientes e controles analisados
para as repetições em tandem no promotor do gene TS.
Características Casos Controles
CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL
Sexo
Masculino 99 88 187 98 86 184
Feminino 88 76 164 110 91 201
Tipo de leucemia
LLA 140 141 281 - - -
LMA 31 34 65 - - -
Não identificado 5 - 5 - - -
As freqüências genotípicas de pacientes e controles analisados para as
repetições em tandem no promotor do gene TS estão dispostas na tabela 13.
Todos os grupos estavam de acordo com o equilíbrio de Hardy-weinberg. As
freqüências obtidas para o alelo 2R e 3R em pacientes foi 0,43 e 0,57, e 0,42 e
0,58 no grupo controle, respectivamente. O qui-quadrado de heterogeneidade
não revelou diferença estatisticamente significante na distribuição do perfil
genético entre pacientes e controles. O que já era esperado, devido à
proximidade das freqüências alélicas em ambos os grupos. Sendo assim, a
estimativa do risco não possui embasamento estatístico.
Tabela 13. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e
controles analisados para as repetições em tandem no promotor do gene TS.
Genótipos Variantes
TS (2R/3R)
Casos LA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE
3R3R 56 (31,82%) 74 (35,58%) 1 Referência
2R3R 89 (50,57%) 96 (46,15%) 0,8163 0,5198 – 1,2819 0,4430
2R2R 31 (17,61%) 38 (18,27%) 0,9276 0,5153 – 1,6698 0,9201
62
2R3R + 2R2R 120 (68,18%) 134 (64,42%) 0,8450 0,5521 – 1,2934 0,5046
INCa
3R3R 58 (33,14%) 56 (30,77%) 1 Referência
2R3R 86 (49,14%) 98 (53,85%) 1,1802 0,7394 – 1,8839 0,5650
2R2R 31 (17,72%) 28 (15,38%) 0,9355 0,4986 – 1,7552 0,9623
2R3R + 2R2R 117 (66,86%) 126 (69,23%) 1,1154 0,7147 – 1,7408 0,7134
CEONHPE + INCa
3R3R 114 (32,48%) 130 (33,33%) 1 Referência
2R3R 175 (49,86%) 194 (49,74%) 0,9721 0,7031 – 1,3442 0,9296
2R2R 62 (17,66%) 66 (16,93%) 0,9335 0,6083 – 1,4325 0,8371
2R3R + 2R2R 237 (67,52%) 260 (66,66%) 0,9620 0,7077 – 1,3077 0,8659
OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante
Quanto aos dois tipos de leucemia (LLA e LMA) as amostras de ambos os
centros estavam condizentes com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Porém, da
mesma forma como aconteceu na análise conjunta, o teste de qui-quadrado de
heterogeneidade não indicou diferença na distribuição dos perfis genéticos em
nenhuma das amostras analisadas (Tabela 14). Não sendo, dessa forma,
possível estimar o risco que a presença de determinado alelo poderia conferir
para o desenvolvimento da doença.
Tabela 14. Qui-quadrado de heterogeneidade dos casos analisados para as
repetições em tandem no promotor do gene TS.
Tipo de Leucemia Procedência Qui-quadrado de
heterogeneidade GL p
LLA
CEONHPE 0,098 2 0,9522
INCa 0,11 2 0,9463
CEONHPE + INCa 0,163 2 0,9219
LMA
CEONHPE 0,12 2 0,9418
INCa 0,433 2 0,8052
CEONHPE + INCa 0,292 2 0,864
63
5.4 Análise dos dados do gene MS
Para o gene MS a população amostral foi constituída apenas com
indivíduos provenientes do CEONHPE/HUOC - Recife/PE. No total analisamos
157 pacientes e 141 controles, para o polimorfismo MS A2756G. Dos 157
pacientes, 49,7% (78) foram do sexo masculino e 50,3% (79) do sexo feminino;
dos 141 controles, 47% (66) foram do sexo masculino e 53% (75) do sexo
feminino (2=0,574; GL=1; p=0,4485) (Tabela 15). Pelo valor do qui-quadrado
ter sido inferior ao valor crítico ao nível de 5%, é possível afirmar que não há
diferença estatisticamente significante, quanto à distribuição sexual, entre
pacientes e controles na população analisada.
Quando ao tipo de leucemia, 80% (126) dos casos eram portadores de
LLA (leucemia linfóide aguda), 18% (28) LMA (leucemia mielóide aguda) e em
2% (3) dos casos, não foi possível classificar (Tabela 15).
Tabela 15. Características demográficas dos
pacientes e controles analisados para o
polimorfismo MS A2756G.
Características Casos Controles
Sexo
Masculino 78 66
Feminino 79 75
Tipo de leucemia
LLA 126 -
LMA 28 -
Não identificado 3 -
As freqüências genotípicas de pacientes e controles o polimorfismo MS
A2756G estão dispostas na tabela 16. Ambos os grupos estavam de acordo
com o equilíbrio de Hardy-weinberg. As freqüências obtidas para o alelo 2756G
foi 25% e 20% em pacientes e controles, respectivamente. Assim como
observado na Análise das repetições em tandem no promotor do gene TS, o
qui-quadrado de heterogeneidade não revelou diferença estatisticamente
significante na distribuição do perfil genético entre pacientes e controles
64
(2=2,444; GL=2; p=0,2946). Essa falta de aderência quanto à
heterogeneidade entre as distribuições do perfil genético, impossibilita a
estimativa do risco de desenvolvimento da doença.
Tabela 16. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos
pacientes e controles analisados para o polimorfismo MS A2756G.
Genótipos Variantes
MS A2756G
Casos LA
n (%)
Controles
n (%)
OR IC 95% p
CEONHPE
AA 87 (54,41%) 90 (63,83%) 1 Referência
AG 61 (38,85%) 46 (32,62%) 0,729 0,4497 – 1,1816 0,2453
GG 09 (5,74%) 05 (3,55%) 0,537 0,1731 – 1,6662 0,4165
AG + GG 70 (44,59%) 51 (36,17%) 0,7043 0,442 – 1,1222 0,1742
OR – Odds Ratio IC – Intervalo de confiança
Quanto aos dois tipos de leucemia (LLA e LMA) a amostra se adequou ao
equilíbrio de Hardy-Weinberg. Entretanto, o teste de qui-quadrado de
heterogeneidade não indicou diferença na distribuição dos perfis. Dessa forma,
não foi possível estimar o risco que a presença de determinado alelo poderia
conferir para o desenvolvimento da doença.
65
66.. DDiissccuussssããoo
No presente estudo, foi analisada a associação entre a suscetibilidade
de desenvolvimento de leucemias agudas e polimorfismos em genes
envolvidos no metabolismo do ácido fólico.
Em relação ao polimorfismo RFC-1G80A, o presente estudo indicou que
os indivíduos portadores do genótipo 80GG que possuem 2,9 mais chance de
desenvolver leucemia do que aqueles com genótipo 80AA. Quando a análise
foi feita apenas com portadores de leucemia linfóide aguda (LLA) encontramos
que a presença do alelo 80A no gene RFC-1 exerce um efeito protetor da
ordem de 2 (OR=1,9621; IC 95%=1,0796 – 3,5660; p=0,0372), quando
comparado com o genótipo 80GG e que indivíduos portadores do genótipo
80AA possuem 2,6 menos chance de desenvolver a doença do que os
portadores do genótipo 80GG (OR= 2,6250; IC 95%=1,3053 – 5,2789; p=
0,0104). O efeito protetor do alelo 80A também foi verificado na população de
pacientes portadores de LMA. Segundo nossos dados o risco conferido pela
presença do genótipo 80GG pode chegar a 6 vezes mais chance de
desenvolver a doença do que aqueles cujo genótipo é 80AA. Na análise dos
portadores de LMA o risco conferido pela presença do genótipo 80GG pode ser
observado quando comparado a quaisquer dos outros genótipos.
Diferentemente, Jonge et al., (2009) relatou que o genótipo 80AA
confere 2 vezes mais chance de desenvolver leucemia linfóide aguda, quando
comparado com o genótipo 80GG. Da mesma forma a presença do alelo 80A
(80GA + 80AA) também exerce esse risco, só que da ordem de 1.5.
A incompatibilidade entre os nossos resultados e os de Jonge et al.,
(2009) pode ser explicada pelo tamanho das amostras e/ou pela variabilidade
étnica entre as populações analisadas. O número de controles utilizados no
presente estudo foi significativamente menor nas análises de ambos os tipos
de leucemia e LLA (separadamente). Todavia, na análise de pacientes com
LMA esse problema foi superado devido à pequena quantidade de casos.
Quanto à diversidade étnica, o estudo citado foi realizado no Oeste da Europa,
onde a freqüência do alelo mutante (RFC 80A) está em torno de 36% a 41%
(Chango et al., 2000 e Relton et al., 2004). Na nossa população, contudo, as
66
freqüências encontradas foram: 58%, 49% e 52% nas amostras oriundas do
CEONHPE, INCa e ambos os centros, respectivamente.
Em relação ao polimorfismo MTHFR C677T, contrariando os dados
encontrados na literatura (Skibola et al., 1999, Gemmati et al., 2004, Da Costa
Ramos et al., 2006, Jonge et al., 2009), o presente estudo verificou que o
genótipo 677CT e a presença do alelo 677T (677CT + 677TT) no gene
MTHFR, conferiram aumento do risco de desenvolvimento de leucemia na
amostra oriunda do Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital
Universitário Oswaldo Cruz – CEONHPE/HUOC. Apesar de o mesmo não ter
sido encontrado na amostra proveniente do Instituto Nacional do Câncer
(INCa), a analise conjunta indicou a presença de um significativo aumento do
risco. O risco estimado foi da ordem de 2,2 tanto para indivíduos heterozigotos
como para portadores do alelo 677T no CEONHPE. Já a análise conjunta
detectou risco da ordem de 1,5 e 1,6 em heterozigotos e portadores do alelo
mutante, respectivamente. Quando separamos os tipos de leucemia, apenas
nos pacientes portadores de LLA foi possível a verificação do risco, porque na
população de pacientes com LMA não houve diferença estatística na
distribuição dos perfis genéticos. A tendência ao risco conferida pela presença
do alelo mutante foi novamente confirmada entre pacientes com LLA. No
amostra do CEONHPE o risco estimado foi da ordem de 1,8 para heterozigotos
e portadores do alelo mutante e na análise conjunta de 1,6 e 1,7 em indivíduos
677CT e portadores do alelo 677T, respectivamente.
Corroborando os nossos resultados, Kim et al., (2009), analisando 110
indivíduos adultos portadores de LLA, na Coréia, observaram que o genótipo
677TT aumentava em 1,7 a chance do desenvolvimento da doença (OR = 1,77;
IC 95%= 1,02–3,09; p= 0,044). Nesse mesmo estudo, Kim et al., (2009)
verificaram que a presença do polimorfismo 677 CT conferiu tendência ao
risco de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide
crônica e síndrome mielodisplásica.
A aparente inconsistência dos nossos resultados e dos estudos
anteriores, em diferentes populações, pode ser devida, entre outras causas, a
diferença nas freqüências genotípicas do polimorfismo, as diferenças étnicas
entre as populações analisadas e ainda, a ausência de informações sobre a
ingestão de folato. Uma vez que a população brasileira é formada por diversos
67
grupos étnicos e que assim como fatores genéticos, a ingestão diária e os
níveis plasmáticos de folatos estão direta e indiretamente relacionados ao
surgimento câncer.
Apesar da contribuição da variante polimórfica MTHFR 1298CC na
redução da função enzimática não ser totalmente esclarecida, uma vez que
estudos observaram resultados contraditórios (Weisberg et al,. 1998 e
Yamada et al,. 2001), observamos uma significante diminuição do risco de
desenvolvimento de leucemia em indivíduos MTHFR 1298CC. Na análise feita
com pacientes LA, apenas na amostra proveniente do INCa não foi possível a
estimativa do risco. O resultado dessa análise revelou que, no CEONHPE, o
efeito protetor em indivíduos heterozigotos (1298AC) e homozigotos mutantes
(1298CC), assim como para portadores do alelo mutante (1298AC + 1298CC),
foi da ordem de 1,7, 5,0 e 2,0, respectivamente. O mesmo foi observado
quando da análise de ambos os centros conjuntamente, diferindo apenas
quanto ao risco apresentado pelos indivíduos 1298AA em relação aos 1298CC,
nos quais o risco estimado para o desenvolvimento da doença foi
aproximadamente 5 vezes maior (OR=4,9891; IC 95%= 2,17 – 11,49;
p=0,0001). Quando separamos os tipos de leucemia, a mesma tendência foi
observada nas amostras analisadas para LLA, enquanto no grupo de LMA não
apresentou diferença na distribuição dos perfis genéticos. Na sub-amostra de
LLA, oriunda do CEONHPE, o efeito protetor foi da ordem de 1,7 (OR= 1,7275;
IC 95%= 1,0862 – 2,7475; p=0,0278), 3,9 (OR=3,9388; IC 95%=2,0361 –
7,6193; p=0,0000) e 2,1 (OR=2,1435; IC 95%=1,4 – 3,2818; p=0,0006), para
indivíduos heterozigotos, homozigotos mutantes e portadores do alelo mutante,
respectivamente. Na amostra conjunta, o efeito protetor estimado, foi da ordem
de 1,7 (OR= 1,7367; IC 95%= 1,1167 – 2,7007; p=0,0189), 3,3 (OR=3,3849; IC
95%=1,7629 – 6,4990; p=0,0003) e 2 (OR=2,0467; IC 95%=1,3603 – 3,0794;
p=0,0008) para 1298AC, 1298CC e portadores do alelo mutante,
respectivamente.
Nossos resultados corroboram o estudo de Ulrich et al. (2005) que
encontraram associação do genótipo mutante MTHFR 1298CC com diminuição
do risco de câncer de cólon. Skibola et al., (1999) encontraram associação
desta variante MTHFR 1298C com redução no risco de desenvolver a LLA em
adultos, assim como Krajinovic et al., (2004) e Kamel et al., (2007) em crianças.
68
Contrastando com esses resultados, um estudo com pacientes diagnosticados
para tumores do sistema nervoso central, como o meduloblastoma, demonstrou
um aumento do risco para desenvolvimento da doença em portadores do
genótipo homozigoto 1298CC (Sirachainan et al., 2008). Nos trabalhos de
Chiusolo et al., (2004), Schnakenberg et al., (2005) e Gemmati et al., (2004) a
distribuição do alelo variante MTHFR 1298C entre casos de LLA infantil e
controles, não revelaram diferença estatística significante.
De acordo com Da Costa Ramos et al., (2006), que analisoram 182
crianças brasileiras tratadas para LMA atendidas no INCa, Centro Infantil
Boldrini e também no CEONHPE, os polimorfismos MTHFR 677 e 1298 foram
associados a LMA apenas em crianças não brancas. Nessa população, houve
uma diminuição do risco da doença para o alelo MTHFR 677T, e um aumento
no risco de desenvolver LMA para as crianças não brancas portadoras do alelo
1298C. Nesse caso uma possível explicação para os divergentes resultados
encontrados é o reduzido número de casos LMA na amostra analisada, por Da
Costa Ramos et al., (2006). Uma vez que o risco não pode ser estimado devido
à ausência de heterogeneidade na distribuição genotípica de pacientes e
controles.
Em relação ao polimorfismo na região promotora do gene TS, o presente
estudo não verificou associação desse polimorfismo e o desenvolvimento de
leucemia. Esse resultado é bastante expressivo devido ao tamanho amostral e
a análise de pacientes oriunda de dois centros de pesquisas em diferentes
regiões do país. Nossos resultados sugerem que a presença de variantes
alélicas na região promotora do gene TS não exerce qualquer efeito no risco de
desenvolvimento de leucemia, na população brasileira.
Entretanto, Skibola et al., (2002) observaram a redução do risco de
desenvolvimento de leucemia linfóide aguda, em adultos do Reino Unido, para
indivíduos que possuíam a variante alélica 3R, do gene TS . Nesse trabalho, o
risco estimado para indivíduos 2R2R quando parado com indivíduos 2R3R foi
de 2,6. A presença da tripa repetição, na região promotora do gene, em
homozigose (3R3R) conferiu ao seu portador um efeito protetor da ordem de 4
vezes. Da mesma forma, só que em pacientes com linfoma, Hishida et al.,
(2003) e Lightfoot et al., (2005) associaram a presença do alelo TS2R ao
aumento no risco de desenvolvimento da doença. Seguindo a mesma
69
tendência, Kim et al., (2009) verificaram associação do genótipo 2R3R a
diminuição do risco de LMA em adultos coreanos. Por outro lado, Jonge et al.,
(2009) não observou esse efeito protetor conferido pela presença do alelo
variante TS3R, em vez disso, relacionou a redução do risco a presença do
alelo TS2R (2R3R: OR= 0,7; IC 95%= 0,4-1,0; p= 0,04 e presença do alelo 2R:
OR= 0,7; IC 95%= 0,5-1,0; p=0,03).
Em relação ao gene MS, nosso resultados também não indicaram
associação de quaisquer dos genótipos com o risco de desenvolvimento de
leucemia. Da mesma forma, Skibola et al., (2002), Kamel et al., (2007), Kim et
al., (2009) e Jonge et al., (2009) não observaram nenhum impacto no
desenvolvimento da doença, provocado pela presença do polimorfismo, em
adultos ou crianças. Igualmente, Lightfoot et al., (2005) e Sirachainan et al.,
(2008) também não verificaram associação da variante polimórfica MS 2756
AG à modificações nos níveis de homocisteína e susceptibilidade a linfoma e
tumores no sistema nervos central, respectivamente.
Por outro lado, Gemmati et al., (2004) constatou uma significativa
redução do risco de LLA, em adultos italianos, provocada pela presença do
alelo mutante. Gemmati et al., (2004) observou que indivíduos portadores do
genótipo 2756AG assim como os portadores do alelo 2756G (2756AG +
2756GG) apresentaram um efeito protetor da ordem de 1,9 (2756AG: OR=0,56;
IC 95%= 0,32–0,90; p= 0,030 e portadores do alelo 2756G: OR=0,52, IC
95%=0,30–0,80; p=0,011).
Analisando pacientes com linfoma, Matsuo et al., (2001) relataram que a
presença do genótipo 2756GG conferia maior susceptibilidade para o
desenvolvimento da doença, do que o genótipo 2756AA. Esse aumento do
risco foi estimado em 3,59 vezes. Contrariamente, Niclot et al., (2006)
descreveu que os portadores do genótipo 2756AA é que estavam relacionados
ao aumento do risco de linfoma folicular.
A grande discordância dos dados da literatura só evidencia a necessidade
de mais estudos a respeito da interação gene – gene e gene – ambiente dada
a importância e a necessidade de determinar, classificar e qualificar,
verdadeiramente, os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer.
70
77.. CCoonncclluussõõeess Em relação ao polimorfismo RFC-1 G80A, foi detectado aumento do risco para
desenvolvimento de LA, LLA e LMA, em indivíduos 80GG quando comparado
com 80AA e portadores do alelo 80A .
Em relação ao polimorfismo MTHFR C677T, foi observado aumento do risco
para desenvolvimento de LA e LLA em indivíduos 677CT e portadores do alelo
677T, quando comparado com 677CC.
A presença do genótipo 1298AA no gene MTHFR foi relacionada ao aumento
do risco do desenvolvimento de LA e LLA em relação a indivíduos 1298AC,
1298CC e portadores do alelo 1298C.
O polimorfismo MS A2756G e as repetições em tandem no promotor do gene
TS não foram associados ao desenvolvimento da doença.
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ANEXOS
______________________________________________________
ANEXO I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1. Afirmação introdutória
A criança pela qual você responde frente à equipe médica está sendo
convidada a participar de um estudo de investigação clínica para decidir se
deseja ou não que ela participe, você precisa entender os benefícios e riscos
do mesmo, a fim de formar a sua opinião.
2. Objetivo do estudo
O médico diagnosticou na criança que você acompanha uma doença
conhecida como leucemia, que é caracterizada por uma produção anormal de
glóbulos brancos no sangue e acúmulo de células jovens anormais na medula
óssea. Neste estudo, não serão administrados medicamentos para esta
doença, mas através de uma coleta única de sangue, poderão ser
determinadas características genéticas (características que vem de nossos
pais) que possam estar associadas com alterações que poderão estar ligadas a
leucemia. Farão parte deste estudo crianças que apresentem leucemias
linfóide agudas. Através do estudo das características genéticas, ou seja,
relacionadas com a leucemia poderão ser reconhecidos novos fatores de risco
das mesmas.
3. Procedimentos a serem seguidos
Após você ter assinado o Consentimento Informado, será coletada uma
amostra de sangue para os exames de laboratório. Através destes exames
serão examinadas características genéticas e fenotípicas que poderão estar
associadas com as leucemias. A criança continuará a tomar todos os remédios
que vem fazendo uso, ou a critério de seu médico estes poderão ser
87
modificados no futuro se os seus exames revelarem que outros poderiam ser
mais apropriados. O estudo constará de apenas uma visita médica e coleta de
exame de sangue. A criança continuará a receber a assistência ambulatorial
que já vinha sendo oferecida, sem prejuízo ou interrupção de medicamentos
que por ventura já esteja fazendo uso.
4. Desconforto e riscos
Nenhum novo medicamento ou forma de tratamento será testado na
criança não apresentando nenhum desconforto, pois a coleta de sangue será
realizada no momento do diagnóstico ou durante o tratamento sendo
aproveitado para tanto o sangue que normalmente é coletado para
acompanhamento médico.
5. Exclusões
Se você não entender alguma palavra do texto, peça explicações ao seu
médico.
6. Benefícios aos participantes
A leucemia representa um grupo de doenças malignas que poderão
incapacitar o paciente ou mesmo levá-lo à morte. Ao deixar a criança pela qual
você é o responsável frente ao médico, enfermeiras e demais equipe participar
de estudos como este você estará colaborando para que um maior
conhecimento médico e cientifico das leucemias em nosso país seja
conseguido.
7. Confidencialidade
A menos que sejam requeridos por lei, apenas o investigador, o comitê
de revisão e a Comissão de Ética irão ter acesso a dados confidenciais que
identificam o paciente pelo nome. Os resultados desta pesquisa poderão ser
apresentados em reuniões ou em publicações, no entanto você e a criança não
serão identificadas nestas apresentações. Todo o material biológico coletado
neste estudo será exclusivamente utilizado para as pesquisas de variantes
genéticas e fenotípicas especificadas no protocolo, podendo ainda ser
examinadas e descritas novas características genéticas relacionadas às
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leucemias. Este material não será utilizado para outros estudos ou utilizado
para outros fins.
8. Novas descobertas
Se no decorrer deste estudo ou ao seu final surgir alguma conclusão
relevante para beneficio no tratamento da leucemia você será informado a
respeito.
9. Pessoas para contato
O pesquisador ou seu substituto responderá a todas as perguntas, Se
você tiver questões adicionais no decorrer deste estudo sobre a pesquisa ou
seus direitos como um participante da pesquisa, poderá dirigi-las à professora
Maria Tereza Cartaxo Muniz, Instituto de Ciências Biológicas, Disciplina de
Bioquímica fones: 3423-8112 ou 3423-8582.
10. Participação voluntária
A criança está participando voluntariamente deste estudo. Você pode se
recusar a deixá-la participar do mesmo a qualquer momento, sem penalidades
nem perda dos benefícios que ela já tem direito.
11. Consentimento Informado
Li o texto acima e estou ciente do conteúdo deste formulário de
consentimento. Minhas perguntas foram respondidas. Autorizarei a criança que
acompanho em participar. Recebi uma cópia deste formulário de
consentimento.
Nome do paciente: ________________________________________________
Assinatura do responsável:__________________________________________
data:__/__/__
Nome do investigador:_____________________________________________
Assinatura:______________________________________________________
data:__/__/__
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Nome da testemunha:______________________________________________
Assinatura da testemunha:__________________________________________
data:__/__/__
Pessoa que conduziu o Termo de Consentimento:
_______________________________________________________________
Assinatura:______________________________________________________
data:__/__/__