univerzitet u niŠu - pmf.ni.ac.rs · nakon toga su pacovi žrtvovani i uzeta je krv za...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

DRAGANA D. MITROVIĆ

MASTER RAD

Niš, oktobar 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

DRAGANA D. MITROVIĆ

UTICAJ PANKLAVA NA BROJ LEUKOCITA U PERIFERNOJ

KRVI PACOVA SOJA WISTAR

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Dragana Mitrović 193 Dr Perica Vasiljević

Niš, oktobar 2018.

3

Sažetak

Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na broj

leukocita i morfometrijske karakteristike leukocita u krvi pacova soja Wistar. Lek Panklav je

antibiotik koji deluje tako što ubija bakterije koje su uzročnici infekcija. Lek Panklav se sastoji

iz dva različita leka: amoksicilin i klavulanska kiselina.

Amoksicilin je beta-laktamski antibiotik srednje-širokog spektra dejstva koji se koristi u lečenju

infekcija izazvanih mikroorganizmima. Spada u peniciline (proširenog spektra), i u toj grupi je

najčešći izbor kada je reč o oralnoj primeni, jer je stabilan u kiseloj sredini, dobro se apsorbuje

u poređenju sa drugim sličnim antibioticima, i generalno dobro podnosi. Osetljiv je na dejstvo

beta-laktamaza pa se u preparatima često kombinuje sa inhibitorom istih, najčešće

klavulanskom kiselinom. Životinje su tretirane Panklavom koncentracijama od 25%, 50%, 75%

i 100%. Nakon toga su pacovi žrtvovani i uzeta je krv za određivanje broja leukocita a na

osnovu toga je određena leukocitarna formula i kako bi se izmerio uticaj Panklava na parametre

ćelija leukocita kao što su površina ćelije i prečnik ćelije. Rezultati su pokazali da uticaj

različitih koncentracija panklava ne utiče značajno na promenu brojnosti ćelija neutrofila i

eozinofila. Broj bazofila je smanjen u poredjenju sa kontrolnom jedinkom ali bez statističke

značajnosti. Broj limfocita je viši kod tretiranih jedinki u odnosu na kontrolnu jedinku, nema

statističke značajnosti. Kod svih tretiranih jedinki zapaža se opadanje broja monocita. Ovo je

jedina grupa leukocita gde postoji statistička značajnost dobijena analizom varijansi različitih

koncentracija panklava.

Ključne reči: panklav, leukociti, Wistar pacovi

Sadržaj

1. Uvod..........................................................................................................................5

1.1.Panklav................................................................................................................5

1.1.2. Mehanizam dejstva....................................................................................5

1.1.3 Dostupni oblici........................................................................................6

1.1.4 Primena...................................................................................................7

1.1.5 Neželjena dejstva....................................................................................7

1.2.Krv.......................................................................................................................8

1.2.1. Stvaranje krvnih ćelija.......................................................................8

1.2.2. Sastav krvi.........................................................................................11

1.2.3. Uobličeni krvni elementi...................................................................11

2. Cilj rada.....................................................................................................................20

3. Materijali i metode....................................................................................................21

3.1. Materijal.............................................................................................................21

3.2. Metode................................................................................................................21

3.2.1. Pripreme štok rastvora i radnih rastvora..........................................................21

3.2.2. Tretiranje životinja u konsantnim eksperimentalnim uslovima.......................22

3.2.3 Postupak za dobijanje krvnih elemenata...........................................................22

3.2.4.Izrada krvnog razmaza i određivanje leukocitarne formule..............................22

3.2.5 Merenje morfometrijskih karakteristika keukocita

4. Rezultati i diskusija....................................................................................................24

4.1. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na broj krvnih ćelija kod

pacova.........................................................................................................................24

4.2. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na morfometrijske

karakteristike leukocita..........................................................................................................33

5. Zaključak ...................................................................................................................37

6. Literatura....................................................................................................................38

5

1. Uvod

Antibiotici su jedinjenja koja proizvode neki mikroorganizmi a koja deluju na druge

mikroorganizme tako što sprečavaju njihovo razmnožavanje ili ih uništavaju. Proces stvaranja

antibiotika naziva se antibioza. Prvi otkriveni antibiotik bio je penicilin. Antibiotici se razlikuju

po hemijskom sastavu i načinu delovanja na patogene bakterije.

Obzirom na kratko vreme potrebno za izmenu generacije, bakterije su u velikoj evolucijskoj

prednosti nad čovekom. Prednost koju je čovek stekao uvođenjem antibiotika u kliničku praksu

1940-ih godina polako nestaje zbog prilagodjavanja bakterija. Stručnjaci su relativno rano, već

na početku antibiotske ere, bili svesni da će razvoj rezistencije ugroziti delotvornost ovih

dragocenih lekova. Procena Europske Unije (EU) je da u zemljama EU multiplorezistentne

bakterije godišnje uzrokuju smrt u oko 25 000 bolesnika te da uzrokuju 1,5 milijarde eura

dodatnih troškova u zdravstvu. Zbog toga su se u suzbijanje širenja otpornosti bakterija na

antibiotike uključila mnoga nacionalna i internacionalna stručna društva kao i vladine

organizacije propagirajći edukaciju o racionalnoj upotrebi antibiotika i među zdravstvenim

radnicima i medju pacijentima. Racionalnom upotrebom antibiotika možemo kupiti vreme za

razvoj novih antibiotika i alternativnih pristupa lečenju infektivnih bolesti. (Andrašević, 2009.).

1.1.Panklav

Lek Panklav je antibiotik koji deluje tako što ubija bakterije koje su uzročnici infekcija. Lek

Panklav se sastoji iz dva različita leka: amoksicilin i klavulanska kiselina.

Amoksicilin je beta-laktamski antibiotik srednje-širokog spektra dejstva koji se koristi u lečenju

infekcija izazvanih mikroorganizmima. Spada u peniciline (proširenog spektra), i u toj grupi je

najčešći izbor kada je reč o oralnoj primeni, jer je stabilan u kiseloj sredini, dobro se apsorbuje

u poređenju sa drugim sličnim antibioticima, i generalno dobro podnosi. Osetljiv je na dejstvo

beta-laktamaza pa se u preparatima često kombinuje sa inhibitorom istih, najčešće

klavulanskom kiselinom.

1.1.2. Mehanizam dejstva

Amoksicilin, kao i svi penicilini, inhibira sintezu ćelijskog zida bakterija. Vezuje se za

enzime transpeptidaze, uz otvaranje laktamskog prstena, i time sprečava formiranje postojanih

peptidnih veza između lanaca peptidoglikana. Ovo smanjuje integritet i modifikuje

permeabilnost ćelijskog zida, pa se smatra da amoksicilin deluje baktericidno.

Amoksicilin je derivat benzilpenicilina, odnosno α-aminobenzilpenicilin. Uvođenjem amino

grupe u bočnu reziduu, povećava se polarnost molekula pa i u izvesnoj meri proširuje spektar

dejstva na Gram-negativne bakterije. Amino grupa uslovljava i relativnu stabinost u kiseloj

sredini; uvođenjem dodatnog baznog centra u molekulu konkurentno se štiti beta-laktam od

otvaranja u kiseloj sredini. Podložan je degradaciji u prisustvu nukleofila i beta-laktamaza.

Amoksicilin je strukturno sličan ampicilinu, sa jedinom razlikom u vidu fenolne grupe. Oralno

primenjen, amoksicilin se značajno bolje apsorbuje od ampicilina.

Slika 1. Hemijska formula amoksicilina

1.1.3. Dostupni oblici

Amoksicilin je primarno prilagođen oralnoj primeni, i dostupan je u vidu tableta,

kapsula i sirupa najčešće u obliku amoksicilin-trihidrata (Amoksicilin®, Sinacilin®...). 95%

unete količine se apsorbuje iz digestivnog trakta i oko 30% metaboliše u jetri. Metaboliti i lek

u neizmenjenom obliku izlučuju se gotovo isključivo putem urina. Osim oralne, natrijumova so

amoksicilina primenjuje se i intravenski. Terapijske doze kod odraslih variraju između 750 i

1500 mg dnevno.

Dostupan je prolek amoksicilina — pivampicilin (pivaloiloksimetilestar amoskicilina) — koji

ima bolju bioraspoloživost kod per os primene.

7

1.1.4. Primena

Upotreba amoksicilina indikovana je kod infekcija gornjih respiratornih organa i uha

izazvanih podložnim vrstama pneumokoka, stafilokoka i hemofilusa, zatim, kod infekcija

urinarnog trakta, streptokoknih infekcija donjeg respiratornog trakta i gonoreje. Efikasan je

primarno kod gram-pozitivnih bakterija.

Preparat sa dodatkom klavulanske kiseline (Amoksiklav®, Panklav®...) može se primenjivati

kod sojeva koji luče beta-laktamazu, ali je neophodno prethodno uraditi antibiogram.

1.1.5. Neželjena dejstva

Osim reakcija preosetljivosti koje se mogu javiti kod primene penicilina u kom slučaju

je upotreba kontraindikovana, amoksicilin se dobro podnosi. Mogu se javiti lakše alergijske

reakcije u vidu promena na koži. Pojava osipa uglavnom zahteva prekid terapije. Drugi

neželjeni efekti su ograničeni na lakše stomačne tegobe. Kod primene preparata sa

klavulanskom kiselinom mogu se javiti i drugi neželjeni efekti, uglavnom holestatična žutica

ili hepatitis samoograničavajućeg karaktera.

https://www.alims.gov.rs/wp-content/blogs.dir/2/files/lekovi/pil/1153-2008-12.pdf

Slika 2. Hemijska formula klavulanske kiseline

1.2.Krv

Krv je tečno vezivno tkivo koje cirkuliše u zatvorenom sistemu za krvotok i na taj način

održava vezu između svih organa u organizmu. Zahvaljujući cirkulaciji kroz sistem sudova, krv

snabdeva ćelije kiseonikom i hranljivim materijama a prima od njih ugljen dioksid i druge

produkte metabolizma (Štajn, 1990).

Boja krvi potiče od hemoglobina koji se nalazi u eritrocitima. Oksigenisana krv bogata

kiseonikom ima svetliju boju dok dezoksigenisana krv sadrži manji procenat kiseonika vezanog

za hemoglobin pa ima tamniju crvenu boju. Specifična težina krvi je 1,050 - 1,060.

Elektrohemijska reakcija krvi čoveka i domaćih životinja je slabo bazna (pH 7,3-7,5) (Štajn,

1990).

Krv ima četiri osnovne fukcije u organizmu: transportna funkcija, humoralna funkcija, uloga u

termoregulaciji i odbrambena uloga (Štajn, 1990)

1.2.1. Stvaranje krvnih ćelija

Krvne ćelije se stvaraju u koštanoj srži a proces nastajanja krvi naziva se hematopoeza.

Broj krvnih ćelija održava se u uskim granicama a ako je to potrebno njihov broj se može

znaćajno povećati. Uz krvne ćelije hematopoezni sistem čine potporne strukture i tkiva koji su

nužni za razvoj ćelija. Organi koji potpuno ili delimično učestvuju u stvaranju i sazrevanju

krvnih ćelija su: koštana srž, slezina, timus i limfni čvorovi. Između njih ne postoji anatomska

veza ali oni su kvrlju fukncionano povezani (Labar, 2007). Mogu se podeliti na primarne i

sekundarne hematopoezne organe. U primarne spadaju koštana srž i i timus a u sekundarne

slezina i limfni čvorovi (Petrović, 2009). Tokom čovekovog života različiti organi služe kao

mesta hematopoeze. Tokom embrionalnog života krvne ćelije nastaju iz aortalno-mazonefros-

gonadalne regije u žumancetnoj kesici. U fetalnom periodu glavni hematopoezni organi su

slezina i jetra a kasnije tu ulogu delimično preuzima kosna srž da bi nakon rođena ona u

potpunosti preuzela ulogu stvaranja krvnih ćelija (Labar, 2007).

Koštana srž se pri rođenju sastoji isključivo od hamatopoeznog tkiva (crvena srž) dok se kasnije

tokom života ono postupno zamenjuje masnim tkivom (žuta srž). Ovo se najipre dešava u

dijafizama dugih kostiju koje ostaju ispunjene do kraja života žutom srži. Crvena srž se kod

odraslog čoveka zadržava u kratkim kostima (pršljenovima), u pljosnatim kostima (kosti

lobanje, grudna kost, sakrum i kosti karlice) i epifizama dugih kostiju. Pored hematopoeznog

tkiva u kosnoj srži nalaze se i ćelije strome koje čine mikrookolinu hematopoeznog tkiva. Uz

9

venske sinuse, mikrookolinu čine sledeće ćelije: fibroblastoidne ćelije, endotelne ćelije,

makrofagi i masne ćelije. Ove ćelije posreduju u samom procesu hematopoeze tako sto šalju

odgovarajuće faktore rasta na matične ćelije hematopoeznog tkiva (Labar, 2007). Krvne ćelije

se stalno troše i obnavljaju. Proces regeneracije krvnih ćelija naziva se hematopoeza (Slika 4) i

obavlja se u tri koraka : proliferacija, diferencijacija i sazrevanje. Sve krvne ćelije potiču od

jedne ishodne matične ćelije hematopoeze u koštanoj srži. To je pluripotentna matična ćelija

koja je još uvek morfološki neprepoznatljiva i koja pod dejstvom faktora svoje mikrookoline

započinje proliferaciju, rast i deobu. Od nje diferencijacijom nastaju matične ćelije

predodređene za pojedine krvne loze, multipotentne mijeloidne i limfoidne matične ćelije. Iz

njih nastaju opredeljene matične ćelije pojedinačnih krvnih loza i to su unipotentne matične

ćelije koje daju prve morfološke preoznatljive ćelijske oblike : proeritroblaste, mijeloblaste,

monoblaste, megakarioblaste i nulte ćelije limfoidne loze. Od proeritroblasta nastaju erirtocit,

od mijeloblasta nastaju granulociti, od monoblasta monociti, od megakarioblasta trombocti a

od ćelija limfoidne loze T i B limfociti (Petrović, 2009).

Slika 3. Šematski prikaz hematopoeze

Hematopoeza ne bi bila moguća bez faktora rasta koj regulišu procese proliferacije i

diferencijacije u kosnoj srži. Svi faktori rasta osim eritropoetina, koji nastaje u bubregu,

sintetišu ćelije strome kosne srži, limfociti T, monociti, endotelne i fibroblastoidne ćelije.

Hematopoezni faktori rasta su: interleukini IL-1,IL-3,IL-5,IL-6, TNF, koloni-stimulišući

faktori SCF, eritropoetin, trombopoetin (Labar, 2007). U koliko koštana srž ne može da

odgovori na zahteve za povećanim stvaranjem krvnih ćelija, masna srž može da se pretvori u

hematopoeza

11

aktivnu a isto tako u hematopoezu se uključuju embrionalni hematopoezni organi slezina, jetra

i limfne žlezde. Ova pojava se naziva ekstramedulska hematopoeza (Petrović, 2009).

1.2.2.Sastav krvi

Krv kičmenjaka sastoji se iz krvne plazme i uobličenih krvnih elemenata koji lebde u

njoj - eritrociti, leukociti i trombociti (Štajn, 1990). Odnos plazme i uobličenih krvnih

elemenata izražavaju se preko hematokritske vrednosti. Hematokrit (Ht) je deo ukupne

zpremine krvi koji otpada na masu eritrocita. U normalnim stanjima to iznosi 0,45 l/l sto znači

da u 1 litru krvi eritrociti zauzimaju 0,45 litra dok 0,55 litra zauzima plazma (Štajn, 1990).

Krvna plazma je bledožuta viskozna tečnost koja sadrži veliki broj rastvorenih elektrolita i

neelektrolita. Od 90-92% sadrži vodu dok ostali deo otpada na suvu materiju. Suva materija se

u osnovi sastoji od nebelačevinastih supstanci male molekulse mase i belančevina plazme. Od

nebelančevinastih supstanca dominira elektrolit plazme NaCl koji ima ulogu pufera tj. u

održavanju acido-bazne ravnoteže. Koncentracija soli takođe obezbeđuje stalni osmotski

pritisak plazme koji omogućava razmenu materija sa tkivima. Od ostalih nebelančevinastih

supstanci u plazmi se nalaze mokraćna kiselina, kreatinini, glukoza, holesterol i bilirubin. Od

belančevina plazme najvažniji je fibrinogen koji se u procesu koagulacije taloži u nerastvorljivi

fibrin. Ono što ostaje izdvajanjem fibrina naziva se serum a 20 u njemu su serumske

belančevine. Ove belančevine imaju ulogu u transportu, zaštiti, matabolizmu i regulaciji acido-

bazne ravnoteže (Štajn, 1990). Najzastupljenija belančevina je albumin koji ima transportnu

ulogu i za koji se vezuje njaveći broj produkata metabolizma. On takođe održava volumen

plazme konstantnim i obezbeđuje proteinsku rezervu krvi(Despopulus & Silbernagal, 2011).

1.2.3. Uobličeni krvni elemneti

Eritrociti (crvena krvna zrnca) su bezjedarne, bikonkavne ćelije diskoidnog oblika,

prečnika 7-8 μ. Nastaju procesom eritrocitopoeze koji se posle rođenja odigrava samo u

koštanoj srži. Sastoje se iz membrane i citoplazme. Membrana eritrocita je sačinjena od

proteina, lipida i steroida (lecitin, holesterol). Citoplazmu sačinjava mrežasta struktura u čijim

se okcima nalazi “krvni pigment disanja”, hemoglobin, koji joj daje crvenu boju i čini 95 %

suve supstance eritrocita (Slika 6). Ove ćelije krvi služe za transport gasova. Kiseonik prenose

iz pluća do perifernih tkiva i na taj način eritrocit snabdeva organizam kiseonikom koji je

neophodan za stvaranje energije, a takođe učestvuje i u eliminaciji ugljen dioksida iz tkiva

(Petrović, 2009). Energiju za obavljanje svoje fiziološke funkcije eritrocit stvara procesom

glikolize. Prosečan životni vek eritrocita kod čoveka je 120 dana. U normalnim uslovima,

dnevno se stvara oko 3 milijarde eritrocita na kg telesne mase, a približno toliko u jednom danu

i završi svoj životni vek (Anđelković i sar. , 2002).

Slika 4. Prikaz eritrocita i hemoglobina

Normalna vrednost broja eritrocita kod pacova je 7,8 x 1012

/L, a referentne vrednosti se kreću

od 4,7 do 8,5 x 1012

/L. Stanja kod kojih postoji smanjenje mase eritrocita u krvi, tj. smanjen je

njihov broj ispod normalnih vrednosti, nazivaju se anemije. Povećan broj eritrocita u krvi se

naziva policitemija, eritrocitoza ili poliglobulija (Rusov, 1984).

Leukociti (bela krvna zrnca) su ćelije koje za razliku od eritrocita imaju jedro, ćelijske

organele i granule. Pri bojenju krvnog razmaza njihove granule ispoljavaju različita

tinktorijalna svojstva, usled čega se leukociti tradicionalno dele na granulocite i agranulocite

(Slika 8). Leukociti su ćelije krvi koje su uključene u humoralnu i celularnu odbranu organizma.

Odbrambena uloga se zasniva na njihovoj sposobnosti fagocitoze i ameboidnog kretanja. 15

Granulociti imaju segmentovano jedro i u njihovoj citoplazmi su prisutne granule. Ove granule

mogu biti prijemčive za kisele ili bazne boje, ili i za jedne i za druge, na osnovu čega je

granulocite moguće razvrstati na eozinofilne, bazofilne i neutrofilne. Neutrofilni granulociti su

najbrojniji i čine 50-70% ukupnog broja leukocita. Jedro neutrofila ima najčešće tri segmenata

13

i njihove granule se boje ljubičasto jer imaju podjednaki afinitet prema bazama i kiselinama.

Neutrofili čine prvu liniju odbrane organizma od bakterijskih infekcija i u aktivnom stanju

označavaju se mikrofagima. Eozinofilni granulociti imaju isti oblik i neznatno veći dijametar

od neutrofila, jedro ima dva režnja povezana hromatinskim mostom. U njihovoj citoplazmi

dominiraju granule koje pokazuju visok afinitet za kisele boje (eozin). Kod alergijskih i

parazitarnih bolesti značajno se povećava broj eozinofila u krvi (eozinofilija). Bazofilni

granulociti su najsitniji i najmanje brojni granulociti. Njihovo jedro je potkovičasto a granule

ispoljavaju bazofiliju.

Agranulociti imaju nesegmentovano jedro i azurofilne granule koje se boje isključivo

ljubičasto. U agranulocite spadaju limfociti i monociti. Monociti su najkrupnije ćelije krvi,

ovalnog oblika sa ovalnim jedrom. Predstavljaju pokretnu rezervu tkivnih makrofaga koji

učestvuju u čišćenju tkiva od raspadnih produkata i u odbrani od mikroorganizama (Anđelković

i sar. , 2002).

Slika 5. Sazrevanje leukocita

Neutrofili (Slika 6.) su granulociti prečnika od 9-15 mikrona sa više segmentisanim

jedrom (3-5 režnjeva). U ctoplazmi se mogu uočiti specifične bezbojne granule koje sadrže

lizozim i kolagenazu (Labar, 2007). Njihova glavna uloga je u odbrani organizma od bakterija

i ostalih stranih čestica koje fagocitiraju (Štajn, 1990).

Slika 6. Izgled neutrofila

Eozinofili (Slika 7.) su granulocti koji za razliku od neutrofila sadže specifične tamno

crvene granule i jedro sa manje režnjeva (manje od 3). Eozinofilne granule sadrže lizozim i

peroksidazu. Ove ćelija imaju važnu ulogu u alergijskih reakcija, gde fagocitiraju kompleks

antigen-antitelo (Štajn, 1990). Eozinofili imaju sklonost da se nagomilavaju u tkiva u kojima

se događa alergijska reakcija i dovode do pojavu edema (Gauyton & Hall, 2003).

15

Slika 7. Izgled eozinofila

Bazofili (Slika 8.) su granulociti koji imaju više manje bubrežasto jedro sa većim

brojem useka i specifične tamno plave ganule. Ove granule sadrže histamin i heparin (Labar,

2007). Bazofili u krv ispuštaju heparin, prirodni antikoagulans i sprečavaju koagulaciju krvi.

Takođe imaju ulogu u alergijama gde vrše hemotaksiju eozinofila na mestu upale. Oni tokom

alergijske reakcije ispuštaju histamin i niz drugih supstanci koje dovode do lokalnih promena i

alarm rekacije (Gauyton & Hall, 2003).

Slika 8. Izgled bazofila

Monocit (Slika 9.) je najveća ćelija periferne krvi čija se veličina kreće od 14 do 21

mikrona. Jedro ćelije je uglavnom bubrežastog oblika a u citoplazmi mogu se videti sitne, u

obliku prašine nespecifične granule (Petrović, 2009). Mnociti funkcionisu kao čistači i oni su

prva linija odbrane u tkivima protiv infekcija. Po izlasku iz krvotoka u vezivno tkivo pretvaraju

se u makrofage i fagocitiraju strane materije (Štajn, 1990).

Slika 9. Izgled monocita

Limfociti su najmanji leukociti i njihova veličina iznosi oko 10 mikrona. Jedro ćelije

je ovalno i citoplazma je bez specifičnih granula. T i B limfociti morfološki ne mogu da se

razlikuju. Oni se razlikuju na osnovu ćelijskih markera, posebnih struktura koje se nalaze na

njihovim membranama koji se otkrivaju raznim imunološkim metodama (Petrović, 2009). Po

svojoj funkciji limfociti su imunobiološke kompetentene ćelije koje na delovanje antigena

počinju svoji diferencijaciju i ostvaruju odbranu posredno ili neposredno. B limfociti deluju

posredno preko svojih glavnih produkata antitela, i obezbeđuju humoralni imuni odgovor. T

limfociti deluju neposredno i obezbeđuju celularni imuni odgovor kada antigen ne dospeva u

kvotok i limfotok (Štajn, 1990).

17

Slika 10. Uporedni prikaz leukocita

Procentulani odnos pojedinih vrsta leukocita u krvi predstavlja leukocitarnu formulu.

Određivanje leukocitarne formule ima veliki značaj u kliničkoj praksi jer se zahvaljujući

promenama unutar leukocitarne formule mogu dijagnostikovati pojedine bolesti. Procentulana

zastupljenost leukocita u perifernoj krvi čoveka je sledeći: Neutrofili 67-70%, Eozinofili 2-4%,

Bazofili 0,5%, Limfociti 25-40%, Monociti 2-6% (Štajn, 1990).

Kod pacova normalna leukocitarna formula izgleda ovako: Neutrofili 9-47%, Eozinofili 0-3%,

Bazofili retko, Limfociti 51-90%, Monociti 0-3% (Rusov, 1984).

Normalan broj leukocita kod odraslog čoveka iznosi 5-8 x 109 /l krvi (Gauyton & Hall, 2003).

Kod pacova ova brojka iznosi 6-10,5 x 109 /l (Rusov, 1984). Privremeno povećanje broja

leukocita iznad normale naziva se leukocitoza i zapaža se posle uzimanja hrane, napornog rada

ili zapaljivih procesa. Bolest praćena velikim i stalnim povećanjem broja leukocita u krvi naziva

se leukemija. Ukoliko dođe do smanjenog broj leukocita od normalnog tada govorimo o

leukopeniji (Štajn, 1990).

Do promene broja pojedinačnih vrsta leukocita takođe može doći usled različitih fizioloških ili

patoloških činioca. Možemo razlikovati sledeće "penije" ili smanjenje broja leukocita:

neutropenije - usled lekova, bakterija; eozinopenije - usled akutnih bakterijskih infekcija, stresa;

bazocitopenije - retke idu sa neutrofilijom; monocitopenije - retke i limfocitopenije - usled

stresnih reakcija, akutnih infekcija, povreda. Ukoliko dolazi do povećanja tada imamo "filije" i

one su sledeće: neutrofilija - infekcije, intoksikacije, metabolicki poremećaji; eozinofilija -

infekcije, alergijske reakcije; bazocitofilija - obično udružena sa eozinofilijom; monocitoza -

parazitarne infekcije i limfocitoza - virusne infekcije, zajedno sa neutropenijom (Rusov, 1984

; Petrović 2009).

Trombociti (krvne pločice) su bezjedarni fragmenti dzinovskih poliploidnih ćelija

megakariocita koji nastaju tokom trombocitopoeze u koštanoj srži. Imaju oblik bikonveksnog

diska prečnika 2-4 μm. Njihova izrazita sklonost ka aglutinaciji omogućava im da učestvuju u

procesu stvaranja krvnog ugruška na mestu oštećenog krvnog suda. Njihov životni vek je od 8

do 14 dana, posle čega se razgrađuju u slezini (Anđelković i sar. , 2002).

Broj trombocita kod normalnih osoba iznosi 150-350 x 109 /l krvi (Gauyton & Hall, 2003).

Kod pacova ova vrednost iznosi 460-1050 x 109 /l (Rusov, 1984). Do povećanog broja

trombocita može doći usled različitih povreda i većeg gubitka krvi i tada govorimo o

trombocitozi. U koliko dolazi do smanjenja broja u odnosu na normalni tada imamo

trombocitopeniju i ona se javlja u raznim patološkim stanjima koja se manifestuju krvarenjem.

Dosadašnja istraživanja

Dosadašnja istraživanja o amoskicilinu i klavulanskoj kiselini uglavnom su se odnosila

na trombocitopeniju. Rezultati su pokazali vezu između trombocitopenije i delovanja

amoksicilina i klavulanske kiseline (Mansour, 2014.).

Takođe, rezultati istraživanja sa eugenolom su pokazali da eugenol primenjivan tokom dve i

četiri nedelje u dozama od 10, 50, 200 i 400 mg/kg tm/dan ne ispoljava hematotoksično,

hepatotoksično niti nefrotoksično dejstvo. Eugenol davan tokom četiri nedelje ne utiče značajno

na broj eritrocita, koncentraciju hemoglobina, hematokrit, zapreminu eritrocita, broja leukocita

i leukocitnu formulu. Primenjivan tokom dve nedelje, prouzrokuje značajno povećanje mase

hemoglobina po eritrocitu. Ovaj efekat je nespecifičan i ne zavisi niti doze, niti od dužine

19

tretmana. Doze eugenola od 10 i 200 mg/kg/dan primenjivane tokom četiri nedelje prouzrokuju

značajno smanjenje broja trombocita, dok najviša ispitivana doza (400 mg/kg/dan) prouzrokuje

značajno povećanje, u poređenju sa brojem trombocita kod pacova tretiranih dozom od 10 i 200

mg/kg/dan. Promene broja trombocita izazvane eugenolom kvalitativno su različite i ne zavise

od doze, niti od dužine tretmana (Jezdimirović, 2013.).

2. Cilj rada

Cilj ovog rada bio je:

1. Određivanje leukocitarne formule

2. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na broj leukocita

3. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na morfometrijske karakteristike

leukocita

21

3. Materijali i metode

3.1 Materijal

U toku eksperimenta je korišćen sledeći materijal:

• Eksperimentane životinje, pacovi soja Wistar

• Krvno tkivo

• Panklav

3.2 Metode

• Pripreme štok rastvora i radnih rastvora

• Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima

• Postupak za dobijanje krvnih elemenata

• Izrada krvnog razmaza i određivanje leukocitarne formule

• Bojenje preparata

• Merenje morfometrijskih karakteristika leukocita

3.2.1.Pripreme štok rastvora i radnih rastvora

Štok rastvor je koncentrovani rastvor od koga se razblaženjem dobijaju radni rastvori manje

koncentracije za izvodjenje eksperimenta. U eksperimentu so koišćeni sledeći štok rastvori:

• Koncentracija 1: 20mg amoksicilina i 2.85mg klavulanske kiseline,



• Koncentracija 4: 80mg amoksicilina i 11.4mg klavulanske kiseline.

3.2.2. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima

Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, tretirani su 5 dana panklavom u prethodno

navedenim koncentracijama /kg telesne tezine. Ukupno je bilo 5 životinja od kojih su 4 tretirane

i jedna netretirana praćena kao kontrola. Lek je apliciran oralno. Životinje su dozirane sa po 1

ml rastvora određene koncentracije svakog dana u 9h, u trajanju od 7 dana.

Eksperimentalne životinje čuvane su na temperaturi od 22-23 C, sa slobodnim režimom ishrane

i režimom dana od 12:12h svetlost/tama.

3.2.3 Postupak za dobijanje krvnih elemenata

Pribor za uzimanje uzorka krvi mora biti hemijski čist, sterlan i suv. Takođe mora se

pripremiti dovoljna količina injekcionih igli i špriceva. Injekicione igle moraju biti od čelika i

odgovarajuće dužine i promera. U cilju sprečavanja koagulacije igle i špricevi se heparinizuju.

Ukoliko se krv vadi iz vene potrebno je mesto uboda sterilizirati, izvršiti kompresiju vene i

punktirati ogovarajćom sterilnom iglom. Kada se dobije uzorak krvi kompresija vena se prekida

tako sto se komadić čiste vate natopljene alkoholom stavi preko igle i mesta uboda i igla izvuče

naglim pokretom. Korišćena igla se adekvatno odlaze i baca. (Rusov, 1984).

Petog dana od početka tretiranja životinjama je za izračunavanje krvnih elemenata uzeta puna

krv iz srca nakon žrtvovanja i to na sledeći način. Životinja je anestezirana sa 0,4 ml 10%

ketamidorom. Zatim se heparinizovanom iglom i špricem izvrši punktacija leve komore srca.

Tokom vađenja krvi vodi se računa de se ne ošteti komora i da se povremeno zaustavi kako bi

se ona napunila krvlju. Nakon dobijenog uzorka igla se adekvatno odlaže i baca a i iz šprica se

laganim pokretom istisne kap krvi na sahatno staklo za dalju analizu.

3.2.4.Izrada krvnog razmaza i određivanje leukocitarne formule

Potreban pribor: dva predmetna stakla, pipeta, May-Grunwald-ov rastvor, Giemsa

rastvor, stalak za bojenje i sušenje, mikroskop, imerziono ulje.

Način rada:

23

Pipetom nanesemo kap krvi (prečnika 1-2 mm) na početak predmetnog stakla. Drugo brušeno

staklo prislonimo pod uglom od 35 do 45º uz kap kako bi se krv razlila duž ivice prislonjenog

stakla. Zatim se pod određenim pritiskom to staklo bez zadržavanja prevuče preko predmetnog

stakla (Rusov, 1984).

Razmaz se osuši na vazduhu a zatim se boji po Pappenheim-u. Fiksiranje razmaza se dobija

rastvorom May-Grunvald 3-5 min, ispere se mlazom destilovane vode, pa se prelije razblaženim

rastvorom Giemsa i ostavi da stoji 15-30 minuta. Na kraju se boja ispire destilovanom vodom

dok razmaz ne dobije crvenkastu boju.

Uz upotrebu imerzionog ulja i objektiva razmaz se pregleda i na njemu se broje 100 do 200

leukocita pri čemu se beleži svaka vrsta ponaosob. Na osnovu toga izračunava se procentualna

zastupljenost svake vrste leukocita - diferencijalni odnos (Petrović, 2009).

3.2.5 Merenje morfometrijskih karakteristika keukocita

Za merenje morfometrijskih karakteristika koristi se slobodno dostupan softver za

analizu slika ImageJ. Autor softvera ImageJ je Vejn Resband (Wayne Rasband) sa Nacionalnog

Instituta zdravlja Sjedinjenih Američkih Država iz Betesde, država Merilend (Bethesda,

Maryland). ImageJ je dostupan online i kao download aplikacija za sve racunare koji imaju

instaliranu Javu 1.4 ili noviju verziju. U ImagJ-u se radi sa sledećim formatima slika: TIFF,

GIF, JPEG, BMP i DICOM. Omogućena je analiza 8, 16 i 32-bitnih slika uz odgovarajuću

kalibraciju.

Slika 11. Izgled glavnog prozora ImageJ programa

4. Rezultati i diskusija

4.1. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na broj krvnih ćelija kod pacova

Nakon završenog tretiranja životinja različitim koncentracijama panklava, i uzimanja

krvi na ranije opisan način, izbrojane su ćelije leukocita i dobijene su sledeće vrednosti

prikazane u Tabeli 1.:

Tabela 1. Broj leukocita u perifernoj krvi životinja tretiranih različitim koncentracijama panklava

Koncentarcina panklava Limfociti SV±SD

Bazofili SV±SD

Eozinofili SV±SD

Neutrofili SV±SD

Monociti SV±SD

Kontrola 74±28.284 22.5±27.577 4.5±2.121 65±42.426 10±0

25% 76±24.042 7±2.828 6±1.414 86±57.983 7.5±2.121

50% 141±8.485 1.5±0.707 2.5±0.707 75.5±37.477 3±1.414

75% 67.5±4.962 3±1.414 1.5±0.707 60.5±28.991 7±1.414

100% 116±22.627 3.50±2.121 1±1.414 89±43.841 5±2.828

* Broj ćelija po krvnom razmazu

Broj limfocita kreće se od 74±28.284 kod kontrolne grupe. Najveći broj limfocita zapaža se

kod jedinki tretiranih koncentracijom panklava 50% i kreće se od 141±8.485 i kod jedinki

tretiranih koncentracijom 100% gde se brojnost kreće 116±22.627 (Tabela 1.). I kod ostalih

koncentracija se zapaža povećanje broja limfocita, osim kod grupe tretirane sa 75% gde se

zapaža manji broj limfocita u poređenju sa kontrolom I ostalim tretiranim jedinkama. Limfociti

u krvi pacova cine 51-90% od ukupnog broja leukocita. Povećanje broja limfocita, tj.

limfocitoza, prisutna je prilikom tretmana lekovima.

Broj bazofila je najviši kod kontolne jedinke I kreće se od 22.5±27.577. Kod svih ostalih

životinja tretiranih različitim koncentracijama panklava je smanjen broj bazofila. Zaključuje se

da različite koncentracije panklava utiču na smanjenje broja bazofila. Pošto su bazofilni

granulociti uključeni u trenutne alegrijske reakcije, može se pretpostvaiti da aktivne supstance

panklava tokom tretmana od nekoliko dana utiču na smanjenje alegrijskog potencijala.

Broj eozinofila kod kontrolne grupe kreće se od 4,5±2.121. Kod svih ostalih koncentracija je

manji broj eozinofila, jedino je veći kod koncentracije 25% i kreće se od 6±1.414. Eozinopenija

25

je pojava smanjenog broja eozinofila u odnosu na normalne vrednosti. Povećanjem doze

panklava uočeno je postepeno smanjivanje broja eozinofila. Eozinofili učestvuju u ukupnu

brojnost leukocita pacova sa 0-3% (kod čoveka 2-4%), međutim, iako je mala brojnost, zapaža

se dodatno smanjenje brojnosti sa većom dozom panklava.

Broj neutrofila kod kontrolne grupe kreće se od 65±42.426. Kod svih tretiranih grupa je veći

broj neutrofila, jedino je neznatno manji broj kod koncentracije od 75% I kreće se 60.5±28.991.

Neutrofili su najbrojniji od svih vrsta leukocita i predstavljaju prvi odgovor organizma na

infekciju kada dolazi do povećanja njihovog broja. Neutrofilija (povećan broj neutrofila u

odnosu na normalne vrednosti) se javlja usled različitih bolesti, kao odgovor imunog sistema,

ali, takođe i usled primene raznih lekova, u ovom slučaju različitih koncentracija panklava.

Broj monocita kod kontrole kreće se od 10±0. Kod svih tretiranih jedinki zapaža se opadanje

broja monocita. Monocitopenija (smanjen broj monocita u odnosu na normalne vrednosti) se

može javiti kao posledica delovanja lekova i toksičnih materija. Monociti predstavljaju prvu

liniju odbrane u tkivima protiv infekcija. Kod svih životinja tretiranih različitim

koncentracijama panklava se zapaža smanjen broj što je verovatno posledica primene paklava.

Grafikon 1. Analiza varijanse uticaja panklava različitih koncentracija na broj limfocita

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

4

54

104

154

204

Lim

fociti

Tabela 2. Uticaj različitih koncentracija panklava na broj limfocita u perifernoj krvi.

Statistička značajnost između različitih koncentracija

* Jednofaktorska analiza varijansi; p≤0,05

Analizom varijanse (ANOVA) uticaja panklava različitih koncentracija na broj limfocita

dobijeno je da nema statističke značajnosti u uticaju različitih koncentracija panklava na broj

limfocita (Tabela 2.).

Grafikon 2. Analiza varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na broj bazofila

Source Type III SS df Mean Squares F-Ratio p-Value

Koncentracija 8,230.400 4 2,057.600 2.525 0.169

Error 4,074.500 5 814.900

Analysis of Variance

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

-24.0

-9.8

4.4

18.6

32.8

47.0

Ba

zo

fili

27

Tabela 3. Uticaj različitih koncentracija panklava na broj bazofila u perifernoj krvi. Statistička

značajnost između različitih koncentracija



Koncentracija 595.000 4 148.750 0.959 0.502

Error 775.500 5 155.100

Analizom varijanse (ANOVA) uticaja panklava na broj bazofila dobijeno je da nema statističke

značajnosti u uticaju različitih koncentracija panklava na broj bazofila (Tabela 3.).

Grafikon 3. Analiza varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na broj eozinofila

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

-3

1

5

9

Eo

zin

ofil

i

Tabela 4. Uticaj različitih koncentracija panklava na broj eozinofila u perifernoj krvi. Statistička


df Mean Squares F-Ratio p-Value

4 8.850 4.658 0.061

5 1.900

Analiza varijanse pokazuje da panklav nema statistički značajne efekte na broj eozinofila u

perifernoj krvi kod tretiranih životinja. (Tabela 4.).

Grafikon 4. Analiza varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na broj neutrofila

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

-27.0

23.5

74.0

124.5

175.0

Ne

utr

ofil

i

29

Tabela 5. Uticaj različitih koncentracija panklava na broj neutrofila u perifernoj krvi.



4 313.650 0.168 0.946

5 1,865.800

Analizom varijanse uticaja panklava na broj neutrofila dobijeno je da nema statističke

značajnosti u uticaju različitih koncentracija panklava na broj neutrofila (Tabela 5.).

Grafikon 5. Analiza varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na broj monocita

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

-2

2

6

10

14

Mo

no

citi

Tabela 6. Uticaj različitih koncentracija panklava na broj monocita u perifernoj krvi.



4 14.000 4.242 0.072

5 3.300

Analizom varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na broj monocita dobijeno je da

postoji statistička značajnost u uticaju različitih koncentracija panklava na broj monocita jer se

broj monocita smanjuje kod svih tretiranih životinja (Tabela 6.).

Slika 12. Krvni razmaz leukocita (x400, May-Greenwald- Giemsa)

Slika 13. Krvni razmaz leukocita sa prikazom neutrofila (x400, May-Greenwald-Giemsa)

31

Slika 14. Krvni razmaz leukocita kontrolne jedinke (x400, May-Greenwald, Giemsa)

4.2. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija panklava na morfometrijske karakteristike

leukocita

Kako bi se utvrdio uticaj panklava na morfologiju ćelija leukocita, izmeren je prečnik

ćelija i površina ćelija leukocita kod životinja tretiranih različitim koncentracijama panklava

kao i kod kontrolne jedinke.

Program ImageJ podržava standardne funkcije obrade slike, ali obezbeđuje i određivanje raznih

morfometrijskih pokazatelja objekta, kao što su površina (area), obim, faktor oblika, i slično.

Može meriti udaljenosti i uglove, dakle daje topološke odnose između označenih objekata, pa

smo ovaj program i upotrebili za određivanje dijametra jedara hepatocita. Programom ImageJ

mogu se obavljati transformacije slika kao što su rotacije i skaliranja. Slika se može povećati

do 32:1, a smanjiti do 1:32. Sve analize i funkcije obrade su dostupne na bilo kojem faktoru

uvećanja (Vasiljević, 2012).

Nakon podešene kalibracije, parametara i jedinice za meru dobijene su sledeće vrednosti

traženih parametara:

Tabela 7. Prečnik ćelija bele loze u perifernoj krvi

Koncentracija Kontrola 25% 50% 75% 100%

Prečnik ćelija

(µm) 6.102±0.864 5.404±0.684 5.540±0.478 5.842±0.824 5.270±0.577

Prečnik ćelija leukocita je najveći kod jedinke kontrola i kreće se 6.102±0.864. Najveći prečnik

je kod kontrole i on iznosi 6.102±0.864 µm, a najmanji prečnik imaju leukociti kod životinja

koje su tretirane koncentracijom od 100% panklava i on iznosi 5.270±0.577 µm. Kod svih

ostalih tretiranih životinja je neznatno manji. Dakle, uticaj panklava dovodi do malih promena

u prečniku ćelija leukocita. Ova promena se može objasniti promenom osmolarnosti i tonicitetu

kako u krvnoj plazmi tako i u samim ćelijama.

33

Grafikon 6. Uticaj razlicitih koncentracija panklava na prečnik ćelija leukocita

Tabela 8. Uticaj različitih koncentracija panklava na prečnik leukocita u perifernoj krvi.




Koncentracija 1.825 4 0.456 0.929 0.473

Error 7.367 15 0.491

Analizom varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na prečnik ćelija leukocita došlo

se do zaključka da nema statističke značajnosti.

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

2

4

6

8

Pre

cn

ik c

elij

a

Tabela 9. Uticaj različitih koncentracija panklava na površinu leukocita u perifernoj krvi. Statistička


Površina ćelija leukocita kod kontrolne jedinke iznosi 29.665±8.228. Kod svih ostalih

koncentracija je manja površina u odnosu na kontrolu, najmanje zabeležena površina je kod

jedinke tretirane sa 100% štok rastvorom i iznosi 21.998±4.788.

Grafikon 7. Uticaj različitih koncentracija panklava na površinu ćelija leukocita

Koncentracija Kontrola 25% 50% 75% 100%

Površina ćelija 29.665±8.228 23.195±5.601 24.225±4.057 27.183±7.58921.998±4.788

Least Squares Means

Kon

trola

25%

50%

75%

100%

Koncentracija

11

18

25

32

39

Po

vrš

ina

ce

lija

35

Tabela 10. Uticaj različitih koncentracija panklava na površinu leukocita u perifernoj krvi.




Koncentracija 156.317 4 39.079 0.997 0.440

Error 588.144 15 39.210

Analizom varijanse uticaja različitih koncentracija panklava na površinu leukocita došlo se do

zaključka da nema statističke značajnosti.

5. Zaključak:

U toku ovog istraživanja, na osnovu dobijenih rezultata, došlo se do sledećih zaključaka:

• Broj limfocita kreće se od 74±28.284 kod kontrolne grupe. Najveći broj limfocita

zapaža se kod jedinke tretirane koncentracijom panklava 50% i kreće se od 141±8.485.

I kod ostalih koncentracija se zapaža povećanje broja limfocita. Analiza varijanse

pokazuje da nema statističke značajnosti.

• Broj bazofila je najviši kod kontolne jedinke I kreće se od 22.5±27.577. Kod svih ostalih

životinja tretiranih različitim koncentracijama panklava je smanjen broj bazofila.

Zaključuje se da različite koncentracije panklava utiču na smanjenje broja bazofila.

Analiza varijanse pokazuje da nema statističke značajnosti.

• Broj eozinofila kod kontrolne grupe kreće se od 4.5±2.121. Kod svih ostalih

koncentracija je manji broj eozinofila, jedino je veći kod koncentracije 25% i kreće se

od 6±1.414. Analiza varijanse pokazuje da nema statističke značajnosti.

• Broj neutrofila kod kontrolne grupe kreće se od 65±42.426. Kod svih tretiranih grupa je

veći broj neutrofila, jedino je neznatno manji broj kod koncentracije od 75% i kreće se

60.5±28.991. Analiza varijanse pokazuje da nema statističke značajnosti.

• Broj monocita kod kontrole kreće se od 10±0. Kod svih tretiranih jedinki zapaža se

opadanje broja monocita. Ovo je jedina grupa leukocita gde postoji statistička

značajnost dobijena analizom varijansi različitih koncentracija panklava.

• Uticaj panklava neznatno utiče na prečnik ćelija leukocita, pokazan je smanjen prečnik

leukocita u odnosu na kontrolnu jedinku.

• Površina ćelija leukocita kod kontrolne jedinke iznosi 29.665±8.228. Uticaj panklava

neznatno utiče na površinu ćelija leukocita, pokazana je smanjena površina leukocita u

odnosu na kontrolnu jedinku.

37

6. Literatura

Andrašević, S,. Vranić-Ladavac, M., Tambić-Andrašević, A., 2009: Osjetljivost

enterobakterija na antibiotike, Zagreb.

Anđelković, Z., et al., 2002: Ćelija i tkiva – Bonafides.

Gauyton, AC., Hall, E.J., 2003: Medicinska fiziologija - Savremena administracija, Beograd.

Grozdanović-Radovanović, J.,2000: Citologija, ZUNS, Beograd.

http://www.biology.iastate.edu/Courses/Leon/212L%20Docs/Using%20ImageJ.pdf

https://www.alims.gov.rs/wp-content/blogs.dir/2/files/lekovi/pil/1153-2008-12.pdf

Jezdimirović, M., Aleksić, N., Milovanović, M., Stojanović, D., Jezdimirović, N., 2013:Uticaj

produžene peroralne primene eugenola na hematološke i neke biohemijske parametre krvi kod

pacova-Veterinarski žurnal Republike Srpske, broj 2, Banja Luka.

Katzung, B., 2004: Basic and clinical pharmacology. - Lange medical book, Ninth edition,

United States.

Labar, B., Hauptman, E. i dr., 2007: Hematologija. - Školska knjiga, poglavlje 24, Zagreb.

Mansour, H., Saad, A., Azar, M., Khouery, P., 2014: Case report, Amoxicilin/Clavulanic Acid

Induced trombocitopenia.

Petrovic, M., Dopsaj, V., & Rajic, M., 2009: Laboratorijska hematologija. – Farmaceutski

fakultet, Drugo dopunjeno izdanje, Beograd.

Rusov, C., 1984: Osnovi hematologije životinja. - Naucna knjiga, Beograd.

Štajn, A., Tikić, R.,1990: Vežbe iz fiziologije životinja - Prirodnomatematićki, Kragujevac

Ten Berg M, Huisman A, Souverein P, et al. Drug-induced thrombocytopenia. Drug Saf.

2006;29:713-721.

Varagić, V., Milošević, M., 2005: Farmakologija - Elita Medica, Beograd

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Драгана Митровић

Ментор, МН: Перица Васиљевић

Наслов рада, НР: Утицај панклава на број леукоцита у периферној крви

пацова соја Вистар

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/цитата/табела/слика/графика/прилога)

38 стр.

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД:

Предметна одредница/Кључне речи, ПО:

УДК

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ:

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије,

КО:

Председник:

Члан: Члан, ментор:

39

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Dragana Mitrović

Mentor, MN: Perica Vasiljević

Title, TI:

Language of text, LT: serbian

Language of abstract, LA: english

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD:

(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

38 p.

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD:

Subject/Key words, S/KW: tortoise

UC

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB:

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

univerzitet u niŠu - pmf.ni.ac.rs · nakon toga su pacovi žrtvovani i uzeta je krv za...

Documents