univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo janja …

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

JANJA BELINC

ANALIZA ZA AROMO POMEMBNIH HLAPNIH SPOJIN V CVETOVIH

HIBISKUSA

ANALYSIS OF VOLATILE COMPOUNDS IMPORTANT FOR THE AROMA

OF HIBISCUS SABDARIFFA

Ljubljana, 2015

Janja Belinc______________________________________________________Diplomsko delo

i

Diplomsko delo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo na Katedri za farmacevtsko

biologijo pod mentorstvom doc. dr. Damjana Janeša, mag. farm.

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mojemu vseživljenjskemu mentorju doc. dr. Damjanu Janešu,

mag. farm., za odlično mentorstvo in veliko mero razumevanja. Zahvala gre tudi

Katedri za farmacevtsko biologijo, ki je z mano delila svoje prostore, čas in ideje ob

nastanku mojega diplomskega dela. Za jezikovno dovršenost slednjega lepa hvala Maji

Kovačič, prof. ang. in slov.

Posebna zahvala gre vsem mojim bližnjim, še posebno Boštjanu, Marku in Damjanu, ki

so mi stali ob strani in me vsesplošno podpirali ter verjeli vame celotno obdobje

študija. Iskrena hvala mami Mariji za požrtvovalnost in skrbnost ter Petru za

vzpodbude in motivacijo.

Za pomoč in lepa študentska leta hvala tudi vsem pedagogom, sošolcem, prijateljem in

vsem novim poznanstvom.

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala samostojno pod mentorstvom doc. dr.

Damjana Janeša, mag. farm.

Janja Belinc

Predsednik komisije: izr. prof. Janez Ilaš, mag. farm.

Članica komisije: asist. dr. Mirjam Gosenca, mag. farm.


ii

KAZALO VSEBINE

POVZETEK ................................................................................................................................... VIII

ABSTRACT ...................................................................................................................................... IX

SEZNAM OKRAJŠAV ...................................................................................................................... X

1 UVOD .......................................................................................................................................... 1

1.1 OPIS RASTLINE IN GEOGRAFSKA OPREDELITEV ..................................................... 1

1.2 FITOKEMIJSKA SESTAVA VENČNIH LISTOV IN SEMEN .......................................... 2

1.2.1 Hlapne spojine venčnih listov ....................................................................................... 2

1.2.2 Nehlapne spojine venčnih listov .................................................................................... 3

1.2.3 Olje iz semen................................................................................................................ 4

1.3 ETNOFARMAKOLOŠKI PREGLED ................................................................................ 4

1.4 FARMAKOLOŠKI PREGLED .......................................................................................... 5

1.4.1 Antioksidativno delovanje ............................................................................................ 5

1.4.2 Diabetes ...................................................................................................................... 5

1.4.3 Hipertenzija ................................................................................................................. 5

1.4.4 Hormonsko delovanje................................................................................................... 5

1.4.5 Lipidemija ................................................................................................................... 6

1.4.6 Metabolni sindrom ....................................................................................................... 6

1.4.7 Urologija ..................................................................................................................... 6

1.4.8 Vnetni procesi .............................................................................................................. 6

1.5 PREHRANSKA UPORABNOST ....................................................................................... 6

1.6 VARNOST IN ODMERJANJE .......................................................................................... 7

1.6.1 Toksikologija ............................................................................................................... 7

1.6.2 Odmerjanje .................................................................................................................. 8

1.7 PLINSKA KROMATOGRAFIJA ...................................................................................... 8

2 NAMEN DELA ......................................................................................................................... 10

3 MATERIALI IN METODE ...................................................................................................... 11

3.1 VZORCI .......................................................................................................................... 11

3.2 REAGENTI ..................................................................................................................... 11

3.2.1 Topila ........................................................................................................................ 11


iii

3.2.2 Referenčne spojine ..................................................................................................... 11

3.3 APARATURE IN LABORATORIJSKA OPREMA ......................................................... 12

3.3.1 Tehtanje vzorcev ........................................................................................................ 12

3.3.2 Kodestilacija .............................................................................................................. 12

3.3.3 Priprava in redčenje referenčne spojine ..................................................................... 12

3.3.4 Raztapljanje in segrevanje referenčne spojine ............................................................ 12

3.3.5 Plinska kromatografija z masnim detektorjem – GC-MS ............................................. 12

3.3.6 Organoleptična analiza .............................................................................................. 12

3.4 METODE ANALIZE HLAPNIH SPOJIN ........................................................................ 13

3.4.1 Razmere kodestilacije................................................................................................. 13

3.4.2 Kromatografske razmere ............................................................................................ 13

4 EKSPERIMENTALNI DEL ..................................................................................................... 14

4.1 KODESTILACIJA ETERIČNEGA OLJA IZ VZORCEV HIBISKUSA ........................... 14

4.1.1 Priprava vzorcev ........................................................................................................ 14

4.1.2 Potek kodestilacije ..................................................................................................... 14

4.2 ANALIZA HLAPNIH SPOJIN IN AROME ..................................................................... 16

4.2.1 Priprava vzorcev ........................................................................................................ 16

4.2.2 Priprava referenčnih spojin ........................................................................................ 16

4.3 POSTOPEK REDČENJA MATIČNE RAZTOPINE ........................................................ 17

4.4 ORGANOLEPTIČNA ANALIZA .................................................................................... 18

4.4.1 Pridobivanje OTV iz virov in izbira spojin za izdelavo raztopin rekonstrukcij.............. 18

4.4.2 Priprava rekonstrukcije .............................................................................................. 19

4.4.3 Priprava poparka ....................................................................................................... 23

4.4.4 Izbira ocenjevalcev .................................................................................................... 23

4.4.5 Potek vonjanja vzorcev............................................................................................... 24

5 REZULTATI IN RAZPRAVA.................................................................................................. 25

5.1 EKSTRAKCIJA ETERIČNEGA OLJA IZ VZORCEV HIBISKUSA ............................... 25

5.1.1 Izbira vzorcev/virov.................................................................................................... 25

5.1.2 Izvedba kodestilacije .................................................................................................. 25

5.2 ANALIZA HLAPNIH SPOJIN ........................................................................................ 26


iv

5.3 ORGANOLEPTIČNA ANALIZA .................................................................................... 34

5.3.1 VZOREC 1: Farmex ................................................................................................... 35

5.3.2 VZOREC 2: Caelo...................................................................................................... 36

5.3.3 VZOREC 3: 1001 cvet ................................................................................................ 37

5.3.4 VZOREC 4: Papaja .................................................................................................... 38

5.3.5 VZOREC 5: Povprečje vseh vzorcev ........................................................................... 39

6 SKLEP ...................................................................................................................................... 40

7 LITERATURA.......................................................................................................................... 41

PRILOGE ......................................................................................................................................... 45


v

KAZALO SLIK

Slika 1: Cvetoči hibiskus (2).................................................................................................................. 1

Slika 2: Rastlinska droga – Hibisci flos (6) ............................................................................................ 2

Slika 3: Aparatura za kodestilacijo (foto: Tomaž Strnišnik) .................................................................. 15

Slika 4: Material za izvedbo kodestilacije in prenos koncentrata v vialo (foto: Tomaž Strnišnik)........... 15

Slika 5: Pripravljene MIX 1 do MIX 5 (foto: Janja Belinc)................................................................... 17

Slika 6: Pripravljanje MIX 1 do MIX 5 (foto: Janja Belinc).................................................................. 17

Slika 7: Spojine z OAV > 100 v destilatih venčnih listov hibiskusa ...................................................... 27


vi

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Postopek redčenja matične raztopine ............................................................................. 18

Preglednica II: Spojine v rekonstruiranem povprečju vseh vzorcev ...................................................... 19

Preglednica III: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij Farmex (H1) ........................................... 20

Preglednica IV: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij Caelo (H2).............................................. 21

Preglednica V: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij 1001 cvet (H3) ......................................... 22

Preglednica VI: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij Papaja (H4) ............................................ 23

Preglednica VII: Hlapne spojine v kodestilatih hibiskusa, potrjene z referenčnimi spojinami (spojine z

OAV > 10 so v krepkem tisku, spojine z OAV > 100 so dodatno označene z zvezdico) ........................ 28

Preglednica VIII: Nepotrjene spojine v kodestilatih hibiskusa (× ‒ prisotnost spojine v vzorcu) ............ 32

Preglednica IX: Vzorci s številom potrjenih in kvantificiranih spojin, nepotrjenih spojin in spojin z

OAV > 10 ........................................................................................................................................... 33

Preglednica X: Vsota koncentracij kvantificiranih spojin za posamezne vzorce .................................... 34


vii

KAZALO GRAFOV

Graf 1: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome vzorca Farmex (H1)............................. 35

Graf 2: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome vzorca Caelo (H2) ............................... 36

Graf 3: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome vzorca 1001 cvet (H3) ......................... 37

Graf 4: Prikaz rezultatov pri vrednotenju ponovne rekonstrukcije arome vzorca Caelo (H2)

namesto Papaja (H4) ........................................................................................................... 38

Graf 5: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome povprečja vseh vzorcev – Farmex

in Caelo (H1 in H2)............................................................................................................. 39


viii

POVZETEK

Aroma hibiskusovih cvetov, natančneje venčnih listov, je kljub priljubljenosti in široki

uporabi te rastlinske droge slabo raziskana. Ključna hlapna spojina, ki je odgovorna za

značilno aromo, je namreč še vedno neznana. V diplomskem delu smo iz venčnih listov

hibiskusa iz štirih različnih virov s postopkom kodestilacije z Likens-Nickersonovo

aparaturo pridobili vzorce eteričnega olja. Analizirali smo jih s plinsko kromatografijo,

sklopljeno z masno spektrometrijo. Celotno smo identificirali 89 spojin, ki jih s

kemijskega vidika uvrščamo med organske kisline, aldehide, ketone, aromatske

aldehide, fenole, alkohole, etre, estre in terpenoide. Z uporabo referenčnih spojin smo

potrdili identiteto 63 spojinam, ki smo jih tudi kvantitativno vrednotili – izračunali

koncentracijo v rastlinski drogi in aktivnost vonja. Med spojinami z najvišjo

aktivnostjo vonja (> 100) so bili: (2E,6Z)-nona-2,6-dienal, (2E,4E)-deka-2,4-dienal,

(2E,4E)-nona-2,4-dienal, evgenol, (2E)-non-2-enal, 1-okten-3-ol, dekanal in

fenilacetaldehid. Na podlagi aktivnosti vonja posameznih spojin smo izvedli

organoleptično analizo, saj nas je zanimalo, katere spojine so odgovorne za tipično

aromo hibiskusa. Ugotovili smo, da 18 spojin v vseh štirih vzorcih pomembno vpliva

na aromo hibiskusa (aktivnost vonja > 10), kljub temu pa nam z rekonstrukcijo arome

in organoleptičnim vrednotenjem ni uspelo ugotoviti spojine ali spojin, ki je oziroma so

odgovorne za tipično aromo hibiskusa. Neuspešnost rekonstrukcije vonja pripisujemo

kompleksni kemijski sestavi hibiskusa in sinergizmu teh spojin, ki ga je zelo težko

rekonstruirati v laboratorijskih razmerah, zlasti če so pomembne spojine, ki jih nismo

identificirali, prisotne v sledovih. Ugotovili smo, da sta rastlinski drogi farmacevtske

kakovosti sicer vsebovali večje število hlapnih spojin, ki pomembno vplivajo na aromo,

kar potrjuje večjo kakovost farmacevtskega materiala, toda če gledamo število in

koncentracijo vseh kvantificiranih hlapnih spojin, razlike niso značilne.

Ključne besede: hibiskus, Hibiscus sabdariffa, aroma, GC-MS


ix

ABSTRACT

Despite popularity and wide use of roselle flowers, more accurately calyces, their

aroma has not been intensively studied and the essential volatile compound, responsible

for the typical aroma, is still unknown. In this diploma thesis, samples of essential oil

from four different sources of roselle calyces were prepared by codistillation employing

Lickens-Nickersen apparatus. Samples were analysed by gas chromatography coupled

with mass spectrometry. In total 89 compounds were identified and classified from a

chemical point of view as organic acids, aldehydes, ketones, aromatic aldehydes,

phenols, alcohols, ethers, esters and terpenoids. Identities of 63 compounds were

confirmed employing reference compounds and quantitatively evaluated – their

concentrations and odour activity values were calculated. Among the compounds with

the highest odour activity values (> 100) were: (2E,6Z)-nona-2,6-dienal, (2E,4E)-deca-

2,4-dienal, (2E,4E)-nona-2,4-dienal, eugenol, (2E)-non-2-enal, 1-octen-3-ol, decanal

and phenylacetaldehyde. Based on odour activity values of individual compounds an

organoleptic analysis was performed to determine which compounds are responsible

for the typical aroma of hibiscus. It was found out that 18 compounds in all four

samples have a significant impact on the aroma of hibiscus (odour activity value > 10).

However, despite the reconstruction of aroma and organoleptic evaluation none of them

was found to be responsible for the typical aroma of roselle. This could be explained

with the complex chemical composition of the roselle and synergism of aroma

compounds, which is very difficult to reconstruct in the laboratory, especially when

unknown but important aroma compounds are present in traces. In the pharmaceutical-

grade roselle calyces there were more volatile compounds important for the aroma,

which confirms higher quality of pharmaceutical-grade material, but there are no great

differences regarding the number and concentration of all quantified volatile

compounds.

Keywords: roselle, Hibiscus sabdariffa, aroma, GC-MS


x

SEZNAM OKRAJŠAV

GC-MS – (angl.: Gas Chromatography – Mass Spectrometry) plinska kromatografija,

sklopljena z masno spektrometrijo

m/z – (angl.: Mass to Charge Ratio) razmerje med maso in nabojem

HDL – (angl.: High Desity Lipoprotein) lipoprotein velike gostote

IL – interlevkin

MCF – (angl.: Michigan Cancer Foundation)

MCP – (angl.: Monocyte chemoattractant protein) monocitni kemoatraktivni protein

LD50 – (angl.: Lethal Dose, 50 %) srednji smrtonosni odmerek

N.A. – (angl.: Not Available) ni na voljo

OAV – (angl.: Odour Activity Value) vrednost aktivnosti vonja

OTV – (angl.: Odour Threshold Value) prag zaznave vonja

ppb – (angl.: Parts per Billion) število delcev na milijardo

ppm – (angl.: Parts per Million) število delcev na milijon

R2 – kvadrat korelacijskega koeficienta

RI – retencijski indeks

SPME – (angl.: Solid Phase Micro Extraction) mikroekstrakcija na trdno fazo

Janja Belinc Diplomsko delo

1

1 UVOD

1.1 OPIS RASTLINE IN GEOGRAFSKA OPREDELITEV

Hibiskus ali oslez (Hibiscus sabdariffa L.) je glede na rastišče enoletnica ali trajni grm, ki

ga uvrščamo v družino slezenovk (Malvaceae) (Slika 1). Izvira iz tropskih in subtropskih

predelov (1). Zraste do višine treh metrov, cveti od avgusta do oktobra, seme zori od

oktobra do novembra. Rastlina je hermafrodit, oprašujejo jo žuželke (2). Cvetovi imajo

rdeče užitne venčne liste izrazito kislega okusa in značilne arome (3). Ime hibiskusovi

cvetovi ni pravilno, saj za pripravo osvežilnih čajev in za obarvanje hrane uporabljamo le

del cveta – venčne liste (1) (Slika 2). Hibiskus v angleško govorečih državah imenujejo

roselle ali red sorrel, v arabskih je znan po imenu carcade ali karkade (4). Poznamo več

kot 300 kultivarjev (sort) hibiskusa, dve ekonomsko najpomembnejši sta 'Kenaf' in

'Roselle'. Danes sta največji pridelovalki hibiskusa Kitajska in Tajska, najkakovostnejša

rastlinska droga pa prihaja iz Sudana (5).

Slika 1: Cvetoči hibiskus (2)


2

Slika 2: Rastlinska droga – Hibisci flos (6)

1.2 FITOKEMIJSKA SESTAVA VENČNIH LISTOV IN SEMEN

V nadaljevanju podajamo pregled raziskav hlapnih in nehlapnih spojin hibiskusa v venčnih

listih in semenih.

1.2.1 Hlapne spojine venčnih listov

Kodestilacija z Likens-Nickersonovo aparaturo. S kodestilacijo so simulirali razmere pri

pripravi poparka hibiskusovih venčnih listov. Uporabili so sveže, zamrznjene, pri 50 °C in

pri 75 °C sušene venčne liste. Destilate so analizirali z GC-MS in identificirali 37 spojin.

Med razgradnimi produkti maščobnih kislin so na primer identificirali (2E)-heks-2-enal,

(2E)-heks-2-en-1-ol, (3Z)-heks-3-en-1-ol in nonanal. Med furanoidi, ki so navadno

razgradni produkti sladkorjev, sta bila najpomembnejša furfural in 5-metilfurfural.

Identificirali so ju v vzorcih sušenega hibiskusa. Vzorec, sušen pri 75 °C, je vseboval

skoraj dvakrat večjo koncentracijo furfurala kot vzorec, sušen pri 50 °C. Najpomembnejši

predstavnik fenolov je bil evgenol, ki je bil v vseh vzorcih v približno enaki koncentraciji.

Med terpenoidi so na primer identificirali 1,8-cineol, α-farnezen, kariofilen, limonen, (E)-

in (Z)-linalooloksid, α-terpineol, α-terpinilacetat, 2-viniltetrahidro-2,6,6-trimetil-2H-piran,

med katerimi so bili v največjih koncentracijah limonen, α-terpineol in linalooloksid.

Največ limonena je bilo v svežem in zamrznjenem hibiskusu, v suhem hibiskusu se je zelo

zmanjšala koncentracija limonena, linalooloksida in α-terpineola. Spojine, odgovorne za

tipično aroma hibiskusa, niso odkrili (3).


3

Kodestilacija z Likens-Nickersonovo aparaturo in termična desorpcija. Primerjali so

sestavo arome hibiskusovega osvežilnega čaja, in sicer so vzorce hlapnih spojin dobili s

kodestilacijo in z adsorpcijo na trdno fazo, ki ji je sledila analiza s termično desorpcijo. Za

pripravo osvežilnega čaja so uporabili sveže hibiskusove cvetove in cvetove, posušene pri

25, 50, 75 in 85 °C. Metodi izolacije sta dali vzorce z zelo različno sestavo. Pri adsorpciji

na trdno fazo so v vzorcih prevladovali terpenoidi (limonen, linalol) in C6-spojine

(heksanal, (2E)-heks-2-enal), v kodestilatih pa furanoidi (furfural), fenoli (evgenol) in

terpenoidi (linalooloksid, α-terpineol). Ugotovili so, da se z višanjem temperature sušenja

zmanjšuje koncentracija C6-spojin (najbolj izrazito (3Z)-heks-3-en-1-ol), terpenoidov (α-

terpineol, α-terpininilacetat), narašča pa koncentracija furfurala. Aktivnosti vonja niso

vrednotili (7).

Mikroekstrakcija na trdno fazo (SPME). Sveže in suhe venčne liste hibiskusa so pripravili

kot macerat (22 °C, 4 h) in poparek (98 °C, 16 min). Hlapne spojine so ekstrahirali z

vlaknom iz plinske faze nad vzorcem in analizirali z GC-MS. V poparku sušenega

hibiskusa so identificirali 28, v maceratu sušenega hibiskusa 25, v poparku svežega

hibiskusa 17 in v maceratu svežega hibiskusa 16 spojin. Med 13-imi spojinami, ki so jih

identificirali v vseh štirih vzorcih, so bili v največjih koncentracijah dekanal, nonanal,

oktanal in 1-okten-3-ol. Geranilaceton je bil prisoten v vseh štirih vzorcih in je bil med

petimi najbolj intenzivnimi komponentami. Furfural in 5-metilfurfural ter

dihidrolinalooloksid A in B so identificirali zgolj v sušenem hibiskusu, linalool in 2-etil-1-

heksanol pa le v svežem hibiskusu. Največji prispevek k aromi sta imela 1-okten-3-on in

nonanal, ki so jima sledili geranilaceton, evgeneol in (2E)-non-2-enal pri poparku suhega

hibiskusa; geranilaceton, (2E)-non-2-enal in neidentificirana spojina pri maceratu suhega

hibiskusa; linalol, geranilaceton in oktanal pri svežem hibiskusu. V sušenih vzorcih je bilo

bistveno več produktov razgradnje lipidov, na primer dekanal, heksanal in nonanal (1).

1.2.2 Nehlapne spojine venčnih listov

Venčni listi hibiskusa vsebujejo do 1,5 % antocianinov, ki jim dajejo intenzivno rdečo

barvo. Izrazit kisel okus je posledica prisotnosti organskih kislin (15 do 30 %), predvsem

hibiskusne (15 do 20 %) in citronske (do 13,5 %) kisline, poleg njiju pa tudi jabolčne,

vinske in oksalne kisline (8,9).


4

1.2.3 Olje iz semen

Ekonomsko najbolj pomembna semena kultivarjev 'Kenaf' in 'Roselle' vsebujejo poleg

ogljikohidratov, proteinov, aminokislin in vlaknin (10) v povprečju 18 % olja. Trigliceride

olja sestavljajo: linolna (45 %), oleinska (25 %), palmitinska (19 %) in stearinska kislina

(4 %) ter nenavadna epoksi maščobna kislina – vernolinska (3,5 %) in ciklopropil

maščobna kislina – dihidrosterulinska (1,6 %) (5). Neumiljivi del predstavljajo tokoferoli

(2000 mg kg-1

) in steroli (Δ5-avenasterol, kampesterol, β-sitosterol) (11).

1.3 ETNOFARMAKOLOŠKI PREGLED

Hibiskusove cvetove uporabljamo zaradi značilne arome in kislega okusa za pripravo

toplih in hladnih osvežilnih napitkov (12), zaradi intenzivne rdeče barve pa tudi za

barvanje živil (2).

Tradicionalno hibiskusove venčne liste obirajo ročno. Za shranjevanje jih zamrznejo ali

posušijo na soncu ali z umetnim virom toplote (13). V ljudski medicini izvlečke venčnih

listov uporabljajo za zdravljenje visokega krvnega tlaka (2, 4, 12), bolezni jeter in

zniževanje povišane telesne temperature (4, 12, 14). Hibiskus se tradicionalno uporablja pri

gastrointestinalnih motnjah (2), uporabljajo ga za zdravljenje ognojkov, žolčnih kamnov,

raka, kašlja, slabotnosti, dispepsije, disurije, alkoholnega mačka, nevroz, hipertenzije,

skorbuta (14) …

Liste uporabljajo proti skorbutu, kot mucilaginozum proti suhemu kašlju, kot diuretik, blag

sedativ in za spodbujanje prebave. Liste in cvetove uporabljajo kot tonik, za pospeševanje

prebave in izboljšanje funkcije jeter. Zrele venčne liste uporabljajo kot diuretik, proti

skorbutu in za blaženje žolčnih napadov. Semena uporabljajo kot diuretik, laksativ in

tonik. Grenko korenino uporabljajo kot aperitiv in tonik (14). V Mehiki napitke iz

hibiskusovih venčnih listov pogosto uporabljajo kot diuretik, za zdravljenje

gastrointestinalnih motenj, motenj delovanja ledvic, zniževanje povišane telesne

temperature, proti hiperholesterolemiji in hipertenziji.

Izvlečki suhih cvetov hibiskusa so popularne sestavine azijske tradicionalne medicine in

jih uporabljajo za zdravljene hipertenzije, motenj delovanja jeter, proti vnetjem in povišani

telesni temperaturi (15).


5

V tropskih krajih je hibiskus cenovno dostopna zdravilna rastlina, ki jo je preprosto gojiti.

Uporabljajo ga kot diuretik, adstringent, za zniževanje telesne temperature, proti skorbutu

in za zniževanje serumskih lipidov (14).

V zahodnoafriški ljudski medicini hibiskus priporočajo kot afrodiziak (2).

1.4 FARMAKOLOŠKI PREGLED

1.4.1 Antioksidativno delovanje

Vodni izvlečki hibiskusa izkazujejo tako in vitro kot in vivo antioksidativno delovanje, ki

temelji zlasti na učinkih flavonoidov – flavonolov in antocianinov (15, 16, 17, 18).

1.4.2 Diabetes

V raziskavi na podganah z diabetesom so pokazali, da izvleček hibiskusa, bogat s

polifenolnimi spojinami, v odmerkih 200 mg kg-1

zmanjša hiperglikemijo,

hiperinzulinemijo, glikacijo proteinov in lipidno peroksidacijo (19).

1.4.3 Hipertenzija

Za antocianina delfinidin-3-O-sambubiozid in cianidin-3-O-sambubiozid so ugotovili, da

delujeta kot zaviralca angiotenzinske konvertaze z IC50 84,5 in 68 µg mL-1

.

V raziskavi na podganah so ugotovili, da vodni izvleček hibiskusa okrepi aktivnost srčne

Na+-K

+-ATPaze in Ca

2+-Mg

2+-ATPaze, kar pojasnjuje kardioprotektivno in kardiotonično

delovanje (20), in da metanolni izvleček hibiskusa sproži vazodilatacijo v izoliranih aortah

(21).

1.4.4 Hormonsko delovanje

Etanolni izvlečki hibiskusa izražajo estrogensko aktivnost v celični kulturi estrogensko

odzivnih celičnih linij raka dojke (MCF-7). Ugotovili so, da to ni posledica zgolj učinkov

kvercitina in daidzeina, ampak je možno, da hibiskus vsebuje še neznane fitoestrogene

(22).


6

1.4.5 Lipidemija

Izvleček hibiskusa je pri podganah zmanjšal koncentracijo serumskih lipidov, povečal

koncentracijo HDL in zmanjšal vsebnost lipidov v hepatocitih (23). Pri modelu debele miši

je vodni izvleček hibiskusa zavrl pridobivanje telesne mase (24).

V klinični študiji o učinkovitosti hibiskusovega čaja za zmanjševanje serumskih lipidov pri

90 hipertenzivnih pacientih je bil učinek na lipidni profil nejasen (25).

V dvojno slepi, s placebom kontrolirani študiji so raziskovali učinek izvlečka hibiskusovih

listov za zmanjšanje koncentracije lipidov v serumu pri Indijancih s hiperlipidemijo. Nivo

serumskega LDL holesterola, nivo trigliceridov in telesna masa so se zmanjšali pri obeh

skupinah, vendar ni bilo nobenih pomembnih razlik med verum in placebo skupino (26).

1.4.6 Metabolni sindrom

Hibiskusna kislina, ki je podobna kot (–)-hidroksicitronski kislini iz garcinije (Garcinia

camboga), zmanjša apetit pri podganah, vendar ne pri človeku. Zelo neverjetno je namreč,

da bi hibiskus povzročil zmanjšanje telesne mase brez zmanjšanja apetita (14).

1.4.7 Urologija

Poskusi na podganah so pokazali, da vodni izvleček hibiskusa lahko zavre nastajanje

oksalatnih ledvičnih kamnov (27), poveča Ca2+

-Mg2+

-ATPazno aktivnost (28) in da imajo

sestavine, kot je kvercitin, učinek na vaskularni endotelij, sprožijo sproščanje dušikovega

oksida, povečajo ledvično vazorelaksacijo in ledvično filtracijo (29).

1.4.8 Vnetni procesi

Z uporabo izvlečka hibiskusa so dokazali učinkovito zaščito kultiviranih perifernih

monocitov proti celični smrti, inducirani s H2O2, in pomembno vlogo v proizvodnji vnetnih

citokinov. In vitro izvleček sproži nastanek IL-6 in IL-8 ter zmanjša koncentracijo MCP-1.

Pri človeku je zaužitje enkratnega odmerka 10 g izvlečka znatno zmanjšalo plazemsko

koncentracijo MCP-1, brez neželenih učinkov in nadaljnjih učinkov na druge citokine (30).

1.5 PREHRANSKA UPORABNOST

Venčne liste hibiskusa v mnogih delih sveta uporabljajo za pripravo hladnih in toplih pijač

(4). Najpogostejši je hibiskusov poparek, ki mu v različnih delih sveta dodajajo različne


7

začimbe, na primer ingver, in sladila (2, 1). Intenzivno rdeče obarvan hibiskusov osvežilni

čaj je na primer ena izmed najbolj popularnih pijač na Tajvanu (7). Hibiskusove cvetove

uporabljamo tudi za obarvanje in aromatiziranje osvežilnih čajev (2). Barvila v hibiskusu

so kemijsko nestabilna (3).

Sveže venčne liste, mlade nežne liste in stebla uporabljajo presne v solatah ali kuhane. Po

kislosti spominja na peclje rabarbare. Venčni listi vsebujejo tudi pektin, zato jih

uporabljajo za izdelavo želejev, marmelad in omak (2, 3). Okus marmelad in želejev s

hibiskusom naj bi bil podoben kisli slivovi marmeladi (1). Prepražena in zmleta semena

uporabljajo v juhah in omakah. Prepražen hibiskus je uporaben tudi kot kavni nadomestek

(2).

1.6 VARNOST IN ODMERJANJE

1.6.1 Toksikologija

Izvlečki hibiskusa imajo zelo nizko akutno toksičnost, LD50 pri podganah je 5000 mg kg-1

(12), v drugi raziskavi so ugotovili, da je LD50 pri podganah 200 mg kg-1

(14).

Pri dolgotrajnem uživanju visokih odmerkov vodnega izvlečka pa so dokazali toksično

delovanje na testise pri podganah (31). Vodni izvleček posušenih venčnih listov je jasno

pokazal spremembo v normalni morfologiji sperme, testistikularni ultrastrukturi in

negativnem vplivu na plodnost pri albino miših (32).

Pri podganah naj bi uživanje vodnega izvlečka hibiskusa (0,6 ali 1,8 g v 100 mL vode za

pitje) med brejostjo povzročilo abnormalno visoko skotitveno maso in kasneje zamik

pubertete. Zmanjševanje apetita je povzročilo slabo prehranjenost matere, kar je vplivalo

na zarodek (14). Uživanje hibiskusa med nosečnostjo znatno zmanjša vnos tekočine in

hrane pri materah, poviša telesno maso, maso ledvic, jeter, srca, vranice, pri potomcih se

pojavi zamuda v začetku pubertete. Mehanizem, ki to povzroča, naj bi bil povezan z

motnjo leptinske signalne poti (33).

V raziskavi na albino podganah so ugotovili, da visoki odmerki izvlečka hibiskusa, ki

ustrezajo 10,000- do 66,000-kratnemu priporočenemu odmerku za človeka (ki je 1 g na

dan (2)), delujejo hepatotoksično in povzročijo mišično distrofijo pri kroničnem vnosu (90

dni). Vodni izvleček je tudi povečal vrednosti serumskega kreatinina. Etanolna izvlečka z

absolutnim in 50-odstotnim (V/V) etanolom sta imela več škodljivih učinkov na funkcijo


8

jetrnih encimov in v nadaljevanju na zvišano vrednost plazemskega kreatinina, vendar se

izmerjeni biokemijski parametri po 7 dneh dajanja niso več spreminjali (16).

Pri zauživanju hibiskusa priporočajo previdnost, saj je meja med neškodljivostjo in

toksičnostjo odmerka manjša, kot je zaželeno, zato so neželeni učinki pri prevelikem

odmerjanju hibiskusa bolj verjetni kot pri večini drugih prehranskih dopolnil. Čeprav niso

nobenega od toksičnih učinkov opazili pri človeku, še ne pomeni, da ni možen (14).

1.6.2 Odmerjanje

Priporočen dnevni odmerek posušenih venčnih listov hibiskusa je 1 g kot poparek 1- do 2-

krat dnevno z razmikom vsaj 8 ur (2).

Kot prehransko dopolnilo priporočajo do 10 mg antocianinov, ki ustrezajo 1 g izvlečka,

standardiziranega na 1 % antocianinov ali 500 mg izvlečka, standardiziranega na 2 %

antocianinov (14).

1.7 PLINSKA KROMATOGRAFIJA

Plinska kromatografija je metoda izbora za separacijsko analizo eteričnih olj in podobnih

rastlinskih izvlečkov, ki vsebujejo hlapne sestavine. Danes navadno uporabljamo

sklopljeno tehniko z masno spektrometrijo (GC-MS), kjer masni spektrometer služi kot

detektor (34). Plinski kromatograf s pomočjo kolone loči posamezne komponente, masni

spektrometer pa da podatke o fragmentih, na osnovi katerih lahko te spojine identificiramo.

Molekule navadno fragmentiramo z elektronsko ionizacijo, pri čemer tok elektronov v

vakuumu povzroči razpad molekul spojine na ionizirane fragmente z določeno maso. Ti

fragmenti potujejo v kvadropolni masni analizator, ki ionizirane fragmente selektivno

usmerja glede na spreminjajoče se elektromagnetno polje. Na računalniku dobimo izpisani

masni spekter, ki je rezultat signalov, značilnih za posamezno spojino. Domnevno

identiteto spojine dobimo s primerjavo izmerjenega masnega spektra z masnimi spektri iz

knjižnice. Verjetnost pravilne identitete lahko izboljšamo z uporabo retencijskih indeksov,

ki jih izračunamo s pomočjo referenčnih spojin serije n-alkanov, in jo na koncu potrdimo

ali ovržemo s primerjavo z referenčnimi spojinami (35).

Združitev plinske kromatografije in masne spektrometrije omogoča kvalitativno in

kvantitativno vrednotenje (36). Prednosti GC-MS so visoka občutljivost, ločljivost in

učinkovitost, uporaba majhne količine vzorca in kratek čas analize (35). Z uporabo GC-MS


9

lahko ugotavljamo kakovost hlapnih kozmetičnih sestavin v procesu proizvodnje

kozmetičnih izdelkov. Za analizo nekaterih eteričnih olj na primer lahko uporabimo

predpisane metode po Evropski farmakopeji, vendar te metode niso aplikativne v vseh

primerih; glede na to, kar želimo vrednotiti, je pa njihova prednost v tem, da validacija

postopka ni nujna (34).

Pri plinski kromatografiji uparjen vzorec potuje s tokom inertnega plina, ki predstavlja

mobilno fazo, skozi kolono s stacionarno fazo (34). Kot nosilni plin najpogosteje

uporabljamo helij, saj je inerten, ima nizko relativno atomsko maso in je nevnetljiv (36).

Čas zadrževanja posamezne spojine iz vzorca v stacionarni fazi je ob konstantnih

parametrih ločbe odvisen od fizikalno-kemijskih lastnosti te spojine. Najpogosteje

uporabljamo kapilarne kolone s stacionarnimi fazami, ki se razlikujejo glede na stopnjo

polarnosti oziroma nepolarnosti, kar je odvisno od kemijske sestave stacionarne faze.

Različno polarne oziroma nepolarne spojine se eluirajo ob različnih, zanje značilnih

retencijskih časih (34). Pri ločbi spojin si pomagamo tudi z nastavitvijo temperature

termostata kolone. Spojine z višjim vreliščem se dlje zadržijo na koloni kot tiste z nižjim

vreliščem (35). Optimalno temperaturo kolone ugotovimo na podlagi naših zahtev ločbe in

temperature vrelišča vzorca (36). Za analizne namene ponavadi uporabljamo kapilarne

kolone z zelo velikim številom teoretskih podov in nizko kapaciteto (34).

Retencijski čas spojine je variabilna spremenljivka, odvisna od kromatografskih

parametrov, kot so vrsta in debelina stacionarne faze ter dolžina kolone, zato pri

vrednotenju spojin uporabljamo retencijski indeks (RI). Retencijski indeks je konstantna,

numerična vrednost, ki jo dobimo z logaritemsko interpolacijo in omogoča pretvorbo

retencijskih časov v neodvisne konstante s pomočjo analize serije referenčnih spojin n-

alkanov:

RI

Pri tem c pomeni število ogljikovih atomov krajšega n-alkana, c+1 število ogljikovih

atomov daljšega n-alkana, t'R retencijski čas n-alkana in (t'R)x retencijski čas neznane

spojine (35).


10

2 NAMEN DELA

Na voljo je zelo malo podatkov o hlapnih spojinah hibiskusa, zlasti slabo raziskano je

področje hlapnih spojin, ki dajejo značilno aromo hibiskusa. V eksperimentalnem delu se

bomo posvetili identifikaciji in kvantifikaciji hlapnih spojin v cvetovih hibiskusa. Eterično

olje hibiskusovih cvetov bomo pridobili s postopkom kodestilacije z Likens-Nickersonovo

aparaturo, s katero bomo simulirali pripravo hibiskusovega osvežilnega čaja. Z analizo

različnih hibiskusovih cvetov različnega porekla bomo preverili morebitne razlike v sestavi

hlapnih spojin. Procesu kodestilacije bo sledila analiza z uporabo plinske kromatografije,

sklopljene z masno spektrometrijo (GC-MS). Identificirali bomo posamezne hlapne

spojine, potrdili njihovo identiteto s primerjavo z referenčnimi spojinami in izmerili

njihovo koncentracijo. Raziskavo bomo nadaljevali s senzorično analizo, ki jo bomo

zasnovali na osnovi aktivnosti vonja posameznih spojin, ki jo bomo izračunali z uporabo

podatkov iz literature o pragu zaznave vonja. Z aktivnostjo vonja namreč vrednotimo

pomembnost prispevka posamezne spojine k skupni aromi. Pripravili bomo rekonstrukcije

arome in jih primerjali s poparkom hibiskusovih cvetov. Poskusili bomo ugotoviti, katera

spojina je značilna za aromo. Predvidevamo, da bomo ugotovili značilne razlike v sestavi

hlapnih spojin v vzorcih hibiskusovih cvetov iz različnih virov in da bomo ugotovili, katera

spojina ali več spojin je pomembnih za tipično aromo hibiskusa.


11

3 MATERIALI IN METODE

3.1 VZORCI

Za analizo smo uporabili vzorce iz različnih virov in nivojev kakovosti.

a) Farmacevtska kakovost:

H1 – Hibisci sabdariffae flos (Farmex, d. o. o., Nova gorica, Solkan, Slovenija,

poreklo: Čile).

H2 – Flores hibisci tot. PH. EUR. 7.0 (Caelo GmbH, Hilden, Nemčija, poreklo:

Čile).

b) Prehrambna kakovost:

H3 – cvetovi hibiskusa, 1001 cvet naravni zeliščni čaj (Žito, d. d., Ljubljana,

Slovenija, poreklo: neznano).

H4 – cvetovi hibiskusa, Hibiskus cvet zeliščni čaj (Papaja, d. o. o., Trbovlje,

Slovenija, poreklo: neznano).

3.2 REAGENTI

3.2.1 Topila

Prečiščena voda (Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Ljubljana),

pentan p. a. (Carlo Erba, Milano, Italija),

absolutni etanol p. a. (Carlo Erba, Milano, Italija).

3.2.2 Referenčne spojine

Uporabili smo referenčne spojine proizvajalcev Sigma-Aldrich (Steinheim, Nemčija),

Fluka (Buchs, Švica) in Merck (Darmstadt, Nemčija). Spojine so bile največje možne

čistote, dostopne na trgu, v večini primerov je bil čistota več kot 99-odstotna.


12

3.3 APARATURE IN LABORATORIJSKA OPREMA

3.3.1 Tehtanje vzorcev

Analizna tehtnica PC 2000 (Mettler, Zürich, Švica),

analizna tehtnica KERN ALS 120-4 (Kern & Sohn GmbH, Balinger, Nemčija).

3.3.2 Kodestilacija

Aparatura Likens-Nickerson (Kefo, Šurlan, Medulin, Hrvaška),

2000 mL buča z okroglim dnom in obrusom,

400 mL čaša,

magnetno mešalo z gretjem in kaloto (Radleys, Shire Hill, Velika Britanija).

3.3.3 Priprava in redčenje referenčne spojine

Avtomatske pipete (10 µL, 100 µL) (Biohit, Helsinki, Finska).

3.3.4 Raztapljanje in segrevanje referenčne spojine

Ultrazvočna kadička SONIS 2GT (Iskra PIO, d. o. o., Šentjernej, Slovenija).

3.3.5 Plinska kromatografija z masnim detektorjem – GC-MS

Sistem: GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska).

Kolona: kapilarna kolona Rxi-5Sil MS, 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm, 5 % fenil/95 %

dimetilpolisiloksan (Restek, Bellefonte, PA, ZDA).

Računalniški program: GMS Solution 2.3 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska),

podatkovna knjižnica: NIST08 in FFNSC 1.3.

3.3.6 Organoleptična analiza

10 mL bučke s plastičnimi pokrovčki,

plastične epruvete s pokrovčki in stojalo za plastične epruvete,

100‒1000 µL pipeta in plastični nastavki,

1000 mL erlenmajerice,

aluminijasta folija,

300 mL čaše.


13

3.4 METODE ANALIZE HLAPNIH SPOJIN

3.4.1 Razmere kodestilacije

Začetna temperatura grelnika, kjer je kalota s poparkom (grelnik 1): 300 °C,

delovna temperatura grelnika 1: 250 °C,

obrati grelnika 1: 0 obrmin-1

,

temperatura grelnika, kjer je čaša z bučko s prstom (grelnik 2): 300 °C ves čas

izvedbe kodestilacije,

obrati grelnika 2: 500 obrmin-1

skozi ves čas izvedbe kodestilacije,

začetna temperatura regulatorja: 60 °C,

delovna temperatura regulatorja: 55 °C,

trajanje kodestilacije: 4 ure.

3.4.2 Kromatografske razmere

Način injiciranja: »split« 1:100,

nosilni plin: helij,

pretok: 1 mL/min,

temperaturni program: 40 °C (5 min), 40 → 250 °C (3 °C/min), 250 °C (5 min),

volumen injiciranja: 1 µL,

temperatura injektorja: 250 °C,

temperatura ionskega izvora: 200 °C,

temperatura vmesnika: 270 °C,

napetost na detektorju: 1 kV,

način ioniziranja: EI,

energija ioniziranja: −70 eV,

razpon snemanja molekulske mase: 35‒500,

frekvenca zajemanja podatkov: 5 s-1

,

celoten čas analize: 80 min.


14

4 EKSPERIMENTALNI DEL

4.1 KODESTILACIJA ETERIČNEGA OLJA IZ VZORCEV HIBISKUSA

4.1.1 Priprava vzorcev

Natehtali smo 100 g rastlinske droge izbranega vira. Pri vzorcu H2 smo zaradi velikosti

venčnih listov rastlinsko drogo predhodno zdrobili na manjše dele s pestilom, da smo jih

vsuli skozi lij v bučo. Nato smo zavreli 1000 mL destilirane vode in jo dodali vzorcu v

buči.

4.1.2 Potek kodestilacije

Uporabili smo 5000-mililitrsko kaloto, katere dno smo predhodno zasuli s peskom in jo

segrevali pri temperaturi 300 °C. V kaloto smo položili bučko s poparkom rastlinske droge

določenega vira. Pesek smo uporabili kot prenosnik toplote, ker nismo imeli manjše kalote,

ki bi se prilegala buči. Višina peska je bila poravnana z gladino poparka rastlinske droge.

Za hlajenje smo uporabili po meri narejeno Likens-Nickersonovo aparaturo, ki smo jo

povezali z bučo. Na drugo stran aparature smo pritrdili bučko s prstom, ki je služila

uparevanju pentana in zbiranju destilata. Bučko s prstom smo potopili v čašo z destilirano

vodo in vanjo postavili magnetno mešalo in termometer, ki je s povezanim regulatorjem

temperature zagotavljal konstantno temperaturo 60 °C, tako da je pentan konstantno vrel.

Temperaturo grelne plošče, na kateri je bila postavljena 400-mililitrska časa in pritrjen del

hladilnika z bučko s prstom, smo nastavili na 300 °C in 500 obrmin-1

. V hladilnik Likens-

Nickersonove aparature smo začeli dovajati vodovodno vodo za hlajenje. V koleno

aparature smo dodali destilirano vodo in nato toliko pentana, da je dopolnil koleno in

polovico bučke s prstom (Slika 3). Ko je zmes v buči zavrela, smo temperaturo kalote

zmanjšali na 250 °C, regulator temperature za segrevanje pentana pa smo nastavili na

55 °C. Pomembno je bilo, da je pentan zavrel pred vodo, da voda ni prehajala v bučko s

prstom. Destilacijo smo izvajali 4 ure, nato smo odstranili bučko s prstom, odparili pentan

do oznake 1 mL in raztopino prenesli v vialo za GC-MS analizo (Slika 4). Kodestilacijo

smo naredili 8-krat: 4 vzorci v 2 paralelah.


15

Slika 3: Aparatura za kodestilacijo (foto: Tomaž Strnišnik)

Slika 4: Material za izvedbo kodestilacije in prenos koncentrata v vialo (foto: Tomaž Strnišnik)


16

4.2 ANALIZA HLAPNIH SPOJIN IN AROME

4.2.1 Priprava vzorcev

Posebna predpriprava vzorcev za GC-MS analizo ni bila potrebna, injicirali smo 1 µL

raztopine.

4.2.2 Priprava referenčnih spojin

Priprava zmesi referenčnih spojin je temeljila na domnevno identificiranih spojinah na

osnovi primerjave s knjižnico masnih spektrov v vzorcih. V 10-mililitrsko bučko smo

natehtali 5,00 mg vsake trdne spojine oziroma odpipetirali ekvivalent volumna tekočih

spojin, preračunan s pomočjo relativne gostote. Podatke o gostosti posameznih spojin smo

pridobili z ovojnine ali spletnih strani proizvajalcev. Bučko smo nato s pentanom dopolnili

do oznake, jo dobro premešali in za kratek čas položili v ultrazvočno kadičko. S

postopkom mešanja in s pomočjo ultrazvočne kadičke smo zagotovili popolno raztapljanje

referenčnih spojin. Matično raztopino MIX 1 s koncentracijo 500 ppm smo nato redčili

tako, da smo dobili raztopine referenčnih spojin z naslednjimi koncentracijami (Slika 5 in

Slika 6):

MIX 2 = 250 ppm,

MIX 3 = 100 ppm,

MIX 4 = 50,0 ppm,

MIX 5 = 10,0 ppm.

Vse referenčne raztopine smo analizirali na GC-MS in izračunali umeritvene premice. Za

vse spojine je bila vrednost R2 večja od 0,99. Primer umeritvene premice je v prilogi.


17

Slika 5: Pripravljene MIX 1 do MIX 5 (foto: Janja Belinc)

Slika 6: Pripravljanje MIX 1 do MIX 5 (foto: Janja Belinc)

4.3 POSTOPEK REDČENJA MATIČNE RAZTOPINE

Matična raztopina = MIX 1: 5,00 mg/10,0 mL = 500 ppm. Postopek prikazuje Preglednica

I.


18

Preglednica I: Postopek redčenja matične raztopine

VRSTNI

RED

REDČ.

VOL.

BUČKE

[mL]

VOL.

MIX 1

[mL]

VOL.

MIX 3

[mL]

VOL.

PENTANA

[mL, do

oznake]

RAZM.

REDČ.

NOVA

KONC.

[ppm]

IME

1 10,0 5,00 - 5,00 1:2 250 MIX 2

2 10,0 2,00 - 8,00 1:5 100 MIX 3

3 10,0 1,00 - 5,00 1:2 50,0 MIX 4

4 10,0 - 1,00 9,00 1:10 10,0 MIX 5

4.4 ORGANOLEPTIČNA ANALIZA

4.4.1 Pridobivanje OTV iz virov in izbira spojin za izdelavo raztopin rekonstrukcij

Za vsako z GC-MS identificirano spojino smo v literaturi (37, 38) poiskali podatek o

vrednosti praga zaznave vonja (OTV) in nato s pomočjo izmerjenih koncentracij izračunali

aktivnost vonja (OAV) po naslednji formuli:

OAV = c/OTV

Pomen posameznih vrednosti v formuli je naslednji:

c = koncentracija,

OAV = angl. Odour Activity Value,

OTV = Odour Treshold Value v enoti ppb (»parts per billion«) ali ppm (»parts per

million«).

OTV vrednost je ugotovljena eksperimentalno in je odvisna od medija, pomeni pa

minimalno vrednost, ki jo uspemo prepoznati. OTV vrednosti smo poiskali s pomočjo dveh

literaturnih virov. Pri izračunih smo upoštevali vrednosti OTV, ugotovljene v vodi. Kjer je

bil podan interval večvrednosti, smo izračunali povprečen OTV.

Za organoleptično analizo smo izbrali spojine z vrednostjo OAV večjo od 10, saj te

značilno prispevajo k izrazitem vonju, zavedati pa se moramo, da je v zmeseh možen vpliv

sinergije ali supresije (39).


19

4.4.2 Priprava rekonstrukcije

Pripravili smo etanolne raztopine referenčnih spojin, katerih koncentracije so bile

1000-krat višje od izmerjenih v vzorcih hibiskusa. Izbrali smo spojine, ki imajo aktivnost

vonja večjo od 10 (Preglednica II do Preglednica VI). Te raztopine smo nato 1000-krat

redčili z vodo, da smo dobili raztopine z enakimi koncentracijami spojin kot v rastlinski

drogi: 500 µL posamezne raztopine rekonstrukcije smo odpipetirali v 1000-mililitrsko

erlenmajerico, napolnjeno s 500 mL destilirane vode, premešali in pokrili z aluminijasto

folijo. To pomeni, da je bila količina hlapnih spojin v rekonstrukciji predvidoma enaka

količini, ki se je sprostila iz rastlinske droge v poparku. Erlenmajerice smo oštevilčili, da

prostovoljcem nismo dajali uporabnih podatkov o vrsti vzorca, ki bi vplival na izvedbo

analize. Pred testiranjem smo erlenmajerico odkrili, premešali in povonjali ter primerjali s

poparkom.

Preglednica II: Spojine v rekonstruiranem povprečju vseh vzorcev

SPOJINA OAV V [µL]

(2E,6Z)-nona-2,6-dienal 21209 2,20

(2E,4E)-deka-2,4-dienal 4608 4,10

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 1680 3,70

evgenol 1155 27,1

(2E)-non-2-enal 840 6,90

1-okten-3-ol 147 2,70

dekanal 129 4,70

fenilacetaldehid 98 5,80

3-metilbutanal 55 0,800

nonanal 51 4,90

2-pentilfuran 37 2,50

p-krezol 35 3,50 mg

p-cimen 34 2,00

4-vinilgvajakol 33 6,20 mg


evkaliptol 24 1,20

1-heksanol 22 1,50

2-metoksi-4-metilfenol 19 5,30

karvon 16 4,50

(2E)-heks-2-enal 14 3,10

(2E)-okt-2-en-1-ol 13 3,10

pentanal 12 1,80

estragol 11 1,80

anetol 11 7,90


20

Preglednica III: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij Farmex (H1)

SPOJINA OAV V [µL]

(2E,4E)-deka-2,4-dienal 4509 4,00

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 1692 3,70

evgenol 958 22,4

(2E)-non-2-enal 919 7,50

dekanal 137 5,00

1-okten-3-ol 136 2,50



p-krezol 45 4,50 mg

nonanal 43 4,10



evkaliptol 38 1,90

p-cimen 35 2,10

1-heksanol 29 2,00


karvon 22 6,30


anetol 20 14,6

(2E,4E)-hepta-2,4-dienal 16 3,10

metilsalicilat 13 4,60

(2E)-okt-2-en-1-ol 12 2,90

(2E)-heks-2-enal 12 2,70

pentanal 11 1,60

estragol 10 1,70


21

Preglednica IV: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij Caelo (H2)

SPOJINA OAV V [µL]

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 29346 3,10

(2E,4E)-deka-2,4-dienal 4668 4,10

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 1705 3,80

evgenol 1012 23,7

(2E)-non-2-enal 950 7,80

1-okten-3-ol 183 3,30

dekanal 134 4,80


nonanal 71 6,90


p-krezol 45 4,50 mg


p-cimen 38 2,20

evkaliptol 37 1,80

1-heksanol 32 2,20




estragol 18 2,90

(2E,4E)-hepta-2,4-dienal 16 3,10

(2E)-heks-2-enal 16 3,70

pentanal 15 2,20

karvon 15 4,10

(2E)-okt-2-en-1-ol 14 3,30

anetol 12 8,90

(2E)-hept-2-enal 12 5,40


22

Preglednica V: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij 1001 cvet (H3)

SPOJINA OAV V [µL]

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 28687 3,00

(2E,4E)-deka-2,4-dienal 4672 4,10

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 1663 3,70

evgenol 1598 37,4

(2E)-non-2-enal 834 98,6

1-okten-3-ol 140 2,50

dekanal 127 4,60



nonanal 56 5,40

p-krezol 51 5,10 mg


p-cimen 34 2,00




karvon 15 4,10

(2E)-heks-2-enal 14 3,10

(2E)-okt-2-en-1-ol 14 3,20


pentanal 12 1,80

estragol 11 1,90


23

Preglednica VI: Spojine v rekonstruiranem vzorcu povprečij Papaja (H4)

SPOJINA OAV V [µL]

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 26802 2,80

(2E,4E)-deka-2,4-dienal 4583 4,10

(2E,4E)-nona-2,4-dienal 1662 3,70

evgenol 1052 24,6

(2E)-non-2-enal 656 5,30

1-okten-3-ol 129 2,30

dekanal 118 4,30



nonanal 33 3,20



p-cimen 30 1,70

1-heksanol 28 1,90


evkaliptol 20 1,00


(2E)-okt-2-en-1-ol 14 3,30

(2E)-heks-2-enal 13 2,90

karvon 12 3,50


pentanal 10 1,50

4.4.3 Priprava poparka

V 300-mililitrske čaše smo natehtali 25 g rastlinske droge ter jo prelili z 250 mL prekuhane

vrele destilirane vode. Čaše smo takoj po dodatku prekuhane vrele destilirane vode pokrili

z aluminijasto folijo in jih ohladili na sobno temperaturo.

4.4.4 Izbira ocenjevalcev

Za sodelovanje pri organoleptični analizi smo prosili sodelavce na Katedri za farmacevtsko

biologijo Fakultete za farmacijo. Med desetimi prostovoljci so bili profesorji, asistenti,

strokovni sodelavci in mladi raziskovalci, ki so imeli predhodne izkušnje v podobnih

organoleptičnih analizah in za katere smo domnevali, da so sposobni točno razlikovati in


24

opredeliti vonje. Prostovoljce smo seznanili z namenom raziskave in po njihovi privolitvi

za sodelovanje začeli s pripravami na izvedbo organoleptične analize.

4.4.5 Potek vonjanja vzorcev

Organoleptično analizo smo izvedli v študentskem laboratoriju na Katedri za farmacevtsko

biologijo. Izvedba organoleptične analize je zahtevala predpripravo prostora in potrebne

opreme ter vzorcev. Prostor izvedbe smo pred začetkom analize dobro prezračili tako, da

smo odprli vsa okna, istočasno pa je potekalo notranje ventilatorsko kroženje zraka v

laboratoriju. Temperatura v laboratoriju je bila ves čas 23 °C. Na delovno površino

(laboratorijski pult) smo postavili ustrezno označene vzorce tako, da je bil prvi vzorec

vonjanja originalni poparek, pripravljen iz hibiskusa točno določenega vira. Prvi

erlenmajerici je sledila pripadajoča rekonstrukcija arome, pripravljena iz referenčnih

spojin. Prostovoljcem smo podali navodila za potek dela in jim razdelili anketne

vprašalnike (v prilogi). V anketne vprašalnike so prostovoljci ob vsaki vonjalni izkušnji

sproti vpisali ocenjeno podobnost rekonstrukcije s poparkom, torej z originalnim vonjem,

prijetnost rekonstruiranega vonja ter morebitne asociacije ob vonjanju rekonstrukcije

arome. Posamezni prostovoljec je povonjal vseh 5 rekonstruiranih vzorcev in jih primerjal

z originalnim vonjem. Med vonjanjem posameznega vzorca je bila minuta premora. Na

takšen način smo prišli do 10 različnih rezultatov za vsak rekonstruiran vzorec. Lestvica

ocenjevanja je bila od 1 do 5, pri čemer je ocena 1 pri podobnosti rekonstrukcije z

originalom pomenila najmanj podobno, ocena 5 pa najbolj podobno originalnemu vonju

poparka. Po enaki ocenjevalni lestvici smo ocenili prijetnost rekonstruiranega vonja, kjer je

ocena 1 pomenila neprijetnost vonja, ocena 5 pa zelo prijeten vonj. Odločili smo se, da

bomo anketi dodali kriterij asociacij, saj je vonj načeloma lažje oceniti preko spominskih

povezav, ki pridejo na plan ob vonjanju določenih vzorcev. V kolikor asociacije ni bilo

mogoče priklicati, so polje pustili prazno.


25

5 REZULTATI IN RAZPRAVA

5.1 EKSTRAKCIJA ETERIČNEGA OLJA IZ VZORCEV HIBISKUSA

5.1.1 Izbira vzorcev/virov

Odločili smo se izbrati vzorce različnih kakovostnih razredov. Predvidevali smo, da so

prehrambni vzorci slabše kakovosti od farmacevtskih vzorcev rastlinske droge hibiskusa.

Domnevo je potrdila tudi senzorična ocena kupljene rastlinske droge. Farmacevtski

proizvodi so imeli izrazitejši vonj, bili so manj razdrobljeni in temnejše barve. Na podlagi

senzorične ocene vzorcev smo sklepali, da bodo kakovostnejši proizvodi vsebovali večjo

koncentracijo in več različnih spojin, ki prispevajo k aromi.

5.1.2 Izvedba kodestilacije

Z metodo kodestilacije smo simulirali pripravo hibiskusovega osvežilnega čaja in hkrati

pridobili eterično olje hibiskusa, ki smo ga analizirali z GC-MS. Pri kodestilaciji v Likens-

Nickersonovi aparaturi hkrati potekata destilacija in ekstrakcija. Prednost te aparature v

primerjavi s Clevenegerjevo je ta, da ekstrakcijsko topilo kroži v vzpostavljenem sistemu

in kondenzirana voda ne teče skozi topilo, kar pomeni, da v končnem koncentratu

zajamemo tudi bolj hidrofilne spojine, ki se tekom postopka zbirajo v koncentracijskem

prstu in se ne spirajo s kontinuiranim tokom vode.

Za bučo smo se odločili, ker ohranja tesen stik s celotno grelno površino in omogoča

enakomerno segrevanje vsebine. Zaradi omejitve laboratorijskega materiala (prevelika

kalota) smo morali proces prilagoditi z dodajanjem peska kot prevodnika toplote, s katerim

smo zasuli vmesni prostor med 2-litrsko bučko in 5-litrsko kaloto. Temperaturo grelnika, s

katerim smo segrevali bučko s poparkom hibiskusove droge, smo na začetku nastavili na

300 °C. Za to temperaturo smo se odločili, saj je bilo treba čim prej segreti tudi pesek v

kaloti. Ko se je celoten sistem segrel in smo opazili vretje vsebine bučke, smo temperaturo

zmanjšali na 250 °C in jo vzdrževali skozi celoten proces kodestilacije.

V procesu destilacije smo s kodestilacijo hlapnih spojin hibiskusa in pentana pridobili

raztopino eteričnega olja v pentanu. Za uporabljeno ekstrakcijsko topilo pentan smo se

odločili zaradi njegovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Ima namreč nizko vrelišče (približno

36 °C), kar je ugodno z vidika stabilnosti spojin med kodestilacijo, v postopku


26

koncentriranja vzorca pa ga hitro odparimo, ne da bi prišlo do prevelike izgube drugih

hlapnih spojin.

Uhajanje in kondenziranje vodnega destilata v cev aparature s pentanom smo preprečili z

ovijanjem z aluminijasto folijo, ki je preprečila izgubo toplote, s čimer smo zagotavljali

enakomerno prehajanje parne faze pentana v hladilnik.

Temperaturo grelnika, s katerim smo segrevali pentan, smo na začetku nastavili na 60 °C,

saj je bilo pomembno, da pentan zavre pred poparkom hibiskusove droge. V kolikor bi

popravek zavrel pred pentanom, bi voda na vrhu hladilnika kondenzirala v pentan. Ko je

pentan zavrel, smo temperaturo znižali na 55 °C, da je ohranjala konstantno vretje pentana

skozi celoten proces kodestilacije.

Za zbiranje eteričnega olja v pentanu smo izbrali bučko s prstom, saj so v prstu prisotne

minimalne turbulence, ki omogočajo dobro koncentriranje vzorca. Zaradi konstantnega

sprotnega izparevanja, kondenziranja pentana in njegovega ločevanja v stiku z vodo v

kraku hladilnika je bila dejanska temperatura vode v čaši okrog vrelišča pentana. Na stiku

hladilnika in bučke s prstom smo uporabili teflonsko srajčko, ki je preprečila sprijemanje

dveh površin, uhajanje hlapnega pentana pa smo preprečili z ovojem parafilma na tem

stiku.

Odparevanje ekstrakcijskega topila je potekalo preprosto, saj smo imeli na prstu v bučki

označen volumen 1 mL, do katerega smo po končanem procesu kodestilacije pentan

odparili. Pri prenosu raztopin smo uporabljali stekleno pipeto zaradi inertnosti stekla v

primerjavi s plastiko, ki bi zaradi primesi lahko motile analizo GC-MS. Za pravilen prenos

z minimalno izgubo vzorca smo poskrbeli z izenačevanjem tlakov v pipeti, in sicer tako, da

smo koncentrat večkrat potisnili skozi cev pipete.

5.2 ANALIZA HLAPNIH SPOJIN

Linearnost odziva in pravilnost identifikacije s spektralnimi knjižnicami smo preverili z

referenčnim spojinami. Pri analizi vseh vzorcev hibiskusa, pripravljenih iz različnih virov,

smo v celoti identificirali 89 spojin. Z referenčnimi spojinami smo potrdili in kvantificirali

63 spojin. Slika 7 prikazuje strukturne formule spojin, ki imajo aktivnost vonja večjo od

100. Za izračun koncentracij smo uporabili površine pod krivuljo v kromatogramih

različnih vzorcev in pripadajočih referenčnih spojinah ter koncentracije referenčnih spojin.

Zaradi postopkov destilacije in koncentriranja smo morali ugotovljene koncentracije


27

preračunati na koncentracije teh spojin v rastlinski drogi. Destilirali smo 100 g rastlinske

droge in spojine skoncentrirali v 1 mL, torej so bile koncentracije spojin v rastlinski drogi

100-krat nižje (Preglednica VII), drugih 26 spojin od 89 identificiranih pa nam ni uspelo

potrditi z referenčnimi spojinami (Preglednica VIII).

Slika 7: Spojine z OAV > 100 v destilatih venčnih listov hibiskusa


28

Preglednica VII: Hlapne spojine v kodestilatih hibiskusa, potrjene z referenčnimi spojinami (spojine z OAV > 10 so v krepkem tisku, spojine z

OAV > 100 so dodatno označene z zvezdico)

IME SPOJINE RI

izm.

RI

knjiž.

OTV

[ppm]

H1

[ppm]

OAV

H1

H2

[ppm]

OAV

H2

H3

[ppm]

OAV

H3

H4

[ppm]

OAV

H4

POVP.

VSEH

VZOR.

[ppm]

RSD

[%]

POVP.

OAV

3-metilbutanal 647 664 0,0012 0,0673 56 0,0655 55 0,0741 62 0,0565 47 0,0658 11,0 55

2-metilbutanal 657 662 0,0044 0,111 25 0,122 28 0,127 29 0,0914 21 0,113 14,0 26

pentanal 697 696 0,012 0,132 11 0,178 15 0,146 12 0,125 10 0,145 16,2 12

toluen 759 763 0,527 0,0248 0,0471 0,0229 0,044 0,0197 0,0374 0,0222 0,0420 0,0224 9,41 0,0425

2-metildihidrofuran-3(2H)-on 805 806 - 0,155 - 0,171 - 0,185 - 0,147 - 0,165 10,3 -

furfural 827 845 9,562 62,4 6,53 53,9 5,63 53,9 5,64 45,2 4,73 53,9 13,0 5,63

heks-(2E)-enal 849 850 0,0192 0,229 11,9 0,313 16,3 0,264 13,8 0,244 12,7 0,262 14,0 13,7

α-angelikalakton 861 864 - 1,25 - 0 - 1,54 - 0,633 - 0,854 80,2 -

1-heksanol 867 867 0,0056 0,165 30 0,179 32 0 0 0,156 28 0,125 67,1 22

2-acetilfuran 905 913 10 0,298 0,030 0,314 0,031 0,326 0,033 0,260 0,026 0,299 9,61 0,03

kamfen 946 953 1,92 0 0 0 0 0,0538 0,0280 0,101 0,0526 0,0387 126 0,0201

(2E)-hept-2-enal 954 956 0,04 0,316 8 0,466 12 0,3245 8 0,312 8 0,354 21,0 9

5-metilfurfural 957 960 1,11 4,44 4 2,16 1,94 3,14 2,83 1,53 1,38 2,82 45,0 2,54

geranioloksid 968 968 - 0,0911 - 0,108 - 0 - 0,0806 - 0,0699 68,6 -

1-okten-3-ol* 980 978 0,0015 0,205 136 0,275 183 0,209 140 0,193 129 0,220 16,8 147

6-metilhept-5-en-2-on 983 995 0,068 0 0 0,154 2,3 0,174 2,6 0,193 2,8 0,130 67,9 1,9

2-pentilfuran 989 991 0,006 0,232 39 0,24 40 0,224 37 0,185 31 0,220 11,1 37

oktanal 1002 1006 0,069 0,170 2,5 0,213 3,1 0,193 2,8 0 0 0,144 67,8 2,1


29

IME SPOJINE RI

izm.

RI

knjiž.

OTV

[ppm]

H1

[ppm]

OAV

H1

H2

[ppm]

OAV

H2

H3

[ppm]

OAV

H3

H4

[ppm]

OAV

H4

POVP.

VSEH

VZOR.

[ppm]

RSD

[%]

POVP.

OAV

Δ3-karen 1006 1009 2,03 0 0 0 0 0,170 0,0822 0 0 0,0417 204 0,0206

(2E,4E)-hept-2,4-dienal 1009 1013 0,0154 0,248 16,1 0,254 16,5 0 0 0 0 0,126 115 8,15

1,4-cineol 1013 1017 - 0,233 - 0,258 - 0 - 0,211 - 0,176 67,4 -

α-terpinen 1015 1018 - 0,235 - 0,204 - 0 - 0 - 0,110 116 -

p-cimen 1023 1025 0,00501 0,177 35,2 0,193 38,5 0,170 33,9 0,150 29,8 0,172 10,4 34,4

limonen 1028 1030 0,2 0,179 0,9 0,153 0,8 0,268 1 0,206 1 0,202 24,4 1

1,8-cineol 1030 1032 0,0046 0,176 38 0,171 37 0 0 0,0916 20 0,110 75,2 24

fenilacetaldehid 1039 1045 0,0063 0,638 101 0,813 129 0,623 99 0,407 65 0,620 26,8 98

(2E)-okt-2-en-1-ol 1067 1067 0,02 0,241 12 0,274 14 0,272 14 0,275 14 0,265 6,18 13

(Z)-linalooloksid 1069 1069 0,1 0,355 4 0,703 7 0,771 8 0,532 5 0,590 31,6 6

p-krezol 1073 1072 0,01 0,452 45 0,451 45 0,507 51 0 0 0,353 67,0 35

fenhon 1085 1090 0,44 0,141 0,32 0,207 0,47 0 0 0,148 0,34 0,124 70,8 0,28

nonanal 1103 1107 0,008 0,341 43 0,571 71 0,446 56 0,265 33 0,405 32,8 51

2-feniletanol 1108 1113 0,39 0,400 1 0,378 0,99 0,382 0,98 0,381 0,98 0,385 2,59 0,99

kafra 1143 1149 4,6 0,292 0,064 0,483 0,11 0 0 0,265 0,058 0,260 76,4 0,057

(2E,6Z)-nona-2,6-dienal* 1151 1153 9,10×10-6 0 0 0,267 29346 0,261 28687 0,244 26802 0,193 66,6 21209

menton 1153 1158 0,35 0,342 0,98 0,273 0,78 0,265 0,78 0,176 0,5 0,264 25,8 0,75

(2E)-non-2-enal* 1158 1163 0,00069 0,634 919 0,656 950 0,576 834 0,453 656 0,580 15,7 840

1-nonanol 1171 1176 0,0455 0 0 0 0 0 0 0,419 9,21 0,105 200 2,3

terpinen-4-ol 1178 1180 1,24 0,309 0,249 0,273 0,220 0,254 0,204 0,260 0,210 0,274 8,99 0,221

2-metoksi-4-metilfenol 1186 1190 0,03 0,596 20 0,575 19 0,630 21 0,533 18 0,583 6,96 19


30

IME SPOJINE RI

izm.

RI

knjiž.

OTV

[ppm]

H1

[ppm]

OAV

H1

H2

[ppm]

OAV

H2

H3

[ppm]

OAV

H3

H4

[ppm]

OAV

H4

POVP.

VSEH

VZOR.

[ppm]

RSD

[%]

POVP.

OAV

metilsalicilat 1189 1192 0,04 0,540 13 0 0 0,516 13 0,495 12 0,388 66,8 10

α-terpineol 1193 1195 1,2 0,447 0,37 0,317 0,26 0,4187 0,35 0,392 0,33 0,394 14,2 0,33

estragol 1196 1201 0,016 0,161 10 0,284 18 0,180 11 0,0832 5,2 0,177 46,7 11

dekanal* 1205 1208 0,003 0,412 137 0,402 134 0,38 127 0,354 118 0,387 6,65 129

(2E,4E)-nona-2,4-dienal* 1213 1218 0,00019 0,322 1692 0,324 1705 0,316 1663 0,316 1662 0,319 1,29 1680

karvon 1241 1246 0,027 0,600 22 0,396 15 0,396 15 0,334 12 0,431 26,9 16

piperiton 1250 1267 0,68 0,0333 0,049 0,0042 0,0062 0,0031 0,0046 0,00285 0,0042 0,0109 137 0,016

(2E)-dec-2-enal 1261 1265 0,1335 0,476 3,56 0,482 3,61 0 0 0,461 3,45 0,354 66,9 2,66

(E)-cinamaldehid 1268 1273 0,75 0,532 0,71 0,526 0,70 0 0 0,528 0,70 0,396 66,8 0,53

(E)-anetol 1284 1288 0,073 1,45 20 0,878 12 0,315 4,3 0,476 6,5 0,778 65,0 11

timol 1289 1293 1,7 0,675 0,40 0,421 0,25 0,412 0,24 0,426 0,25 0,483 26,5 0,28

karvakrol 1297 1300 2,29 0 0 0 0 0,364 0,159 0,364 0,159 0,182 116 0,0795

4-vinilgvajakol 1307 1309 0,019 0,731 39 0,585 31 0,581 31 0,587 31 0,621 11,8 33

(2E,4E)-deka-2,4-dienal* 1316 1322 7,7×10-5 0,347 4509 0,360 4668 0,360 4672 0,3523 4583 0,355 1,79 4608

evgenol* 1349 1357 0,0025 2,40 958 2,53 1012 3,99 1598 2,63 1052 2,89 25,6 1155

p-acetonilanisole 1378 1384 1,8 0,357 0,20 0,353 0,20 0 0 0,359 0,20 0,267 66,7 0,15

metilevgenol 1397 1403 4,6375 0,404 0,0871 0,351 0,0757 0 0 0 0 0,189 116 0,0407

kariofilen 1419 1424 0,064 0,341 5,3 0,460 7,2 0,372 5,8 0,138 2,2 0,328 41,5 5,1

miristicin 1517 1520 0,088 0,799 9,1 0,477 5,4 0 0 0,493 5,6 0,442 74,7 5,0

benzilbenzoat 1763 1772 0,341 0,411 1,20 0,416 1,22 0,416 1,22 0,419 1,23 0,415 0,799 1,22

metilpalmitat 1924 1927 2 0,901 0,5 0,754 0,4 1,49 0,7 0,789 0,4 0,984 34,9 0,5


31

IME SPOJINE RI

izm.

RI

knjiž.

OTV

[ppm]

H1

[ppm]

OAV

H1

H2

[ppm]

OAV

H2

H3

[ppm]

OAV

H3

H4

[ppm]

OAV

H4

POVP.

VSEH

VZOR.

[ppm]

RSD

[%]

POVP.

OAV

palmitinska kislina 1959 1960 - 74,3 - 128 - 152 - 44,2 - 99,7 49,4 -

metillinolat 2089 2093 - 1,51 - 1,07 - 2,11 - 1,21 - 1,48 31,2 -

metil-α-linolenat 2095 2098 - 2,14 - 1,98 - 2,55 - 2,06 - 2,18 11,6 -


32

Preglednica VIII: Nepotrjene spojine v kodestilatih hibiskusa (× ‒ prisotnost spojine v vzorcu)

IME SPOJINE RI

izmer.

RI

knjiž.

OTV

[ppm] H1 (1) H1 (2) H2 (1) H2 (2) H3 (1) H3 (2) H4 (1) H4 (2)

dehidrolinalooloksid 1003 1006 -

×

terpinolen 1083 1086 0,2

×

(E)-linalooloksid 1084 1086 0,19

×

izomenton 1162 1166 -

×

β-terpineol 1164 1149 -

×

×

×

neomentol 1175 1170 1,05 × × ×

×

× ×

γ-terpineol 1197 1200 - × ×

× × × × ×

(8Z)-undec-8-enal 1362 1365 - × × × × × ×

×

nerilaceton 1445 1428 -

× × ×

(E)-β-farnezen 1451 1452 0,087

×

α-humulen 1452 1454 0,16

×

×

masojalakton 1467 1474 - × ×

× ×

α-kurkumen 1479 1480 - × × × × ×

× ×

valencen 1493 1492 - ×

β-selinen 1493 1492 0,001 ×

×

β-bisabolen 1506 1508 - × × × ×

kesan 1526 1533 - ×

α-kalakoren 1538 1544 - × ×

kariofilenalkohol 1572 1578 -

×

×

dilapiol 1614 1621 - × ×

epi-γ-evdezmol 1628 1624 -

×

bisabololoksid B 1652 1655 4,5005 ×

×

×

2-pentadekanon 1694 1697 -

×

izopropilmiristat 1822 1826 -

×

×

fiton 1840 1841 -

× × × × × × ×

izofitol 1945 1947 -

×

× × ×

×


33

Od 63 kvantificiranih spojin je bilo 41 spojin prisotnih v vseh vzorcih. Med spojinami z

najvišjo aktivnostjo vonja (OAV > 100) so: (2E,6Z)-nona-2,6-dienal, (2E,4E)-deka-2,4-

dienal, (2E,4E)-nona-2,4-dienal, evgenol, (2E)-non-2-enal, 1-okten-3-ol, dekanal in

fenilacetaldehid. Na osnovi analize hlapnih spojin smo potrdili hipotezo, da je

najkakovostnejša rastlinska droga farmacevtskega izvora H2, vendar razlike pri

pomembnih spojinah za aromo niso velike, saj je zelo podobna vzorcu hibiskusa

prehrambne kakovosti H3 (Preglednica IX). Med posameznimi izbranimi viri ni bilo

bistvenega odstopanja v številu in koncentraciji spojin (Preglednica IX). Pri komercialno

dostopnejšem viru H4 in farmacevtskem viru H2 smo kvantitativno identificirali celo

enako število spojin, vendar se seštevka njunih koncentracij razlikujeta, vzorec H4 je imel

približno dvakrat nižjo skupno koncentracijo kvantificiranih spojin. Večjo veljavo kot

seštevek koncentracij ima število spojin z OAV > 10 zaradi večjega vpliva na aromo.

Vzorca farmacevtske rastlinske droge H1 in H2 imata več takšnih spojin. Razlika se je

pojavila tudi pri številu spojin z OAV > 10, kjer je bilo pri farmacevtskih virih H1 in H2

identificiranih več spojin v primerjavi s komercialnima viroma H3 in H4. Sklepamo, da so

spojine, ki naj bi bile odgovorne za značilno aromo hibiskusa, prav tiste, ki so posušeni

drogi farmacevtskih virov dajale močnejši vonj v primerjavi s komercialnimi viri. Število

nepotrjenih, kvalitativno ovrednotenih spojin je najvišje pri obeh farmacevtskih virih

(H1 - 18 in H2 - 17), pri komercialnih virih pa je bilo takšnih spojin 10.

Preglednica IX: Vzorci s številom potrjenih in kvantificiranih spojin, nepotrjenih spojin in spojin z

OAV > 10

Vzorec Št. potrjenih in kvantificiranih spojin Št. nepotrjenih spojin Št. spojin z

OAV > 10

H1 49 18 25

H2 50 17 26

H3 44 10 22

H4 50 10 22


34

Preglednica X: Vsota koncentracij kvantificiranih spojin za posamezne vzorce

VZOREC

VSOTA KONCENTRACIJ

KVANTIFICIRANIH SPOJIN

[ppm]

H1 16660

H2 20752

H3 23386

H4 11197

Možna razlaga za večje število potrjenih in nepotrjenih spojin v farmacevtskih virih je v

bolj primernih razmerah za gojenje, sušenje, shranjevanje in transport rastlinske droge.

5.3 ORGANOLEPTIČNA ANALIZA

Po GC-MS analizi smo dobili kromatogram in koncentracije spojin v kodestilatih, ki pa ne

dajo ustreznih podatkov o spojinah, ki dajejo značilno aromo. Tudi vrednosti OAV so zgolj

informativne in ne predstavljajo pravega vpogleda spojin na vpliv arome pripravka, saj je

pri aromi vedno pomemben tudi princip sinergije. Spojina ima torej lahko OAV večji od

10, vendar ni nujno, da bistveno vpliva na aromo, zato smo se odločili za izvedbo

organoleptične analize, s katero lahko vrednotimo vpliv posamezne spojine v kombinaciji z

drugimi spojinami v zmesi.

Grafi Graf 1 do Graf 5 prikazujejo število prostovoljcev, ki so s posamezno oceno ocenili

podobnost vonja rekonstrukcije poparka z vonjem originalnega poparka. Na lestvici 1

pomeni najmanj podobno oziroma najmanj prijetno in 5 najbolj podobno oziroma najbolj

prijetno.


35

5.3.1 VZOREC 1: Farmex

Graf 1: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome vzorca Farmex (H1)

V vzorcu poparka H1, ki smo ga pripravili iz vira Farmex, smo potrdili 25 spojin z OAV

vrednostjo nad 10. To pomeni, da je 25 spojin od skupno 49 kvantitativno identificiranih

spojin pomembno prispevalo k značilni aromi rekonstrukcije vonja vzorca H1, torej 51 %

kvantificiranih spojin. Rezultati vrednotenja podobnosti so bili naslednji: prostovoljci so s

povprečno oceno 1,4 ovrednotili rekonstrukcijo arome vzorca H1 za najmanj podobno

originalu, torej poparku (Graf 1).

Najmanj podoben vzorec H1 se je s povprečno oceno 1,9 izkazal za neprijetnega (Graf 1).

Asociacije, ki so jih prostovoljci doživljali ob vonjanju vzorcev, so bile: »moker les,

narcise, gnoj z malo janeža, seno, hlevski sintetični smrad, lupina citrusov, evkalipt.«

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8

Oce

na

vzo

rca

(1-5

)

Število posameznih ocen (maks. 10)

Vrednotenje rekonstrukcije arome vzorca 1

Podobnost

Prijetnost


36

5.3.2 VZOREC 2: Caelo

Graf 2: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome vzorca Caelo (H2)

V vzorcu poparka H2, ki smo ga pripravili iz vira Caelo, smo potrdili 26 spojin z OAV

vrednostjo nad 10. To je največje število spojin z OAV > 10 v vseh vzorcih H1‒H4. 26

spojin od skupno 50 kvantificiranih spojin je pomembno prispevalo k značilni aromi

rekonstrukcije vonja vzorca H2, torej 52 % vseh kvantificiranih spojin. Prostovoljci so

podobnost vzorca H2 ocenili s povprečno oceno 1,6, kar nakazuje na slabo podobnost s

poparkom (Graf 2).

Prijetnost rekonstrukcije vzorca H2 so prostovoljci ocenili s povprečno oceno 2, kar

pomeni, da je vzorec manj primeren (Graf 2). Asociacije, ki so jih ob analizi doživljali

prostovoljci, so bile: »vino, krizantema, gnoj, rdeča pesa s citrusi, hlevski sintetični smrad,

lupina citrusov, sadje, cvet, citrusi.«

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6

Oce

na

vzo

rca

(1-5

)



Podobnost

Prijetnost


37

5.3.3 VZOREC 3: 1001 cvet

Graf 3: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome vzorca 1001 cvet (H3)

V vzorcu poparka H3, ki smo ga pripravili iz vira 1001 cvet, smo potrdili 22 spojin z OAV

vrednostjo nad 10. 22 spojin od skupno 44 kvantificiranih spojin je pomembno prispevalo

k značilni aromi rekonstrukcije vonja vzorca H3, torej 50 % vseh kvantificiranih spojin

(Graf 3).

Povprečna ocena podobnosti vzorca H3 je bila 1,8, kar je najvišja ocena podobnost i pri

vzorcih H1‒H4. Najboljšo rekonstrukcijo arome nam je torej uspelo dobiti pri vzorcu H3,

ki pa so ga prostovoljci s povprečno oceno 1,5 označili za najmanj prijetno (Graf 3).

Vonjave, ki so jih navajali pri opisu rekonstrukcije, so bile: »borovnica, rože, gnoj, hlevski

vonj, hlevski sintetični smrad, lupina citrusov, kislo zelje.«

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8

Oce

na

vzo

rca

(1-5

)



Podobnost

Prijetnost


38

5.3.4 VZOREC 4: Papaja

Graf 4: Prikaz rezultatov pri vrednotenju ponovne rekonstrukcije arome vzorca Caelo (H2)

namesto Papaja (H4)

Vzorec poparka H4 smo pripravili iz vira Caelo namesto Papaje, saj smo želeli preveriti,

ali bomo dobili primerljive rezultate z vzorcem H2, kjer je bila res uporabljena droga

Caelo. 45 % vseh kvantificiranih spojin pri viru Papaja pomembno prispeva k značilni

aromi vzorca. Potrdili smo 22 spojin z OAV vrednostjo nad 10. 22 spojin od skupno 50

kvantificiranih spojin je pomembno prispevalo k značilni aromi rekonstrukcije vonja

vzorca vira Papaje (Graf 4).

Pri preverjanju podobnosti smo dobili povprečno oceno 1,7, kar se za le 0,1 razlikuje od

vzorca H2, kjer je bila zares uporabljena ta rastlinska droga. Tudi pri prijetnosti smo dobili

povprečno oceno 2,2, kar se le za 0,2 razlikuje od ocene prijetnosti pri vzorcu H2 (Graf 4).

Z drogo vira Caelo pri vzorcu H4 nam je torej uspelo dobiti najvišjo oceno prijetnosti

vzorca. Po ocenah prostovoljcev vzorec H2 med vzorci H1 do H4 velja torej za najbolj

prijetnega med neprijetnimi. Dodali bi, da glede na majhna odstopanja ocen prostovoljcev

pri ocenjevanju vzorcev H2 in H4 veljata vzorca H2 in H4 za najbolj prijetna med

neprijetnimi, saj smo ju pripravili iz istega vira, le da tega prostovoljci niso vedeli. To

dejstvo, da prostovoljci dejansko niso vedeli, da ocenjujejo ista vzorca, pa so ju kljub temu

ocenili zelo podobno, pomeni večjo verodostojnost rezultatov. Asociacije, ki so se pri

prostovoljcih pojavljale, so bile: »moker les, pasji kožuh in narcise, gnoj, sladki koren,

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6

Oce

na

vzo

rca

(1-5

)



Podobnost

Prijetnost


39

mokra stara krpa, lupina citrusov, limona, narcise.« Asociacije vzorca H2 in H4 so bile

relativno podobne.

5.3.5 VZOREC 5: Povprečje vseh vzorcev

Graf 5: Prikaz rezultatov pri vrednotenju rekonstrukcije arome

povprečja vseh vzorcev – Farmex in Caelo (H1 in H2)

Prostovoljci so najprej povonjali povprečje vseh vzorcev, nato pa še rekonstrukcijo, ki je

bila pripravljena iz čajev Farmex (H1) in Caelo (H2). Povprečje vseh vzorcev so

predstavljale spojine s povprečjem OAV > 10, ki smo ga izračunali iz vrednosti OAV v

posameznih vzorcih. Teh spojin je bilo 23. Podobnost vonja rekonstrukcije v primerjavi s

povprečjem vseh vzorcev je bila ocenjena z nizko povprečno oceno 1,4 od možne najvišje

ocene 5. To pomeni, da si vonja nista bila podobna. Povprečna ocena prijetnosti

rekonstrukcije pa je bila ocenjena z 2,2 od možne najvišje ocene 5, kar predstavlja

neprijeten vonj (Graf 5). Zapisane asociacije pri vonjanju povprečja vseh vzorcev so bile

naslednje: »leseni sod, narcise, gnoj, sladki koren, hlevski sintetični smrad, lupina citrusov,

sadje, citrusi.«

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6

Oce

na

vzo

rca

(1-5

)



Podobnost

Prijetnost


40

6 SKLEP

S kodestilacijo venčnih listov hibiskusa smo uspešno pridobili eterično olje hibiskusa.

Skupno smo v 4 vzorcih rastlinske droge iz različnih virov identificirali 89 spojin, od

katerih smo 63 spojinam (71 %) potrdili identiteto z referenčnimi spojinami in jih

kvantitativno vrednotili, kar je približno dvakrat več kot v primerljivih objavljenih

raziskavah. S kemijskega vidika identificirane spojine uvrščamo med organske kisline,

ketone, aldehide, aromatske aldehide, estre, etre, fenole, alkohole in terpenoide. Med

spojinami z najvišjo aktivnostjo vonja so bili: (2E,6Z)-nona-2,6-dienal, (2E,4E)-deka-2,4-

dienal, (2E,4E)-nona-2,4-dienal, evgenol, (2E)-non-2-enal, 1-okten-3-ol, dekanal in

fenilacetaldehid. Potrdimo lahko hipotezo, da sta farmacevtski rastlinski drogi višje

kakovosti v primerjavi s prehrambnima, če upoštevamo za aromo pomembne spojine z

aktivnostjo vonja večjo od 10, vendar razlike niso velike, če gledamo število in

koncentracijo vseh hlapnih spojin. Devet od skupno desetih najpomembnejših spojin se

pojavlja v vseh vzorcih farmacevtskih virov, kar govori o podobnosti profila pomembnih

aromatičnih spojin. Organoleptična analiza rekonstrukcij arome s spojinami, ki imajo

aktivnost vonja, ni potrdila, da daje katera koli izmed spojin značilno aromo hibiskusa.

Predvidevamo, da je za značilno aromo odgovorna spojina ali več spojin, ki jih nismo

identificirali, možno je tudi, da je ta spojina ali da so te spojine prisotne v zelo nizki

koncentraciji, zato je smiselno narediti nadaljnje raziskave arome hibiskusa z uporabo GC-

olfaktometrije.


41

7 LITERATURA

1. Ramírez-Rodrigues MM, Balaban MO, Marshall MR, Rouseff RL: Hot and Cold

Water Infusion Aroma Profiles of Hibiscus sabdariffa: Fresh Compared with Dried.

J Food Sci 2011; 76(2): 212‒7.

2. Hibiscus sabdariffa Roselle PFAF Plant Database (http://www.pfaf.org/user

/Plant.aspx?LatinName=Hibiscus+sabdariffa, dostop 6. 5. 2015).

3. Chen SH, Huang TC, Ho CT, Tsai PJ: Extraction, Analysis, and Study on the

Volatiles in Roselle Tea. J Agric Food Chem 1998; 46: 1101‒5.

4. Mozaffari-Khosravi H, Jalali-Khanabadi BA, Afkhami-Ardekani M, Fatehi F,

Noori-Shadkam M: The effects of sour tea (Hibiscus sabdariffa) on hypertension in

patients with type II diabetes. J Hum Hypertens 2009; 23(1): 48‒54.

5. Wang ML, Morris B, Tonnis B, Davis J, Pederson GA: Assessment of Oil Content

and Fatty Acid Composition Variability in Two Economically Important Hibiscus

Species. J Agric Food Chem 2012; 60(26): 6620‒6.

6. Hibiscus sabdariffa dried (https://commons.wikimedia.org/wiki

/File:Hibiscus_sabdariffa_dried.jpg, dostop 14. 5. 2015).

7. Tsai PJ, Huang TC, Chen SH, Ho CT: Thermally Generated Volatiles in Roselle

Tea. Flavor Chemistry of Ethnic Foods 1999; 185‒95.

8. Liberti L, Brown D, Flaster T, Lessing C, Sutherland J, Tims M: Roselle. The

Review of Natural Products (Eds. DerMarderosian A, Beutler JA) 2004.

9. Hiller K, Löw D: Hibisci sabdariffae flos. (Ed. Wichtl M) 2009; 344‒345.

10. Jirovetz L, Jäger W, Remberg G, Espinosa-Gonzales J, Morales R, Woidich A,

Nikiforov A: Analysis of the Volatiles in the Seed Oil of Hibiscus sabdariffa

(Malvaceae) by Means of GCMS and GCFTIR. J Agric Food Chem 1992; 40:

1186‒7.

11. Mohamed R, Fernández J, Pineda M, Aguilar M: Roselle (Hibiscus sabdariffa)

Seed Oil Is a Rich Source of γ-Tocopherol. J Food Sci 2007; 72(3): S207‒11.

12. Ali HB, Al Wabel N, Blunden G: Phytochemical, Pharmacological and

Toxicological Aspects of Hibiscus sabdariffa L: A Review. Phytother Res 2005;

19(5): 369‒75.

13. Ramírez-Rodrigues MM, Plaza ML, Azeredo A, Balaban MO, Marshall MR:

Phytochemical, sensory attributes and aroma stability of dense phase carbon


42

dioxide processed Hibiscuss sabdariffa beverage during storage. Food Chem 2012;

134: 1425‒31.

14. Hibiscus sabdariffa – Scientific Review on Usage, Dosage, Side Effects

(http://examine.com/supplements/Hibiscus%20sabdariffa, dostop 14. 5. 2015).

15. Frank T, Netzel G, Kammerer DR, Carle R, Kler A, Kriesl E, Bitsch I, Bitsch R,

Netzel M: Consumption of Hibiscus sabdariffa L. aqueous extract and its impact on

systemic antioxidant potential in healthy subjects. J Sci Food Agric 2012; 92(10):

2207‒18.

16. Fakeye TO, Pal A, Bawankule DU, Yadav NP, Khanuja SP: Toxic Effects of Oral

Administration of Extracts of Dried Calyx of Hibiscus sabdariffa Linn.

(Malvaceae). Phytother Res 2009; 23(3): 412‒6.

17. Fernández-Arroyo S, Herranz-López M, Beltrán-Debón R, Borrás-Linares I,

Barrajón-Catalán E, Joven J, Fernández-Gutiérrez A, Segura-Carretero A, Micol V:

Bioavailability study of a polyphenol-enriched extract from Hibiscus sabdariffa in

rats and associated antioxidant status. Mol Nutr Food Res 2012; 56(10): 1590‒5.

18. Farombi EO, Ige OO: Hypolidemic and antioxidant effects of ethanolic extract

from dried calyx of Hibiscus sabdariffa in alloxan-induced diabetic rats. Fundam

Clin Pharmacol 2007; 21(6): 601‒9.

19. Peng CH, Chyau CC, Chan KC, Chan TH, Wang CJ, Huang CN: Hibiscus

sabdariffa Polyphenolic Extract Inhibits Hyperglycemia, Hyperlipidemia, and

Glycation-Oxidative Stress while Improving Insulin Resistance. J Agric Food

Chem 2011; 59(18): 9901‒9.

20. Olatunji LA. Adebayo JO. Adesokan AA. Olatunji VA. Soladoye OA: Chronic

administration of Aqueous Extract of Hibiscus sabdariffa Enhances Na+-K

+-

ATPase and Ca2+

-Mg2+

-ATPase Activities of Rat Heart. Pharm Biol 2005; 44:

213-6.

21. Ajay M, Chai HJ, Mustafa AM, Gilani AH, Mustafa MR: Mechanism of the anti-

hypertensive effect of Hibiscus sabdariffa L. calyces. J Ethnopharmacol 2007;

109(3): 388‒93.

22. Saeed IA, Ali L, Jabeen A, Khasawneh M, Rizvi TA, Ashraf SS: Estrogenic

Activities of Ten Medicinal Herbs from the Middle East. J Chromatogr Sci 2013;

51(1): 33‒9.


43

23. Yang MY, Peng CH, Chan KC, Yang YS, Huang CN, Wang CJ: The

Hypolipidemic Effect of Hibiscus sabdariffa Polyphenols via Inhibiting

Lipogenesis and Promoting Hepatic Lipid Clearance. J Agric Food Chem 2010;

58(2): 850‒9.

24. Alarcon-Aguilar FJ, Zamilpa A, Perez-Garcia MD, Almanza-Perez JC, Romero-

Nuñez E, Campos-Sepulveda EA, Vazquez-Carrillo LI, Roman-Ramos R: Effect of

Hibiscus sabdariffa on obesity in MSG mice. J Ethnopharmacol 2007; 114(1):

66‒71.

25. Mohagheghi A, Maghsoud S, Khashayar P, Ghazi-Khansari M: The Effect of

Hibiscus Sabdariffa on Lipid Profile, Creatinine, and Serum Electrolytes: A

Randomized Clinical Trial. ISRN Gastroenterology 2011; 2011:976019.

26. Kuriyan R, Kumar DR, Rajendran R, Kurpad AV: An evaluation of the

hypolipidemic effect of an extract of Hibiscus Sabdariffa leaves in hyperlipidemic

Indians: a double blind, placebo controlled trial. BMC Complement Altern Med

2010; 10:27.

27. Laikangbam R, Damayanti Devi M: Inhibition of calcium oxalate crystal deposition

on kidneys of urolithiatic rats by Hibiscus sabdariffa L. extract. Urol Res 2012;

40(3): 211‒8.

28. Olatunji LA, Usman TO, Adebayo JO, Olatunji VA: Effects of aqueous extract of

Hibiscus sabdariffa on renal Na+-K

+-ATPase and Ca

2+-Mg

2+-ATPase activities in

Winstar rats. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao 2012; 10(9): 1049‒55.

29. Alarcón-Alonso J, Zamilpa A, Aguilar FA, Herrera-Ruiz M, Tortoriello J, Jimenez-

Ferrer E: Pharmacological characterization of the diuretic effect of Hibiscus

sabdariffa Linn (Malvaceae) extract. J Ethnopharmacol 2012; 139(3): 751‒6.

30. Beltrán-Debón R, Alonso-Villaverde C, Aragonès G, Rodríguez-Medina I, Rull A,

Micol V, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A, Camps J, Joven J: The

aqueous extract of Hibiscus sabdariffa calices modulates the production of

monocyte chemoattractant protein1 in humans. Phytomedicine 2010; 17(34):

186-91.

31. Orisakwe OE, Husaini DC, Afonne OJ: Testicular effects of sub-chronic

administration of Hibiscus sabdariffa calyx aqueous extract in rats. Reprod Toxicol

2004; 18(2): 295‒8.


44

32. Mahmoud YI: Effect of extract of Hibiscus on the ultrastructure of the testis in

adult mice. Acta Histochem 2012; 114(4): 342‒8.

33. Iyare EE, Adegoke OA: Body Mass Index at onset of Puberty in Rats Exposed to

Aqueous Extract of Hibiscus Sabdariffa in Utero. Pakistan J Nutrition 2008; 7(1):

98‒101.

34. Ilaš J, Žakelj S: Instrumentalna analiza v kozmetiki, Fakulteta za farmacijo,

Ljubljana, 2013: 37‒9, 53‒4.

35. Hübschmann HJ: Handbook of GC/MS: Fundamentals and applications, Second

edition, WILEY-CH Verlag GmBh / Co. KgaA, Weinheim, 2009: 150.

36. Skoog DA, Holler FJ, Crouch SR: Principles of instrumental analysis, 6th Edition,

Belmont, 2007: 281‒302.

37. Gemert L. I.: Odour thresholds. Oliemans Punter & Partners. The Netherlands,

2011.

38. Burdock G. A.: Fenaroli's Handbook of Flavor Ingredients, 6th Ed. CRC Press,

ZDA 2010.

39. Xiaofen Du, Chad E. Finn, Michael C. Qian: Volatile composition and odour-

activity of thornless 'Black Diamond' and 'Marion' blackberries. Food Chemistry,

2009.


45

PRILOGE

Priloga 1: Primer kromatograma (H1)


46

Priloga 2: Primer umeritvene premice (1,8-cineol)

Priloga 3: Vprašalnik za organoleptično vrednotenje

Organoleptična analiza: HIBISKUS

1. Povonjajte POPAREK

2. Povonjajte REKONSTRUKCIJO

3. Ocenite:

Vzorec 1 Vzorec 2 Vzorec 3 Vzorec 4 Vzorec 5

Podobnost z originalnim vzorcem

(od 1 do 5, pri čemer je 1 najmanj podobno in 5 najbolj)

Prijetnost

(od 1 do 5, pri čemer je 1 najmanj prijetno in 5 najbolj)

Asociacije

(z eno besedo opišite, na kaj vas spominja vonj)

univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo janja …

Documents