univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo · chromatography (non-dhplc) and have determined...

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

GREGOR JUG

VPLIV delAGG V ITROU 6 GEA GSTM3 A MIERALO KOSTO GOSTOTO

IMPACT OF ITRO 6 delAGG I GSTM3 GEE O BOE MIERAL

DESITY

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2009

Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, v

laboratorijih Katedre za klinino biokemijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Janje Marc,

mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom Simone Jurkovi Mlakar, mag. farm.

Meritve mineralne kostne gostote so opravili na Kliniki za endokrinologijo in bolezni

presnove v Univerzitetnem klininem centru v Ljubljani, v Sploni bolninici Celje in v

Ambulanti za osteoporozo Zdravilia Dolenjske toplice. Meritve koncentracije

biokemijskih kazalcev kostne remodelacije so opravili na Kliniki za nuklearno medicino

Univerzitetnega klininega centra v Ljubljani. Sekvenno analizo so opravili v podjetju

MWG Biotech, Ebersberg, Nemija.

Zahvaljujem se mentorici, izr. prof. dr. Janji Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in

somentorici Simoni Jurkovi Mlakar, mag. farm. za tevilne strokovne nasvete in pomo

pri izdelavi diplomske naloge. Za vso pomo in praktine nasvete se prav tako zahvaljujem

vsem ostalim zaposlenim na Katedri za klinino biokemijo, Fakultete za farmacijo

Univerze v Ljubljani. Zahvaljujem se tudi druini in prijateljem za pomo in podporo v

asu tudija.

Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom izr. prof. dr. Janje

Marc, mag. farm., spec. med. biokem.

Gregor Jug

Ljubljana, februar 2009

Predsednik komisije: prof. dr. Danijel Kikelj

lanica komisije: izr. prof. dr. Saa Baumgartner

i

KAZALO VSEBIE

KAZALO VSEBINE ........................................................................................................................... i

POVZETEK / ABSTRACT............................................................................................................... iii

SEZNAM OKRAJAV ..................................................................................................................... iv

SEZNAM PREGLEDNIC, SLIK IN GRAFOV ................................................................................ v

1 UVOD ......................................................................................................................................... 1

1.1 KOSTNINA........................................................................................................................ 1

1.1.1 ZGRADBA KOSTI .................................................................................................... 1

1.1.2 REMODELACIJA KOSTI ......................................................................................... 2

1.2 OSTEOPOROZA ............................................................................................................... 3

1.2.1 PREVALENCA .......................................................................................................... 5

1.2.2 ETIOPATOGENEZA ................................................................................................. 6

1.2.3 DIAGNOSTIKA ......................................................................................................... 6

1.2.4 ZDRAVLJENJE ......................................................................................................... 8

1.3 OSTEOPOROZA IN OKSIDATIVNI STRES .................................................................. 9

1.3.1 OKSIDATIVNI STRES IN ANTIOKSIDATIVNI ENCIMI .................................... 9

1.3.2 VPLIV OKSIDATIVNEGA STRESA NA RAZVOJ OSTEOPOROZE ................ 10

1.3.3 GLUTATION S-TRANSFERAZE .......................................................................... 12

2 NAMEN DELA ........................................................................................................................ 18

3 MATERIALI IN METODE ..................................................................................................... 19

3.1 OPIS PREISKOVANCEV ............................................................................................... 19

3.2 OPIS VZORCEV DNA .................................................................................................... 21

3.3 VERINA REAKCIJA S POLIMERAZO ...................................................................... 21

3.3.1 POMNOEVANJE ODSEKA DNA ....................................................................... 22

3.3.2 REAGENTI IN OPREMA ....................................................................................... 27

ii

3.4 DENATURACIJSKA TEKOINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOLJIVOSTI 29

3.4.1 PRIPRAVA MIKROTITRSKE PLOE ................................................................ 31

3.4.2 PRIPRAVA APARATURE DHPLC ZA ANALIZO .............................................. 32

3.4.3 POTEK ANALIZE ................................................................................................... 32

3.4.4 REAGENTI IN OPREMA ....................................................................................... 33

3.5 SEKVENNA ANALIZA ............................................................................................... 34

3.5.1 PRIPRAVA VZORCEV ........................................................................................... 34

3.5.2 IZVEDBA SEKVENNE ANALIZE ...................................................................... 35

3.6 STATISTINE METODE ............................................................................................... 36

4 REZULTATI IN RAZPRAVA................................................................................................. 37

4.1 OPTIMIZACIJA POGOJEV VERINE REAKCIJE S POLIMERAZO ........................ 37

4.2 OPTIMIZACIJA POGOJEV ANALIZE Z METODO DHPLC IN REZULTATI ANALIZE ..................................................................................................................................... 40

4.2.1 GENOTIPIZACIJA VZORCEV .............................................................................. 41

4.2.2 PONOVLJIVOST ANALIZE .................................................................................. 44

4.3 SEKVENNA ANALIZA ............................................................................................... 45

4.4 KLININI POMEN delAGG V GENU GSTM3 ............................................................. 46

4.4.1 POGOSTOST delAGG PRI SLOVENCIH .............................................................. 47

4.4.2 VPLIV delAGG NA MINERALNO KOSTNO GOSTOTO ................................... 49

4.4.3 VPLIV delAGG NA KONCENTRACIJO BIOKEMIJSKIH KAZALCEV KOSTNE REMODELACIJE .................................................................................................................... 52

5 SKLEP ...................................................................................................................................... 54

6 LITERATURA ......................................................................................................................... 55

7 PRILOGE ................................................................................................................................. 61

7.1 PRILOGA 1: REZULTATI GENOTIPIZACIJE ............................................................. 61

7.2 PRILOGA 2: REZULTATI STATISTINE ANALIZE ................................................. 63

iii

POVZETEK / ABSTRACT

VPLIV delAGG V ITROU 6 GEA GSTM3 A MIERALO KOSTO GOSTOTO

Glutation S-transferaza M3 je pomemben antioksidativni encim v lovekem telesu. V stanju oksidativnega stresa iti telo pred negativnimi uinki reaktivnih kisikovih spojin. Eden izmed teh uinkov je tudi zmanjana mineralna kostna gostota, ki lahko privede do pojava osteoporoze. V okviru diplomske naloge smo na vzorcih 400 preiskovancev, 284 ensk in 116 mokih, doloili pogostost delAGG v intronu 6 gena GSTM3, nato pa smo ocenili tudi klinini pomen polimorfizma. Z verino reakcijo s polimerazo (PCR) smo pomnoili elene odseke DNA. Produktom smo nato, po predhodni optimizaciji metode, doloili dolino s pomojo nedenaturacijske tekoinske kromatografije visoke loljivosti (ne-DHPLC). PCR produkti z delecijo so kraji in so se eluirali hitreje, kakor PCR produkti, kjer delecija ni bila prisotna. Ugotovili smo, da ima genotip +/+ 72 %, genotip -/+ 26,2 % , genotip -/- pa 1,8 % preiskovancev. Genotipi so porazdeljeni v skladu s Hardy-Weinbergovim ravnotejem. S statistinimi testi smo pri skupini pomenopavznih ensk ugotovili statistino signifikantno povezanost med delAGG in zmanjano mineralno kostno gostoto vratu stegnenice (p = 0,026) in ledvenih vretenc (p = 0,033). Prav tako smo pri skupini pomenopavznih ensk ugotovili statistino signifikantno povezanost med polimorfizmom in koncentracijo liganda receptorja za aktivacijo jedrnega faktorja kappa-B (RANKL; p = 0,024). Smiselno bi bilo ponoviti raziskavo na vejem tevilu preiskovancev in obenem skuati razjasniti mehanizem vpliva polimorfizma na zmanjanje mineralne kostne gostote.

IMPACT OF ITRO 6 delAGG I GSTM3 GEE O BOE MIERAL DESITY

Glutathione S-transferase M3 is important antioxidant enzyme in human body. It protects human body from negative effects of reactive oxygen species in state of oxidative stress. One of these effects is diminished bone mineral density, which can lead to development of osteoporosis. In scope of our diploma work we determined on samples of 400 volunteers, 284 women and 116 men, frequency of intron 6 delAGG in GSTM3 gene. We also estimated clinical importance of this polymorphism. First of all we have multiplied DNA fragments using polymerase chain reaction (PCR). Then we have optimised method of non-denaturation high performance liquid chromatography (non-DHPLC) and have determined lenghts of multiplied DNA fragments. PCR products with deletion are shorter and were eluted before products without deletion. We found out, that genotype +/+ has 72 %, genotype -/+ 26,2 % and genotype -/- 1,8 % of volunteers. Genotypes are distributed in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium. Using statistical analysis we showed, that statistical significance is present between delAGG and diminished bone mineral density of femoral neck (p = 0,026) and lumbar spine (p = 0,033) in group of postmenopausal women. We also found out, that there is statistical significance between delAGG and concentration of receptor activator of nuclear factor-B ligand (RANKL; p = 0,024). It would be reasonable to repeat this research on much larger group of volunteers. We also think, that there is a need to find out the mechanism by which this polymorphism effects bone mineral density.

iv

SEZAM OKRAJAV

ALP alkalna fosfataza

ALT alanin-amino transferaza

ANCOVA analiza kovariance

ANOVA analiza variance

AST aspartat-amino transferaza

BMD mineralna kostna gostota (angl.: bone mineral density)

CTx preno povezani C-terminalni telopeptid kolagena I

DEXA dvoenergijska rentgenska absorpciometrija

DHPLC denaturacijska tekoinska kromatografija visoke loljivosti

DNA deoksiribonukleinska kislina

dNTP deoksiribonukleozid trifosfat

FoxO transkripcijski faktorji Forkhead box O

GSTM3 glutation S-transferaza razreda mu 3

IL - interlevkin

ITM indeks telesne mase

M-CSF makrofagne kolonije stimulirajoi faktor

NF-B jedrni faktor kappa-B

OC osteokalcin

OPG - osteoprotegrin

PBM povprena kostna masa mladih odraslih (angl.: peak bone mass)

PCR verina reakcija s polimerazo (angl.: polymerase chain reaction)

PGE2 prostaglandin E2

PTH parathormon

RANKL ligand receptorja za aktivacijo jedrnega faktorja kappa-B

ROS reaktivne kisikove spojine (angl.: reactive oxygen species)

SD standardna deviacija

SR hitrost sedimentacije eritrocitov

TAE Tris-acetat EDTA

TEAA trietilamonijev acetat

TNF- dejavnik tumorske nekroze alfa

v

SEZAM PREGLEDIC, SLIK I GRAFOV

Preglednice

Preglednica I: Nekateri dejavniki tveganja za nastanek in razvoj osteoporoze (2, 5, 6). ................... 5

Preglednica II: Biokemijski kazalci tvorbe (11) in razgradnje kosti (9, 11). ...................................... 7

Preglednica III: Uinkovine za zdravljenje osteoporoze. ................................................................... 8

Preglednica IV: Imena glutation S-transferaze M3 (42). .................................................................. 14

Preglednica V: Bolezni, povezane z delecijo AGG v intronu 6 GSTM3. ......................................... 16

Preglednica VI: Frekvenca delAGG glede na rasne skupine (58). ................................................... 17

Preglednica VII: Povprene vrednosti in standardna deviacija parametrov za enske, moke in celotno populacijo preiskovancev. ................................................................................................... 20

Preglednica VIII: Povprene vrednosti in standardna deviacija parametrov za premenopavzne in

pomenopavzne enske preiskovanke. ............................................................................................... 20

Preglednica IX: Sestava reakcijske zmesi za pomnoevanje DNA odseka s PCR po optimizaciji. . 23

Preglednica X: Sestava reakcijske zmesi za pomnoevanje DNA odseka s PCR z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase . ............................................................................................... 23

Preglednica XI: Zaporedje zaetnih oligonukleotidov. .................................................................... 24

Preglednica XII: Shema temperaturnega programa. ......................................................................... 24

Preglednica XIII: Shema temperaturnega programa pri pomnoevanju z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase. .................................................................................................................. 25

Preglednica XIV: Sestavine za pripravo 2 % agaroznega gela. ........................................................ 26

Preglednica XV: Potek analize z metodo ne-DHPLC. ..................................................................... 33

Preglednica XVI: Pregled uporabljenih statistinih testov. .............................................................. 36

Preglednica XVII: Pregled pogojev PCR reakcije z oznaenimi mesti sprememb parametrov (podrtane vrednosti so se izkazali za primerneje). ........................................................................ 38

Preglednica XVIII: Prikaz razlinih deleev pufrov A in B pri optimizaciji metode ne-DHPLC.... 41

Preglednica XIX: Optimiziran program analize z ne-DHPLC (M5). ............................................... 41

Preglednica XX: Frekvenca genotipov med Slovenci. ..................................................................... 48

vi

Preglednica XXI: Frekvenca delAGG glede na prebivalstvo nekaterih evropskih drav (63). ........ 48

Preglednica XXII: Statistino signifikantne vrednosti povezanosti delAGG in mineralne kostne gostote na podroju vratu stegnenice in ledvenih vretenc pri pomenopavznih enskah (povzeto po Preglednicah XL in XLI, Priloga 2). ................................................................................................ 49

Preglednica XXIII: Mejne statistino signifikantne vrednosti povezanosti delAGG in mineralne kostne gostote na podroju vratu stegnenice pri skupini mokih (povzeto iz Preglednice XXXI, Priloga 2). ......................................................................................................................................... 51

Preglednica XXIV: Statistino signifikantni vrednosti povezanosti med delAGG in vrednostjo RANKL pri skupini pomenopavznih ensk (povzeto po Preglednici XLII, Priloga 2). ................... 52

Preglednica XXV: Zbrani genotipi za posamezne vzorce; genotip +/+ je oznaen z 0, genotip -/+ je oznaen z 1, genotip -/- je oznaen z 2. ................................................................................ 61

Preglednica XXVI: Rezultati testa ANOVA. ................................................................................... 63

Preglednica XXVII: Rezultati testov Post Hoc. ............................................................................... 63

Preglednica XXVIII: Rezultati testa Kruskal-Wallis. ...................................................................... 64

Preglednica XXIX: Rezultati testa ANCOVA. ................................................................................ 64

Preglednica XXX: Rezultati testa ANOVA - moki. ....................................................................... 65

Preglednica XXXI: Rezultati Post Hoc testov - moki. .................................................................... 65

Preglednica XXXII: Rezultati testa Kruskal-Wallis - moki. ........................................................... 66

Preglednica XXXIII: Rezultati testa ANCOVA - moki. ................................................................. 66

Preglednica XXXIV: Rezultati testa ANOVA - enske. .................................................................. 67

Preglednica XXXV: Rezultati Post Hoc testov - enske. ................................................................. 67

Preglednica XXXVI: Rezultati testa Kruskal-Wallis - enske. ........................................................ 68

Preglednica XXXVII: Rezultati testa ANCOVA - enske. .............................................................. 68

Preglednica XXXVIII: Rezultati testa ANOVA - premenopavzne enske. ..................................... 69

Preglednica XXXIX: Rezultati testa ANCOVA - premenopavzne enske. ..................................... 70

Preglednica XL: Rezultati testa ANOVA - pomenopavzne enske. ................................................ 70

Preglednica XLI: Rezultati Post Hoc testov - pomenopavzne enske. ............................................. 71

Preglednica XLII: Rezultati testa Kruskal-Wallis - pomenopavzne enske. .................................... 71

Preglednica XLIII: Rezultati testa ANCOVA - pomenopavzne enske. .......................................... 72

vii

Slike

Slika 1: Faze remodelacije kosti. ........................................................................................................ 3

Slika 2: Razlika med zdravo kostjo in kostjo z osteoporozo. ............................................................. 4

Slika 3: Osteoporozi najbolj podvreni deli skeleta. .......................................................................... 4

Slika 4: Spreminjanje koliine kostne mase s starostjo. ..................................................................... 6

Slika 5: Dvoenergijska rentgenska absorpciometrija. ........................................................................ 7

Slika 6: Mesto gena GSTM3 na kromosomu 1. ................................................................................ 13

Slika 7: Shematski prikaz aparature DHPLC sistema WAVE; A pufer A, B pufer B, C raztopina za spiranje igle, D raztopina D....................................................................................... 30

Slika 8: TEAA omogoi vezavo negativno nabitih molekul DNA na C18-alkiliran polistiren-divinilbenzenski delec. ..................................................................................................................... 31

Slika 9: Potek ienja produktov PCR reakcije. ............................................................................. 35

Slika 10: Optimizacija koncentracije MgCl2; s tevilkami 1, 2 in 3 so oznaene koncentracije MgCl2 v mM, sl predstavlja slepi vzorec, M pa DNA markerje. .............................................. 39

Slika 11: PCR produkti po optimizaciji metode; 38 ciklov, temperatura prileganja zaetnih oligonukleotidov 56,5C, as podaljevanja verige DNA pri 72C znaa 20 sekund (M DNA

marker, SL slepi vzorec, 781-784 tevilke vzorcev). ................................................................. 39

Slika 12: Primerjava kromatografskih vrhov genotipa +/+ pomnoenega z AmpliTaq Gold polimerazo (A; dva vrhova) in z Optimase Polymerase (B; en vrh)............................................ 42

Slika 13: Primerjava kromatografskih vrhov genotipa -/+ pomnoenega z AmpliTaq Gold polimerazo (A; osem vrhov) in z Optimase Polymerase (B; dva vrhova). .................................. 43

Slika 14: Kromatografski vrhovi treh genotipov; A homozigot -/- (dva vrhova), B heterozigot -/+ (osem vrhov), C homozigot -/- (trije vrhovi). ........................................................................... 43

Slika 15: vrh A - nezreagirani zaetni oligonukleotidi; vrh B - acetonitril ...................................... 44

Slika 16: Sekvenciranje vzorca 730 z istosmernim zaetnim oligonukleotidom (genotip +/+). ...... 45

Slika 17: Sekvenciranje vzorca 686 z istosmernim zaetnim oligonukleotidom (genotip -/+). ....... 45

Slika 18: Sekvenciranje vzorca 983 z istosmernim zaetnim oligonukleotidom (genotip -/-); s

puico je oznaeno mesto delecije AGG. ....................................................................................... 45

viii

Grafi

Graf 1: Vrednosti BMD vratu stegnenice glede na genotip.............................................................. 50

Graf 2: Vrednosti BMD ledvenih vretenc glede na genotip. ............................................................ 50

Graf 3: Vrednosti BMD vratu stegnenice glede na genotip pri mokih. .......................................... 51

Gregor Jug Vpliv delAGG v intronu 6 gena GSTM3 na mineralno kostno gostoto

1

1 UVOD

1.1 KOSTIA

Kost je vitalno, dinamino povezovalno tkivo, katerega struktura in zgradba odraata

ravnoteje med njenimi glavnimi tremi funkcijami, ki so (1, 2, 3):

zagotovitev mehanske integritete za lokomocijo (telesu nudi oporo, je nasadie za

miice);

zaita (iti kostni mozeg in vitalne organe);

vpletenost v presnovne poti, katere so povezane s homeostazo mineralov (rezerva

kalcija in fosfatov).

1.1.1 ZGRADBA KOSTI

Kost je sestavljena iz organskih in anorganskih sestavin (2). Glede na maso kosti, je

priblino 60 % le-te anorganske narave, 30 % organske narave, priblino 10 % pa

predstavlja voda. Anorganski del predstavlja neisti hidroksiapatit (Ca10[PO4]6[OH]2) (1).

Organski del sestavljajo beljakovine (glavna beljakovina je kolagen tipa I),

mukopolisaharidi (vloga ni raziskana) in kostne celice, katere so (2):

Osteoblasti nastanejo iz mezenhimskih celic strome kostnega mozga (2). Prisotni

so na povrju kosti. Sintetizirajo kostni matriks (osteoid) in uravnavajo njegovo

mineralizacijo, po kateri se preobilje osteoblastov odstrani z apoptozo. Ostali

osteoblasti se pretvorijo v mirujoe celice (mirujoi osteoblasti) na povrju kosti,

ali pa ostanejo zagozdeni v novo nastali kostnini kot osteociti (3). Osteoblasti

tvorijo citokine, ki so nujno potrebni za dozorevanje osteoklastov (interlevkin-6,

interlevkin-11) (2). Osteoblasti so bogati z alkalno fosfatazo (ALP), na svoji

povrini pa izraajo tudi mnogo receptorjev, vkljuno s tistimi za glukokortikoide,

PTH, 1,25-dihidroksi vitamin D3, estrogene, prostaglandine, interlevkine, TNF-

in TGF- (3).


2

Osteociti so preoblikovani osteoblasti, zagozdeni med kostne lamele ali pa se

nahajajo na povrini kosti. Imajo lastnosti osteoblastov in osteoklastov. Med seboj

in s povrino kosti so povezani z izrastki. Omogoajo hitro sproanje kalcija iz

kosti in tako zagotavljajo uravnoteenost notranjega okolja (2).

Osteoklasti skrbijo za resorpcijo kosti (2). Nastanejo iz hematopoetskih celic

makrofagne-monocitne vrste. Izraajo receptorje za M-CSF, RANKL in kalcitonin,

ne pa za PTH (3).

1.1.2 REMODELACIJA KOSTI

Kost je iva, zato skozi vse ivljenje poteka njena gradnja in razgradnja. Proces gradnje in

razgradnje kosti imenujemo remodelacija (2). Remodelacija kosti je sparjen proces, pri

katerem pride do lokalnega odstranjevanja stare kosti (resorpcija) in nadomeanja le-te z

na novo zgrajeno kostjo. Pri odraslih med 25. in 35. letom sta ta procesa v ravnoteju (4).

Pri otrocih gradnja kosti prevladuje nad njeno resorpcijo, po 35. letu pa zane proces

resorpcije prevladovati nad izgradnjo kosti. Dokazi o sparjenem procesu temeljijo na ideji,

da osteoblasti vplivajo na nastanek in aktivnost osteoklastov. Osteoblasti namre izraajo

veino citokinov (M-CSF, RANKL, OPG), ki vplivajo na diferenciacijo osteoklasta od

hematopoetske celice, do zrelega vecelinega osteoklasta (1).

Bistveno vlogo pri uravnavanju presnove kosti imajo hormoni, med katerimi so

najpomembneji PTH, kalcitonin in vitamin D3, ki ga imenujemo tudi hormon D ter

estrogeni. Poleg teh na gradnjo in razgradnjo vplivajo e nekateri drugi hormoni (rastni

hormon, inzulin, glukokortikoidi, itnini in spolni hormoni). Posebno vlogo v

uravnavanju remodelacije pa imajo lokalni dejavniki in tkivni hormoni (citokini,

prostaglandini) (2).

Skladno z modelom, ki ga je predlagal Parfitt, poteka remodelacija po zaporedju: faza

mirovanja, faza aktivacije, faza resorpcije, faza preobrata, faza izgradnje in povratek v

mirujoo fazo (Slika 1) (1, 2). V fazi mirovanja je povrina kosti prekrita s tankimi,

mirujoimi in neaktivnimi osteoblasti (2). Neaktivni osteoblasti imajo receptorje za

razline snovi, ki spodbudijo resorpcijo kosti (PTH, PGE2) (1). V fazi aktivacije se

neaktivni osteoblasti razmaknejo in razgalijo kostno povrino (2). To povzroi


3

kemotaktino privabljanje osteoklastov (1). V fazi resorpcije osteoklasti izdolbejo

Howshipove lakune (2). Faza preobrata je asovni interval od konca resorpcije, do

zaetka izgradnje kosti (1). V tem asu enojedrni fagociti oistijo dno votline in ga

obloijo s cementno plastjo (2). To v normalnih razmerah traja 1 2 tedna (1). V

Howshipovi lakuni se nato namestijo osteoblasti, ki nastanejo iz mezenhimskih celic, in

tvorijo osteoid, ki kasneje mineralizira, kar imenujemo faza izgradnje (1, 2).

Slika 1: Faze remodelacije kosti.

Nepravilnosti v remodelaciji kosti se kaejo kot ene izmed najbolj pogostih bolezni, ki

prizadenejo loveka. Mednje spadajo osteoporoza, osteomalacija, periodontitis, artritis in

tumorsko sproena osteoliza (2, 4).

1.2 OSTEOPOROZA

Svetovna zdravstvena organizacija (WHO, angl.: World Health Organization) definira

osteoporozo na podlagi merjenja mineralne kostne gostote z metodo dvoenergijske

rentgenske absorpciometrije (DEXA). Osteoporoza je prisotna, e je kostna gostota 2,5 ali

ve standardnih deviacij (SD) pod povprejem kostne gostote mladih odraslih (T-

vrednost).


4

Osteoporoza je najbolj razirjena metabolina bolezen kosti pri odraslih (5). Zanjo sta

znailni zniana koliina kostne mase in

poruenje mikroarhitekturne zgradbe

kostnega tkiva (Slika 2). Ti dve spremembi

vodita do poveane krhkosti kosti, obenem

pa poveujeta tveganje za zlom le-teh e

pri najmanjih telesnih pokodbah (2, 3).

Zlomom so, eprav je lahko prizadeta

katerakoli kost, najbolj podvreni kolk,

hrbtenica in zapestje (6) (slika 3).

Osteoporozo delimo na dve veliki skupini, in sicer na primarno in sekundarno

osteoporozo. Pod primarno osteoporozo uvramo juvenilno, idiopatino in involutivno

osteoporozo.

Involutivno osteoporozo delimo na dve manji skupini:

tip I (pomenopavzna osteoporoza);

tip II (senilna osteoporoza).

Juvenilna in idiopatina osteoporoza sta izredno redki. Juvenilna se pojavlja pred puberteto

in traja od 2. do 4. leta starosti, medtem ko se idiopatina pojavlja predvsem pri mlajih

osebah mokega spola (2).

Pomenopavzna osteoporoza se pojavlja pri

enskah med 50. in 70. letom starosti.

Povezana je s pomanjkanjem estrogenov po

menopavzi, kar privede do poveane resorpcije

in zmanjane tvorbe kosti (2, 7). Senilna

osteoporoza se pojavi po 70. letu starosti in v

vejem tevilu zajame tudi osebe mokega

spola (2). Vzrok za razvoj le-te pa ja

pomanjkanje kalcija in staranje okostja (7).

Teorijo delitve involutivne osteoporoze na dva tipa je nadomestila noveja teorija, ki trdi,

da osteoporoza predstavlja neprekinjeno zvezo ve patogenetskih mehanizmov, katerih

Slika 3: Osteoporozi najbolj podvreni deli skeleta.

Slika 2: Razlika med zdravo kostjo in kostjo z osteoporozo.


5

rezultat je zmanjana koliina kostne mase in poruenje mikroarhitekture kosti. Osnovni

patogenetski mehanizmi, ki privedejo do krhkosti okostja so: (a) neuspena tvorba okostja

s primerno kostno maso in vrstostjo med rastjo; (b) prekomerna resorpcija kosti, katere

rezultat je zmanjana koliina kostne mase in poruenje mikrostrukture okostja; in (c)

nezadostna tvorba kosti med remodelacijo kosti, kot odziv na poveano resorpcijo (7).

Pojav sekundarne osteoporoze je pogojen s prisotnostjo nekaterih bolezni (endokrine

bolezni, bolezni prebavil, bolezni kostnega mozga) oziroma so zanjo odgovorni tevilni

drugi dejavniki (npr. imobilizacija, KOPB, kronini alkoholizem, dolgotrajno zdravljenje z

glukokortikoidi, s heparinom, z antacidi, revmatoidni artritis, antikonvulzivna zdravila) (2).

1.2.1 PREVALECA

Osteoporoza prizadene veinoma enske, a zanjo zbolijo tudi moki; med bolniki z

osteoporozo je kar 80 % ensk in 20 % mokih (6). Po 70. letu se to razmerje nekoliko

zmanja, a e vedno znaa 2:1 v korist ensk. tudija na 610 Slovencih (418 enskah in

192 mokih, ki je bila izvedena v letu 2006, je pokazala, da za osteoporozo zboli 80,4 %

Slovenk in 19,6 % Slovencev (8). Obstajajo tevilni dejavniki tveganja, ki lahko privedejo

do nastanka osteoporoze (Preglednica I) :

Preglednica I: Nekateri dejavniki tveganja za nastanek in razvoj osteoporoze (2, 5, 6).

otranji dejavniki tveganja Zunanji dejavniki tveganja

etnina pripadnost (belci, Azijci) prehrana s premalo kalcija

enski spol nezadostna telesna aktivnost

dednost in genetski faktorji prekomerno uivanje alkohola

zapoznela puberteta, zgodnja menopavza kajenje

drobna konstitucija zdravljenje z glukokortikoidi

nekatere bolezni lez z notranjim izloanjem (hipogonadizem, hiperkorticizem, hipertiroidizem, hiperparatiroidizem)

dolgotrajno zdravljenje z nekaterimi zdravili (heparin, ciklosporin, antacidi, antiepileptiki)

starost imobilizacija

bolezni jeter, olnih poti in prebavil presaditev jeter, srca

maligna obolenja celic kostnega mozga

Gregor Jug

1.2.2 ETIOPATOGEEZA

V dobi odraanja izgradnja kosti prevladu

vea (2). Med 20. in 30. letom doseemo

najvijo vrednost koliine

peak bone mass; PBM) (3

in razgradnje so nato nekaj let uravnoteeni

emur pravimo tudi utrjevanje kosti (

Okrog 40. leta starosti pa se

starosti) koliina kostne mase

Pri enskah je v asu menopavze ta izguba

pospeena (3), saj pride

delovanja jajnikov do hitrega upada koliine

estrogenov (2). Pospeena razgradnja traja

vejo vlogo pri propadanju kostnine e pomanjkanje vitamina D, zviana koncentracija

parathormona (PTH) oziroma sek

kalcija iz revesja (2, 3) (Slika

1.2.3 DIAGOSTIKA

Osteoporozo pogosto imenujemo tiha bolezen, saj se kostna masa zmanjuje brez

simptomov (6). Diagnosticiramo jo lahko na podlagi zloma, ki je nast

pokodbi. Seveda pa je zaeleno, da

ob pravoasnem odkritju prepreiti

toliko veji pomen. Pri diagnosticiranju osteoporoze uporabljamo metode za merjenje

kostne gostote, kot tudi laboratorijske teste.

ultrazvona preiskava petnice (za diferencialno diagnozo osteoporoze)

rentgensko slikanje

(3);

kvantitativni CT pr

ob preiskavi

prednosti pred ostalimi metodami)

Vpliv delAGG v intronu 6 gena GSTM3 na mineralno kostno gosto

6

ETIOPATOGEEZA

gradnja kosti prevladuje nad razgradnjo, zato se koli

Med 20. in 30. letom doseemo

kostne mase (angl.:

3). Procesi izgradnje

in razgradnje so nato nekaj let uravnoteeni,

emur pravimo tudi utrjevanje kosti (2).

krog 40. leta starosti pa se zane (zaradi

koliina kostne mase zmanjevati (3).

enskah je v asu menopavze ta izguba

zaradi prenehanja

do hitrega upada koliine

ospeena razgradnja traja od 5 do 10 let (3). Pri viji starosti pa dobijo


parathormona (PTH) oziroma sekundarni hiperparatiroidizem ter zmanjana a

(Slika 4).


Diagnosticiramo jo lahko na podlagi zloma, ki je nastal ob precej nedolni

zaeleno, da jo odkrijemo e pred zlomom (5).

ob pravoasnem odkritju prepreiti ali pa vsaj omiliti, kar daje pravoasni diagnozi e

Pri diagnosticiranju osteoporoze uporabljamo metode za merjenje

kot tudi laboratorijske teste. Metode za merjenje kostne gostote so:

ultrazvona preiskava petnice (za diferencialno diagnozo osteoporoze)

rentgensko slikanje hrbtenice (ob zlomu in za oceno deformacije vretenc)

kvantitativni CT pregled (angl.: computer axial tomography;

ob preiskavi je pacient izpostavljen veliki meri sevanja, nobene velike

prednosti pred ostalimi metodami) (3);

Slika 4: Spreminjanje koliine kostne mase s starostjo.

na mineralno kostno gostoto

je nad razgradnjo, zato se koliina kostne mase

Pri viji starosti pa dobijo


zmanjana absorpcija


al ob precej nedolni

). Osteoporozo se da

, kar daje pravoasni diagnozi e

Pri diagnosticiranju osteoporoze uporabljamo metode za merjenje

Metode za merjenje kostne gostote so:

ultrazvona preiskava petnice (za diferencialno diagnozo osteoporoze) (3);

hrbtenice (ob zlomu in za oceno deformacije vretenc)

.: computer axial tomography; draga metoda,

pacient izpostavljen veliki meri sevanja, nobene velike

minjanje koliine kostne mase s


7

dvoenergijska rentgenska absorpciometrija (angl.: dual energy X-ray

absorptiometry, DEXA; slika 5); zlati standard za diagnostiko osteoporoze,

merjenje mineralizacije kosti v gramih kalcija na kvadratni centimeter

(g/cm2) povrine prereza kosti (5), natanna in tona metoda, pacient je ob

preiskavi izpostavljen majhni meri sevanja) (3, 5).

Po strokovnih smernicah diagnoza osteoporoze

temelji na merjenju kostne gostote. Osnovana je

na podlagi primerjave pacientove kostne gostote s

povpreno kostno maso mladih odraslih oziroma

PBM (angl.: peak bone mass) (5). Tudi definicija

WHO, kot smo e omenili, temelji na primerjavi

kostne gostote. Osteoporoza je prisotna, e je

kostna gostota 2,5 ali ve standardnih deviacij (SD) pod povprejem kostne gostote mladih

odraslih (T-vrednost). SD od 0 do -1 pod T-vrednostjo oznauje normalno kostno gostoto,

SD med -1 in -2,5 pod T-vrednostjo oznauje osteopenijo, e pa je kostna gostota -2,5 ali

ve SD pod T-vrednostjo in so obenem prisotni zlomi, gre za hudo osteoporozo (3, 10).

Laboratorijski testi nam omogoajo spremljanje procesa tvorbe in razgradnje kosti (9) z

doloanjem biokemijskih kazalcev v serumu ali v urinu (11). Med biokemijskimi kazalci

so najpomembneji (Preglednica II):

Preglednica II: Biokemijski kazalci tvorbe (11) in razgradnje kosti (9, 11).

Kazalci tvorbe kosti Kazalci razgradnje kosti

osteokalcin preni povezovalci C-telopeptidov kolagena tipa I

kostno specifina alkalna fosfataza (ALP) preni povezovalci N-telopeptidov kolagena tipa I

N-terminalni propeptid kolagena tipa I piridinolin

deoksipiridinolin

hidroksiprolin

tartrat rezistentna kisla fosfataza

Slika 5: Dvoenergijska rentgenska absorpciometrija.


8

Postavitev diagnoze nam zelo olaja kombinacija obeh vrst preiskav, tako merjenje kostne

gostote z eno izmed metod, kakor tudi doloanje biokemijskih kazalcev (11).

Da bi se lahko na podlagi rezultatov preiskav opredelili, katera oblika, primarna ali

sekundarna, je prizadela pacienta, moramo narediti e nekaj ostalih klininih preiskav.

Vsem pacientom doloimo e koncentracijo kalcija, fosfata, alkalne fosfataze, senine,

kreatinina, AST, ALT, TSH in prostega testosterona (pri mokih) v serumu. Poleg

natetega naredimo e proteinogram, SR in hemogram. Pri primarni osteoporozi so vsi

nateti kazalci v mejah normale (9).

1.2.4 ZDRAVLJEJE

Na osnovni cilj je, da skuamo ljudi usmeriti k takemu nainu ivljenja, da bi prepreili

pojav osteoporoze. Za prepreevanje osteoporoze so pomembni: zdrav nain ivljenja

(brez alkohola in cigaret), prehrana z zadostno koliino kalcija ter stalna telesna aktivnost.

Zato pacientom najprej svetujemo spremembo naina ivljenja (2). V kolikor je

osteoporoza e prisotna, smo primorani k zdravljenju (5). Bistveni cilj zdravljenja

osteoporoze je prepreiti zlom. Za zdravljenje sta nam na voljo naslednji skupini

uinkovin (Preglednica III):

Preglednica III: Uinkovine za zdravljenje osteoporoze.

Zaviralci resorpcije kosti Pospeevalci tvorbe kosti

estrogeni natrijev fluorid

kalcij (v obliki soli) rekombinantni parathormon (PTH)

bisfosfonati

kalcitonin

vitamin D

selektivni modulatorji estrogenskih receptorjev (SERM)

Uporabne so tudi kombinacijske terapije, kjer lahko kombiniramo dve uinkovini, ki

zavirata resorpcijo, ali pa izberemo eno uinkovino, ki zavira resorpcijo in drugo, ki

pospeuje tvorbo kosti (3). Za zdravljenje pa lahko uporabimo tudi anabolne steroide, a je

njihova uporaba omejena s stranskimi uinki (androgenizacija in znianje koncentracije


9

HDL). Mehanizem delovanja anabolnih steroidov e ni znan, verjetno pa zavirajo

resorpcijo (2).

1.3 OSTEOPOROZA I OKSIDATIVI STRES

1.3.1 OKSIDATIVI STRES I ATIOKSIDATIVI ECIMI

V normalnih pogojih je med nastajanjem reaktivnih kisikovih spojin (angl.: reactive

oxygen species, ROS) in antioksidativno kapaciteto celice vzpostavljeno dinamino

ravnoteje (12). Reaktivne kisikove spojine, kot so superoksidni anion (O2-), vodikov

peroksid (H2O2), hidroksilni radikal (OH), organski peroksidi in radikali, nastajajo

endogeno v vseh aerobnih celicah kot stranski produkt raznih metabolinih reakcij (13). Te

produkte v celicah obiajno nevtralizirajo antioksidativni obrambni mehanizmi (12).

Oksidativni stres se pojavi, e je nastajanje reaktivnih kisikovih spojin poveano, oziroma

e so antioksidativni obrambni sistemi okrnjeni. Tako stanje lahko privede do pokodb

celic, saj prihaja do lipidne peroksidacije in spremembe struktur proteinov in nukleinskih

kislin (13). Velja preprianje, da je oksidativni stres mono vpleten v tevilna bolezenska

stanja, kakor tudi v proces staranja. Vendar bodo za tono doloitev vpliva oksidativnega

stresa potrebne e tevilne raziskave na ve podrojih (14).

Sesalske celice so z namenom, da bi prepreile oksidativno kodo in omogoile preivetje

v okolju s kisikom, razvile izpopolnjen antioksidativni obrambni sistem. Le-ta vkljuuje

neencimske antioksidante (npr. glutation, vitamina C in E) in antioksidativne encime, med

katerimi so najpomembneji superoksid dismutaza (SOD), glutation peroksidaza (GPx),

glutation reduktaza (GSR) in katalaza (CAT) (13, 22). Poleg natetih, tudi antioksidativni

encimi, ki lahko metabolizirajo uinkovine (glutation S-transferaze, glukuronozil

transferaze, NADPH in NADH), zniujejo raven oksidativnega stresa in so prav tako del

antioksidativnega obrambnega sistema (13). Dokazano je tudi, da stanje oksidativnega

stresa zvia stopnjo izraanja genov, ki nosijo zapis za aktivnost antioksidativnih encimov,

med drugimi tudi glutation S-transferaze (15).


10

1.3.2 VPLIV OKSIDATIVEGA STRESA A RAZVOJ OSTEOPOROZE

Stanje oksidativnega stresa lahko dolgorono vpliva tudi na pojav in razvoj osteoporoze.

Ideja o povezovanju stanja poveane produkcije reaktivnih kisikovih spojin z osteoporozo

se je porodila ele pred nekaj leti. Dokazali so, da imajo estrogeni neposreden vpliv na

obrambo pred oksidativnim stresom (16). Tezo, da so prosti radikali vpleteni v

osteoklastogenezo in resorpcijo kosti, so kasneje potrdili in vitro in na glodavcih (17). Ker

je znano, da nivo estrogenov z naraajoo starostjo upada, lahko ugotovimo, da

pomanjkanje estrogenov tako posredno in neposredno vpliva na veanje kostne resorpcije

in posledino na razvoj osteoporoze.

Vpliv na nastanek in razvoj osteoporoze ima tudi pomanjkanje oziroma zmanjana

aktivnost antioksidativnih encimov. Glutation peroksidaza 1 (GPx) je prevladujo

antioksidativni encim (18). V procesu kostne remodelacije ima vpliv na delovanje

osteoblastov (21). Izraanje gena za ta encim je mono povezano z estrogeni; ker je po

menopavzi nivo estrogenov niji, se posledino koliina GPx v telesu zmanja (18), s tem

pa je okrnjeno delovanje osteoblastov. In vitro so dokazali, da ima katalaza (CAT)

sposobnost prepreevanja diferenciacije osteoklastov (18). Koliina glutation reduktaze

(GSR) v telesu se s starostjo zmanjuje. Aktivnosti tega encima v homeostazi kosti

povezujejo z apoptozo osteoblastov in osteoklastov, obenem pa naj bi imel direkten vpliv

na jakost kosti in kostno maso (22). Poleg omenjenih vplivov pa vodi pomanjkanje teh

encimov do pojava stanja oksidativnega stresa.

Raziskave, ki poskuajo pojasniti mehanizme, preko katerih prosti radikali vplivajo na

kostno resorpcijo, potekajo oziroma so potekale veinoma na glodavcih (16-24). Nekatere

raziskovalne skupine so e naredile korak naprej in naredile raziskave na enskah in

mokih (25, 26).

Mehanizmi, preko katerih prosti radikali vplivajo na nastanek in razvoj osteoporoze, niso

popolnoma znani. Znano pa je, da reaktivne kisikove spojine vplivajo na prevajanje po

nekaterih signalnih poteh, med katerimi so tudi tiste, ki so bistvene za aktivacijo

osteoklastov. Nekatere izmed tar so jedrni faktor kappa-B (NF-B), c-Jun amino-

terminalna kinaza (JNK), fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K) in p38 MAP kinaza (16, 18).

Tvorba osteoklastov je odvisna od aktivacije F-B, le-ta pa je dokazana ob prisotnosti


11

reaktivnih kisikovih spojin (18, 25, 26). Reaktivne kisikove spojine so prav tako

potencialni aktivatorji dejavnika tumorske nekroze (TF-), interlevkina 1 (IL-1),

interlevkina 6 (IL-6) in drugih citokinov, ki so mono vpleteni v izgubo kostne mase zaradi

pomanjkanja estrogenov (16). Garrett in sodelavci zagovarjajo monost, da prosti radikali

vplivajo tudi na parathormon (PTH) in preko delovanja le-tega povzroajo izgubo kostne

mase. Prav tako izpostavljajo monost, da je razgradnja kostnine mona kot posledica

direktnega delovanja prostih radikalov (19). Grassi in sodelavci so dokazali, da upadanje

koliine estrogenov privede do stanja oksidativnega stresa, ki vodi do od antigenov

odvisne aktivacije T celic s soasnim poveanjem koliine ko-stimulatorne molekule CD80

na dendritskih celicah, posledica esar je poveana produkcija TNF- v T celicah. TNF- v

kostnih celicah in v celicah kostnega mozga stimulira nastajanje liganda receptorja za

aktivacijo jedrnega dejavnika kappa-B - RANKL (angl.: receptor activator of nuclear

factor-B ligand) in makrofagne kolonije stimulirajoega dejavnika M-CSF (angl.:

macrophage colony-stimulating factor), povea dovzetnost prekurzorjev osteoklastov za

RANKL in inducira dodatne osteoklastogenetske citokine IL-1, IL-6 in IL-7 (20). Vezava

RANKL na prekurzorje osteoklastov povzroi diferenciacijo le-teh v popolnoma zrele,

vejedrne osteoklaste. M-CSF inducira proliferacijo zgodnjih oblik prekurzorjev

osteoklastov, diferenciacijo nekoliko bolj zrelih osteoklastov, fuzijo enojedrnih pre-

osteoklastov in preivetje zrelih osteoklastov (27). Almeida in sodelavci so dokazali e eno

mono pot, po kateri reaktivne kisikove spojine povzroajo izgubo kostne mase. Ugotovili

so, da oksidativni stres antagonizira Wnt signalno pot v prekurzorjih osteoblastov, in sicer

preko indukcije transkripcijskih faktorjev Forkhead box O (FoxO). Wnt signalna pot je

bistvena v procesu osteoblastogeneze in tvorbe kosti, njeno zavrtje pa poleg zmanjane

osteoblastogeneze povzroa e apoptozo mezenhimskih celic kostnega mozga (22, 23, 24).

Skupina transkripcijskih faktorjev FoxO (FoxO1 (Fkhr), FoxO3a (Fkhrl1), FoxO4 (Afx) in

FoxO6) ima vlogo pri preivetju sesalskih celic, saj preko p27kip1 oziroma GADD45

inducira ustavitev in mirovanje celinega cikla, kar nastane kot odgovor na oksidativni

stres (23, 28). Prav tako preko regulacije ekspresije genov vpliva na apoptozo,

diferenciacijo celic in hitrejo obnovo pokodovane DNA, obenem pa vpliva tudi na

metabolizem glukoze in lipidov (24, 28). Ima tudi vpliv na obrambo pred oksidativnim

stresom, kar je paradoksalna trditev glede na zgoraj navedeno dejstvo, da so transkripcijski

faktorji FoxO vpleteni v mehanizem, ki povzroa izgubo kostne mase. Smiselna razlaga je,

da FoxO faktorji glede na intenziteto draljaja vplivajo na transkripcijo razlinih genov,


12

oziroma v razlinih tkivih vplivajo na transkripcijo razlinih genov (28). Oksidativni stres

pospeuje povezovanje FoxO3a z -kateninom. -katenin je protein, ki ima v primeru

vezave na transkripcijski faktor Tcf kljuno vlogo v homeostazi kosti, saj vpliva na

transkripcijo gena za Wnt (23, 24). Manolagas in Almeida domnevata, da je povezovanje

-katenina s FoxO pomembno za zveano adipogenezo v kostnem mozgu, prav tako pa za

poveano apoptozo osteoblastov in osteoklastov (24).

Med reaktivnimi kisikovimi spojinami je najpomembneji vodikov peroksid (H2O2), saj

mu njegove lastnosti omogoajo opravljanje funkcij intra- in intercelularnega prenaalca

signala. Ima namre relativno dolg razpolovni as in lahko prehaja membrano. Prav tako je

bilo dokazano, da direktno vpliva na tvorbo in delovanje osteoklastov (18).

Glede na zgoraj navedena dejstva lahko trdimo, da lahko zadosten vnos antioksidantov s

hrano v veliki meri ublai negativne uinke prostih radikalov, ki prispevajo k

zmanjevanju kostne mase. Povedano drugae, premajhen vnos antioksidantov in

kovinskih ionov (selen, cink in baker), ki so potrebni za delovanje antioksidativnih

encimov, lahko privede do oksidativnega stresa in posledino do osteoporoze (25).

1.3.3 GLUTATIO S-TRASFERAZE

Glutation S-transferaze (GST) so dimerni detoksifikacijski encimi, katerih delovanje je

pomembno v II. fazi metabolizma, saj omogoajo nastanek konjugata med reducirano

obliko glutationa (GSH; -L-glutamil-L-cisteinil glicin), ki je pomemben celini reducent,

in razlinimi elektrofili, ki so lahko genotoksini in citotoksini. Konjugati so, ali bolj

vodotopni in se lae izloijo iz telesa, ali pa so netoksini in zapadejo nadaljnjemu

metabolizmu. GST katalizirajo nukleofilno adicijo tiolne skupine GSH (-SH) na

elektrofilne akceptorje, kateri so lahko elektrofilni ogljik, elektrofilni duik ali elektrofilni

kisik (29, 30). Med molekule, ki so podvrene tej poti metabolizma, spadajo razlini

endogeni metaboliti, ksenobiotiki, nekatere protitumorne uinkovine (1,3-bis(2-kloroetil)-

1-nitrozourea), aril in alkil halidi, kinoni, organski peroksidi (peroksidi maob in DNA),

policiklini aromatski ogljikovodiki (benzo[a]piren), nekateri aldehidi, etilen oksid, 4-

aminobifenil in nitrozamini (29-38). Med endogene metabolite spadajo tudi epoksidi

policiklinih aromatskih ogljikovodikov, ki nastanejo v I. fazi metabolizma (produkt

delovanja citokromov P450). Ta vrsta spojin nastaja tudi zaradi stanja oksidativnega stresa


13

(33). Glutation S-transferaze imajo poleg encimske e neencimsko funkcijo, in sicer

uravnavajo tevilne celine procese, ki pripomorejo k intrinzini sposobnosti celic, da

preivijo genotoksini, metabolini in oksidativni stres (31).

Glutation S-transferaze delimo na citosolne oziroma jedrne, mitohondrijske in

mikrosomalne (31). Med citosolne GST uvramo sedem od osmih do sedaj znanih

razredov, in sicer alfa, mi, theta, pi, zeta, sigma, omega (znan tudi kot razred hi). Edini do

sedaj znan razred mitohondrijskih GST je razred kappa (29, 31, 33). Znane pa so e tri

izoforme encimov GST, ki so vezani na membrano (MGST1, MGST2 in MGST3) (39).

1.3.3.1 GLUTATION S-TRANSFERAZA M3

Razred mi je najbolj razirjen v druini glutation S-transferaz v lovekem telesu. V tem

razredu je identificiranih pet genov (GSTM1 - GSTM5), ki kodirajo za encime GSTM1

GSTM5. Geni so organizirani v skupino in se nahajajo v kromosomski regiji 1p13 (Slika

6) (29, 33). Locirani so eden za drugim v zaporedju 5'-GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-

GSTM3-3' (33).

Slika 6: Mesto gena GSTM3 na kromosomu 1.

Encim glutation S-transferaza M3 (GSTM3) je najbolj zastopan v testisih, pljuih,

moganih in v jetrih (40). Prisoten je tudi v celicah kostnega mozga (41). GSTM3

poznamo e pod ve drugimi imeni, ki so zbrana v Preglednici IV:


14

Preglednica IV: Imena glutation S-transferaze M3 (42).

Alias Opisno ime

EC 2.5.1.18 GST razred mi

GST5 S-(hidroksialkil)glutation liaza M3

GSTB moganska GST

GSTM3-3 moganski tip mi-glutation S-transferaza

GTM3 glutation S-alkiltransferaza M3

MGC3310 glutation S-alkiltransferaza M3

MGC3704 glutation S-ariltransferaza M3

OTTHUMP00000013355 glutation S-transferaza M3 (moganska)

hGSTM3-3 glutation S-transferaza, Mi-3

GSTM3 kodira za protein, ki je e najmanj podoben ostalim tirim lanom razreda mi, a

e vedno ima 70 % zaporedja aminokislin enakega, kakor ostali proteini iz razreda. Prav

tako je zanimivo, da se GSTM3 prepisuje v obratni smeri, kakor ostali tirje geni razreda

mi. Gena GSTM5 in GSTM3 sta orientirana v nasprotnih smereh, 3' koncu GSTM5 sledi

vmesno zaporedje nukleotidov, temu pa sledi 3' konec GSTM3. Temu pravimo orientacija

rep proti repu. GSTM3 sestavlja osem eksonov in sedem intronov. Prvi in osmi ekson sta

za malenkost dalja v primerjavi z ostalimi tirimi geni v razredu mi. Rezultat tega je za

4 aminokisline dalji N-konec in za 3 aminokisline dalji C-konec encima GSTM3.

Razlike se prav tako pojavljajo v intronih, in sicer v intronu 3, ki je bistveno dalji v

GSTM3, intron 7 pa je ve kot desetkrat kraji v primerjavi s tistimi v ostalih tirih genih

(38). Promotorska regija GSTM3 je edina v razredu mi, ki vsebuje TATA zaporedje

(TATAAA - Hognesovo zaporedje) (38, 57). TATA je glavno mesto vezave za RNA-

polimerazo II, ki je odgovorna za prepis mRNA in snRNA (57). GSTM3 vsebuje tudi

obmoje bogato z GC zaporedjem (38).

V genu GSTM3 najdemo tevilne polimorfizme, tako v intronih, v eksonih, pri 3' in pri 5'

koncu gena. Mi smo se osredotoili na intron 6, na katerem najdemo tri polimorfizme,

odloili pa smo se za slednjega (44):

delTCC (delecija TTC)

delCTC (delecija CTC)

delAGG (delecija AGG)


15

Zaradi delecije v intronu 6 dobimo dva razlina alela:

GSTM3*A wild type

GSTM3*B delecija AGG v intronu 6 (mesto delecije je obarvano rdee in

podrtano)

Polimorfizem v alelu GSTM3*B povzroi nastanek prepoznavnega mesta (-AAGATA-) za

transkripcijski faktor Ying Yang 1 (YY1). YY1 vpliva na transkripcijo, posledica esar je

spremenjeno izraanje obeh alelov in tako mono spremenjena ekspresija GSTM3. Le-ta je

lahko poveana, lahko pa je, kar je e bolj verjetno, zmanjana. Toni mehanizmi, po

katerih YY1 vpliva na transkripcijo, e niso znani (29, 31-34, 36-38, 40, 43). Polimorfizma

delAGG v GSTM3 in GSTM1 ni se obiajno pojavljata skupaj, obenem pa naj bi GSTM1

ni vplival na zmanjano ekspresijo GSTM3 (38, 56). Z GSTM1 ni oznaujemo

polimorfizem gena GSTM1 (navadno je to delecija), ki povzroi popolno neaktivnost

encima GSTM1.

Zaradi spremenjene ekspresije GSTM3 se je smiselno vpraati, kakne posledice prinaa ta

polimorfizem pri obrambi pred stanjem oksidativnega stresa. Do sedaj so ta polimorfizem

povezovali z ve razlinimi boleznimi (Preglednica V), nihe pa ga e ni povezoval z

osteoporozo.

5'CCATGTTTCTGGGGAAATTCTCATGGTTTGCCGGGGAAAAG[intron6]GT

AGGAAGAAGGGAAAAGAAGAGGATACTTCTCTATCTCTGCAGGCTACT

ACTCCTCAGACCTAAGCATCTTATTGCTTTTCTTCTAG[intron6]CTCACCT

TTGTGGATTTTCTCACCTATGATATCTTGGATCAGAACCGTATATTTGA3'


16

Preglednica V: Bolezni, povezane z delecijo AGG v intronu 6 GSTM3.

Bolezen Genotip in statistina signifikanca rak poiralnika (34) GSTM3*A/B (p = 0,000)

GSTM3*A/B+GSTM3*B/B+GSTM1 ni

(p = 0,010) distalni kolorektalni rak (35) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B

proksimalni in distalni kolorektalni rak (35) GSTM3*A/B + GSTM1 ni

GSTM3*B/B + GSTM1 ni

rak na materninem vratu (36) GSTM3*A/B (p = 0,053)

rak na prostati (37) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B (p = 0,044)

rak na prostati (50) GSTM3*B/B (p = 0,016)

gliom (43) GSTM3*B/B

meningiom (43) GSTM3*B/B

rak na dojki (ER- pozitiven) (45) ni definirano

Alzheimerjeva bolezen (46) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B (p = 0,050)

akutna levkoblastna levkemija (47) ni definirano

rak na grlu (51) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B

GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B+GSTM1 ni rak na mehurju (52) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B

rak na dojki (54) GSTM3*A/B ali GSTM3*B/B

Nekatere raziskave so pokazale, da polimorfizem delAGG nima vedno negativne vloge v

lovekem telesu. Kadilke z genotipom GSTM3*A/A so bolj podvrene tveganju, da dobijo

raka na materninem vratu, kakor nosilke genotipov GSTM3*A/B in GSTM3*B/B (36).

Prav tako so nosilci genotipa GSTM3*A/A podvreni vejemu tveganju za razvoj

multiplega karcinoma bazalnih celic koe (53). Prisotnost alela GSTM3*B pri pacientih z

malignimi neoplazmami, ki se zdravijo s cisplatinom, izkazuje pomen pri zaiti pred

ototoksinostjo. Le-ta se pojavi kot stranski uinek terapije s cisplatinom (48). Prav tako so

imeli otroci s cistino fibrozo in prisotnim alelom GSTM3*B bolje rezultate pri testih

FEV1 in FVC (49). Genotip GSTM3*A/A prav tako izkazuje pomen pri zaiti pred rakom

na mehurju (52). Zanimivo je tudi, da je frekvenca genotipa GSTM3*B/B pri pacientih z

rakom na grlu signifikantno nija, kakor pri kontrolnih osebah (55).


17

Frekvenca delAGG se razlikuje glede na rasno pripadnost. al so podatki o frekvenci

polimorfizma zelo skopi (N = 200). V preglednici so zbrani podatki za tiri rasne skupine

(Preglednica VI):

Preglednica VI: Frekvenca delAGG glede na rasne skupine (58).

Populacija (t.)

Frekvenca genotipa Frekvenca alela

+/+ -/+ -/- + -

belci (58) 0,931 0,034 0,035 0,948 0,052

rnci (48) 0,292 0,542 0,166 0,563 0,437

prebivalci

pacifikih

drav (48)

1,000 0,000 0,000 1,000 0,000

panci (46) 0,652 0,261 0,087 0,783 0,217

VSI (200) 0,730 0,200 0,070 0,830 0,170


18

2 AME DELA

V uvodu smo pokazali, da bi stanje oksidativnega stresa lahko vplivalo na zmanjanje

mineralne kostne gostote. Prav tako smo navedli, da je eden izmed pomembnejih

obrambnih encimov pred reaktivnimi kisikovimi spojinami, in posledino pred

oksidativnim stresom, glutation S-transferaza M3. Namen nae tudije je ugotoviti vpliv

delecije AGG (delAGG) v intronu 6 gena za glutation S-transferazo razreda mu 3

(GSTM3) na mineralno kostno gostoto. S tem namenom bomo v raziskavo vkljuili 400

preiskovancev, 284 ensk in 116 mokih. Preiskovancem je bila predhodno z metodo

DEXA v predelu kolka, ledvenih vretenc in vratu stegnenice izmerjena kostna gostota.

Raziskava bo obsegala naslednje stopnje:

optimizirali bomo verino reakcijo s polimerazo, nato pa pomnoili odsek DNA, v

katerem se nahaja polimorfizem

vzorce bomo genotipizirali z denaturacijsko tekoinsko kromatografijo visoke

loljivosti

s statistino analizo bomo ocenili vpliv polimorfizma gena GSTM3 na mineralno

kostno gostoto in na koncentracijo biokeminih kazalcev kostne remodelacije


19

3 MATERIALI I METODE

3.1 OPIS PREISKOVACEV

V tudijo smo vkljuili vzorce 400 preiskovancev, med katerimi je bilo 284 ensk in 116

mokih. Vsem preiskovancem je bila predhodno na Kliniki za endokrinologijo, diabetes in

bolezni presnove Univerzitetnega klininega centra v Ljubljani, v Sploni bolninici Celje

in v Ambulanti za osteoporozo Zdravilia Dolenjske toplice z metodo DEXA izmerjena

mineralna kostna gostota (BMD) v predelu vratu stegnenice (del kolka), celotnega kolka in

ledvenih vretenc. Pri vseh preiskovancih so prav tako opravili rutinske biokemijske teste za

izkljuitev sistemskih in metabolinih kostnih bolezni. Pred preiskavo preiskovanci niso

jemali zdravil za zdravljenje osteoporoze.

Vsi preiskovanci so dali soglasje za vkljuitev njihovih vzorcev v tudijo. tudija ima prav

tako dovoljenje etine komisije.

Pri ugotavljanju povezanosti polimorfizma in ostalih parametrov (ITM, starost, BMD, t-

vrednost, RANKL, pOC, sCTX, sOPG in pri enskah starost, ko se je pri njih zaela

menopavza in as trajanja menopavze), smo preiskovance razdelili na ve skupin, in sicer:

vsi preiskovanci (400)

enske preiskovanke (284)

moki preiskovanci (116)

premenopavzne enske (33); v kolikor ni bilo podatka o menopavzi, smo v to

skupino uvrstili vse enske, mlaje od 60 let

pomenopavzne enske (239)

V Preglednicah VII in VIII so zbrane povprene vrednosti parametrov glede na izbrane

skupine preiskovancev:


20

Preglednica VII: Povprene vrednosti in standardna deviacija parametrov za enske, moke in celotno populacijo preiskovancev.

Spremenljivka enske Moki Vsi

Starost (leta) 64,42 9,278 67,57 6,099 65,36 8,568

ITM 27,75 4,782 27,89 3,757 27,79 4,509

Menopavza (starost) 49,92 4,018 / /

Leta menopavze 14,79 10,174 / /

BMDtot (g/cm2) 0,87 0,142 1,03 0,163 0,91 0,166

t_tot -0,79 1,128 -0,23 1,099 -0,62 1,151

BMDfn (g/cm2) 0,72 0,129 0,82 0,157 0,75 0,144

t_fn -1,48 1,182 -1,17 1,193 -1,39 1,192

BMDL1L4 (g/cm2) 0,91 0,156 1,06 0,177 0,95 0,176

tL1L4 -1,38 1,390 -0,42 1,511 -1,10 1,486

RANKL (pmol/L) 0,23 0,296 0,18 0,112 0,21 0,249

pOC (g/L) 14,87 7,696 9,55 5,171 13,05 7,352

sCTX (pmol/L) 3361,01 2313,833 2003,72 1086, 740 2949,71 2108, 740

sOPG (pmol/L) 5,33 1,703 5,46 1,539 5,37 1,640

Preglednica VIII: Povprene vrednosti in standardna deviacija parametrov za premenopavzne in pomenopavzne enske preiskovanke.

Spremenljivka Premenopavzne enske Pomenopavzne enske

Starost (leta) 53,73 3,125 65,90 8,869

ITM 25,67 4,962 28,07 4,725

BMDtot (g/cm2) 0,92 0,185 0,86 0,134

t_tot -0,49 1,196 -0,84 1,108

BMDfn (g/cm2) 0,75 0,122 0,72 0,131

t_fn -1,25 1,174 -1,53 1,178

BMDL1L4 (g/cm2) 0,90 0,144 0,91 0,158

tL1L4 -1,36 1,297 -1,40 1,408

RANKL (pmol/L) 0,31 0,161 0,30 0,368

pOC (g/L) 17,73 5,559 14,12 8,079

sCTX (pmol/L) 3773,33 1967,940 3301,95 2418,497

sOPG (pmol/L) 4,58 0,851 5,59 1,883

Menopavza (starost) / 49,92 4,018

Leta menopavze / 14,79 10,174


21

3.2 OPIS VZORCEV DA

Preiskovancem so na Kliniki za endokrinologijo, diabetes in bolezni presnove

Univerzitetnega klininega centra v Ljubljani, v Sploni bolninici Celje in v Ambulanti za

osteoporozo Zdravilia Dolenjske odvzeli periferno vensko kri. Kri so shranili pri -20C.

V manj kot petih dneh je bila iz levkocitov odvzete krvi izolirana genomska DNA. To je

bilo storjeno z metodo izsoljevanja po Millerju.

3.3 VERIA REAKCIJA S POLIMERAZO

Verina reakcija s polimerazo (angl.: Polymerase Chain Reaction - PCR) je visoko

specifina in selektivna encimska metoda pomnoevanja dela DNA. Reakcijo, ki poteka po

naslednjih stopnjah, katalizira termostabilna DNA polimeraza:

1. zaetna denaturacija dvoverine DNA (2 minuti pri temperaturi 90 95C);

2. ciklino pomnoevanje DNA;

3. konno podaljevanje verige DNA s termostabilno DNA polimerazo (5 15 minut

pri temperaturi 72C).

Druga stopnja se ciklino ponavlja, ponavadi 25 do 35-krat, poteka pa prav tako v treh

stopnjah:

1. denaturacija DNA med cikli (20 30 sekund pri 90 95C);

2. prileganje zaetnih oligonukleotidov (30 60 sekund pri 40 60C);

3. podaljevanje verige DNA s termostabilno DNA polimerazo (45 sekund do 2

minuti pri 72C).

Po prvi denaturaciji dobimo enoverino DNA, ki slui kot matrica za sintezo novih

odsekov. tevilo kopij elenega odseka DNA po n ciklih znaa 2n kopij. Po fazi

konnega podaljevanja pri temperaturi 72C (po zadnjem ciklu), sledi inkubacija DNA pri

4C.


22

3.3.1 POMOEVAJE ODSEKA DA

S PCR reakcijo smo pomnoili 80 bp dolg odsek DNA, ki je vseboval del introna 6 gena

GSTM3.

3.3.1.1 PRIPRAVA REAKCIJSKE ZMESI

Klju za uspeno pripravo reakcijske zmesi za PCR reakcijo je, da delamo v fizino

loenem prostoru z ustrezno stopnjo istoe. V laboratoriju za PCR smo uporabljali isto

delovno haljo in rokavice brez smukca. Vse delovne pripomoke, kot so polavtomatske

pipete in ves plastini pribor, ki smo ga uporabili v delovni komori, smo pred uporabo

avtoklavirali, oziroma smo uporabili sterilne nastavke za pipete. Reakcijsko zmes smo

pripravili v za to namenjeni delovni komori. Delovno povrino komore smo pred zaetkom

dela oistili z 10 % etanolom, delovne pripomoke pa s 3 % hipokloritom (pripravljen z

razredevanjem iz 13 % natrijevega hipoklorita, NaOCl). Prav tako smo s 3 %

hipokloritom obrisali katlice z nastavki za pipete in steklen kozarec, v katerem smo imeli

shranjene avtoklavirane plastine epruvete s pokrovkom. Te pripomoke smo nato

postavili v delovno komoro. Vse pripomoke, ki smo jih zloili v delovno komoro, smo

nato za 30 minut izpostavili UV svetlobi. Delovne raztopine DNA smo shranjevali v

hladilniku pri temperaturi 4C, preiene vzorce DNA pa v zamrzovalniku pri -20C.

Reagente smo prav tako shranjevali v zamrzovalniku pri -20C, pred uporabo smo jih

odmrznili in dobro premeali. DNA polimerazo Taq smo vzeli iz zamrzovalnika tik pred

uporabo in jo takoj po uporabi vrnili v zamrzovalnik. Pri sobni temperaturi se namre

aktivnost le-te manja.

Reakcijsko zmes smo najprej optimizirali. Po optimizaciji smo jo, brez dodatka DNA,

pripravili po predpisu (Preglednica IX). Pripravili smo jo v 3 do 20-kratni koliini, jo

dobro premeali in v vsako plastino epruveto s pokrovkom odpipetirali po 19,0 L. Nato

smo v vse posamezne epruvete, razen v eno, dodali 1,0 L delovne raztopine vzorne

DNA. Epruveta brez DNA nam je sluila kot slepi vzorec. Plastine epruvete s

pokrovkom smo predhodno ustrezno oznaili s tevilkami vzorcev.


23

Preglednica IX: Sestava reakcijske zmesi za pomnoevanje DNA odseka s PCR po optimizaciji.

Reagent Volumen (L) pufer 10x 2,0 L

dNTP (2mM) 2,0 L

istosmerni zaetni oligonukleotid 2,0 L

obratnosmerni zaetni oligonukleotid 2,0 L

MgCl2 2,4 L

avtoklavirana ultraista voda 8,5 L

AmpliTaq Gold polimeraza DNA

(5U/L)

0,1 L

DNA 1,0 L

Konni volumen zmesi 20,0 L

Zaradi izredno nesimetrinih vrhov pri genotipizaciji z nedenaturacijsko tekoinsko

kromatografijo visoke loljivosti, smo za pomnoevanje tirih vzorcev namesto DNA

polimeraze AmpliTaq Gold, uporabili DNA polimerazo Optimase Polymerase. DNA

polimeraza Optimase Polymerase potrebuje za optimalno delovanje nekoliko drugano

reakcijsko zmes, namesto MgCl2 pa smo uporabili MgSO4 (Preglednica X):

Preglednica X: Sestava reakcijske zmesi za pomnoevanje DNA odseka s PCR z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase .

Reagent Volumen (L) pufer 10x 2,0 L

dNTP (2mM) 1,6 L

istosmerni zaetni oligonukleotid 1,5 L

obratnosmerni zaetni oligonukleotid 1,5 L

MgSO4 1,2 L

avtoklavirana ultraista voda 10,8 L

Optimase Polymerase polimeraza DNA 0,4 L

DNA 1,0 L

Konni volumen zmesi 20,0 L

V Preglednici XI so zbrani podatki o zaetnih oligonukleotidih. Med njimi je predvsem

pomembna Tm, saj nam omogoa izbiro primerne temperature v fazi prileganja zaetnih

oligonukleotidov.


24

Preglednica XI: Zaporedje zaetnih oligonukleotidov.

Poli-morfizem

Ime zaetnega oligonukleotida

Zaporedje

[5' 3']

Dolina [bp]

Tm [C]

delAGG

GSTM3delAGG-F

AAATTCTCATGGTTTGCCGG 20 58,4

GSTM3delAGG-R

AGTAGTAGCCTGCAGAGATAGA 22 60,8

Spodaj je prikazano zaporedje odseka DNA, ki smo ga pomnoevali s PCR reakcijo.

Oznaeno je tudi mesto delecije treh baznih parov (krepko in podrtano). Mesti, kjer se

prilegata zaetna oligonukleotida, sta oseneni s sivo barvo. Z zeleno barvo je oseneno

mesto zaetka introna 6 (G) in mesto konca introna 6 (T) gena GSTM3.

5'AAATTCTCATGGTTTGCCGGGGAAAAGGTAGGAAGAAGGGAAAAGA

AGAGGATACTTCTCTATCTCTGCAGGCTACTACT3

3.3.1.2 POTEK REAKCIJE PCR

Preden smo dali epruvete s pokrovkom, ki so vsebovale reakcijsko zmes, v ciklini

termostat, smo jih dobro premeali in centrifugirali. Tako smo zagotovili, da je bila vsa

reakcijska zmes homogena in na dnu epruvete, kar omogoa optimalen potek reakcije. Za

pomnoevanje vzorne DNA smo uporabili temperaturni program (Preglednica XII),

katerega smo doloili s predhodno optimizacijo.

Preglednica XII: Shema temperaturnega programa.

Stopnja reakcije delAGG

T [C] t tevilo ciklov Zaetna denaturacija 95 10 min

Denaturacija 95 1 min

Prileganje zaetnih oligonukleotidov

56,5 30 s

Podaljevanje 72 20 s

Konno podaljevanje

72 8 min

Prekinitev reakcije 8

3

38-krat


25

Kot smo omenili e prej, smo za pomnoevanje nekaj vzorcev uporabili DNA polimerazo

Optimase Polymerase. Le-ta, ne samo, da zahteva pripravo drugane reakcijske zmesi,

ampak zahteva tudi drugaen temperaturni program ciklinega termostata (Preglednica

XIII):

Preglednica XIII: Shema temperaturnega programa pri pomnoevanju z uporabo DNA polimeraze Optimase Polymerase.

Stopnja reakcije delAGG

T [C] t tevilo ciklov Zaetna denaturacija 95 5 min

Denaturacija 95 30 s Prileganje zaetnih oligonukleotidov

56,7 30 s

Podaljevanje 72 15 s

Konno podaljevanje

72 5 min

Prekinitev reakcije 8

Skozi celoten potek pomnoevanja DNA smo ogrevali tudi pokrov ciklinega termostata,

saj smo tako prepreili izhlapevanje reakcijske zmesi in posledino izgubo produktov.

Temperatura pokrova je bila ves as konstantna, in sicer 110C.

3.3.1.3 PREVERJANJE USPENOSTI PCR REAKCIJE

Po konani PCR reakciji smo preverili, ali so v vseh epruvetah nastali produkti, in ali so

nastali v dovolj veliki meri. Prav tako smo preverili, e so v slepem vzorcu nastali produkti

in tako ugotovili ali je morda prilo do kontaminacije. To smo naredili s pomojo

agarozne gelske elektroforeze. Agarozna gelska elektroforeza je separacijska metoda, ki

temelji na potovanju nabitih delcev v elektrinem polju. Loevanje nukleinskih kislin

poteka na osnovi velikosti, saj potujejo manji fragmenti proti anodi hitreje kakor veji.

Razmerje med velikostjo in nabojem je pri vseh nukleinskih kislinah enako (59). Po

konani elektroforezi smo s pomojo etidijevega bromida, ki smo ga predhodno vgradili v

gel, detektirali DNA. Etidijev bromid je planarna molekula, ki se interkalira med bazne

pare dvovijane DNA. Interkalirane molekule pod UV svetlobo fluorescirajo veliko

3

30-krat


26

moneje, kakor proste molekule, kar izkoristimo za detekcijo poloaja lis (DNA) na gelu

(60).

Detekcijo smo izvajali na 2 % agaroznem gelu, sestavo katerega prikazuje Preglednica

XIV. Ustrezno koliino agaroze smo natehtali v erlenmajerico, dodali TAE pufer in pokrili

z urnim steklom. Isto erlenmajerico smo postavili na tehtnico in jo starirali. Erlenmajerico

smo segrevali v mikrovalovni peici, in sicer trikrat po 30 sekund. Vmes smo vsebino

dobro premeali, da se je stalila vsa agaroza. Erlenmajerico smo nato ponovno postavili na

tehtnico in dodali ustrezno koliino pufra, ki je izparel med segrevanjem. Vsebino smo

spet premeali, nato pa erlenmajerico postavili na pult, da se je agaroza zaela ohlajati.

Medtem smo pripravili nosilec za gel (velikosti 10x15 cm), ki smo ga vpeli v podstavek in

ga zatesnili iz obeh strani. Na nosilec smo postavili dva glavnika, od katerih vsak

omogoa nastanek 30 epkov v ohlajenem agaroznem gelu. Ko se je agaroza ohladila na

priblino 50C, smo vanjo odpipetirali 6 L etidijevega bromida, vsebino dobro premeali

in vlili v nosilec. Preverili smo, da v ulitem gelu ni zranih mehurkov, e pa so bili

prisotni, smo jih s spatulo odstranili. Ves postopek, od dodajanja etidijevega bromida do

vlivanja, smo izvajali v digestoriju, na rokah pa smo imeli posebne rokavice, saj je etidijev

bromid mutagen, potencialno pa tudi teratogen in kancerogen. Nosilec za gel smo nato

prekrili s kartonom in tako prepreili razpadanje etidijevega bromida na svetlobi. Gel se je

strdil v priblino pol ure, nakar smo ga s skalpelom razrezali na dva enaka dela, ter ga do

uporabe shranjevali v ustrezno oznaeni plastini vreki v hladilniku pri 4C.

Preglednica XIV: Sestavine za pripravo 2 % agaroznega gela.

Sestavina Koliina

agaroza 1,5 g

TAE pufer 75 mL

etidijev bromid 6 L

Gel smo pred nanosom PCR produktov namestili v elektroforezno kadiko in preverili, da

je bil v celoti potopljen v TAE pufer. PCR produkte smo pred nanosom pomeali z

nanaalnim pufrom, ki vsebuje glicerol in ksilencianol. Glicerol povea gostoto vzorca in

omogoi usedanje PCR produktov v epek. Ksilencianol modro obarva vzorce, kar olaja

nanos le-teh v epke, poleg tega pa omogoa spremljanje hitrosti potovanja proti anodi. Na

parafilm smo zato vekrat nanesli po 2 L nanaalnega pufra, nato pa pred nanosom PCR


27

produkta le-tega pomeali z nanaalnim pufrom (vsak vzorec z 2 L nanaalnega pufra). V

prvi epek smo nanesli 2 L oznaevalca velikosti DNA fragmentov. V naslednje epke pa

smo zaporedoma nanaali po 2 L produktov posameznih vzorcev. Nazadnje smo v epek

nanesli e 2 L slepega vzorca. Elektroforeza je potekala 20 minut pri napetosti 90 V. Po

konani elektroforezi smo gel prenesli v komoro z digitalnim fotoaparatom in ga

fotografirali. Z ustrezno programsko opremo smo dokumentirali gel in na fotografiji

doloili poloaj ter jakost lis.

3.3.2 REAGETI I OPREMA

3.3.2.1 VERINA REAKCIJA S POLIMERAZO

REAGENTI:

avtoklavirana ultraista voda (aparat Elga, Purelab Classic)

10x PCR pufer Gold Buffer MgCl2, 25 mM, 1,5 mL (Applied Biosystem, Roche,

ZDA); sestava: 150 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH (pufer) = 8, pri T = 25C

raztopina dNTP, 2mM; sestava: 10 L vsake od raztopin dATP, dGTP, dCTP in

dTTP koncentracije 100 mM z dodatkom 460 L avtoklavirane ultraiste vode

(Perkin Elmer)

25 mM raztopina MgCl2 (Applied Biosystem, Roche, ZDA)

zaetna oligonukleotida GSTM3delAGG-F in GSTM3delAGG-F, redenje 1:20

(Qiagen OPERON, Nemija)

delovne raztopine DNA pripravljene z redenjem izolata 1:20

DNA polimeraza AmpliTaq Gold, 5 U/L (Applied Biosystem, Roche, ZDA)

DNA polimeraza Optimase Polymerase, 2,5 U/L (Transgenomic)

APARATURE IN PRIBOR:

avtoklav (Kambi laboratorijska oprema, Semi, Slovenija)


28

delovna komora za PCR (Biosan DNA/RNA UV-Cleaner UVC/T-M-AR, Latvija)

polavtomatske pipete (0,1-2,5 L; 2-20 L; 20-200 L, Eppendorf, Nemija)

mikrocentrifuga (FVL-2400N Combi-Spin, Biosan, Latvija)

ciklini termostat (MWG AG Biotech Primus 96Plus, Nemija)

mikrocentrifuga Mikro-242 (Tehtnica, elezniki, Slovenija)

katlice z avtoklaviranimi nastavki za pipete (Sarstedt, Nemija)

sterilni nastavki za pipete s filtrom e.p.T.I.P.S., 10 L (Eppendorf, Nemija)

avtoklavirane plastine epruvete s pokrovkom, 0,5 in 1,5 mL (Eppendorf,

Nemija)

brezprane rokavice Safeskin PFE, velikost L (Kimberly-Clark)

3.3.2.2 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA

REAGENTI:

agaroza (Agarose for rutine use, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim,

Nemija)

TAE pufer (Tris-acetat in EDTA), redenje 1:50

ultraista voda (aparat Elga, Purelab Classic)

etidijev bromid, 10 mg/mL (Sigma-Aldrich, GmbH, Steinheim, Nemija)

oznaevalec velikosti DNA; fragmenti velikosti 50, 150, 300, 500, 700 in 1000 bp

(PCR Markers G316A, Promega Corp., ZDA)

nanaalni pufer (glicerol in ksilencianol)


elektronska tehtnica Exactan300 EB (Tehtnica, elezniki, Slovenija)


29

mikrovalovna peica

centrifuga Centric 150 (Tehtnica, elezniki, Slovenija)

kadika za elektroforezo (BIO-RAD Wide mini-sub cell, ZDA)

vir napetosti (BIO-RAD Power Pac Basic, 300 V/400 mA/75 W)

komora z UV svetilko ( = 302 nm) in z digitalnim fotoaparatom za slikanje gelov

(UVI Tec)

raunalnik s programom UVI Photo (verzija 99.01s za operacijski sistem Windows)

polavtomatska pipeta (2-20 L, HTL, Poljska)

erlenmajerica z ozkim vratom (200 mL)

merilni valj (100 mL)

urno steklo

plastina lica

gumijasta prijemalka za vroo steklovino

parafilm

oranne rokavice (Orange Nitrile 260, SHIELDSkin)

nosilec za gel z glavniki za tvorbo epkov

polavtomatska pipeta (2-20 L)

avtoklavirani nastavki za pipete (Sarstedt, Nemija)

3.4 DEATURACIJSKA TEKOISKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOLJIVOSTI

Analiza nukleinskih kislin z denaturacijsko tekoinsko kromatografijo visoke loljivosti

(DHPLC) temelji na reverznofazni ionsko-izmenjevalni tekoinski kromatografiji.


30

Nukleinske kisline lahko analiziramo pri razlinih pogojih, ki se razlikujejo po

spremembah temperature:

popolnoma denaturacijski pogoji (75 80C; loitev na podlagi velikosti ali

velikosti in zaporedja)

delno denaturacijski pogoji (50 75C; loitev na podlagi velikosti in zaporedja)

nedenaturacijski pogoji (45 50C; loitev na podlagi velikosti)

Za detekcijo se uporabljajo UV detektorji (254 nm). Le-ti omogoijo, da zaznamo

nukleinske kisline v koncentracijah, ki so vije od 0,5 ng na vrh.

Za genotipizacijo s PCR reakcijo pomnoenih produktov smo uporabili nedenaturacijske

pogoje, saj je metoda dovolj obutljiva, da loi fragmente, ki se razlikujejo za dolino 3 bp.

Uporabili smo sistem WAVE proizvajalca Transgenomic. Sistem je popolnoma

avtomatiziran. Povezan je z raunalnikom, na katerem nam ustrezna programska oprema

(Navigator Software) omogoa nastavitve pogojev oziroma programa analize,

spremljanje napredovanja analize in pregled rezultatov.

Slika 7: Shematski prikaz aparature DHPLC sistema WAVE; A pufer A, B pufer B, C raztopina za spiranje igle, D raztopina D.

VZOREC GRELEC


31

Princip lobe temelji na interakcijah negativno nabite molekule DNA s stacionarno fazo.

Stacionarno fazo sestavljajo nepolarni hidrofobni materiali, med katere spadajo razlini

alkilirani polistiren-divinilbenzenski delci ali pa delci alkiliranega silikagela. V naem

primeru so stacionarno fazo predstavljali C18-alkilirani polistiren-divinilbenzenski delci.

Vezavo negativno nabite DNA na stacionarno fazo omogoa pozitivno nabiti reagent,

trietilamonijev acetat (TEAA), ki se s pozitivno nabito amonijevo skupino vee na DNA, s

hidrofobnimi etilnimi skupinami pa na stacionarno fazo (Slika 8). Interakcija med DNA in

stacionarno fazo je tem moneja, im dalji je odsek DNA. Elucijo DNA doseemo pri

optimalni temperaturi s poveevanjem koncentracije organskega topila. Najvekrat je to

acetonitril.

Slika 8: TEAA omogoi vezavo negativno nabitih molekul DNA na C18-alkiliran polistiren-divinilbenzenski delec.

3.4.1 PRIPRAVA MIKROTITRSKE PLOE

Pred nanosom vzorcev smo si zaradi lajega sledenja le-teh pripravili preglednico, v katero

smo zabeleili, kateremu vzorcu pripada katera vdolbinica. Ta ukrep je pomemben, saj

tako prepreimo zamenjavo vzorcev ali pa napake pri pipetiranju. Prav tako smo

preglednico potrebovali kasneje pri pripravi programa analize z ne-DHPLC, kjer smo z

vnosom pozicij vzorcev in njihovih tevilk poskrbeli, da so se rezultati analize ujemali s

tevilko posameznega vzorca.


32

V vsako vdolbinico, razen v eno, smo nanesli po 12 L vzorca. Prazna nam je sluila za

ekvilibracijo aparature DHPLC. Pri pripravi ploice smo namesto enega vzorca nanesli 10

L standardne raztopine odsekov DNA znanih dolin (DNA sizing standard), ki nam

omogoi doloitev doline analiziranega odseka DNA. Ko smo konali s pripravo ploice,

smo jo pokrili z avtoklaviranim gumijastim pokrovom, centrifugirali dve minuti (tako smo

poskrbeli, da na steni vdolbinic niso ostale kapljice s produktom), nato pa ploico vstavili

v nosilec za mikrotitrske ploice v DHPLC aparaturi. Nosilec ves as analize vzdruje

konstantno nizko temperaturo (T = 2-20C). Tako je prepreeno izparevanje vzorcev in

posledino poveana optimalnost analize.

3.4.2 PRIPRAVA APARATURE DHPLC ZA AALIZO

Preden smo zaeli z analizo vzorcev, smo morali v skladu s standardnim operativnim

postopkom pripraviti celoten sistem. Standardni operativni postopek (SOP) je priloen

aparaturi DHPLC (priloi ga proizvajalec, v tem primeru Transgenomic). Sprva smo

preverili, ali je koliina pufrov zadostna za nemoten potek analize. Nato smo iz kolone

odstranili morebitne mehurke in sprali iglo, ki avtomatsko odpipetira vzorce iz vdolbinic.

Preverili smo e nivo odpadnih tekoin v za to namenjenem zbiralniku. Nazadnje smo e

ekvilibrirali kolono. To smo storili s 50 % pufra A in 50 % pufra B. Ekvilibracija je pri

pretoku 0,9 mL/min trajala 30 minut. Med celotnim postopkom smo kontrolirali tlak v

koloni.

3.4.3 POTEK AALIZE

Metodo smo po nastavitvah vseh parametrov v skladu s SOP morali e optimizirati. Tako

smo zagotovili pogoje, potrebne za genotipizacijo naih vzorcev. Odloili smo se za

analizo pod nedenaturacijskimi pogoji. Vzorce smo iz kolone eluirali z uporabo linearnega

gradienta pufrov A in B. Zaetno razmerje pufrov se v odvisnosti od asa spreminja, tako

da se vea koliina pufra B. To nam omogoa postopno eluiranje odsekov DNA, saj pufer

B vsebuje acetonitril.

Analiza se zane z avtomatskim injiciranjem produkta PCR reakcije v kolono, kjer sledi

vezava odsekov DNA na stacionarno fazo preko TEAA mosta, nato pa gradientna elucija


33

iz kolone ob zveznem spreminjanju razmerja pufra A in pufra B (pretok 0,9 mL/min).

Aparatura po konani eluciji avtomatsko poskrbi za ienje in ekvilibracijo kolone, ter jo

tako pripravi za analizo naslednjega vzorca. Potek analize po posameznih stopnjah, as

analize in dele pufrov v posamezni stopnji so zbrani v Preglednici XV:

Preglednica XV: Potek analize z metodo ne-DHPLC.

Stopnja analize as (min) Dele pufra A ( %) Dele pufra B ( %)

Injiciranje 0 65 35

Zaetek gradienta 1 60 40

Konec gradienta 5,5 51,9 48,1

Zaetek ienja 5,6 65 35

Konec ienja 6,1 65 35

Zaetek ekvilibracije 6,2 65 35

Konec ekvilibracije 6,6 65 35

Temperatura grelca je bila skozi celoten as analize konstantna in je znaala 50C.

Volumen injiciranega vzorca je znaal 8 L. Dele pufra B je med procesom elucije

naraal s hitrostjo 1,8 % na minuto. Odseke DNA smo po eluciji iz kolone detektirali z

UV detektorjem pri valovni dolini 254 nm. Pri tej valovni dolini namre DNA molekule

absorbirajo UV svetlobo. Analiza enega vzorca je znaala priblino 7,9 minut.

3.4.4 REAGETI I OPREMA

REAGENTI:

WAVE DNA Sizing standard (DNA odseki dolin 80, 102, 174, 257, 267, 298,

434, 458 in 587 bp; Transgenomic Inc, Omaha, ZDA)

pufer A (WAVE Optimized Buffer A; 0,1 M TEAA, raztopina v vodi, pH = 7;

Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija)

pufer B (WAVE Optimized Buffer B; 0,1 M TEAA, raztopina v vodi, 25 %

acetonitril, pH = 7 ; Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija)

raztopina D (WAVE Optimized Solution D; 25 % voda, 75 % acetonitril;

Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija)


34

raztopina za spiranje igel (WAVE Optimized Syringe Wash Solution; 96 % voda,

4 % acetonitril; Transgenomic Ltd, Elancourt, Francija)

Opozorilo: Pri rokovanju s pufri za DHPLC, predvsem s tistimi, ki vsebujejo acetonitril,

nujno uporabljamo rokavice; acetonitril je namre toksien ob inhaliranju in stiku s koo.


DHPLC aparatura: WAVE MD System model 4000 Plus s separacijsko kolono

DNASep ter s programsko opremo Navigator Software (Transgenomic Inc,

Omaha, ZDA)

polavtomatska pipeta (2-20 L, Eppendorf, Nemija)

avtoklavirani nastavki za pipete (Sarstedt, Nemija)

mikrotitrske ploice (96 vdolbinic; Thermo Scientific, VB)

avtoklavirani gumijasti pokrovi za mikrotitrske ploice

brezprane rokavice Safeskin PFE, velikost L (Kimberly-Clark)

3.5 SEKVEA AALIZA

3.5.1 PRIPRAVA VZORCEV

Po konani genotipizaciji vzorcev smo se odloili, da dobljene rezultate preverimo s

sekvenno analizo. Med dobljenimi rezultati analize z ne-DHPLC smo izbrali po enega za

vsakega izmed treh genotipov, in sicer enega z genotipom +/+ (wild type, brez

prisotnega polimorfizma; vzorec t. 730), enega za genotip -/+ (heterozigot; vzorec t. 686)

in enega z genotipom -/- (mutiran homozigot; vzorec t. 983). Izbrane vzorce smo e enkrat

pomnoili pod enakimi pogoji s pomojo PCR reakcije, razlika je bila le ta, da je tokratni

konni volumen reakcijske zmesi v epruveti s pokrovom znaal 50 L. Uspenost PCR

reakcije smo preverili na agaroznem gelu.

Preden smo vzorce poslali na sekvenciranje, smo jih morali ustrezno oistiti, saj je le tako

mogoa tona doloitev zaporedja nukle

univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo · chromatography (non-dhplc) and have determined...

Documents