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Universo Diagnóstico

DirectorDr. Julio Beltrán Hernández

Médico Especialista de II Grado en HematologíaInvestigador Auxiliar

Secretaria MC. Patricia Hernández Díaz

Secretaria EjecutivaLic. Jazmín Rodríguez Cruz

Comité de RedacciónLic. María Elena Trujillo Rexach

Lic. Igrid García GonzálezDra. Juana Duany

MC. Félix Ganem BáezTéc. Meybol Moya Mederos

Lic. Daymara González Fuentes

Edición y diseño interior: Lic. Ileana Herrera LópezDiseño de cubierta: Lic. María Elena Trujillo Rexach

Realización formato HTML y PDF: Lic.Jazmín Rodríguez CruzTraducción : Lic. Emma Rodríguez Durán

La revista Universo Diagnóstico tiene como objetivo que los profesionales y técnicos vinculados de unforma u otra con el mundo de los DIAGNOSTICADORES, publiquen sus experiencias y los resultados de sustrabajos científicos con rigor pero de forma ágil, novedosa y que permita su divulgación nacional e internaca través de la página WEB de salud. También se pretende dar la oportunidad a productores, comercializay otros interesados en esta temática de promover sus productos y servicios en una publicación electrespecializada.Su frecuencia es semestral.y el formato electrónico en HTML y PDF.

2000

Calle 102 e/ 31 y 31B, Marianao, Ciudadde La Habana, Cuba.

E-mail: beltranh@infomed.sld.cu

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Intrucciones al autor abreviadas

Los artículos deben ser inéditos y una vez aceptados pasarán a ser propiedad de esta revista para su pubSe presentarán impresos a 2 espacios, por una sola cara, y un disquete con el texto cargado. Se utilWord como procesador de textos.

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Las figuras se harán en los software especializados para su realización y se colocarán en ficheros aparTambién debe presentarse una copia impresa de éstos. Si no es posible su realización (salidas de ecromatografías, etc.) deben ser escaneadas y guardadas en ficheros aparte en el disquete.

La redacción de los trabajos científicos se ajustarán al estilo Vancouver aceptado en las revistas biomé

Título (con no más de 15 palabras)Nombre y apellidos de los autores: con su grado científico y categoría docente e investigativa. Dirección teléfono.Resumen: Informativo, de 150 palabras como máximo, donde sintetice los objetivos, métodos, resultadprincipales conclusiones. Al final del resumen debe colocar las palabras clave.IntroducciónMétodosResultadosDiscusiónLos resultados y la discusión deben presentarse separados.Las conclusiones no se presentarán aparte, deben estar desarrolladas en la discusión y mencionadaresumen.

La bibliografía debe quedar acotada en el texto y relacionada al final del artículo con la numeracconsecutiva, en hojas aparte. Se recomienda por el estilo Vancouver seguir estas guías para citar las ry los libros

Revistas:Cañedo Andalia R. La revolución de los años 90 en el sector informativo-bibliotecario. ACIMED 2000;3(129.Si son varios autores se separan por una coma.Libros:Lee JV.Vibrio, Aeromonas and Plesiomonas. En: Parker MT,Duerden BI,eds. Topley and Wilson’s principof bacteriology, virology and inmunology. 8 ed. London: Eward Arnold, 1990, vol.2:526.

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SUMARIO

EDITORIAL

“El testamento del último milenio” / 5Julio Beltrán Hernández

ARTÍCULOS ORIGINALES

Comportamiento de diferentes sistemas tampón en equipo PhastSystem / 8Hilda Marilín García, David Higginson, Odalys Martín y Félix Ganem

Detección de anticuerpos antineuronas en pacientes con enfermedades del sistemnervioso: estudio preliminar / 14Odalis Asín Milán, Raisa Jofra Hernández, Arturo Muster, Orestes Ponce de León y Roberto AlegMéndez

Determinación de anticuerpos anti-DNA de doble cadena sobre preparaciónnacional de Crithidia luciliae / 17Elena Kokuina, Igrid García, Javier Suárez, Aracelis Chico y Nelsa Casas

Obtención de sustancia específica de grupo AB a partir de meconio / 21 Jorge Luis Leyva Torres, Elvira Gallardo Rodríguez, Alicia Luberta Lugo e Ibraín Reyes Valdés

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

La ética y la ciencia en la donación de sangre voluntaria / 24Patricia Hernández Díaz, Antonio Bencomo Hernández, María Elena Alfonso Valdés y Pablo CastañedaGamboa

Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia / 30Hilda Marilín García Pérez

SECCIÓN INFORMATIVA

Noticias / 41Frases famosas / 43

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CONTENTS

EDITORIAL

The testament of the last Milenium / 5Julio Beltrán Hernández

ORIGINAL AR TICLES

Behavior of different buffer systems in the phastsystem equipment / 8Hilda Marilín García, David Higginson, Odalys Martín y Félix Ganem

Detection of antineuron antibodies in patients with nervous system diseases:preliminary study / 14Odalis Asín Milán, Raisa Jofra Hernández, Arturo Muster, Orestes Ponce de León y Roberto Ale

Mendez

Determination of anti-DNA antibodies of double chain-upon a national preparationCrithidia luciliae / 17Elena Kokuina, Igrid García, Javier Suarez, Aracelis Chico y Nelsa Casas

Obtainment of specific substance of group AB from meconium / 21Jorge Luis Leyva Torres, Elvira Gallardo Rodríguez, Alicia Luberta Lugo e Ibraín Reyes Valdés

REVIEW ARTICLES

Ethics and science in the volunteer blood donation / 24Patricia Hernández Díaz, Antonio Bencomo Hernández, María Elena Alfonso Valdés y Pablo CastañedaGamboa

Electrophoresis in polyacrylamide gels: foundations, present time and importance / 30Hilda Marilín García Pérez

INFORMATIVE SECTION

News / 41Famous phrases / 43

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EDITORIAL

“El testamento del último milenio”

Muchas personas pensaron que el año 2000 sería seguido de grandes desastres provocados popoca prevención de los creadores de la tecnología computacional alcanzada hasta ese momenEl fenómeno 2YK amenazaba el mundo, sin embargo, no pasó nada. Históricamente en cadanuevo siglo el mundo ha temido el advenimiento de su destrucción quizás porque el comienzo un nuevo milenio es la pauta, el pretexto al que nos aferramos para renovarnos en la historia qupodría aprender de su pasado y tratar de evitar las actividades negativas que nos dañan. Siembargo, el curso de la humanidad lleva un cause difícil de transformar y muchas de estas accionse repiten como parte de su propia naturaleza. El cambio, entonces, está en los descubrimientoel avance de las ciencias; la tecnología lograda hasta ahora va más allá de la ficción, la medicinaha alcanzado niveles que se creían imposibles y los hallazgos astronómicos están convirtiendo espacio en una opción conocible

Los adelantos tecnológicos y su innovación sin reposo auguran una nueva revolución en locampos de la electrónica, la robótica, la información, la biotecnología y los transportes ¡Veamos!:El ADSL ( Asymmetric Digital Subcriber Line) y el cable, pelean por la posición de ser el proveedorprincipal de servicios en las comunicaciones; pero esta lucha se decidirá de acuerdo con lasnecesidades de los usuarios. El cable es más práctico para las residencias mientras el ADSL conviemás en las pequeñas empresas por su rapidez y economía y utiliza una línea telefónica de cobEstas dos tecnologías permitieron unir el uso del teléfono, Internet y la televisión y predicen qupronto será posible programar todos los aparatos electrónicos desde fuera de la casa. En laactualidad Cablevisión Systems Corporation ( ASE:CVC) y Sony Corporation of American desarrollanuna nueva plataforma de entretenimiento y comunicación digitales para el área metropolitana deNueva York. Más de cuatro millones de personas en esa ciudad tienen acceso a este servicio quincluye video instantáneo, que significa al oprimir un botón del control remoto obtener acceso avarias películas, programas de televisión y videos, Internet, revisar el e-mail al utilizar el cursorde pantalla o un teclado o control remoto.

El sonido digital tiene la mejor calidad en existencia y el método de LINKTH de interaccióndigital y la protección del contenido de la transmisión (5C DTCP), permiten la recepción de lasseñales de televisión de alta definición inaugurada por la Panasonic en marzo del 2000 con imágengeneradas por sesenta marcos por segundo libres de artefactos entretejidos.

Nuevas tecnologías para WWW, dos de estas, el XML y el RDF, prometen cambiar el uso de lascomputadoras para siempre. El primero es un formato para publicaciones electrónicas a granescala. El segundo ofrece una capa de metadatos, es decir una descripción de datos aparte deinformación ya marcada en XML. Esta tecnología mejora la capacidad de los promotores debúsqueda, apoya a los agentes de software y crea nuevas formas de archivar información paramejorar la navegación. La computadora para ciegos con un sistema Braille desarrollada por la

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empresa neozelandesa Pulse Data International. El ayuda lector, que es un equipo con mecanismos, qu“lee” el libro en voz alta.

El oler por Internet es otro logro. El procedimiento consiste en tres fases: primero, un olfateaque captura aromas electrónicamente, después un descifrador que interpreta la información a pde una matriz de ciento cincuenta olores y, finalmente se trasmite la fragancia al receptor, computadora personal, un televisor o un proyector de cine robotizado.

El sistema quirúrgico Da Vinci fue aprobado el pasado año por el Food and Drug Administration delos EE.UU. Esta tecnología es menos destructora y más precisa, permite una recuperaciónrápida y por consecuencia menos costos. El robo Da Vinci permite al cirujano manipular instrumencon puntos de 15 mm -más o menos el diámetro de un lápiz- dentro de espacios pequeños y minlos movimientos manuales a un cuarto de su tamaño. Los cirujanos manipulan el robot al movemanos y los pies. Las manos del robot se colocan dentro del cuerpo del paciente y reproducemovimientos del cirujano o sea corta, cose, une, cauteriza, se hace hacia atrás... según se lo hordenado las manos del médico. Con este aparato las incisiones son pequeñas no hay que huesos, también permite una recuperación más rápida, menos transfusiones de sangre y cicamás pequeñas. El entrenamiento para su uso además de la manipulación del sistema, inclucorrección de posibles fallas como son los cables desconectados y lentes sucios.

Los chips para Internet en aparatos comunes, los bomberos electrónicos, los coches híbridos, tamaparecen en el “Testamento” al igual que lo logrado en la astronaùtica y la astronomía, que yaobserva el universo desde el mismo espacio con descubrimientos que han sorprendido a los mastrónomos. Todo esto ha permitido el desarrollo de las comunicaciones por satélites, la predicdel clima, de epidemias, mayor seguridad en la navegación marítima, así como la mejora demapas, soluciones para las sequías y las cosechas. Con respecto a la llamada ciencia de la tietoma conciencia de que una explotación irracional ha puesto en peligro el equilibrio vital del planelos científicos buscan las fórmulas que lo salven.

De todo este patrimonio, el mapa del genoma humano dado a conocer el 26 de junio del paaño es unos de los hechos que más influencia tendrá para el desarrollo de las ciencias biológicel futuro pues permitirá aislar los genes que provocan las enfermedades genéticas, el procesenvejecimiento y ciertos comportamientos humanos lo que sin duda llevará a una nuinterpretación de la evolución mediante la comparación de los genes en las distintas espeAdemás tendremos la capacidad de manipular los genes de nuestros descendientes escogiencaracterísticas físicas y algunas de su comportamiento. Las enfermedades genéticas desaparey el diagnóstico específico de otras permitirán que se traten con nuevos medicamentosadecuados. Aunque existen discusiones sobre lo ético de estas manipulaciones genéticas, las téde hibridización y clonación se practican en plantas y animales e incluso en el hombre. El pasaño en la universidad KyungHee de Corea del Sur, Lee Bo Yeon y otros anunciaron que habíanclonado células humanas en la clínica de infertilidad de la escuela utilizando seis óvulos demujeres, los sacaron de los ovarios y después cambiaron los núcleos por los de células somordinarias de la misma mujer. El procesamiento provocó la división del huevo. Este pudo implantado en el útero para producir un clon humano, una persona genéticamente idéntica mujer que dio el óvulo.

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Los científicos coreanos pararon el experimento antes de implantar el óvulo en la matriz, nseguro que se hubiera producido un clon, sin embargo, es obvio que el momento en que estopasar se acerca día a día, aunque en la oveja Dolly se produjo después de 250 abortos. Los aby fetos mal formados que resultaron de las investigaciones no serían aceptados en los humanembargo, si las investigaciones continúan se considera que será imposible evitar la eventual clonen humanos. Por otra parte la compañía Human Genoma Sciences ha “patentado” un gen, el CCR5que es necesario para la entrada en la célula de virus del SIDA y que puede sentar las basesfuturos fármacos, también se ha identificado el gen que provoca el cáncer del pulmón poequipo de investigadores del Hospital Germansw Trial Pujol, de Barcelona en España. Se tratan depatentar todos los genes que se identifican y tienen funciones e irónicamente se dice que “la natutiene millones de patentes escondidas”. Lo cierto es que la interacción de todos los conocimieacumulados, que se pueden contar en miles de kilómetos de disco duro de computadoras degeneración puesto unos al lado de otros, dará lugar a nuevas ciencias y especialidades y la apay aplicación de cifras geométricas de nuevos conocimientos hasta ahora inimaginables ¿Serlo suficientemente inteligentes para hacer uso racional de esas sabidurías? ¿Surgirá un nsúper ser humano, más humano? ¡Eso esperamos! Porque de lo contrario sería el términnuestra estancia en el universo.

DR. JULIO BELTRÁN HERNÁNDEZ

Director Laboratorios BETERÁ

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ARTÍCULOS ORIGINALES

LABORATORIOS BETERÁ

Comportamiento de diferentes sistemas tampón en equipoPhastSystem

Dra. Hilda Marilín García1, Dr. David Higginson2 , Lic. Odalys Martín3 y Dr. Félix Ganem2

RESUMEN

El sistema PhastSystem de electroforesis, a pesar de ser uno de los más modernos en el mercado, presenta la dificultad de sudependencia al uso de los geles (PhastGel) y tiras tampón de electrodo que el mercado internacional presenta a elevado precio.Se desarrolló un método de fabricación de geles de poliacrilamida heterogéneos vertidos en moldes de 50 x 43 x 0,45 mm (largo xancho x alto). Se estudió el efecto de diferentes sistemas tampones sobre el poder resolutivo y el tiempo de corrida. Se empleó unamezcla de proteínas patrones con pesos moleculares en el rango de 13 a 66 kDa. Los datos obtenidos se procesan estadísticamcon STATISTIC 5.1 M, 1998. Se obtuvieron geles por el sistema de Laemmli modificado con tiempos de corrida y resoluciónentre bandas sin diferencias significativas con el sistema PhastGel. Estos resultados permiten concluir que los geles preparadoscon el sistema desarrollado sustituyen satisfactoriamente a los PhastGeles originales y que el sistema tampón modificado por losautores es de mejor resultado que el método sin modificar.

Palabras clave: PhastSystem, electroforesis, poliacrilamida.

UNIV DIAG 2000;1(2):8-14

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La electroforesis es un método de separaciónde biomoléculas sobre un soporte sólido(generalmente en forma de gel) quetradicionalmente emplea una fuente de poder yuna cubeta, después de manera independiente srealiza el revelado de este. Sin embargo, se halogrado automatizar esta técnica de forma que enuna unidad integrada (equipo PhastSystem) serealice mediante control computarizado laelectroforesis y el revelado posterior. En aras dela disminución de los costos, existe una tendenciaactual en los países del primer mundo alreacondicionamiento de los equipos y sistemasmanteniendo los parámetros de calidad de losdiseños originales (Block Scientific, INC1 yDiagnostic Consumables, Inc.2); para países deltercer mundo como lo es Cuba, esto reviste unaimportancia mucho mayor.

Para la utilización del equipo PhastSystemes necesario la importación, entre otros insumosde los geles denominados PhastGel y de las tirasde tampones de electrodos. Estos renglones so

1 Máster en Ciencias Bioquímicas. Investigador Agregado.2 Doctor en Ciencias.3 Licenciado en Ciencias Biológicas. Aspirante a Investigador.4 Doctor en Ciencias.

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los más costosos, por lo que se hace necesaria obtención en el laboratorio. Tomando en cuenta loanterior, los autores se propusieron como objetivodesarrollar sistemas de geles de corridas así comde tampones de electrodos con propiedadesimilares a los del PhastSystem.

MÉTODOS

MOLDES DE LOS GELES PARA PHASTSYSTEM

Se emplea como soporte para el gel depoliacrilamida gel bond (Catálogo Sigma, 1998)o cualquier película plástica transparentedegaseada de aproximadamente 0,2 mm dgrosor. El molde confeccionado tiene capacidadpara 2 geles de 50 mm de longitud, 43 mm de anchoy 0,45 mm de grosor.

Zona de concentración: 6 % en T; 3 % en Cy 13 mm de longitud.

Zona de separación: 12,5 % en T; 2 % en Cy 37 mm de longitud.

Temperatura de polimerización: 5 ºC

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SISTEMA DE LAEMMLI UK, 19703

Tampón de gel concentrador: Tris HCl0,125 mol/L pH 6,8, SDS 0,1 %.

Tampón de gel separador: Tris HCl 0,375 mol/LpH 8,8, SDS 0,1 %.

Tampón de electroforesis: Tris HCl 0,05 mol/L,glicina 0,834 mol/L pH 8,3, SDS 0,1 %.

LAGLI

Se adiciona al sistema de Laemmli glicerhasta 10 % en el gel concentrador y 7,5 % engel separador.

LAGLIPH

Se cambia en el sistema de Laemmli el pdel Tris HCl a 8,8 en el gel concentradomanteniendo el glicerol en ambos geles a lconcentraciones similares que LaGli.

LAGLIPHM

Se cambia en el sistema LaGlipH lconcentración del Tris HCl a 0,375 mol/L en egel concentrador.

MÉTODO DE STARR CM, 19974

Tampón de gel separador: Tris acetato0,0679 mol/L pH 7, glicerol 7,5 %.

Tampón de gel concentrador: Tris acetato0,044 mol/L pH 7, glicerol 6,5 %, PEG 8000 5 %

Tampón de electroforesis: Tricina 0,2 mol/L,tris 0,2 mol/L, SDS 0,55 % pH 8,1.

MÉTODO DE WEBER Y OSBORN 19695

Tampón de electroforesis: Fosfato de sodio0,05 mol/L, SDS 0,15 % pH 7,0.

Tampón de gel: Fosfato de sodio 0,1 mol/L,SDS 0,1 %, pH 7,0.

TRIS-ACETATO DECLARADO PARA PHASTGEL6

Tampón de gel separador y concentrador:Tris acetato 0,114 mol/L pH 6,5.

Tampón de electroforesis: Tricina 0,2 mol/L,Tris 0,2 mol/L, SDS 0,55 %, pH 8,1

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Se utilizaron como proteínas patrones: albúmibovina, ovoalbúmina, anhidrasa carbónicquimotripsina, lactoalbúmina, ribonucleasa

9

aldolasa. Para la desnaturalización se mantienen5 min a 100 ºC en el tampón de muestra.

PROGRAMA DE CORRIDA

Precorrida: 250 V,10 mA, 3 W,15 ºC,1V.hAplicación: 250 V, 1 mA, 3 W, 15 ºC, 1 V.hCorrida: Para las corridas se definió como

número de V.h óptimo, el necesario para que elbromofenol azul migre hasta el final del gel:

Laemmli UK: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 61 V.hTris acetato: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 55 V.hWeber K y Osborn M: 250 V, 20 mA, 3 W, 15 ºC,71 V.hStarr C: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 102 V.hPhastGel: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 65 V.hTinción: La tinción se realizó con coomassiebrillante R-250 según PhastsystemDevelopment Technique7

MEDICIONES

Las diferentes mediciones se realizaronempleando un vernier o pie de rey y a partir delpunto de aplicación de las muestras. Sedeterminaron la resolución y el Rf según lasfórmulas siguientes:

2 (Distancia banda 2 – Distancia banda 1) Resolución banda 1 y 2: ––––––––––––––––––––––––– Ancho banda 2 + Ancho banda 1

Distancia de migración de la banda Rf: ––––––––––––––––––––––––––––

Distancia de migración del bromofenol azul

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA),para determinar diferencias significativas entrelas medias de los Rf obtenidos para cada marcadorde peso molecular, la resolución entre bandascontiguas y el tiempo de corrida con los diferentessistemas tampón. En el caso de existir diferenciassignificativas, se evaluaron por una prueba derangos múltiples de DUNCAN. Se determinó laecuación de regresión de las rectas obtenidas

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mediante el ploteo de Rf en función del log PM,calidad de ajuste de estas se definió por el cálcde los coeficientes de determinación. Pacomparación de las pendientes se empleóanálisis de covarianza. Se trabajó con un coeficientede variación menor que 10 %, un nivel dsignificación de a = 0,l05 y el paquete estadístSTATISTIC versión 5.1 M de 1998.

RESULTADOS

Los resultados se presentan en la tabla y elas figuras 1 y 2.

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Fig. 1. Tiempo de corrida de las electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en los sistemas taónestudiados.

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Fig. 2. Comparación de los Rf de proteínas patrón en SDS-PAGE obtenidos por los diferentes sistemas tampón. Los números del 1 arepresentan los pesos moleculares de 13,7; 14,2; 25; 29; 40; 43 y 66 kD respectivamente. La comparación de las medias de estos para cadapunto reflejó la existencia de diferencias significativas. La prueba de DUNCAN demostró que los sistemas PhastGel y LaGlipHM pertenecenal mismo nivel de significación en los marcadores de peso molecular 13,7 y 14 kD.

Fig. 3. Resolución entre las bandas de proteínas patrón obtenidas por SDS-PAGE con los diferentes sistemas tampón. Los números del 1 al6 representan la resolución entre los marcadores de pesos moleculares de 13,7-14,2, 14,2 - 25, 25 - 29, 29 - 40, 40 - 43 y 43 - 66 kDrespectivamente. Al aplicar un ANOVA se observaron diferencias significativas entre estos.

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Tabla 1. Parámetros de las rectas de regresión de los Rf como función del log PM de las proteínas patrón por los diferentes sistemas tampón

Sistema tampón Coeficiente de regresión Significación Coeficiente de determinación (r2) N

Tris-acetato - 0,195 A 0,19802 35Weber y Osborn - 0,1646 C 0,19691 41Starr CM - 0,1934 A 0,19378 40PhastGel - 0,1822 B 0,19741 35Laemmli - 0,1972 A 0,19965 53LaGli - 0,1977 A 0,19714 34LaGlipH - 0,1848 B 0,19812 35LaGlipHM - 0,1859 B 0,19803 55

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DISCUSIÓN

En el sistema de Weber y Osborn5 existendiferencias significativas respecto al PhastGel encuanto a la distancia media recorrida por lmuestras (resultó la menor de todos los estudiacon solo 2,l05 cm) mientras que el tiempo corrida medio es significativamente mayor (fig, 1Es de destacar que en todas las repeticionesnecesario detener la corrida, porque el gel comiea deformarse, se detiene la migración de muestras y la capacidad tampón no es suficiepara mantener el pH (se aprecia el cambiocolor del bromofenol azul a amarillo, lo que indicun pH inferior a 3, y el valor original en el gel es d7), por lo que se determinó que este sistema tamno es apropiado para su empleo en PhastSystem.En el sistema de Starr CM4 el tiempo de corrida esmuy superior al del PhastGel (fig.1) y el gelpresenta tendencia a la separación física entgel concentrador y separador. Estas desventlo hacen no apropiado para el PhastSystem. Elsistema de Tris-acetato tiene el mayor tiempocorrida con diferencias altamente significativas cel resto de los sistemas (fig. 1), sin embargo el muestra una buena adaptación al equiPhastSystem, El sistema de Laemmli UK3 alcanzamenor tiempo de corrida que el resto de los sisteestudiados excepto al del PhastGel (pero sindiferencias significativas con este) así como buecapacidad de adaptación al equipo PhastSystem.Por lo que los autores de este trabajo lo consideapropiado para su uso.

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En el sistema de electroforesis con tampóngel heterogéneos, la diferencia de concentracientre los geles concentrador y separador creapotencial osmótico entre los 2 geles, la difusiódel agua en el gel lo hace inestable y es necesaemplearlos en el día de su preparación. Se reportado una serie de compuestos posiblesadicionar para inmovilizar el agua, sin afectar proceso electroforético.4 El método de Laemmlise modificó con la adición de compuestos qudisminuye la difusión del agua y la ruptura de logeles durante su secado.8 La inclusión de SDS enla muestra permite hacer los geles sin SDS ya qdurante la electroforesis, al gel se le suministra SDproveniente del tampón de corrida manteniendo el nivel de saturación de las proteínas en sistema.9 Por causa de esto en los minigeles paPhastSystem diseñados en este trabajo se eliminel SDS. La inclusión del SDS modifica el sistemy no es necesario que los pH y la fuerza iónica los geles concentrador y separador sediferentes,10 por lo que se igualó el pH a 8,8 y lafuerza iónica a 0,l375 mol/L en ambos geles, consideró que la movilidad del complejo SDS-proteínes insensible al pH en este rango, Esta adaptaciónes además conveniente para evitar la difusión enla zona de concentración y separación.

El tiempo de corrida obtenido en las SDS-PAGcon el sistema de Laemmli, ya sea original modificado, no presenta diferencias significativacon el PhastGel (fig. 1), además la distanciamigrada por las muestras en el gel se logra conmismo valor de VH. Por lo que, considerando esparámetro, el método de Laemmli modificad

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cumple los requisitos de rapidez necesarios paratrabajo con el equipo PhastSystem,

En PhastGel con los marcadores de pesomolecular empleados se obtienen mayores valode Rf (fig. 2), coincidiendo con el sistema dStarr CM y LaGlipHM a peso molecular menoque 14,2, pero sin diferencias significativas respeca la resolución (fig. 3), lo que difiere de reportesobre geles de poliacrilamida para SDS-PAGE eel sistema Tris-Acetato/Tris-Tricina11donde losvalores de Rf son similares a los obtenidos por sistema de Laemmli.3 En el sistema de Weber yOsborn se obtienen valores Rf significativamenmenores que el PhastGel y LaGlipHM (fig. 2), yexiste una menor resolución entre las bandas 29-40 y 43-66 respecto al resto de los sistem(fig. 3), aspectos que se pueden considerar codesventajas de este y que posiblemente esimplícitos en el comportamiento de la electroforescontinua. Al probar el sistema descrito por StaCM en el equipo PhastSystem en cuanto alcomportamiento de los diferentes marcadores peso molecular, se obtuvieron niveles de migracisin diferencias significativas con PhastGel en 13,7;14,2; 25 y 43; mientras que presenta diferencien el resto de los marcadores. Es de destaque en la resolución entre 25-29 y 43-66 se obtieun valor significativamente superior al obtenido poPhastGel. En el sistema de Laemmli original ymodificado a pesar de que se obtuvierodiferencias significativas en varios Rf respecto PhastGel (fig. 2), al analizar la resolución no seencontraron diferencias significativas entre ello(fig. 3), lo que significa que la migración neta fumayor, pero no la relación de la distancia entre lbandas y el ancho de estas,

En la tabla I se observa que el coeficiende determinación obtenido con el sistema tampde Starr CM al ser aplicado en el equipPhastSystem presenta un valor más pequeñcomparado con el resto de los sistemas tampestudiados, a pesar de esto el ajuste de la rectaregresión no puede considerarse malo, pues mde 93 % del error total está explicado y por endeliminado por la regresión; el resto de locoeficientes de determinación oscilan entre 0,l969y 0,l9965, lo que demuestra un buen ajuste. Tambpuede apreciarse en el análisis de los coeficiende regresión obtenidos en la SDS-PAGE con l

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diferentes sistemas tampón, se destaca que el valordel PhastGel es similar a los obtenidos por el sistemaLaGlipH y LaGlipHM. A un grupo de mayorpendiente pertenecen los sistemas Tris Acetato,Starr, Laemmli y LaGli. La menor pendiente seobtiene con el sistema continuo de Weber y Osborn(característico de los sistemas continuos).

Se concluye lo siguiente:

1. Se obtuvieron moldes para la polimerizaciónsimultanea de dos geles de poliacrilamidasimilares al PhastGel,

2. Se modificaron los tampones de preparaciónde geles del sistema discontinuo de Laemmli, yse obtuvieron parámetros de corrida (tiempo,voltaje, comportamiento del gel), y resoluciónde las bandas en los patrones electroforéticossin diferencias significativas con el gel comercialdel PhastSystem,

3. Se determinó que en geles del sistema deLaemmli con glicerol e igual pH y fuerza iónicaen las zonas concentradoras y separadoras seobtenían resultados similares al PhastGel,

SUMMARY

The electrophoresis Phastsystem in spite of being, one of themost modern in the market, it depends upon the use of gels(phastgel) and electrode buffers stripes which are very expensiveat the international market. A method was developed forproducing heterogeneous polyacrylamide gels poured into 50x43x0.45 mm casts (length, width, height). The effect of differentbuffer systems upon the resolution power and the running timewas studied. A mixture of pattern proteins with molecular weightswithin the range of 13 to 66 kda was employed. The resultingdata were statistically analyzed by Statistic 5.1 M. 1998.By means of the modified system of Laemmli, gels were attained,the running time and the resolution between the bands did nothave significant differences with the phastgel System.It can be concluded that the gels prepared by this systemsatisfactorily replace the original Phastgels and the buffer system,modified by the authors give better results than the originalmethods.

Keywords: Phastsystem, electrophoresis, polyacrylamide.

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrerodel 2001.

Dra. Hilda Marilín García Pérez,Laboratorio BETERÁ, Calle102 e/ 31 y 31-B Marianao, Ciudad de La Habana, Email:beterá@infomed,sld,cu

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LABORATORIOS BETERÁLABORATORIOS DE AUTOINMUNIDAD

Detección de anticuerpos antineuronas en pacientescon enfermedades del sistema nervioso: estudio preliminar

Dra. Odalis Asín Milán,1 Lic. Raisa Jofra Hernández,2 Dr. Arturo Muster,3 Lic. Orestes Ponce de León4 y Lic. RobertoAlegre Mendez5

RESUMEN

Con el objetivo de profundizar en la patogenia de enfermedades que involucren al sistema nervioso central, un colectivo de lolaboratorios se dio a la tarea de detectar autoanticuerpos antineuronas en pacientes con estas enfermedades mediante la técde inmunofluorescencia indirecta. Se analizaron 31 sueros de pacientes y 72 controles, se obtuvo como resultado una sensibiliddde 77 % y una especificidad de 95 % en la técnica realizada, el valor predictivo positivo fue de 88 % y el valor predictivo negativode 89 %. Esto sugiere que en estas enfermedades existe una pérdida de equilibrio de los mecanismos que en el cerebro evitainiciación de respuesta inmune a ese nivel.

Palabras clave: autoanticuerpos antineuronas, sistema inmune, inmunofluorescencia indirecta, autoinmunidad, sistema nerviosocentral.

UNIV DIAG 2000;1(2):15-21

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1 Especialista en Inmunología.2 Licenciada en Farmacia y Alimentos. Aspirante a Investigador3 Especialista de I Grado en Inmunología. Investigador Agregado4 Técnico de Laboratorio5 Licenciado en Bioquímica.

El cerebro, la cámara anterior del ojo y lostestículos han sido considerados por mucho tiempositios de privilegio inmune por su capacidad paraaceptar trasplantes rápidamente. Los antígenoscontenidos en estos sitios han sido denominadosantígenos “secuestrados” pues se pensaba quese encontraban totalmente ignorados por elsistema inmune. Estudios posteriores handemostrado que los linfocitos pueden llegar aestos tejidos porque, cuando se activanadquieren la molécula de adhesión VLA-4, lacual permite atravesar el endotelio de los vasossanguíneos. En el cerebro reconocen antígenospresentados por las microglias y comienzan asíla producción de linfocinas que trae comoconsecuencia daño tisular y liberación deantígenos “secuestrados” con la consiguienteproducción de autoanticuerpos.1

Por otra parte se conoce que el sistemanervioso central (SNC) presenta una serie decaracterísticas que le permiten prevenir la

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iniciación de la respuesta inmune como son lapresencia de pocas o ningunas células dendríticasla ausencia de drenaje linfático en esas zonas yel hecho de que las neuronas no expresanmoléculas del complejo mayor dehistocompatibilidad (CMH) y en presencia delinfocinas inflamatorias solo expresan pequeñosniveles de CMH clase I, previniendo la iniciaciónde la respuesta de los linfocitos T CD8+. Sinembargo, cuando ocurre una reaccióninflamatoria y se liberan ciertas cantidades deinterferón gamma aumenta la expresión demoléculas CMH y las células presentadoras deantígenos se hacen mejores presentadoras dpéptidos endógenos.1

Por todo lo antes expuesto y con el objetivode profundizar en la patogenia de enfermedadesque involucren al SNC, mediante estudiosinmunológicos, este colectivo se dio a la tarea dedetectar autoanticuerpos antineuronas enpacientes con estas enfermedades

16

MÉTODOS

Pacientes

Se analizaron los sueros de pacientes coenfermedades del sistema nervioso de los cuale25 pacientes presentaban neuropatía ópticepidémica (NOE), 1 paciente con esclerosismúltiple (EM) y síntesis intratecal deinmunoglobulinas, 1 paciente con enfermedaddesmielinizante, 3 pacientes con lupus eritematossistémico (LES) y afectación cerebral (neurolupus)y 1 paciente con el síndrome de Guillain-Barré.

Controles

Se analizaron los sueros de 72 individuos norelacionados supuestamente sanos, donantevoluntarios del Banco de Sangre Docente deMarianao.

A ambos grupos se les realizó la técnica dedetección de anticuerpos antineuronas poinmunofluorescencia indirecta (IFI), modificada yestandarizada en el laboratorio utilizando kitcomerciales (Biosystem) de láminas con cortes decerebro de mono.

Se realizaron diluciones dobles seriadas detodos los sueros a partir de 1/10 hasta 1/60. Sconsideró como positivo aquel suero que presentfluorescencia igual al control positivo, a partir de ladilución 1/10. Se consideraron como negativos lossueros de los pacientes que no presentarofluorescencia, igual al control negativo, en ningunade las diluciones estudiadas.

Los resultados obtenidos fueron evaluadosmediante porcentajes y números enteros plasmadoen una tabla de contingencia de doble entrada. Sles calculó sensibilidad, especificidad, valorpredictivo positivo (VPP) y valor predictivonegativo (VPN).2

RESULTADOS

En la muestra estudiada se detectaron 24 casode pacientes con anticuerpos antineuronas. Fueropositivos a la prueba 18 de los pacientes con NOE1 paciente con EM, 1 paciente con el síndrome dGuillain-Barré, 3 pacientes con neurolupus y solo

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3 individuos del grupo control. La dilución óptimade trabajo para la muestra fue 1/10 y para elconjugado fue 1/50 (según la recomendación delfabricante). El patrón predominante fue elhomogéneo.

La sensibilidad fue de 77 % y la especificidadfue de 95 %. El VPP resultó de 88 % y la VPN de89 %.

La probabilidad de estar enfermo cuando elresultado de la prueba resultó positivo (VPP)consistió en 88 % y la probabilidad que tiene unindividuo de no estar enfermo cuando el resultado dela prueba fue negativo (VPN) se manifestó en 89 %.

Los resultados serológicos se presentan en latabla.

TABLA .Resultados serológicos

Prueba Pacientes Controles Total

Positiva 24 3 27Negativa 7 69 76

Total 31 72 103

DISCUSIÓN

Durante el desarrollo de la epidemia deneuropatía se observó que aproximadamente 50% de los pacientes con NOE presentaronalteraciones neuropsicológicas como irritabilidad,depresión, déficit de la memoria de fijación,disminución de la capacidad de concentración ypara el trabajo intelectual, e insomnio. Una partede estas alteraciones sin dudas tuvo un carácterreactivo, psicológicamente condicionado, pero esplanteable que en algunos casos existió algún gradode lesión encefálica, lo que se pudiera explicar porla presencia de estos autoanticuerpos.3

Se ha descrito la presencia de anticuerposantineuronas en múltiples enfermedades como son:enfermedad de Alzheimer, parkinson,esquizofrenias, esclerosis múltiple, síndrome deGuillain-Barré, LES, neurolupus, en pacientesalcohólicos y en el autismo infantil.4-10 Por lo tanto,los autores consideran que como el SNC tiene unaserie de características que le permiten evitar lainiciación de la respuesta inmune, normalmente noaparecen estos autoanticuerpos; pero una vez que

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ocurren infecciones, traumatismos u alteracionque rompen este equilibrio, los antígenos, que haahora llegaban a la circulación en pequeñcantidades, lo hacen en grandes cantidadeprovocan la estimulación de linfocitos específicopara esos antígenos y la consiguiente produccde anticuerpos, o sea, al ocurrir un daño tisularestos tejidos puede conducir a la exposición de aconcentraciones de antígenos que provocaactivación de linfocitos autorreactivos tolerantehasta el momento en que se activan, desencadenan reacciones autoinmunes coocurre en el infarto del miocardio, orquitis despude la vasectomía, uveítis y orquitis postraumáticEstos autoanticuerpos podrían ser por lo tanconsecuencia y no causa de estas enfermedade 8,9

En el caso de los pacientes con LES se conola existencia de anticuerpos antinucleares qpueden atravesar la barrera hematoencefálicactuar también contra los núcleos neuronales.

SUMMARY

With the aim of deepening on the pathogeny of diseasinvolving the central nervous system, a search was carried to find antineuron antibodies in patients with such diseasthe indirect immunofluorescence technique was used. Thewere analyzed, 31 serum samples from patients and 72 frcontrols, as result a sensitivity of 77% and a specificity of 95were obtained. The positive predictive value was of 88% athe negative predictive value was of 89%. This suggests existence of a balance lost in the mechanisms that avoid beginning of an immune response at the brain.

Keywords: antineuron antibodies, immune system, indirecimmunofluorescence, autoimmunity, Central Nervous System

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrerodel 2001.

Dra. Odalis Asín Milán. Laboratorios BETERÁ. Calle 102 e/. 31

y 31B. Marianao. Ciudad de La Habana.Telf. 20-0711 al 14. E-

mail: BETERÁ@infomed.sld.cu

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HOSPITAL CLÍNICOQUIRÚRGICO “HERMANOS AMEIJEIRAS”LABORATORIOS BETERÁ

Determinación de anticuerpos anti-DNA de doble cadenasobre preparación nacional de Crithidia luciliae

Dra. Elena Kokuina,1 Lic. Igrid García,2 Lic. Javier Suarez,2 Dra. Aracelis Chico4 y Dra. Nelsa Casas5

RESUMEN

Se cultivó el hemoflagelado Crithidia luciliae con el objetivo de desarrollar un método para la determinación de anticuerpos anti-DNA de doble cadena (dc) séricos. Se prepararon láminas portaobjetos, que fueron utilizadas para la detección de estos anticuepospor el método de inmunofluorescencia indirecta en 124 muestras de suero de pacientes con enfermedades autoinmunes reumátSe compararon los resultados de las preparaciones con los obtenidos sobre láminas comerciales. Solo 4 muestras fuediscordantes, y se obtuvo un coeficiente Kappa de 0.92. Estos resultados demostraron el valor diagnóstico de estas preparaciospara la detección de anticuerpos anti-DNAdc.

Palabras clave: Autoanticuerpos anti-DNA de doble cadena, Inmunofluorescencia, Enfermedades autoinmunes reumáticaslupus eritematoso sistémico.

UNIV DIAG 2000;1(2):18-21

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1 Especialista de II Grado en Inmunología. Profesor Asisten2 Licenciada en Biología. Aspirante a Investigadora.3 Especialista de II Grado en Reumatología. Profesor Auxilia4 Especialista de I Grado en Reumatología.

La detección de los anticuerpos anti-DNdoble cadena (dc) es esencial en el estudio deenfermedades autoinmunes reumáticas. Ademde su importancia diagnóstica en estas condicioclínicas, estos anticuerpos probablemendesempeñan un papel en la patogenia de algude estas enfermedades, como el lupus eritematsistémico.

Uno de los métodos utilizados en la actualidpara la detección de los anticuerpos anti-DNAes la inmunofluorescencia indirecta sobre protozoo Crithidia luciliae, cuyo DNA circular yen forma de hélice está contenido dentro dmitocondrión gigante desplazado hacia uno de polos, llamado cinetoplasto. Como la Crithidiaes un organismo procariota, de núcleo pobremeorganizado y carente de membrana nuclear, essubstrato inadecuado para la detección de anticuerpos antinucleares en su totalidad. Portanto, los anticuerpos anti-DNAdc presentes ensuero del paciente reaccionaran únicamente cel cinetoplasto, esto se puede revelar por la técnde inmunofluorescencia.1

En este trabajo se probó el valor clínico dnuestras preparaciones de Crithidia luciliae para

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la determinación de los anticuerpos anti-DNAmediante la comparación de los resultados conde un método comercial.

MÉTODOS

Preparación de láminas portaobjetos cCrithidia luciliae: Se cultivó la Crithidia luciliaedonada por el profesor L.A. Aarden (Red BloodTransfusion Service, Amsterdam) en medio dcultivo modificado respecto al original,2 bajocondiciones de vigorosa agitación a 24 oC durante48 h. A partir de este, se preparó un segundo cuhasta que la concentración del parásito alcanzó de x 106 células/mL. Después de 2 lavados con solusalina fosfatada tamponada (PBS) con 1 mg/mLalbúmina bovina, las células fueron resuspendidasuna solución de albúmina bovina (1 mg/mL) en adestilada a una densidad de 10x106 células/mL.Después de 10 min la suspensión fue filtradaplicada en fracciones de 20 mL a los espasobre la lámina portaobjetos. Las láminas fuesecadas y fijadas en etanol 96 % durante 10 Las preparaciones fueron conservadas hast

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utilización a –20 oC . Parte del cultivo celular secriopreservó en medio de cultivo con DMSO 7 %en nitrógeno líquido.

Pacientes: Se estudiaron las muestras desuero de 124 pacientes adultos del Servicio dReumatología del Hospital Clínicoquirúrgico“Hermanos Ameijeiras“ con indicación clínica debúsqueda de anticuerpos anti-DNAdc. Los suerose conservaron a –20 oC hasta su utilización.

Determinación de anticuerpos anti-DNAdc:Se realizó simultáneamente sobre láminapreparadas en el laboratorio y láminas comerciale(Biosystem, Barcelona) y dividida en 8 ensayos.Se empleó el método de inmunofluorescenciindirecta (IF), para lo cual los sueros se aplicarodiluidos 1:10 en PBS sobre el substrato antigénicfijado en las láminas portaobjetos y la presencia dlos anticuerpos anti-DNAdc se demostró por laincubación de las muestras con antisuerantiinmunoglobulinas humanas (IgA, IgG, IgM),conjugado con isotiocianato de fluoresceina (SigmBioSciences, St. Louis).

Después de aplicar el medio de montaje lamuestras fueron observadas en el microscopio dfluorescencia. La brillantez del mitocondrión de laCrithidia luciliae permitió clasificar la muestracomo positiva para los anticuerpos anti-DNAdc.

Los resultados de ambos métodos scompararon mediante la prueba de chi cuadrad(X2) y se determinó el coeficiente de concordanciKappa.

RESULTADOS

De las 124 muestras de suero estudiadas, 9(72,58 %) resultaron negativas y 34 (27,42 %resultaron positivas para los anticuerpos antiDNAdc por el método de inmunofluorescencia conlas láminas comerciales de Crithidia luciliae.

Se obtuvieron resultados idénticos para ladetección de los anticuerpos anti-DNAdc sobrelas láminas comerciales y las nuestras en 120 dlas 124 muestras de suero de pacientes coenfermedades reumáticas, lo que se correspondcon un X2 de 104,7, p < 0,01, y un coeficiente deconcordancia Kappa de 0,92, p < 0,01 (fig.1). De

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las 34 muestras clasificadas como positivas paralos anticuerpos anti-DNAdc por las láminascomerciales, 32 lo fueron también sobre las láminasnuestras (fig. 2); mientras que de las 90 muestrasnegativas para los anti-DNAdc por laspreparaciones comerciales, 88 resultaron negativastambién sobre nuestras preparaciones de Crithidialuciliae (fig. 3).

DISCUSIÓN

Las técnicas para la detección de losanticuerpos anti-DNAdc séricos se han hechoimprescindibles en los laboratorios clínicos. Estosanticuerpos se presentan en distintas enfermedadeautoinmunes y niveles elevados de anticuerpos anti-DNAdc están fuertemente asociados con el

X2 = 104,7 p < 0,01 K = 0,92 p < 0,01

Fig 1. Los resultados de la detección de los anticuerpos anti-DNAdc por las láminas comerciales de la Crithidia luciliae(Biosystems) y las preparaciones del laboratorio fueron igualesen 120 de las 124 (96,77 %) muestras de sueros de pacientes conenfermedades reumáticas.

96,77 %

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diagnóstico del lupus eritematoso sistémico. Entr60 y 83 % de pacientes con lupus eritematospresentan en su circulación anticuerpos anti-DNAdcen algún período de tiempo durante su evolución.3 Lapresencia de los anticuerpos anti-DNAdc séricoes una de las 3 alteraciones inmunológicanecesarias para la clasificación del lupueritematoso sistémico según los criterios del ColegAmericano de ReumatologÍa, los cuales han sidrevisados en 1997.4 Los anticuerpos anti-DNAdcson los de más probado papel patogénico qucausan mediante diversos mecanismos el daño redel lupus.5 Se ha encontrado que los aumentos elos niveles séricos de anticuerpos anti-DNAdpreceden las exacerbaciones del lupus, y estparticularmente relacionados con el riesgo dglomerulonefritis lúpica.6 Por lo tanto, mientrasque las mediciones puntuales de los anticuerpanti-DNAdc son útiles para establecer ediagnóstico del lupus, las mediciones seriales destos autoanticuerpos pueden ser importantes pevaluar la actividad de la enfermedad.5-7

El propósito de este trabajo ha sido introducien la práctica clínica un método útil para ladetección de los anticuerpos anti-DNAdc. En la

Fig 2. De las 34 muestras positivas para anticuerpos anti-DNAdpor las preparaciones comerciales de la Crithidia luciliae(Biosystem), 32 (94,11 %) fueron detectadas porlas láminas del laboratorio.

94,11 %

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actualidad los métodos más utilizados para ladetección de los anticuerpos anti-DNAdc en laclínica son el radioinmunoanálisis (RIA) de Farr, elensayo inmunoenzimático (ELISA) y lainmunofluorescencia sobre el protozoo Crithidialuciliae.7 El método de inmunofluorescencia queutiliza como fuente antigénica la Crithidia luciliae,resulta muy atractivo, porque aunque es menossensible que el RIA y el ELISA, su mayor ventajaes su gran especificidad, pues casi exclusivamentedetecta anticuerpos anti-DNAdc, en virtud de queeste microrganismo posee un miticondrión giganterico en DNAdc, a diferencia de los substratosantigénicos de RIA y ELISA, los cuales puedenestar contaminados con DNA de cadena simple(DNAsc). Los anticuerpos anti-DNAsc carecende valor diagnóstico y pueden proporcionarresultados falsos positivos que confunden eldiagnóstico del paciente.8,9 Otro factor a considerares el alto costo de los juegos diagnósticoscomerciales de RIA y ELISA para la detecciónde los anticuerpos anti-DNAdc, asi como resultantambién costosas y complejas la obtención delDNAdc de fuentes bacterianas y de mamíferos, yel desarrollo de estas tecnologías en el nivel del

c Fig 3. De las 90 muestras negativas para anticuerpos anti-DNAdcpor las láminas comerciales de Crithidia luciliae (Biosystems),88 (97,77 %) también lo fueron por las preparaciones dellaboratorio.

2,22 %

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laboratorio; mientras que la preparación de láminacon Crithidia luciliae resulta simple, rápida yeconómica. 9,10 El cultivo de este parásito nopatógeno para el hombre, no es complejo, y srápida reproducción ha permitido disponer de unalta concentración de microorganismos en solo unpocos días, aún con un medio de cultivo modificadpor sustitución de algunos de sus componentrespecto al utilizado por Aarden L.A. 2,10

Las preparaciones funcionaron de igual formque las láminas comerciales de Crithidia luciliaepara la detección de los anticuerpos anti-DNAdcuando se evaluaron muestras de 124 paciencon enfermedades autoinmunes reumáticas. Lcomparación de los resultados se correspondió cun coeficiente de concordancia Kappa de 0,92, p < 0,01).

Estos resultados permiten introducir el métodde inmunofluorescencia sobre Crithidia luciliaedesarrollado para la detección de los anticuerpanti-DNAdc en la práctica clínica, lo que amplía yconsolida el diagnóstico inmunológico de lasenfermedades autoinmunes y en particular del luperitematoso sistémico en Cuba.

SUMMARY

For determining the serum Anti DNA antibodies of double chainthe hemoflagellate Crithidia Luciliae was cultured and slideswere prepared, and used for detecting such antibodies by tmethod of indirect immunofluorescence in 124 serum samplefrom patients suffering autoimmune rheumatic diseases. Thresults of the local preparations were compared with the oneobtained with commercial slides. Only 4 samples disagreed, Kappa coefficient of 0.92 was obtained. These results showethe diagnostic values of our preparations for detecting AntiDNA antibodies.

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Keywords: Anti-DNA antibodies of double chain,immunofluorescence, rheumatic autoimmune diseaseserythematous systemic lupus.

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrerodel 2001.

Dra. Elena Kokuina. Laboratorios BETERÁ. Calle 102 e/. 31 y31B. Marianao. Ciudad de La Habana.Telf. 20-0711 al 14. E-mail: betera@infomed.sld.cu

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LABORATORIOS BETERÁ

Obtención de sustancia específica de grupo AB a partirde meconio

Lic. Jorge Luis Leyva Torres1, Téc. Elvira Gallardo Rodríguez2, Lic. Alicia Luberta Lugo3 y Téc. Ibraín Reyes Valdés4

RESUMEN

La sustancia específica de grupo AB se utiliza para la estimulación de donantes destinados a la obtención de plasma hiperinmunepara la producción de sueros hemoclasificadores del sistema ABO. Está constituida por mucopolisacáridos solubles en agua que seencuentran en altas concentraciones en los órganos secretores como las glándulas salivales, mucosa gastrointestinal, etc. y en elmeconio; y constituyen una forma de presentarse en el organismo las sustancias A, B y O (H) de los grupos sanguíneos. Sedescribió la extracción a partir de meconio según la técnica recomendada por Robert Wall y otros. Se obtuvo un producto contítulos adecuados, transparente, entre verde claro a incoloro, estéril y resultados satisfactorios en los ensayos de toxicidad ypirógenos, que cumple los requisitos establecidos para inyectables.

Palabras clave: Sustancia de grupo, Meconio, Isoinmunización.

UNIV DIAG 2000;1(2):22-4

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La química ha demostrado que las sustanciaA, B y H de los grupos sanguíneos se presentaen el organismo con diferentes características: unque es soluble en solventes orgánicos y seencuentra en los glóbulos rojos y otra comomucopolisacáridos solubles en agua (sustancia dgrupo).1,2

Esta sustancia de grupo no se encuentra etodos los individuos; está presente en 75 % de losujetos a los que se les denomina «secretores»ausente en 25 % que son los «no secretores», estable al calor, su concentración más alta lapodemos encontrar en los órganos secretoresglándulas salivares, páncreas, mucosagastrointestinal, vesículas seminales y en emeconio y se pueden obtener tanto de origenhumano como animal.1-3

La sustancia de grupo por su composición noconstituye un antígeno, pero unida a los anticuerponaturales de carácter proteico que poseen loindividuos hacen que esos productos decombinación sean verdaderos antígenos y actúecomo estimulantes de la respuesta inmune.2

La sustancia de grupo se utiliza para lainmunización de donantes destinados a la obtencióde plasma hiperinmune para la producción de lossueros hemoclasificadores del sistema ABO.

1 Licenciado en Bioquímica.2 Técnico en Inmunohematología.3 Licenciada en Bioquímica.4Técnico en Procesos Biológicos.

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También tiene utilidad como neutralizadora de lasaglutininas naturales anti-A y anti-B, con aplicaciónen hemoterapia para lograr plasma y componentecarentes de estas aglutininas y en la búsqueda anticuerpos inmunes del sistema ABO al carecede efecto neutralizantes sobre estos anticuerpos.2,4

MÉTODOS

El meconio se obtiene de recién nacidos sanoen el salón de parto del Hospital Ginecoobstétrico«Eusebio Hernández» por personal capacitado, srecoge de forma individual en bolsas de nailon, juntocon una muestra de sangre de la madre sianticoagulante después del parto.

Las muestras de sangre se utilizan para locontroles virológico y microbiológico de la madre:pruebas VIH, HBsAg, HCV y VDRL. En el casode muestras positivas el meconio correspondienta estas se desecha.

El meconio se preserva individualmente y sehomogeniza con 25 a 50 mL de fenol 0,3 % y seconserva a 4 °C; utilizando una muestra de estsuspensión se identifica la sustancia específicpresente por la técnica de inhibición de lasaglutininas.4

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Una vez identificados, se colectan de acuerdcon el grupo a que pertenecen (A, B y AB) y sconservan a 4 °C hasta su utilización. Los que npresentan sustancia de grupo se desechan.

La obtención de la sustancia específica srealiza por el método descrito por Robert Wall yotros.: Los meconios de grupo A, B y AB semezclan en iguales proporciones, se homogenizy esto se precipita con acetato de sodio y etanSe diluye con agua destilada apirogénica y posteritratamiento con carbón activado. Se repite lprecipitación con etanol y acetato de sodio y diluciócon solución salina fisiológica, 3 veces y se dializcontra agua destilada a 4 °C durante 3 d, hacien2 ó 3 cambios al día.

Se determina la potencia de la sustancia portécnica de inhibición en tubo, se prueban dilucioneseriadas dobles en solución salina de la sustanfrente a suero anti-A y anti-B con títulos de 1:16incubación 30 min a temperatura ambiente centrifugación a 1 000 rpm durante 1 min.4 Se diluyecon solución salina hasta valores entre 128 y 102y se ajusta el pH entre 6,8 a 7,0 con cloruro dcalcio 8,6 %.

Se clarifica por filtración a través de fibra devidrio y membranas de 0,2 y 0,1 µ hasta obtenerproducto transparente y entre verde claro incoloro.

El proceso de esterilización se realiza pofiltración hasta membrana de 0,1 µ y se envaen bulbos de vidrio por 10 mL con 5 mL delproducto.

Los ensayos para el control de la calidad fuerolos siguientes:

Potencia: Se realiza según la técnica deinhibición en tubo.4

Control microbiológico: Prueba deesterilidad según U.S.P. 23.6

Toxicidad: Según B.P. 93.7

Pirógenos: Según U.S.P 24.8

Se realizó el estudio de estabilidad con 3 lotede sustancia de grupo AB, se utilizó un bulbo dcada lote cada 3 meses.

Los ensayos realizados correspondieron colas especificaciones de calidad necesarias paestablecer la durabilidad del producto: potenciay pH.

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RESULTADOS

Se obtuvo la sustancia específica de grupo ABcon la calidad requerida:

Características físicas: transparente y librede partículas.Título: entre 128 y 1024Toxicidad y pirógenos: negativoControl microbiológico: estéril

Los resultados obtenidos en las pruebas detoxicidad y pirógenos y en el control microbiológicofueron satisfactorios.

En las tablas 1, 2 y 3 se refleja elcomportamiento de la estabilidad de los 3 lotes enun período de 3 años, donde se observa que losparámetros de calidad se mantienen similares einvariables en el tiempo para cada lote.

TABLA 1. Estudio de estabilidad del lote 71001

Fecha Potencia pHA B

2/97 128 256 6,8 5/97 128 256 6,8 8/97 128 256 6,8 11/97 128 256 6,8 2/98 128 256 6,8

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TABLA 2. Estudio de estabilidad del lote 71002

Fecha Potencia

A B pH

3/97 512 102 46,86/97 512 102 46,89/97 512 102 46,812/97 512 102 46,83/98 512 102 46,86/98 512 102 46,89/98 512 102 46,812/98 512 102 46,83/99 512 102 46,86/99 512 102 46,89/99 512 102 46,812/99 512 102 46,8

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DISCUSIÓN

La sustancia específica de grupo AB se obtuvcon la calidad requerida que cumple con lasespecificaciones establecidas para su utilización ehumanos. Los resultados satisfactorios obtenidoen las pruebas de toxicidad y pirógenos y en econtrol microbiológico avalan el producto para suutilización en la inmunización de donantes.

Del estudio de estabilidad se concluye que lasustancia específica de grupo AB, obtenida eestas condiciones, tiene un período de durabilidade al menos 2 años (teniendo en cuenta eporcentaje de cobertura).

TABLA 3 . Estudio de estabilidad del lote 71003

Fecha Potencia pH

A B

5/97 512 512 6,8

8/97 512 512 6,8

11/97 512 512 6,8

2/98 512 512 6,8

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5/99 512 512 6,8

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11/99 512 512 6,9

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SUMMARY

The specific substance of group AB is used for stimulating donorsdestined for attaining hyperimmune plasma for producinghemoclassifiers of ABO system. This substance is made up bywater soluble mucopoly saccharide which are found in highconcentrations in the secretory organs such as the salivary glandsgastrointestinal mucosa and in meconium. They constitute theway in which the blood groups A, B, and O (H) are present in thebody. The extraction of this substance from meconium using thetechnique recommended by Robert Wall et al. is described. Theproduct obtained has adequate titles, is transparent, betweelight green and colorless and sterile. In the toxicity trials, theresults were good, the pyrogens meet the established requiremenfor inyectable agents.

Keywords: group substance, meconium, isoimmunization

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrerodel 2001.

Lic. Jorge Luis Leyva Torres. Avenida 29 No. 23814Apartamento 53, e/ 238 y 240, Reparto San Agustín, La Lisa,Ciudad de La Habana, Cuba.

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ARTÍCULOS DE REVISIÓN

LABORATORIOS BETERÁINSTITUTO DE HEMATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA

La ética y la ciencia en la donación de sangre voluntaria

Dra. Patricia Hernández Díaz,1 Lic. Antonio Bencomo Hernández,2 Dra. María Elena Alfonso Valdés3 y Téc. PabloCastañeda Gamboa4

RESUMEN

La relevancia del nexo Ciencia-Tecnología-Sociedad es una de las razones que explica la importancia creciente que en lúltimas décadas se ha atribuido a los estudios sociales de la ciencia. Las transformaciones que ocasionan la ciencia y la técarevolucionan las bases existenciales de la sociedad humana, permiten y exigen al individuo una nueva conducta y actitud haclmundo exterior natural, social y hacia sí mismo. La extracción de sangre humana es un servicio público que se inscribe enmarco legal y ético, en el que están involucrados los bancos de sangre, el personal que labora en estas instituciones, los donntesy toda la sociedad. Se analizaron aspectos éticos y sociales de la ciencia y su aplicación en el campo de las donaciones de sgrey se abordó la bioética como una consecuencia necesaria de los principios que influyen en la vida espiritual de la sociedad.

Palabras clave: Ciencia, Sociedad, Moral, Ética, Bioética, Donación de sangre.

UNIV DIAG 2000;1(2):24-30

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La ciencia es una rama de la actividad humadirigida a la producción, difusión y aplicación dconocimientos científicos, es el conocimienobjetivo de la verdad objetiva.1,2

La ciencia carecerá de sentido, si no fundamenta en el principio del humanismo, putoda actividad científica deberá orientarse porreconocimiento del hombre como valor supremEs precisamente el hombre, su vida, bienestar, sacultura, libertad y progreso, quien le confiere senta la ciencia, por lo que debe existir un trabamancomunado entre los científicos y la sociedque permita utilizar los grandes avances científiy tecnológicos en beneficio de esta.3

Las investigaciones que se realizan en el camde la Medicina han mostrado gran desarrollolos últimos años con los avances obtenidos eBiología Molecular e Informática. Por esta razlos trabajadores de la ciencia deben sostenerposición activa por la introducción y generalizacide los resultados científicos y estar atentos a

,

las implicaciones negativas que pueda tener laaplicación práctica de uno u otro conocimientocientífico para la sociedad, la naturaleza y elindividuo.

La necesidad de una moral profesionaladquiere mayor relevancia en aquellas profesionesrelacionadas con las investigaciones biomédicas,cuya actividad tiene como objeto al hombre mismo,así como la producción de determinadas sustanciaque repercuten directamente sobre la saludhumana.

La medicina y la salud son y serán siempreprácticas sociales con profundo e imprescindiblesentido humanístico y moral. Todo lo concernientea la salud se ha convertido en un tema de crecienteinterés público en la medida en que se acentúa ecariz tecnológico y político de la medicina.

En la medida en que la ciencia y la técnicaamplíen sus capacidades para intervenir en losprocesos que modifican o determinan la vida delos individuos o las sociedades, aumenta la

ología

1 Máster en Ciencias. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Laboratorios BETERÁ.2 Licenciado en Biología. Profesor Instructor. Investigador Titular. Instituto de Hematología e Inmunología.3 Especialista de II Grado en Inmunología. Profesor Asistente. Investigador Titular. Instituto de Hematología e Inmun4 Técnico en Iconopatografía Médica. Laboratorios BETERÁ.

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necesidad de subordinar su uso a laconsideraciones éticas. La reflexión bioéticproporciona un contexto filosófico y moral de formordenada y justa para resolver los retos de medicina actual y su proyección al futuro.

La extracción de sangre humana mediante ldonaciones voluntarias es un principio público quse inscribe en un contexto legal y ético, en el questán involucrados los bancos de sangre, el persoque labora en estas instituciones, los donantessangre, el médico y toda la sociedad.

El objetivo del presente trabajo es analizaalgunos aspectos éticos y sociales de la ciencila aplicación de estos principios en el campo de ldonaciones de sangre.

MÉTODOS

Se analizaron trabajos relacionados con loconceptos de ética, bioética y su relación con ciencia.

Se estableció el nexo que existe entre la étiy las investigaciones biomédicas específicamenlas donaciones de sangre voluntarias.

DESARROLLO

Ciencia y sociedad

En la ciencia contemporánea todo estudconstituye una unidad dialéctica de factorecolectivos e individuales, sin restar importancia papel individual, sintetizador del ser humano. Epapel determinante de todo trabajo científico recen el grupo de trabajo, en el colectivo de hombrque forman parte de esa comunidad científica qrepresentan, o sea, en decir el estudmultidisciplinario de los fenómenos.

La concepción dialéctica y materialista de lciencia supone el estudio sistémico de la totalidade las relaciones internas y externas de lcondiciones y los factores que caracterizan fenómeno y supone un estudio histórico concrede modo que puedan ser reveladas lacontradicciones inherentes a una etapa definida fenómeno y revelar las vías para superarlas.

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La ciencia se vincula tanto a las relacionessujeto-objeto, como a las sujeto-sujeto. El objetose define en la acción misma del sujeto, escambiante en relación con el nivel de desarrollo dela práctica. El sujeto de la ciencia no es el individuoaislado, es la sociedad toda.

El alto grado de desarrollo de las fuerzasproductivas y de la socialización de la producciónpermitió el desarrollo de la revolución científicotécnica (RCT), que ha ido madurando gradualmentecon el desarrollo científico-técnico ysocioeconómico en general.1

La RCT es un fenómeno característico delsiglo que afecta en mayor o menor grado a casitoda la humanidad y que está provocando uncambio esencial en el modo de vida de toda lasociedad contemporánea.2

El trabajo científico concreto se robustece siel sujeto que lo adelanta tiene un concepción clarade la dimensión social de la actividad que realiza,así la sociedad está en mejores condiciones deaprovechar los frutos de la ciencia si conoce mejorla naturaleza del trabajo científico.4

Todo país que aspire al desarrollo debedesplegar un sistema científico centrado en susrealidades sociales y culturales en correspondenciacon su proyecto de desarrollo. Una culturacientífico-técnica que abarque a amplios sectoresde la población contribuye al desarrollo cultural y asu vez posibilita la interrelación fecunda entreciencia, tecnología y desarrollo social. Los idealesde la ciencia deben articularse con las más elevadasaspiraciones humanistas.

Aspectos de la bioética, la ética, la ética médicay la moral en la ciencia en general y la medicinaen particular

La moral como forma del comportamientohumano tiene un carácter social en la medida enque es propia de un ser que incluso, al comportarseindividualmente, se manifiesta como ser social.5

La moral como forma de conciencia social esuna de las más influyentes en la actividad prácticadel hombre y está estrechamente ligada con laciencia. El contenido moral de la actividad científicay la responsabilidad que asume el especialista enel ejercicio de su profesión, parte de la moral como

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reguladora de la vida social y la actividad profesiodel científico.

La ética es la ciencia que trata los principmorales, su origen y desarrollo, establece regnormas de conducta entre los hombres y deberes hacia los diversos componentes dsociedad.6,7

En el transcurso del desarrollo histórico-soy en la misma medida en que fueron apareciediferentes instituciones, surgieron reglamentocódigos de ética profesional con el objetivoregular la conducta moral de los diversprofesionales.

La ética profesional por su parte es la tede la moral profesional. Se divide en diferenramas de acuerdo con sus objetos de estudio:médica, jurídica, militar, artística del científico, emuchas de ellas vinculadas entre sí.

La ética del científico es el conjunto principios que guían al profesional en el procde la actividad cognoscitiva y el comportamieque este asume en el contexto de una comuncientífica determinada.5

El científico debe respetar los principios eficacia, modestia, sencillez, tenacidad, discrey capacidad de abnegación y sacrificio, pero todo debe ser esencialmente humanista. Dtransformar la naturaleza y la sociedad en benedel hombre.

El papel de la ciencia en la ética es complEn primer lugar los métodos científicos puedsuministrar métodos de pensamiento ético ydescubrimiento moral. En segundo luginvestigaciones y teorías científicas proporciodatos necesarios para la ética y ayudan a expmediante análisis comparativos los diferensistemas morales. En tercer lugar, los logcientíficos pueden determinar el rango y los límde las decisiones y elecciones moralmeresponsables. En cuarto lugar, la ciencia trae nuelecciones, nuevos problemas y nuecircunstancias para viejos problemas. Por últicomo la ciencia es una empresa humana, la de la ciencia, su desarrollo, puede mostrar lección moral o ética de cómo algunos hombconviven o de cuáles han sido los valores yjustificaciones o sistemas que los han impulsaesto es, el estudio de la Historia de la Ciencia pmostrarnos una ética científica.

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El código ético de la ciencia supone,fundamentalmente, amor por la libertad intelectuasentido de justicia, constante defensa de la verdacrítica del error, denuncia de la farsa, así comasumir la crítica y la autocrítica como un poderosoargumento de autorregulación moral.

La bioética ha sido definida en laEncyclopedia of Bioethic como: el estudiosistemático de la conducta humana en el campde las ciencias biológicas y la atención de la saluen la medida en que esta conducta se examine aluz de valores y principios morales.

La bioética abarca la ética médica, pero no slimita a ella, constituye un concepto más amplio e4 aspectos importantes:

1. Los problemas relacionados con valores qusurgen en todos los profesionales de la salud

2. Se aplica a las investigaciones biomédicas.3. Las cuestiones sociales como las que s

relacionan con la salud pública, la saludocupacional e internacional y la ética del controde la natalidad.

4. Cuestiones relativas a la vida de los animaleslas plantas en lo que concierne a experimentocon animales y demandas ambientaleconflictivas.

La idea central de la bioética es el respeto dla vida humana, idea que está presente en todlas corrientes del pensamiento ético. La bioétictrata de vincular la ética con la medicina, trata dhumanizar la medicina, trata de ayudar a todos lopacientes del mundo a tomar conciencia dederecho que les asiste.

Uno de los principales textos fundadores de lbioética es el Código de Nuremberg redactado e1947 por la Asociación Médica Mundial en nombrede la ciencia bajo el nazismo. Se han escrito otradeclaraciones con propósitos similares. En 199la OMS y el Consejo de OrganizacionesInternacionales Médicas emitieron algunasconsideraciones éticas para las investigaciones humanos, en especial en países en desarrotomando en consideración sus condicionesocioeconómicas, culturales y leyes nacionales.8,9

Los cambios tecnológicos se acompañan dnuevas actitudes sociales y culturales que hacehincapié en el individuo como principal autoridad

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decisoria sobre cuestiones relacionadas con valorreferentes a estilos de vida y metas personaleEsta nueva situación personal con su abundancde opciones de diversos valores exige concentraren los principios morales tradicionales de la éticmédica como beneficencia, justicia y respeto porla autonomía del paciente. Estos principios sonllamados trinidad de la bioética. La ética médicaha de hacer todo lo posible por respetarla.

En los últimos 25 años la autonomía hadesplazado a la beneficencia como primer principide la ética medica. Como resultado la relación entrel médico y el paciente es ahora más franca abierta y se respeta más su dignidad. Con beneficencia se persigue el fin de procurabienestar y evitar el mal.10

El sentido de justicia está íntimamenterelacionado con la ideología de quien la defina. Ela justicia como igualdad social, “ a cada uno debexigírsele según su capacidad y debe dársele segsus necesidades”.

Por último la teoría del bienestar colectivo serige por el principio de que “La mayor felicidad dela mayoría es la medida de lo justo y de lo injusto”.10

Aplicación de la bioética en las investigacionesy la donación de sangre

El descubrimiento de los grupos sanguíneos acomo el desarrollo de las soluciones anticoagulantenecesarias para la colección de la sangre, perfeccionamiento de los equipos de infusión dsangre como las bolsas plásticas conanticoagulantes y los equipos desechables qupermiten la conservación de la sangre durantvarias semanas en refrigeración, permitió laconcepción de los bancos de sangre como uninstitución donde se colecta sangre, se producelos hemoderivados, además de regular y asegurla transfusión de los mismos a los pacientes que necesiten.11

Los principios éticos siempre han estadopresentes en la colección, el procesamiento y transfusión de la sangre y sus componenteFundamentalmente estos están orientados a protección del donante y del receptor de sangre.11

Desde el año 1936 el movimiento de la CruzRoja Internacional ha destacado los principios d

humanidad, solidaridad, servicio voluntario imparcialidad de la donación de sangre.

Por otra parte, el Departamento del Programde Sangre de la Federación Internacional Sociedades de la Cruz Roja y de la Media LunRoja; la Sociedad Internacional de Transfusión Sangre; el Consejo de Europa; la AsociacióNorteamericana de Bancos de Sangre y Organización Mundial para la Salud hapreconizado la donación voluntaria y no remunerade la sangre. Estos criterios se basafundamentalmente en que la hepatitis es 10 vecmayor en la sangre procedente de donanpagados que en aquellos voluntarios. Lseropositividad al VIH es 8 veces mayor en lodonantes retribuidos .

La defensa de la donación de sangre voluntano es un simple lujo idealista es una cuestióprimordial de ética. Por este motivo, la SociedaInternacional de Transfusión de Sangre elaboróCódigo de Ética para la donación y transfusión sangre en el año 1980, que fue aprobado porXXIV Conferencia Internacional de la Cruz Rojaen 1989. En concenso se ratificaron los principiéticos de voluntariedad, anonimato y altruismo ddonante de sangre.12,13

El acto de la donación de sangre es un ejemppalpable de la aplicación de los principios bioéticoEl principio de la autonomía tiene aquí un clarexponente. El donante de sangre debe ser atodo un individuo que voluntariamente y de formaltruista está en disposición de brindar su sangralgunos de sus componentes para ser empleaen enfermos que lo necesitan.

El donante es informado de los detalles dproceder, sus objetivos y los riesgos a que se somy con todos estos elementos da su consentimieescrito. La donación de sangre es un acto en qel principio de la beneficencia tiene un propósitdual: no causar daño al donante ni al receptor desangre. De este modo, en el interrogatorio, examen físico y los estudios de laboratorio que realizan al donante se persigue detectaantecedentes, síntomas, signos o parámetroslaboratorio que puedan dañar a cualquiera ellos.

En los últimos años se ha venido usando cavez con más frecuencia el método de autoexclusdel donante, quien después de recibir un

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información escrita de algunas de las posibcausas que pueden invalidarlo como dona(pertenecer a grupos de riesgo como drogadicpromiscuos, etc.), puede declinar el acto dedonación o señalar en el boletín informativo quesangre es de riesgo. De este modo se evitdonante tener que responder pregunembarazosas.

En segundo lugar la donación remunerapuede ocasionar riesgos para el donante, puesintereses económicos puede ocultar situaciopatológicas que pueden dañar su estado de sen su condición de donante, o donar mfrecuentemente de lo admitido, y violar los períodde tiempo recomendados entre una u otra donacPor otra parte los donantes deben recibir ucompensación, en el caso de ocurrir un accideo una complicación asociada con la donaciónsangre.

En el código de ética se hace hincapié enprincipio de justicia en virtud del cual la donacióde sangre no habrá de entrañar discriminaciónninguna clase por concepto de raza, nacionalio religión. Del mismo modo orienta la creación reglamentos en los que se especifiquen requisitos a cumplir por un presunto donante cuanto a edad, peso corporal, estado de saludvolumen y frecuencia de la donación según el py sexo del individuo.

El código de ética se refiere además anecesidad de confeccionar reglamentos especique deben ser objeto de conocimiento del donaen procederes especiales como la plasmaférla citoféresis y la inmunización deliberada ddonantes.

La sangre y sus componentes, al ser de orihumano, solo deben usarse en caso de necesidad médica genuina. Los productos desangre deben estar disponibles para todo enfeque lo necesite, para lograr esto es necesariose provea de forma gratuita o a través desistema de seguridad social o esquemasseguro.14

La obtención de donantes a partir de familiade los pacientes, de Centros UniversitariosMilitares, no está en contraposición con la donacvoluntaria, siempre que se le ofrezca informacexacta al donante de los riesgos que pueocasionarle al receptor.15

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La socialización de la donación de sangreincluye también los programas donde el personadel Centro de Sangre se involucre en actividadecomunitarias, y actúe como modelo decomportamiento altruista y como educador de loniños de la comunidad.16

El sistema de salud cubano no ha estado margen de este campo. Se han creado bancossangre provinciales y municipales de acuerdo colas necesidades asistenciales. Se creó el GruNacional de Hematología y Bancos de Sangre qudirige la formación de médicos especialistas, otroprofesionales dedicados a la actividad y técnicomedios de esta especialidad.

Por la importancia que reviste el abastecimientde derivados de la sangre en el nivel nacionarecién se ha creado el Programa Nacional dSangre que resume todas las aspiraciones de ecampo. Por otra parte, el Centro Estatal de Controde Medicamentos (CECMED) del Ministerio deSalud Pública dictó las regulaciones No.1/95 y No.4/96que aseguran la protección de los donantes y losreceptores en correspondencia con los principioéticos de la donación y la transfusión de lasangre.17,18

La creación de centros de investigaciones depolo científico ha permitido el diseño de sistemanovedosos de detección de los virus de la hepatitB y C, los virus de la leucemia T humana I y II(HTLV-I, II) y del VIH (SIDA), con los que sepesquisan todas las donaciones de sangre del paEstos ensayos aseguran la inocuidad de loproductos sanguíneos en los receptores, así compermiten monitorear la salud de la población cubande donantes de sangre.

La donación voluntaria y no remunerada hacaracterizado la donación de sangre en CubGracias a este logro el país se satisface de lproductos sanguíneos para apoyar proyectos tahumanitarios como el trasplante, la cirugíacardiovascular, la oncología y otros. Esto es pocausa delcarácter universal y gratuito del sistemde salud y a la educación comunitaria alcanzaden Cuba, así como la participación activa de loorganismos de masa y de todo el pueblo en estarea.

Dado el avance científico-técnico obtenido enel presente siglo, se hace necesario el enfoque étde la ciencia de forma progresiva, que el científico

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tiene que enfrentar con honestidad y sentido djusticia, teniendo en cuenta la gran responsabilidaque ha asumido ante la sociedad y el carácthumanista que debe tener su actividad creador

El científico tiene el deber de ponerse enfunción de la sociedad. El científico debe asumnumerosos deberes entre los que se destacansuperación profesional permanente, laconsagración al trabajo, la honestidad, lorientación a la obtención de nuevos conocimientosu difusión y aplicación.

La medicina y la salud son productos socialeque requieren un profundo e imprescindible sentidético y humanístico.

El desarrollo de las donaciones de sangre y obtención de hemoderivados ha traído consigproblemas éticos nuevos y más complejos, qudemandan de los científicos mayores exigenciaéticas en su relación con los donantes, la comunidcientífica y la sociedad en general.

El desempeño de la actividad de los Bancode Sangre requiere de forma vital para su éxito dla aplicación correcta y oportuna de los principiode la bioética.

La realización en los bancos de sangre cubande las técnicas de detección de virus, garantizaaporte de sangre segura para los pacientes acuerdo con la Alianza para la SeguridaHematológica.

SUMMARY

The relevance of the links Science-Technology and Societexplains the increasing importance given during the 3 last decadto the social studies in Science. The transformations broughabout by science and techniques evolve the bases of the existeof human society. These transformations allow and demanfrom the individual a new behavior and attitude towards thenatural outer and social world and towards itself. Bloodextraction in humans is a public service inscribed in a legal anethic framework, in which are involved the blood banks thestaff working in such institutions, the donors and the wholesociety. Ethic and social aspects were analyzed, as well as thapplication in the field of blood donations, the Bioethic wasfocused as a necessary consequence of the principles that influein the spiritual life of society.

Keywords: science, society, moral ethics, bioethics, blooddonation

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrero del2001.

Dra. Patricia Hernández Díaz. Laboratorios BETERÁ. Calle102 e/. 31 y 31B. Marianao. Ciudad de La Habana.Telf. 20-0711al 14. E-mail: betera@infomed.sld.cu

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LABORATORIOS BETERÁ

Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,actualidad e importancia

Dra.Hilda Marilín García Pérez1

RESUMEN

Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influenciade un campo eléctrico. Se dio una visión general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para proteínas en condicionenativas o desnaturalizadas, se incorporaron nuevos conocimientos tomados de la literatura reciente a los conceptos tradicionalesde este método, como son la adición de compuestos de restricción de la difusión y que aumentan la estabilidad de los geles. Sejemplificó el comportamiento anómalo de algunas proteínas en la determinación del peso molecular por electroforesis en gelesde poliacrilamida en condiciones desnaturalizadas.

Palabras clave: electroforesis, poliacrilamida, geles.

UNIV DIAG 2000;1(2):31-41

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La electroforesis es un método analítico –semipreparativo, en el que se separan biomoléculen dependencia entre otros factores de su cargbajo la acción de un campo eléctrico, fue empleadpor primera vez por Tiselius en el año 1937.Raymond y Weintraub en 1959 emplearon comosoporte para la electroforesis un gel dpoliacrilamida (PAGE), posteriormente el métodofue perfeccionado por varios investigadores comDavis y Ornstein. La popularidad de este crecirápidamente y se logró un aumento de la resolucióEl dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce eesta técnica en 1970, y ya en 1972 se empleagentes reductores y SDS en la determinación dpeso molecular de proteínas en lo que se denomielectroforesis en geles de poliacrilamida con SD(SDS-PAGE). En este trabajo se da un bosquegeneral de la electroforesis, si se tiene en cuenel desarrollo desde su surgimiento hasta el presen

DESARROLLO

1. Fundamentos de la electroforesis

La electroforesis es la migración de solutoiónicos bajo la influencia de un campo eléctricoEstas partículas migran hacia el cátodo o ánod(electrodos - y +), en dependencia de un

1 Master en Ciencias Bioquímicas. Investigadora Agregada.

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combinación de su carga, peso molecular estructura tridimensional.

Es de destacar que a escala analítica, lmétodos electroforéticos son de alta sensibilidapoder de resolución y versatilidad, y sirven commétodo de separación de mezclas complejas ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculadonde aportan un potente criterio de pureza. Spueden conocer también mediante estas técniclas características ácido-básicas de las proteínpresentes en un extracto crudo, lo que da información necesaria si se pretende realizar useparación cromatográfica basada en diferencide carga. Es útil además para determinar otrparámetros como peso molecular, punto isoeléctriy número de cadenas polipeptídicas de laproteínas.

La velocidad de migración (v) de la partículaes directamente proporcional al producto de scarga efectiva (q) y el gradiente de potenciaeléctrico (E) e inversamente proporcional acoeficiente de fricción (f) relativo a la talla y formade la molécula, o sea, a la resistencia que le ofreel medio.

V = q E / f

La movilidad electroforética (Me) es un casoparticular de la velocidad de migración de un ión

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cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cmSu signo es igual al de la carga de la partícula.

La velocidad de migración electroforéticadepende de la densidad de carga de la molécu(relación carga / peso), del voltaje aplicado y de laporosidad del gel de electroforesis. El voltaje no sepuede incrementar indiscriminadamente porque sgenera un excesivo calor. En contraste, al aplicabajo voltaje puede ocurrir una pobre separaciónpor causa de la difusión por tiempo muy prolongadode la corrida electroforética.1

La mayoría de las biomacromoléculas(proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseedeterminada carga eléctrica con grupos aniónicoy catiónicos capaces de disociarse. La carga nede la partícula está dada por el pH del medio ypuede ser modificada por la interacción conpequeñas moléculas de iones u otrasmacromoléculas. De lo anterior se deduce que epH influye sobre la velocidad de migración de lasmoléculas.2 En el punto isoeléctrico de labiomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta nmigra. Por debajo del punto isoeléctrico tiene carganeta positiva y migra hacia el cátodo, y por encimadel punto isoeléctrico tienen carga neta negativa ymigra hacia el ánodo.

2. Métodos electroforéticos zonales

Son útiles para lograr la separación decomponentes de mezclas complejas. Se aplicapequeñas cantidades de la disolución de proteínaa un soporte sólido, que se impregna con unasolución de tampón. Los soportes son en generapolímeros y forman un gel poroso que restringe emovimiento de las moléculas a través del mediodurante la electroforesis y disminuyen los flujos deconvección del solvente. Como soportes han sidoutilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida,agarosa, acetato de celulosa, etcétera.

Este método tiene gran poder resolutivo porquese aplica una cantidad pequeña de proteína a unzona estrecha, mientras que la longitud del trayectes mucho mayor que la zona de aplicación. Eequipamiento requerido es simple (fuente de podey cubeta vertical u horizontal donde se coloca esoporte y 2 electrodos). Con el desarrollo de laciencia se han diseñado equipos automatizados delectroforesis como el PhastSystem.

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2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida

La poliacrilamida es un soporte empleadofrecuentemente en electroforesis en gel, equímicamente inerte, de propiedades uniformescapaz de ser preparado de forma rápida reproducible. Forma, además, geles transparentcon estabilidad mecánica, insolubles en aguarelativamente no iónicos y que permiten buenvisualización de las bandas durante tiempoprolongado. Además tiene la ventaja de quvariando la concentración de polímeros, se puedmodificar de manera controlada el tamaño deporo.3

2.2. Formación del gel de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se forman por lapolimerización vinílica del monómero acrilamidaCH2=CH-CO-NH2 y del monómero entrecruzador N,N´-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH- CO - NH - CH2

- NH - CO - CH = CH2. La polimerización se inicia conla formación de radicales libres del monómero, quese producen por radicales libres de oxígeno, pocausa de la acción de iones persulfato.1 Las aminasterciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-diamina(TEMED) se emplean como catalizadores de estreacción, porque causan la formación de radicalelibres del persulfato.4 Esta reacción es fuertementeinhibida por altos niveles de oxígeno,5 por lo que lasolución debe ser desgasificada para lograr unformación de gel reproducible. Hay muchosfactores que desempeñan una función importanen la separación electroforética, como son pHfuerza iónica, gradiente de potencial, tiempo dcorrida, concentraciones de acrilamida y bisacrilamida, etc. Las condiciones óptimas de unbuena separación, en la práctica se determinaexperimentalmente, con el análisis de cómoinfluyen los diferentes factores en la electroforesien cuestión. La naturaleza de la muestra sirve dguía para alcanzar las condiciones en la que deben obtener los mejores resultados.6

Bambeck7 reporta que durante lapolimerización del gel a temperaturas inferiores a17 ºC, la iniciación del control catalítico y el tiempode elongación de la cadena comienzan a sdiferencialmente controlables.

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2.3. Significación de % T y % C

La concentración de acrilamida (% T)representa el porcentaje en peso del monómetotal empleado (acrilamida + entrecruzador egramos por 100 mL) y determina la longitudpromedio de la cadena del polímero. Laconcentración de bis-acrilamida (% C) represenel porcentaje de este monómero en el gel determina el grado de entrecruzamiento.

La estructura del gel comienza a ser evidena 4 % T; 0,2-5 % C.8 Los factores que gobiernanla talla del poro del gel son complicados, pero egeneral el tamaño del poro disminuye con eincremento del %T.9 Las proporciones en queambas se encuentran determinan las propiedadfísicas del gel como son densidad, elasticidaresistencia mecánica y el tamaño del poro. Egeneral se recomiendan valores de T de 5 a 15y de C de 2 a 4 %.10 Para separar moléculas portamaño, es necesario tomar en cuenta la relacientre el poro efectivo del medio y el tamaño de lmolécula que se pretende separar. Si el poro dmedio es significativamente mayor que la moléculala separación electroforética será sobre la base diferencias de carga y el tamizaje molecular semínimo. Al aplicar muestras biológicas en un gecon gradiente de acrilamida, todas lamacromoléculas comienzan su migración a baporcentaje y en la medida en que avanzan encuentran con poros más pequeños que retardsu movimiento. Las moléculas menores comienzaa tener alta fricción cuando los poros son mápequeños, mientras que las grandes comienzanfricción en los poros de mayor tamaño.

2.4. Tipos de monómeros

La bis-acrilamida es el agente entrecruzadomás comúnmente empleado en este tipo delectroforesis. O Gaal y otros en 1984,10 plantearonque la bis-acrilamida puede actuar comterminador de la cadena en el proceso dpolimerización y concentraciones altas puededisminuir el tamaño de poro máximo de gel.

Se han reportado otros agenteentrecruzadores como: la N, N´-diallitartar diamina(DATD) que da un tamaño de poro mayor que eobtenido con bis-acrilamida; la N, NC- bisacrililcistamina

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(BAC) cuyo gel resultante se une por los gruposbisulfuro, lo que hace que pueda disolverse ensoluciones de reactivos tiólicos y el N,N´-(1,2-dihidroxietileno) bis-acrilamida o DHEBA formageles de poros altamente hidrofílicos.8

2.5. Catalizadores empleados en la formacióndel gel de poliacrilamida

La polimerización se lleva a cabo con lautilización de sistemas catalíticos redox como porejemplo:

• Persulfato de amonio (agente oxidante) yTEMED como agente reductor.

• Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).

• Peróxido de hidrógeno, sulfato de hierro y ácidoascórbico.

La polimerización no ocurre a bajo pH, ya querequiere radicales de monómeros libres formadospor catálisis básica de radicales oxígeno delpersulfato.

La fotopolimerización con riboflavina no esinhibida por el oxígeno, sin embargo, en amboscasos el TEMED actúa como agente reductorsuave y acelera la polimerización.1

2.6. Sistemas de tampón que se empleanen la electroforesis en geles de poliacrilamida

La fuerza iónica (m) determina el potencialelectrocinético ya que reduce la carga neta de losgrupos con cargas efectivas. Se ha determinadoque la movilidad de las partículas cargadas esinversamente proporcional a la raíz cuadrada de lafuerza iónica, a baja m se eleva la velocidad demigración y es menor la difusión, de manera que lazona de separación es más ancha y mayor laresolución.1 Con el aumento de la m, se incrementael desprendimiento de calor y la evaporación. Enla electroforesis, los efectos de absorción de agua,no-homogeneidad del material, intercambio iónicocon grupos cargados del soporte yelectroendósmosis, pueden influir sobre lamovilidad y la calidad de la separación. Laelectroendósmosis generalmente ocurre porquegrupos cargados del soporte se ionizan en

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soluciones tampón neutras o ácidas y locontraiones libres hidratados (H3O

+) migran haciael cátodo, esto provoca un movimiento relativo dsolvente respecto al soporte sólido y que lamoléculas no cargadas sean transportadas hael cátodo a pesar de no tener grupos ionizados

La electroforesis en geles de poliacrilamidpuede realizarse en el rango de pH de 2 a 11, embargo la desaminación de las proteínas o reacciones hidrolíticas pueden ser severas a valode pH inferiores a 3 y superiores de 10. La mayorde las proteínas con puntos isoeléctricocomprendidos entre pH 4 y 7,5, son separadasgeles con pH entre 8 y 9.

La fuerza iónica del sistema tampón debmantenerse a un nivel adecuado para garantizasolubilidad de la muestra y suficiente capacidaamortiguadora. Es usual utilizar concentracionede tampón en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, peropueden emplearse concentraciones sobre 0,5 moen sistemas fuertemente ácidos, pues a bajosvalores de pH muchos ácidos débiles (que son más empleados) están débilmente ionizados ynecesaria una alta concentración para obteneadecuada capacidad amortiguadora.1

2.6.1. Sistemas de electroforesis. Electroforeside múltiples zonas (MZE)

El sistema de electroforesis a emplear depende los objetivos a alcanzar, los más empleados sgel uniforme y tampón homogéneo, y gel y tampóheterogéneo. La principal desventaja del primeres que la resolución es menor que con los sistemheterogéneos, porque no hay efecto concentraden la primera parte de la corrida. En el sistemdiscontinuo o heterogéneo se varían el poro del gy los iones del tampón, por lo que se puedconcentrar la muestra.11 Cuando no es necesariauna gran resolución, los sistemas homogéneos tienla ventaja de ser rápidos, sencillos. Las bandaespecialmente de proteínas pequeñas, son manchas en el sistema homogéneo que enheterogéneo, efecto que se compensa con la mapendiente de este último.12

En la actualidad es común que la electroforesdiscontinua se realice con 2 tipos de geles, un gconcentrador (de poros grandes) y un gel separa(de poros pequeños).13, 14 Esto se fundamenta en

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que los constituyentes iónicos de las soluciontampones utilizadas en ambos geles son iguapero el pH de estas y el tampón de corridempleado en los electrodos es diferente. separación ocurre en el gel separador, dondemigración está determinada por la carga y el tamamolecular de las partículas. Encima de este gesitúa el gel concentrador, generalmente de umenor altura (1/3 del gel separador), en el quemuestra se concentra en una zona muy estreclo que determina la separación en bandas finasel gel separador y alto poder de resolución. proceso general en PAGE-SDS discontinuo conde 3 etapas: concentración, desconcentracióresolución.

La teoría de MZE fue formulada por Jovin.15

Al aplicar esta teoría a un sistema con tris-HCl ambos geles y tris-glicina como tampón de corridse observa que las 2 especies iónicas existenCl- (iones conductores) y glicinato (ionerezagados) migran en la misma dirección que moléculas de la muestra. Al comenzar electroforesis, los iones Cl- tienden a moverserápidamente, separándose del resto de las espeiónicas y dejando tras de sí una zona de bconductividad. La conductividad específica einversamente proporcional a la fuerza del cameléctrico, se forma un gradiente de voltaje en eregión que acelera el movimiento de los ionrezagados, lo que hace que estos migren en segdetrás de los iones conductores y a la mismvelocidad; de esta manera se forma el denominalímite de Kohlraush, entre los iones conductoreslos rezagados (entre las regiones de alto y bgradiente de voltaje). Las movilidades de locomponentes de la muestra son intermedias enlas de los iones conductores y rezagados, porque se encontrarán en la región límite, en capassolo algunos micrones de grosor.1 Cuando lamuestra concentrada llega a la interfase entregel concentrador y separador, ocurren cambiosla movilidad de los constituyentes por causa dpH, la fuerza iónica y el efecto de tamizaje del gDependiendo de los componentes individuales la muestra estos migran en bandas discretas.

La principal ventaja de la teoría de MZE es flexibilidad con que puede ser aplicada en fraccionamiento analítico o preparativo.

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2.7. Formatos de la PAGE

Existen 3 formas diferentes de realizarelectroforesis en geles de poliacrilamida: láminavertical, varilla cilíndrica y lámina horizontal.

Los geles más finos son más económicoporque emplean menos reactivos y pueden seficientemente refrigerados durante la corrida, polo tanto pueden ser corridos a mayor voltajelográndose así una alta resolución en corto tiempLos tiempos de tinción y destinción son menoretambién porque la difusión es muy rápida; sinembargo como el gel es tan fino es más propensa perturbaciones y problemas en la polimerización8

Se ha planteado que la resolución de las moléculgeneralmente aumenta con la disminución degrosor del gel.16

2.8. Comportamiento de las proteínas en laelectroforesis en geles de poliacrilamida condodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS)

La electroforesis con SDS es un excelentmétodo para identificar y monitorear las proteínadurante un proceso de purificación; también semplea para la determinación del peso moleculade las subunidades de proteínas.4

La estructura del detergente SDS empleaden esta variación de la electroforesis en gel dpoliacrilamida es CH3 (CH2) 10 CH2 = SO3 - Na+.El anión se une a las proteínas por absorción nespecífica (aproximadamente una molécula de SDpor cada dos residuos de aminoácidos, con unrelación SDS/proteína máximo de 1,4 g/g). El SDSdesnaturaliza por completo las proteínas y romplas interacciones no covalentes que determinan estructura terciaria y cuaternaria. Los grupoalifáticos dodecil se colocan en el interior, mientraque los grupos sulfato en la superficie y todos locomplejos SDS-proteína toman carga neta negativ(que excede la carga intrínseca de las cadenasaminoácidos). Las proteínas reaccionan con SDa relativamente alta concentración, pero se hdemostrado que 0,4 % de SDS es el nivel mínimnecesario para saturar los sitios de unión de proteína, sin embargo, se emplea 1 % para logrun margen de seguridad.8

El Rf es una medida convencional de lamovilidad de la proteína relativa al frente de

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migración4 y se define como la distancia desde elinicio del gel separador hasta el centro de cadabanda dividida entre la distancia a la que hamigrado el ión líder.

La concentración apropiada de SDS en eltampón superior, se determina incrementando lacantidad de SDS hasta que no exista variación enel Rf. Se ha demostrado que concentraciones enel rango de 0,02 a 0,025 % de SDS en el tampónsuperior es suficiente, sin embargo se utiliza 0,03 %para obtener un margen de seguridad.

El complejo SDS-proteína tiene forma devarilla con un diámetro aproximado de 18 Å y unalongitud proporcional al peso molecular de la cadenapolipeptídica. El tratamiento concomitante con unagente reductor de puentes bisulfuro, como el betamercaptoetanol ( βME) o el DTT desnaturalizalas proteínas y las rompe en las subunidades que lacomponen. Por lo que el complejo SDS-proteínatiene generalmente mayor densidad de carga ymenor tamaño que las proteínas nativas. Se hadeterminado que con 5 min a 95-100 ºC essuficiente para la formación de enlaces establesSDS-proteína a una concentración de 1 % de SDS,en presencia de EDTA y condiciones reductoras.El complejo SDS-proteína es estable durante 3 mesesa 4 ºC. El SDS migra más rápido que el complejoproteína-SDS en un gel restrictivo, por lo que elSDS no es necesario adicionarlo en los geles sieste está presente en la muestra y en el tampónsuperior, lo que da la ventaja de asegurar lascondiciones y la eficiencia de polimerización delos geles sin SDS.8

La migración de los derivados proteína - SDShacia al ánodo es inversamente proporcional allogaritmo de su peso molecular (log PM).17 Larelación carga/masa es aproximadamente igual paratodas las proteínas de la muestra por lo que la tallade esta deviene en el factor determinante de laseparación. El SDS-PAGE se emplea para estimarel peso molecular de las proteínas y se comparacon un patrón. No obstante Bjellqvist18 hareportado que diferentes proteínas de igual tallapueden migrar como una banda única.

Bajo iguales condiciones de pH y temperatura,el SDS y las proteínas se concentran en la mismazona, pero como la cantidad de SDS es muy grandecomparada con la de proteínas y su concentraciónen el gel concentrador se puede regular, se formauna zona de concentración amplia caracterizada

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fundamentalmente por ser estable con el frente dcorrida y que continuamente aumenta durante laelectroforesis dependiendo de la cantidad de SDintroducido en el tampón. Se aprecia una progresivdifusión del borde de migración en la medida enque aumenta la concentración de T.8 Estos autoresdemostraron que el ión glicinato no se concentracon el gel concentrador, lo que puede estaprovocado por una interacción entre la glicina y elSDS. La concentración de pequeñas proteínas edifícil en estas condiciones, porque se formancomplejos de proteínas y detergentes de igual tally carga que las micelas de SDS solas, por lo qurecomienda el empleo de una mínima cantidad dSDS.

Las condiciones pueden ajustarse dependiendde como se necesite separar las proteínas (eestado completamente desnaturalizadaparcialmente desnaturalizada o nativa). Lasasociaciones covalentes entre las unidades dproteínas pueden mantenerse omitiendo el βMEdel tampón de muestras. En ausencia de este agenreductor los puentes bisulfuro intracatenarios eintercatenarios de la muestra de proteínaspermanecen intactos; la movilidad electroforéticadel complejo SDS proteína se altera bajo estacondiciones de disociación y durante laelectroforesis la movilidad de los oligómeros SDSproteínas es menor que con los componentes SDpolipéptidos completamente desnaturalizados. Laproteínas pueden mostrar una respuesta individucaracterística a la reducción, lo que se determinal comparar los geles corridos con βME o sin este.Adicionalmente las proteínas no reducidas, puedeno estar del todo saturadas con SDS por lo qupuede variar su relación peso/peso en suinteracción con el detergente. Esto hace que ladeterminaciones de peso molecular con estacaracterísticas no tengan la misma confiabilidadque el análisis hecho con polipéptidos del tododesnaturalizados. Es necesario la existencia dpatrones y proteínas conocidas de igualconfiguración para una comparación válida. ELSDS-PAGE bajo condiciones reducidas y noreducidas es un método muy útil para el análisis dlos puentes bisulfuro que contienen las proteínasSchuhmacher M y otros19 en estudios con lalisozima de huevo durante la electroforesisdemostraron que el βME y del DTT forman

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aductos bisulfuro con las proteínas. Jeannot MAy Zheng J20 reportaron un método de preparaciónde la muestra en el que se elimina el SDS del gel.

2.9. Determinación de peso molecular deproteínas. Comportamiento anómalo dediferentes proteínas en electroforesis

El peso molecular (PM) de las proteínas puededeterminarse en electroforesis al comparar lasmovilidades electroforéticas de varios marcadoresde peso molecular conocido. Existen patrones(mezclas de proteínas de peso molecular conocidoy que se tiñen uniformemente) de varios rangos depeso molecular, se debe aplicar el que abarque elpeso molecular esperado para la proteína que sequiere determinar. Estos patrones deben sertratados de manera similar a la muestra. En general,cuando las proteínas tienen gran cantidad decarbohidratos en su composición o cuando estánunidas a complejos de membrana migran de maneraaberrante,8 por lo que no son recomendadas comomarcadores de peso molecular.

Al realizar un ploteo del log PM de la proteínapatrón como función del valor de Rf, se obtiene ungráfico ligeramente sigmoideo. El peso moleculardesconocido puede estimarse por el análisis deregresión lineal o por interpolación en la curva dellog de PM contra Rf.4

El ploteo de Ferguson del log de Rf contra el% T del gel separador para varias proteínaspatrones chequea el error sistemático del método,para lo que es importante que estas proteínasmuestren uniformidad en su densidad de carga, loque se determina por la intercepción de sus líneasa 0 % T. Se obtiene un ploteo de Ferguson nolineal en el fraccionamiento de pequeñas proteínasa una alta concentración de gel o de proteínasmuy grandes que dan valores de Rf muy pequeños.8

El coeficiente de retardación (Kr) da unamedida de la influencia del tamizaje sobre lamovilidad de las biomoléculas, se ha reportado quees función del peso molecular y existe inclusivepara moléculas pequeñas. Los valores de Krpodrían minimizarse para todas las proteínaspatrones por selección de valores bajos de C. Conel empleo del ploteo de Ferguson se puedendiscriminar las diferencias de carga, el pesomolecular y las formas de diferentes isómeros,8

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así como determinar el peso molecular de estosin embargo se pueden encontrar dificultadetécnicas cuando varios multímeros de proteínase analizan.

Existen casos de migraciones anómalas dproteínas como por ejemplo la ferritina y apoferritinade bazo de caballo,8 en que se recomienda suempleo para calibrar SDS-PAGE solo bajoadecuadas condiciones de desnaturalización (2 SDS, agente reductor de bisulfato y 5 min a 100 ºó 5 h a 37 ºC), ya que la apoferritina es inusualmenresistente a la desnaturalización y disociación esubunidades. Puede observarse que en un tampcontinuo a pH 7 da una banda con peso moleculde 20 000 y en SDS -PAGE con sistema de tampódiscontinuo se aprecian 2 bandas de PM 19 88922 200, lo que puede no ser por causa de uaumento de la resolución en la técnica, sino podiferencias en la concentración de SDS, por lo tantel fenómeno puede ser explicado por diferenciaocasionales en la estimación del peso moleculade los 2 tipos de SDS-PAGE. Cuando estaproteínas se separan por filtración en gel, supropiedades geométricas e hidrodinámicas haceque su talla y características superficiales seadiferentes de otras proteínas globulares típicas, plo que es necesario tener en cuenta scomportamiento característico.

Zhang J y otros,21 hacen un interesante análisis decomportamiento anómalo en cuanto a la determinacióde peso molecular, de una proteína recombinaninhibidora de la proteína fosfatasa-1(denominadinhibidor-3), que es extremadamente hidrofílica yestable al calor. Esta proteína tiene un pesmolecular aparente de 23 kD en SDS-PAGE, pogel de filtración, un peso molecular relativo de55 000 y su peso molecular calculado es de 14 kD.Esta característica se ha descrito también para lproteínas inhibidor-1 e inhibidor-2, que actúansobre la proteína fosfatasa-1.

Para completar el estudio de peso moleculade proteínas, se ha reportado19 el análisis porespectrometría de masa por ionización eelectroatomización (ESI-MS) para proveer de undeterminación exacta del peso molecular dproteínas aisladas y no resueltas por SDS-PAGEA pesar de que existen otros métodos márecientes para la determinación del peso moleculde proteínas, la electroforesis en geles dpoliacrilamida no ha perdido su utilidad.

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2.10. Estabilidad de los geles de electroforesis

El principal problema que afecta la estabilidady la resolución en todos los medios de electroforesises la absorción y desorción. Las características detamizaje del gel están fundamentalmente dirigidaspor el tamaño del poro y cuando el medio absorbeagua, el tamaño medio del poro se incrementa, estohace que las moléculas puedan migrar más rápidoa lo largo del gel y disminuye la resolución. Perocomo la absorción de agua no es uniforme encada porción del gel, casi siempre es mayor en laregión central que en los extremos, por lo que lasmoléculas localizadas en esta migran a través delgel más rapido que las que están en los extremoslo que deforma y afecta la reproducibilidad de laelectroforesis.

Todos los geles de poliacrilamida absorben aguadurante el proceso de polimerización y durante laconservación, pero la tendencia se incrementa conel aumento del porcentaje de acrilamida.

En el sistema de electroforesis con tampón ygel heterogéneos, la diferencia de concentraciónentre los geles concentrador y separador crea unpotencial osmótico entre los 2 geles, lo que provocaque el agua pase del gel concentrador (región debajo % acrilamida) hacia el separador (región dealto % de acrilamida). Este proceso es muy rápidoy continúa hasta que se establezca un equilibrioentre ambos geles como resultado de la difusióndel agua al gel separador, por lo que el porcentajede acrilamida no es estable en el gel separador yes necesario emplear los geles en el día de supreparación.

Cuando se mantiene en tampón, el gel absorberápidamente agua de este hasta llegar al equilibrio,lo que provoca inestabilidad en este y dificulta sucomercialización. Un gel no tiene una calidadaceptable si presenta poros no uniformes comoresultado de la difusión de agua entre el gel dealto porcentaje y la atmósfera.16 Por todo loanterior se ha planteado la utilización decompuestos que restringen la difusión, los quepueden ser polioles, polisacáridos, alcoholespoliméricos, etc. Estos compuestos se adicionanen la parte del medio de electroforesis en que sequiere inmovilizar el agua, en el caso de laelectroforesis en poliacrilamida cuando estásintetizando el gel concentrador, lo que no afecta

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el proceso electroforético que se puede segusegún el método convencional. Si se desea prevela difusión de agua desde el tampón hasta el gel, necesario añadir estos compuestos al tampón.

Los compuestos de restricción de la difusiónreportados por CM Starr16 son moléculas nocargadas hidrofílicas que contrarrestan el potenciosmótico entre 2 geles de electroforesis codiferente potencial osmótico o entre el tampón y egel. Sin embargo como el potencial osmóticodepende de la hidrofilicidad de los compuestos de la concentración molar, la concentración de ucompuesto particular de restricción de la difusióndependerá del desbalance de potencial osmóticque se desee contrarrestar; se necesita una meconcentración para un gel uniforme que la necesarpara un gel discontinuo. El polietilenglicol es elagente hidrofílico de restricción de la difusión másempleado en el gel concentrador en electroforesde poliacrilamida. El proceso de difusión de agues dependiente de la temperatura, por lo que reducción de la difusión en el medio aumentatambién la estabilidad térmica de este. Laviscosidad del gel puede controlarse con la adicióde polímeros, además se le puede añadir agaroen concentración de 0,2 a 2 % p/v, dependiendo dla cantidad de monómero y agente entrecruzadque contenga el gel.

2.11. Phastsystem

El equipo PhastSystem consiste en un sistemade electroforesis computarizado, en el cual spuede ejecutar focalización isoeléctrica,electroforesis y revelar estas automatizadamentLos geles de electroforesis denominados PhastGel,empleados en el equipo PhastSystem, tanto parasistema nativo como desnaturalizado emplean comtampón acetato 0,112 mol/L y tris 0,112 mol/L apH 6,4 en ambas zonas. Las longitudes de los gelconcentrador y separador son de 13 y 32 mmrespectivamente y su grosor de 0,45 mm.

El tampón de electrodo se suministra en formde tiras de 2 tipos, uno para electroforesis nativaotro para desnaturalizada, hechos con reactivos alta calidad y agarosa de baja electroendósmosEstas crean durante la corrida un sistema dtampón discontinuo o continuo según se dese

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En las tiras para SDS-PAGE se emplea tricin0,2 mol/L, tris 0,2 mol/L, SDS 0,55 % pH 8,1,agarosa 2 %. Esta alta concentración de SDS elas tiras permite eliminar el SDS del gel.

El PAGE-nativo en equipo PhastSystememplea los mismos geles que el desnaturalizadsolo cambia el sistema de tampón en las tiras, ques en este caso de L-alanina 0,88 mol/L y tris 0,2mol/L pH 8,8 en agarosa 2 % (acetato como ionelíderes y L alanina como rezagados). Como el pHdel gel toma un valor de 8,8, las proteínas copunto isoeléctrico menor que 8,3 se carganegativamente y migran a través de la zona dconcentración.8

3. Fuentes de error en la electroforesis

La electroforesis es una técnica muy sensibly puede ser afectada por muchos erroreexperimentales, estos se reflejan a continuación

3.1. Temperatura durante la polimerizacióny la corrida del gel

La movilidad de las proteínas varía entre otracausas porque la viscosidad del agua aumentabajas temperaturas (la distancia recorrida eaproximadamente 20 % mayor en la región centraque es más caliente). Este efecto puede atenuacon el empleo de un tampón más diluido omanteniendo temperaturas bajas durante edesarrollo de la electroforesis.

En geles vertidos a 25 ºC ocurre mayorvariabilidad de los Rf si se comparan con losvertidos a bajas temperaturas. La eficiencia dpolimerización incrementa comparativamente a0 ºC por lo que sus propiedades físicas sonsuperiores (para SDS-PAGE) a las de gelepolimerizados a 25 ºC, posiblemente por unadisminución del promedio de la longitud de lacadena de estos últimos.8

Un promedio de la desviación estándar de loRf determinados por geles hechos con la mismmezcla de polimerización es de 0,01, mientras quentre geles hechos de diferentes lotes dpolimerización, aunque preparados con idénticcantidad de catalizadores es de 0,13. Esto esdado porque no es igual el porcentaje de conversióde monómero en polímero.

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La uniformidad de la temperatura a través degel mientras ocurre la corrida electroforéticageneralmente elimina el efecto de la deformacióde las bandas en forma de “sonrisa”.22

3.2. Velocidad de la polimerización. Nivelesde catalizador

Una polimerización muy rápida puede deformalas bandas, porque ocurre una contracción nuniforme del gel, en este caso debe reducirse TEMED y el persulfato de amonio o adicionarferricianuro de potasio, con el objetivo de hacemás lenta esta.

El empleo de niveles bajos de catalizadoprovoca que la superficie del gel se torne desiguy tienda a romperse con facilidad, pero el emplede altas concentraciones provoca que los geltiendan a cuartearse. Este problema puedsolucionarse en geles de altas concentracionesponer una capa de alcohol isobutílico en lugar dagua (en geles de bajas concentraciones debemplearse alcoholes de altas densidades).

3.3. Pureza de los reactivos

El empleo de reactivos de alta calidad y agudesionizada es un prerrequisito para hacer gelreproducibles y de alta resolución, en particular eses muy importante para la acrilamida, ya que esconstituyente más abundante del gel y suprincipales impurezas son ácido acrílico residua(que puede retardar la movilidad electroforéticade algunas proteínas), poliacrilamida lineal iones.4

O Gaal y otros10 plantearon que el ácidoacrílico y otras impurezas pueden ser eliminadopor diferentes métodos, entre ellos la recristalizacióde la acrilamida.

En SDS-PAGE la calidad del SDS esimportante, porque las proteínas pueden unirseimpurezas como alkil sulfato C10, C14 y C16, yprovocar que una simple proteína forme múltiplebandas en el gel. Con SDS puro ocurre unmigración anómala en proteínas muy básicas o mácidas, en varias glicoproteínas y lipoproteínas pcausa de su composición inusual.4

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3.4. Tiempo de corrida

La determinación del tiempo adecuado decorrida es muy importante, pues corridas muycortas impiden que las muestras avancen el espacionecesario para su correcta separación, perotambién se ha probado que tiempos de corridacortos minimizan la dispersión de la muestra y elensanchamiento de la banda.

3.5. Preparación de las muestras

En el caso de la SDS-PAGE es necesariolograr una completa desnaturalización de lasproteínas, para evitar la aparición de bandasfantasmas en la electroforesis (bandas dobles porla concentración de βME o por el tiempo deincubación).12

Seichi y Chait23 reportaron que la alquilaciónde la cisteína antes de la electroforesis evita laformación accidental de aductos de acrilamidadurante la electroforesis.

4.Tinción

Las proteínas coloreadas naturales como lamioglobina, hemoglobina, ferritina y citocromo C,pueden ser observadas directamente en los geles,sin embargo la visualización de la mayoría de lasproteínas requiere el uso de colorantes.

Los colorantes orgánicos fueron los que seemplearon primero para teñir proteínas en los geles(ejemplo de estos bromofenol azul, azul deCoomassie, etc.).

Una rápida tinción, destinción y fijación sonesenciales en el caso de las proteínas pequeñaspara evitar su elusión; la omisión del metanol de lasolución de tinción es beneficiosa ya que se reduceel tiempo de tinción y disminuye el hinchamientode los geles.12

Existen diferentes tipos de tinción, entre ellosla plata que es muy sensible y tiene la característicade producir generalmente coloraciones carmelitao negro, sin embargo algunas proteínas tienencolores característicos como las lipoproteínas quetienden a colorearse de azul y algunas glicoproteínasque aparecen amarillas, carmelitas o rojas.24 Esteefecto cromático se ha demostrado que está dadopor la difracción de la luz en la plata. Se han

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desarrollado algunos procedimientos de tinción conplata para identificar ciertas proteínas, con eempleo de combinaciones de tinción.

La tinción con Coomassie puede emplearsepara la determinación de proteínas cuando estason abundantes, pero no para la determinación dpureza de proteínas trazas. Esta tinción requierun medio ácido para la generación de la atraccióelectrostática entre las moléculas del colorante ylos grupos amino de las proteínas. La atraccióniónica es a través de las fuerzas de Van Der Wallsque une a las proteínas y al colorante formando ucomplejo. Esta unión es totalmente reversible encondiciones apropiadas.

Se ha reportado la tinción de proteínas por otrométodos entre los que se encuentran: eriocromnegro, compuestos fluorogénicos, modificación delos aminoácidos de las proteínas.8

5. Conservación de los geles de electroforesis

Notsu K y Shiratori M25 reportaron sumergirel gel después de electroforesis en una solución dsacáridos, azúcares, alcoholes de más de carbonos y polímeros solubles en agua; despuése introduce este entre 2 filmes de celofántransparentes y semipermeables colocado en formde sandwich a ambos lados del gel o en uno y enel otro una lámina plástica. De esta forma loscomponentes acuosos del gel son reemplazadopor los de la solución. Esto permite que el gel seseque, sin causar su ruptura, deformación, pérdidde la transparencia y sin necesidad de empleacalor o presión reducida ni ningún aparato especiaNo se han reportado variaciones en geles tratadocon este método después de 2 años.

Se recomienda el empleo de un poliol como eglicerol como un agente «húmedo» cuya funciónes además de actuar como un agente de restriccióde la difusión, impedir que el gel se seque por laevaporación durante la conservación, lo que evitala ruptura de este.

AGRADECIMIENTOS

A Gretter Armas García por su colaboraciónen la realización de este trabajo.

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SUMMARY

Electrophoresis makes possible to separate biological moleculesdepending mainly upon their charge under the influence of anelectric field. A general and updated outlook on electrophoresisin polyacrylamide gels for proteins is given. Some traditionalconcepts about this methods such as the addition of compoundlimiting diffusion and that increase the gel stability are analyzed.Examples are given about the abnormal behavior of some proteinsin the determination of the molecular weight by electrophoresisin polyacrylamide gels under disnatured conditions.

Keywords: electrophoresis, polyacrylamide, gels.

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrero del 2001.

Dra. Hilda Marilín García Pérez. Laboratorios BETERÁ. Calle102 e/ 31 y 31-B. Marianao. Ciudad de La Habana.Correoelectrónico: beterá@infomed.sld.cu

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pregunta permanece tonto por siempre”.

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Bertrand Russell (1872-1970), filósofo y matemático inglés.

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Johann Wolfgang von Goethe (1749-1832), poeta y dramaturgo alemán

«El hombre nada puede aprender sino en virtud de lo que ya sabe”.

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