università di bologna dipartimento di medicina clinica specialistica e sperimentale sezione di...
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Università di BolognaUniversità di BolognaDipartimento di Medicina Clinica Specialistica e SperimentaleDipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale
Sezione di MicrobiologiaSezione di Microbiologia
Tecniche di amplificazione real-time nella Tecniche di amplificazione real-time nella determinazione della carica viraledeterminazione della carica virale
Parvovirus B19 e Papillomavirus umaniParvovirus B19 e Papillomavirus umani
Giorgio GallinellaGiorgio Gallinella
La ricerca di acidi nucleici virali mediante PCR assicura:
Specificità – la scelta nell’utilizzo dei primer determina il bersaglio della reazione
Sensibilità – la definizione delle condizioni di reazione determina il livello di sensibilità della reazione
La determinazione quantitativa mediante real-time PCR permette:
Valutazione quantitativa come parametro diagnostico
Valutazione quantitativa in corso di screening
Valutazione quantitativa in corso di follow-up
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
Real-Time PCR nella diagnosi virologicaReal-Time PCR nella diagnosi virologica
La determinazione mediante PCR end-point fornisce informazioni qualitative:
Informazioni quantitative possono essere ottenute mediante modificazioni della tecnica di base (diluizioni end-point, PCR competitiva, …)
La determinazione mediante PCR real-time fornisce informazioni quantitative:
Informazioni quantitative possono essere ottenute direttamente mediante analisi in tempo reale delle curve di accumulo dei prodotti di reazione
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
Real-Time PCR nella diagnosi virologicaReal-Time PCR nella diagnosi virologica
La tecnica di PCR real-time:
Si basa sulla rivelazione dell’emissione luminosa di fluorocromi presenti nella miscela di reazione
Fluorocromi intercalanti (SybrGreen) Flurocromi legati a sonde (FRET, Taqman, Molecular Beacons)
Utilizza strumenti che sono in grado di rilevare in tempo reale l’emissione luminosa dei fluorocromi
Thermal Cyclers a blocco Thermal Cyclers ad aria
Utilizza software in grado di effettuare analisi quantitative e delle curve di melting dei prodotti di amplificazione
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
Real-Time PCR nella diagnosi virologicaReal-Time PCR nella diagnosi virologica
Diagnosi virologica e determinazione del carico virale
Real-Time PCR nella diagnosi virologicaReal-Time PCR nella diagnosi virologica
Determinazione quantitativa mediante PCR real-time nello studio delle infezioni da Parvovirus B19 e Papillomavirus umani
• Famiglia Parvoviridae
• Genere Erythrovirus
• DNA monocatenario 5600 nucleotidi
• Struttura icosaedrica
• Privo di pericapside
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Caratteristiche molecolari di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Schema patogenetico dell’infezione da Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Principali manifestazioni cliniche dell’infezione da Parvovirus B19
Eritema infettivo
Artralgie/Artropatie
Crisi aplastica transitoria
Idrope fetale e infezioni congenite
Possibile sviluppo di infezioni persistenti
Valutazione del carico virale per una più corretta valutazione del processo infettivo
Necessità di valutare l’andamento temporale del carico virale nel corso di infezioni croniche o persistenti
Infezione da Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Vie di trasmissione dell’infezione da Parvovirus B19
Trasmissione aerogena
Trasmissione materno-fetale
Trasmissione mediante sangue ed emoderivati
Necessità di valutare il carico virale nelle unità di donazione e nei pool di plasma per la produzione di emoderivati
Valore soglia ammesso di contaminazione da parvovirus B19 nei pool di plasma per la produzione di emoderivati pari a104 UI/ml
Infezione da Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione in soggetti normali Picco viremico e graduale clearance virale
Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG
Depressione transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo modesto dell’emoglobina
Manifestazioni cliniche bifasiche:1. Sintomi aspecifici2. Rash, artralgia (quinta malattia)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Infezione in soggetti con stress eritroide Picco viremico e graduale clearance virale
Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG
Depressione acuta ma transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina
Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (TAC)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Infezione in soggetti con deficit del sistema immunitario
Picco viremico e ritardata o assente clearance virale
Deficit (quantitativo e/o qualitativo) di anticorpi specifici di classe IgM e IgG
Depressione persistente della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina
Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (PRCA)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Infezione da Parvovirus B19
Materiale biologico
Sangue periferico, plasma, siero
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR
Determinazione anticorpi specifici anti-B19 (IgG+IgM)
Rilevanza diagnostica
Infezioni acute: malattia esantematica, artropatia
crisi aplastica midollare
Infezioni croniche: artropatia, aplasia eritrocitaria
Infezioni in gravidanza: infezione materna
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Materiale biologico
Sangue midollare, sangue fetale, liquido amniotico, biopsie tissutali
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR
Ricerca virus mediante ibridazione in situ
Rilevanza diagnostica
Infezioni acute: crisi aplastica midollare
Infezioni croniche: aplasia eritrocitaria
Infezioni persistenti: presenza del virus nei tessuti
Infezioni in gravidanza: infezione fetale
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Presenza di marcatori Numero di campioni Percentuale
DNA neg/ IgM neg/ IgG neg 123 35.8
DNA pos/ IgM neg/ IgG neg 14 4.1
DNA pos/ IgM pos/ IgG neg 9 2.6
DNA pos/ IgM pos/ IgG pos 40 11.6
DNA pos/ IgM neg/ IgG pos 36 10.5
DNA neg/ IgM pos/ IgG pos 26 7.6
DNA neg/ IgM neg/ IgG pos 96 27.8
Campioni con marcatore unico 40 11.6
Totale campioni 344 100
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Presenza di marcatori Numero di campioni Percentuale
DNA neg/ IgM neg/ IgG neg 123 35.8
DNA pos/ IgM neg/ IgG neg 14 4.1
DNA pos/ IgM pos/ IgG neg 9 2.6
DNA pos/ IgM pos/ IgG pos 40 11.6
DNA pos/ IgM neg/ IgG pos 36 10.5
DNA neg/ IgM pos/ IgG pos 26 7.6
DNA neg/ IgM neg/ IgG pos 96 27.8
Campioni unicamente DNA pos 50 14.6
Totale campioni 344 100
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Diagnosi di infezione da Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
La ricerca del DNA di Parvovirus B19 mediante PCR deve: Permettere una valutazione quantitativa del carico virale
Includere l’utilizzo di un reagente di controllo analitico
Modalità di quantificazione mediante real-time PCR: Quantificazione relativa (riferimento a campione calibratore)
Quantificazione assoluta (riferimento a curva standard)
Utilizzo di un controllo analitico interno
Eterologo
Omologo
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCRSono state descritte numerose coppie di primers che consentono un’efficiente amplificazione del bersaglio virale (del genoma virale oppure dellle diverse classi di messaggeri)
HR1 HR3 HR4 HR5 HR2
Ricerca di Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Metodi di indagine
Ricerca virus mediante PCR: PCR Real-Time
Rivelazione della fluorescenza emessa da un fluorocromo intercalante (SybrGreen)
Rivelazione della fluorescenza emessa da fluorocromi legati a sonde oligonucleotidiche (FRET, Taqman, Beacons, …)
Monitoraggio in tempo reale, ciclo per ciclo, della quantità di prodotto di amplificazione
Ricerca di Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Sviluppo di una tecnica di PCR real-time calibrata: Amplificazione in due reazioni parallele del bersaglio virale e di un
bersaglio di riferimento eterologo
Rivelazione dei prodotti di PCR mediante SybrGreen e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point
Quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto mediante applicazione della formula:
Etarget ed Ereference sono le efficienze, determinate sperimentalmente, delle due diverse reazioni di amplificazione
Cp (calb-sample) sono le differenze fra i crossing point del campione calibratore e dei campioni in esame
sample)(calbΔCref
sample)(calbΔCtarget
refP
targetP
E
E
ratio
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Virus
Ref
Amplificazione parallela del bersaglio virale e del bersaglio di riferimento
Virus
Valutazione dell’efficienza della reazione: EVirus = 1.909
Valutazione della variabilità della reazione: CpVirus = 0.21-1.71%
Riferimento
Valutazione dell’efficienza della reazione: ERef = 1.658
Valutazione della variabilità della reazione: CpRef = 0.45-2.41%
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Log Expected geq
Lo
g C
alc
ula
ted
ge
q
Analisi di regressione
Slope1.000 0.010
SD of Slope0.006 0.002
Standard Error0.1190.038
R2
0.996 0.002
Curve di regressione ottenute per la quantità calcolata di bersaglio virale rispetto alla quantità attesa, utilizzando come campione calibratore ciascun campione nell’intervallo 101-108 geq
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG-
N=3, Media: 1.1e9; Mediana: 1.4e9
CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG+
N=24, Media: 4.3e6; Mediana: 8.7e4
CAMPIONI PCR+, IgM-, IgG+
N=11, Media: 3.7e5; Mediana: 3.2e4
Determinazione quantitativa del carico virale in campioni di siero
Ricerca di Parvovirus B19
Analisi mediante real-time PCR calibrata su campioni di siero ottenuti da pazienti con documentata infezione persistente da Parvovirus B19, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml
Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata:
Nei pazienti seguiti il carico virale è risultato compreso fra 102 – 106 geq/ml per periodi estesi di tempo
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
1.0E+00
1.0E+01
1.0E+02
1.0E+03
1.0E+04
1.0E+05
1.0E+06
1.0E+07
Days
Vir
us IU
/ml
Patient 1 Patient 2 Patient 3
100 200 300 400 500 600
Ricerca di Parvovirus B19
1.0E+00
1.0E+01
1.0E+02
1.0E+03
1.0E+04
1.0E+05
1.0E+06
1.0E+07
1.0E+08
1.0E+09
1.0E+10
1.0E+11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Pools
Vir
us g
eq
/ml
Analisi mediante real-time PCR calibrata su 16 pool di plasma destinati alla produzione di emoderivati, costituiti ciascuno da 960 singole donazioni, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml
Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata:
In quattro campioni il carico virale è risultato superiore al valore soglia predefinito di 104 geq/ml
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
I pool contaminati da Parvovirus B19 ad un valore superiore a 104 geq/ml sono risultati infettanti in esperimenti di infezione in vitro di cellule KU812Ep6, come dimostrato mediante ibridazione in situ, PCR e RT-PCR per la ricerca di acidi nucleici virali
Pool # geq/ml IgG (IU/ml) ISH PCR RT-PCR
1 1.81 x 1010 15.21 Pos Pos Pos 2 1.36 x 1006 29.55 Pos Pos Pos 3 2.29 x 1002 23.18 Neg Neg Neg 4 7.68 x 1000 36.77 Neg Neg Neg 5 5.17 x 1002 9.65 Neg Neg Neg 6 2.24 x 1003 19.20 Neg Neg Neg 7 1.99 x 1002 21.56 Neg Neg Neg 8 3.39 x 1002 35.47 Neg Neg Neg 9 5.02 x 1000 84.45 Neg Neg Neg
10 1.15 x 1003 23.98 Neg Neg Neg 11 6.08 x 1002 20.55 Neg Neg Neg 12 3.10 x 1002 46.27 Neg Neg Neg 13 2.88 x 1008 27.10 Pos Pos Pos 14 1.27 x 1002 27.37 Neg Neg Neg 15 1.57 x 1004 19.76 Neg Neg Neg 16 1.21 x 1002 11.71 Neg Neg Neg
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Sviluppo di una tecnica di PCR real-time competitiva: Amplificazione in unica reazione del bersaglio virale e di un bersaglio
competitore
Rivelazione dei prodotti di PCR mediante coppie di sonde con emissione di segnali FRET e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point
Quantificazione assoluta mediante curve di calibrazione esterne
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
ITR IR ITR
NSVP
Competitore
Coppie di sonde oligonucleotidiche e emissione di distinti segnali FRET
Virus
Comp
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Ricerca di Parvovirus B19
Amplificazione del bersaglio virale e del bersaglio competitore
Reazione di amplificazione
Efficienza della reazione: EVirus = EComp = 1.98
Errore standard: 0.06; R2: 1.00;
Effetto competitivo
Amplificazione inibita in presenza di 1 Log in eccesso del bersaglio competitore
Ad equimolarità, CpVirus-Comp = -0.68 – +0.90
Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19:
L’utilizzo di un bersaglio di riferimento come controllo analitico consente un monitoraggio sia delle fasi pre-analitiche che analitiche
La quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto e la normalizzazione rispetto ad un bersaglio di riferimento eterologo consentono di minimizzare gli errori nella valutazione quantitativa
La quantificazione assoluta mediante real-time competitiva risente in maniera sensibile degli effetti di interferenza reciproca, ma può consentire uno screening rispetto ad un valore soglia prefissato
Conclusioni (1)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19:
La determinazione quantitativa del carico virale in campioni di sangue periferico consente di caratterizzare con maggior precisione il processo infettivo e di seguirne lo sviluppo nel tempo
In prospettiva, la valutazione quantitativa dell’espressione virale in campioni tissutali può consentire di definire il ruolo patogenetico del virus in numerose situazioni di rilevanza clinica
La diffusione del virus nella popolazione e la sua presenza nel sangue per periodi di tempo anche prolungati portano ad un rischio di trasmissione del sangue per via ematica: la valutazione quantitativa permette di discriminare i campioni di plasma con carico virale contaminante superiore al valore soglia di sicurezza
Conclusioni (2)
Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19
• Famiglia Papillomaviridae
• Genere Papillomavirus> 100 distinti genotipi
• DNA bicatenario 8000 nucleotidi
• Struttura icosaedrica
• Privo di pericapside
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Caratteristiche molecolari dei Papillomavirus
Infezione da Papillomavirus
Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2
Inibizione trascrizione di E6/E7
Replicazione DNAFattori cellulari
Particelle virali complete
Differenziamento cellulare
Infezione da Papillomavirus
Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
TRASFORMAZIONE IMMORTALIZZAZIONE
Blocco inibizione di E6/E7
LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2
Integrazione
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR: Rivelazione del DNA di un ampio spettro di genotipi mediante reazioni di
amplificazione che utilizzano coppie di primer di consenso
Tipizzazione del genotipo virale mediante sonde oligonucleotidiche specifiche per i diversi genotipi
Valutazione della persistenza dell’infezione da genotipi di HPV ad alto rischio oncogeno
Determinazione della carica virale e dello stato fisico che assumono rilevanza:
In caso di persistenza dell’infezione per valutare il rischio oncogeno
Nel follow up di pazienti conizzate per CIN di alto grado per identificare i casi di infezione persistente dopo il trattamento
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: Metodi quantitativi che utilizzano pool di primer in grado di definire la
carica virale di un ampio spettro di genotipi, in relazione al numero di cellule presenti nel campione, e che consentono la successiva genotipizzazione virale
PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA
Metodi quantitativi genotipo-specifici per la valutazione della carica virale di HPV16 e HPV18
PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 e HPV18
Metodi quantitativi genotipo-specifici per la definizione dello stato fisico di HPV16 e HPV18
PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 e HPV18
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
PCR Real Time di consenso: Amplificazione con pool di primer (MGP5Bio/MGP6) e marcatura dell’amplificato con Biotina
Genoma HPV MGP5 Bio
MGP6
E6 E7 E1
E2
E4 E5 L2
L1
150 bpBIO
La quantificazione avviene mediante interpolazione su curve di calibrazione esterna, sia per il bersaglio virale (HPV) sia per il bersaglio cellulare (GAPDH) utilizzato per la normalizzazione
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
Genotipizzazione in ELISA: Cattura dell’amplificato su pozzetti streptavidinati e tipizzazione mediante l’utilizzo di sonde specifiche per HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58
amplificatoBIO
streptavidina
PODAb anti-DIG
POD
sonda DIGgenotipo specifica
ABTS
5206 11 16 18 31 33 35 45 58 sonde HPV
A
B
CAm
pli
fica
ti
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
HPV16 pap-colpo margini cono HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo22,520.20 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 1,459.50 LSIL/NTZ 350.1 LSIL/NTZ Neg NEG/NTZ
720.2 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 110.1 NEG/NTZ 87.23 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ
520.2 LSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 160.6 NEG/NTZ 103.12 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ
17.8 HSIL/ANTZ2 FM CIN3 7.7 HSIL/ANTZ2 2.6 NEG/ANTZ1 1.8 NEG/ANTZ1 4.2 NEG/ANTZ1
36.5 HSIL/ANTZ2 IM IA1 10 HSIL/ANTZ2 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1
28.6 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 4.5 LSIL/NTZ 1.8 LSIL/NTZ 2.6 ASCUS/NTZ
26.4 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 9.3 HSIL/NTZ 3.3 NEG/NTZ
15.9 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.3 HSIL/NTZ 0.2 HSIL/NTZ 1.3 HSIL/NTZ 3.4 HSIL/NTZ
6.8 HSIL/ANTZ2 IM IA1 3.9 HSIL/ANTZ2 2 HSIL/ANTZ2 2.3 Ca./ANTZ2
6.8 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.2 HSIL/ANTZ2 0.2 HSIL/ANTZ2
6.7 HSIL/ANTZ2 IM IA1 0.3 LSIL/NTZ 0.6 LSIL/NTZ 0.3 LSIL/NTZ 3.2 LSIL/NTZ
4.1 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.8 HSIL/NTZ 0.4 NEG/NTZ 1.2 NEG/NTZ
1.3 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.4 LSIL/ANTZ2 1.6 HSIL/ANTZ2
4° Follow upCONO 1° Follow up 2° Follow up 3° Follow up
2° trattamento di conizzazione
Le pazienti che hanno un’alta carica virale iniziale e mostrano un decremento della carica virale dopo il trattamento risolvono spontaneamente l’infezione
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
HPV16 pap-colpo margini cono HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo22,520.20 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 1,459.50 LSIL/NTZ 350.1 LSIL/NTZ Neg NEG/NTZ
720.2 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 110.1 NEG/NTZ 87.23 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ
520.2 LSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 160.6 NEG/NTZ 103.12 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ
17.8 HSIL/ANTZ2 FM CIN3 7.7 HSIL/ANTZ2 2.6 NEG/ANTZ1 1.8 NEG/ANTZ1 4.2 NEG/ANTZ1
36.5 HSIL/ANTZ2 IM IA1 10 HSIL/ANTZ2 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1
28.6 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 4.5 LSIL/NTZ 1.8 LSIL/NTZ 2.6 ASCUS/NTZ
26.4 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 9.3 HSIL/NTZ 3.3 NEG/NTZ
15.9 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.3 HSIL/NTZ 0.2 HSIL/NTZ 1.3 HSIL/NTZ 3.4 HSIL/NTZ
6.8 HSIL/ANTZ2 IM IA1 3.9 HSIL/ANTZ2 2 HSIL/ANTZ2 2.3 Ca./ANTZ2
6.8 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.2 HSIL/ANTZ2 0.2 HSIL/ANTZ2
6.7 HSIL/ANTZ2 IM IA1 0.3 LSIL/NTZ 0.6 LSIL/NTZ 0.3 LSIL/NTZ 3.2 LSIL/NTZ
4.1 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.8 HSIL/NTZ 0.4 NEG/NTZ 1.2 NEG/NTZ
1.3 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.4 LSIL/ANTZ2 1.6 HSIL/ANTZ2
4° Follow upCONO 1° Follow up 2° Follow up 3° Follow up
2° trattamento di conizzazione
Le pazienti che hanno una bassa carica virale iniziale e mostrano una carica virale costante dopo il trattamento non risolvono spontaneamente l’infezione e mostrano una persistenza/recidiva della lesione
Ricerca di Papillomavirus
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:
PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
CARICA VIRALE HPV 16 STATO FISICO HPV 16
La carica virale e lo stato fisico di HPV 16 sono importanti parametri per la valutazione del rischio oncogeno in pazienti con infezione persistente
Nelle infezioni persistenti il DNA virale può integrarsi nel genoma umano, con interruzione dei geni E2/E1e conservazione dei geni E6/E7
DNA di HPV 16 episomiale: E2/E6 = 1
DNA di HPV 16 misto: 1< E2/E6 < 0
DNA di HPV 16 integrato: E2/E6 = 0
Costruzione delle curve standard per E6 e per GAPDH
La quantificazione del bersaglio virale E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare della rispettiva curva standard, normalizzata sul valore corrispondente per GAPDH
Ricerca di Papillomavirus
Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus
CARICA VIRALE: espressa come numero di copie di E6 per 100.000 copie di GAPDH
CURVA STANDARD E6 CURVA STANDARD GAPDH
Costruzione delle curve standard per E2 e per E6
La determinazione del rapporto E2/E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare delle rispettiva curve standard
Ricerca di Papillomavirus
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STATO FISICO: espressa come rapporto di numero di copie E2/E6
CURVA STANDARD E2 CURVA STANDARD E6
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E6 HPV 16 plasmid
Full length HPV 16 plasmid
E2
gen
e co
pie
s
E6
gen
e co
pie
s
Due cloni plasmidici sono stati utilizzati per valutare sperimentalmente i diversi valori del rapporto E2/E6, nell’intervallo relativo a 102 - 106 copie di E6
La PCR real-time può distinguere lo stato misto dallo stato episomiale quando più del 20% del DNA virale è allo stato integrato
È possibile costruire una retta di regressione lineare per distinguere lo stato episomiale dallo stato misto in funzione del numero di copie di E6
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0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07
E6 copies
E2/
E6
STATO EPISOMIALE
STATO MISTO
Risultati dell’analisi per carica virale e stato fisico in 68 campioni citologici positivi per HPV 16 DNA – distribuzione dei valori quantitativi attorno alla retta di regressione dei valori di cut-off
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1.00E+01
1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
1.00E+01
1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
1.00E+06
1.00E+07
1.00E+08
Stato fisico e carica virale Lesione e carica virale
EPISOMALE MISTO INTEGRATO
29.4% 54.4% 16.2%
LSIL HSIL IA1
22.0% 69.2% 8.8%
Una elevata carica virale aumenta la probabilità di integrazione di HPV 16 nel genoma umano e rappresenta un fattore di rischio per la progressione a carcinoma invasivo
Le cellule con DNA virale integrato acquistano un vantaggio di crescita sulle altre cellule infettate, si ha una selezione dei cloni cellulari con DNA integrato, un abbassamento della carica virale e una progressione della lesione
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Lesione e stato fisico
80.0%
20.0%
17.0%
72.3%
10.7%
100.0%
EPISOMAL CONCOMITANT INTEGRATED
La percentuale di DNA virale totalmente episomiale diminuisce con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL)
La percentuale di DNA allo stato misto aumenta con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL)
DNA virale totalmente integrato è presente solo in lesioni di alto grado (HSIL) e nei carcinomi invasivi
Conclusioni (3)
Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: L’andamento della clearance virale nel corso del follow up è indicativo
della risoluzione o persistenza dell’infezione e quindi della possibile persistenza o recidiva della lesione
Il decremento della carica virale conduce a risoluzione dell’infezione
Il mantenimento della carica virale indica una persistenza dell’infezione
La carica virale e lo stato fisico del DNA di HPVassumono rilevanza: Un’alta carica virale è associata allo stato episomiale di HPV16
Una bassa carica virale è associata allo stato integrato di HPV16
La quantificazione del DNA di HPV nello stato episomiale vs. integrato può assumere rilevanza nella valutazione del rischio oncogeno
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Università di BolognaUniversità di BolognaDipartimento di Medicina Clinica Specialistica e SperimentaleDipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale
Sezione di MicrobiologiaSezione di Microbiologia
Monica MusianiMonica Musiani
Marialuisa ZerbiniMarialuisa Zerbini
Giorgio GallinellaGiorgio Gallinella
Giovanna GentilomiGiovanna Gentilomi
Elisabetta ManaresiElisabetta Manaresi
Francesca BonviciniFrancesca Bonvicini
Stefania DelbarbaStefania Delbarba
Claudia FilipponeClaudia Filippone
Simona VenturoliSimona Venturoli
Simone AmbrettiSimone Ambretti
Monica CriccaMonica Cricca