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UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU
CURSO DE MESTRADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA
APARECIDA GABRIELA BEXIGA VELOSO
EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO NO PÂNCREAS DE
CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT OVARIECTOMIZADAS
São Paulo
2017
APARECIDA GABRIELA BEXIGA VELOSO
EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO NO PÂNCREAS DE
CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT OVARIECTOMIZADAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Educação Física da
Universidade São Judas Tadeu para a
obtenção do título de Mestrado em Educação
Física.
Área de Concentração: Escola, Esporte,
Atividade Física e Saúde.
Linha de Pesquisa: Atividade Física e
Disfunções Orgânicas
Orientadora: Profª. Drª Laura Beatriz Mesiano
Maifrino.
São Paulo
2017
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca
da Universidade São Judas Tadeu Bibliotecária: Cláudia Silva Salviano Moreira - CRB 8/9237
Veloso, Aparecida Gabriela Bexiga V443e Efeitos do treinamento físico no pâncreas de camundongos fêmeas
LDL knockout ovariectomizadas / Aparecida Gabriela Bexiga Veloso. - São Paulo, 2017.
99 f. : il. ; 30 cm.
Orientadora: Laura Beatriz Mesiano Maifrino. Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São Paulo,
2017.
1. dislipidemia. 2. pancreas. 3. exercicio físico. 4. menopausa. I. Maifrino, Laura Beatriz Mesiano. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Educação Física. III. Título
CDD 22 – 796
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu esposo, MARCELO, por estar ao meu lado em todos os
momentos de minha vida, e aos meus filhos LUCAS e ARTHUR, amor incondicional.
AGRADECIMENTO
Primeiramente meu agradecimento à DEUS, que permitiu que tudo isso acontecesse,
colocando pessoas tão especiais, ao meu lado, sem as quais certamente não teria dado
conta!
Ao meu esposo, MARCELO, meu infinito agradecimento. Sempre ao meu lado,
compreendendo minhas constantes ausências. Devido ao seu companheirismo,
amizade, paciência, apoio, alegria e amor, este trabalho pôde ser concretizado.
Obrigada por ter feito do meu sonho o nosso sonho!
Aos meus filhos LUCAS e ARTHUR, que iluminam minha vida e me dão motivos para
continuar sempre buscando dar o melhor de mim.
Ao meu PAI, “in memoriam”, que sempre me apoiou aos estudos, e infelizmente não
pode compartilhar este momento tão importante.
A minha mãe LUIZA, por muitas vezes, olhou meus filhos, para que eu pudesse ir ao
mestrado a minha tia LUCY e ao meu irmão PEDRO, qυе direta оυ indiretamente
fizeram parte dа minha formação, о mеυ muito obrigado.
A minha irmã JHENIFFER e seu esposo BISCOITO, pelo carinho, pela amizade e apoio
incondicional.
Meus agradecimentos, TATIANA, MARLI, SUELI, aos amigos CEGAF, companheiros
de trabalhos e irmãos na amizade que fizeram parte da minha formação e que vão
continuar presentes em minha vida com certeza.
Agradeço os amigos, colegas, professores e funcionários da USJT, que sempre me
apoiaram
Obrigada a todos os meus familiares, por serem privados em muitos momentos da
minha companhia e atenção, e pelo profundo apoio.
A esta universidade, seu corpo docente, direção e administração, que me deram a
oportunidade de poder abrir a janela onde hoje vislumbro um horizonte superior.
Minha gratidão especial, ao Prof. Drº. LUÍS ANTÔNIO BAFFILE LEONI, um querido e
grande amigo, por ser uma inspiração profissional e de vida. Obrigada, por ter
acreditado e depositado sua confiança em mim, ainda na graduação (2002-2006), e me
dado a oportunidade de conhecer pessoas que tive o prazer de compartilhar seus
saberes e amizade.
Sou imensamente grata, à Profª. Drª. LAURA BEATRIZ MESIANO MAIFRINO, minha
orientadora, e sobretudo, uma grande amiga. Obrigada pela pessoa e profissional que
é. Sempre presente me dando todo o suporte, transmitindo incansáveis ensinamentos e
me ajudando a concluir este trabalho. E agradeço em especial, pelo acolhimento, nos
momentos mais difíceis da minha vida, no decorrer deste curso.
As minhas amigas NATÁLIA, pelo suporte dado, que compartilhou importantes
conhecimentos comigo, e a minha companheira desde à graduação BETH, que não
poupou esforços para me ajudar.
Quero agradecer também aos professores Drº. CLEVER GOMES CARDOSO e Drª.
ELIANE FLORENCIO GAMA, membros da banca de qualificação, pelos conselhos,
sugestões e interesse em contribuir para o desenvolvimento deste projeto.
Ninguém vence sozinho... OBRIGADA A TODOS!
Tudo aquilo que o homem ignora, não existe para ele. Por isso o universo de cada um, se
resume no tamanho de seu saber. Albert Einstein
BEXIGA AGV. Efeitos do treinamento físico no pâncreas de camundongos fêmeas LDL
knockout ovariectomizadas. [Dissertação]. Curso de Mestrado da Universidade São
Judas Tadeu. São Paulo, 2017.
Mulheres menopausadas, sedentárias e com maus hábitos alimentares, podem
apresentar aumento de peso e maior porcentagem de lipídios na corrente sanguínea,
resultando no acúmulo destes lipídios em tecidos periféricos, como fígado, músculo
esquelético e pâncreas. Nesta situação, o pâncreas aumenta a sua atividade,
aumentando a secreção e biossíntese da insulina, como uma tentativa de regularizar o
metabolismo. Ainda não está bem claro, a influência do treinamento físico no pâncreas
de animais dislipidêmicos associados à ovariectomia. O objetivo do presente trabalho
foi analisar os efeitos do treinamento físico sobre o pâncreas de camundongos fêmeas
LDL Knockout ovariectomizadas submetidas a treinamentos físicos aeróbios. Foram
utilizados 30 camundongos fêmeas com 9 meses de idade, sendo15 camundongos
fêmeas selvagens C57BL/6 e 15 camundongos ovariectomizados, knockout do receptor
de lipoproteína de baixa densidade, distribuídos em grupos: controle Sedentário (CS),
controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT),
LDL sedentários (LDL-S), LDL ovariectomizado sedentário (LDL-OS) e LDL
ovariectomizado treinado (LDL-OT). Os animais exercitados realizaram um programa de
treinamento físico aeróbio moderado, uma hora por dia, 5 dias por semana, durante 4
semanas. Ao final do treinamento os animais foram decapitados, retirado o pâncreas e
o tecido adiposo visceral. As amostras foram pesadas e fixadas em formol 10% por
24hs e submetidas ao processamento histológico, sendo coradas com hematoxilina e
eosina e imunomarcadas por marcadores de insulina e glucagon. Foram realizadas
análises morfoquantitativa e estereológica através de imagens capturadas pelo
programa (AxioVision- Zeiss). Foram analisadas as densidades de volume das células
imunomarcadas alfa e beta, os diâmetros maior e menor (µm) e a área das ilhotas
pancreáticas (µm²). Os dados obtidos foram tabulados e comparados através de análise
estatística Anova (two way) e nível de significância p<0,05. Os resultados obtidos
mostraram que: a ovariectomia induziu ao aumento das massas corporal e do tecido
adiposo visceral, e que o treinamento promoveu diminuição nestes parâmetros; o grupo
dislipidêmico treinado (LDL OT) apresentou aumento significante no teste de esforço
físico; a ovariectomia acentuou de forma significante os valores das concentrações do
Triglicérides, VLDL e Colesterol total, e o treinamento apresentou uma tendência a
reversão deste processo; a ovariectomia promoveu uma tendência ao aumento da área
e diâmetro médio das ilhotas pancreáticas, da densidade de volume e apresentou um
maior número de ilhotas grandes; a dislipidemia, promoveu diminuição significante na
densidade de volume dos vasos das ilhotas, porém o treinamento, teve uma tendência
ao aumento, mas não significante; e a ovariectomia gerou uma tendência ao aumento
na imunomarcação das células-beta e uma diminuição significativa nas células-alfa
pancreáticas e que o treinamento reverteu este processo, levando os valores próximos
ao controle. Concluímos que o treinamento físico minimiza os efeitos da dislipidemia
associada a ovariectomia no tecido pancreático de animais LDL Knockout.
Palavras - chave: dislipidemia, pâncreas, treinamento físico, menopausa.
BEXIGA AGV. Effects of physical exercise on the pancreas of female ovariectomized
knockout LDL mice. [Dissertation]. Master's course at São Judas Tadeu University. São
Paulo, 2017
Menopausal women, associated with sedentary lifestyle and poor eating habits, lead to
weight gain and a higher percentage of lipids in the bloodstream, inducing the
accumulation of these lipids in peripheral tissues such as liver, skeletal muscle and
pancreatic cells. At the same time, the pancreas works by increasing the secretion and
biosynthesis of insulin, as an attempt to regulate the metabolism, leading the pancreas
to exhaustion, resulting in the abnormal reduction of beta cells by apoptosis, thereby
progressing to type 2 diabetes. Articles point out that physically active individuals enjoy
a better quality of life and lower mortality rate, resulting in greater longevity. However,
the literature consulted did not show any work evidencing the influence of dyslipidemia
associated with ovariectomy in the pancreas of LDL knockout mice. The objective of the
present work was to analyze the effects of physical exercise on the pancreas of
ovariectomized female knockout LDL mice submitted to aerobic physical exercises.
Thirty female mice at 9 months of age and initial weight ranging from 20 to 30 grams
were used, 15 female mice LDL knockout and 15 wild-type C57BL / 6 female mice was
divided in groups: Sedentary LDL (LDL-S), sedentary ovariectomized LDL (LDL-OS) and
trained ovariectomized LDL (LDL-OT). For the control group, 15 wild female mice were
used. Sedentary Control (CS), sedentary ovariectomized control (COS) and trained
ovariectomized control (TOC). The animals exercised underwent an aerobic physical
training program, with load, one hour per day, 5 days per week, for 4 weeks. At the end
of the training the animals were decapitated, removing the pancreas and visceral
adipose tissue. The samples were weighed and fixed in 10% formaldehyde for 24 h and
submitted to histological processing, stained with hematoxylin and eosin and
immunolabelled by insulin and glucagon markers. Morpho-quantitative and stereological
analyzes were performed through images captured by the program (AxioVision-Zeiss).
Volume densities of the alpha and beta immunolabellated cells, the major and minor
diameters (μm) and the area of the pancreatic islets (μm 2) were analyzed. Data were
tabulated and compared by anova (two way) and significance level (p <0.05). The
results showed: tendency, accentuated by ovariectomy, to increase body mass and
visceral adipose tissue, and that training promotes a decrease in these parameters; the
trained dyslipidemic group (LDL OT), presented a significant increase in physical
exercise test; ovariectomy significantly increased the values of the Triglyceride, VLDL
and total cholesterol analyzes, and that exercise showed a tendency to reverse this
process; ovariectomy promoted a tendency to increase the area and mean diameter of
the pancreatic islets and the volume density of the same, triggered a larger number of
large islets; dyslipidemia, promoted a significant decrease in the volume density of the
pancreatic islets vessels, but the exercise had a tendency to increase, but not
significant; and ovariectomy promoted a tendency to increase in pancreatic beta-cell
immunostaining, and a significant decrease in pancreatic alpha-cells, and that training
reversed this process, bringing values closer to control. We conclude that physical
exercise minimizes the effects of dyslipidemia associated with ovariectomy in the
pancreatic tissue of LDL Knockout animals.
Keywords: dyslipidemia; pancreas, physical exercise, menopause.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fases do ciclo reprodutivo feminino .............................................................. 23
Figura 2- Localização do pâncreas, mostrando seus ductos, células acinares e ilhotas
pancreáticas. .................................................................................................................. 26
Figura 3- Fotomicrografias do pâncreas mostrando em A: Ilhota pancreática e vaso,
(400x) grupo COS. HE e B: Tecido pancreático mostrando em menor aumento (100x) os
ácinos , ductos e ilhota pancreática. Grupo LDL S HE ................................................... 27
Figura 4- Histologia do pâncreas exo-endócrino. Tipos de células pancreáticas. ......... 29
Figura 5 – Vias de ativação intracelular desencadeadas pela insulina.1- Ligação da
insulina ao receptor na membrana; 2- cascata molecular ativada, para a abertura da
proteína de transporte de glicose (glut4); 3- abertura da proteína glut4, permite a
entrada da glicose na célula;4- após a entrada, ocorre o armazenamento em forma de
glicogênio a glicose; 5- no fígado e no músculo esquelético; 6- ou a transformação e
deposição no tecido adiposo em forma de ácido graxo. ................................................ 31
Figura 6 – Camundongos LDL Knockout e C57BL/6 (Selvagens), no Biotério na USJT.
....................................................................................................................................... 36
Figura 7 – Delineamento do estudo, modelo dos grupos LDL Knockout e Controle. .... 37
Figura 8- Adaptação e Treinamento: A: esteira ergométrica para camundongos. B:
camundongos em treinamento ....................................................................................... 40
Figura 9-Fotomicrografia da mesma ilhota pancreática imunomarcadas em A células α
(glucagon) e B: células β (insulina) (grupo COT) IHQ (200X). ....................................... 43
Figura 10- Fotomicrografia do pâncreas aplicado o Software Image J. Grid com 200
pontos.(1) Ilhotas pancreáticas; (2) Ácinos pancreáticos; (3) Vasos. Grupo COS H&E,
400X. .............................................................................................................................. 44
Figura 11- Fotomicrografia, da ilhota pancreática, medindo sua área em µm2.Grupo LDL
S. H&E.(400X) ................................................................................................................ 45
Figura 12- Fotomicrografia, da ilhota pancreática identificando o diâmetro maior e do
diâmetro menor. Grupo COS.H&E. (400X), barra 2µm.. ................................................ 46
Figura 13- Fotomicrografia da ilhota pancreática. Imunomarcada para células α (1), na
periferia da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada. (Grupo
COS). IHQ 200X. ........................................................................................................... 47
Figura 14- Fotomicrografia da ilhota pancreática. Observar as células β imunomarcadas
(1), no centro da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada.
(Grupo COS). IHQ 200X................................................................................................ 47
Figura 15- Diferença entre a massa corporal inicial e final em gramas dos grupos. ..... 50
Figura 16- Delta percentual do Tecido Adiposo Visceral (%). ........................................ 51
Figura 17- Delta percentual da Massa do tecido do Pâncreas (%). ............................... 51
Figura 18- Diferença entre o Teste de Esforço Máximo Final (TF) e Inicial (TI), em Km/h,
nos grupos estudados. ................................................................................................... 53
Figura 19- Análise bioquímica da glicose nos grupos experimentais. ........................... 54
Figura 20- Parâmetro bioquímico Triglicérides (TG), nos grupos experimentais. .......... 55
Figura 21- Parâmetros bioquímico VLDL, nos grupos experimentais. .......................... 56
Figura 22- Parâmetro bioquímico Colesterol Total (CT), dos grupos experimentais. ..... 56
Figura 23- Área da ilhota pancreática nos grupos estudados. ..................................... 58
Figura 24- Diâmetro médio das ilhotas pancreáticas nos grupos estudados. ............... 58
Figura 25- Histograma de distribuição de frequência do tamanho das ilhotas
pancreáticas quanto sua área, nos grupos estudados. .................................................. 60
Figura 26- Fotomicrografias do tecido pancreático, ilhotas (seta branca), ácinos (seta
preta) e vasos (seta verde), dos grupos estudados. H&E, 400X. Barra 2µm ................ 61
Figura 27- Densidade de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), nos grupos
estudados. ...................................................................................................................... 62
Figura 28- Densidade de volume dos ácinos pancreáticos (Vv[ac]), nos grupos
estudados ....................................................................................................................... 63
Figura 29- Densidade de volume dos vasos pancreáticos (Vv [vasos]), nos grupos
estudados. ...................................................................................................................... 64
Figura 30- Densidade de volume das células- β (beta), das ilhotas pancreáticas, nos
grupos estudados. .......................................................................................................... 65
Figura 31- Densidade de volume das células α- pancreáticas, nos grupos estudados. 67
Figura 32- Fotomicrografias das ilhotas pancreáticas com as técnicas em H&E e
Imunohistoquímica com células alfa e beta imunocoradas, das ilhotas
pancreáticas.200X, barra 5µm. ...................................................................................... 68
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Variáveis Biométricas, Massa corpora; tecido adiposo e do pâncreas. .......... 49
Tabela 2- Resultado do Teste de Esforço Inicial (TI), Teste de Esforço Final (TF), e a
diferença entre o teste de esforço máximo final e inicial (TF – TI), nos grupos
estudados. ...................................................................................................................... 53
Tabela 3- Variáveis Bioquímicas, dos grupos experimentais. ......................................... 54
Tabela 4- Área (µm2) e diâmetro médio (µm) das ilhotas pancreáticas nos grupos
estudados. ...................................................................................................................... 57
Tabela 5- Valores representam a porcentagem das Ilhotas pancreáticas (IP) distribuídas
em tamanhos. ................................................................................................................. 60
Tabela 6- Densidades de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), ácinos (Vv[ac]) e
vasos (Vv[vas]) (%) dos animais nos grupos estudados. ............................................... 62
Tabela 7- Densidade de volume das células beta (β) e outras células: Alfa ( ), Delta (δ),
Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos grupos
estudados. ...................................................................................................................... 65
Tabela 8- Densidade de volume das células Alfa ( ) e outras células: beta (β), Delta (δ),
Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos grupos
estudados. ...................................................................................................................... 66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGL Ácidos Graxos Livres
COS Controle Ovariectomizado Sedentário
COT Controle Ovariectomizado Treinado
CS Controle Sedentário
CT Colesterol Total
E
EPM
Grelina
Erro Padrão da Média
H&E Hematoxilina e Eosina
HDL Hight Density Lipoprotein
HE Hematoxilina e Eosina
IGT Intolerância à glicose
IHQ Imunohistoquímica
IL Ilhotas Langerhans
IP Ilhotas pancreáticas
LDL Low Density Lipoprotein
LDL-c Low Density Lipoprotein- cholesterol
LDL-OS LDL-knokout Ovariectomizado Sedentário
LDL-OT LDL-knokout Ovariectomizado Treinado
LDL-S
M
LDL-knokout Sedentário
Média
PA Pressão Arterial
PP Polipeptídeo pancreático
TA Temperatura Ambiental
TG Triglicérides
µm Micrômetro
µm2 Micrômetro ao quadrado
VLDL Very Low Density Lipoprotein
Vv[acino] Densidade de volume dos ácinos na porção exócrina
Vv[cels.ip] Densidade de volume das células nas ilhotas pancreáticas
Vv[int.ip] Densidade de volume dos interstícios nas ilhotas pancreáticas
Vv[α] Densidade de volume das células alfa (imunomarcadas)
Vv[β] Densidade de volume das células beta (imunomarcadas)
β Beta
δ ou D Delta
α Alfa
Sumário
SUMÁRIO .......................................................................................................................................... 17
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 19
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................................... 23
2.1 MENOPAUSA E PERFIL LIPÍDICO ...................................................................................................................... 23
2.2 PÂNCREAS ................................................................................................................................................. 25
2.3 TREINAMENTO FÍSICO .................................................................................................................................. 30
3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................ 33
4 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 34
4.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................................ 34
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................... 34
5. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................ 36
5.1 ANIMAIS DO ESTUDO ................................................................................................................................... 36
5.1.1 Delineamento do estudo ............................................................................................................... 37
5.2 FORMAÇÃO DOS GRUPOS E SEQUÊNCIA EXPERIMENTAL ...................................................................................... 38
5.2.1 Ovariectomia .................................................................................................................................. 38
5.2.2 Colpocitologia ................................................................................................................................ 38
5.3 TREINAMENTO FÍSICO .................................................................................................................................. 40
5.3.1 Teste de Esforço Máximo ............................................................................................................... 40
5.3.2 Treinamento Físico ......................................................................................................................... 40
5.4 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E RETIRADA DO PÂNCREAS E DO TECIDO ADIPOSO ........................................................... 41
5.5. PREPARO DO MATERIAL ............................................................................................................................... 41
5.5.1 Preparo do material para a técnica H&E ........................................................................................ 41
5.5.2 Preparo do material para a técnica de imunohistoquímica ........................................................... 41
5.6. ANÁLISES ESTEREOLÓGICA E MORFOMÉTRICA .................................................................................................. 43
5.6.1 Análise Estereológica ..................................................................................................................... 44
5.6.2 Análise Morfométrica .................................................................................................................... 45
5.7. TÉCNICAS IMUNOHISTOQUÍMICA ................................................................................................................... 46
5.7.1 Análise estereológica ..................................................................................................................... 46
5.8. ANÁLISES BIOQUÍMICAS .............................................................................................................................. 48
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................................................... 48
6. RESULTADOS .............................................................................................................................. 49
6.1 AVALIAÇÃO DO PERFIL BIOMÉTRICO. ..................................................................................................... 49
6.1.1 Massa Corporal (g). ........................................................................................................................ 49
6.1.2 Massa Tecido Adiposo Visceral (TAV) (g). ....................................................................................... 50
6.1.3 Massa do Pâncreas (g). .................................................................................................................. 51
6.2 TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO (KM/H) ............................................................................................................. 52
6.3 AVALIAÇÃO DO PERFIL BIOQUIMICO ................................................................................................................ 54
6.3.1 Glicose ............................................................................................................................................ 54
6.3.2. Triglicérides (mg/dL) ..................................................................................................................... 55
6.3.3 VLDL (mg/dL).................................................................................................................................. 55
6.3.4 Colesterol Total .............................................................................................................................. 56
6.4 ANÁLISES MORFOMÉTRICA, ESTEREOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA. ................................................................... 57
6.4.1 ANÁLISE MORFOMÉTRICA .......................................................................................................................... 57
6.4.2 Análise estereológica ..................................................................................................................... 61
6.4.3 Imunohistoquímica ........................................................................................................................ 64
7. DISCUSSÃO ................................................................................................................................. 69
7.1. MASSA CORPORAL, DO TECIDO ADIPOSO VISCERAL E DO PÂNCREAS. .................................................................... 70
7.2 TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO ......................................................................................................................... 72
7.3 EXAMES LABORATORIAIS ............................................................................................................................... 72
8. CONCLUSÃO ............................................................................................................................... 77
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 79
19 1 INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
O Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2010), segundo coleta
do censo de 2010, aponta que 11% da população do país, ou seja 20,5 milhões de
indivíduos, possuem 60 anos ou mais. Esse número, em 2025, deve dobrar, colocando
nosso país em sexto lugar no mundo no que se refere a população idosa (OMS, 2015).
Assim sendo, políticas públicas de prevenção e tratamento tornam-se ferramentas
necessárias.
Com o envelhecimento, os sistemas e órgãos sofrem modificações no padrão
normal do organismo, conduzindo a alterações, principalmente nos sistemas locomotor,
endócrino e cardiovascular, acentuada no sedentarismo, prejudicando sobremaneira a
qualidade de vida, e determinando muitas vezes uma perda da sua auto-independência.
(NASRI, 2008; RIBEIRO et al., 2012; DE MEDEIROS et al., 2014).
Entre as alterações endócrinas-metabólicas, a menopausa, caracterizada pela
inatividade dos ovários e consequente privação do estrogênio, marca, por volta dos 45
a 55 anos, o início de uma nova etapa da vida da mulher, acompanhada por alterações
na composição corporal, diminuição de massa muscular, aumento de peso e massa de
tecido adiposo. A obesidade e consequente depósito de tecido adiposo visceral, leva ao
desenvolvimento de doenças crônicas, dentre elas, diabetes, síndrome metabólica,
dislipidemia (MARQUEZINE & MANCINI, 2006; JANSSEN et al., 2002), doença
cardiovascular e resistência à insulina. (DE KONING et al, 2007)
Na pós-menopausa, além da tendência ao ganho de massa corporal, as
mulheres também estão susceptíveis a apresentarem alterações no metabolismo
lipídico, devido à privação estrogênica, que eleva os níveis de colesterol total,
lipoproteínas e triglicerídeos, acarretando um perfil lipídico altamente favorável à
20 1 INTRODUÇÃO
aterogênese, principalmente quando associada à diabetes mellitus e hipertensão
(PASQUALI et al, 1997).
O esgotamento dos óvulos localizados no interior dos ovários, e
consequentemente privação dos hormônios ovarianos, eleva o Colesterol Total e o LDL-
c em aproximadamente 25%, podendo estar associado ao menor catabolismo das LDL
pela diminuição do número de receptores hepáticos B/E. Além disso, a menopausa
promove redução da atividade hepática da 7ª hidroxilase, diminuindo a síntese de
ácidos biliares e consequentemente, redução da excreção de colesterol. Com a
diminuição da síntese da bile, pode ocorrer elevação dos triglicérides e VLDL-colesterol,
decorrente da menor atividade da lipase lipoproteica, com menor produção de VLDL
remanescente. Essa situação leva a maior proporção das pequenas e densas LDL, que
são mais suscetíveis a sofrerem alterações oxidativas, sendo mais facilmente
reconhecidas e captadas pelos macrófagos, formando células espumosas, ponto inicial
da formação do processo aterosclerótico (STEVENSON et al., 1993; AUSTIN et
al.,1988; PAPALÉO et al., 2006).
Após a menopausa ocorre redução dos níveis de colesterol em até 25%,
representado principalmente pela subfração HDL (FALUDI & ALDRIGHI, 2003; GRAFF-
IVERSEN et al., 2008; STACHOWIAK et al., 2015). O HDL é a principal lipoproteína
dividida em subfrações HDL2-colesterol e a HDL3-colesterol, com a função de carregar
o colesterol para o fígado, resultando na diminuição do mesmo da corrente sanguínea.
É sabido que as subfrações, principalmente o HDL-3, quanto maior a sua concentração,
maior a proteção contra as doenças cardiovasculares, porém temos poucos estudos
nesta área, necessitando de mais pesquisas (KIM et al., 2014).
Trabalhos apontam que indivíduos fisicamente ativos desfrutam de uma melhor
qualidade de vida e menor taxa de mortalidade, (TRIBESS, 2016; AGUIAR et al., 2014;
ANTUNES et al., 2006, MATSUDO et al., 1992). Destarte, o treinamento físico regular
pode ser uma estratégia na prevenção e redução de diversas doenças senis como
dislipidemias, diabetes mellitus e pressão arterial, dentre outras (ROUSSEL et al., 2009;
MCLELLAN et al., 2007). Malin et al. (2013), observaram que o treinamento físico de 12
semanas em 35 adultos obesos com pré- diabetes, promoveu redução na gordura
21 1 INTRODUÇÃO
corporal total, melhorando a sensibilidade à insulina, com isso, refere aumento da
função das células- β, contribuindo para a preservação do pâncreas, e prevenção de
diversas doenças senis.
Fagherazzi et al. (2008) estudaram indivíduos em sobrepeso, onde analisaram
o impacto do treinamento associado a dieta, verificando que a prática regular de
exercícios e hábitos alimentares adequados, produzem efeitos benéficos sobre as
dislipidemias. No entanto, os valores de Colesterol total (CT), LDL-c, TG-c e HDL, não
foram significativos em todos os grupos.
Fernandes et al. (2008) estudaram indivíduos idosos do sexo feminino, com
hiperlipidemia e diabetes mellitus, e verificaram redução significativa nos níveis de LDL
colesterol, triglicérides e da glicemia, bem como da massa corporal, quando aplicado
um programa regular de treinamentos físicos.
Estudos realizados em mulheres na pré- menopausa que realizaram treinamento
de resistência por três dias na semana, durante 14 semanas, apontaram diminuição de
14% do LDL-C, tornando melhor a relação LDL-C / HDL-C (PRABHAKARAN et al.,
1999).
Mulheres menopausadas, associadas ao sedentarismo e maus hábitos
alimentares, levam ao aumento de peso e maior porcentagem de lipídios na corrente
sanguínea, induzindo o acúmulo destes lipídios em tecidos periféricos, como fígado,
músculo esquelético e células pancreáticas. Concomitante, o pâncreas trabalha mais
aumentando a secreção e biossíntese da insulina, como uma tentativa de regularizar o
metabolismo, levando o pâncreas a exaustão, resultando redução anormal das células
betas por apoptose, com isso, progredindo à Diabetes tipo 2 (SAVAGE et al., 2007).
Malin et al. (2013), estudando adultos pré-diabéticos pós treino, observaram
melhora na função das células-β pancreáticas. Em homens e mulheres de forma linear,
doses crescentes de treinamentos, parecem aumentar a perda de peso e a função das
células-β pancreáticas.
22 1 INTRODUÇÃO
Slentz et al. (2009), comparando três programas de treinamento: intensidade
baixa/moderada, baixa intensidade/ intensidade vigorosa e alta intensidade/ vigorosa,
verificou que o treinamento de intensidade moderada, foi o que apresentou melhor
resultado no índice de disposição (DI= sensibilidade à insulina x resposta insulínica
aguda à glicose - AIRg).
Solomon et al. (2013), analisando 105 adultos diabéticos tipo 2 ou tolerância à
glicose diminuída, após 12 a 16 semanas de treinamento aeróbio, observaram que 90%
destes, aumentaram a eliminação da glicose, mediada por insulina.
23 2 REVISÃO DE LITERATURA
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Menopausa e Perfil Lipídico
A menopausa é caracterizada pela interrupção fisiológica dos ciclos menstruais,
devido à privação dos hormônios ovarianos. Inicia-se por volta dos 45 a 55 anos,
promovendo diversas alterações físicas, fisiológicas e endócrinas.
A figura 1 mostra as fases do ciclo reprodutivo da mulher, onde a menarca é
caracterizada pela primeira menstruação, por volta dos 10-12 anos de idade. Deste
período até a menopausa temos o período fértil, onde os óvulos são liberados
mensalmente e a produção dos hormônios ovarianos (estrógeno e progesterona) está
em produção. A pré-menopausa é o período entre três a sete anos antes da
menopausa, sendo, a menopausa, caracterizada pela última menstruação, e a pós –
menopausa, denominada climatério. A perimenopausa engloba a pré- menopausa e o
primeiro ano da pós menopausa, fase onde a mulher passa por várias alterações
fisiológicas e endócrinas, como ondas de calor, insônia, irritabilidade e alterações do
perfil lipídico, associada ao ganho de peso e sedentarismo, favorecendo a dislipidemia,
podendo assim, progredir para a diabetes tipo 2. (PASQUALI, 1997).
Figura 1- Fases do ciclo reprodutivo feminino Fonte: mdsaude1
24 2 REVISÃO DE LITERATURA
Os hormônios estrogênios, responsáveis pela proteção de doenças
cardiovasculares na mulher, antes da menopausa, são derivados do colesterol,
destarte, com a diminuição da formação do estrogênio incide aumento do colesterol,
consequentemente ocorre um aumento das lipoproteínas de baixa densidade (LDL),
lipoproteína muito baixa de idade (VLDL), levando a um quadro de hipercolesterolemia,
que induz ao processo aterogênico. (CHAGAS et al, 2015)
A dislipidemia é um dos fatores que leva ao desequilíbrio do metabolismo da
glicose no sangue. Associada à hiperglicemia sanguínea, ocorre uma intolerância à
glicose (IGT), pois compromete a absorção da glicose para as células e o pâncreas, na
tentativa de compensar esta hiperglicemia, secreta abusivamente o hormônio insulina,
através das células β, levando a alterações morfológicas, como aumento das ilhotas
pancreáticas, prejudicando a função das células β. (WU et al., 2013; JIMÉNEZ-
MALDONADO et al., 2014; AMARAL et al., 2015).
Mulheres menopausadas apresentam maiores riscos de alterações no
metabolismo dos lipídeos e carboidratos levando ao aumento da intolerância à glicose,
menor sensibilidade periférica a ação da insulina e instalação de um perfil lipídico mais
aterogênico. (IBGE, 2010).
O desequilíbrio entre gordura, peso corporal, lipídeos e lipoproteínas pode levar
ao aumento das reservas de gordura, promovendo aumento dos fatores de risco como
obesidade abdominal, alterações do perfil lipídico, estados pró- inflamatórios, estresse
oxidativo e aterosclerose, culminando em uma série de doenças metabólicas
(BERTOLAMI, 2004; BEVILACQUA et al., 2007; REBUGLIO et al.; 2013).
Dados da OMS (2010), apontam que a dislipidemia favorece o aumento da
mortalidade de portadores de diabetes mellitus tipos 1 e 2 e existem evidências de que
o tratamento das mesmas, colabora para a prevenção e controle de doenças
vasculares nos indivíduos diabéticos (SALLIS, 2000; GRILLO & GORINI, 2007).
25 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.2 Pâncreas
O pâncreas, classificado como uma glândula mista (exo-endócrina), é um órgão
alongado, amarelado e recoberto por uma cápsula de tecido conjuntivo. Está situado
na parte superior do abdomen, posteriormente ao estômago, constituído de três partes
bem definidas: cabeça, corpo e cauda.
Na maioria dos roedores, o pâncreas inclui-se totalmente no tecido adiposo
mesentérico, de forma alongada estendendo-se entre o duodeno e o baço (HEBEL &
STROMBERG, 1976).
Na figura 2 observa-se a parte exócrina do pâncreas, relacionada ao sistema
digestivo, formada por uma glândula túbulo acinar composta, que diariamente produz
cerca de 1200 ml de líquido rico em bicarbonato e enzimas digestivas.
Aproximadamente 40 a 50 células acinares formam um ácino seroso, cuja luz contem 3
células centroacinares, que dão início ao sistema de ductos pancreáticos, formando
assim o pâncreas exócrino.
26 2 REVISÃO DE LITERATURA
Figura 2- Localização do pâncreas, mostrando seus ductos, células acinares e ilhotas pancreáticas.
Fonte: mdsaude2
Cada célula acinar tem forma de pirâmide truncada, cuja base, descansa sobre a
lâmina basal separando as células do tecido conectivo denso que rodeia o pâncreas. O
núcleo destas células é redondo e intensamente basófilo, apresenta dentre as
organelas citoplasmáticas, grande quantidade do complexo de Golgi e grânulos
secretórios, que recebem o nome de grânulos de zimogênio, responsável pela
produção de pró-enzimas digestivas do pâncreas. Estas enzimas, amilase pancreática;
quimotripsina; tripsina e carboxipeptidase permanecem nos ácinos pancreáticos, na
forma inativa, e só é ativada no intestino delgado.
A figura 3 mostra a porção endócrina do pâncreas, formada por ilhotas
pancreáticas (IP) ou ilhotas de Langerhans, espalhadas por toda a glândula, geralmente
próximas ao centro de um lóbulo. As IP são cercadas por vasos capilares, ductos e
ácinos e representam cerca de 1 a 2% do tecido pancreático (FALKMER,1995).
27 2 REVISÃO DE LITERATURA
Figura 3- Fotomicrografias do pâncreas mostrando em A: Ilhota pancreática e vaso, (400x) grupo COS. HE e B: Tecido pancreático mostrando em menor aumento (100x) os ácinos , ductos e ilhota pancreática. Grupo LDL S HE. Fonte: BEXIGA/2016
Histologicamente, a ilhota apresenta um formato arredondado ou ovalado,
envolta por uma delicada cápsula de tecido conjuntivo frouxo, rico em fibras reticulares
e seu parênquima é constituído por cordões das células endócrinas, entremeados por
uma rica rede de capilares sanguíneos do tipo fenestrado.
As ilhotas pancreáticas são constituídas por cinco tipos celulares, que se
dispõem em diferentes regiões da ilhota. As células são secretoras de diferentes
hormônios, envolvidos direta e indiretamente na homeostase glicêmica: células beta (β)
ou B secretam insulina; célula alfa (α) ou A, secretam glucagon; célula delta (δ) ou D,
responsáveis pela secreção de somatostatina, hormônio de ação parácrina, que regula
a liberação de insulina e glucagon; célula polipeptídio pancreático (PP), que parece
exercer uma função inibidora na secreção do pâncreas exócrino e células épsilon ou E,
produtoras de grelina, estando envolvida no controle do apetite, ingestão de alimentos e
provavelmente nos gastos energéticos (EKBLAD & SUNDLER, 2002; KANNO et al.,
2002; YOSHIHARA et al, 2002; ANDRALOJC et al., 2009).
28 2 REVISÃO DE LITERATURA
As células betas (β), responsáveis pela produção de insulina, de ação
hipoglicemiante, induz a captação de glicose da corrente sanguínea, pelos
tecidos/órgãos, para sua metabolização intracelular; são as mais abundantes. Sua
produção se inicia com a síntese de pré- proinsulina no retículo endoplasmático rugoso
(RER) das células beta, logo por segmentação enzimática da pré-proinsulina nas
cisternas do RER, esta se converte em pró- insulina. A pró-insulina, se agrupa em
vesículas de onde por auto excisão, elimina um segmento da molécula e produz a
insulina. A Insulina é liberada no espaço extracelular quando aumentam os níveis de
glicose, por ex., após uma comida rica em carboidratos.
As células alfa (α), responsáveis por sintetizar e secretar o hormônio
peptídeo glucagon, eleva os níveis de glicose no sangue. O glucagon, não tem efeito
sobre o músculo, age em adipócitos e no fígado. Promove a liberação de glicose do
fígado para o sangue, aumenta o catabolismo das gorduras e reduz os níveis de
aminoácidos (neoglicogênese). O glucagon é liberado, em situações de treinamento ou
de jejum (CANALI & KRUEL, 2001).
A citoarquitetura ou arranjo preferencial dos tipos celulares dentro da ilhota de
várias espécies, incluindo a humana, parece ser fundamental para o seu
funcionamento. A organização histológica e arranjos celulares das ilhotas modificam-se
ao longo do desenvolvimento animal, paralelamente à maturação funcional do pâncreas
endócrino, do seu funcionamento e de algumas patologias (CARVALHO et al., 2006).
Alterações na morfologia e citoarquitetura normal das ilhotas são observadas em
animais com quadro estabelecido de diabetes ou em modelos in vitro de disfunção
secretora de insulina (FU et al., 2013; HONG et al., 2002; TAK‐YING SHIU et al., 2003).
Com relação à disposição ou arranjo das células endócrinas na ilhota, em
roedores, as células- beta ocupam a região central, células alfa, delta e épsilon
localizam-se na periferia da ilhota. As células PP também estão, preferencialmente,
dispostas na periferia da ilhota (GOLDSMITH, et al., 1975; ORCI, 1976; NAKAMURA, et
al., 1980). Diferenciam-se morfologicamente pelas suas propriedades tintoriais, pelo
29 2 REVISÃO DE LITERATURA
aspecto ultra - estrutural de seus grânulos e pelo seu conteúdo hormonal (ORCI, 1984;
BONNER-WEIR, 1988; ANDRALOJC et al., 2009). Figura 4
Figura 4- Histologia do pâncreas exo-endócrino. Tipos de células pancreáticas.
Fonte: Fisiologia Médica- Guyton et al, 20123 (Modificado pela autora)
O padrão de organização histológica das IP pode estar alterado em casos de
disfunção pancreática, como na dislipidemia, ocasionando diabetes do tipo 2. Dentre as
alterações tem-se o desenvolvimento de aspecto irregular da periferia das IP,
caracterizado pelo aparecimento de projeções das células endócrinas no parênquima
exócrino adjacente e o surgimento de fibrose progressiva do tecido pancreático
endócrino (HONG, et al., 2002; JANSSEN, et al., 2003).
A anatomia fisiológica do pâncreas de humanos e de camundongos, apresentam
as células β na porção central da ilhota, enquanto as células α, δ e PP se localizam na
periferia (GOLDSMITH, et al., 1975; HAYEK & WOODSIDE, 1979; NAKAMURA, et al.,
1980).
3 Disponível em:< http://pt-br.aia1317.wikia.com/wiki/Introdu%C3%A7%C3%A3o_%C3%A0_ Fisiopatologia _do_
Diabetes_Mellitus file=Pancreas_2.jpg
30 2 REVISÃO DE LITERATURA
Estudos realizados em ratos obesos verificaram que as ilhotas pancreáticas
quando aumentadas, ou seja, em situação de hiperplasia, (>0,45 mm) induzem
aumento de secreção da insulina e em ilhotas pancreáticas com hipertrofia (<0,12mm),
apresentam maior secreção de glucagon, e menor de insulina (HAYEK &
WOODSIDE,1979).
Duarte et al. (2006) estudando dieta hiperlipídica em ratos Wistar machos,
administrada por 15 semanas, registraram uma diminuição no tamanho do pâncreas, e
um aumento nos números das células hipoglicemiantes betas.
Tomita & Doull, (1992), através de análises imunohistoquímicas com marcadores
para as células α, β e δ, em ratos induzidos ao Diabetes Mellitus, observaram aumento
significativo no número das células α, e uma hipertrofia das células β.
Estudos realizados por Kawano et al., (1992) diagnosticaram pela primeira vez, o
desenvolvimento morfológico de ratos OLEFT obesos, classificando as mudanças das
ilhotas pancreáticas em três fases: fase I (9 semanas) início das alterações envolvendo
uma leve inflamação; fase II (10 a 40 semanas), já com alterações morfológicas como
hiperplasia e fibroses, um aumento dos tamanhos da massa das ilhotas, e na fase III, a
fase final (mais de 40 semanas), com a diminuição das massas das ilhotas devido a
uma hipertrofia das ilhotas.
2.3 Treinamento Físico
Diversos trabalhos correlacionam o treinamento físico com as alterações dos
hormônios pancreáticos insulina, glucagon (HOWARTH et al, 2009). Amaral (2015),
estudando animais com síndrome metabólica que realizaram exercícios físicos,
observaram melhora na morfologia das ilhotas pancreáticas.
31 2 REVISÃO DE LITERATURA
Estudos feitos por JIMENEZ-MALDONADO (2014), demostrou que o treinamento
físico crônico promoveu melhora na sensibilidade da insulina e aumento nas densidade
de volume das ilhotas pancreáticas, quando praticado exercício crônico.
Estudos relatam que o treinamento físico favorece a redução na massa corpórea,
com perda de tecido adiposo, melhorando a ação da insulina periférica aos receptores
GLUT4 (transportador de glicose insulino- sensível, cujo principal papel é a captação de
glicose insulino-mediada em tecido adiposo e muscular), prevenindo o esgotamento da
função das células betas do pâncreas (MACHADO, 1998; SLENTZ et al., 2009) e
diminuindo a secreção da insulina. (HUGHES et al.,1993; SOLOMON et al. 2013;
MALIN et al., 2012). Figura 5
Figura 5 – Vias de ativação intracelular desencadeadas pela insulina.1- Ligação da insulina ao receptor na membrana; 2- cascata molecular ativada, para a abertura da proteína de transporte de glicose (glut4); 3- abertura da proteína glut4, permite a entrada da glicose na célula;4- após a entrada, ocorre o armazenamento em forma de glicogênio a glicose; 5- no fígado e no músculo esquelético; 6- ou a transformação e deposição no tecido adiposo em forma de ácido graxo.
Fonte: medicinageriatrica.com.br 4
4
Disponível em:< http://www.medicinageriatrica.com.br/2013/05/21/transpote-de-glicose-glut-4-
nos-diabetes-e-obesidades/
32 2 REVISÃO DE LITERATURA
Artigos relacionados a diferentes modelos de treinamento aeróbio, anaeróbio e
em ambos, os resultados mostraram melhora do perfil lipídico, perda de peso e maior
estímulo do sistema imunológico levando ao aumento da resistência cardiovascular. Os
treinamentos moderados promoveram a normalização dos níveis de glicose, mostrando-
se mais eficazes na preservação do pâncreas, evitando sua exaustão e revertendo
processos de dislipidemia e até uma possível Diabetes tipo 2. (JIMÉNEZ-MALDONADO
et al.,2014; AMARAL et al.,2015)
Estudos epidemiológicos vêm indicando que mulheres pós- menopausadas tem
um maior risco de desenvolver a dislipidemia, porém essa situação pode ser revertida
com treinamento, como verificados em mulheres asiáticas (OMIYA et al.,2015). Silva
(2013) estudando disfunção das células β em indivíduos sedentários e treinados,
observou uma progressão mais rápida para a Diabetes tipo 2 nos sedentários, e que o
treinamento físico conseguiu reverter este processo.
O treinamento moderado é considerado uma forma eficaz de combater os
radicais livres, ele tende a melhorar a capacidade do organismo de produzir enzimas do
sistema antioxidante endógeno, portanto, aumenta as defesas antioxidantes,
contribuindo para a diminuição dos radicais livres (TELESI & MACHADO, 2008), porém
o treinamento de intensidade alta, promove um aumento dos radicais livres, tendo que
associar com alimentos antioxidantes.
33 3. JUSTIFICATIVA
3. JUSTIFICATIVA
Considerando que o avanço da idade, em especial em mulheres pós-
menopausa, impõe modificações físicas e endócrinas que podem alterar o equilíbrio
metabólico do indivíduo, favorecendo a manifestação da dislipidemia e do diabetes
mellitus, como fatores de risco às doenças cardiovasculares, desarte a investigação das
alterações impostas ao pâncreas torna-se relevante no esclarecimento desse quadro
clínico.
Para tanto, a proposta é investigar as alterações das estruturas pancreáticas de
camundongos fêmeas C57BL/6 (selvagem) e LDL Knockout ovariectomizadas
submetidas a treinamentos físicos aeróbios.
34 4 OBJETIVOS
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Investigar as alterações estruturais do pâncreas de camundongos fêmeas
ovariectomizadas selvagens e LDL Knockout submetidas a treinamentos físicos
aeróbios.
4.2 Objetivos Específicos
Analisar os efeitos do treinamento físico no pâncreas de camundongos fêmeas
ovariectomizadas selvagens e LDL Knockout através de análises:
Biométrica
Massas corporal, do tecido adiposo visceral e do pâncreas.
Bioquímica
Glicose, Colesterol, Triglicérides, VLDL e Colesterol total.
Estereológica
Na porção exócrina do pâncreas:
Densidade de volume dos ácinos (Vv[acino]);
35 4 OBJETIVOS
Na porção endócrina do pâncreas:
Densidade de volume das células das ilhotas pancreática (Vv[cels.ip]);
Densidade de volume dos vasos das ilhotas pancreática (Vv[vaso]);
Morfométrica
Diâmetro médio das ilhotas pancreáticas (µm);
Área das ilhotas pancreáticas (µm²).
Imunohistoquímica
Análise imunohistoquímicas foi realizada através de marcadores para as células α e β.
Densidade de volume das células alfa (α);
Densidade de volume das células beta (β)
36 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade São Judas Tadeu (COEP-USJT) de acordo com o protocolo: 058/2007.
5.1 Animais do Estudo
Foram utilizados 15 camundongos fêmeas knockout do receptor de lipoproteína
de baixa densidade, com níveis de LDL plasmático aumentados e 15 camundongos
fêmeas selvagens C57BL/6, com 5 semanas de vida, vindos do Biotério Central da
Faculdade de Medicina (FMUSP). Ambos os grupos iniciaram o experimento com 9
meses de idade e peso inicial variando entre 20 e 30 gramas.
Os camundongos foram mantidos em gaiolas, em local com temperatura
ambiente controlada entre 22 – 24ºC e com ciclo claro/escuro de 12/12 horas no
Biotério da USJT. Todos os camundongos foram alimentados com água e ração padrão
“ad libitum”. Figura 6
Figura 6 – Camundongos LDL Knockout e C57BL/6 (Selvagens), no Biotério na USJT.
Fonte: BEXIGA/2016
37 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1.1 Delineamento do estudo
Figura 7 – Delineamento do estudo, modelo dos grupos LDL Knockout e Controle.
38 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.2 Formações dos Grupos e Sequência Experimental
Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n=5 em cada grupo):
CS - Controle não ovariectomizado sedentário;
COS - Controle ovariectomizado sedentário;
COT - Controle ovariectomizado treinado;
LDL-S - LDL Knockout não ovariectomizado sedentário;
LDL-OS - LDL Knockout ovariectomizado sedentário e
LDL-OT - LDL knockout ovariectomizado treinado.
5.2.1 Ovariectomia
Os animais aos 9 meses de idade, foram submetidos à cirurgia da ovariectomia,
do qual, foram anestesiados com uma mistura de ketamina (120:20 mg/ Kg IM) e foram
colocados em decúbito dorsal para que se realizasse uma pequena incisão mediana na
pele e na musculatura no terço inferior na região abdominal. Os ovários foram
localizados, realizada a ligadura dos cornos uterinos, incluindo os vasos sanguíneos.
Os cornos uterinos e os ovários foram seccionados e removidos e a sutura da
musculatura e da pele realizada.
5.2.2 Colpocitologia
A citologia vaginal foi realizada para confirmar a eficácia da ovariectomia. Foi
coletada a secreção vaginal dos animais, com o auxílio de uma micropipeta com
solução salina (NaCl a 0,9%), colocada em uma lâmina e observada em microscópio de
39 5. MATERIAIS E MÉTODOS
luz, em aumento de 400X, durante quatro dias consecutivos. O estado de menopausa
foi observado, quando ocorre ausência de células epiteliais (fase diestro).
(MARCONDES et al., 2002; VILELA et al., 2007).
40 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.3 Treinamento Físico
5.3.1 Teste de Esforço Máximo
O teste de esforço máximo foi realizado no início e no final do programa de
treinamento físico, em todos os grupos. Este teste serviu de base para prescrição do
treinamento físico para os grupos treinados, bem como verificar a capacidade aeróbia
dos animais, após o período de treinamento físico. O teste consistiu em colocar o
animal correndo na esteira ergométrica a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo esta carga
incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até o animal atingir a exaustão. (ANGELIS
et al.,2004).
5.3.2 Treinamento Físico
Após sete dias da cirurgia de ovariectomia, os animais foram adaptados na
esteira por 10 minutos, durante três dias antes do início do treinamento. Após teve início
o treinamento físico, onde os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de
treinamento físico em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva (1 hora
por dia/ 5 dias por semana de 50 a 60% da velocidade máxima de esforço) durante 4
semanas conforme protocolo padrão (ANGELIS et al.,2004). Figura 08
Figura 8- Adaptação e Treinamento: A: esteira ergométrica para camundongos. B: camundongos em
treinamento. Fonte: A: Biotério-USJT(BEXIGA, 2016); B: www.faperj.br.
41 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.4 Sacrifício dos Animais
Ao término do protocolo de treinamento, em igual tempo para o grupo sedentário,
os animais foram mantidos em jejum por 8 horas para a coleta de sangue, após
eutanasiados por decapitação. O sangue foi coletado em tubos de ensaio secos, com
auxílio de um funil e após heparinizados. Os animais foram submetidos à abertura da
cavidade abdominal, retirado o pâncreas e o tecido adiposo visceral, os quais foram
pesados em balança analítica digital.
5.5. Preparo do Material
5.5.1 Preparo do material para a técnica H&E
As amostras do pâncreas foram fixadas em formol tamponado 10%, para evitar o
processo de autólise. Após foram submetidos aos processos de desidratação em uma
série crescente de álcool etílico, diafanização (clareamento) em xilol, para permitir uma
melhor penetração da parafina na peça, e inclusão em parafina. Os blocos de parafina
com os fragmentos de pâncreas foram cortados em micrótomo rotativo e cortes não
seriados de 5 μm de espessura, montados em lâminas de vidro e corados pelo método
de HE (STEVENS, 1982).
5.5.2 Preparo do material para a técnica de imunohistoquímica
5.5.2.1 Imunomarcação para glucagon
42 5. MATERIAIS E MÉTODOS
Para a visualização dos antígenos utilizou-se o kit NovoLink Polymer Detection
System (RE7150K, Leica BIOSYSTEMS). Primeiramente a atividade endógena da
peroxidase foi neutralizada com aplicação de Novocastra Peroxidase Block por 10
minutos. Em seguida foi feita a incubação com Novocastra Protein Block por 5 minutos,
para reduzir a ligação não especifica do anticorpo primário e do polímero. Após
lavagem com PBS, os cortes foram incubados com o anticorpo primário anti Glucagon
(SC 1309, IgG policlonal de coelho, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) em diluição de
1:100 a 4ºC, overnight. No dia seguinte foi realizada a incubação com o Novocastra
Post Primary Block por 1 hora a temperatura ambiente (TA). Após este tempo e
lavagens em PBS, foi aplicado o NovoLink Polymer por 1 hora, TA. Depois os cortes
foram incubados com uma solução de Novocastra DAB Chromogen e NovoLink DAB
Substrate Buffer (1:20) durante 30 segundos e contrastados com Novocastra
Hematoxylin por 2 minutos. Em seguida foram desidratados em séries crescentes de
etanol, diafanizadas em xilos e montadas em Entellan® (MERK, Alemanha). (Figura 9
A)
5.5.2.2 Imunomarcação para Insulina
Após a desparafinização e a reidratação dos cortes foi realizado o bloqueio da
peroxidase endógena com solução de peróxido de hidrogênio 3% em água destilada.
Em seguida realizou-se o bloqueio dos sítios inespecíficos com solução de BS/BSA 1%
em tampão fosfato 0,01M (pH 7,4). Os tecidos foram incubados com o anticorpo
primário policlonal de coelho antiisulina na diluição de 1:100 a 4°C, overnight (SC 7839,
IgG policlonal de cabra, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) e, após lavagens em
PBS, com o anticorpo secundário anticabra conjugado à peroxidase na diluição de
1:400 por 1 hora a TA (COD 705035003, burro anti IgG de cabra, Jackson Imuno
Research labs, USA). Os controles negativos foram obtidos através da omissão do
anticorpo primário. A reação antígeno anticorpo foi revelada utilizando o cromógeno
3,3’diaminobenzidina (DAB, Ref D39391SET; Sigma Aldrich, USA) e em seguida os
cortes foram contrastados com hematoxilina, desidratados em sequências crescentes
43 5. MATERIAIS E MÉTODOS
de etanol, diafanizados em xilol e as lâminas montadas com Permount ® (Fischer
Scientific Inc). (Figura 9 B)
Figura 9-Fotomicrografia da mesma ilhota pancreática imunomarcadas em A células α (glucagon) e B:
células β (insulina) (grupo COT) IHQ (200X).
Fonte: BEXIGA/2016
5.6. Análises Estereológica e Morfométrica
As imagens dos cortes histológicos corados em H&E foram capturadas através
de um sistema digital de processamento e análise de imagens em computador, do
Laboratório de Estudos Morfológicos e Imunohistoquímicos da Universidade São Judas
Tadeu. O sistema consiste de uma microcâmera de vídeo Sony, acoplada ao
Microscópio Zeiss, que capta as imagens das lâminas histológicas e as transmite para
um computador equipado com software específico para análises quantitativas.
Para a realização das análises estereológica utilizamos o software Image J
(versão 1.47 - National Intitutes of Health; Collins, 2007) e para a morfométrica foi
utilizado o programa de análise de imagens Software Axio Vision 4.8, Zeiss.
44 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.6.1 Análise Estereológica
A densidade de volume expressa a fração de volume ocupada pela estrutura de
interesse pelo número total de pontos. Para ser estimada a densidade de volume de
cada estrutura analisada utiliza-se um sistema teste composto por pontos delimitados e
por linhas de exclusão e inclusão, dispostas sistemática e uniformemente sobrepostas
às imagens capturadas (MANDARIM DE-LACERDA, 1998).
Foram utilizados 5 cortes não seriados por animal, sendo analisados 4 campos
aleatórios de cada corte (20 imagens por animal totalizando 100 imagens por grupo),
em aumento de 400X, e um sistema teste dotado de 200 pontos, com auxílio do
software Image J. As densidades de volume de cada estrutura de interesse foram
expressas em porcentagens, levando em consideração, para efeito de contagem,
somente os pontos que coincidiram sobre a estrutura estudada. (Figura 10)
Figura 10- Fotomicrografia do pâncreas aplicado o Software Image J. Grid com 200 pontos.(1) Ilhotas
pancreáticas; (2) Ácinos pancreáticos; (3) Vasos. Grupo COS H&E, 400X. Fonte: BEXIGA/2016
45 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.6.2 Análise Morfométrica
5.6.2.1 Área e diâmetro médio das ilhotas pancreáticas
Foram capturadas 4 imagens em 5 campos aleatórios de cada animal (20
imagens por animal, 100 imagens por grupo, 600 imagens total) em aumento de 400X
utilizando para a mensuração o software Axio Vision 4.8, Zeiss.
Cada ilhota pancreática foi delimitada e sua área medida em micrômetros (µm2)
e seu diâmetro maior e menor em micrômetros (Figura 11 e 12). Seus valores foram
tabulados e utilizados no tratamento estatístico.
Figura 11- Fotomicrografia da ilhota pancreática, medindo sua área em µm2. Grupo LDL S. H&E.(400X)
Fonte: BEXIGA/2016
46 5. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 12- Fotomicrografia da ilhota pancreática medindo os diâmetros maior e menor. Grupo COS.
H&E. (400X), barra 2µm..
Fonte: BEXIGA/2016.
5.7. Técnicas Imunohistoquímica
5.7.1 Análise estereológica
Para a análise da densidade de volume das células alfa e beta das ilhotas
pancreáticas utilizamos um Grid individualizado (média 125 pontos) para cada ilhota e
para cada imunomarcação, conforme figuras 13 e 14.
47 5. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 13- Fotomicrografia da ilhota pancreática imunomarcada para células α (1), na periferia da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada. (Grupo COS). IHQ 400X.
Fonte: BEXIGA/2016.
Figura 14- Fotomicrografia da ilhota pancreática. Observar as células β imunomarcadas (1), no centro da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada. (Grupo COS). IHQ 400X.
Fonte: BEXIGA/2016.
48 5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.8. Análises Bioquímicas
As análises bioquímicas avaliadas foram realizadas segundo técnicas
tradicionalmente utilizadas em laboratórios de análises clínicas (MOLINARO, 2009).
Dosagem sérica de glicose
O soro obtido após centrifugação do sangue foi utilizado para análise da glicemia
pelo método da glicose oxidase realizados no laboratório de análises clínica da
Universidade São Judas Tadeu (USJT).
Dosagem de Triglicérides, Colesterol e VLDL.
As dosagens foram realizadas por meio de Kits comerciais ELITech
EL200 (ELITechGroup vital ® científico), seguindo as recomendações do fabricante,
com utilização do analisador automatizado FLEXOR-EL200 (ELITechGroup vital ®
científico), no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de medicina do ABC
(FMABC).
5.9 Análise Estatística
Os resultados foram apresentados como média e erro padrão da média. O teste
de análise de variância (ANOVA) two way, e post-hoc de Tukey foram aplicados para
análise dos dados. O nível de significância adotado foi de p< 0,05.
R E S U L T A D O S
49
6. RESULTADOS
6.1 Avaliação do perfil biométrico.
Os resultados dos parâmetros massa corporal, pancreática e tecido adiposo
visceral dos animais estudados estão apresentados na tabela 1 e figuras 15, 16 e
17. Os valores estão apresentados em média e erro padrão da média.
Tabela 1: Massas corporal, do tecido adiposo visceral e do pâncreas dos animais
estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
MCI (g) 22,65±0,39 22,39±0,33 22,42±0,24 22,89±0,73 22,47±0,53 23,90±0,44
MCF(g) 24,04±0,37 23,76±0,19 23,30±0,46 23,16±0,73 24,88±1,87 25,05±0,47
MCF-MCI (g) 1,39±0,20 1,37±0,4 0,88±0,52 0,27±0,13 1,84± 0,71 1,14±0,23
MTAV (g) 1,00±0,13 0,47±0,12 0,46±0,02 0,33± 0,03 0,71±0,05 0,58±0.06
Δ% MTAV 2,36±0,06 3,62±0,03* 1,9±0,06* 2,59±0,20*
+ 3,01± 0,03
*#+1 1,62±0,07
*#12
MPANC (g) 0,27±0,02 0,28±0,04 0,31±0,02 0,19±0,01 0,32±0,03 0,25±0,02
Δ% MPANC 1,06±0,07 1,18±0,17 1,21±0,05 0,80±0,06 * 1,05±0,10 1,02±0,04
Variáveis biométricas, massa corporal Inicial (MCI), Final (MCF) e diferença entre as massas final e inicial (MCF-MCI), do tecido adiposo visceral (MTAV) e do pâncreas (MPANC) e seus respectivos deltas percentuais (Δ% MC, Δ% MTAV e Δ% MPANC).Valores representam média e erro padrão da Média (M±EPM). *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS; +p<0,05 vs COT; ¹p<0,05 vs LDL S; 2p<0,05 vs LDL OS.
6.1.1 Massa Corporal (g).
A pesagem dos animais foi realizada a cada quinze dias, desde o início do
protocolo experimental (ovariectomia) até seu término (final do protocolo de
treinamento). Os animais dos grupos controle (CS, COS e COT) não apresentaram
diferença significante entre si. Verificamos que os animais dislipidêmicos (LDLS,
50 6. RESULTADOS
LDLOS e LDLOT) mostraram aumento, não significante, com a ovariectomia e uma
tendência a diminuição com o treinamento.
Figura 15- Diferença entre a massa corporal inicial e final em gramas dos grupos.
Valores representam média ± EPM. Os grupos não apresentaram valores significantes.
6.1.2 Massa Tecido Adiposo Visceral (TAV) (g).
Ao analisarmos o delta percentual da massa do tecido adiposo visceral, nos
animais controle, observamos que a menopausa promoveu aumento de tecido
adiposo visceral (TAV) de 53% e 16% , respectivamente, nos grupos COS e LDLOS,
em comparação aos seus pares (CS e LDLS). O treinamento promoveu uma
redução de 47% e 46%, respectivamente, nos grupos COT e LDL OT, quando
comparados aos grupos COS e LDLOS, respectivamente. (Tabela 1 e Figura 18).
51 6. RESULTADOS
Figura 16- Delta percentual do Tecido Adiposo Visceral (Δ%).
Δ% da massa do tecido adiposo visceral dos grupos: controle sedentário (CS); controle
ovariectomizado sedentário (COS); controle ovariectomizado treinado (COT); LDL knockout sedentário (LDLS); LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDLOS); LDL knockout ovariectomizado treinado (LDLOT).Valores representam média ± EPM. *p<0,05 vs CS, #p<0,05 vs COS, +p<0,05 vs COT, 1p<0,05 vs LDLS, 2p<0,05 vs LDLOT.
6.1.3 Massa do Pâncreas (g).
Não foi observada diferença significante no delta percentual da massa do
pâncreas entre os animais do grupo controle. Observamos no grupo dislipidêmico
sedentário uma diminuição significativa de 25% na massa do pâncreas nos animais
LDLS, quando comparados ao grupo CS, e que a ovariectomia proporcionou uma
tendência ao aumento e que o treinamento reverteu o processo, não significativo,
quando comparado aos seus pares. Tabela 01 e Figura 19.
Figura 17- Delta percentual da Massa do tecido do Pâncreas (%).
52 6. RESULTADOS
Δ% da massa do tecido do pâncreas dos grupos sedentários (CS); controle ovariectomizado
sedentário (COS); controle ovariectomizado treinado (COT); LDL knockout sedentário (LDLS); LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDLOS); LDL knockout ovariectomizado treinado (LDLOT).Valores representam M±EP. *p<0,05 vs CS.
6.2 Teste de Esforço Máximo (Km/h)
O Teste de Esforço Máximo Inicial foi avaliado, em todos os grupos
estudados, antes do treinamento e o teste de Esforço Máximo Final ao término do
protocolo de treinamento físico, na mesma data.
Nossos resultados mostram que o grupo controle ovariectomizado sedentário
(COS), foi o que apresentou o pior desempenho (-4,3 ± 0,6) e que o grupo
dislipidêmico treinado (LDLOT) também teve uma melhora com o treinamento (2,9 ±
0,3). Tabela 2 e Figura 18.
53 6. RESULTADOS
Tabela 2- Resultado do Teste de Esforço Inicial (TI), Teste de Esforço Final (TF), e a
diferença entre o teste de esforço máximo final e inicial (TF – TI), nos grupos
estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
TI (Km/h) 12,84 17,13 17,23 15,18 16,64 18,57
TF (Km/h) 11,11 12,82 18,6 15,71 16,14 21,56
TF - TI (Km/h) 1,7± 0,5 -4,3 ± 0,6 1,4 ± 1# 0,5 ± 1,5
# -0,5 ± 1,1 2,9 ± 0,3*
#
Valores representam média ± EPM. * p< 0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS.
Figura 18- Diferença entre o Teste de Esforço Máximo Final (TF) e Inicial (TI), em
Km/h, nos grupos estudados.
54 6. RESULTADOS
6.3 Avaliação do perfil bioquímico
A tabela 3 mostra o perfil bioquímico dos grupos experimentais estudados.
Tabela 3- Variáveis Bioquímicas dos grupos estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
Glicemia (mg/dL) 84,2±19,8 96±14 89,1±12,9 85±19,2 125±7,4 102,9±44,4
TG (mg/dL) 29,7±7,6 73,2±16,9* 26,3±15,5# 109,5±20,7
*#2 176,5±7,4
*#+ 87±19,9
*+2
VLDL 7,14±1,08 12,87±2,17 6,75±2,52 20,7±1,83*+ 23,33±2,49*
#+ 15,43±2,38
Col. Total (mg/dL) 68,3±14,7 179,6±68,9* 82,7±116,6# 220,8±53,7*
+ 243,4±5,2*
+ 157,4±32,5*
+2
Valores representam M ± EPM. *p< 0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS; +p<0,05 vs COT; 2p<0,05 vs LDLOS.
6.3.1 Glicose
Não houve diferença significante nos níveis de Glicose, nos grupos controle e
dislipidêmicos. No entanto, observamos uma tendência ao aumento dos níveis de
Glicose com a ovariectomia, e uma tendência à diminuição com o treinamento, em
ambos os grupos. Tabela 3 e Figura 19.
Figura 19- Análise bioquímica da glicose nos grupos experimentais.
Valores representam M± EPM.
55 6. RESULTADOS
6.3.2. Triglicérides (mg/dL)
Na figura 20, podemos observar que os animais dislipidêmicos (109,5±20,7 ;
176,5±7,4 e 87±19,9) apresentaram aumento significante nos valores do triglicérides,
quando comparado aos grupos controle (29,7±7,6; 73,2±16,9 e 26,3±15,5). Os níveis
se comportaram de forma semelhante tanto no grupo controle, quanto nos animais
dislipidêmicos, onde a ovariectomia promoveu aumentou significante e o treinamento
reverteu o processo, se aproximando de seus pares.
Figura 20- Parâmetro bioquímico Triglicérides (TG), nos grupos
experimentais.
Valores representam M± EPM. *p<0,05vs CS; #p<0.05 vs COS ;
+p<0,05 vs COT.
6.3.3 VLDL (mg/dL)
56 6. RESULTADOS
Observamos aumento significante no VLDL nos animais dislipidêmicos
quando comparados ao controle. Verificamos que tanto os animais controle quanto
os dislipidêmicos se comportaram de maneira semelhante, exibindo tendência ao
aumento na ovariectomia (COS e LDLOS), e redução ao treinamento (COT e
LDLOT).
Figura 21- Parâmetros bioquímico VLDL, nos grupos experimentais.
Valores representam M ± EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT.
6.3.4 Colesterol Total
Os dados do Colesterol Total, conforme figura 22, mostra resultados
semelhantes ao Triglicérides e ao VLDL, em ambos os grupos.
Figura 22- Parâmetro bioquímico Colesterol Total (CT), dos grupos experimentais.
57 6. RESULTADOS
Valores representam M ± EPM.* p<0,05 vs CS; # p<0,05 vs COS ;
+ p<0,05 vs COT ;
2p<0,05 vs LDL-
OS.
6.4 Análises morfométrica, estereológica e imunohistoquímica.
6.4.1 Análise morfométrica
6.4.1.1 Área (µm2) e diâmetro médio (µm) das Ilhotas Pancreáticas.
Os parâmetros área e o diâmetro médio das ilhotas pancreáticas estão
apresentados na Tabela 4 e figuras 23 e 24.
Tabela 4- Área (µm2) e diâmetro médio (µm) das ilhotas pancreáticas nos grupos
estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
Área 6797,5±506,5 8740,8±104,22 7549,4±832,1 4060,3±367,1*
#+ 9593,4±1144,8
1 6897,8±558,9
2
Diâmetro 94,5±3,9 106,0 ±6,1 99,5 ± 5,3 73,8±3,2*#+
109,8±7,11 93,7±4,0
2
58 6. RESULTADOS
Valores representam média ± erro padrão da média (M±EPM). *p<0.01 vs CS; #
p<0,001 vs COS; +p<0.01 vs COT;
1p<0.01 vs LDL S e
2p<0.05 vs LDL OS
Ao compararmos o grupo CS ao grupo LDL S, verificamos que a dislipidemia
promoveu uma diminuição significante tanto da área (-40%) quanto no diâmetro
médio (-22%) das ilhotas pancreáticas e que a ovariectomia (LDL OS), apontou um
aumento significante tanto na área (+136%) quanto no diâmetro (+40%), quando
comparado com o grupo LDL S e que o treinamento (LDL OT) reverteu este
processo (-28%) e (-15%), respectivamente, quando comparado ao grupo LDL OS,
aproximando aos resultados do grupo COT.
Figura 23- Área da ilhota pancreática nos grupos estudados.
Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS;
#p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL
S; 2p<0,05 vs LDL OS.
Figura 24- Diâmetro médio das ilhotas pancreáticas nos grupos estudados.
59 6. RESULTADOS
Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL
S; 2p<0,05 vs LDL OS.
6.4.1.2 Distribuição de frequência da área das ilhotas
pancreáticas (%)
Na tabela 5 e figura 25 observamos os resultados da distribuição de
frequências (%) da área das ilhotas pancreáticas, para tal consideramos os
seguintes valores para o tamanho das áreas: pequena (593- 4863 µm2); média
(4864-9726 µm2) e grande (9726-20868 µm2).
Verificamos que o tamanho das ilhotas pancreáticas sofre influência da
ovariectomia (COS), nos animais do grupo controle, promovendo aumento na
frequência de ilhotas pequenas e grandes e diminuição das médias, quando
comparado ao grupo CS. Ressaltamos que o treinamento conseguiu reverter este
processo se aproximando dos valores encontrados no grupo CS.
Os animais do grupo LDL S apresentaram aumento de ilhotas pancreáticas de
tamanho pequeno e uma diminuição acentuada nos tamanhos médio e grande,
60 6. RESULTADOS
quando comparado com o grupo CS. Notamos que nestes animais, o ovariectomia
(LDL OS), diferentemente do grupo controle, promoveu diminuição no tamanho
pequeno e aumento nos tamanhos médio e grande. Já o treinamento conseguiu
reverter o processo aumentando a frequência das ilhotas pequenas, diminuindo as
médias e mantendo as de tamanho grande.
Tabela 5- Valores representam a porcentagem das Ilhotas pancreáticas (IP)
distribuídas em tamanhos.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
Pequena 34,6% 40,6% 31,2% 68% 35% 44,9%
Média 40,4% 29,7% 37,5% 17% 31,7% 22,5%
Grande 25% 29,7% 31,3% 15% 33,3% 32,6%
Porcentagem das Ilhotas pancreáticas (IP) distribuídas em tamanhos pequena (593- 4863µm2), média (4864-9726 µm2) e grande (9727-20868 µm2).
Figura 25- Histograma de distribuição de frequência do tamanho das ilhotas
pancreáticas quanto sua área, nos grupos estudados.
61 6. RESULTADOS
6.4.2 Análise estereológica
6.4.2.1 Densidade de volume das ilhotas, ácinos e vasos
pancreáticos.
Os resultados da densidade de volume das ilhotas, ácinos e vasos
pancreáticos estão representados na tabela 6 e nas figuras 26, 27, 28 e 29.
Figura 26- Fotomicrografias do tecido pancreático, ilhotas (seta branca), ácinos
(seta preta) e vasos (seta verde), dos grupos estudados. H&E, 400X. Barra 2µm
Na tabela 6 e figuras 26 e 27 podemos observar que a ovariectomia, nos
animais do grupo controle, mostrou uma tendência ao aumento na densidade de
volume das ilhotas e uma diminuição nos vasos, e o treinamento conseguiu reverter,
chegando próximo aos valores do grupo CS.
62 6. RESULTADOS
Nos animais dislipidêmicos constatamos que o sedentarismo (LDLS)
promoveu diminuição de (-46,3%) na densidade de volume das ilhotas, a
ovariectomia (LDLOS) aumento, de forma expressiva (+266%) e o treinamento
(LDLOT) redução (-37,7%), quando comparado aos seus pares. Verificamos que a
densidade de volume dos vasos diminui significantemente nos animais
dislipidêmicos e que o treinamento conseguiu reverter o processo, quando
comparado aos seus pares.
Quanto aos ácinos verificamos que os animais do grupo controle não
apresentaram alterações significantes em relação à ovariectomia e ao treinamento.
Os animais dislipidêmicos sedentários (LDLS) mostraram aumento significante
(+18,3%), a ovariectomia promoveu diminuição significante (-29,65%) em relação ao
LDLS e o treinamento (LDLOT) conseguiu reverter (+21%) este parâmetro, quando
comparado ao grupo LDLOS.
Tabela 6- Densidades de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), ácinos (Vv[ac]) e
vasos (Vv[vas]) (%) dos animais nos grupos estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
Vv[ip] % 18,66 ± 1,31 23,82 ± 2,55 18,70 ± 2,2 17,70 ± 2,18 28,17 ± 2,731 22,18 ± 2,39
Vv[ac]% 73,88 ± 2,07 69,39 ± 2,97 71,31 ± 2,63 79,3± 2,13 69,67 ± 2,72
1 74,49 ± 2,67
Vv[vas]% 7,44± 1,68 6,80±1,56 9,98± 1,94 3,01± 0,58*+
2,15 ± 0,45*#+
3,32 ± 0,77+
Valores representam M±EPM. Densidade de volume das Ilhotas, dos ácinos e dos vasos pancreáticos
(IP), nos grupos estudados. * p<0,05 vs CS; #p<0,05vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL S.
Figura 27- Densidade de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), nos grupos
estudados.
63 6. RESULTADOS
Valores representam M±EPM. Densidade de volume das Ilhotas pancreáticas, nos grupos estudados. 1p<0,05 vs LDL S
Figura 28- Densidade de volume dos ácinos pancreáticos (Vv[ac]), nos grupos
estudados
Valores representam M±EPM. Densidade de volume dos ácinos pancreáticos, nos grupos estudados. 1p<0,05 vs LDL S.
Observamos que houve uma diminuição significante (-21%) quanto a
densidade de volume dos vasos nos animais dislipidêmicos e que o ovariectomia
apresentou uma tendência a redução e o treinamento a um aumento, não
significante, quando comparado os dados a seus pares. Figura 28 e 31 e tabela 6
64 6. RESULTADOS
Figura 29- Densidade de volume dos vasos pancreáticos (Vv [vasos]), nos grupos
estudados.
Valores representam média ± erro padrão da média (M±EPM). * p<0.05 vs CS; #p<0.05 vs COS; +p<0,05 vs COT.
6.4.3 Imunohistoquímica
6.4.3.1- Densidade de Volume das células-β (insulina)
imunomarcadas das ilhotas pancreáticas (Vv[cels β]) %
A tabela 7 e a figura 30 mostram os resultados da densidade de volume das
células β insulina das ilhotas pancreáticas.
65 6. RESULTADOS
Tabela 7- Densidade de volume das células beta (β) e outras células: Alfa ( ), Delta
(δ), Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos
grupos estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
Células-β(%) 73,7±1,8 82,4±3,1 74,5±1,7 71,6±1,2# 86±1,6
*+1 60,4±3,3
*#+12
Outras Cels(%) 26,3±1,8 17,6±3,1 25,5±1,7 28,4±1,2
# 14±1,6*
+1 39,6±3,3
*#+12
Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL
S; 2p<0,05 vs LDL OS
Verificamos que a ovariectomia, no grupo controle, apresenta uma tendência
ao aumento na densidade de volume das células β e que o treinamento consegue
reverter este processo, quando comparamos os dados aos seus pares. Nos animais
dislipidêmicos, resultados semelhantes foram encontrados, mas de forma
significante. Tabela 07 e figura 32, 34.
É importante, ressaltar que a células não marcadas foram consideradas
células alfa, delta, PP e épsilon, encontradas nas ilhotas pancreáticas, onde suas
porcentagens foram consideradas em conjunto, como pode ser observada na tabela
7.
Figura 30- Densidade de volume das células- β (beta), das ilhotas pancreáticas, nos
grupos estudados.
Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL
S; 2p<0,05 vs LDL OS.
66 6. RESULTADOS
6.4.3.2- Densidade de volume das células-α (glucagon) da Ilhota
pancreática (Vv[cels α]) %.
A tabela 8 e a figura 31 mostra os resultados da densidade de volume das
células Alfa (α) (glucagon) das ilhotas pancreáticas.
Tabela 8- Densidade de volume das células Alfa ( ) e outras células: beta (β), Delta
(δ), Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos
grupos estudados.
CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT
Células α (%) 32,7±1,6 18,2±1,2* 43,3±2
*# 30,4±3,8
*+ 29,1±2,3*
+ 47,1±18,3
*#12
Outras Cels (%) 67,3±1,6 81,8±1,2* 56,7±2
*# 69,6±3,8
#+ 71±2,3*
+ 52,9±2,9
*#1
Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL
S; 2p<0,05 vs LDL OS
Verificamos que no grupo controle a ovariectomia (COS) promoveu
diminuição significante da porcentagem das células-α e que o treinamento (COT)
promoveu sua recuperação, ao compararmos a seus pares. (Tabela 08 e figura 31).
Nos animais dislipidêmicos, a ovariectomia (LDL OS), não mostrou alterações
nas células-α, quando comparamos ao grupo LDL S, mas verificamos aumento
significante das mesmas, quando comparamos com o grupo controle
ovariectomizado (COS). Já o treinamento (LDL OT) se apresentou de forma positiva
conseguindo reverter o processo, chegando próximo ao grupo COT. (Tabela 08 e
figura 31).
67 6. RESULTADOS
Figura 31- Densidade de volume das células α- pancreáticas, nos grupos estudados.
Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;
+p<0,05 vs COT;
1p<0,05 vs LDL
S; 2p<0,05 vs LDL OS
68 6. RESULTADOS
Figura 32- Fotomicrografias das ilhotas pancreáticas com as técnicas em H&E e
Imunohistoquímica com células alfa e beta imunocoradas, das ilhotas pancreáticas.200X,
barra 5µm.
69 7. DISCUSSÃO
7. DISCUSSÃO
Com o evento da menopausa, alterações endócrino-metabólicas, causadas
pela privação dos hormônios estrogênios, promovem aumento de lipoproteínas de
baixa densidade sanguínea (LDL), diminuição da lipoproteína de alta densidade
(HDL), associados a um quadro de hipercolesterolemia, acarretando diversas
doenças senis, como Síndrome Metabólica, aterosclerose, doenças
cardiovasculares e principalmente diabetes (GRAFF-IVERSEN et al., 2008), levando
à disfunções morfológicas pancreáticas, induzindo um quadro dislipidêmico pré-
diabéticos (SILVA et al.; 2013).
Diabetes tipo 2 (T2D) e resistência periférica à insulina é causado por uma
combinação da incapacidade do corpo em produzir insulina suficiente. A American
Diabetes Association (ADA), 2008, enfatiza que, isto leva a uma deficiência da
homeostase da glicose com subsequente hiperglicemia crônica, associada a danos
em longo prazo e a disfunção de vários órgãos, incluindo olhos, rins, nervos,
coração e vasos sanguíneos.
O treinamento físico vem sendo apontado como uma intervenção eficaz, não
farmacológica, pois induz a uma maior tolerância à glicose aumentando a
sensibilidade à insulina e melhorando o perfil lipídico, circulação, massa muscular,
taxa metabólica e capacidade antioxidante, reduzindo assim os riscos de
complicações diabéticas (SARACENI & BRODERICK, 2007; GOLBIDI et. al, 2012).
Além disso, foi demonstrado que o treinamento voluntário aumenta a quantidade de
insulina pancreática e previne a falência de células beta, em modelos animais
diabéticos (SLENTZ et al, 2009; DELGHINGARO-AUGUSTO et. al, 2011; HUANG et.
al, 2011; MALIN et al, 2012; OMIYA et al, 2015).
Portanto, o objetivo deste estudo foi evidenciar o efeito do treinamento físico
sobre as ilhotas pancreáticas em modelo camundongos femeas LDL Knockout
ovariectomizadas.
70 7. DISCUSSÃO
7.1. Massas corporal, Tecido Adiposo Visceral e Pâncreas.
Nossos resultados mostram que após 5 semanas de treinamento, não
obtivemos resultados significativos quanto a massa corporal, no entanto, nota-se
que,os grupos ovariectomizados treinados apresentaram uma tendência à
diminuição de massa corporal. Essa diminuição, nestes animais, é semelhante as
observadas por SLENTZ (2009), em mulheres menopausadas que realizaram
treinamento físico.
O treinamento físico, tem sido um tratamento eficaz não farmacológico, para a
redução de peso corporal, (MALIN et al, 2013; OMIYA et al, 2015) tanto em
humanos, quanto em modelos experimentais (MARQUES et al., 2010; TRAISAENG
et al.,2014).
Também observamos aumento do tecido adiposo visceral, no grupo LDL OS,
provavelmente associado à dislipidemia e a menopausa. Cabe citar os trabalhos de
Gaspard (2009) e Meirelles (2014), destacam que a obesidade visceral favorece a
resistência insulínica, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares. Com a
diminuição do acúmulo de gordura abdominal, é possível reverter à resistência a
insulina, aumentando a absorção da glicose dos tecidos, prevenindo o pâncreas do
excesso de secreção da insulina (AFONSO et al., 2003).
Um estudo transversal, com 118 mulheres pós- menopáusicas, foi apontado
que 30% destas mulheres apresentavam síndrome metabólica concomitante à
obesidade abdominal (JOUYANDEH et al, 2013). Este aspecto também é comentado
por Veras (2014), em estudo com ratas Wistar ovariectomizadas alimentadas com
dieta hipercalórica, onde observou aumento significativo no peso corporal e redução
na sensibilidade e secreção da insulina. Dados semelhantes foram encontrados por
Figueiredo-Neto, (2010) em 323 mulheres, pré e pós-menopausa, evidenciando que
a prevalência da obesidade abdominal e síndrome metabólica, foi maior em
mulheres menopausadas do que as não menopausadas.
Ao mencionar tal assunto, Meirelles (2014) relata que uma das funções do
hormônio estrogênio, é conduzir a deposição da gordura nas regiões femoral e
71 7. DISCUSSÃO
glútea (gordura diferente da visceral) e apresentar um perfil glicídico não tão
agressivo, como a do tecido adiposo visceral, porém, após a menopausa, sem a
função estrogênica, o corpo passa a depositar a maior parte da gordura para a
região abdominal.
Estudos demonstram que a pós-menopausa, acentua a deposição de gordura
abdominal em aproximadamente em 40%. O excesso da gordura visceral aumenta a
atividade lipolítica celular, resultando em um aumento na liberação dos ácidos
graxos livres (AGL) pela veia porta, desembocando uma parte deste substrato, no
fígado, músculo e no pâncreas (CESARIO & NAVARRO, 2008).
Vários autores relatam que durante o treinamento físico moderado, ocorre o
efeito do ciclo glicose-ácido graxo, que representa a preferência do tecido muscular
pelos ácidos graxos e os carboidratos para a produção de energia muscular,
favorecendo a lipólise do tecido adiposo (RANDLE et al.,1963, BONADONNA et al.,
1994; HABER et al., 2001; HUE et al., 2009; SILVEIRA et al., 2011).
Neste sentido, evidenciamos em nosso estudo diminuição significante na
porcentagem da gordura visceral no grupo dislipidêmico treinado (LDL OT), quando
comparado ao grupo controle. A despeito disso, Cesário (2008) comenta que o
treinamento físico de intensidade moderada, induz o aumento da atividade
simpática, estimulando a atividade da enzima lipase, cuja função é catalisar a
liberação de glicerol e ácidos graxos.
O papel endócrino do tecido adiposo, afeta a função de órgãos, como o
fígado, músculo, sistema nervoso central e pâncreas (ESTEVES, 2013). Viola
(1998), estudando camundongos com restrição alimentar verificou diminuição do
peso do fígado, rins, trato gastrintestinal e pâncreas. Em nosso estudo verificamos
nos grupos controle, uma tendência ao aumento da massa do pâncreas com a
ovariectomia, e diminuição com o treinamento.
72 7. DISCUSSÃO
7.2 Teste de Esforço Máximo
Quanto ao teste de esforço físico, observamos que no grupo controle houve
uma diminuiu sua capacidade com a ovariectomia, e uma tendência a com o
treinamento. Já os animais dislipidêmicos apresentaram tendência a redução do
seu esforço físico quando comparado ao grupo CS. A ovariectomia promoveu nos
grupos dislipidêmicos (LDLOS) uma piora, onde o treinamento (LDL OT) conseguiu
reverter positivamente o resultado do teste de esforço físico, quando comparado ao
grupo LDLS. Corroboram com nossos resultados os pesquisadores Solomon et al.
(2013), onde observaram, em indivíduos com diabetes tipo 2 ou intolerância à
glicose, melhora na aptidão aeróbica, após treinamento físico.
Alves et al., (2004), estudando mulheres acima de 60 anos, incluídas em um
programa de aulas de hidroginástica por 12 semanas, observaram uma melhora na
aptidão física. O American College Of Sports Medicine (ACSM), 2003; sugere que o
treinamento físico para o idoso deve ser de intensidade moderada, três vezes por
semana, frequência cardíaca máxima 55 a 85%. (FCmax).
7.3 Exames Laboratoriais
Sabe-se que o treinamento físico estimula a liberação dos hormônios
catecolaminas (norepinefrina e epinefrina), do crescimento GH, glucagon,
glicocorticoide cortisol, entre outros, atuando na glicogenólise hepática, com isso, a
degradação dos ácidos graxos do fígado, aumentam a liberação de glicose, sem a
necessidade da secreção da insulina, sendo assim a a glicose sofre alterações de
acordo com as concentrações destes hormônios (POWERS, 2009; AFONSO et al.,
2003; LIMA et al., 2010).
No presente estudo, o treinamento, tanto nos animais controle (COT) quanto
nos dislipidêmicos (LDLOT) mostraram uma diminuição nos resultados bioquímicos
73 7. DISCUSSÃO
realizados, pois o treinamento moderado está relacionado com o gasto energético,
corroboram com nossos resultados Solomon et al., (2013) e Omiya et al., (2015).
Nossos resultados mostram que a ovariectomia (COS e LDL OS) promoveu
aumento significante, no TG, VLDL e Colesterol total, e que o treinamento (COT e
LDL OT) conseguiu reverter estes resultados, quando comparados aos seus pares.
Neste contexto corroboram com nossos resultados Cheik, et al., (2006), onde
utilizando ratos com dieta hipercolesterolêmica que realizaram treinamento físico,
verificaram diminuição significativa no colesterol e a TG e aumento da fração lipídica
HDL-c.
Cabe citar o trabalho de Solomon et al., (2013), mostrando que o treinamento
físico obteve melhoras na sensibilidade à insulina, aumentando a absorção da
glicose nos tecidos periféricos, reduzindo a função das células-beta do pâncreas.
Este aspecto também é comentado por Amaral et al.; (2015), concluindo que o
treinamento físico reduz os níveis de triglicérides e promove aumento de Glut4,
melhorando o transporte de glicose para os músculos.
7.4 Análises Morfométrica, estereológica e Imunohistoquímica.
Os parâmetros área e o diâmetro médio das ilhotas pancreáticas, nos animais
controle, apresentaram uma tendência ao aumento com a ovariectomia (COS) e
diminuição com o treinamento (COT). Já os animais dislipidêmicos sedentários (LDL
S), apresentaram diminuição significante de -40% na área e -22% no diâmetro médio
das ilhotas pancreáticas, quando comparados ao grupo CS. Dados semelhantes
foram encontrados por Huang et al., (2007) onde demonstraram que o excesso de
lipídios, colesterol e triglicérides, contribuem ao estresse oxidativo, favorecendo o
quadro de apoptose, reduzindo a área das ilhotas pancreáticas. Silva et al., (2011),
estudando ratos diabéticos, também mostraram, diminuição no tamanho das ilhotas
pancreáticas, quando comparados ao grupo controle.
74 7. DISCUSSÃO
O grupo dislipidêmico ovariectomizado (LDL OS) obteve aumento significante
e de forma expressiva, tanto na área (+136%), quanto no diâmetro médio (+40%).
Dados semelhantes foram encontrados por Veras et. al (2014) em ratas e com Silva
(2013) em camundongos C57BL/6, submetidos à ovariectomia combinados com
dieta hiperlipídica.
Verificamos que o treinamento, é um fator preponderante para a reversão
deste processo, corroboram com nossos resultados Traisaeng et al., (2014);
Delghingaro-Augusto et al., (2011); Huang et al., (2011). Na mesma direção, Pauli et
al. (2009) e Speretta et. al. (2014) mostraram que o treinamento físico contribui para
efeito anti-inflamatório, promovendo diminuição na produção de TNF-alfa e outras
adipocinas pró- inflamatórias.
Hayek & Woodside (1979), consideram, que o tamanho da ilhota está
relacionado à secreção da insulina, portanto, ilhotas grandes secretam mais insulina.
Isto explica os resultados encontrados no grupo LDL OS, com aumento significativo
da densidade das ilhotas e a diminuição dos ácinos, promovendo também aumento
significativo na densidade das células-beta β, (insulina) imunomarcadas, quando
comparados ao grupo CS.
Poitout & Robertson (2002) e Kim & Yoon (2011) ponderam que a
glicotoxicidade e a hiperglicemia exercem efeitos prejudiciais as células-beta,
levando a apoptose, prejudicando sua função e consequentemente levando a um
quadro pré- diabético tipo 2.
Já os animais dislipidêmicos sedentários (LDL S), apresentaram uma
tendência à diminuição na densidade de volume das ilhotas pancreáticas, aumento
dos ácinos e uma diminuição significante dos vasos, quando comparados seus
pares. Vale notar que este grupo foi o que apresentou maior porcentagem de ilhotas
pequenas e tendência ao aumento na densidade das células-beta quando
comparado ao grupo CS. Mais estudos estão sendo realizados por nosso grupo para
tentar explicar a causa da diminuição das ilhotas pequenas sugerindo ser devido ao
75 7. DISCUSSÃO
quadro de dislipidemia que compromete a ação da insulina (LEAL et al., 2010)
levando a apoptose ou a formação de ilhotas novas, das quais, em caso de
hiperglicemia crônico, aumentariam de tamanhos, para a adaptação do ambiente
(BEAUDRY & RIDDELL, 2012). Já a ovariectomia promove um aumento significativo
das densidades de volume das células- beta, das ilhotas, e a presença de um maior
número de ilhotas grandes, sugerindo o esgotamento das células- beta pancreáticas.
Com o treinamento físico, diminuiu tanto a densidade das células- beta, quanto das
ilhotas pancreáticas, tendenciado as características do grupo controle (CS).
Verificamos que a dislipidemia, promove diminuição significativa na densidade
de volume dos vasos, quando comparados aos seus pares, no entanto, o
treinamento (LDL OT), apresenta uma tendência ao aumento. Cabe citar o trabalho
de Iwase et al., (2002), em ratos OLEFT com 12 semanas, pré-diabético, pré- obeso,
onde concluíram que hiperglicemia a longo prazo, diminui o fluxo sanguíneo das
ilhotas e destaca também que, a restrição alimentar, melhorou o fluxo sanguíneo.
Vale lembrar que as ilhotas, diminuem com o envelhecimento, potencializando
esta redução em casos crônicos de hiperglicemia, dislipidemia, onde o pâncreas
pode ser levado à exaustão, resultando em uma diminuição da secreção de insulina
a longo prazo (IWASE et al., 2002; HAYEK et al.,1979). Estudos demonstraram
correlação das ilhotas pancreáticas expostas em níveis elevados de glicose, por um
tempo crônico, resultam em ineficácias da funcionalidade das células betas (insulina)
(ROCHA et al., 2006).
Em nosso trabalho, o grupo treinado (COT), apresentou uma tendência à
diminuição das ilhotas e um pequeno aumento dos ácinos, quando comparados aos
grupos COS. Os nossos estudos estão de acordo com Amaral et al., (2015), do qual,
a corrida com ratos Wistar, mostrou diminuição também da área das ilhotas e um
aumento dos ácinos.
Nossos experimentos mostraram que o treinamento promoveu aumento da
densidade de volume das células- alfa pancreáticas (glucagon), tanto nos animais
76 7. DISCUSSÃO
controle (COT), quanto os dislipidêmicos (LDL OT). Corroboram com nossos
resultados, os pesquisadores Lima et al., (2010); Afonso et al., (2003); Canali &
Kruel (2001), mostrando que o glucagon é estimulado por jejum ou treinamento.
Quanto maior o tempo de treinamento, maior a liberação do glucagon
(FERNANDEZ-PASTOR et al., 1992). Porém, a densidade das células-beta
pancreáticas (insulina), aumentaram com a ovariectomia, mas o treinamento
conseguiu reverter. O Glucagon, estimula a degradação do glicogênio no fígado, e a
quebra dos triglicérides no tecido adiposo, facilitando a captação de glicose e
diminuindo os níveis de insulina (FERNANDEZ-PASTOR et al., 1992; CANALI &
KRUEL, 2001). Com isso, observamos nos grupos treinados, uma tendência à
diminuição das densidades de volume das ilhotas (Vv[ip]), se aproximando aos
valores do CS.
77 8. Conclusão
8. Conclusão
Ao analisarmos os dados obtidos neste trabalho, sugerimos que a ovariectomia,
promoveu aumento na massa corporal, no tecido adiposo e também na massa do
pâncreas, tanto no grupo controle COS, quanto no grupo dislipidêmico LDLOS. Este
aumento é devido as alterações promovidas pelo envelhecimento, menopausa e
sedentarismo, levando ao aumento na Glicemia, no Triglicérides, VLDL e no Colesterol
Total, indo ao encontro de que o aumento de peso eleva os níveis bioquímicos,
resultando na diminuição do fluxo sanguíneo.
Diante de um quadro de alteração nos níveis bioquímicos, levando a dislipidemia,
alterações como aumento na área e no diâmetro das ilhotas, na densidade de volume
das ilhotas pancreáticas de 17% no grupo LDL S, para 28% no grupo LDLOS, foram
observadas.
O histograma de frequência do tamanho das ilhotas pancreáticas evidencia aumento
das ilhotas grandes (33,3%) no grupo LDL OS, quando comparados ao grupo LDL S
(15%). Isto explica o aumento das células beta, como tentativa de reverter o quadro da
dislipidemia, com o aumento da secreção da insulina, também observada na
ovariectomia, evidenciando uma tendência ao aumento na densidade de volume das
células-beta.
Observamos na imuno-histoquímica, que houve um aumento na densidade das
células-alfa (glucagon) e diminuição das células-beta (insulina), isso explica a
diminuição da área, do diâmetro e da densidade das células-beta (insulina), e o
aumento das células alfa (glucagon), que vai ao encontro de que o treinamento físico
moderado, promove a liberação do hormônio glucagon e o aumento de Glut4.
Ou seja, o hormônio glucagon promove a liberação de glicose do fígado e do tecido
adiposo para o sangue (por isso a diminuição do tecido adiposo), e o Glut4 melhora o
78 8. Conclusão
transporte de glicose para os músculos, não havendo a necessidade do hormônio da
insulina, assim, prevenindo o pâncreas.
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