universidade federal fluminense centro de ciÊncias …livros01.livrosgratis.com.br/cp109334.pdf ·...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSECENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA APLICADAS
DANIELLE PACHECO ALVES
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE AMOSTRAS DE
ESCHERICHIA COLI UROPATOGÊNICA ISOLADAS DE HUMANOS E DE CÃES.
Niterói 2009
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
DANIELLE PACHECO ALVES
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE AMOSTRAS DE ESCHERICHIA COLI UROPATOGÊNICA ISOLADAS DE HUMANOS E DE CÃES.
Orientador: Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA
Niterói
2009
2
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do título de mestre.
3
A474 Alves, Danielle Pacheco.Caracterização fenotípica e genotípica de amostras de
Escherichia coli uropatogênica isoladas de humanos e de cães / Danielle Pacheco Alves – Niterói, 2009.
96 f
Dissertação (Mestrado em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas) – Universidade Federal Fluminense, 2009
1. E. coli; 2. humanos; 3. cães; 4. virulência;
5. trato urinário
CDD 589.95
DANIELLE PACHECO ALVES
Caracterização fenotípica e genotípica de amostras de Escherichia coli
uropatogênica isoladas de humanos e de cães.
Aprovada em 31 de março de 2009.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. ROSANA ROCHA BARROS
UFF
Prof. Dra. CLAUDIA REZENDE VIEIRA DE MENDONÇA SOUZA
UFF
Prof. Dr. JOÃO RAMOS COSTA ANDRADE
UERJ
Niterói
2009
4
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.
• AGRADECIMENTOS
À Deus, por me guiar e estar presente em todos os momentos de minha vida.
Ao Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira pela orientação, atenção,
crédito a min confiado e pela oportunidade de ampliar meus conhecimentos.
Ao Laboratório de Patologia do Departamento de Microbiologia do Hospital
Universitário Antônio Pedro e a Profa. Dra. Claudia Rezende Vieira de Mendonça
Souza por ceder gentilmente as amostras de UPEC de origem humana dos
pacientes desta unidade.
À todos os professores, colegas, técnicos e demais funcionários do
Departamento de Microbiologia e Parasitologia pelo apoio e atenção dispensada.
Aos Professores do Curso de Mestrado em Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas por sua dedicação ao compartilhar seus conhecimentos.
Aos meus colegas de turma Ana Paula, Bárbara, Carlos, Cecília, Denise,
Flávia, Ivana e Matheus, pelos bons momentos que passamos juntos!
A todos os amigos do Laboratório de enteropatógenos e alimentos do
MIP/UFF pela cooperação, atenção, carinho, alegrias, tristezas e até confusões.
Sem vocês este trabalho não existiria!
Aos meus pais, Jorge Luiz Alves e Maria Regina Pacheco Alves por toda sua
dedicação e apoio em todos os momentos. Mesmo que o faça por todos os dias da
minha vida, não será o suficiente para agradecer tudo o que vocês fizeram por min.
Amo vocês!
À minha irmã Izabella Pacheco Alves por ter sempre um sorriso a oferecer e
por sempre se espelhar em mim, o que me motiva a fazer sempre o melhor.
5
Ao meu marido Marco Vinícius Ramos Ximenes pela cumplicidade, carinho,
paciência e presença em mais uma etapa da minha vida.
A minha madrinha, Margarida dos Santos Pacheco com quem sempre pude
contar e serei eternamente grata.
A minha tia Maria de Fátima Pacheco pelo estímulo, atenção e carinho de
sempre.
Aos meus avós, tios, tias e primos, pela estima recíproca e confiança de
sempre.
À Capes pelo apoio financeiro ao projeto.
6
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 10LISTA DE ABREVIATURAS 12RESUMO 14ABSTRACT 16
1 INTRODUÇÃO 171.1 Escherichia coli uropatogênica - UPEC 181.2 Fatores de virulência 201.2.1 Adesinas 211.2.2 Toxinas 221.2.3 Sideróforos e outros fatores 231.3 Antimicrobianos e aquisição da resistência 23
1.3.1 Resistência intrínseca aos antimicrobianos 26
1.3.2 Resistência adquirida aos antimicrobianos 27
1.3.3 Genética da resistência 28
1.3.4 Bioquímica da resistência 29
.1.4 Multirresistência bacteriana 31
1.5 ESBL – beta-lactamases de espectro estendido 32
1.6 Infecção hospitalar 35
1.7 Epidemiologia molecular 37
2 OBEJETIVO GERAL 38
2.1 Objetivos específicos 38
3 MATERIAL E MÉTODOS 40
3.1 Amostras clínicas 40
3.2 Confirmação da pureza e isolamento das amostras 41
3.3 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos 41
7
3.4 Detecção de amostras produtoras de ESBL 42
3.5 Sorotipagem 44
3.6 Produção de hemolisina 44
3.7 Seleção de amostras para avaliação do perfil
genotípico
44
3.8 Obtenção de DNA molde de isolamentos 45
3.9 Caracterização genotípica da virulência e da
resistência
45
3.10 Eletroforese em gel de agarose 46
3.11 Extração plasmidial 48
4 RESULTADOS 50
4.1 Perfil das amostras de origem humana 50
4.2 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos 52
4.3 Avaliação da Multirresistência 56
4.4 Perfil plamidial 58
4.5 Identificação de ESBL 62
4.6 Avaliação da produção de hemólise 64
4.7 Detecção de genes de resistência e de genes de
virulência
66
5 DISCUSSÃO 73
6 CONCLUSÕES 80
7 BIBLIOGRAFIA 81
8
Lista de Ilustrações:Página
Figura 01 Exemplificação da metodologia de Disco Aproximação.
Escherichia coli produtora da ESBL.
43
Figura 02 Resistência aos antimicrobianos em amostras humanas. 52Figura 03 Resistência aos Antimicrobianos em amostras caninas. 54Figura 04 Frequencia de Multirresistência em amostras humanas e
caninas.57
Figura 05 Gel de eletroforese de extração plasmidial ilustrando:
controle da extração R23, controle positivo R861 (indicados
respectivamente pelas setas) e amostras humanas
demonstrando a presença de plasmídeos de alto e baixo
peso molecular.
61
Tabela 01 Primers utilizados para detecção de genes de virulência e
resistência.47
Tabela 02 Características dos pacientes dos quais foram obtidas as
amostras UPEC em relação ao sexo do paciente51
Tabela 03 Características dos pacientes dos quais foram obtidas as
amostras UPEC em relação à idade do paciente51
Tabela 04 Características dos pacientes dos quais foram obtidas as
amostras UPEC em relação a localização do paciente51
Tabela 05 Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia
coli uropatogênica isoladas no Hospital Universitário
Antonio Pedro (HUAP), 2007-2008.
53
Tabela 06 Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia
coli uropatogênica isoladas no Laboratório Veterinário
Laborlife. 2007-2008.
55
Tabela 07 Classificação da resistência das amostras UPEC de origem
humana de acordo com as classes de antimicrobianos
testados.
56
Tabela 08 Classificação da resistência das amostras UPEC de origem
canina acordo com as classes de antimicrobianos testados.56
Tabela 09 Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC humanas. 59Tabela 10 Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC caninas. 60Tabela 11 Caracterização das amostras produtoras ESBL através de
sorotipagem e PCR.63
9
Tabela 12 amostras produtoras de α-hemólise fenotípica e presença
do gene HlyA.
65
Tabela 13 Divisão dos grupos de amostras para realização das PCRs. 66Tabela 14 Caracterização fenotípica e genotípica das amostras de
UPEC humanas.69 e 70
Tabela 15 Caracterização fenotípica e genotípica das amostras de
UPEC caninas.71 e 72
10
Lista de Abreviaturas
afa gene codificador de adesina afimbrial
blaCMY gene codificador de resistência a cefalosporinas
blaCTX gene codificador de beta lactamases de espectro estendido mediadas
pela enzima CTX
blashv gene codificador de beta lactamases de espectro estendido mediadas
pela enzima SHV
blaTem gene codificador de beta lactamases de espectro estendido mediadas
pela enzima TEM e aminopenicilinas
cnf gene codificador do fator citotoxico necrozante
CEP comitê de ética em pesquisa
CTI centro de tratamento intensivo
DNA ácido desoxirribonucléico
drfA17 gene codificador de resistência a trimetoprim
E. coli Escherichia coli
EDTA ácido etilenodiamino tetracético
ESBL beta-lactames de espectro estendido
EPEC Escherichia coli enteropatogênica
ExPEC Escherichia coli extra-intestinal
fimH gene codificador de fímbria tipo1
hlyA gene codificador de alfa-hemilisina
iroN sideróforo salmoquelina
HUAP Hospital Universitário Antonio Pedro
ITU Infecção do trato urinário
kb kilobase
kpsMTII gene capsular associado a aderência em cistite
11
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
MDa megadalton
MDR multirresistênte
MIP Depertamento de Microbiologia e Parasitologia
µL microlitro
Ml mililitro
µM micromolar
NR não realizado
PAI Ilhas de patogenicidade
Pap gene codificador do pilus associado a pielonefrite
Pb pares de base
PBS solução salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
Ph potencial de hidrogênio
rmtb gene codificador de resistência a aminoglicosídeos
TBE tampão Tris – Borato - EDTA
TSA agar tripticase soja
TSB caldo tripticase soja
TSI agar ferro três açúcares
UPEC Escherichia coli uropatogênica
VF fatores de virulência
UV ultra-violeta
12
• RESUMO
As infecções no trato urinário (ITU) são frequentemente causadas por cepas de Escherichia coli uropatogênica (UPEC). Este patotipo é a principal causa de ITU na comunidade e um dos mais importantes no ambiente hospitalar. A localização, gravidade e sequelas destas infecções são determinadas pelo equilíbrio entre a virulência bacteriana e a resistência do hospedeiro. A multirresistência bacteriana aos antimicrobianos, que vem ocorrendo de modo crescente tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária, dificulta o combate a estes microrganismos. A produção de beta-lactamases de espectro estendido é um importante mecanismo de resistência em enterobactérias, visto que essas enzimas catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico, impossibilitando sua atividade antimicrobiana. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar comparativamente os perfis de virulência e resistência antimicrobiana de amostras de Escherichia coli isoladas de infecções do trato urinário de humanos e de cães. A resistência a 19 antimicrobianos foi avaliada em amostras de UPEC de origem humana (n=50) e de origem canina (n=50). Adicionalmente, testes fenotípicos de avaliação da produção de ESBL e de hemolisina foram realizados. O perfil genotípico das amostras foi avaliado através de detecção de genes específicos codificadores da virulência (afa, cnf, fimH, hly, kps e pap) e da resistência bacteriana (blaCMY , blaTEM , blaSHV , blaCTX , drf, rmtB) além da avaliação do perfil plasmidial. Pode-se observar multirresistência a antimicrobianos em 94% das amostras de origem humana, assim como em 74% nas de origem canina. Resistência simultânea a mais de 8 classes de antimicrobianos foi detectada em 4% e 10 % das amostras de origem humana e canina, respectivamente. Todas as amostras testadas foram sensíveis ao imipenem. A ocorrência de cepas produtoras de ESBL, detectadas em amostras de origem humana (n=4) e canina (n=3) foi principalmente mediada pela presença das enzimas Tem e Ctx, uma vez que nenhuma das amostras testadas apresentou o gene codificador da enzima Shv. O perfil genético de virulência foi diverso, ocorrendo amostras portadoras de apenas 1 gene de virulência (fimH - 14% das amostras de origem humana e 17% das amostras de origem canina testadas), até amostras que apresentaram todos os genes investigados ( 18% das amostras de origem humana e 17% das amostras de origem canina testadas). Várias destas amostras exibiram simultaneamente um padrão de multirresistência. A presença do gene hlyA foi comumente associada a xiv
XIII
presença dos genes pap e/ou cnf. Os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância do monitoramento de amostras multirresistentes de modo a otimizar as estratégias de tratamento e controle da infecção.
Palavras-chave: E. coli; humanos; cães; virulência; trato urinário;
xv
14
• ABSTRACT
The urinary tract infections are often caused by urophatogenic Escherichia coli (UPEC) strains . This pathotype is the main cause of communitary UTI and one of the most important in the nosocomial infections. The location, severity and sequelae of these infections are determined by the balance between bacterial virulence and resistance of the host. The bacterial multidrug resistance to antibiotics, which is increasingly occurring in both human and veterinary medicine, hinders the fight against these organisms. The production of extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) is an important mechanism of resistance in Enterobacteriaceae, since these enzymes catalyze the hydrolysis of the beta-lactam ring, disabling its antimicrobial activity. This study searched in a comparative way the virulence and antimicrobial resistance profiles of Escherichia coli strains isolated from UTI in humans and dogs. Resistance to 19antimicrobial agents was assessed in samples of UPEC from human (n = 50) and canine origin (n = 50). Additionally, phenotypic tests for assessing the production of ESBLs and hemolysin production were done. The genotypic profile of strains was evaluated by plasmid extraction and by detection of specific virulence (afa, cnf, fimH, hly, kps and pap) and resistance (blaCMY, blaTEM, blaSHV, blaCTX, drf, rmtB) genes. Multiresistance was observed in 94% of strains of human origin, as well as in 74% strains of canine origin. Simultaneous resistance to more than 8 classes of antimicrobials was detected in 4% and 10% of samples of human and canine origin, respectively. All strains were sensitive to imipenem. The occurrence of ESBL-producing strains was detected in samples of human (n = 4) and canine (n = 3) origin and was mainly mediated by the presence of Tem and Ctx enzymes, since none of the strains tested had the blashv gene. The virulence genetic profile was diverse, including strains carrying only one virulence gene (fimH - 14% of human and 17% of canine tested strains) and strains that had all the searched genes (18% of human and 17% of canine tested strains).Several of these strains also exhibited a multiresistance pattern. The presence of hlyA gene was commonly associated with pap and/or cnf genes. The results of this study reinforce the importance of multiresistant strains monitoring to optimize the strategies for treatment and control of infection.
Key words: E. coli; humans; dogs; virulence; urinary tract
xvi
15
1. Introdução
Ao longo do tempo, tem havido uma batalha contínua entre o homem e
microrganismos patogênicos. Diversas patologias têm afetado porções substanciais
da população, provocando significativa morbidade e mortalidade. A partir de meados
do século 20 importantes avanços no desenvolvimento de drogas antibacterianas e
outros meios de controle de infecções, ajudaram a inverter este quadro a favor do
homem. No que diz respeito às infecções bacterianas, a situação melhorou
consideravelmente com a introdução da penicilina nos anos 40. No entanto, as
bactérias responderam a estes avanços manifestando diversas formas de
resistência. Com o aumento do uso de antimicrobianos, houve também um aumento
da complexidade de mecanismos de resistência expostos pelas bactérias. A
resistência bacteriana geralmente resulta em falha no tratamento, o que pode
acarretar em conseqüências graves, inclusive óbito (TENOVER, 2006).
Os microrganismos pertencentes a família Enterobacteriaceae são
importantes patógenos humanos, seja no meio ambiente e em ambientes
hospitalares, onde são causadores dos mais diversos tipos de infecção, tais como
infecções no trato urinário (ITU), pneumonias, septicemias e meningites. Tanto sua
patogenicidade quanto a alta incidência de resistência a antimicrobianos são fatores
preocupantes. (SADER et al, 2001).
16
1.1 Escherichia coli uropatogênica – UPEC
Escherichia coli é uma espécie da família Enterobacteriaceae, apresentando-
se como bastonetes, Gram negativos, facultativamente anaeróbios, móvel ou imóvel,
não-esporulado, capaz de fermentar a glicose com produção de ácido e gás
(SCHROEDER et al., 2002; FRANCO & LANDGRAF, 2002).
Trata-se de uma espécie bacteriana incrivelmente diversificada e com a
capacidade de colonizar e persistir em vários nichos, tanto no ambiente quanto no
hospedeiro. Tanto E. coli quanto outros microrganismos comensais da microbiota
intestinal de mamíferos, freqüentemente formam uma relação simbiótica benéfica
com seu hospedeiro, fornecendo nutrientes, regulação imune e proteção contra
patógenos externos (YAN & POLK, 2004). A maioria das amostras é constituída por
microragnismos comensais, contudo algumas cepas de E. coli podem assumir um
caráter mais patogênico, apresentando a capacidade de causar doenças graves,
tanto gastrintestinais quanto extra-intestinais no hospedeiro (KAPER et al, 2004).
De acordo com seus fatores de virulência e propriedades clinicas, cepas de E.
coli podem ser classificadas como patógenos comensais, intestinais ou extra-
intestinais (ABE et al, 2008). Cepas de E.coli que causam patologias no trato
intestinal são classificadas como E. coli diarreiogênica e cepas de E. coli causadoras
de infecções extra-intestinais, são chamadas de ExPEC – extraintestinal pathogenic
E. coli (KAPER et al, 2004). Dentro de cada um destes grandes grupos há conjuntos
de estirpes conhecidas como “patotipos” que compartilham de fatores de virulência
comuns e obtém semelhantes resultados em sua patogenicidade (MARRS et al,
2005). Vários patotipos de E.coli diarreiogênica dão origem a gastrenterites, mas
raramente causam doença fora do trato intestinal. ExPEC, ao contrário, mantém a
habilidade de existir no intestino sem nenhuma conseqüência, mas tem a
capacidade de se disseminar e colonizar outros nichos do hospedeiro, incluindo o
sangue, sistema nervoso central e o trato urinário, resultando em doença (TRAVIS
et al, 2008).
A capacidade de migrar e colonizar regiões periuretrais torna estas cepas
capazes de causar diversos tipos de infecção, fazendo desta, uma espécie
bacteriana muito versátil em sua patogenicidade (NATARO & KAPER, 1998).
17
Escherichia coli uropatogênica é freqüentemente associada com infecções do
trato urinário (ITU) e bacteremia em crianças e adultos, assim como sepse e
meningite em neonatos (RUSSO & JOHNSON, 2000). Compreendem a muitos
sorotipos, mas em torno de 75% destes pertencem a seis principais sorogrupos: O1,
O4, O6, O16, O18 e O25. Expressam diversos fatores de virulência, dentre os quais
adesinas (fímbrias), toxinas, proteínas fixadoras de ferro, antígenos O e K
(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005).
As infecções do trato urinário acometem principalmente mulheres e crianças
(KAPER et al, 2004). E. coli é um dos mais comuns microrganismos isolados tanto
de infecções simples ou casos mais graves de infecções no trato urinário
(YAMAMOTO, 2007).
Recorrentemente ou reincidivamente, as ITUs são especialmente
problemáticas em alguns indivíduos, pois algumas cepas de UPEC podem agir como
patógenos oportunistas, aproveitando-se do comportamento e susceptibilidade do
hospedeiro, empregando um repertório diversificado de fatores de virulência a fim de
colonizar o tato urinário.
Acredita-se que o principal reservatório de UPEC seja o trato intestinal
humano, responsável por causar ITU a partir de bactérias provenientes da região
retal do próprio indivíduo (RUSSO et al., 1995; JOHNSON & DELAVARI, 2002). Em
alguns casos, a disseminação de um único grupo clonal de cepas pode ocorrer
dentro de uma comunidade através de alimentos contaminados ou outros
consumíveis (MANGES et al, 2001). Além disso, UPECs isoladas de paciente
sexualmente ativas, freqüentemente correspondem a isolados fecais de seus
parceiros, indicando que ITUs podem ser sexualmente transmissíveis (FOXMAN et
al, 2002; JOHSON & DELAVARI, 2002).
Uma vez dentro do aparelho urinário, UPEC coloniza preferencialmente a
bexiga causando cistite, mas pode também ascender até os rins através dos
ureteres causando pielonefrite. Em resposta à violação do trato urinário,
normalmente estéril, por UPEC, são desencadeadas respostas inflamatórias no
hospedeiro, levando a produção de citocinas, afluxo de neutrófilos, esfoliação de
células epiteliais na bexiga e geração de compostos reativos de oxigênio e
18
nitrogênio, juntamente a outros compostos antimicrobianos (BOWER et al, 2005;
MULVEY et al, 2000).
Dados recentes informam a publicação da seqüência genômica de isolados
de cistite e pielonefrite. Apesar de haver muitas semelhanças entre os isolados de
UPEC, características genômicas que são especificamente exclusivas de UPEC
ainda não foram bem identificadas. Comparando estirpes laboratoriais de isolados
de E. coli comensais, UPECs aportam mais genes que codificam virulência a partir
de antígenos capsulares, sistemas de aquisição de ferro, adesinas e toxinas
secretadas. Estes genes são freqüentemente codificados dentro de regiões referidas
como ilhas de patogenicidade (PAI) com conteúdo nucleotídico distinto de resto do
genoma (HACKER & KAPER, 2000, LLOYD et al, 2007).
1.2 Fatores de virulência
O conceito de virulência implica em bactérias que provocam doenças e se
diferem da microbiota endógena. Estas diferenças são denominadas fatores de
virulência. Escherichia coli uropatogênica tem servido como modelo para o estudo
da virulência bacteriana devido a uma série de fatores como: o trato urinário é
normalmente estéril acima do nível uretral e respostas para infecções sediadas
nesta região do hospedeiro podem estar diretamente relacionadas com as
propriedades das bactérias; a infecção está associada a condições clínicas de
gravidades variadas como pielonefrite aguda, cistite aguda e infecção assintomática;
os efeitos a longo prazo de uma infecção no tato urinário variam desde nenhum até
uma cicatriz renal, hipertensão e até mesmo insuficiência renal. Além disso,
algumas propriedades bacterianas contribuem para a virulência, uma vez que
algumas cepas causadoras de infecção têm a capacidade de persistir no trato
urinário mesmo na ausência de defeitos no fluxo urinário. A capacidade de produzir
19
sintomas é uma característica de cepas causadoras de pielonefrite, mas não de
algumas envolvidas em bacteriúria assintomática (SVANBORG-EDEN et al, 1987).
A presença de certos fatores de virulência em cepas de E. coli causando
ITUs, corroboram na designação de UPEC. Dentre estes fatores, pode-se incluir
certos antígenos somáticos (especialmente O1, O2, O4, O6, O7, O15, O18, O25,
O75 E O83), antígenos capsulares (K1 e K2), habilidade de aderir a células
uroepiteliais através de fimbrias (P, S e tipo1) ou adesina afimbrial (afã), presença
de OmpT (outer-membrane protein), produção de toxinas (alfa hemolisina, fator
citotóxico necroSante – CNF1 e toxina serina protease autotransporter – sat) e
produção de sideróforos como aerobactina (ABE et al, 2008). Dois fatores de
virulência muito expressado por E. coli uropatogênica incluem hemolisina e fimbria P
(DREWS et al, 2005).
1.2.1 Adesinas
A colonização do trato urinário depende da capacidade das cepas de UPEC
de se vincular a tecidos e células hospedeiras. A aderência também estimula a
entrada de UPEC nas células epiteliais do hospedeiro, um processo que parece
promover a sobrevivência de UPEC dentro do trato urinário. Os principais fatores de
aderência codificados por UPEC e muitos outros microrganismos, são organelas
filamentosas adesivas conhecidas como pili ou fímbria. As organelas adesivas
comumente elaboradas por UPEC são fímbria tipo 1 , P, S e F1C codificadas pelos
genes fim, pap, sfa e operon foc, respectivamente (BOWER et al, 2005).
Fímbrias e adesinas como as do tipo 1, P (Pap; pilus associado a pielonefrite),
fímbria S (Sfa) mediam o ataque da bactéria às células uroepiteliais no inicio da
infecção (DE GRAAF & MOOI, 1986). Um destes agentes de adesão, os pili tipo1,
uma adesina manose-sensível, tem sido mostrado como o mais comum fator de
virulência expressado em UPEC (GUNTHER et al, 2001). Além disso, pili também
são comumente encontrados tanto entre cepas UPEC como não-UPEC
20
(YAMAMOTO et al, 1995). Já as fímbrias P são as mais bem estudadas e as mais
importantes adesinas em infecções do trato urinário superior. Têm sido
demonstrado que estas adesinas são encontradas em aproximadamente 80% das
cepas de E.coli provenientes de casos de pielonefrite (YAMAMOTO et al, 1995).
1.2.2 Toxinas
A utilização da secreção de toxinas por bactérias patogênicas é um
mecanismo bem reconhecido. A maior parte das UPEC não possuem sistema de
secreção tipo III, que alguns patógenos usam para injetar moléculas efetoras em
células hospedeiras, ao invés disso, costumas utilizar os sistemas de secreção tipo I
e tipo IV (HENDERSON et al., 2004).
A alfa-hemolisina (Hly-A) e o fator citotoxico necrozante (CNF1) são duas
toxinas bem conhecidas apontadas como as causadoras diretas de citoxicidade nos
tecidos do hospedeiro (KEANE et al, 1987; DE RYCKE et al, 1987). A alfa-
hemolisina é codificada por 50% das amostras de UPEC e sua expressão está
associada ao aumento da gravidade clínica em pacientes com ITU (JOHNSON,
1991; MARRS et al, 2005). HlyA é uma toxina cálcio-dependente que forma poros na
célula hospedeira, levando à lise celular quando níveis altos são atingidos. Está
geralmente localizada em ilhas de patogenicidade (PAI) de UPEC junto a fimbria P
e/ou CNF1 (HACKER & KAPER, 2000). O fator citotoxico necrosante é conhecido
por facilitar a sobrevivência de UPEC durante a resposta inflamatória aguda,
modulando a função de leucócitos polimorfonucleares, incluindo a regulação da
fagocitose (DAVIS et al, 2005). Alem disso, CNF tem sido demonstrado capaz de
matar as células uroepiteliais através da apoptose (MILLS et al, 2000).
21
1.2.3 Sideróforos e outros fatores
Sideróforos e outros fatores dependentes do ferro são essenciais para o
crescimento bacteriano. Estes sistemas de captação de ferro contribuem para
resistência bacteriana, sobrevivência e crescimento no hospedeiro. IroN é um
sideróforo essencial para o crescimento bacteriano, o mesmo tem sido mostrado por
ser mais prevalente em isolados de E. coli proveniente de ITU ou bacteremia do que
em isolados fecais (RUSSO et al, 1999). Alem deste, outros fatores como Cápsula
do grupo II (KpsMTII) e proteína de membrana externa (OmpT) também são
importantes na patogênese das ITU’s (BAUER et al, 2002; KANAMARU et al, 2003).
1.3 Antimicrobianos e Aquisição da resistência
A maioria dos agentes antimicrobianos utilizados atualmente na medicina
humana e veterinária são substâncias de baixo peso molecular que podem inibir o
crescimento de bactérias ou até mesmo matá-las, mesmo em baixas concentrações.
Os primeiros antimicrobianos utilizaram substâncias ou parentes próximos de
substâncias que eram produzidas por fungos ou bactérias do solo e forneceram uma
vantagem seletiva aos antimicrobianos produzidos na luta por recursos e nichos
ecológicos. Assim, bactérias têm entrado em contato com substâncias
antimicrobianas há um longo tempo, antes dos primeiros agentes antimicrobianos
serem introduzidos na prática clínica (SCHWARZ & CHASLUS-DANCLA, 2001).
O uso incorreto de antimicrobianos associado à seleção natural dos
microrganismos, provavelmente resultou no fenômeno da resistência, tanto na
medicina humana quanto na veterinária. A resistência a drogas está relacionada
22
aouso excessivo de antibióticos e às aplicações sub-terapêuticas de antimicrobianos
para a prevenção de doenças e para a promoção do crescimento e da eficiência
alimentar em animais de produção (MENG et al, 1998).
A pressão seletiva sobre as cepas bacterianas, favorece a preservação das
cepas que sofrem mutação genética para a resistência em relação às cepas
sensíveis. A disseminação desses agentes ocorre, particularmente, quando as
medidas básicas no controle das infecções não são respeitadas (PADOVEZE &
OLIVEIRA, 2000).
A aquisição de resistência pode ser cromossômica (aquisição de genes ou
mutações) e extra-cromossômica (plasmídios etransposons). Um fator agravante é a
existência, em muitas espécies de bactérias, de plasmídios transportando genes
codificando resistência a drogas – plasmídios R ou fatores R - e que podem, através
do fenômeno da conjugação bacteriana, se autotransferir entre bactérias da mesma
espécie, de espécies relacionadas e mesmo de diferentes gêneros. A mobilidade de
tais genes funciona como um mecanismo amplificador do fenômeno da resistência a
antibióticos. A existência de tais genes não somente permite como favorece a
sobrevivência e a multiplicação de bactérias patogênicas durante a antibioticoterapia
(KONEMAN et al, 2001)
Depois da introdução das sulfonamidas na metade até o final da década de
30 e da penicilina no início da década de 40, as companhias farmacêuticas
introduziram uma série de antimicrobianos para combater as infecções bacterianas,
cujo agente etiológico mostrava-se resistente aos primeiros antimicrobianos
utilizados. Estes antimicrobianos incluíam, no final da década de 50, as penicilinas
semi-sintéticas para tratar Staphylococcus aureus resistente à penicilina e, nas
décadas de 60 até 80, cefalosporinas e aminoglicosídeos para microrganismos em
infecções hospitalares, principalmente bacilos Gram negativos. (REESE et al, 2002).
As enterobactérias possuem comumente um único e grande plasmídio R que
codifica para a resistência a vários antibióticos (KONEMAN et al, 2001).
Antimicrobianos tais como trimetoprim-sulfametoxazol, fluoroquinolonas e
Cefalosporinas de terceira geração geralmente são recomendados no tratamento de
infecções provocadas por E. coli, com exceção das amostras produtoras de toxina
Shiga. (SCHROEDER et al, 2002).
23
Diversos microrganismos patogênicos podem agora desafiar antimicrobianos
aos quais eram previamente susceptíveis. Há diversos exemplos: resistência à
meticilina entre Staphylococcus aureus e espécies coagulase-negativas, resistência
à terceira geração de cefalosporinas entre Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e
Enterobacter sp., resistência ao imipenem, às quinolonas e aos aminoglicosídeos
entre Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, e espécies de
Acinetobacter. Além disso, as bactérias Gram negativas estão desenvolvendo uma
gama sempre maior de mecanismos de resistência. Um dos mecanismos mais
relatados e potencialmente importantes é emergência de cepas produtoras de beta-
lactamases de amplo espectro entre Klebsiella spp. e Escherichia coli,
possivelmente relacionados à pressão seletiva a partir do uso generalizado de
cefalosporinas de última geração. A descoberta de que cepas de Neisseria
gonorrhoeae e de Haemophilus influenzae haviam adquirido plasmídeos com
codificação de β-lactamase demonstrou que a resistência não era apenas um
fenômeno restrito aos patógenos das infecções hospitalares (MURRAY, 1992).
Estudos recentes sugeriram que o uso de tetraciclinas, drogas à base de
sulfas, (GUERRA et al, 2006) cefalosporinas e penicilinas parecem ser os maiores
responsáveis pelo aparecimento e disseminação de amostras de E. coli resistentes
aos antimicrobianos. Porém, existe uma grande escassez de informações existentes
a respeito de amostras de E. coli resistentes a partir de fontes não hospitalares,
especialmente a partir de fontes animais (SCHROEDER et al, 2002).
Diversos motivos tornam a resistência bacteriana um motivo de grande
interesse da medicina humana e veterinária. Essa resistência freqüentemente
resulta em falha do tratamento, a qual pode ter graves conseqüências,
particularmente em pacientes críticos. A terapia antibacteriana empírica inadequada,
definida como o uso inicial de um agente antibacteriano ao qual o patógeno
bacteriano responsável pela infecção não é sensível, tem sido associada com o
aumento da taxa de mortalidade em pacientes com septicemia devido a amostras
resistentes de Escherichia coli.
A resistência aos antimicrobianos é também um problema para a saúde
animal. A monitorização da resistência restrita exclusivamente a patógenos animais
(exemplo, Moraxella bovis, Actinobacillus pleuropneumoniae e Pasteurella
multocida) é pobre quando comparada com a fiscalização de enteropatógenos
24
zoonóticos. Laboratórios de diagnóstico veterinário tipicamente analisam amostras
clínicas de forma limitada, muitas vezes sem identificá-las (MCEWEN & FEDORKA-
CRAY, 2002).
O uso de agentes antimicrobianos tanto em animais como em humanos de
forma abusiva resultou em uma resistência emergente e na disseminação desses
patógenos multirresistentes, que podem ser transmitidos por animais a seres
humanos através da cadeia alimentar e pelo crescente estreitamento de relações
entre humanos e animais de companhia. (WEGENER, 2003)
Na atualidade, a resistência aos antimicrobianos constitui um dos maiores
desafios à saúde pública (BYARUGABA, 2004). O entendimento das propriedades
farmacodinâmicas dos agentes antimicrobianos proporciona uma melhor escolha,
adaptando-os corretamente à situação clínica. Deve-se ainda selecionar agentes
que atingem uma concentração inibitória mínima adequada a fim de reduzir o
desenvolvimento da resistência (WISE, 2003), posto que atualmente as doenças
bacterianas ainda são tratáveis em sua maioria, contudo com a progressão da
resistência, o conceito de doença bacteriana não tratável pode tornar-se uma
realidade (REESE et al., 2002).
Determinados eventos, capazez de alterar o conteúdo genético das
bactérias, podem ser extrínsecos ou intrínsecos. Mecanismos intrínsecos são
mutações pontuais ou amplificações genéticas enquanto, a transferência horizontal
de genes de resistência entre bactérias da mesma espécie ou não, através de
transposons, integrons ou plasmídeos são mecanismos adquiridos, o resultado
desse conjunto de modificações genéticas correspondem à introdução de novos
antibióticos, gerando determinantes de resistência que são freqüentemente
modificados (LIVERMORE, 2004). Uma vez isso tenha acontecido, a restrição no
uso dos antimicrobianos não resultaria na queda da resistência.
1.3.1 Resistência Intrínseca aos Antimicrobianos
25
A resistência aos antimicrobianos é considerada intrínseca quando espécies
são naturalmente resistentes a determinados antimicrobianos, sem que,
essencialmente, tenha havido alguma mutação genética, transferência de material
cromossômico ou pressão seletiva (WILLIAMSON et al, 1983). Podemos observar a
resistência intrínseca em diversos microrganismos, como por exemplo, a maioria das
enterobactérias são intrinsecamente resistentes à eritromicina, enquanto a maioria
dos estreptococos são resistentes aos aminoglicosídeos.
Um importante determinante de resistência intrínseca nos microrganismos é a
ausência do sítio de ligação do antimicrobiano. Penicilinas e cefalosporinas inibem
as enzimas transpeptidases, as quais estão envolvidas na polimerização dos
peptídeoglicanos durante a biossíntese da parece celular bacteriana. A membrana
externa dos microrganismos gram negativos, composta por uma densa camada
lipopolissacarídica, é um forte determinante de resistência intrínseca, pois diversos
antimicrobianos são incapazes de penetrar e atingir seu alvo. Esse mecanismo é a
base da resistência intrínseca das enterobactérias a eritromicina e também da P.
aeruginosa a diversos antimicrobianos (WEINSTEIN et al, 1980).
1.3.2 Resistência Adquirida aos Antimicrobianos
A resistência adquirida aos antimicrobianos tem sido atualmente, um
problema detectado em vários ambientes aquáticos, incluindo rios, esgosto, água
potável (OZGUMUS et al, 2007). O aumento da introdução de agentes
antimicrobianos através da terapêutica médica, agricultura e pecuária animal têm
resultado em pressões seletivas sobre as populações bacterianas (COL &
O'CONNER, 1987). A aquisição e transferência da resistência aos antimicrobianos e
fatores de virulência por bactérias através da transferência horizontal da resistência,
plasmídeos R, transposons, e integrons são problemas crescentes em doenças
infecciosas. Os integrons são capazes de mobilizar e integrar-se a cassetes gênicos
26
codificando determinantes da resistência aos antibióticos, como resistência a
trimetoprim, aminoglicosídeos, clorafenicol ou tetraciclinas. Estudos anteriores
demonstram que Integrons de classe I e/ou classe II foram relatados em isolados
clínicos da família Enterobacteriaceae (LEVERSTEIN-VAN HALL et al., 2001), em
bactérias alimentares (SUNDE, 2005) e no ambiente (ROE et al, 2003).
Além disso, outra condição crescente nos dias atuais e o uso abusivo desses
medicamentos, de forma inadequada e excessiva. O uso por longo prazo também é
outro fator importante por oferecer um risco mais elevado para a seleção de cepas
resistentes do que o uso por curto prazo ou a profilaxia (LIVERMORE, 1995).
Outros fatores que também são importantes para a disseminação da
resistência são os aspectos ambientais e sócio-econômicos, que também
contribuem para uma pressão seletiva, reforçando a capacidade da bactéria de
desenvolver resistência, pois tais condições estimulam mudanças no
comportamento bacteriano a fim de garantir sua sobrevivência.
1.3.3 Genética da resistência
Há diferentes mecanismos e caminhos através dos quais as bactérias podem
trocar informação genética. Plasmídeos, transposons e cassetes gênicos/ integrons
são distribuídos verticalmente durante a divisão da célula hospedeira, mas também
podem ser transferidos horizontalmente entre bactérias da mesma espécie ou
gênero e de espécies ou gêneros diferentes através de transdução, conjugação ou
da transformação (SCHWARZ & CHASLUS-DANCLA, 2001).
A transdução é um processo de transferência mediado por um bacteriófago,
também referidos como “ vírus-bacterianos”, que infectam bactérias por injeção de
seu DNA, que pode direcionar a produção de novas partículas na célula hospedeira
incluindo a expressão de genes, ou pode se integrar ao DNA cromossômico da
célula hospedeira e permanecer em estado inativo. A conjugação descreve a
autotransferência de um plasmídeo conjugativo ou um transposon de uma célula
27
doadora para uma célula receptora, e o contato entre o doador e o receptor é um
dos principais requisitos para a conjugação. A transformação descreve a
transferência de DNA livre para células competentes, sendo a principal forma de
introduzir plasmídeos em um novo hospedeiro sob condições in vitro. Já sob
condições in vivo, a transformação desempenha apenas um papel limitado na
transferência de genes de resistência (BENNETT, 1995).
Nem todos os genes de resistência que podem ser transferidos entre bactérias
são expressos ou até mesmo mantidos. Na realidade, parece haver alguns limites na
gama de genes de resistência que podem ser reunidos e expressos nas bactérias.
Entretanto, a capacidade das mesmas adquirirem genes de resistência de outros
microrganismos - incluindo aqueles que constituem a microbiota residente dos seres
humanos e dos animais - sob pressão seletiva do uso de agentes antimicrobianos,
não deve ser subestimada (LEUNG et al, 1997).
Outra forma de aquisição de resistência são as mutações, nas quais erros
podem levar a uma parcial ou completa deleção de genes individuais. Como
resultado, os alvos dos antimicrobianos podem ser alterados, drogas podem ser
inativadas e bombas de efluxo podem ser expressas ou suprimidas e o sistema de
difusão da droga (porinas e transportes ativos) pode ser perdido ou ativado. Genes
de resistência ou seus repressores podem também ser expressos ou suprimidos
pela aquisição de seqüências de inserção (LIVERMORE, 2004). Essas mutações
nos genes de resistência podem aumentar o espectro de atividade, como ocorre nas
ESBLs.
1.3.4 Bioquímica da resistência
Diversos mecanismos bioquímicos podem levar à resistência bacteriana,
dentre eles as bombas de efluxo, as enzimas modificadoras, as alterações no sítio
de ação dos antimicrobianos e as alterações na permeabilidade da membrana.
28
Algumas proteínas transportadoras encontradas tanto em bactérias Gram
negativas quanto em bactérias gram positivas, estão envolvidas na extrusão de
substratos tóxicos do interior da célula para o meio externo, sendo conhecidas como
bombas de efluxo. Estas podem ser específicas para um substrato ou podem
transportar uma gama de compostos estruturalmente diferentes (incluindo
antimicrobianos de diversas classes) podendo ser associadas a multirresistênciaàs
drogas (MDR). Embora os genes que codifiquem bombas de efluxo possam ser
encontrados em plasmídeos, a presença destes no cromossomo fornece à bactéria
um mecanismo intrínseco que permite a sua sobrevivência em ambientes hostis
como a presença de antimicrobianos (WEBBER & PIDDOCK, 2003).
A inativação de antimicrobianos é ocasionada por enzimas modificadoras que
promovem a inativação dos mesmos. Com isso, os antimicrobianos têm sua ação
neutralizada não exercendo sua função sobre os microrganismos alvo. Um
importante exemplo de enzimas modificadoras de antimicrobianos são as Beta-
lactamases de espectro estendido e as cloranfenicol acetilases. As beta-lactamases
de espectro estendido inativam os antimicrobianos β-lactâmicos através de hidrólise
enquanto as cloranfenicol acetilases inativam o cloranfenicol por acetilação
(TRABULSI & ALTERTHUM, 2002).
Tipicamente, o antimicrobiano tem como alvo um componente celular
bacteriano o qual é chamado sítio de ação. Alterações nos sítios de ação ocasionam
uma redução da eficácia do antimicrobiano sobre o microrganismo (WALSH et al,
1996).
Através do mecanismo de alteração na permeabilidade da membrana a
entrada do antimicrobiano na célula bacteriana é impedida, seja por uma mudança
na composição da membrana celular, ou por estruturas específicas da mesma. As
bactérias Gram negativas possuem uma membrana externa que promove uma
barreira efetiva contra pequenas moléculas, como os antimicrobianos. As bactérias
que possuem essa segunda membrana devem possuir um mecanismo que permita
a entrada dos nutrientes necessários. Para esse propósito, essas membranas
possuem proteínas chamadas de porinas, as quais produzem canais aquosos não
específicos de difusão através da membrana, provocando a saída dos
antimicrobianos da célula bacteriana. Esse tipo de mecanismo de resistência parece
ser o único mecanismo natural ou intrínseco que as bactérias apresentam. Contudo,
29
a perda de porinas não é um mecanismo eficiente para manter os antimicrobianos
do lado de fora da célula. Em Escherichia coli, por exemplo, somente aumenta a
MIC da tetraciclina em cinqüenta por cento, o que pode representar resistência
(NIKAIDO, 1994).
1.4 Multirresistência Bacteriana
A multirresistência normalmente resulta da acumulação de mutações
múltiplas e/ou presença de genes de resistência (nos integrons), mas crescimento
em sítios específicos (biofilmes) e mutações únicas (alterações na permeabilidade
da membrana ou expressão de sistemas de efluxo) também podem promover
multirresistência (POOLE, 2003).
Amostras multirresistentes já foram relatadas em diversos países. Grande
parte das amostras isoladas apresentava, concomitantemente, resistência à
tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, estreptomicina, fluoroquinolonas e trimetoprim-
sulfametoxazol (CHANG et al, 2000).
Talvez, o maior problema observado em amostras de E. coli multirresistentes
seja a disseminação da resistência às quinolonas e às fluoroquinolonas. Estudos
moleculares revelam que todas as amostras resistentes às quinolonas apresentam
mutações nos genes gyrA e parC, responsáveis pela codificação das enzimas DNA
girase e topoisomerase IV, respectivamente, mas pode haver mutações nos genes
gyrB e parE, porém com menor frequencia. Há ainda outros mecanismos de
resistência as fluoroquinolonas, como diminuição da produção de proteínas porinas
e a expressão de genes que codificam bombas de efluxo (YANG et al, 2004). A
presença de integrons, também está associada a multirresistência em bactérias
entéricas. Estudos relatam a presença de diversos integrons em amostras
multirresistentes de E. coli. Esses integrons continham genes de resistência aos
aminoglicosídeos, trimetoprim e β-lactâmicos (CHANG et al, 2000; YANG et al,
2004).
30
Devido à ausência de regras que regulamentem o uso correto dos
antimicrobianos, tanto na Medicina humana quanto na Medicina Veterinária na
maioria dos países em desenvolvimento, o uso de medicamentos se torna
inapropriado e abusivo, facilita a disseminação de microrganismos multirresistentes
acarretando conseqüências graves aos seres humanos e aos animais (YANG et al,
2004).
Torna-se fundamental a conscientização de todos sobre este problema e a
difusão dos conceitos de controle da resistência, que consistem no uso mais
cauteloso dos antimicrobianos em seres humanos e animais, dando abordagens
adequadas de orientação, programas de controle de antimicrobianos, administração
menos prolongada possível e uso de agentes de menor espectro. É importante
ressaltar a importância de diagnósticos mais rápidos e tratamentos imediatos com
antimicrobianos eficazes.
Em diversos países muitas estratégias tem sido utilizadas afim de otimizar o
controle de uso dos antimicrobianos, limitar a propagação de microrganismos
resistentes e tratar as infecções com o mínimo montante de antibióticos possível pra
efeito de cura. Esses programas envolvem métodos em comum, dentre os
quais:vigilância do uso de antibióticos e taxas de resistência, orientações para
otimizar o uso de antibióticos em tratamentos, educação de profissionais e da
população, prevenção e controle de infecção, com imunização, participação
financeira de indústrias na mobilização de recursos e desenvolvimento de
medicamentos, regulamentação de questões centrais, com restrição a prescrições e
à publicidade, auditoria com avaliação das intervenções, do cumprimento e feed
back médico e cooperação internacional (RAGHUNATH, 2008).
1.5 ESBL - Beta-lactamases de espectro estendido
31
Dentre as bactérias gram negativas, a produção de beta-lactamases de
espectro estendido é o mais importante mecanismo de resistência contra os agentes
beta- lactâmicos (SANDERS & SANDERS, 1992). As beta-lactamases são enzimas
que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico, impossibilitando, assim, a sua
atividade antimicrobiana. A prevalência crescente de amostras produtoras de beta-
lactamases de espectro estendido, ESBL, representa um impacto significativo na
prescrição de antimicrobianos, considerando-se que a produção dessas enzimas
constitui o principal mecanismo de resistência das enterobactérias (SADER et al,
2002). Membros da família enterobacteriaceae comumente expressam Beta-
lactamases codificadas por plasmídeos que conferem resistência às penicilinas, mas
não às cefalosporinas de amplo espectro (BUSH et al, 1995; LIVERMORE, 1995).
Pelo uso extensivo de antimicrobianos beta-lactâmicos de amplo espectro na
década de 1980, um novo grupo de enzimas logo nomeadas de Beta-lactamases de
espectro estendido (ESBL) foi detectado em cepas de Serratia marcescens e
Klebsiella pneumoniae na Alemanha (KNOTHE Et al, 2003). Mais tarde, essas
enzimas foram classificadas em dois grande grupos, não relacionados entre si,
embora algumas enzimas dos dois grupos, ajam sobre o mesmo substrato (o
antibiótico Beta-lactâmico), ligando-se a estes antibióticos em sítios completamente
distintos. Este grupo de enzimas foi primeiramente referido como resultado de genes
presentes em plasmídeos, como o TEM-1, TEM-2 e SHV-1, os quais sofreram
mutações semelhantes, resultando em substituições no aminoácido terminal e no
sítio ativo dessas enzimas. Essas mutações causaram modificações estruturais no
sítio ativo, ocasionando acréscimo de sua ação sobre as cefalosporinas. Como
resultado, sua ação não se restringe apenas às penicilinas e cefalosporinas de
primeira e segunda geração mas, também, sobre as cefalosporinas de amplo
espectro (oxiamino-cefalosporinas)( Cefotaxima, Ceftazidima, Ceftriaxona) e
monobactâmicos (Aztreonam). Os plasmídios que carregam os genes que codificam
a produção de ESBL geralmente contêm genes de resistência a outros
antimicrobianos, como aminoglicosídeos, sulfonamidas, tetraciclinas e cloranfenicol.
(SADER et al, 2002; STURENBURG & MACK, 2003).
As ESBLs podem ser bloqueadas por inibidores de Beta-lactamases como o
clavulanato, sulbactam e tazobactam. Contudo, são ineficazes contra a classe C
dessas enzimas, que também apresentam resistência a drogas não Beta-lactâmicas,
32
causando um grande problema na terapêutica a ser utilizada nesses casos. Apesar
de nos últimos anos, ter havido desenvolvimento de inúmeros fármacos com o
propósito de possuírem resistência à ação hidrolítica das Beta-lactamases, a
utilização indiscriminada desses fármacos também têm favorecido a seleção de
bactérias produtoras de ESBL (MEDEIROS, 1997).
A primeira mutação em ESBL foi a enzima denominada SHV-2, encontrada
em uma cepa de Klebsiella pneumoniae, na Alemanha em 1983 (LIVERMORE,
1995) e a primeira ESBL mutante identificada um ano depois em um hospital
universitário na França, a qual foi posteriormente caracterizada molecularmente
como TEM / CTX (SANDERS et al, 2000). A partir desses achados hospitalares, o
fenômeno tem se tornado cada vez mais comum, inclusive em ambientes
ambulatoriais. Além disso, ESBLs já foram encontradas em diversos gêneros de
enterobactérias, como em E. coli.
Atualmente as ESBLs representam o maior grupo de beta-lactamases
estudado mundialmente e têm sido motivo de extensivas investigações
microbiológicas, bioquímicas, genéticas e epidemiológicas (BUSH et al, 1995; REIS
et al, 1998; SADER & JONES, 1994)
As ESBL “clássicas” são enzimas codificadas por plasmídeos, como as
famílias: Temoniera (TEM), Sulfidril variável (SHV) e oxacilina (OXA). Dentro dessas
famílias maiores estão incluídas as duas primeira variantes de Beta-lactamases
identificadas (SIROT et al,1987). Embora essas variantes ainda se mantêm nos dias
atuais como as mais isoladas, nos últimos anos houve uma explosão no
aparecimento de outras ESBLs (CTX-M, PER, VEB, GES, TLA e BES). Como
resultado disso, mais de 370 variantes são conhecidas atualmente. (STURENBURB
et al, 2005)
As ESBLs têm mostrado variável expressão fenotípica. Enquanto uma ESBL
pode ter maior capacidade para hidrolisar drogas como a ceftriaxona ou a
cefotaxima, outra pode ter maior capacidade para hidrolisar a ceftazidima ou
aztreonam. A detecção laboratorial de cepas produtoras de ESBL é muito
desafiadora, pois são necessários múltiplos substratos de detecção específicos
(BUSH et al, 1995) De modo geral, os métodos de triagem se baseiam no padrão de
sensibilidade das amostras. Testes especiais têm sido designados especificamente
33
para a detecção e/ou confirmação da produção de ESBL. Entre estes testes estão o
teste de disco-difusão utilizando pontos de corte (breakpoints) indicativos da
produção de ESBL estabelecidos pelo CLSI, o teste de adição de ácido clavulânico
Oxoid (Basingstoke, Inglaterra) e o Etest ESBL Screen (AB Biodisk, Solna, Suécia).
Alguns relatos mostram que o ácido clavulânico é um inibidor mais potente do que
sulbactam para enzimas TEM e SHV com espectro ampliado. Desta maneira, o
ácido clavulânico é o composto mais utilizado nestes testes. (SADER et al, 2003).
A produção de ESBLs tem sido um problema, principalmente em K.
pneumoniae e, em menor grau em E. coli. Porém ESBLs foram encontradas em
Citrobacter diversus, C. freundii, E. cloacae. Enterobacter aerogenes, Proteus
mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, em várias espécies de Salmonella e Serratia
marcescens bem como K. oxytoca (SIROT et al, 1992, CHANAL et al, 1996).
Os microrganismos produtores de ESBL são usualmente encontrados no
ambiente hospitalar, principalmente em centros de tratamento intensivo (CTI).
Embora seu aparecimento venha aumentando em ambientes cirúrgicos, pediátricos,
neonatais, além dos oncológicos. Alguns estudos têm demonstrado a exitência de
fatores de risco independentes entre si, associados a produção de ESBL, dentre
eles destacam-se: o tempo de permanência do paciente em ambientes hospitalares,
principalmente em CTI; casos de hospitalização anterior, onde foram administrados
diversos antimicrobianos para erradicação de infecção (principalmente
cefalosporinas de amplo espectro); além da utilização procedimentos invasivos,
intubações e doenças severas (DALMARCO et al, 2006).
1.6 Infecção Hospitalar
A Infecção Hospitalar constitui um sério problema de saúde pública,
principalmente porque contribui para o aumento da taxa de morbidade e mortalidade
de pacientes hospitalizados, além de aumentar o tempo de internação destes
pacientes e conseqüentemente o custo do tratamento (JARVIS, 1987).
34
Pode ser considerada infecção hospitalar, toda aquela adquirida após
admissão do paciente, e que se manifesta durante a internação ou após a alta,
quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares.
Para ser considerada hospitalar a infecção: não deve estar presente ou em
incubação por ocasião da admissão; se estiver em incubação à admissão, deve
estar relacionada a prévia hospitalização na mesma instituição; se estiver presente
na admissão, deve estar temporalmente associada com prévia hospitalização ou a
um procedimento realizado em instituição de saúde. Estas infecções são geralmente
provocadas pela própria microbiota bacteriana humana, que se desequilibra com os
mecanismos de defesa imunológica em decorrência da doença, dos procedimentos
invasivos e do contato com a microbiota hospitalar (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA
SAÚDE, 2007).
Dentre as ExPEC, cepas de UPEC são mais comumente associadas a
doenças humanas. Essas bactérias são a principal causa de ITU na comunidade e
uma grande porção de ITU hospitalar, representando uma porção substancial nos
custos médicos e em morbidade mundial (FOXMAN, 2003).
A ITU representa o principal tipo de infecção hospitalar e é uma das principais
causas de consulta na prática médica, com cerca de 40% dos processos infecciosos
nosocomiais e a grande maioria das ITUs são causadas por bactérias (TORTORA et
al, 2002). O estabelecimento da etiologia das ITU tem demonstrado que a
enterobactéria Escherichia coli permanece o uropatógeno predominantemente
isolado em comunidades com casos de infecções agudas, seguida da prevalência
de Klebsiella, Enterobacter e Proteus (GRUDE et al, 2001).
É importante conhecer o modo de disseminação das bactérias
multirresistentes, e isto pode ser feito através de uma avaliação microbiológica.
Quando se sabe o modo de disseminação da bactéria, podem ser tomadas medidas
de controle mais adequadas (RAVANELLO, 2003). Merecem atenção especial os
CTI´s que são considerados epicentros de resistência bacteriana, sendo a principal
fonte de surtos de bactérias multirresistentes (TEIXEIRA et al, 2004).
Existem várias medidas para minimizar a infecção hospitalar e o surgimento
de resistência a antimicrobianos, mas as duas medidas fundamentais são: medidas
de barreira e higiene, para evitar a transmissão de bactérias de um paciente para o
35
outro e o uso adequado de antibióticos para dificultar o surgimento de
microrganismos multirresistentes (SADER, 2003). A maioria dos trabalhos acerca do
isolamento e identificação de cepas bacterianas multirresistentes foi realizada em
pacientes hospitalizados, entretanto, acredita-se que microrganismos resistentes
possam ser agentes de infecções de trato urinário, também na comunidade.
1.7 Epidemiologia molecular
Os mecanismos genéticos envolvidos na resistência são diversos e sua
disseminação é possível graça a alta eficiência de sistemas de transferência de
elementos genéticos móveis (SCHWARZ & CHASLUS-DANCIS, 2001) Nos últimos
anos, tem sido estabelecida a importância dos Integrons – sistemas móveis de
expressão genética - na disseminação de resistência em E.coli (GUERRA et al,
2003; WHITE et al, 2002). A caracterização destes mecanismos de resistência
proporciona informações adicionais acerca da importância epidemiológica da
resistência antimicrobiana, uma vez que estudos anteriores já demonstraram que foi
encontrada 76% de resistência em isolados de E.coli estudados, com uma
prevalência de 72% de multirresistência (GUERRA et al, 2006).
Métodos genotípicos como a determinação do perfil plasmidial, ribotipagem,
avaliação do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP), amplificação de
segmentos do DNA utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a análise
da fragmentação do DNA, após digestão com enzimas de restrição, através de
eletroforese em gel de campo pulsado (Pulsed-field Gel Electrophoresis) são
recomendados para tipagem de microrganismos com propósitos epidemiológicos.
Estes métodos são menos sujeitos a variações e apresentam maior poder
discriminatório e reprodutibilidade, e em alguns casos permitem estabelecimento de
banco de dados para caracterização dos microrganismos (BELKUM et al, 2001).
A utilização de técnicas moleculares é de relevante importância nos estudos
de amostras de Enterobactérias, uma vez que permitem estabelecer o grau de
36
similaridade entre as mesmas, possibilitando a caracterização de surtos de infecção,
a detecção de possíveis fontes de transmissão e os aspectos epidemiológicos de
disseminação.
37
2. Objetivo Geral
Caracterizar comparativamente os perfis de virulência e resistência
antimicrobiana de amostras de Escherichia coli isoladas de infecções do trato
urinário de humanos e de cães.
2.1 Objetivos Específicos
Determinar diferenças fenotípicas no perfil de resistência bacteriana entre
amostras de ITU humanas e caninas.
Comparar a ocorrência de ITU por UPEC em amostras provenientes de
pacientes ambulatoriais e de pacientes internados.
Detectar a produção de beta-lactamases de espectro estendido em amostras
de UPEC de origem humana e de origem canina.
38
Identificar a presença de genes de virulência e resistência em amostras de
UPEC isoladas de humanos e de cães.
Comparar o perfil de virulência e de resistência bacteriana em amostras de
origem humana e canina.
39
3. Material e Métodos
3.1 Amostras clínicas
Foram estudadas 100 amostras de Escherichia coli isoladas de infecção
urinária de humanos e de cães. As amostras humanas de pacientes internados e
ambulatoriais (n=50) foram oriundas de Hospital Universitário Antônio Pedro,
Niterói/RJ, no período de dezembro de 2007 a agosto de 2008. As amostras caninas
(n=50) foram fornecidas pelo Laboratório Veterinário Laborlife no mesmo período.
Este projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Medicina / UFF e aprovado para utilização das amostras humanas
(CEP – CAAE- 0003.0.258.000-08).
40
3.2 Confirmação da pureza e identificação das amostras
As amostras foram semeadas e incubadas a 35ºC durante 24 horas em Ágar
Cled. Após o crescimento, as colônias típicas foram semeadas nos meios Ágar TSI -
Triplo Açúcar e Ferro (HIMEDIA-Munbai, Índia), Ágar SIM - Sulfato Indol Motilidade,
e Ágar Citrato de Simmons (MERCK-Darmstadt, Alemanha) para a confirmação
bioquímica correspondente à espécie: fermentação da glicose (com produção de
gás) e lactose, ausência de produção de H2S, produção de indol, mobilidade e
ausência de utilização de citrato..
3.3 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Amostras clínicas de humanos e cães foram avaliadas pelo método de
difusão em disco para testar a sensibilidade aos antimicrobianos, utilizando-se
critérios aprovados pelo CLSI. A determinação da susceptibilidade bacteriana a um
agente patogênico, é particularmente importante na seleção do antimicrobiano mais
apropriado ao tratamento de determinada doença. O teste de Difusão em Disco ou
antibiograma constitui um dos métodos utilizados com este objetivo. Este método
consiste na colocação de discos com concentrações conhecidas de determinado
antimicrobiano, na superfície de uma placa contendo um meio sólido apropriado
(Agar Mueller Hinton) e previamente inoculado com o microrganismo cuja
susceptibilidade se pretende testar. O antimicrobiano difunde-se a partir do disco
para o meio, formando um gradiente de concentração que decresce desde o
perímetro do disco até distâncias mais elevadas. Os microrganismos multiplicam-se
exponencialmente em toda a superfície da placa, à exceção das zonas à volta do
disco impregnado do antimicrobiano ao qual são sensíveis. As zonas em que o seu
crescimento é inibido ou a sua morte são provocadas pela concentração do
antimicrobiano, tornam-se visíveis através de uma zona clara que rodeia o disco e a
41
que se dá o nome de halo de inibição ou zona de inibição. Foram utilizados discos
comerciais de acordo com as normas de procedimento do CLSI, 2007. Os
antimicrobianos testados de uso humano foram Ácido Nalidíxico, Imipenem,
Cefepime, Cefoxitina, Ceftriaxona, Cefalotina, Amoxilina-ácido-clavulânico,
Aztreonama, Ampicilina, Sulfametoxazol, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Amicacina,
Gentamicina, Tobramicina e Tetraciclina. Os antimicrobianos testados de uso
exclusivamente veterinário serão Enrofloxacina, Florfenicol e Ceftiofur (SENSIFAR-
São Paulo, Brasil). As amostras utilizadas como controle dos TSAs foram E. coli
ATCC25922 e E. coli ATCC35218.
3.4 Detecção de amostras produtoras de ESBL
As amostras humanas e caninas que apresentaram resistência aos β-
Lactâmicos, principalmente às Cefalosporinas e aos Monobactâmicos foram
testadas para a produção de ESBL. (amostra controle: Escherichia coli ATCC
25922). O método de triagem utilizado foi de disco-aproximação (figura 1), um teste
muito utilizado, uma vez que pode ser realizado em qualquer laboratório de
microbiologia. Também conhecida como “Double-disc synergism”, neste teste utiliza-
se no centro de uma placa (150 mm) de ágar Muller-Hinton, previamente inoculada
com a cepa a ser estudada ajustada para a escala 0.5 de Mc Farland e coloca-se no
centro do ágar um disco de amoxacilina/ ácido clavulânico e, ao redor deste, os
antimicrobianos marcadores (Cefoxitina, Aztreonam, Ceftazidima e Cefoxitina) na
distância de 20 a 30 mm de centro a centro, em relação ao disco central Após
incubação por 18 a 20 horas de 33 a 35º.C, deve ser procedida a leitura dos halos. A
formação de uma zona fantasma “Ghost Zone” entre qualquer antimicrobiano
marcador e o disco contendo ácido clavulânico é positiva para presença de ESBL
(SOUZA JÚNIOR et al, 2004)).
Para realização deste teste foram utilizados os seguintes antimicrobianos:
- Ácido clavulânico: amoxacilina + ácido clavulânico
42
- Monobactâmico: Aztrenama
- Cefalosporina de 3ª geração: Cefotaxima
- Cefalosporina de 3ª geração: Ceftazidima
- Cefalosporina de 4ª geração: Cefepime
Figura 1: Exemplificação da metodologia de Disco Aproximação.* Escherichia coli produtora da ESBL. AMC = Amoxacilina + Ácido Clavulânico; CTX = Cefotaxima; ATM = Aztreonam; CAZ = Ceftazidima; CPO = Cefpodoxima. A seta negra, demonstra o aparecimento do fenômeno conhecido como Zona Fantasma “Ghost Zone”, que
caracteriza a produção de ESBL pela cepa bacteriana isolada (DALMARCO et al, 2006).
3.5 Sorotipagem
Os isolados positivos para ESBL no teste fenotípico foram submetidos à
sorotipagem para identificação do antígeno somático (O) e do antígeno flagelar (H).
Esta etapa foi realizada em colaboração com a Dra. Kinue Irino e sua equipe no
laboratório de Enterobactérias do Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo.
43
3.6 Produção de hemolisina
A partir do estoque à -20ºC, as amostras foram inoculadas TSB e incubadas a
37ºC por 6 horas. Após esse período, o crescimento uma alíquota do crescimento foi
semeado em forma de spot (5µl em cada quadrante) em placas de Agar sangue
Triptose (HiMedia, Mumbai, Índia), suplementado com CaCl2 a 10 mM e 5% de papa
de hemácias previamente lavadas 3 vezes em PBS, obtidos de sangue desfibrinado
de carneiro. As placas foram incubadas a 37ºC e foram realizadas leituras após 3
horas da inoculação e após 18 horas da inoculação para detecção de α-hemólise e
entero-hemólise respectivamente (BEUTIN, 1991).
Os controles utilizados para os testes e também inoculados às placas com as
amostas foram U441 – α hemólise, EC784 – entero-hemólise e C600 – negativo)
3.7 Seleção das amostras para avaliação do perfil genotípico
Para realização das PCRs a fim de determinar o perfil genotípico da virulência
e da resistência, foram selecionadas amostras representativas através dos seguintes
critérios. Primeiramente as amostras foras agrupadas em relação à resistência aos
antimicrobianos da seguinte forma: resistentes a 1 classe, resistentes a 2 classes,
resistentes a 3-4 classes, resistentes a 5-7 classes e resistentes a 8-10 classes. A
partir desse agrupamento, a seleção das amostras obedeceu aos seguintes critérios:
um mínimo de duas amostras por grupo; em grupos de até dez amostras foram
selecionadas cinco amostras; em grupos de mais de dez amostras foram
selecionadas 50% do número total de amostras; a seleção das amostras ocorreu de
modo aleatório, por sorteio.
44
3.8 Obtenção do DNA molde de isolamentos
As amostras isoladas em estoque foram inoculadas em 2mL de TSB e
incubadas à 37ºC por 4-6 horas sob agitação. Foram semeados em meio TSA e
novamente incubados 37ºC por 4-6 horas. Um raspado do crescimento foi
ressuspenso em 200µL de PBS, posteriormente foi aquecido por 10 minutos à 100ºC
e sofreu rápida centrifugação (spin). O DNA extraído foi utilizado na pesquisa por
fatores de virulência e de resistência através da reação em cadeia da polimerase. O
tempo entre as extrações e a sua utilização em reações foi em média de 15-20 dias.
3.9 Caracterização genotípica da virulência e da resistência
Ensaios de PCR foram realizados para amplificação dos genes pap, afa, sfa,
HlyA, Cnf1, KpsMTII, FimH, blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, rmtB, drfA17 e blacmY.
As amplificações foram executadas em dois termocicladores modelos PTC
100 (MJResearch, Watertown, MA, EUA) e Multi Gene II / TC050A (Labnet
Inetrnation, Edison, NJ, EUA). Os iniciadores e os protocolos para as reações de
PCR utilizados são apresentados na tabela 1.
As seguintes amostras de E.coli foram utilizadas como controles positivos:
J96 (pap), KS52 (afa), RS218 (Kps), U4-41 (hlyA) e MR219 (cnf). Devido à ausência
controles positivos para os demais genes, as amostras consideradas positivas em
testes fenotípicos foram testadas através das PCRs para estes genes e resultados
positivos ou negativos após três ensaios foram considerados válidos.
45
A amostra DH5α foi utilizada como controle negativo em todas as reações,
exceto para o gene fimH, para o qual foi utilizada a amostra EPEC atípica 2.3 da
coleção do laboratório de enteropatógenos do MIP/UFF.
Os reagentes utilizados nas reações de amplificação foram do fabricante
Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) e suas concentrações de acordo com as referências.
3.10 Eletroforese em gel de agarose
O produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 1% em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE; Tris-base
89mM, ácido bórico 89mM, EDTA 2mM). A corrida eletroforéica foi feita no mesmo
tampão e a voltagem utilizada foi de 100V mantendo-se a amperagem em torno de
100mA, por 50 minutos utilizando fonte modelo EPS250 (CBS, Scientific Company,
DelMar, CA, EUA) e cuba modelo MGU-502T (CBS, Scientific Company, DelMar,
CA, EUA) .. Nos “slots” do gel foram aplicados os controles, os amplicons e o
marcador de peso molecular (1 kb plus DNA ladder; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA),
sendo este adequado para mapear fragmentos de DNA fita dupla de 100 pb a 12 kb.
Concluída a corrida eletroforética, o gel foi retirado da cuba e corado com brometo
de etídio e visualizado em transiluminador UV modelo TCX 26.M (Vilber Lourmat,
Marne-la-Vallée, França).
46
Gene Descrição Primer Sequëncia Temperatura de
anelamento
Tamanho Referëncia
blacmy-2 / blacmy-7
Resistencia cefalosporinas
cmy25f-1 CAA TGT GTG AGA AGC AGT C 50ºC 1432bp Sidjabat et al, 2006.cmydr-1 CGC ATG GGA TTT TCC TTG CGT
drfA17 Resistência trimetoprim drfa17-f GAA CCT TGA CCG AAC GC 50ºC 454bp Sidjabat et al, 2006.drfa17-r GTT GCG GCT TTG TGG AAT AC
rmtB Resistencia aminoglicosideos rmtB-fw ATG AAC ATC AAC GAT GCC CT
55ºC 769bp Yan et al, 2004.
rmtb-rv CCT TCT GAT TGG CTT ATC CAblaSHV ESBL s1 ATG AGT TAT ATT AGA ATG GT 58ºC 860bp Wiegand et al, 2007;
Fu et al, 2007.s2 GTT AGC GTT GCC AGT GCT CGblaCTX-M ESBL ctx-ma CGC TTT GCG ATG TGC AG 54ºC 550bp Wiegand et al, 2007;
Bonnet et al, 2003.ctx-mb ACC GCG ATA TCG TTG GTblaTEM Resistencia a
Ampicilina ;ESBLt1 ATT CTT GAA GAC GAA AGG GCC TC 55ºC 1100bp Wiegand et al, 2007.t3 TTG GTC TGA CAG TTA CCA ATG C
kpsMTII Gene capsular associado a aderência em casos de
cistite
kpsII-r GCG CAT TTG CTG ATA CTG TTG 63ºC 272bp Johnson & Stell, 2000; Tiba et al, 2008..
kpsII-f CAT CCA GAC GAT AAG CAT GAG CAfimH Fimbria tipo 1 fimH-f AAC AGC GAT GAT TTC CAG TTT GTG TG 60ºC 465bp Usein et al, 2001.
fimH-r ATT GCG TAC CAG CAT TAG CAA TGT CCCnf1 Fator necrozante
citotoxicocnf-s TTA TAT AGT CGT CAA GAT GGA 50ºC 693bp Eric Oswald (personal
comunication); Usein et al 2001.cnf-as CAC TAA GCT TTA CAA TAT TGA
Afa1 adesina afa-1 GCT GGG CAG CAA ACT GAT AAC TCT C 65ºC 750bp Le Bouguenec et al, 1992.afa-2 CAT CAA GCT GTT TGT TCG TCC GCC G
hlyA Alfa hemolisina hlyA-f16 CAG TCC TCA TTA CCC AGC AAC 52,6 ºC 355bp Beutin et al, 2004.hlyA-b14 ACA GAC CCC TTG TCC TGA AC
pap Pilus associado a pielonefrite
pap1 GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G 65ºC 328bp Le Bouguenec et al, 1992.pap2 ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A
Tabela 1 - Primers utilizados para detecção de genes de virulência e resistência
47
3.10 Extração Plasmidial
Os genes que conferem resistência aos antimicrobianos comumente estão
contidos em Plasmídeos que podem ser transferidos a outras bactérias. Baseado
nisso, a determinação do perfil plasmidial é um importante parâmetro na avaliação
do perfil de resistência bacteriana, sugerindo se esta é cromossômica ou adquirida.
Os isolados foram submetidos à extração plasmidial através do método
descrito por (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). As amostras foram cultivadas em 2
mL de TSB em tubos 16x100 por 18-24 horas à 37ºC sob agitação constante de
150rpm. Uma alíquota de 1,5 mL foi transferida para um microtubo e centrifugada, à
4ºC, por 30 segundos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi aspirado, de forma a não
deixar resíduos de meio no microtubo e o “pellet” ressuspenso em 100 µL de
solução I (Glicose 50 mM; Tris-HCl [pH 8,0] 25 mM; NaEDTA [pH 8,0] 10 mM)
gelada (mantida em gelo) e homogeneizado em vortex. Depois de completa
dispersão do “pellet”, 200 µL de solução II (NaOH 0,2N; SDS 1% [p/v]), recém
preparada, foram adicionados. Os microtubos foram agitados cinco vezes por
inversão rápida e mantidos em gelo por 10 minutos. Após este tempo, 150 µL da
solução III (Acetato de Sódio 3M pH 4,8) gelada, foram adicionados e os tubos,
novamente, agitados 5 vezes por inversão rápida, mantendo-os no gelo por 5
minutos. Os microtubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos à 4ºC. Uma
alíquota de 450 µL do sobrenadante límpido foi transferida para novo microtubo com
900 µL de etanol absoluto (temperatura ambiente) e levada ao vortex, sendo deixada
em repouso por 2 minutos. Centrifugou-se os microtubos a 14.000 rpm por 5 minutos
e todo o sobrenadante foi removido. Um mililitro de álcool 70º GL foi adicionado ao
“pellet” e a suspensão foi homogeneizada por inversão rápida cinco vezes.
Posteriormente, os microtubos foram submetidos à nova centrifugação a 14.000 por
dois minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e os microtubos, deixados abertos
em temperatura ambiente, por 5-10 minutos, para evaporação do álcool. Para
dissolver o DNA, foram adicionados 50 µL de tampão TE (Tris 10mM; EDTA 1 mM;
pH 8,0) e os microtubos, levados ao vortex em baixa rotação para uma suave
homogeneização. O material extraído foi conservado à -20ºC.
48
As amostras controles R23 (não carreadora de plasmidios) e R861
(plasmídios de 4,3; 22; 39 MDa (baixo peso molecular) e 91 MDa (alto peso
molecular)) foram submetidas à extração junto com os isolados.
Para corrida de eletroforese em gel de agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EUA) a 0,8% em tampão TBE (Tris-Borato-EDTA; pH 8,2), uma alíquota de 15 µL da
solução de DNA foi misturada a 5 µL de corante Azul de Bromofenol e
homogeneizada. Nos poços do gel, foram adicionados 15 µL da mistura e a corrida
foi realizada a 80V até o corante atingir a parte inferior do gel, que, posteriormente,
foi corado com brometo de etídio e visualizado em transiluminador U.V.
49
4. Resultados
4.1 Perfil das amostras de origem humana
As amostras humanas obtidas no Hospital Universitário Antônio Pedro,
localizado no município de Niterói, foram analisadas segundo alguns critérios, dentre
os quais: o sexo dos pacientes, onde predominaram amostras coletadas de
pacientes do sexo feminino (84%), frente a apenas 16% de amostras de pacientes
do sexo masculino (tabela 2).
A idade dos pacientes foi mais um dos fatores analisados. Pode-se observar
que a maioria das amostras (46%) foi proveniente de pacientes acima de 50 anos,
ou seja, acima de meia-idade. Já os pacientes na idade adulta entre 26 e 50 anos
totalizaram 34% das amostras e as crianças foram a minoria, com apenas 20% do
total recolhido. (tabela 3)
Segundo o local de precedência do paciente no HUAP, obtivemos 58% de
amostras de pacientes ambulatoriais e 42% de amostras oriundas de pacientes
internados no Hospital (tabela 4).
50
Tabela 2 – Características dos pacientes dos quais foram obtidas as amostras UPEC em relação ao sexo do paciente
Sexo Numero de amostras Total %
Feminino 42 84%
Masculino 8 16%
Tabela 3 - Características dos pacientes dos quais foram obtidas as amostras UPEC em relação à idade do paciente
Idade Numero de amostras Total%
0 a 25 anos 10 20%
26 a 50 anos 17 34%
Acima de 50 anos 23 43%
Tabela 4 - Características dos pacientes dos quais foram obtidas as amostras UPEC em relação a localização do paciente
Localização Numero de amostras Total%
ambulatório 29 58%
internados 21 42%
51
4.2 Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos
Dentre as amostras humanas os maiores índices de resistência foram para os
antibióticos Ampicilina ([aminopenicilina] 68%), Cefalotina ([cefalosporina de 1ª
geração] 78%) e Amicacina ([aminoglicosídeo] 66%). Não foi observada resistência
ao antibiótico Imipenem (Ccrbapenêmico) (Figura 2; Tabela 5).
Pode-se observar ainda, que foi encontrada resistência aos antibióticos de
uso veterinário testados para as amostras humanas, dentre estes Ceftiofur (34%,)
Enrofloxacino ( 38%) e Florfenicol ( 24%).
R e sis tê n c ia a A n tim ic r o b ia n o s - A m o s tr as H u m an as
0 %
1 0 %
2 0 %
3 0 %
4 0 %
5 0 %
6 0 %
7 0 %
8 0 %
9 0 %
Ampicilina
Amoxacilina
Cefalotina
Cefoxitin
a
Ceftriax
onaCefti
ofur
Cefepime
Aztreonama
Imipenem
Amicacin
a
Gentamicina
Tobramicina
Ciprofloxacin
o
Enroflox
acino
Clorafenico
l
Florfen
icol
Tetraci
clina
Trimeto
prin + sulfa
Ác. Nalidíxico
A ntib ióticos
Resis
tência
Figura 2 - Resistência aos antimicrobianos em amostras humanas
52
Tabela 5 - Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia coli uropatogênica isoladas no Hospital Universitário Antonio Pedro (HUAP), 2007-2008.
Antibióticos Cepas resistentes
Nº %
Ampicilina 34 68%
Amoxacilina 15 30%
cefalotina 39 78%
Cefoxitina 6 12%
Ceftriaxona 11 22%
Ceftiofur 17 34%
Cefpime 9 18%
Aztreonama 2 4%
Imipenem 0 0%
Amicacina 33 66%
Gentamicina 17 34%
Tobramicina 17 34%
Ciprofloxacino 21 42%
Enrofloxacino 19 38%
Clorafenicol 17 34%
Florfenicol 12 24%
Tetraciclina 24 48%
Trimetiprin + sulfa 32 64%
Ácido nalidíxico 17 34%
53
Dentre as amostras caninas os maiores índices de resistência foram para os
antibióticos: Ácido nalidíxico ([quinolona] 64%), Cefalotina ([cefalosporina de 1ª
geração] 58%) Tetraciclina (46%) e Ampicilina ([aminopenicilina] 44%). Assim como
nas amostras humanas, não foi observada resistência ao antibiótico Imipenem
(Carbapenêmico). Os Antibióticos de uso veterinário Ceftiofur, Enrofloxacino e
Florfenicol obtiveram índices baixos de resistência, sendo eles 16%, 30% e 14%
respectivamente. (Figura 3; tabela 6)
R e s i s t ê n c i a a A n t i m i c r o b i a n o s - A m o s t r a s C a n i n a s
0 %
1 0 %
2 0 %
3 0 %
4 0 %
5 0 %
6 0 %
7 0 %
Ampicilina
Amoxacilin
a
Cefalotina
Cefoxitin
a
Ceftriaxona
Ceftiofur
Cefepime
Aztreonama
Imipenem
Amicacina
Gentamicina
Tobramicina
Ciprofloxacin
o
Enrofloxacin
o
Clorafenicol
Florfenicol
Tetracicl
ina
Trimetop
rin + sulfa
Ác. Nalidíxic
o
A n t ib ió tic o s
Resis
tência
Figura 3: Resistência aos Antimicrobianos em amostras caninas.
54
Tabela 6- Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia coli uropatogênica isoladas no Laboratório Veterinário Laborlife. 2007-2008.
Antibióticos Cepas resistentes
Nº %
Ampicilina 22 44%
Amoxacilina 7 14%
Cefalotina 29 58%
Cefoxitina 4 8%
Ceftriaxona 8 16%
Ceftiofur 8 16%
Cefpime 14 28%
Aztreonama 4 8%
Imipenem 0 0%
Amicacina 16 32%
Gentamicina 6 12%
Tobramicina 15 30%
Ciprofloxacino 17 34%
Enrofloxacino 15 30%
Clorafenicol 13 26%
Florfenicol 7 14%
Tetraciclina 23 46%
Trimetiprin + sulfa 17 34%
Ácido nalidíxico 32 64%
55
4.3 Avaliação da Multirresistência
Após a realização dos antibiogramas das amostras humanas e caninas
podemos determinar um perfil de multirresistência entre as mesmas, sendo
consideradas multirresistentes as amostras que apresentaram resistência a duas ou
mais classes de antibióticos (Tabela 7; Tabela 8).
Como já era esperado, o índice de multirresistência foi maior em amostras de
origem humana do que em amostras de origem canina, com índices de 94% e 74%
dos totais individuais de 50 amostras, respectivamente. (Figura 4)
Resistência em amostras humanasQuantidade de
amostras Porcentagem
Não apresentaram resistência 1 2%
Resistentes a 1 classe 2 4%
Resistentes a 2 classes 6 12%
Resistentes a 3-4 classes 12 24%
Resistentes a 5-7 classes 27 54%
Resistentes a 8-10 classes 2 4%
Resistência em amostras caninasQuantidade de
amostras Porcentagem
Não apresentaram resistência 9 18%
Resistentes a 1 classe 4 8%
Resistentes a 2 classes 5 10%
Resistentes a 3-4 classes 9 18%
Resistentes a 5-7 classes 18 36%
Resistentes a 8-10 classes 5 10%
Tabela 8 - Classificação da resistência das amostras UPEC de origem canina acordo com as classes de antimicrobianos testados.
Tabela 7 – Classificação da resistência das amostras UPEC de origem humana de acordo com as classes de antimicrobianos testados.
56
Figura 4 - Frequencia de Multirresistência em amostras humanas e caninas
Multirresistência
94%
74%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Amostras Humanas
Amostras Caninas
Amostras
%
57
4.4 Perfil Plasmidial
A fim de detectar e presença de plasmídeos foi realizada a extração
plasmidial das amostras consideradas multirresistentes segundo o método de
SAMBROOK & RUSSEL, 2001. (Figura 5).
Pode-se observar que a presença da plasmídeos de baixo peso molecular foi
mais freqüente do que a presença de plasmídeos de alto peso molecular tanto em
amostras UPEC de origem humana quanto em amostras caninas. A presença de
plasmídeos foi mais comum em amostras de UPEC provenientes de humanos,
principalmente associadas a presença de mutirresistência dessas amostras.
Nas amostras de UPEC de origem humana foi detectada a presença de
plasmídeos de alto peso molecular (72%) e de baixo peso molecular, sendo mais
freqüente a presença dos plasmídeos de baixo peso molecular (84%)em número de
dois ou três plasmídeos na mesma amostra, como por exemplo, nas amostras H12,
H15, H46 dentre outras descritas (Tabela 9) .
A frequência de plasmídeos de baixo peso molecular também bastante
elevada em amostras caninas (84%), nas quais se pode notar também a presença
de dois e/ou três plasmídeos em uma única amostra, embora este fato tenha
ocorrido com menor frequencia do que nas amostras de humanos (Tabela 10).
58
Tabela 9: Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC humanas
Amostras humanas Pasmídeos alto peso Plasmídeos baixo peso
H1 0 1H2 0 2H3 1 1H4 1 1H5 1 3H6 1 2H7 1 1H8 1 3H9 0 1
H10 1 1H11 1 1H12 0 3H13 0 1H15 1 3H16 1 1H18 1 1H19 1 1H20 1 1H21 0 1H22 1 1H23 1 1H24 0 1H25 1 3H26 1 1H27 1 1H28 1 0H29 1 3H30 1 1H31 1 1H33 0 0H34 0 0H35 1 1H36 1 1H37 1 0H38 0 0H39 1 1H40 0 1H41 1 2H42 1 2H43 1 1H44 0 0H45 0 0H46 1 2H47 1 1H48 1 1H49 1 1H50 0 0
59
Tabela 10: Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC caninas
Amostras caninas Pasmídeos alto peso Plasmídeos baixo pesoA2 0 1A3 0 0A4 0 1A5 1 1A6 1 1A7 0 0A8 0 3A9 0 0A10 1 1A12 1 1A13 0 0A16 1 1A17 0 0A18 1 1A21 1 1A22 0 1A23 1 0A26 0 1A27 1 1A28 1 1A29 1 2A31 0 1A32 0 1A33 1 1A34 1 1A35 1 1A36 0 0A37 1 1A40 0 2A41 1 1A42 0 1A43 0 1A44 1 1A45 0 1A46 0 1A47 1 1A48 1 1A50 0 0
60
Figura 5: Gel de eletroforese de extração plasmidial ilustrando: controle da extração R23, controle positivo R861 e amostras humanas demonstrando a presença de plasmídeos de alto e baixo peso molecular.
R23 R861 H16 H15 H13 H12 H11 H10 H9 H8 H6 H5 H4 H3 H2 H1
4,3MDa22MDa39MDa
91MDa
61
4.5 Identificação de ESBL
As amostras resistentes às aminopenicilinas e cefalosporinas foram
submetidas à confirmação da presença de beta lactamases. Dentre as amostras
UPEC de origem humana, foram encontradas quatro amostras positivas no teste
fenotípico de disco-aproximação e dentre as amostras caninas foram encontradas
três amostras positivas no teste fenotípico.
Sete amostras apresentaram distintos antígenos somáticos, contudo houve
amostras que apresentaram mesmo antígeno flagelar. Dentre as sete amostras
sorotipadas 03 (aproximadamente 43%) foram consideradas não tipáveis e uma
amostra (14%) apresentou-se rugosa, o que impediu a sorotipagem somática.
Outras três amostras apresentaram antígenos somáticos diferenciados entre si (O4,
O11 e O8). O sorogrupo nove do antígeno flagelar (H9) foi o mais freqüente, estando
presente em duas amostras caninas, o que representa aproximadamente 29% do
total analisado. Outros sorogrupos presentes foram H49 na amostra A21, H14 na
amostra H15, H1 na amostra H21, H15 na amostra H39 e H4 na amostra H49
(Tabela 11).
Todas as amostras consideradas positivas para ESBL no teste fenotípico
foram submetidas ao teste genotípico de PCR a fim de detectar a presença dos
genes específicos: blaCTX-M, blaTEM e blaSHV (Tabela 11).
Dentre as amostras de UPEC humanas, H21, H39 e H49 apresentaram os
genes blaCTX-M e blaTEM, somente H15 não amplificou nenhum desses genes.
Entretanto, nenhuma das amostras amplificou o gene SHV (Tabela 11).
As amostras de UPEC caninas A31 e A41 foram positivas para o gene blaCTX-
M, enquanto A21 não amplificou este gene. Já no caso do gene blaTEM, as amostras
A21 e A41 foram positivas e apenas na amostra A31 não houve amplificação deste
gene. Assim como no caso das amostras humanas as amostras caninas também
não amplificaram o gene SHV (Tabela 11).
62
Tabela 11 - Caracterização das amostras produtoras ESBL através de sorotipagem e perfil genético.
Amostra Sorotipagem Perfil genético
blaCTX-M blaTEM blaSHV
A21 OR:H49 - + -
A31 ONT:H9 + - -
A41 ONT:H9 + + -
H15 ONT:H14 - - -
H21 O4:H1 + + -
H39 O11:H15 + + -
H49 O8:H4 + + -
63
4.6 Avaliação da produção de Hemólise
Todas as amostras foram submetidas ao teste fenotípico de alfa e entero -
hemólise.
Dentre as amostras humanas pode-se observar α-hemólise em 20% das
amostras (n=10) e pode-se observar entero-hemólise somente em 6% das amostras
(n=3).
Dentre as amostras caninas podemos observar α-hemólise em 36% das
amostras (n=18); e entero-hemólise em 6% das amostras (n=3).
As amostras de UPEC que apresentaram hemólise em seu perfil fenotípico
foram testadas para a presença do gene HlyA, que codifica α-hemolisina. Dentre as
amostras humanas, 69% amplificaram o gene e dentre as amostras caninas
somente 28% amplificaram o gene. Desta forma pode-se observar que as amostras
humanas analisadas representaram alta positividade no teste genotípico, ou seja, a
maioria dessas amostras expressa o gene que determina sua característica
fenotípica. Já nas amostras caninas, houve uma positividade bem menor dentre as
testadas, o que pressupõem uma baixa expressão genética (Tabela 12).
64
Tabela 12 - Amostras produtoras de α-hemólise fenotípica e presença do gene hlyA
α-hemóliseAmostra fenótipo genótipo
H1 + +H7 + -H10 + +H17 + +H21 + +H31 + +H32 + -H34 + +H38 + +H39 + +H47 + +H50 + -A1 + -A3 + -A4 + -A9 + +A11 + -A14 + -A15 + -A16 + -A17 + -A18 + -A22 + +A23 + -A24 + +A25 + -A30 + +A35 + -A39 + -A40 + +A42 + +
H: Amostras de origem humana
A: Amostras de origem canina
65
4.7 Detecção de genes de resistência e de genes de virulência
Amostras previamente isoladas neste estudo foram submetidas à avaliação
do perfil genotípico através da Reação em Cadeia da Polimerase de acordo com seu
perfil de sensibilidade e demais testes fenotípicos, a fim de confirmar características
já demonstradas fenotipicamente e/ou detectar os genes responsáveis por estas
características. Além disso, serão pesquisados os genes de virulência a fim de fazer
uma associação entre a patogenicidade das amostras e a expressão de resistência
das mesmas.
Para seleção das amostras avaliadas genotipicamente foram obedecidos
critérios estabelecidos na metodologia desse estudo e descritos no item 3.7: Seleção
das amostras para avaliação do perfil genotípico. A partir dessa seleção prévia das
amostras, os dados obtidos estão demonstrados na tabela a seguir (Tabela 13). De
acordo com a seleção descrita, a técnica de PCR foi realizada com um total de 28
amostras de UPEC humanas e 23 amostras de UPEC caninas.
Tabela 13 – Divisão dos grupos de amostras para realização das PCRs.
Identificação de amostras estudadas por grupos para PCR
Humanos Caninas
Resistentes a 1 classe H14 e H17 A24, A30,
Resistentes a 2 classes H5, H31, H33, H47, H48. A6, A8, A34, A40, A42,
Resistentes a 3-4 classes H1, H3,H4, H13, H24, H42, A2, A29, A47, A48, A50
Resistentes a 5-7 classesH2, H10, H12, H21, H27, H34,
H35, H36, H37, H38, H45, H46, H49,
A5, A7, A9, A10, A13, A21, A22, A33, A46, ,
Resistentes a 8-10 classes H15, H39 A31, A45 .
66
A presença de genes de resistência no DNA molde extraído tanto de
amostras de UPEC humanas quanto de amostras UPEC caninas, foi avaliada
através da utilização de primers específicos para o perfil fenotípico da resistência
previamente avaliado através de TSA. Os genes avaliados foram selecionados de
acordo com o perfil de resistência, onde os três grupos de antimicrobianos que
obtiveram maior índice de resistência fenotípica foram associados a presença de
genes específicos e a presença destes confirmada através da técnica de PCR.
Esses genes e suas descrições foram os seguintes: blacmy-2 / blacmy-7 resistência
a cefalosporinas, blaTEM resistência as aminopenicilinas, drfA17resistência a
trimetoprim e rmtB resistência aos aminoglicosídeos.
O gene blaTEM apresentou um considerável índice de amplificações dentre os
DNAs das amostras que apresentaram resistência fenotípica às aminopenicilinas.
Todas as amostras caninas testadas tiveram seus DNAs amplificados pelo primer
específico e o índice de amplificações em amostras de origem humana foi de
aproximadamente 76%. Nenhum dos demais genes selecionados para
caracterização genotípica da resistência apresentou amplificações de DNA a partir
dos iniciadores utilizados neste estudo. Todas as amostras selecionadas para esta
avaliação tiveram seu DNA amplificado por um iniciador universal de DNA
bacteriano, conforme a seguinte descrição: rrsB-F TGCAAGTCGAACGGTAACAG /
rrsB-R AGTTATCCCCCTCCATCAGG (dados não informados).
Todas as amostras selecionadas para avaliação genotípica foram testadas
para confirmação da presença dos genes de virulência pap, afa, kps, cnf e fimH .
Foi observado que um total de 100% das amostras humanas e caninas
apresentaram pelo menos um dos genes de virulência testados. A maioria das
amostras apresentou mais de um gene de virulência em seu perfil. O gene fimH foi o
mais freqüente dentre todas as amostras estudadas, estando presente em 100% das
amostras de ambos os grupos (Tabela 14 e 15).
A presença do gene hlyA foi comumente associada a presença dos genes
pap e/ou cnf. A distribuição dos genes de virulência ocorreu de maneira bastante
uniforme, havendo poucos casos de amostras com apenas um dos genes avaliados
e surpreendentemente essas amostram demonstraram perfis de fenotípicos de
resistência bastante amplos, com resistência a 5 a 6 classes de antimicrobianos, ou
67
seja, amostras multirresistentes nesses casos, não podem ser consideradas como
de alto índice de virulência (tabela 14 e 15).
68
Continua...* Genes re resistência: blaTEM
** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyANR – não realizado; AMB – ambulatório; INT - internados
69
Triagem hospitalar perfil genotípicoAmostras Local Sexo Idade fenótipo de resistência
MDRQuantidade de classes
Resistência * Virulência **
H1 AMB F 40 cfl, ami, gen, tob, cip, + 3 classes NR cnf, kps, hlya, fimhH2 AMB F 38 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, tet, sul nal + 7 classes + kps, fimhH3 AMB F 49 amp, amc, cfl, ami, clo, + 4 classes + kps, fimhH4 INT F 21 amp, cfl, cft, gen, tob, clo + 4 classes + pap, kps, fimhH5 AMB F 14 amp, sul + 2 classes + cnf, kps, fimhH6 AMB F 38 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, cip, enr, tet, nal + 6 classes NR NRH7 AMB F 37 amp, amc, cfl, ami, gen, sul + 4 classes NR NRH8 AMB F 44 cft, ami, tob, tet + 3 classes NR NRH9 AMB F 52 amp, amc, cfl, cfo, cro, cft, ami, tob, cip, tet, sul + 6 classes NR NRH10 AMB F 3M amp, amc, cfl, cep, tob, clo, sul + 5 classes + pap, kps, hlya, fimhH11 AMB F 77 cft, ami, gen, cip, enr, flo, tet, sul, nal + 7 classes NR NRH12 AMB F 80 amp, cfo, ami, cip, enr, tet, sul, nal + 7 classes + fimhH13 AMB M 49 amp, ami, gen, tob, tet, sul + 4 classes - fimhH14 AMB F 80 ami, tob - 1 classe NR pap, kps, fimhH15 INT F 9 amp, cfl, cro, cft, azt, ami, gen, tob, cip, enr, tet, sul, nal + 8 classes - fimhH16 INT F 33 amp, cfl, ami, tet, sul + 5 classes NR NRH17 INT F 24 cfl - 1 classe NR pap, kps, hlya, fimhH18 AMB F 54 amp, amc, cfl, sul + 3 classes NR NRH19 AMB F 66 amp, amc, cfl, cep, gen, enr, sul, nal + 6 classes NR NRH20 AMB F 37 amp, cfl, cft, ami, cip, enr, sul + 5 classes NR NRH21 AMB M 2M amp, cfl, cro, cft, gen, tob, tet, sul + 5 classes - pap, cnf, kps, hlya, fimhH22 AMB F 39 cfl, cft, ami, tob, cip, enr + 3 classes[ NR NRH23 AMB F 7 amp, amc, cfl, cfo, cft, ami, gen, tob, cip, clo, tet, sul + 7 classes NR NRH24 AMB F 9 gen, sul, nal + 3 classes NR pap, afa, kps , fimhH25 INT F 41 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo sul + 6 classes NR NRH26 AMB F 64 amp, cfl, cfo, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, tet, sul + 7 classes NR NR
Tabela 14: Caracterização fenotípica e genotípica das amostras de UPEC humanas.
Triagem hospitalar perfil genotípicoAmostras Local. Sexo Idade fenótipo de resistência Multirresistência Quantidade
de classesResistência
*Virulência **
H27 AMB F 52 amp, cfl, cfo, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo, sul
+ 6 classes - pap, kps, fimhH28 AMB F 76 amp, amc, cfl, cfo, cro, cft, ami, gen,
tob, cip, enr, clo, flo, tet, sul+ 7 classes NR NR
H29 INT F 53 amp, cfl, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo, sul, nal
+ 7 classes NR NRH30 INT F 40 amp, cfl, ami, clo, tet + 5 classes NR NRH31 AMB M 77 cfl, ami + 2 classes NR pap, afa, cnf, kps, hlya,
fimhH32 INT F 46 0 - 0 NR NRH33 AMB F 51 amp, ami + 2 classes + pap, afa, cnf, kps, fimhH34 INT F 37 amp, cfl, ami, clo, tet + 5 classes + pap, cnf, kps, hlya, fimhH35 INT F 49 amp, cfl, ami, cip, enr, tet, sul, nal + 7 classes + afa, kps, fimhH36 INT F 61 amp, cfl, ami, gen, cip, enr, tet, sul, nal + 7 classes + pap, afa, cnf, kps, fimhH37 INT M 77 cfl, ami, gen, cip, enr, clo, flo, tet, sul,
nal+ 7 classes + kps, fimh
H38 AMB M 22 amp, cfl, tet, sul, nal + 5 classes + pap, cnf, kps, hlya, fimhH39 INT F 67 amp, amc, cfl, cro, cft, cep, azt, cip,
enr, clo, flo, tet, sul, nal+ 8 classes + afa, hlya, fimh
H40 INT F 69 cfl, cfo, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo, tet
+ 4 classes NR NRH41 INT F 70 cfl, cep, ami, cip, enr, flo, nal + 5 classes NR NRH42 AMB F 56 amp, cfl, cep, tet, sul + 4 classes + pap, cnf, kps, fimhH43 INT F 85 amp, amc, cfl, cep, clo, flo, tet, sul + 5 classes NR NRH44 INT M 47 cro, nal + 2 classes NR NRH45 AMB F 40 amp, cfl, cep, clo, tet, sul + 5 classes - afa, cnf, fimhH46 INT F 71 amp, amc, cfl, cep, clo, flo, tet, sul, nal + 6 classes + pap, kps, fimhH47 INT F 60 cfl, cep, ami + 2 classes NR pap, kps, hlya, fimhH48 AMB F 85 cfl, ami + 2 classes NR kps, fimhH49 INT M 55 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, cip, enr, flo,
sul, nal+ 7 classes + fimh
H50 INT M 14 cfl, ami, flo + 3 classes NR NR
* Genes re resistência: blaTEM
** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyANR – não realizado; AMB – ambulatório; INT - internados
70
Perfil genotípicoAmostras Fenótipo de resistência Multirresistência n de classes Resistência * Virulência **
A1 cro - 0 NR NRA2 ctr, ami, tob, tet, nal + 4 classes - fimhA3 amp, cro, enr, flo, nal + 5 classes NR NRA4 amo, cfl,cfo, ctf,cep, ami, tob,
cip, enr, flo, tet+ 6 classes NR NR
A5 cro, gen, tob, cip, enr, tet, nal + 5 classes NR fimhA6 cfl, nal + 2 classes NR cnf, fimhA7 amp, cfl, ami, cip, sul, nal + 6 classes + fimhA8 ami, nal + 2 classes NR kps, fimhA9 amc, cfl, cro, cft, tob, cip, enr,
clo, tet, nal+ 7 classes + pap, cnf, hlya, fimh
A10 amp, cfl, cft, ami, tob, cip, enr, clo, tet, nal
+ 7 classes + kps, fimhA11 ami - 1 classe NR NRA12 amp, cfl, cip, enr, tet, sul, nal + 6 classes NR NRA13 amp, amc, cfl, ami, tob, tet, sul, + 5 classes + pap, kps, fimhA14 0 - 0 NR NRA15 0 - 0 NR NRA16 ami, flo, nal + 3 classes NR NRA17 0 - 0 NR NRA18 cfl, ami, gen, flo, nal + 4 classes NR NRA19 0 - 0 NR NRA20 amp - 1 classe NR NRA21 cfl, cfo, cro, cft, cep, azt, gen tob,
cip, clo, flo, tet, nal+ 7 classes NR fimh
A22 amp, amc, cfl, gen, tob, cip, enr, tet, sul, nal
+ 7 classes + pap, cnf, kps, hlya, fimhA23 amp, cfl, cft, cep, ami, gen, tob,
cip, clo, tet, sul, nal+ 8 classes NR cnf, kps, fimh
A24 nal - 1 classe NR pap, cnf, kps, hlya, fimhA25 0 - 0 NR NR
71
* Genes re resistência: blaTEM continua..** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyA
perfil genotípicoAmostras fenótipo de resistência Multirresistência n de classes resistência virulência
A26 amp, cfl, ami, sul, nal + 5 classes NR NRA27 amp, tob, cip, enr, tet, nal + 5 classes NR NRA28 cfo, cep, tob, cip, enr, clo, tet,
sul, nal+ 6 classes NR NR
A29 amp, amc, clo, sul, nal + 4 classes + cnf, kps, fimhA30 ami - 1 classe NR pap, cnf, kps, hlya, fimhA31 amp, amc, cfl, cro, cft, cep, azt,
tob, cip, enr, tet, sul, nal+ 8 classes + cnf, fimh
A32 amp, cfl, cep, gen, tob, cip, enr, tet, sul, nal
+ 7 classes NR NRA33 amp, cfl, cro, cft, tob, cip, enr,
tet, sul+ 6 classes + pap, cnf, kps, fimh
A34 amp, cfl + 2 classes + cnf, fimhA35 amp, cfl, clo, tet, nal + 5 classes NR NRA36 cfl, tet, nal + 3 classes NR NRA37 cfl, tet, nal + 3 classes NR NRA38 0 - 0 NR NRA39 0 - 0 NR NRA40 cfl, ami + 2 classes NR cnf, kps, hlya, fimhA41 amp, cfl, cro, cft, cep, azt, cip,
enr, clo, tet, sul, nal+ 8 classes NR NR
A42 cfl, cep, ami, + 2 classes NR pap, cnf, kps, hlya, fimhA43 amp, cfl, cep, azt, ami, clo, tet,
sul, nal+ 8 classes NR NR
A44 amp, cfl, cfo, ami, clo, flo, tet, nal
+ 6 classes NR NRA45 amp, amc, cfl, cep, tob, cip, enr,
clo, tet, sul, nal+ 8 classes + pap, cnf, fimh
A46 amp, cfl, cep, cip, enr, clo, tet, sul, nal
+ 7 classes + cnf, fimhA47 cfl, cep, flo, sul, nal + 4 classes NR pap, cnf, kps, fimhA48 cfl, cep, sul, nal + 3 classes NR cnf, kps, fimhA49 0 - 0 NR NRA50 amp, cfl, cep, clo, nal + 4 classes + pap, cnf, fimh
72
* Genes re resistência: blaTEM
** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyA
5. Discussão
A última década tem proporcionado novas perspectivas para os
mecanismos de interação parasita-hospedeiro no trato urinário. A redução da
defesa do hospedeiro parece diminuir a exigência da virulência bacteriana,
considerando que a resistência do hospedeiro torna-o susceptível à infecção
por bactérias com maior virulência. Num hospedeiro resistente, a virulência
bacteriana pode ser definida como a soma das propriedades exigidas para
colonizar o trato urinário e induzir a lesões teciduais. A resistência induzida
pela exposição natural à infecção ou imunização pode ser protetora em
modelos experimentais, mas sua importância ainda não está definida.
(SVANBORG-EDEN et al, 1987).
A localização, gravidade e seqüelas da infecção no tato urinário são
determinadas pelo equilíbrio entre a virulência bacteriana e a defesa do
hospedeiro. Embora a doença seja um resultado da interação entre a virulência
bacteriana e a resistência do hospedeiro, estes componentes são discutidos
separadamente com maior clareza. (SVANBORG-EDEN et al, 1987).
Neste estudo, a virulência e a resistência bacteriana foram avaliadas em
amostras de UPEC derivadas de humanos e de cães. A resistência aos
antimicrobianos ocorreu tanto em amostras de origem humana quanto em
amostras de origem canina, demonstrando a disseminação de resistência em
ambos os grupos. Ao abordar o impacto da terapêutica antibiótica sobre o
desenvolvimento da resistência, deve-se compreender não só o processo de
seleção, mas desenvolvimento de resistência e a complexa evolução ecológica
dos determinantes da resistência envolvidos. Vale ressaltar que ao longo do
tempo, em resposta ao desenvolvimento dos antibióticos, as bactérias têm
evoluído e otimizado seu arsenal genético para lidar com a ação dos
antibióticos (BARBOSA & LEVY, 2000).
A disseminação da resistência em espécies animais vem aumentando
ao longo dos anos. Estudos anteriores demonstram que a nível mundial, a
utilização de antimicrobianos em animais para fins de saúde foi estimado em
27000 toneladas/ano das quais, 50% para fins terapêutico e o restante para
finalidades aditivas alimentares (BOATMAN , 1998). Diversos estudos discutem
sobre a resistência crescente aos antimicrobianos de cepas bacterianas
isoladas de várias espécies animais (JOINT EXPERT TECHNICAL ADVISORY
COMMITTEE ON ANTIBIOTIC RESISTANCE 1999; WHO, 1999). A resistência
aos antimicrobianos entre enteropatógenos zoonóticos e comensais é de
interesse à saúde sública, pois essas bactérias são, na maioria, transferidas
aos humanos através da cadeia alimentar, assim como podem ser transferidos
genes de resistência de bactérias comensais a enteropatógenos zoonóticos
(SALYERS & SHOEMAKER, 1995). Existem consideráveis evidências que o
uso dos antimicrobianos seleciona microrganismos e promove a resistência em
bactérias comensais e em enteropatógenos zoonóticos (DAWSON et al, 1984;
DUNLOP et al, 1998; BAGER et al, 1997).
Consideráveis índices de resistência foram atribuídos a antibióticos das
classes de aminopenicilinas, cefalosporinas e quinolonas em amostras de
origem canina. Em amostras de origem humana destacou-se a resistência as
classes de aminopenicilinas, cefalosporinas e aminoglicosídeos,
demonstrando que cepas de UPEC são capazes de driblar variados
mecanismos de ação antimicrobinana. Outros grupos já demonstram a
emergência de E. coli multirresistente associada a infecções hospitalares e
caninas em diversos países, com isolados que demonstraram resistência a
cefalosporinas de espectro estendido (SIDJABAT et al, 2006). Apesar do
desenvolvimento de novos beta-lactâmicos e fluoroquinonas, os
aminoglicosídeos ainda são muito utilizados no tratamento de infecções graves
causadas por microrganismos gram negativos e a resistência bacteriana a
esses medicamentos têm sido relatada desde sua introdução no uso clínico
74
(GALIMAND et al, 2003). Além disso, estudos já relaram a presença de
plasmídeos carreando genes responsáveis pela resistência a quinolonas
(JONES et al, 2008).
Entre os antibióticos testados, o imipenem, foi o antibiótico que revelou o
melhor índice de sensibilidade (100%) em ambos os grupos de amostras
testadas. Essa classe de antibiótico é um bactericida, notável pelo seu amplo
espectro de atividade, agindo pela inibição da síntese da parede celular e
representa uma outra modificação na estrutura do beta-lactâmico. Vários
autores demonstraram que a combinação do Imipenem com a cilastatina de
sódio previne a degradação dessa combinação nos rins, com atividade contra
98% dos organismos isolados a partir de pacientes hospitalizados (NICOLLE,
2003) .
Embora a frequencia de pacientes hospitalizados tenha sido menor que
a de pacientes ambulatoriais, nesse grupo também prevaleceu a presença de
pacientes do sexo feminino e de idade adulta, principalmente com idades
acima dos 50 anos. As amostras de pacientes do sexo masculino de idade
adulta presentes neste grupo, foi marcada pela multirresistência, com
resistência a até 7 classes de antimicrobianos. Além disso, como já era
esperado, o ferfil genotípico de virulência desse grupo foi também bastante
amplo, com a presença de diversos genes de virulência em uma mesma
amostra. O gene mais freqüentemente observado dentre essas amostras foi o
FimH, seguido por pap e Kps. O aparecimento de resistência em patógenos
hospitalares tem-se mostrado associada com o uso inadequado de antibióticos
na terapia e profilaxia e situações semelhantes podem ser encontradas na
comunidade (MCGOWAN, 1996).
E. coli é frequentemente resistente à Aminopenicilinas, tais como
Amoxilina e Ampicilina, além das Cefalosporinas de estreito espectro. A
resistência é tipicamente devido a aquisição de plasmídeos que codificam as
beta-lactamases, tais como TEM-1, TEM-2 e SHV-1, as quais hidrolizam e
inativam essas drogas. Algumas amostras de E. coli adquirem resistência à
terceira geração de Cefalosporinas e Monobactâmicos (por exemplo, o
Aztreonam), através da aquisição das ESBLs (β-Lactamases de amplo
espectro), que comumente surgem através de mutações nas enzimas TEM-,
75
SHV- ou CTX-M. As ESBLs não são ativas contra as Cefamicinas. Contudo, a
resistência às Cefamicinas e a outros β-Lactâmicos pode surgir como resultado
de mudanças em proteínas (porinas) localizadas na membrana externa
(proteínas formadoras de canais pelos quais drogas e outras moléculas
penetram no interior da célula bacteriana). Tais mudanças podem diminuir ou
até mesmo impedir a entrada de pequenas moléculas hidrofílicas, como as
drogas β-Lactâmicas, para o interior da célula. A perda do principal canal
formado pelas porinas (OmpF) pode reduzir a entrada das Cefamicinas na
célula bacteriana, aumentando ainda mais o espectro de resistência da bactéria
(TENOVER, 2006).
A produção de ESBL por cepas de UPEC neste estudo, foi
principalmente decorrente da presença de TEM e CTX, uma vez que nenhuma
das amostras testadas apresentaram o gene codificador da enzima SHV, ou
seja, nesse grupo de amostras esse mecanismo não foi comum entre as
amostras testadas. Pode-se observar ainda, a positividade tanto fenotípica
quanto genotípica para ESBL em amostras caninas, as quais apresentaram
antígenos somáticos não tipáveis, porém duas das três amostras apresentaram
mesmo antígeno flagelar e mesma enzima moduladora, a CTX. Uma das
amostras oriundas de humanos testada não amplificou nenhum dos genes
codificadores de ESBL, o que nos leva a crer que esta amostras de UPEC se
utiliza de outro possível mecanismo enzimático não estado nesse estudo.
Outras três amostras de UPEC humana apresentaram positividade para ambos
os genes CTX e TEM. Embora essas variantes sejam muito isoladas, sabe-se
que nos últimos anos houve uma explosão no aparecimento de outras ESBLs
(PER, VEB, GES, TLA e BES). Como resultado disso, mais de 370 variantes
são conhecidas atualmente (STURENBURB et al, 2005) o que amplia a
possibilidade de identificação das mesmas.
A ocorrência da resistência entre as amostras parece estar associada ao
número de plasmídeos encontrados, já que a frequencia de amostras
resistentes foi tão comum quanto a frequencia da presença de plasmídeos de
alto e de baixo peso molecular nas mesmas. Pode-se sugerir que em algumas
poucas amostras que não apresentaram nenhum tipo de plasmídeo, ocorreu
outro tipo de mecanismo de transferência da resistência. Sidjabat et al,
76
corroboram com esta premissa, afirmando em estudos anteriores que a
transferência horizontal de genes entre bactérias através de elementos
genéticos móveis como plasmídeos, tansposons e integrons têm facilitado a
disseminação de resistência a múltiplos antibióticos entre enterobactérias
(SIDJABAT et al, 2006). Além disso, a presença de apenas um dos genes
buscados em amostras de UPEC humanas nesse estudo, sugere que nessas
amostras o mecanismo de codificação da resistência ocorre mediado por
outros genes não avaliados.
O perfil genotípico das amostras de UPEC humanas e caninas foi
semelhante, pois ambas tiveram seus DNAs amplificados pelo iniciador do
gene que codifica resistencia a aminopenicilinas (blaTEM), contudo seu perfil de
virulência não foi tão semelhante. A presença de adesina afimbrial codificada
pelo gene afa ocorreu nas amostras oriundas de humanos, mas não nas
amostras caninas. Além disso, o perfil de virulência confirmado pela presença
de genes específicos foi mais amplo em amostras humanas, embora as
amostras caninas também tenham apresentado uma vasta gama de genes de
virulência como demonstrado na tabela 14.
Através de testes fenotípicos e genotípicos pode-se avaliar que a
produção de hemolisina nas amostras (n=50) de UPEC humanas foi de 26% e
nas amostras de caninos foi de 42%, sendo a maioria das amostras produtoras
de alfa-hemólise. A análise genotípica através de um iniciador pra alfa-
hemolisina, toxina comumente presente em cepas de UPEC (YAMAMOTO,
2007), demonstrou que dentre as amostras de origem humana 9 das 13
amostras testadas, e consideradas positivas em teste fenotípico realizado
previamente, expressam o gene hlyA (índice = 69%) e dentre as amostras
caninas apenas 6 das 21 amostras testadas e positivas em teste fenotípico
(índice = 28%). As amostras que apresentaram perfil fenotípico entero-
hemolítico e perfil genotípico alfa-hemolítico foram também testadas
genotipicamente para entero-hemólisina através de reação para o gene ehxA
(dados não informados) (PATON & PATON, 1998). Posto que, as reações
entero-hemolíticas não apresentaram amplificação, pode-se pressupor que as
amostras em questão sejam realmente alfa-hemolíticas, porém serão
necessários testes adicionais para melhor esclarecer a questão.
77
Análises do perfil genotpico da virulência das amostras apontam a
associação da produção de alfa-hemolisina através do gene hlyA a pap, cnf
e/ou kps, tanto em amostras de origem humanas quanto em amostras de
origem canina. hlyA é normalmente codificada por PAIs de UPEC , juntamente
com pap e cnf (HACKER & KAPER, 2000). Tal fato corrobora a estudos
anteriores que revelam a presença de hlyA muitas vezes associada a pap, e/ou
cnf, mas não a afa (YAMAMOTO et al , 1995a; TERAI et al, 1997).
A frequência do fator citotoxico necrosante codificado pelo gene cnf foi
maior em amostras de origem canina, sendo detectado em aproximadamente
74% das amostras, contra apenas 36% das amostras de origem humana.
Este fator é conhecido por facilitar a sobreviveência de UPEC durante a
resposta inflamatória aguda, modulando a função de leucócitos, incluindo a
baixa da fagocitose (DAVIS et al, 2005). Além disso foi demonstrado que o
fator citotóxico necrozante é capaz de matar as células uroepiteliais humanas
através de um mecanismo apoptótico (MILLS et al, 2000).
O fator capsular tipo II representou mais um fator de virulência muito
comum entre cepas de UPEC, tendo sido encontrado em aproximadamente
79% das amostras humanas e em 57% das amostras caninas. Esse resultado
já era esperado, visto que se trata de um potencial fator da virulência em UPEC
como já descrito em estudos anteriores (YAMAMOTO, 2007).
Nas ultimas décadas têm havido um grande número de investigações
acerca de fatores de virulência em UPEC e o estabelecimento dessas
propriedades em infecções sintomáticas agudas como cistite, pielonefrite,
assim como em infecções assintomáticas. No entanto, a maioria das
conclusões sobre estas investigações são baseadas em observações
epidemiológicas sobre indícios do papel direto de um único fator de virulência
na patogênese de uma ITU, sendo essas características de virulência capazes
de superar as defesas do hospedeiro ou lesar tecidos (YAMAMOTO, 2007).
Nesse estudo observou-se a presença de inúmeros fatores de virulência
simultaneamente em uma amostra e a associação de altos índices de
resistência antimicrobiana das amostras. A partir das observações aqui
estudadas pode-se indagar a presença de plasmídeos como possível
mecanismo de transferência horizontal entre essas amostras e a associação da
78
presença de diversos fatores de virulência como potenciais mecanismos
atuando diretamente na potencialização de sua patogenicidade. É certo que
para realizar tais afirmações, várias interações precisam ser esclarecidas e
técnicas na abordagem desse estudo realizadas a fim de contribuir para o
entendimento desses dinâmicos mecanismos.
79
7. Conclusões
• Amostras de UPEC isoladas de humanos e de cães apresentaram um
alto índice de resistência antimicrobiana.
• Amostras de UPEC de origem humana foram mais comuns em
pacientes do sexo feminino, adultos e ambulatoriais.
• A produção de beta-lactamases de espectro estendido foi detectada em
amostras de origem humana e canina.
• Amostras de UPEC isoladas de humanos e de cães apresentaram um
alto índice de resistência antimicrobiana sendo, no entanto, mais intenso
dentre as primeiras.
• A base genética da multirresistência presente nas amostras estudadas é
muito diversificada, uma vez que foi baixa a ocorrência dos genes
avaliados.
• Amostras UPEC de origem humana e canina estudadas exibiram um
variado perfil genotípico de virulência.
80
8. Bibliografia
- ABE C.M.; SALVADOR F.A.; FALSETI I.N.; VIEIRA M.A.M.; BLANCO J.;
BLANCO J.E.; BLANCO M.; MACHADO A.M.O.; ELIAS W.P.;
HRNANDES R.T.; GOMES T.A.T. Uripathogenic Escherichia coli (UPEC)
strains may carry virulence properties of diarrhoeagenic E. coli. Immunol
Méd Microbiol. 52: 397-406, 2008.
- BAGER F, MADSEN M, CHRISTENSEN J, AARESTRUP FM. Avoparcin
used as a growth promoter is associated with the occurrence of
vancomycin-resistant Enterococcus faecium on Danish poultry and pig
farms. Prev Vet Med. 31(1-2):95-112. 1997.
- BARBOSA, T.M.; LEVY, S.T. The impact of antibiotic use on resistance
development and persistence. Drug Resistance Updates. 3, 303–311.
2000.
- BAUER R.J.; ZHANG L.; FOXMAN B.; SIITONEN A.; JANTUNEN M.E.
SAXEN H. MARRS C.F. Molecular epidemiology of three putative
virulence genes for Escherichia coli urinary tract infection – usp, iha,
anda iron (E. coli). J. Infect Dis; 185: 1521-4, 2002.
81
- BELKUM, A.V.; Struelens, M.; Visser, A.; Verbrugh, H.; Tibayrenc, M.
Role of Genomic Typing in Taxonomy, Evolutionary Genetics, and
Microbial Epidemiology. Clin Microbiol Rev. 14(3): 547–560, 2001.
- BEUTIN, L. The different hemolysins of Escherichia coli . Med Microbiol
Immunol.;180(4):167-82. Review. 1991.
- BENNETT, P.M. The spread of drug resistance, in: Baumberg S., Young
J.P.W., Wellington E.M.H., Saunders J.R. (Eds.), Population Genetics in
Bacteria, University Press, Cambridge, pp. 317- 344. 1995.
- BOATMAN M. Survey of antimicrobial usage in animal health in the
European union, Boatman consulting. (by order of FEDESA) 1998.
- BOWER, J.M. ; ETO, D.S. and MULVEY, M.A. Covert operations of
uropathogenic Escherichia coli within the urinary tract. Traffic 6, 18–31.
2005.
- BUSH, K.; JACOB, G.A. & MEDEIROS, A.A. A functional classification
scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure.
Antimicrob. Agents Chemother., 39: 1211-33, 1995.
- BYARUGABA, D. K. A view on antimicrobial resistance in developing
countries and responsible risk factors. International Journal of
Antimicrobial Agents, 24(2) 105-110. 2004.
- CHANAL, C.; SIROT, D.; ROMASZKO, J.P.; BRET, L.; SIROT, J. Survey
of prevalence of extended spectrum beta-lactamases among
enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother. 38(1):127-32. 1996.
82
- CHANG, C.Y.; CHANG, L.L.; CHANG, Y.H.; LEE, T.M.; CHANG, S.F.
Characterisation of drug resistance gene cassettes associated with class
1 integrons in clinical isolates of Escherichia coli from Taiwan, ROC. J
Med Microbiol. 2000 Dec;49(12):1097-102
- CHEN S.L.; HUNG C.S.; XU J.; REGSTAD C.S.; MAGRINI V.; SABO A.
Identification of genes subject to positive selection in uropathogenic
strains of Escherichia coli: a comparative genomics approach. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 10: 5977-82, 2006.
- CLSI – Clinical and laboratorial Standards Institute. Fourteeth
Informational Supplement. M100-S14, Wayne, Pa. CLSI, 2007.
- COL, N.F.; O’CONNOR, R.W. Estimating worldwide current antibiotic
usage: Report of task force I. Rev. Infect. Dis. 9, S232-243. 1987.
- DALMARCO, E.M.; BLATT S.L.; CÓRDOVA C.M.M. Identificação
Laboratorial de β-Lactamases de Espectro Estendido (ESBLs) –
Revisão. RBAC, vol. 38(3): 171-177 2006.
- DAWSON, K.A.; LANGLOIS, B.E.; STAHLY, T.S.; CROMWELL, G.L.
Some characteristics and antibiotic resistance of anaerobic bacteria from
the ceca and colons of pigs fed chlortetracycline-containing and
unmedicated diets. Appl Environ Microbiol.;47(1):210-2. 1984.
- DAVIS, J.M.; RASMUSSEN, S.B.; O’BRIEN A.D. Citotoxic necrotizing
factor type 1 production by uropathogenic Escherichia coli modulates
polymorphonuclear leukocyte function. Infect Immun, 68: 5869-80, 2005.
83
- DE GRAAF, F.K. and MOOI, F.R. The fimbrial adhesins of Escherichia
coli. Adv. Microb Physiol, 28: 65-143, 1986.
- DE RYCKE, J.; GUILLOT, J.F.; BOIVIN, R. Cytotoxins in non-
enterotoxigenic strains of Escherichis coli isolated from feces of diarrheic
calves. Vet. Microbiol. 15-:137-50, 1987.
- DREWS, S.J.; POUTANEN, S.M.; MAZZULLI, T.; MCGEER, A.J.;.
SARABIA, A.; PONG-PORTER, S.; RZAYEV, Y.; WILLEY, B.; GREEN
K. AND LOW, D.E. Decreased prevalence of virulence factors among
ciprofloxacin-resistant uropathogenic Escherichia coli isolates, J. Clin.
Microbiol. 43 pp. 4218–4220. 2005,
- DUNLOP, R.H.; MCEWEN, S.A.; MEEK, A.H.; CLARKE, R.C.; BLACK,
W.D.; FRIENDSHIP, R.M. Associations among antimicrobial drug
treatments and antimicrobial resistance of fecal Escherichia coli of swine
on 34 farrow-to-finish farms in Ontario, Canada. Prev Vet Med. 1998 Mar
27;34(4):283-305.
- FOXMAN, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence,
morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49(2):53-70. Review. 2003.
- FOXMAN, B.; MANNING, S.D.; TALLMAN, P.; BAUER, R.; ZHANG, L.;
KOOPMAN, J.S.; GILLESPIE, B.; SOBEL, J.D. AND MARRS, C.F.
Uropathogenic Escherichia coli Are More Likely than Commensal E. coli
to Be Shared between Heterosexual Sex Partners. Am J Epidemiol;
156:1133-1140. 2002.
- FRANCO, B. D. G. M. e LANDGRAF, M. Microbilogia dos Alimentos. 2
ed. São Paulo: Editora Atheneu, 194p, 2002.
84
- GALIMAND, M.; COURVALIN, P.; LAMBERT, T. Plasmid-Mediated High-
Level Resistance to Aminoglycosides in Enterobacteriaceae Due to 16S
rRNA Methylation. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. p. 2565–
2571. 2003.
- GRUDE, N.; TVETEN, Y.; KRISTIANSEN, B.E. Urinary Tract Infections
in Norway: Bacterial Etiology and Susceptibility. A Retrospective Study of
Clinical Isolates. 2001. Disponível em:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi.
- GUERRA, B.; JUNKER, E.; SCHROETER, A.; HELMUTH, R.; GUTH,
B.E.C.; BEUTIN, L. Phenotypic and genotypic characterization of
antimicrobial resistence in Escherichia coli O111 isolates. J. Antimicrob.
Chemotherapy. 57, 1210-1214, 2006.
- GUERRA, B.; JUNKER, E.; SCHROETER, A. Phenotypic and genotypic
characterization of antimicrobial resistence in German Escherichia coli
isolates from cattle, swine and poutry. J. Antimicrob. Chemother. 52:489-
492, 2003.
- GUNTHER N.W.; LOCKATELL V.; JOHNSON D.E.; MOBLEY H.L.; In
vivo dynamics of type 1 fi mbria regulation in uropathogenic Escherichia
coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun; 69:2838–
46, 2001.
- HACKER J. and KAPER J.B. Pathogenicity islands and the evolution of
microbes. Annu. Rev Microbiol. 54: 641-79, 2000.
- JAMES, P.; NATARO, J.P.; JAMES, B.K.. Diarrheagenic Escherichia coli.
Clinical Microbiology Reviews. V11. p. 403-403, 1998.
85
- JARVIS, W.R. – Epidemiology of nosocomial infections in pediatric
patients. Pediat Infect Dis J, v. 6, p. 344-351, 1987.
- JOINT EXPERT ADVISORY COMMITTEE ON ANITBIOTIC
RESISTANCE, 1999, The Use of Antibiotics in Food-Producing Animals:
Antibiotic Resistant Bacteria in Animals andHumans. Canberra:
Commonwealth of Australia.
- JONES, G.L.; WARREN, R.E.; SKIDMORE, S.J.; DAVIES, V.A.;
GIBREEL, T.; UPTON, M. Prevalence and distribution of plasmid-
mediated quinolone resistance genes in clinical isolates of Escherichia
coli lacking extended-spectrum beta-lactamases. J Antimicrob
Chemother. 2008 Dec;62(6):1245-51. Epub 2008 Sep 30.
- JONHSON, J.R. Virulence factors in Escherichia coli urinary tract
infection. Clin. Microbiol. Rev. 4:80-128, 1991.
- JOHNSON, J.R.;DELAVARI, P. Concurrent fecal colonization with
extraintestinal pathogenic Escherichia coli in a homosexual man with
recurrent urinary tract infection and in his male sex partner. Clin. Infect.
Dis. 35, E65–E68, 2002.
- KANAMARU S.; KURAZONO H.; ISHITOYA S.; TERAI A.; HABUCHI T.;
NAKANO M. Distribution and genetic association of putative
uropathogenic virulence factors, iron, iha, kpsMT, ompT and usp in
Escherichia coli isolated from urinary tract infection in Japan. J. Urol.
170: 2490-3, 2003.
- KAPER, J.B.; NATARO, J.P.; MOBLEY, H.L.T. Pathogenic Escherichia
coli. Nat Rev Microbiol 2: 123-40, 2004.
86
- KEANE W.F.; WELCH R. GEKKER G.; PETERSON P. K. Mechanism of
Escherichia coli alpha-hemolysin induced injury to isolated renal tubular
cells. Am J Pathol. 126: 350-7, 1987.
- KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCHRECKENBERGER,
P.C.; WINN Jr., W.C. Diagnóstico Microbiológico. 5.ed., Rio de Janeiro:
MEDSI, 2001.
- LEUNG, M.; SHANNON, K.; FRENCH, G. Rarity of transferable beta-
lactamase production by Klebsiella species. J Antimicrob Chemother.
39(6):737-45. 1997.
- LIVERMORE, D.M. B-Lactamases in laboratory and clinical resistance,
Clin. Microbiol. Rev. 8 557-584. 1995.
- LIVERMORE, D.M. The need for new antibiotics, Clin. Microbiol. Infect.
10 (Suppl. 4), pp. 1–9. 2004.
- LLOYD, A.L.; RASKO, D.A. AND MOBLEY, H.L. T. Defining genomic
islands and uropathogen-specific genes in uropathogenic Escherichia
coli. J. Bacteriol. 189, 3532–3546. 2007.
- LEVERSTEIN-VAN HALL, M.A.; BOX, A.T.A.; BLOK, H.E.M.; PAAUW,
A.; FLUIT, A.C.; VERHOEF, J. Evidence of extensive interspecies
transfer of integron-mediated antimicrobial resistance genes among
multidrug-resistant Enterobacteriaceae in a clinical setting. J. Infect. Dis.
186, 49-56. 2001.
- MANGES, A.R.; JOHNSON, J.R.; FOXMAN, B.; O'BRYAN, T.T.;
FULLERTON, K.E.; RILEY, L.W. Widespread distribution of urinary tract
87
infections caused by a multidrug-resistant Escherichia coli clonal group.
N. Engl J Med.. 345(14):1007-13, 2001.
- MARRS, C.F.; ZHANG L.; FOXMAN B. Escherichia coli mediated urinary
tract infections: are there distinct uropathogenic E. coli (UPEC)
pathotypes? FEMS Microbiol. Lett. 252, 183–190, 2005.
- MCEWEN S.A.; FEDORKA-CRAY P.J. Antimicrobial Use and Resistance
in Animals. Clin. Infect. Dis. 34(3):93-106, 2002.
- MCGOWAN JE, JR. Antimicrobial resistance in hospital organisms and
its relation to antibiotic use. Rev Infect Dis 1983; 5: 1033–1048. 22.
Baquero F. Antibiotic resistance in Spain:What can be done? Task Force
of the General Direction for Health Planning of the Spanish Ministry of
Health. Clin Infect Dis; 23: 819–823.1996.
- MENG, J. et al. Antibiotic resistance of Escherichia coli O157:H7 and
O157:NM isolated from animals, food and humans. Journal of Food
Protection, v.61, n.11, p.1511- 1514, 1998.
- MILLS, M.; MEYSIC, K.C.; O’BRIEN A.D. Cyitotoxic necrotizing factor
type 1 of uropathogenic Escherichia coli kills cultured human uroepithelial
5637 cells by na apoptotic mechanism. Infect Immun. 68: 5869-80, 2000.
- MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, disponível em
www.anvisa.gov.br/legis/portarias/2616_98, acesso em 11 de abril de
2007 às 24h.
- MOURA, K. K. V., SILVA A. A. Infecção Hospitalar: a solução em nossas
mãos. Ciência Hoje, 29, 2001.
88
- MULVEY, M.A. ; SCHILLING, J.D.; MARTINEZ, J.J. AND HULTGREN
S.J. Bad bugs and beleaguered bladders: interplay between
uropathogenic Escherichia coli and innate host defenses. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 97, 8829–8835. 2000.
- MURRAY, P. R. Microbiologia Médica. Editora Guanabara. 1992.
- NATARO, J.P. and KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical
Microbiology Reviews, p. 403-403, Vol. 11, N.2, 1998.
- NICOLLE, L.E. Urinary Tract Infection: Traditional Pharmacologic
Therapies. Disponível em: www.medline.com.br.
- NICOLE, L.E. Asymptomatic bacteriuria: when to screen and when to
treat. Infectious Disease Clinics of North America. Vol. 17 (2), 2003.
- NIKAIDO, H. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability
barriers and active efflux. Science. 15;264(5157):382-8. Review. 1994.
- ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, disponível em www.opas.org.br,
acesso em 11 de abril de 2007 às 17h.
- OZGUMUS, O.B.; CELIK-SEVIM, E.; L ALPAY-KARAOGLU, S.;
SANDALLI, C.; SEVIM, A. Molecular Characterization of Antibiotic
Resistant Escherichia coli Strains Isolated from Tap and Spring Waters in
a Coastal Region in Turkey. The Journal of Microbiology. p. 379-387,
2007.
- PADOVEZE, M.C. & OLIVEIRA, E.L. Bactérias multirresistentes. 2000.
89
- PATON, A. W. & PATON J. C. Detection and Characterization of Shiga
Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2,
eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb O111, and rfb O157. J. Clin.
Microbiol.. 36: 598-602, 1998.
- PEREIRA, A.S.; CARMO FILHO, J.R.; TOGNIM, M.C. Avaliação da
acurácia de testes laboratoriais para detecção de amostras de Klebsiella
pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido. J. Bras.
Patol. Med. Lab., 2003, vol.39, no.4, p.301-308. ISSN 1676-2444.
- POOLE, K. Overcoming multidrug resistance in gram-negative bacteria.
Curr Opin Investig Drugs. 4(2):128-39. Review. 2003.
- RAGHUNATH, D. Emerging antibiotic resistance in bacteria with special
reference to India. J Biosci.33(4):593-603. 2008.
- RAVANELLO, M. L. Medidas de Controle de Infecções em Unidades de
Terapia Intensiva Prática Hospitalar, 30, 15-17, 2003.
- REESE, R. E.; BETTS, R. F. AND GUMUSTOP, B. Manual de
Antibióticos. 3º ed. Editora Médica e Científica Ltda – MEDSI, Rio de
Janeiro, pp.357-368, 2002.
- REIS, A.O.; GALES, A.C. & SADER, H.S. Avaliação da acurácia do teste
de adição clavulanato em disco para a detecção de amostras de
Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBL. J. Bras. Patol., 34: 85-93,
1998.
90
- ROE, M.T.; VEGA, E.; PILLAI, S.D. Antimicrobial resistance markers of
Class 1 and Class 2 integron bearing Escherichia coli from irrigation
water and sediments. Emerg. Infect. Dis. 9, 822-826. 2003.
- RUSSO, T.A.; STAPLETON, A.; WENDEROTH, S.; HOOTON, T.M.
AND STAMM. W.E. Chromosomal restriction fragment length
polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent
urinary tract infections in young women. J. Infect. Dis. 172:440-445,
1995.
- RUSSO, T.A.; CARLINO, U.B.; MONG, A.; JODUSH, S.T.; Identification
of genes in an extraintestinal isolate of Escherichia coli with increased
expression after exposure to human urine. Infect Immun;67: 5306–14.
1999.
- RUSSO, T.A., JOHNSON, J.R. Proposal for a new inclusive designation
for extraintestinal pathogenic isolates of Escherichia coli: ExPEC. J.
Infect. Dis. 181, 1753–1754, 2000.
- SADER, H.S. Bactérias Multirresistentes: Microbiologia, Epidemiologia e
Controle Prática Hospitalar, 30, 19-21, 2003.
- SADER, H.S. & JONES, R.N. In vitro antimicrobial activity of cefpirome
against ceftazidime-resistant isolates from two multicenter studies. Eur.
J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 13: 675-9, 1994.
- SADER, H. S.; GALES, A. C.; PFALLER, M. A.; MENDES, R. E.; ZOCCOLI, C.; BARTH, A.; JONES, R. N. Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals: summary of results from three years of the SENTRY antimicrobial surveillance program. Braz. J. Clin. Microbiol., v.5, p.200-214, 2001.
91
- SADER, H.S.; JONES, R.N.; ANDRADE-BAIOCCHI, S.; BIEDENBACH,
D.J. SENTRY Participants Group (Latin America). Four-year evaluation
of frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility patterns of
bacteria from bloodstream infections in Latin American medical centers.
Diagn MicrobiolInfect Dis. 44(3):273-80. 2002.
- SALYERS, A.A.; SHOEMAKER, N.B. Conjugative transposons: the force
behind the spread of antibiotic resistance genes among Bacteroides
clinical isolates. Anaerobe. 1(3):143-50. No abstract available. 1995.
- SAMBROOK, J. & RUSSELL, D.W. Molecular cloning: A laboratory
manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
- SANDERS, C.C.; SANDERS, W.E.JR. beta-Lactam resistance in gram-
negative bacteria: global trends and clinical impact. Clin Infect Dis. 1992
Nov;15(5):824- 39.
- SCHROEDER, C.M.; MENG, J.; ZHAO, S.; DEBROY, C.; TORCOLINI,
J.; ZHAO, C.; MCDERMOTT, P.F.; WAGNER, D.D.; WALKER, R.D.;
WHITE, D.G. Antimicrobial resistance of Escherichia coli O26, O103,
O111, O128, and O145 from animals and humans. : Emerg Infect
Dis.8(12):1409-14, 2002.
- SCHWARZ, S. CHASLUS-DANCLA, E. Use of antimicrobials in
veterinary medicine and mechanisms of resistence. Vet. Res. 32:201-
225, 2001.
- SIDJABAT, H.E.; TOWNSEND, K.M.; HANSON, N.D.; BELL, J.M.;
STOKES, H.W.; GOBIUS, K.S.; MOSS, S.M. TROTT, D.J. Identification
of blaCMY-7 and associated plasmid-mediated resistance genes in
92
multidrug-resistant Escherichia coli isolated from dogs at a veterinary
teaching hospital in Australia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 57,
840–848. 2006.
- SIROT, D.; SIROT, J. LABIA, R.; MORAND, A.; COURVALIN, P.;
DARFEUILLE-MICHAUD, A.; PERROUX, R.; CLUZEL, R. Transferable
resistance to third-generation cephalosporins in clinical isolates of
Klebsiella pneumoniae: identification of CTX-1, a novel beta-lactamase. J
Antimicrob Chemother. 20(3):323-34. 1987;
- SIROT, D.L.; GOLDSTEIN, F.W.; SOUSSY, C.J.; COURTIEU, A.L.;
HUSSON, M.O.; LEMOZY, J.; MEYRAN, M.; MOREL, C.; PEREZ, R.;
QUENTIN-NOURY, C. Resistance to cefotaxime and seven other beta-
lactams in members of the family Enterobacteriaceae: a 3-year survey in
France. Antimicrob Agents Chemother.36(8):1677-81. 1992.
- SOUZA JÚNIOR, M.A.; FERREIRA, E.S.; CONCEIÇÃO, G.C.
Betalactamases de espectro ampliado (ESBL): um importante
mecanismo de resistência bacteriana e sua detecção no laboratório
clínico. Newslab. 63ªed, 2004.
- SVANBORG-EDÉN, C.; DE MAN, P.; JODAL, U.; LINDER, H.;
LOMBERG, H. Host parasite interaction in urinary tract infection. Pediatr
Nephrol. 1(4):623-31. Review. 1987.
- STURENBURG, E.; MACK, D. Extended-spectrum beta-lactamases:
implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection
control. J Infect. 47(4):273-95. 2003.
93
- STURENBURG, E.; SOBOTTKA, I.; LAUFS, R.; MACK, D. Evaluation of
a new screen agar plate for detection and presumptive identification of
Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases.
Diagn Microbiol Infect Dis. 51(1):51-5. 2005.
- SUNDE, M. Prevalence and characterization of class 1 and class 2
integrons in Escherichia coli isolated from meat and meat products of
Norwegian origin. J. Antimicrob. Chemother. 56, 1019-1024. 2005.
- TEIXEIRA, P. J. Z., HERTZ, F. T., CRUZ, D. B. Pneumonia associada à
ventilação mecânica: impacto da multirresistência bacteriana na
morbidade e mortalidade. J. bras. pneumol.,30 (6), 540-548, 2004.
- TENOVER, F. Mechanismis of antimicrobial resistance in bacteria.
American Journal of Infection Control. 34:S3-S10, 2006.
- TORTORA, J.; FUNKE, B.; CASE, C. Microbiologia. 6ª edição, São
Paulo, Artmed, p.827, 2002.
- TRABULSI, L. R; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4ª. ed. São Paulo:
Editora Atheneu, v. 1. p. 718 , 2005.
- VAN BELKUM, A., STRUELENS, M., DEVISSER, A., VERBRUGH, H. &
TIBAYRENC, M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary
genetics, and microbial epidemiology. Clin Rev Microbiol 14, 547±560,
2001.
- WALSH, C.T.; FISHER, S.L.; PARK, I.S.; PRAHALAD, M.; WU, Z.
Bacterial resistance to vancomycin: five genes and one missing
hydrogen bond tell the story. Chem Biol.3(1):21-8. Review. 1996.
94
- WILES, T.J., KULESUS, R.R.; MULVEY, M.A. Origins and virulence
mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. Experimental and
Molecular Pathology 85 11–19, 2008.
- WISE, R. The relentless rise of resistance? Journal of Antimicrobial
Chemotherapy 54(2):306-310. 2004
- WEBBER, M. A.; PIDDOCK, L. J. V. The importance of efflux pumps in
bacterial antibiotic resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy.51,
9–11. 2003.
- WEGENER, H.C. Antibiotics in animal feed and their role in resistance
development. Current opinion in Microbiology. V6, I5, P439-445.2003.
- WEINSTEIN, R.A.; NATHAN, C.; GRUENSFELDER, R.; KABINS, S.A.;
Endemic aminoglycoside resistance in gram-negative bacilli:
epidemiology and mechanisms J Infect Dis. 141(3):338-45. 1980
- WHITE, D.G.; ZHAO, S.; McDERMOTT, P.F. et al. Characterization of
antimicrobial resistance among Escherichia coli O111 isolates of animal
and human origin. Microb. Drug Resist. 8:139-46, 2002.
- WILLIAMSON, R.; CALDERWOOD, S.B.; MOELLERING, R.C. JR.;
TOMASZ, A. Studies on the mechanism of intrinsic resistance to beta-
lactam antibiotics in group D streptococci. J Gen Microbiol. 129(3):813-
22. 1983.
95
- WORLD HEALTH ORGANIZATION. Informal Information Meeting on
Antimicrobial Resistance Surveillance in Foodborne Pathogens. Geneva:
WHO. 1999.
- YAMAMOTO S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia
coli. J Infect Chemother 13: 68-73, 2007.
- YAMAMOTO, S.; TSUKAMOTO, T.; KURAZONO, H.; TAKEDA, Y.;
YOSHIDA, O. Distribution of virulence factors in Escherichia coli isolated
from urine of cystitis patient. Microbiology and Immunology 39, 401–404.
1995.
- YAMAMOTO, S.; TERAI, A.; YURI, K.; KURAZONO, H.; TAKEDA, Y.;
YOSHIDA, O.; Detection of urovirulence factors in Eschericiha coli by
multiplex polymerase chain reaction. FEMS Immunol Med Microbiol
12:85–90./3.1995.a
- TERAI, A.; YAMAMOTO, S.; MITSUMORI, K.; OKADA, Y.; KURAZONO,
H.; TAKEDA, Y.; YOSHIDA, O. Escherichia coli virulence factors and
serotypes in acute bacterial prostatitis. Int J Urol 4:289–97. 1997.
- YAN, F.; POLK, D.B. Commensal bacteria in the gut: learning who our
friends are. Curr. Opin. Gastroenterol. 20, 565–571, 2004.
- YANG, Y.L.; LAUDERDALE, T.L.; LO, H.J. Molecular mechanisms of
fluoroquinolone resistance in Klebsiella. Curr Drug Targets Infect
Disord;4(4):295-302. Review. 2004.
96
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo