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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS
TESE DE DOUTORADO
KYVIA BEZERRA MOTA
Análise energética in silico das interações:
ERα-Tamoxifeno, ERα-Raloxifeno e Integrina αVβ3-Cilengitide
NATAL – RN
2016
KYVIA BEZERRA MOTA
Análise energética in silico das interações:
ERα-Tamoxifeno, ERα-Raloxifeno e Integrina αVβ3-Cilengitide.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (PpgDITM/UFRN) como requisito
para obtenção do título de Doutor em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em
Medicamentos.
Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco (UFRN)
Co-orientador: Prof. Dr. Eudenilson L. Albuquerque (UFRN)
NATAL – RN
2016
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte.UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Mota, Kyvia Bezerra.
Análise energética in silico das interações: ERα-Tamoxifeno, ERα- Raloxifeno e Integrina αVβ3-Cilengitide / Kyvia Bezerra Mota – Natal, 2016.
124f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.
Coorientador: Prof. Dr. Eudenilson Lins de Albuquerque.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e
Inovação Tecnológica em Medicamentos. Centro de Ciências da Saúde.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
1. Modelagem molecular – Tese. 2. Teoria do funcional da densidade –
Tese. 3. Fracionamento molecular com capuzes conjugados – Tese. I. Fulco,
Umberto Laino. II. Albuquerque, Eudenilson Lins de. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 577.2
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo dom da vida
A você minha filha Mila, anjo que ilumina os meus passos, eternas saudades.
A minha mãe pelo incentivo, apoio, carinho e amor, que me são dados em todos os momentos
da minha vida.
Ao meu pai, professor Carlos Fernando Mota (in memorian) pelo cuidado na minha formação e
por ter despertado em mim o gosto pelas ciências exatas.
Aos meus filhos Marta Maria e Rui Cesar que transformam minha vida em alegria.
Ao meu marido Rui Veiga, que através de sua ajuda nas traduções dos artigos dessa tese, e que
graças à sua sensibilidade e suas palavras de sensatez tornaram tudo possível.
Ao Prof. Dr. Umberto Laino Fulco pela inestimável orientação, amizade, pela paciência e por ter
acreditado que este trabalho seria possível.
Ao professor Eudenilson Lins de Albuquerque, por sempre escutar atentamente todos os que o
procuram e pelo exemplo de dedicação e entusiasmo ao ensino e pesquisa na UFRN.
A Katy pela inestimável ajuda na revisão final dessa tese, sem a qual seria impossível esse
resultado.
Os jovens cientistas José Xavier, Jonas e Jefferson Caio pelas explicações técnicas, correções e
ajuda nesse trabalho.
Aos professores do PpgDITM pelos ensinamentos que me fizeram ver muito além do
“prescrever medicamentos”.
À diretoria da Maternidade Januário Cicco pela oportunidade e compreensão durante a minha
jornada do doutorado
Aos novos colegas da Escola Paulista de Medicina pela sensatez e dispensa da minha carga
horária para ser possível a conclusão dessa jornada.
Por fim, a todos os demais que colaboraram direta e indiretamente para a concretização deste
trabalho e que compartilharam comigo os seus conhecimentos.
“É preciso ser valente pra entender um Deus Que nos leva de repente a mesma vida que deu.
Quem plantou esta semente, Com a própria mão colheu.
É preciso ser valente pra enxergar no escuro Ver a vida como é e acreditar no futuro.
Se pra nós o fruto é verde, Pra Deus deve estar maduro.”
(Trecho de VALENTE: Maria Célia Monteiro, Grace Gomes e Nizan Guanaes)
RESUMO
Essa tese trata de duas pesquisas com diferentes naturezas conceituais
no campo da modelagem molecular, porém baseadas em semelhantes
princípios teóricos da física quântica e da química computacional. No primeiro
estudo, as estabilidades dos sistemas ERα-OHT (Receptor α de Estrógeno-
Hidroxitamoxifeno), ERα-RAL (Receptor α de Estrógeno-Raloxifeno) e Integrina
αvβ3-Cilengitide foram determinadas em termos energéticos a partir da técnica
de fracionamento molecular com capuzes conjugados (MFCC) e no escopo da
teoria do funcional da densidade (DFT) seguindo o esquema GGA-PBE-
Grimme para calcular a interação energias dos sistemas estudados. No
primeiro estudo, foi possível predizer a relevância individual dos aminoácidos
Glu, Asp, Arg, Lys no sistema com o Tamoxifeno e Glu, Asp e Lys com o
Raloxifeno. Para isso ser possível, as forças de atração e repulsão dos
resíduos que compõem os sistemas foram calculadas. Cada um desses
resíduos apresentou uma energia de interação que variou dependendo da
natureza química da sua cadeia lateral, do ambiente de microsolvatação que o
envolve e dos contatos intermoleculares que estabelece. O estudo pioneiro da
estabilidade conformacional em termos energéticos de uma região livre de
aminoácidos incitará pesquisas centradas no desenvolvimento e síntese de
novos antagonistas utilizados no tratamento de diversas patologias comuns na
população geral. No segundo estudo, foram determinadas as propriedades
energéticas do sistema Integrina αVβ3-Cilengitide, cuja estrutura cristalográfica
apresenta cátions Mn+2. Observou-se a importâncias dos aminoácidos Ser,
Asp, Leu, Arg, Lys, Ala e Pro na interaçao da integrina com o fragmento RGD
(R: arginina; G: glicina; D: ácido aspártico) do cilengitide. A importância da
integrina com o fragmento RGD no mecanismo de adesão de diversas células
envolvidas nas doenças cancerígenas e também na implantação embrionária
permitirá o desenvolvimento de novas terapias impactantes na sobrevida de
pacientes portadores de diversas neoplasias e na reprodução humana.
Palavras-chave: modelagem molecular, energias de interação, teoria do
funcional da densidade, fracionamento molecular com capuzes conjugados,
ERα-OHT, ERα-RAL, Integrina αVβ3-RGD, Cilengitide.
ABSTRACT
This thesis deals with two researches with different conceptual nature in
the field of molecular modeling based on similar theoretical principles of
quantum physics and computational chemistry. In the first study the stabilities of
ERα-OHT (Receptor α Estrogen co-crystalyzed with Hydroxytamoxifen), ERα-
RAL (α-Estrogen Receptor co-crystalyzed with Raloxifene) and integrin αvβ3
co-crystalyzed with cilengitide systems were determined in terms of energy from
the Molecular Fractionation Technique Caps Conjugates (MFCC), and the
scope of the Density Functional Theory (DFT) following GGA-PBE-Grimme
scheme for calculating the interaction energy of the systems studied. In the first
study, it was possible to predict the relevance of individual amino acids Glu,
Asp, Arg, Lys in the system with Tamoxifen and Glu, Asp and Lys in Raloxifene
system. For this to be possible, the attraction and repulsion forces of the
residues that comprise the systems were calculated. Each of these residues
had an energy of interaction that varied depending on the chemical nature of
the side chain, the microsolvation environment that surrounds and
intermolecular contacts establishing. The pioneer study of conformational
stability in terms of energy of free amino acid region will encourage research
focusing on the development and synthesis of new antagonists used in the
treatment of several common diseases in the general population. In the second
study, we determined the energetic properties of Integrin αVβ3-cilengitide
system, whose crystallographic structure has Mn+2 cations. It was noted the
importance of amino acids Ser, Asp, Leu, Arg, Lys, Ala and Pro in integrin
interaction with the RGD fragment (R: arginine; G: glycine; D: aspartic acid) of
cilengitide. The importance of integrin with the RGD fragment in the adhesion
mechanism of various cells involved in cancers and in embryo implantation
allows the development of new therapies impacting on survival of patients with
various forms of neoplasms and in human reproduction.
Keywords: molecular modeling, interaction energies, the density
functional theory, molecular fractionation conjugated caps, ERα-OHT, ERα-
RAL, Integrin αVβ3-RGD, cilengitide.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação estrutural dos receptores de estrógeno-α no domínio
LDB (ERα-LBD) complexado com 4-hidroxitamoxifeno (PDB ID: 3ERT) (SHIAU,
1998). A esfera denota o bolsão de ligação de raio r. ........................................... 30
Figura 2: Representação do OHT e RAL em pH fisiológico e distribuição da
densidade eletrônica. (a) Estrutura química subdividida em quatro partes para
auxiliar a análise das suas interações com Erα; (b) densidade de eletrônica
projetada sobre um potencial eletrostático de isosuperfície mostrando regiões
negativa e positivamente carregadas destacadas com as cores vermelha e
azul, respectivamente. ................................................................................................ 42
Figura 3: Energia de interação total dos SERMs OHT e RAL considerando o
raio r = 4.0 Å, 6.0 Å, 11.5 Å, 13.0 Å e 15.0 Å, a partir do cálculo utilizando GGA-
PBE-Grimme como funcional de troca e correlação. O valor absoluto de E (r)
obedece a sequência OHT > RAL reproduzindo dados experimentais (CLEGG
et al.,2005; KUIPER et al.,1998). .............................................................................. 43
Figura 4: Painel gráfico BIRD que mostra os resíduos mais relevantes da Erα
que contribuem para a ligação de cada ligante: (a) OHT e (b) RAL. .................. 45
Figura 5: Disposição dos resíduos de aminoácidos mais envolvidos na ligação
ER-SERMs. Contatos entre droga-resíduo são representadas por linhas
tracejadas e as suas distâncias. (a) OHT e (b) RAL.............................................. 52
Figura 6: Isosuperfícies de potencial eletrostático com as densidades
eletrônicas para os SERMs interagindo com os resíduos mais atraentes: (a)
OHT e (b) RAL.............................................................................................................. 53
Figura 7: Classificação da família das integrinas e seus respectivos receptores.
Adaptado de KINASHI, 2005. .................................................................................... 58
Figura 8: Arquitetura de domínio de um heterodímero de integrina. Adaptado de
Gahmberg et al., 2009. ............................................................................................... 60
Figura 9: Representação estrutural da integrina em complexo com o cilengitide,
são representadas as subunidades α e β montadas em uma cabeça ovoides e
duas caudas quase paralelas (PDB ID: 1L5G) (PROWSE et al., 2011). A bolsa
de ligação esférica de raio r também é apresentada nesta figura com um círculo
pontilhado em linha na cor preta em torno do ligante cilengitide. ........................ 66
Figura 10: A energia total de interação como uma função raio r no bolso de
ligação calculada utilizando-se o funcional B97D e GGA. Os resíduos de
aminoácidos responsáveis pelas regiões da variação negativa e positiva mais
acentuada são realçados............................................................................................ 72
Figura 11: Arranjo do sítio de adesão dependente de íons metálicos (MIDAS) e
o resíduos de aminoácidos encontrados na integrina αVβ3. ................................. 73
Figura 12: BIRD painel gráfico que mostra os mais relevantes resíduos que
contribuem para o complexo de integrina αVβ3 cilengitide, distâncias mínimas
entre cada resíduo e o ligante, bem como a região e os átomos dos ligantes
mais próximos de cada resíduo no sítio de ligação. .............................................. 77
Figura 13 - Os principais resíduos de aminoácidos e suas respectivas
interações intermoleculares com o complexo cilengitide- integrina αVβ3 (a)
Região I; (b) Região II; (c) as regiões II e III; (d) Região III. regiões IV e V não
são mostradas aqui porque apresentam poucos contatos com resíduos de
aminoácidos. Potenciais ligações de hidrogênio são indicadas por linhas
tracejadas. ..................................................................................................................... 81
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Energias de interação para OHT. ......................................................... 48
Tabela 2 - Energias de interação para RAL. .......................................................... 49
Tabela 3 - Principais integrinas encontradas em vertebrados, seus ligantes e
seus locais de distribuição. Adaptado de HYNES, 1992. .................................... 59
Tabela 4- Energias dos resíduos, grupo atômico, camada de interação,
distância mínima e ligação MFCC entre cada um dos 76 resíduos de
aminoácidos dos domínios β-hélice e βA. Os valores de energia foram
calculados uti lizando GGA com o funcional B97D + D3. ..................................... 75
Lista de Símbolos e Abreviaturas
A Aminoácido Alanina
AMPc Monofosfato Cíclico de Adenosina
BIRD Binding site, Interaction energy and Residues Domain
BSSE Erro de sobreposição de base
C Aminoácido Cisteína
CRH Hormônio Liberador de Corticotrofina
D Aminoácido Aspartato
DBD Domínio de Ligação de DNA
DFT Teoria do Funcional de Densidade
DNA Ácido desoxirribonucleico
E Aminoácido Glutamina
EGF Fator de Cresciento Epidérmico
ER Receptor de Estrógeno
F Aminoácido Fenilalanina
FA Adesão Focal
FSH Hormônio Folículo Estimulante
G Aminoácido Glicina
GGA Aproximação do Gradiente Generalizado
GMPc Monofosfato Cíclico de Guanosina
GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas
H Aminoácido Histidina
HF Método de Hartree Fock
HRE Hormone Response Element
I Aminoácido Isoleucina
ICAMs Moléculas de Adesão Intercelulares
IGF-1 Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1
INCA Instituto Nacional do Câncer
K Aminoácido Lisina
KS Método de Abordagem Kohn-Sham
L Aminoácido Leucina
LBD Domínio de Ligação ao Ligante
LH Hormônio Luteinizante
LIMBS
M Aminoácido Metionina
MEC Matriz Extracelular
MFCC Fracionamento Molecular por Capas Conjugadas
MIDAS Sítio de Adesão Dependente de Íon Metálico
NR Receptores Nucleares
P Aminoácido Prolina
PDB Protein Data Bank
PSI Plexina-Semaforina-Integrina
PTH Paratormônio
QM/MM Quantum Mechanics/Molecular Mechanics
R Aminoácido Arginina
RCSB Research Collaboratory for Structural Bioinformatics
RGD Arginina-Glicina-Aspartato
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RNAm Ácido Ribonucleico tipo mensageiro
S Aminoácido Serina
SERM Modulador Seletivo dos Receptores de Estrógeno
SyMBs Locais de Ligação Sinérgica ao Íon Metálico
T Aminoácido Tirosina
TGF-β Fator de Transformação do Crescimento tipo β
TRH Hormônio Liberador de tireotrofina
TSH Hormônio Tireoestimulante
V Aminoácido Valina
VCAM-1 Molécula de Adesão Vascular-1
vWF Fator de Von Willebrand
W Aminoácido Triptofano
Y Aminoácido Tirosina
Sumário
INTRODUÇÃO.................................................................................................................15
INTERAÇÃO ENTRE O RECEPTOR DO ESTRÓGENO α E MODULADORES
SELETIVOS .....................................................................................................................20
2.1 Introdução ................................................................................................................21
2.1.1 Câncer de Mama................................................................................................21
2.1.2 Hormônios .........................................................................................................22
2.1.3 Hormônios Esteroides......................................................................................25
2.1.4 Receptor de Esteroide ......................................................................................27
2.1.5 Ligantes: Tamoxifeno e Raloxifeno (SERMs) ................................................30
2.2 Bioquímica Computacional ....................................................................................32
2.2.1 Métodos ab initio...............................................................................................33
2.2.2 Teoria do Funcional da Densidade .................................................................34
2.2.3 Energia de Troca-correlação ...........................................................................35
2.2.4 Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC) .........................36
2.3 Objetivos...................................................................................................................37
2.3.1 Objetivos Gerais................................................................................................37
2.3.2 Objetivos Específicos.......................................................................................37
2.4 Materiais e Métodos ................................................................................................37
2.4.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica ..........................................................38
2.4.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização das Estruturas .....38
2.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional ....39
2.5 Resultados e Discussões .......................................................................................41
2.6 Conclusões ..............................................................................................................53
INTERAÇÃO ENTRE INTEGRINA αVβ3 E CILENGITIDE .............................................56
3.1 Introdução ................................................................................................................57
3.1.1 Estrutura das Integrinas ..................................................................................59
3.1.2 Funções das Integrinas....................................................................................62
3.1.3 Sinalização Mediada por Integrinas................................................................62
3.1.4 Integrina αVβ3 .....................................................................................................64
3.1.5 Cilengitide ..........................................................................................................66
3.2 Objetivos...................................................................................................................67
3.2.1 Objetivos Gerais................................................................................................67
3.2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................68
3.3 Materiais e Métodos ................................................................................................68
3.3.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica ..........................................................68
3.3.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização da Estrutura .........68
3.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional ....69
3.4 Resultados e Discussões .......................................................................................70
3.5 Conclusões ..............................................................................................................82
CONCLUSÃO GERAL E PESPECTIVAS ......................................................................84
REFERÊNCIAS ...............................................................................................................87
ANEXO 1 .......................................................................................................................109
ANEXO 2 .......................................................................................................................117
15
INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
16
1.1 Introdução
A saúde configura-se um tema complexo e multidisciplinar, influenciada
por uma variedade de fatores: fisiológicos, bioquímicos, psicológicos,
ambientais e sociais. Neste contexto, o aumento da população mundial, bem
como também da sua expectativa de vida, tem gerado um acréscimo nos casos
de doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes e câncer, entre
outras, elevando a sua importância entre os maiores desafios modernos na
busca por novas alternativas terapêuticas.
O câncer é caracterizado pela multiplicação descontrolada de células do
organismo (BAROT, 2013; ROSALES-HERNADEZ et al, 2009). Estas células
perdem os mecanismos que regulam o crescimento e a multiplicação, devido
normalmente a danos do material genético celular (DNA). Estes danos são
causados, dentre outros fatores, por agentes externos, como o fumo, radiação
solar, vírus ou alimentação. Esta doença caracteriza uma das principais causas
de morte no mundo e um dos principais problemas de saúde pública em países
desenvolvidos e em desenvolvimento.
Estima-se que no Brasil, biênio 2016-2017, haverá a ocorrência de cerca
de 600 mil novos casos de câncer. O perfil epidemiológico observado no país
demonstra que os tipos mais frequentes em homens serão próstata, pulmão,
intestino, estômago e cavidade oral. Já em mulheres, os cânceres de mama,
intestino, colo do útero, pulmão e estômago figurarão entre os principais tipos
(INCA, 2016).
É compreendido que a predisposição particular de cada indivíduo tem
uma atribuição determinante na resposta ao surgimento da doença, porém não
é possível precisar em que grau esse fator possa influenciar a relação entre a
dose e o tempo de exposição ao carcinógeno e a resposta individual à
exposição. Independentemente da exposição a carcinógenos, as células
sofrem processos de mutação espontânea, que não alteram o desenvolvimento
normal da população celular como um todo. Em síntese, a carcinogênese pode
iniciar-se de forma espontânea ou ser provocada pela ação de agentes
carcinogênicos (químicos, físicos ou biológicos) (DEVITA et al, 2005). Apesar
da grande quantidade de estudos associados ao câncer, a biologia, a etiologia
17
e a fisiopatologia do câncer não estão totalmente estabelecidas, principalmente
devido a obstáculos ao estudo in vivo de uma variedade de fatores envolvidos
na sua gênese (RANG; DALE; RITTER, 2001).
Os tratamentos disponíveis para o câncer muitas vezes não demonstram
a eficácia pretendida, o que explica o grande interesse no desenvolvimento de
novos agentes anticâncer. Mesmo com diversas opções no mercado, a
complexidade da doença é o grande entrave para o seu tratamento (BEGLEY;
ELLIS, 2012). O arsenal terapêutico disponível atualmente, para o tratamento
do câncer, mostra-se muitas vezes ineficaz no controle dessa doença,
sobretudo nos tipos mais agressivos.
Os agentes quimioterápicos usualmente empregados agem no
maquinário genético da célula e não raramente tornam-se obsoletos devido à
resistência desenvolvida pelos tumores. Associa-se a isso alta incidência de
eventos adversos decorrentes da inespecificidade desses fármacos (ROCHE,
2008). Tendo em vista esses problemas e o crescente número de casos de
neoplasias no Brasil e no mundo, faz-se extremamente necessário o
conhecimento preciso da bioquímica estrutural dos compostos utilizados como
agentes anticâncer, bem como seus mecanismos de ligação, conduzindo para
um melhor entendimento de como estes agem sobre os tumores.
Neste sentido, a utilização de ferramentas computacionais baseadas em
química quântica pode prover um passo promissor, já que surgem como uma
alternativa simples e eficiente para o entendimento e desenvolvimento de
novos alvos terapêuticos. O uso destas ferramentas tende a promover o
desenvolvimento de pesquisas experimentais e de bioengenharia, visto que
permitem uma melhor compreensão dos mecanismos de ligação que envolvem
um fármaco ao seu alvo (BARREIRO; FRAGA, 2001; ROCHE, 2008; RUSSO,
2002).
A modelagem molecular constitui um capítulo das ciências naturais que
tem evoluído bastante nos últimos anos, de tal forma que hoje ela está
integrada em boa parte das pesquisas físicas, químicas e genéticas. A
expansão dessa área do conhecimento deve-se, entre outros fatores, aos
avanços conceituais na química teórica, especialmente no campo da mecânica
quântica; ao rápido desenvolvimento dos recursos computacionais; assim como
18
à constante evolução das funcionalidades dos softwares modernos para
análise de estruturas moleculares, que permitem uma complexa caracterização
eletrônica e termodinâmica dos modelos estudados (BULTINCK;
TOLLENAERE; WINTER, 2003; ANDRICOPULO; MONTANARI, 2005; YAN et
al., 2011).
Assim, observa-se que o emprego de metodologias de modelagem
molecular permite gerar conhecimentos sobre fatores estruturais, parâmetros
geométricos e energéticos, propriedades eletrônicas fundamentais para o
estudo de moléculas isoladas ou mesmo sistemas macromoleculares
complexos. Diante disso, neste trabalho, foram utilizadas técnicas quânticas de
modelagem molecular no estudo das energias de interação de modelos
biológicos complexos envolvendo a interação entre o receptor α de estrógeno e
os moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs) 4-
hidroxitamoxifeno e raloxifeno. E também uma análise da interação entre a
integrina αVβ3 e o cilengitide.
Esta tese compreende a descrição de duas pesquisas distintas, mas
estritamente inseridas no campo da modelagem molecular. A tese está
organizada como segue:
Primeiramente, descreve-se o emprego de métodos da bioquímica
quântica baseada na Teoria do Funcional da Densidade modelo (DFT) e a
técnica MFCC (Fracionamento Molecular com Caps conjugado) para
desvendar as interações energéticas detalhadas entre os agentes SERMs 4-
hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL), amplamente utilizado no
tratamento do câncer de mama, co-cristalizados com o receptor α de estrógeno
(Erα). Os resultados computacionais demonstraram ser de grande importância
no entendimento das peculiaridades que envolvem as interações descritas (ver
Anexo 1).
A seguir, apresenta o estudo que explora a interação energética entre o
pentapeptídeo cilengitide e a integrina αVβ3. A metodologia utilizada para a
descrição energética baseia-se, também, na Teoria do Funcional da Densidade
modelo (DFT) e na técnica MFCC. Os resultados demonstrados denotam uma
compreensão a respeito das interações particulares que ocorrem no complexo
(ver Anexo 2).
19
No último capítulo apresentamos nossas conclusões e algumas
possíveis pespectivas deste trabalho.
20
INTERAÇÃO ENTRE O
RECEPTOR DO ESTRÓGENO α
E MODULADORES SELETIVOS
_______________________________________________________________
21
2.1 Introdução
2.1.1 Câncer de Mama
É irrefutável que o câncer é um problema de saúde pública,
principalmente entre os países em desenvolvimento, onde espera-se que, nas
próximas décadas, o efeito do câncer na população chegue a 80% dos mais de
20 milhões de novos casos estimados para 2025. Em mulheres brasileiras, as
maiores frequências de casos de câncer encontradas são mama, intestino,
pulmão, colo do útero e estômago. Para o Brasil, em 2016, são esperados
57.960 casos novos de câncer de mama, com um risco estimado de 56,20
casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2016).
O câncer de mama é uma doença sistêmica de caráter biológico
variável, logo, apresenta conduta terapêutica complexa que, em diversos
casos, os bons resultados (de melhor prognóstico) dependem de um
diagnóstico precoce. Contudo, existe uma porcentagem de casos, cuja
detecção é rápida, mas a evolução não é favorável (mau prognóstico). É
provável que o perfil genético possa regular e diferenciar grupos específicos
que serão beneficiados com determinados tratamentos (PEROU et al., 2000;
QUACKENBUSH, 2006).
É um dos tipos de câncer mais temidos pelas mulheres, devido à sua
alta frequência e efeitos psicológicos (INCA, 2016), tais como: alterações da
sexualidade e da imagem corporal, medo de recidivas, ansiedade, dor e baixa
autoestima (CANTINELI et al., 2006). Os principais sinais e sintomas de câncer
de mama são nódulo na mama e/ou axila, dor mamária e alterações da pele
que recobre a mama, como abaulamentos ou retrações com aspecto
semelhante à casca de laranja (INCA, 2016). Os cânceres de mama localizam-
se, principalmente, no quadrante superior externo, e em geral, as lesões são
indolores, fixas e com bordas irregulares, acompanhadas de alterações da pele
quando em estádio avançado (SMELTZER et al., 2006).
Alguns fatores de risco influenciam o aumento da incidência do câncer
de mama (BERNSTEIN, 2002; FRIMAN et al., 2007), como as mudanças nos
22
hábitos (maior consumo e ingesta de gorduras não saudáveis, sedentarismo e
consumo exagerado de álcool) (MICHELS et al., 2007), como também os
fatores reprodutivos que favorecem a maior exposição estrogênica (menarca
precoce, uso de anticoncepcionais, terapia hormonal, gestação tardia, menor
tempo de amamentação).
Muitos estudos demonstram que o estrógeno é um importante agente
promotor da carcinogênese mamária por aumentar o nível de proliferação das
células, acrescentando, deste modo, o risco de formação de atipias (YAGER;
LIEHR, 1996; ZHENG et al., 1998; RUSSO et al., 2007). Além disso, foi
verificado que alguns metabólitos estrogênicos, como o 4-hidroxiestradiol e o
16 α-hidroxiestradiol, possuem capacidade de induzir a carcinogênese, por
promover lesão genotóxica no DNA da célula mamária (FISHMAN et al., 1984;
MUTI et al., 2000).
2.1.2 Hormônios
As diversas funções do organismo devem ser aptas a responder, de
modo coordenado e apropriado, a distintas modificações físicas e químicas,
oriundas de dentro ou fora do organismo. Os sistemas nervoso e endócrino,
agem de forma integrada na regulação do metabolismo. No primeiro, a
comunicação ocorre por meio de neurotransmissores, tais como a
noradrenalina, acetilcolina ou serotonina, que cobrem uma curtíssima fenda
sináptica existente entre os neurônios. Já no segundo, há a ação de
mensageiros químicos denominados hormônios, que são sintetizados e
armazenados nas glândulas endócrinas, e, quando requeridos, estão prontos
para serem liberados no sistema circulatório pelo processo de exocitose.
Estando no sistema circulatório, os hormônios podem atingir células-alvo
distantes, e a retenção e absorção, são dependentes de receptores específicos
com alta afinidade, localizados na superfície da membrana plasmática da
célula, ou no núcleo celular. Logo, os hormônios são moduladores de reações
enzimáticas do metabolismo, participando de funções específicas, como
crescimento celular, tissular e metabolismo (HADLEY, 1988; NORMAN, A. W.,
LITWACK, 1987).
Os hormônios podem ser divididos em quatro classes, de acordo com
sua estrutura química, síntese e armazenamento, solubilidade, meia-vida,
23
transporte, receptores celulares e mecanismo de ação (NORMAN; LITWACK,
1987), sendo eles:
Peptídeos: estes hormônios são compostos por aminoácidos, podendo
variar entre 3 ou até mais de 180 aminoácidos. É a classe mais
numerosa de hormônios. Os principais locais de produção são o
hipotálamo, hipófise, ilhotas pancreáticas, placenta, paratireoide e trato
gastrointestinal.
Esteroides: produzidos a partir do colesterol, nos tecidos
esteroidogênicos das adrenais, gônadas e placenta. Nas adrenais são
produzidos os glicocorticoides (cortisol, corticosterona e cortisona) e os
mineralocorticoides (aldosterona). As gônadas produzem os andrógenos
(testosterona), estrógeno e progesterona.
Aminas: sintetizados pela medula adrenal, em algumas células
nervosas, e na tireoide. Incluem as catecolaminas e as iodotironinas. Os
mecanismos de ação das catecolaminas são similares aos peptídeos e
as iodotironinas têm o seu mecanismo similar aos hormônios
esteroidais.
Eicosanóides: são produzidos exclusivamente na membrana plasmática
das células de quase todos os tecidos e podem ser considerados como
segundos mensageiros intracelulares. São derivados do ácido
araquidônico, liberado por fosfolipídios originados da ação das
fosfolipases, ativadas por estímulos hormonais. Os eicosanóides
incluem as prostaglandinas, os leucotrienos e os tromboxanos.
A secreção hormonal pode seguir estímulos, estabelecendo ciclos ou
ritmos de vários tipos, assim como ritmo circadiano (diário), ultradiano (horas) e
circalunar (mensal). Alguns hormônios, não entram na circulação sanguínea,
mas podem ir até a célula-alvo por difusão passiva, como algumas
prostaglandinas (GONZALEZ; CERONI, 2006). Os hormônios esteroides e
tireoidianos, são transportados pelo sangue, mediante proteínas específicas, e
isso limita sua difusão através dos tecidos, mas os protege da degradação
enzimática. Porém, devem estar na forma livre para a entrada nas células-alvo.
24
Os mecanismos que controlam a secreção dos hormônios, estão
basicamente centralizados na regulação do tipo feedback. Um exemplo deste
tipo de regulação é a manutenção dos níveis plasmáticos de 𝐶𝑎2+ e glicose no
sangue, uma queda de 𝐶𝑎2+ plasmático, leva à produção de PTH pela
paratireóide (feedback negativo), e um aumento nos níveis de glicose
sanguínea, leva a um aumento da produção de insulina pelas ilhotas
pancreáticas (feedback positivo) (GONZALEZ; CERONI, 2006). Há um
mecanismo de feedback mais complexo, e estes podem ser de “alça longa”,
sendo predominantemente negativos, nos quais os hormônios secretados pelos
órgãos efetores (esteroides sexuais, glicocorticóides, hormônios tireoidianos),
têm efeito negativo sobre a secreção dos hormônios tróficos hipofisários (LH,
FSH, ACTH, TSH) e sobre os hormônios hipotalâmicos (GnRH, CRH, TRH).
Podem ser também de “alça curta” ou de “alça ultracurta”, que agem a nível do
eixo hipotálamo-hipófise, de forma mais rápida. Os hormônios hipotalâmicos
são liberados, obedecendo a uma regulação negativa, podendo exercer um
efeito positivo (liberador), ou negativo (inibidor) (GUYTON; HALL, 2006).
Quanto ao mecanismo de ação, os hormônios atuam através de
receptores específicos existentes nas células-alvo. Os receptores promovem o
meio pelo qual os hormônios interagem preliminarmente com as células,
podendo localizar-se na membrana plasmática, citosol e no núcleo celular. Os
receptores são proteínas nas quais, os hormônios correspondentes, com alta
especificidade e afinidade, provocam mudanças conformacionais que
desencadeiam reações modificadoras do metabolismo da célula-alvo,
constituindo a resposta celular. Estes receptores podem variar quanto ao
número para cada tipo de célula, com isso variam o grau de resposta. A
interação hormônio-receptor é forte, mas não covalente, sendo equivalente à
interação de um efetor alostérico com a enzima que o regula. O sítio de
reconhecimento é esteroespecífico, onde somente se une o hormônio
correspondente ou moléculas similares. (GONZALEZ; CERONI, 2006;
NORMAN; LITWACK, 1987). São descritos basicamente dois tipos de
mecanismos de ação hormonal. Os hormônios que possuem seus receptores
na superfície externa da membrana plasmática das células-alvo, que exercem
seus efeitos pela alteração da permeabilidade da membrana, ou pela ativação
25
de enzimas. A adenilciclase e a guanilciclase, que produzem AMPc e GMPc
respectivamente, são conhecidos como “segundos mensageiros” e têm suas
concentrações aumentadas no interior da célula em resposta ao hormônio
primário, regulando e alterando a velocidade de transcrição de genes
específicos. Os hormônios deste grupo são transportados de forma livre pelo
sistema circulatório, sendo um mecanismo de ação rápido, o que promove
rápidas modificações metabólicas. Já os hormônios que atravessam a
membrana plasmática das células-alvo possuem receptores localizados no
núcleo celular. Estas substâncias devem atravessar a membrana plasmática e
o citosol até chegar ao núcleo. A interação hormônio-receptor altera
diretamente a transcrição de genes específicos, requerendo tempo para a
síntese de RNAm no núcleo e uma posterior síntese de proteínas nos
ribossomos. Os hormônios são transportados ligados a proteínas específicas, e
o tempo de ação é de horas, podendo chegar a vários dias (GUYTON; HALL,
2006; HADLEY, 1988).
2.1.3 Hormônios Esteroides
Esteroides são hormônios produzidos pelo córtex da supra-renal, ou
pelas gônadas, os quais são responsáveis por diversas funções no organismo,
tais como controle metabólico e características sexuais. Estes hormônios
derivam da molécula de colesterol. Dois grupos são sintetizados no córtex da
adrenal: os mineralocorticoides, controladores da reabsorção de íons
inorgânicos pelos rins, e os glicocorticoides, que ajudam a regular a
gliconeogênese e reduzem a resposta inflamatória. Os hormônios sexuais são
produzidos pelas gônadas e placenta. Esses últimos incluem progesterona,
regulador do ciclo reprodutivo feminino, andrógenos (como a testosterona) e
estrógenos (como o estradiol). Os hormônios esteroides são efetivos em baixas
concentrações e, portanto, produzidos em pequenas quantidades. A síntese
dos esteroides requer a remoção de alguns ou todos carbonos da cadeia lateral
no C-17 do anel D do colesterol. Essa remoção acontece na mitocôndria dos
tecidos específicos e envolve a hidroxilação de dois carbonos adjacentes (C-20
e C-22) na cadeia lateral, seguindo-se a clivagem da ligação entre eles. A
síntese de muitos hormônios envolve a adição de átomos de oxigênio (COX;
WISCONSIN, 2004).
26
Estrógenos, como 17β-Estradiol, estão envolvidos no crescimento,
desenvolvimento e homeostase de muitos tecidos (CIOCCA; ROIG, 1995). Os
efeitos fisiológicos desses esteroides são mediados por um fator de transcrição
nuclear induzido por ligante, o receptor de estrógeno (ER) (TSAI; O’MALLEY,
1994). Dada a interação entre o ligante e o receptor, inicia-se uma série de
eventos moleculares que ativam ou suprimem genes alvo. A regulação da
transcrição se dá a partir da interação do ER com a maquinaria de transcrição
da célula.
A diminuição da produção de esteroides ovarianos no climatério está
associada a patologias no período pós-menopausa, principalmente
osteoporose e doenças coronarianas (MANOLAGAS; KOUSTENI; JILKA, 2002;
ROSS et al., 1990). A terapia de reposição hormonal é eficiente em reduzir os
riscos associados a essas patologias. No entanto, há um aumento no risco de
câncer de endométrio e de mama (COLDITZ et al., 1995).
Dados experimentais sugerem o papel dos estrógenos no
desenvolvimento do câncer de mama. Apesar dos mecanismos exatos não
serem completamente elucidados, associam-se a esses a alquilação de
moléculas celulares e formação de radicais livres que podem danificar o DNA
(NANDI; GUZMAN; YANG, 1995), ligadas à genotoxicidade do estrógeno e
alguns de seus metabólitos (YAGER; LIEHR, 1996). Os estrógenos, além de
promoverem câncer de glândulas mamárias em roedores, exerceram direta
(através da indução de proteínas envolvidas na síntese de ácido nucleicos e
ativação de oncogenes) e indiretamente (possivelmente através da estimulação
de secreção de prolactina e produção de fatores de crescimento) efeitos
proliferativos em culturas de células cancerígenas – de mama – de humanos
(LUPULESCU, 1993).
A formação do tumor de mama relaciona-se com a estimulação
hormonal excessiva do órgão, cujos crescimento e função encontram-se sob
controle endócrino. A resposta dos tecidos aos efeitos proliferativos do
hormônio pode progredir, passando o crescimento por estágios de
normalidade, hiperplasia e neoplasia. Outros fatores podem contribuir para a
variação de exposição ao estrógeno. Há relação entre peso e risco de câncer
de mama entre mulheres no período pós-menopausa. Mulheres obesas têm
27
menores concentrações da globulina que transporta os hormônios sexuais
(SHBG) e, portanto, maiores concentrações de estrógeno biodisponível quando
comparadas a mulheres mais magras (POTISCHMAN et al., 1996). Além disso,
diferenças na dieta e quantidade de exercícios também podem influenciar a
exposição ao estrógeno. Estudos que relacionam risco de câncer de mama e
ingestão de álcool, gorduras, vitaminas antioxidantes e fibras apresentam
dados conflituosos (CADE; THOMAS; VAIL, 1998; HOLMES et al., 1999;
POTISCHMAN et al., 1999). A incidência de câncer de mama é mais baixa, por
exemplo, em regiões com dieta à base de soja, rica em fitoestrógenos, e
semente de linho, fonte de ligninas e ácido α-linoleico (BRZEZINSKI; DEBI,
1999). No entanto, não se pode determinar se esse efeito é resultado da
ingestão dos fitoestrógenos, das sementes de linho ou de outros fatores (WU et
al., 1998).
A terapia de reposição hormonal tem sido avaliada como fator de risco
para câncer de mama em mulheres no período pós-menopausa. O aumento do
risco encontra-se presente apenas durante a terapia ou por pouco tempo
depois de encerrada a mesma (CANCER, 1997; MAGNUSSON et al., 1999). E,
se a terapia for associação de estrógeno e progesterona, o risco aumenta, em
comparação à terapia baseada apenas na reposição de estrógeno. Apesar
disso, a mortalidade de forma geral entre essas mulheres é reduzida em virtude
da diminuição de mortes relacionadas a doenças cardiovasculares e
osteoporose (GRODSTEIN et al., 1997).
Uma variedade de compostos esteroidais e não-esteroidais que podem
interagir com o receptor de estrógeno foi desenvolvida a fim de ser utilizada
como tratamento para câncer de mama, disfunção uterina e outras desordens
do sistema reprodutor feminino (MIQUEL; GILBERT, 1988). Dentre essas
drogas, estão o tamoxifeno e raloxifeno, antagonistas do ER.
2.1.4 Receptor de Esteroide
Os receptores de hormônios esteroides são fatores de transcrição
intracelulares que existem na forma inativa de apoproteína no citoplasma ou no
núcleo. Após interação com ligante, os receptores passam por um processo de
ativação. O receptor ativado liga-se a um elemento de DNA (HRE, do inglês
28
Hormone Response Element) e ativa a transcrição de um gene ligado a uma
região cis.
Os receptores de estrógeno fazem parte de uma superfamília capaz de
transformar sinais extracelulares, pequenas moléculas lipofílicas, em respostas
de transcrição (MOSSELMAN; POLMAN; DIJKEMA, 1996). Os efeitos
biológicos do 17β-estradiol são mediados por dois receptores distintos, ERα e
ERβ. Apesar de diferentes, esses receptores apresentam grande homologia em
algumas regiões: 97%, na região que se liga ao DNA; 60%, na região de
interação com o ligante (HALL; COUSE; KORACH, 2001). Enquanto o ERα é o
subtipo predominante expresso na mama, útero, cervix, vagina e outros órgãos;
o ERβ tem um padrão de expressão mais limitado e é detectado principalmente
em ovário, próstata, testículos, baço, pulmão, hipotálamo e timo (COUSE et al.,
1997).
O mecanismo clássico de ação do estrógeno é dependente de ligante.
Na ausência de hormônio, o receptor participa de um complexo multiproteico
inibitório dentro do núcleo das células. A interação com o ligante induz uma
mudança na conformação do ER, promovendo, assim, a homodimerização e
alta afinidade para ligar-se a elementos de resposta do DNA. Os receptores
ligados ao DNA recrutam a maquinaria de transcrição direta ou indiretamente,
através de proteínas cofatores (LANZ et al., 1999; MCKENNA; O’MALLEY,
2000; YANG et al., 1996). Outras rotas atualmente conhecidas influenciam o
funcionamento do ER como, por exemplo: diferentes conformações induzidas
por ligantes distintos, modificações do receptor por fosforilação e interações do
receptor com outros fatores de transcrição (MOSSELMAN; POLMAN;
DIJKEMA, 1996).
Ao longo dos anos, algumas alterações moleculares que refletem as
características biológicas dos carcinomas da mama invasivos foram
identificadas e consideradas marcadores moleculares, tais como os receptores
de estrogénio (ERs) (RIVENBARK; O'CONNOR; COLEMAN, 2013), expressos
em aproximadamente 75% dos tumores de mama invasivos (FLAGENG et al,
2015). Através de receptores nucleares (NR), há o controle da transcrição de
genes importantes para o desenvolvimento reprodutivo, neural, esquelético, de
29
crescimento e de processos cardiovasculares (WALLACE et al, 2003; CLEGG
et al., 2005), transformando estes em importantes alvos de drogas.
Semelhante a outros receptores nucleares, os receptores de estrógeno
são caracterizados por apresentar um domínio variável trans N-terminal de
ativação, um domínio de ligação de DNA conservado (DBD), uma região de
dobradiça variável, um domínio de ligação ao ligante conservado (LBD), e um
domínio C-terminal variável (MANGELSDORF et al, 1995). A ligação ER-ligante
para o domínio de ligação (ER-LBD) é codificada dentro de uma região de
cerca de 300 aminoácidos e a sua arquitetura geral é constituída por hélices de
1 a 12 (H1-H12) e duas folhas-β (S1 e S2) (Figura 1). Ela possui a função de
reconhecimento de ligantes e a ativação da resposta fisiológica (FANG et al,
2003). Assim, após o acoplamento do ligante, há um rearranjo de LBD para o
estado ativo com uma mudança na posição da hélice 12. Logo depois, é
seguido por uma formação de dímeros (homo ou heterodímero) que
reconhecem sequências especificas de DNA com a ligação de diversos tipos
de co-ativadores ou co-repressores. Elas estão relacionadas com a ativação da
transcrição/repressão, a fim de mediar a transcrição de vários genes alvo
(AVIOR et al., 2013).
A família de receptores de estrógeno é composta pelo receptor de
estrógeno α (ERα) e o receptor de estrógeno β (ERβ), que são expressos por
uma ampla gama de tecidos e tipos celulares a partir de algum grau de
homologia em sequências (PAULMURUGAN et al., 2011). O ERα é codificado
pelo gene ESR1 no cromossomo 6 e foi encontrado predominantemente no
osso, testículos, epidídimo, próstata, útero, ovário, fígado, glândula mamária,
tecido adiposo, coração, cérebro e sistema vascular. O ERβ é codificado pelo
gene ESR2 no cromossomo 14 e está presente na bexiga, próstata, ovário,
cólon, tecido adiposo, sistema imunológico, coração, pulmão e cérebro
(NILSSON; KOEHLER; GUSTAFSSON, 2011). Em casos de neoplasias
mamárias, é comum ver uma diminuição da expressão de ERβ e um aumento
da resposta proliferativa associada à ativação do ERα (Rody et al, 2005).
Assim, muitos antagonistas/moduladores dos ERα têm sido desenvolvidos no
intuito de inverter a promoção do crescimento celular no câncer da mama,
30
como, já bem estabelecido, o uso de moduladores seletivos do receptor de
estrógeno (SERMs).
Figura 1: Representação estrutural dos receptores de estrógeno-α no domínio LDB (ERα-LBD)
complexado com 4-hidroxitamoxifeno (PDB ID: 3ERT) (SHIAU, 1998). A esfera denota o bolsão de ligação de raio r.
2.1.5 Ligantes: Tamoxifeno e Raloxifeno (SERMs)
Como dito anteriormente, a ativação de transcrição dependente de
ligante por receptores nucleares é mediada por interações com co-fatores. O
grupo de agonistas do receptor promove a ligação desses co-fatores, enquanto
o dos antagonistas, bloqueiam tal ligação. Todos os ligantes interagem
exclusivamente com o domínio C-terminal (LDB, do inglês ligand-binding
domain) (TSAI; O’MALLEY, 1994). O LDB reconhece uma variedade de
compostos distintos em tamanho, forma e propriedades químicas.
Alguns ligantes funcionam como agonistas puros (17β-estradiol, por
exemplo); uns como antagonistas puros; e outros como antagonistas ou
agonistas a depender do tecido-alvo (SMIGEL, 1998). Nesse último grupo,
conhecido como moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs, do
inglês Selective Estrogen Receptor Modulators), estão o tamoxifeno e o
raloxifeno (GRESE et al., 1997). O tamoxifeno é um SERM não-esteroidal
31
antineoplásico que inibe competitivamente a ligação do estradiol ao ER,
evitando, portanto, que o receptor interaja com o elemento de resposta ao
estrógeno no DNA. Isso resulta na diminuição da resposta ao estrógeno. Além
disso, essa droga regula positivamente a produção do fator de crescimento
TGF-β, um inibidor do crescimento de célula tumoral, e regula negativamente o
fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1), estimulante do
crescimento celular no câncer de mama. O raloxifeno faz parte da segunda
geração de SERMs. Assim como o tamoxifeno, esse composto tem atividade
estrogênica e antiestrogênica, dependendo do tecido no qual atua. Nos ossos,
por exemplo, seu efeito é similar ao do estrógeno, reduzindo a reabsorção
óssea e aumentando a densidade mineral. (BRYANT et al., 1999;
MANOLAGAS; KOUSTENI; JILKA, 2002). Por outro lado, no endométrio e nas
mamas, age como antagonista, exercendo papel importante na redução do
risco de câncer invasivo (BRZOZOWSKI et al., 1997; GRESE et al., 1997).
O tamoxifeno é usado no tratamento de câncer de mama desde a
década de 1970. Depois de ter sua eficácia comprovada para estágios mais
avançados, passou a ser adotado como adjuvante no tratamento de câncer de
mama primário operável, tornando-se o método mais utilizado nos casos desse
tipo de neoplasia. Apesar dessa droga demonstrar benefícios no tratamento de
todos os estágios de câncer de mama, vários efeitos adversos foram
reportados (CAULEY et al., 2001; MOURIDSEN et al., 1978; POWLES, 1992).
Dentre as vantagens do uso do tamoxifeno, também estão a alteração no
metabolismo de lipídios e lipoproteína, reduzindo o risco de doenças
coronarianas, e os efeitos benéficos na prevenção osteoporose. No entanto,
insere-se como desvantagem do seu uso, o aumento a incidência de câncer de
endométrio. O uso dessa medicação sinaliza um risco relativo 6,4 vezes maior
para mulheres que receberam 40mg/dia por, no mínimo, 2 anos quando
comparadas às que não fizeram uso da droga (FORNANDER et al., 1989).
Outros estudos sugerem riscos aumentados em 2 a 3 vezes, para dois anos de
uso, e em 3 vezes, para uso acima de cinco anos (VAN LEEUWEN et al.,
1994). Esse fato pode ser explicado pela natureza parcialmente agonista do
tamoxifeno no endométrio (COHEN, 2004; GOTTARDIS et al., 1988). Alguns
trabalhos sugerem que seu efeito estrogênico, especialmente o proliferativo no
32
endométrio, parece estar relacionado à dose, enquanto outros não encontram
tal relação (VAN LEEUWEN et al., 1994).
Estudos sugerem que tanto o tamoxifeno quanto o raloxifeno são
equivalentes em eficácia na diminuição do risco de câncer de mama invasivo.
No caso de câncer endometrial, demonstrou-se que o raloxifeno não
aumentava os riscos quando comparado a placebos (CAULEY et al., 2001;
MARTINO et al., 2004). No entanto, existe diferença quando se compara os
riscos de câncer endometrial a partir do uso de tamoxifeno e raloxifeno, tendo
este último uma taxa de 38% mais baixa que o primeiro. Além disso, o
raloxifeno também foi associado a menores riscos de eventos tromboembólicos
e catarata (VOGEL et al., 2006). CYP
2.2 Bioquímica Computacional
A bioquímica computacional, consiste num conjunto de ferramentas que
utiliza várias ciências (física, química, biologia, matemática, estatística), com o
intuito de analisar, simular e interpretar dados de sistemas biológicos
complexos fundamentais para a resolução de problemas bioquímicos. Por meio
de softwares que realizam cálculos baseados nas equações da física clássica e
quântica, procura-se investigar a representação das estruturas moleculares,
assim como a simulação de seu perfil em um ambiente fisiológico, de modo a
fornecer informações sobre sua geometria (comprimentos de ligação, ângulos
de ligação, ângulos de torção), energia (calor de formação, energia de
ativação), propriedades eletrônicas (momento de dipolo, potencial de ionização,
afinidade eletrônica), e propriedades espectroscópicas (modo de vibração),
entre outras (volume, área de superfície, difusão, viscosidade) (VERLI;
BARREIRO, 2005; MATTA, 2010).
A análise de interações entre proteínas e seus ligantes é uma das
grandes abordagens da bioquímica computacional. Logo, detectar possíveis
sítios e quantificar a energia de interação entre fármacos e suas proteínas alvo,
são uma das abordagens nas quais o estudo bioquímico computacional pode
proporcionar relevante contribuição, visto que se pode através dele, por
exemplo, compreender fenômenos biológicos e discernir o planejamento de
33
novas drogas farmacológicas (VERLI; BARREIRO, 2005). Neste sentido, a
análise estrutural dá agilidade ao processo de descobrimento de fármacos por
intermédio da utilização de estruturas tridimensionais obtidas por técnicas de
difração de raios-X, ressonância magnética nuclear ou geradas por modelagem
molecular (MATTA, 2010; ZHOU, 2010; HENNIG; SATTLER, 2014).
As técnicas de modelagem molecular podem ser classificadas em três
categorias principais: ab initio, métodos semi-empíricos e mecânica molecular.
Destaca-se neste trabalho a utilização de métodos ab initio.
2.2.1 Métodos ab initio
Os métodos ab initio são os mais precisos e consistentes, visto que
fornecem a melhor aproximação matemática do sistema a ser estudado. O
termo ab initio (do latim, a partir do início, ou seja, dos primeiros princípios)
sugere que os cálculos são baseados somente em leis da mecânica quântica,
massas e cargas dos elétrons e dos núcleos atômicos, e valores das
constantes da física fundamental, tais como velocidade da luz e constante de
Planck, e não contém aproximações. Esses métodos têm como objetivo
resolver a equação de Schrödinger para o sistema, gerando dados de energia
e função de onda. No entanto, a equação de Schrödinger não pode ser
resolvida de forma exata para moléculas com mais de um elétron. Portanto,
são utilizadas aproximações, na forma de funcional, no intuito de possibilitar e
facilitar os cálculos (LEWARS, 2011).
Hartree-Fock (HF) é o método mais comum, fornecendo uma boa
aproximação da equação de Schrodinger independente do tempo para um
sistema de muitos elétrons. Neste método não se considera a repulsão elétron-
elétron associada (correlação eletrônica), sendo seu efeito líquido incluído no
cálculo como uma interação média do sistema, isto é, como se os elétrons se
movimentassem independentemente uns dos outros. Portanto, a eficiência e a
simplicidade desse método conduzem a uma pobre performance para sistemas
de relevância para a química bioinorgânica. Então, o HF é atualmente utilizado
apenas como ponto de partida para métodos ab initio posteriores, mais
elaborados. Tais métodos fornecem formas diferentes de recuperar a
correlação perdida pelo HF e aproximam-se à função de onda exata (VREVEN
et al., 2003).
34
Com o desenvolvimento de métodos baseados na densidade eletrônica,
como a Teoria do Funcional da Densidade (DFT) (HOHENBERG; KOHN,
1964), associado ao aumento do poder computacional das últimas décadas, a
análise de sistemas biológicos mais complexos tornou-se viável. Nesse
método, os cálculos podem ser quânticos ou pela combinação destes com
métodos de mecânica molecular, formando métodos híbridos, conhecidos
como quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) (SENN; THIEL,
2007; VREVEN et al., 2003).
2.2.2 Teoria do Funcional da Densidade
A Teoria do Funcional da Densidade (DFT) teve sua aplicação
aumentada para sistemas biológicos. Avanços na metodologia evoluíram ao
ponto no qual propriedades, desde razoáveis a de alta qualidade, podem ser
obtidas. A DFT emergiu como uma alternativa aos tradicionais métodos ab
initio padrões, já que demanda menor poder computacional e apresenta
resultados mais rapidamente (CUSTODIO; MORGON, 1995).
A DFT tenta solucionar a ineficiência do método HF e alto custo
computacional dos métodos posteriores ao HF a partir da substituição da
função de onda pela densidade eletrônica como base para descrição de
sistemas multieletrônicos (KOCH; HOLTHAUSEN, 2001). Enquanto a função
de onda para um sistema de N elétrons depende de 3N variáveis (três variáveis
espaciais para cada elétron), a densidade do mesmo sistema é dada por uma
função única com três variáveis e, portanto, mais simples tanto do ponto de
vista prático quanto conceitual. A DFT moderna sustenta-se em dois teoremas
propostos por HOHENBERG e KOHN (1964).
O primeiro teorema afirma que a densidade eletrônica do estado
fundamental determina a função de onda eletrônica de um sistema e,
consequentemente, todas as propriedades desse estado para tal sistema. O
segundo teorema estabelece que a energia de uma distribuição eletrônica pode
ser descrita em função da densidade eletrônica, sendo essa função mínima
para a densidade do estado fundamental (HOHENBERG; KOHN, 1964).
No entanto, apesar de estabelecerem teoricamente as relações entre
a densidade eletrônica e energia do sistema, esses teoremas não
materializaram a forma para calculá-las. Dessa forma, na prática, o uso da DFT
35
deve-se à abordagem de Kohn e Sham (KS). O método KS é uma variante
operacional do HF baseado na construção de um sistema inerte, sem
interações, com a mesma densidade do original para o problema. Sistemas
inertes são relativamente mais fáceis de resolver, já que a função de onda
pode ser representada pelo determinante de Slater dos orbitais, nesse caso,
chamado de determinante de Kohn-Sham. Assim, o funcional da energia
cinética é conhecido fidedignamente, mas a energia de troca-correlação
permanece desconhecida (KOHN; SHAM, 1965).
2.2.3 Energia de Troca-correlação
A energia troca-correlação está associada a interações entre elétrons
(de spins iguais e opostos). O uso da DFT apresenta um importante problema:
os funcionais exatos para troca e correlação não são conhecidos, exceto para
gás de elétron livre. Entretanto, algumas aproximações permitem o cálculo de
propriedades moleculares com diversos níveis de acurácia. Os funcionais de
aproximações mais comuns são: densidade local (LDA, do inglês Local Density
Approximation) e gradiente generalizado (GGA, Generalized Gradient
Approximation) (PERDEW; BURKE; ERNZERHOF, 1996; BECKE, 1988; LEE
et al., 1988).
O funcional de aproximação mais fundamental e simples é o LDA, no qual
a energia depende apenas da densidade da região avaliada. O LDA considera
a energia de troca-correlação de um sistema como sendo a mesma de um gás
de elétrons uniformes de igual densidade, que é conhecida de forma precisa.
Seu sucesso na química é considerado, na melhor das hipóteses, moderado
em virtude da forte tendência a superestimar, de forma assistemática, os
valores de energia e o comprimento de ligações. Já o GGA representa um
avanço em relação ao LDA, uma vez que incorpora a dependência tanto da
densidade eletrônica quanto de seu gradiente, sendo, portanto, capaz de
melhor descrever a natureza não homogênea das densidades moleculares. Os
representantes dessa classe variam em acurácia para determinadas
propriedades. Os BP86 e PBE, por exemplo, apresentam bons resultados
particularmente para parâmetros estruturais, mas frequentemente menos
precisos para outras propriedades. Atualmente, o híbrido B3LYP, mistura de
GGA com troca Hartree-Fock, tornou-se escolha dominante quando se trata de
36
moléculas que contêm metais de transição. Esse método tem demonstrado boa
performance para uma grande variedade de sistemas e propriedades químicas
apesar das limitações específicas e algumas falhas identificadas (PERDEW;
BURKE; ERNZERHOF, 1996).
O uso de funcionais GGA melhorou consideravelmente a descrição de
ligações, principalmente de ligações de hidrogênios, sem que essa melhora
significasse uma demanda computacional proibitiva. Entretanto, ainda falha na
descrição de ligações fracas como, por exemplo, interações de Van der Waals,
nesses casos são necessários métodos de correções (KLIMES et al., 2010).
2.2.4 Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC)
Em virtude do grande número de átomos, cálculos completos baseados
em mecânica quântica tornavam-se inviáveis para analisar energias de
interação em sistemas proteicos. Então, métodos que facilitassem o estudo de
sistemas biológicos foram desenvolvidos. Inicialmente, métodos clássicos de
mecânica molecular eram usados para moléculas biológicas. Vias alternativas
surgiram com a abordagem de métodos híbridos (AMARA et al., 2000), nos
quais se combinam mecânica quântica (para pequenos subsistemas) e
molecular (campos de força para a maior parte do sistema). Outra forma é a
divisão de grandes sistemas em subsistemas menores (TITMUSS et al., 2000;
YANG, 1991).
O MFCC pode fornecer cálculos ab initio eficientes para energia de
interação entre uma proteína e uma dada estrutura ou molécula, como uma
droga por exemplo. A ideia central desse método consiste em dividir a energia
de interação (entre uma molécula relativamente pequena e uma proteína) em
pequenas somas de interação que possam ser facilmente calculadas via ab
initio. O sistema estudado é fracionado em subsistemas menores, mantendo-se
as propriedades eletrônicas e estruturais do sistema original. Assim, esses
fragmentos menores podem ser tratados com métodos quânticos de alta
acurácia (ZHANG; ZHANG, 2003).
No método MFCC, a proteína é decomposta em fragmentos menores
baseados em aminoácidos. A fim de conservar as propriedades eletrônicas dos
resíduos analisados, alguns vizinhos (chamados de caps) e suas respectivas
ligações peptídicas são mantidos no sistema, bem como pontes dissulfeto, se
37
necessário. Dessa forma, a energia de interação entre a proteína e a molécula
pode ser inferida a partir de combinações sutis das energias de interação entre
os pequenos fragmentos a molécula em questão. Além disso, pode-se também
determinar o perfil de contribuição energética individual dos resíduos avaliados.
2.3 Objetivos
2.3.1 Objetivos Gerais
O objetivo geral deste trabalho é utilizar técnicas de bioquímica
computacional, dentro da teoria do funcional da densidade (DFT), com o intuito
de apresentar uma descrição adequada da interação entre 4-hidroxitamoxifeno
(OHT), um metabólito ativo do tamoxifeno com alta afinidade para ER, e
raloxifeno (RAL), um SERM amplamente utilizado no tratamento e prevenção
da osteoporose e câncer de mama, co-cristalizados com o receptor do
estrógeno (ERα).
2.3.2 Objetivos Específicos
Quantificar, através de cálculos computacionais, as energias individuais
de cada aminoácido em interação com os OHT e RAL e o ERα.
Avaliar as diferenças existentes entre os resultados energéticos obtidos
para cada ligante.
Identificar, a partir das diferenças energéticas entre os ligantes
analisados, as regiões mais importantes de cada um.
Realizar um comparativo entre os valores energéticos encontrados neste
trabalho e os dados experimentais de relevância para cada aminoácido
e para a resposta biológica de cada ligante.
2.4 Materiais e Métodos
Nesse capítulo abordaremos as diretrizes metodológicas e os aspectos
computacionais relacionados à descrição das interações entre 4-
hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL) com o receptor do estrógeno alfa
38
(ERα). A estrutura utilizada como modelo foi ajustada e as energias de
interação entre os resíduos componentes do ERα e seus ligantes foram
determinadas com base na Teoria do funcional da Densidade (DFT) a partir da
técnica de Fracionamento Molecular com caps Conjugados (MFCC).
2.4.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica
A estrutura cristalográfica utilizada como input para a realização dos
cálculos do estudo in silico foi obtida a partir do banco de dados Research
Collaboratory for Structural Bioinformatics - Protein Data Bank (RCSB/PDB).
Este repositório contém informações sobre estruturas 3D de moléculas
biológicas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos. Com base nos modelos
tridimensionais de complexos ligante-receptor construídos por técnicas como a
difração por raio-X e Ressonância Magnética Nuclear, e depositados no banco
de dados PDB, é possível descrever qualitativamente e quantitativamente seus
respectivos sítios de interação a partir da modelagem molecular. Desta forma,
podemos investigar os aspectos energéticos e as características estruturais
que permitem uma ligação adequada do ligante ao seu receptor. (FERREIRA;
YAMANAKA, 2006).
Os modelos cristalográficos escolhidos estão identificados no PDB pelos
códigos 3ERT e 1ERR. O primeiro refere-se ao receptor humano de estrógeno
alfa (ERα) co-cristalizado ao 4-hidroxitamoxifeno apresentando resolução de
1.90 Å. Já a estrutura 1ERR denota o ERα co-cristalizado com raloxifeno com
resolução de 2.60 Å.
A determinação da estrutura do cristal envolve a descrição da disposição
no espaço de todas as entidades químicas existentes na amostra, assim para a
prescrição dos cristais 3ERT e 1ERR foi utilizada a técnica de difração por raio-
X. Esta técnica permite a exploração do efeito da interação radiação-matéria,
em um contexto de influência elástica entre elementos com dimensões
espaciais semelhantes, com a produção de inúmeros elementos de
interferência em determinadas posições do espaço (MASSA, 2004).
2.4.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização das Estruturas
39
O estado de protonação de todos os ligantes em pH fisiológico foi obtido
utilizando o software de Marvin Sketch versão 5.3.2 (Marvin Beans Suite –
ChemAxon).
Estruturas obtidas por análises cristalográficas, frequentemente,
apresentam ausência dos átomos de hidrogênio, visto que, os mesmos
conferem densidade eletrônica mínima e apenas cristais com resolução
menores que 1.20 Å oferecem estrutura para a visualização dos átomos de
hidrogênio. Logo, fez-se necessário adicionar átomos de hidrogênio às
estruturas. Dessa forma, todos os átomos presentes nas estruturas
cristalográficas foram fixados, em seguida os átomos de hidrogênio foram
adicionados e os sistemas foram submetidos a uma otimização clássica para o
ajuste dos átomos livres. Esta otimização foi realizada no software Discovery
Studio sob os parâmetros de cálculo do campo de força CHARMm (Chemistry
at Harrvard Molecular Mechanics), sendo este parametrizado para todos os
átomos, porém com maior especialização para moléculas orgânicas em geral
(MOMANY; RONE, 1992).
2.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional
Os cálculos energéticos para determinação das energias de interação
entre os SERMs e os resíduos de aminoácidos da proteína ERα foram
realizados utilizando-se a técnica do MFCC. Este método permite cálculos
envolvendo proteínas, DNA e outras macromoléculas biológicas, visando
fornecer informações precisas a respeito das energias de interação
moleculares (ZHANG; ZHANG, 2003; ZHANG; ZHANG, 2005; GORDON et al.,
2011).
O estudo de convergência da energia total interação como uma função
do raio (r) no sítio de ligação ao ligante foi realizado usando-se um raio r a fim
de colocar um limite no número de resíduos de aminoácido a serem
analisados, porém sem perder interações importantes (COSTA et al, 2012). Ao
fazer isso, adicionou-se a energia de interação individual dos resíduos de
aminoácidos dentro de esferas imaginárias no sítio com o raio r centrado no
ligante. Considerando r = n/2 (em que n = 1, 2, 3, 4, ...), alcançaremos a
convergência do raio de ligação, quando a variação de energia no raio
subsequente for menor do que 10% (WU et al., 2007).
40
Neste trabalho, determinou-se a molécula do ligante como L e o resíduo
de aminoácido que interage com o ligante como Ri. O cap Ci-1 (Ci+1) é formado
a partir dos resíduos vizinhos covalentemente delimitados pelo grupo amina
(carboxila) do resíduo Ri ao longo da cadeia de proteína. Para completar,
empregou-se a mesma linha de investigação realizada por LIMA NETO et al.
(2015), em que os cinco fragmentos de aminoácidos mais próximos de cada
lado do resíduo Ri foram usados para construir o cap Ci-1 e Ci+1, proporcionando
uma melhor descrição do ambiente eletrônico. Para estas estruturas
fragmentadas, a energia de interação entre o ligante e os fragmentos
individuais, EI (L - Ri), é calculado de acordo com a seguinte equação:
EI (L – Ri) = E (L + C1-i Ri Ci+1) – E (C1-i Ri Ci+1) – E (L + C1-i Ci+1) + E (C1-i Ci+1),
Eq.(1)
onde o primeiro termo da equação E (L + C1-i Ri Ci+1) é a energia total do
sistema formado pelo ligante e os resíduos com seus caps. O segundo termo
E (C1-i Ri Ci+1) refere-se a energia total do resíduo com seus caps. Já o terceiro
termo da equação E (L + C1-i Ci+1) denota o ligante e os caps do resíduo, por
fim, o último termo E (C1-i Ci+1) corresponde apenas aos caps. A energia total
de interação do RAL e OHT é obtida somando-se as energias de interação com
cada resíduo de aminoácido dentro de um determinado raio no sítio de ligação.
As moléculas de água existentes na estrutura cristalográfica foram levadas em
consideração durante os cálculos, desde que, apresentassem ligações de
hidrogênio formados com resíduos de interesse ou com algum cap. Neste caso,
foi definido um limite de comprimento para as ligações de hidrogênio de 2.5 Å.
Para o cálculo energético de cada resíduo no local de ligação, utilizou-se
o Dmol3 incluso no software Materials Studio, fazendo uso da Aproximação do
Gradiente Generalizado (GGA) através do funcional PBE como potencial de
troca e correlação (PERDEW, BURKE, ERNZERHOF, 1996). Para realizar os
nossos cálculos das energias de interação do OHT e RAL-ERα, utilizamos o
método DFT + D seguindo o esquema GGA-PBE-Grimme juntamente com uma
base de precisão numérica dupla mais polarização (DNP), para expansão das
funções de onda de Kohn-Sham. Levando todos os elétrons em consideração
41
explicitamente com spin irrestrito. DELEY (1999), INADA e ORITA (2008)
apontam para uma elevada precisão e um erro de sobreposição de base
(BSSE) praticamente irrelevante desse conjunto de base. O DNP é comparável
ao conjunto de base gaussiano 6-311+G (3df,2pd), que tem um vasto conjunto
de funções de polarização e uma eficaz correlação eletrônica (INADA; ORITA,
2008; DELLEY, 1990). O raio de corte orbital foi ajustado em 3.7 Å e o limiar
de convergência do campo autoconsistente (SCF) ajustado para uma variação
de energia de até 10-6 Ha.
2.5 Resultados e Discussões
Embora os primeiros SERMs tenham sido identificados há mais de 60
anos, sua base molecular só começou a ser desvendada nos últimos 25 anos
(Wardell et al., 2004). Recentemente, estudos cristalográficos e computacionais
revelaram que a natureza do ligante é um determinante crítico para sua ação
nos receptores de estrógeno (KATZENELLENBOGEN et al., 2001; WARDELL
et al., 2004). Logo, um cenário de energia de ligação que perfaz os complexos
entre 4-hidroxitamoxifeno/raloxifeno e receptores de estrógeno ERα é um
passo crucial para o entendimento das bases moleculares e conformacionais
que regem essas estruturas. Ambos os ligantes são subdivididos em quatro
regiões, como representado na Figura 2a, a fim de facilitar análises posteriores.
A fim de esclarecer como os elétrons são distribuídos em torno das moléculas,
a figura 2b apresenta a isosuperfície de densidade de elétrons para o OHT e
RAL.
Todos os cálculos foram realizados a partir da estrutura cristalográfica
do receptor de estrógeno alfa (ERα) co-cristalizado com 4-hidroxitamoxifeno
(OHT) e raloxifeno (RAL), que estão depositados no Protein Data Bank (PDB
ID: 3ERT e 1ERR, respectivamente) (SHIAU et al., 1998, BRZOZOWSKI et al.,
1997). Como relatado anteriormente, as energias de ligação entre o ERα e dois
de seus antagonistas, 4-hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL), foram
calculadas empregando o método MFCC para obter a contribuição individual
dos resíduos de aminoácidos dentro de um sítio de ligação com um raio
selecionado, classificadas a partir das interações mais relevantes, uma vez que
42
a determinação das características do ligante quanto à afinidade ao ERα é de
grande importância para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
Figura 2: Representação do OHT e RAL em pH fisiológico e distribuição da densidade eletrônica. (a) Estrutura química subdividida em quatro partes para auxiliar a análise das suas interações com Erα; (b) densidade de eletrônica projetada sobre um potencial eletrostát ico de
isosuperfície mostrando regiões negativa e positivamente carregadas destacadas com as cores vermelha e azul, respectivamente.
A energia de ligação para cada raio do sítio de ligação total foi obtida
somando-se as respectivas contribuições individuais através do estudo de
convergência. Para levar em consideração a interação atrativa ou repulsiva de
cada resíduo de aminoácido significante, realizamos uma pesquisa para um
raio de sítio de ligação ideal para a qual nenhuma variação significante na
energia de ligação total pode ser observada depois de um aumento do raio. A
figura 3 apresenta uma comparação entre a energia total calculada das
interações E (r) para o OHT e RAL como uma função do raio r para o sítio de
ligação, indicando que a convergência é de cerca de 15.0 Å, compreendendo
um total de 138 e 145 aminoácidos, respectivamente. Nota-se que a energia de
interação segue a ordem OHT> RAL para cada um dos raios r = 4.0; 6.0; 11.5;
13.0 e 15.0 Å (-184,470 kcal/mol > -154,410 kcal/mol, -164,760 kcal/mol > -
121,360 kcal/mol, -282,170 kcal/mol > -250,220 kcal/mol, -360,420 kcal/mol > -
43
333,640 kcal/mol, -346,230 kcal/mol > -327,750 kcal/mol, respectivamente).
Estes resultados estão de acordo com os dados experimentais obtidos por
CLEGG et al., (2005) e KUIPER et al., (1998), que indicaram uma maior
afinidade do OHT ao receptor.
Figura 3: Energia de interação total dos SERMs OHT e RAL considerando o raio r = 4.0 Å, 6.0 Å, 11.5 Å, 13.0 Å e 15.0 Å, a partir do cálculo utilizando GGA-PBE-Grimme como funcional de troca e correlação. O valor absoluto de E (r) obedece a sequência OHT > RAL reproduzindo
dados experimentais (CLEGG et al.,2005; KUIPER et al.,1998).
As Figuras 4a e 4b mostram um painel gráfico BIRD (Binding site,
Interaction energy and Residues Domain) com as energias de interação entre o
OHT e RAL e os resíduos de aminoácido mais importantes na região de
ligação. O painel descreve basicamente três itens: (1) a energia de interação
(em kcal/ mol) do resíduo com os ligantes ilustrado pelas barras horizontais,
atribuindo, quantitativamente, o papel de cada resíduo no local de ligação, bem
como sua efetividade; (2) no lado esquerdo do gráfico, os resíduos mais
importantes que contribuem para a ligação; (3) a região (identificadas na figura
4 por letras em negrito) e os átomos dos ligantes mais próximos de cada
resíduo no local de ligação.
Como pode-se verificar na figura 4, o padrão de interação parece ser
mais simples para OHT do que para RAL. No complexo OHT-ERα, as
interações atrativas são predominantes, mas também observamos algumas
repulsivas. Os resíduos que se ligam de forma significativa são D351, E542,
E353, D538, E423, C381, T347, M388, M543, M396, M427, M357, M343, L525,
44
L346, I424, F404, H524, R394, R352 e K529, sendo os quatro últimos de uma
forma repulsiva. Para o complexo RAL-ERα, as interações repulsivas aparecem
com maior frequência quando comparadas com as interações de OHT. Seus
principais resíduos são D351, E542, D358, E423, E353, F404, T347, M343,
L346, L525, H524, I424, R394, R335, M543, M388, M396, M427, M357, C381 e
R352, sendo os nove últimos de forma repulsiva. A diferença de energias
atrativas e repulsivas quanto à proporção entre OHT e RAL pode sugerir que a
primeira droga se liga mais fortemente em seu sítio de ligação do que a
segunda, quando se considera a energia total dos sistemas.
Estruturas cristalográficas de raios-x obtidos por SHIAU et al. (1998) e
BRZOZOWSKI et al. (1997) fazem uma representação do complexo estrutural
em que os agonistas e antagonistas ocupam o mesmo local de ligação ER-
LBD. A partir destes, denotamos que a ligação de OHT e RAL é guiada pelo
seu anel fenólico (Figura 2a, região i), bem como pelo lado volumoso da
cadeia, o qual é envolvido pelo núcleo hidrofóbico do LBD. No entanto, apesar
de compartilhar o mesmo local de ligação, agonistas e antagonistas trazem
diferentes rearranjos com o receptor, estes rearranjos estão relacionados com
a ativação ou inibição da sua atividade de transcrição.
45
Figura 4: Painel gráfico BIRD que mostra os resíduos mais relevantes da Erα que contribuem
para a ligação de cada ligante: (a) OHT e (b) RAL.
Ainda como demonstrado pelas estruturas cristalográficas, quando o
receptor de estrógeno está ligado a antagonistas, tal como OHT e RAL, existe
uma reorganização de algumas hélices seguida por um movimento da hélice 12
para a fenda de ligação ao co-ativador, formada pelos resíduos de hélices 3, 4,
e 5. Este, por sua vez, leva o receptor para um estado desativado mimetizando
a hélice de ligação ao co-ativador, criando, deste modo, uma deficiência para a
sua fixação (SHIAU et al., 1998). Desta forma, para compreender as diferenças
entre os complexos OHT/RAL-ERα é importante notar as características
distintas de ligação entre esses ligantes.
Cada uma das quatro regiões (i, ii, iii e iv) do OHT e RAL interage com
pelo menos um aminoácido no raio do sítio (15.0 Å). De acordo com a soma
dos valores na Tabela 1, as regiões (i) e (iv) do OHT são as principais regiões
em termos energéticos, respectivamente, enquanto as regiões (i) e (ii) são as
principais em número de interações com ERα. Além disso, como se pode notar
a partir da Tabela 2, as somas das energias nas regiões (i) e (iv) do RAL
ocupam a primeira e segunda posições, respectivamente, possuindo também
46
maiores números de interações, reforçando a importância destas regiões no
reconhecimento das atividades desses SERMs, como apresentado por SHI et
al. (2001) e KOMM et al., (2014).
As regiões (iv) do OHT e do RAL são constituídas por um nitrogênio
carregado positivamente, que é estabilizado por D351 juntamente com alguns
contatos hidrofóbicos. No cálculo realizado neste trabalho, D351 é o resíduo
com a contribuição mais intensa de energia de ligação para ambos os ligantes,
com energias de interação de -62,92 kcal/mol (OHT) e -91,55 kcal/mol (RAL)
(ver Figura 4). Como observado nas figuras 5 e 6, o que provoca a atração dos
ligantes é uma ponte salina entre a sua cadeia lateral carboxilato e a região (iv)
N24 (N26)H do OHT (RAL), com uma distância de 3.40 Å (1.70 Å). Análises
cristalográficas e a análises computacionais de mutação mostraram que a sua
posição está correlacionada com a entrada da hélice 12 (H12) na forma ativa
ou inativa quando ERα está associado com agonistas ou antagonistas,
respectivamente (JORDAN et al., 1999; WATANABE et al., 2014).
A segunda maior energia de ligação para os OHT e RAL (-44,26 e -47,04
kcal/mol, respectivamente) pertence ao resíduo E542, o qual apresenta
diferentes posições em OHT e no RAL quanto à distribuição do raio (12.5 Å e
9.0 Å, respectivamente), mas está próximo da região (iv), como representado
na figura 4. Ele é seguido pelo resíduo D538 exibindo a terceira maior energia
de ligação, mostrando -39,05 e -42,72 kcal/mol para OHT e RAL,
respectivamente. Note-se que os E542 e D538 são resíduos altamente
conservados que ocupam a hélice 12 (H12) e criam uma área carregada
negativamente para co-ativadores sendo, portanto, resíduos importantes na
ativação ou inibição do ERα (SHIAU et al.,1998; WATANABE et al., 2014).
Um anel fenólico de estrógeno é compartilhado por muitos moduladores
seletivos do receptor de estrógeno (WALLACE, et al., 2003; FANG et al, 2001).
Observa-se a formação de ligações de hidrogênio deste com o grupo
carboxilato do E353 (H3), o grupo guanidina do R394 (H6) e uma molécula de
água conservada entre os resíduos E353 e R394 (FANG et al.,2003; SHIAU et
al,1998; BRZOZOWSKI et al., 1997; FUKUZAWA et al, 2006). Como se pode
ver a partir das figuras 5 e 6, E353 e R394 interagem de uma forma muito
semelhante com os dois SERMs através deste grupo hidroxilo fenólico (região
47
i). É confirmado pelos cálculos de energias de ligações realizadas entre OHT e
RAL, respectivamente, que ambos estão próximos um do outro (ver figura 4),
com 17.25 (2.08 Å) e 21,54 (2.05 Å) kcal/mol para R394 e -38,06 (1.67 Å) e -
35,35 (1.67 Å) kcal/mol para E353 (quarta energia de interação mais atrativa).
Nos nossos cálculos, a molécula de água conservada foi ligada ao resíduo
mais próximo: R394 para o complexo OHT- ERα e para o resíduo E353 no
sistema RAL-Erα. Devido a diferença na quantidade de moléculas de água
cristalográficas, nomeou-se W2 no primeiro complexo e W3 no segundo. Em
ambos os casos, esta água é responsável pela formação de uma ligação de
hidrogênio mediada pela água, juntamente com a ligação de hidrogênio direta
formada pelos aminoácidos com os ligantes. Além da ligação de hidrogênio, os
resultados energéticos acima apresentam um efeito eletrostático na região
carregada (iv), sendo predominante em ambos os casos. Assim, mesmo
havendo ligações de hidrogênio com o mesmo grupo molecular, encontrou-se
energias de ligação opostas. O E423 (H8) é o quinto resíduo com energia de
ligação mais intensa, com valores de -31,98 e -39,25 kcal/mol, e raio em 7.5 Å
e 5.5 Å para os SERMs OHT e RAL, respectivamente.
48
Tabela 1- Energias de interação para OHT.
49
Tabela 2- Energias de interação para RAL.
50
Uma das discussões biologicamente mais tradicionais e importantes da
bioquímica quântica, e que não é totalmente compreendida até agora, é a
natureza física de mutações pontuais espontâneas. Uma causa plausível
destas mutações é a chamada rara tautomeria decorrente da transferência de
prótons (PT) por reações entre a arquitetura de pares de bases da dupla hélice
do DNA, proposto por LÖWDIN em 1963. Mutações experimentais de H524
foram encontradas reduzindo a ligação ao estrógeno (HERYNK, M.H; FUQUA,
S.A., 2004), sendo este aminoácido correlacionado por FUKUZAWA et al. em
2006, como o ponto principal para a ligação de hidrogênio com os ligantes.
Desse modo, a figura 5a mostra H524 (H11) fazendo uma ligação de
hidrogênio com o grupo hidroxila da região (ii) do RAL, imitando (não imitando)
a ligação com estradiol (OHT) (BRZOZOWSKI et al., 1997). Assim, a perda
desta ligação aparece em nossos resultados energéticos através do aumento
(diminuição) da energia (distância) de 0,06 para -4,08 kcal/mol (de 2.5 Å para
2.0 Å), entre OHT e RAL. Além disso, os resíduos de L525 (-6,52 e -4,79
kcal/mol), W383 (-5,52 e -8,70 kcal/mol) e P404 (-2,83 e -8,52 kcal/mol) estão
envolvidos (não envolvidos) em uma interação π-sigma com RAL (OHT) nas
regiões (i), (iii) e (iv). Eles fazem parte da hélice 11 (H11), hélice 5 (H5) e a
folha-ß 1 (S1), sendo muito importantes na estabilização dos ligantes no sítio
de ligação, ao passo que mutações experimentais estão relacionadas com a
redução da ligação entre os ligantes (BRZOZOWSKI, 1997; SHIAU,1998;
HERYNK, 2004; FUKUZAWA, 2006). É importante notar também o papel
desempenhado pelos resíduos metionina (M343 (H3), M388 (H6), M357 (H3),
M427 (H8), M543 (H12), M396 (H6)) e cisteína (C381 (H5)) que estão entre os
resíduos mais relevantes em nossos cálculos. No entanto, como podemos ver
na figura 4, eles mostram um comportamento energético oposto, com uma
energia de ligação atraente (repulsiva) para OHT (RAL), exceto o M343.
No contexto geral, nota-se que entre os aminoácidos analisados neste
trabalho os resultados mostram que as energias mais fortemente atrativas para
ambas as drogas segue a sequência decrescente D351 > E542 > D538 > E353
> E423, sugerindo suas importâncias para a interação entre o ligante e o
receptor. Exceto para o E423, todos estes aminoácidos, por análises de
mutação e cristalográfica, são relevantes para o reconhecimento dos ligantes e
51
para a ativação ou desativação da função da transcrição do ERα. Quando
consideramos estes resíduos específicos, observamos energias de ligação
semelhantes para os dois antagonistas. No entanto, nós encontramos
consideráveis diferenças em outros resíduos que podem estar relacionadas
com a distribuição de carga, distância ligante-resíduo e a presença de
moléculas de água. Os nossos resultados mostram que a perda de hidroxila na
região (ii) pelo OHT diminui a sua energia de interação com o H524, que é um
membro da rede de ligação de hidrogênio no sítio de ligação no ERα (R349,
E353, L387 e H524), e é considerado muito importante para o reconhecimento
de ligantes (FUKUZAWA et al., 2006). Também mostramos a importância de
alguns resíduos de metionina (M343, M388, M357, M427, M543, M396) e
cisteína (C381), que são atraídos pelo OHT, mas repelidos pelo RAL. A
existência de energias mais repulsivas para RAL pode sugerir uma razão pela
qual o mesmo permaneça como antagonista quando ligado ao ERβ (enquanto
OHT desempenha um papel agonista), sabendo que o LBD do ERβ humano
mantém 55% de homologia quando comparado com ERα (FANG et al., 2003;
PAULMURUGAN et al., 2011).
52
Figura 5: Disposição dos resíduos de aminoácidos mais envolvidos na ligação ER-SERMs.
Contatos entre droga-resíduo são representadas por linhas tracejadas e as suas distâncias. (a) OHT e (b) RAL.
53
Figura 6: Isosuperfícies de potencial eletrostático com as densidades eletrônicas para os
SERMs interagindo com os resíduos mais atraentes: (a) OHT e (b) RAL.
2.6 Conclusões
As técnicas computacionais possuem grande relevância para a pesquisa
bioquímica e farmacêutica. O presente trabalho vem reforçar o papel da
simulação computacional em um nível quântico para o entendimento da
interação de drogas antagonistas com o receptor de estrógeno alfa.
O receptor de estrógeno está relacionado com várias patologias como
câncer de mama, próstata e osteoporose. Assim, entender o comportamento
do seu sítio de ligação é um primeiro passo para a formulação de
medicamentos específicos para combater essas entidades patológicas.
54
Os métodos de fragmentação têm-se mostrado bastante eficazes em
desenhar a estrutura do receptor e quantificar a importância de cada interação
formada dentro do sítio de ligação. Neste trabalho, utilizamos a técnica do
fracionamento molecular com caps conjugados para determinar quais são os
aminoácidos de maior importância na resposta dos receptores de estrógeno
após a entrada do antagonista no seu sítio de ligação. Tendo por base as
interações formadas com cada um destes aminoácidos, é possível modificar
estas moléculas (SERMs) e obter uma melhor resposta de antagonismo para o
receptor.
Investigamos as interações entre os bolsões de ligação dos SERMs
(OHT e RAL) co-cristalizados com os ERα usando cálculos de bioquímica
quântica. Depois de um estudo de convergência do tamanho da esfera do
bolsão de ligação, levamos em consideração todas as interações ligante-
resíduo dentro de um raio de 15.0 Å a partir do ligante. Aqui, demonstramos
também a necessidade de levar em conta um tamanho maior do bolsão de
ligação, incluindo mais resíduos de aminoácidos distantes a fim de se obter
uma boa correlação entre os dados experimentais e os dados colhidos a partir
de simulações computacionais.
Empregamos o método baseado na teoria do funcional de densidade
(DFT) para desvendar o detalhamento dos dados das energias de ligação dos
SERMs OHT e RAL com o receptor do estrógeno. Calculamos as energias de
ligação utilizando o método MFCC, incorporando a Aproximação do Gradiente
Generalizado (GGA) como funcional de troca e correlação, técnica que permite
que a descrição energética da estrutura completa, não fragmentada. Foi usado
o DFT + D para o cálculo das energias de ligação dos complexos analisados.
Podemos observar que o SERM OHT liga-se mais fortemente quando
comparado com SERM RAL, confirmando os dados experimentais. Além disso,
nós estabelecemos as principais regiões de ambos os ligantes (regiões I e IV) e
os resíduos que desempenham papel mais importante na afinidade de ligação
do ERα com os seus antagonistas.
Os nossos resultados sugerem que o estado de protonação dos
antagonistas carregados pode ter um efeito antagonista nos ERα dos SERMs
estudados. Para os complexos OHT-ERα (RAL-ERα), os resíduos mais
55
importantes que afetam o mecanismo de ligação são: D351, E542, E353, D538,
E423, C381, T347, M388, M543, M396, M427, M357, M343, L525, L346, I424,
F404, H524, R394, R352 e K529 (D351, E542, D358, E423, E353, F404, T347,
M343, L346, L525, H524, I424, R394, R335, M543, M388, M396, M427, M357 ,
C381 e R352), com a contribuição principal para a energia total de ligação do
SERMs-ERα obedecendo a sequência decrescente D351 > E542 > D538 >
E353 > E423.
Os achados computacionais demonstraram que o total das energias de
ligação dos OHT e RAL com o ERα correlaciona-se com os dados da literatura.
Este modelo ajudou-nos a compreender os mecanismos energéticos e as
afinidades da ligação. Os dados aqui obtidos podem ser de grande auxílio no
entendimento dos sistemas ERα-OHT e ERα-RAL e, posteriormente, no
desenvolvimento de novos fármacos específicos para estes receptores,
estando de acordo com análises experimentais e acrescentando novos
conhecimentos até então não descritos na literatura. Esperamos que os
resultados aqui apresentados estimulem desenvolvimentos experimentais e de
bio-engenharia no tratamento do câncer de mama.
56
INTERAÇÃO ENTRE INTEGRINA
αVβ3 E CILENGITIDE
_______________________________________________________________
57
3.1 Introdução
O controle das interações celulares, em organismos multicelulares, é
crucial para grande parte dos processos biológicos. Estes processos vão desde
a embriogênese, as vias de manutenção das respostas imunes, a integridade
dos tecidos e a homeostase. Assim, a coesão intercelular é crítica para a
organização estrutural e comunicação intercelular dentro de organismos
multicelulares (HUMPHRIES, 2000; COLLER, 1986).
As integrinas são uma família de glicoproteínas transmembranares
heterodiméricas tipo I, que atuam como os principais receptores metazoários
para a adesão celular, desempenhando um papel fundamental em funções de
suporte físico para a transdução de sinais, montagem do citoesqueleto de
actina, expressão gênica e funções celulares, incluindo a adesão celular,
migração, proliferação, diferenciação e apoptose (HYNES, 2002; SCHWARTZ
et al., 1995).
Estas são heterodímeros compostos por duas subunidades, α e β, não
covalentemente associadas (CAMPBELL, HUMPHRIES, 2011). Até o
momento, são conhecidas 18 subunidades α e 8 subunidades β, que se
combinam para formar, pelo menos, 24 heterodímeros distintos com diferentes
propriedades de ligação e distribuição em diversos tecidos. Cada heterodímero
é formado por um grande domínio extracelular que se liga a proteínas em
ambiente extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracelular,
o qual forma ligações com elementos do citoesqueleto através de proteínas
adaptadoras citoplasmáticas (HYNES, 2002).
As integrinas podem se ligar a glicoproteínas da matriz extracelular
(MEC), tais como colágeno, fibronectinas e lamininas, e também a receptores
celulares como, por exemplo, a molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1) e a
família das moléculas de adesão intercelular (ICAMs) (HYNES 2002; PLOW et
al., 2000).
As integrinas e seus ligantes desempenham papéis fundamentais no
desenvolvimento da resposta imunológica, no tráfego de leucócitos, na
hemostasia, e no câncer, estando, portanto, no centro de muitas doenças
58
genéticas humanas, autoimunes, entre outras. Elas são o alvo de fármacos
terapêuticos contra trombose e inflamação, além disso, são receptores para
muitos vírus e bactérias. Por apresentarem múltiplas funções, as integrinas têm
sido estudadas de forma intensiva. Nos últimos anos a elucidação de estruturas
3D da integrina tem permitido uma melhor compreensão da sua estrutura,
funções e interações moleculares que resultam na adesão celular (HYNES,
2002; XIONG et al., 2001).
A especificidade de ligação da integrina com os componentes da matriz
extracelular depende dos domínios extracelulares das subunidades α e β da
integrina. Estas proteínas são classificadas em várias subfamílias com base em
suas cadeias β. As integrinas α1β1, α2β1, α10β1, e α11β1 representam os
principais receptores do colágeno (CAMPER et al, 1998; VELLING et al., 1999;
HYNES, 2002), as integrinas α3β1, α6β1, α6β4 e α7β1 são conhecidas como os
principais receptores de laminina, já integrinas α5β1, α8β1, αIIbβ3 e αVβ são os
principais receptores de fibronectina que se ligam de uma forma dependente de
RGD (Arginina-Glicina-Ácido aspártico) (VAN DER FLIER, 2001; HYNES,
2002). A Tabela 3 resume a diversidade das integrinas em vertebrados.
Algumas integrinas se ligam aos mesmos ligantes extracelulares, porém, com
diferentes afinidades e, alguns ligantes são reconhecidos por diferentes
integrinas (HYNES, 1987; HYNES, 2002). A Figura 7 representa a classificação
da família das integrinas.
Figura 7: Classificação da família das integrinas e seus respectivos receptores. Adaptado de KINASHI, 2005.
59
Tabela 3- Principais integrinas encontradas em vertebrados, seus ligantes e seus locais de
distribuição. Adaptado de HYNES, 1992.
3.1.1 Estrutura das Integrinas
Cada uma das subunidades α e β dos heterodímeros de integrina
possuem um grande domínio extracelular onde as subunidades dobram-se em
uma porção globular N-terminal (Figura 8), que se combinam para criar a
superfície de ligação ao ligante, também possuem um domínio transmembranar
do tipo I e uma região de curta cauda citoplasmática C-terminal (com exceção
das subunidades β4) (SHIMAOKA et al., 2002; HUMPHRIES, 2000). O tamanho
das subunidades varia, mas geralmente a subunidade α contém cerca de 750
aminoácidos, enquanto a subunidade β contém 1000 aminoácidos (XIONG et
al., 2001).
O domínio extracelular das integrinas é, em geral, formado por grandes
estruturas de aproximadamente 80-150 kDa. A maior parte das informações
Integrina Ligante Distribuição celular e tecidual
αvβ1 Laminina, fibronectina, osteopontina Fibroblastos, osteoclastos, células tumorais
αvβ3 Fibrinogênio, vitronectina, tenascina, osteopontina, fibronectina, Vwf* Células endoteliais, plaquetas, leucócitos
αvβ5 Vitronectina, osteopontina, fibronectina Células endoteliais,osteoclastos, células epiteliais
αvβ6 Fibrinogênio, vitronectina, tenascina, fibronectina Células epiteliais, células de carcinoma
αvβ8 Vitronectina Melanoma, cérebro, ovário, útero, placenta
α1β1 Colágeno VI, colágeno I, laminina Condrócitos, células endoteliais
α2β1 Colágeno I, colágeno IV, laminina, Queratinócitos, condrócitos, plaquetas, células endoteliais
α3β1 Laminina, trombospondina Queratinócitos
α4β1 Fibronectina, VCAM-1 Leucócitos, células endoteliais
α5β1 Fibronectina, trombospondina Condrócitos, células endoteliais
α6β1 Laminina, trombospondina Condrócitos, células endoteliais
α7β1 Laminina Células musculares diferenciadas
α8β1 Fibronectina Células do músculo liso
α9β1 Tenascina, VCAM-1 Queratinócitos, células endoteliais
α10β1 Colágeno Condrócitos
α11β1 Colágeno Células mesenquimais
α6β4 Laminina Células endoteliais
αIIIbβ3 Fibrinogênio, fibronectina, vWF* Plaquetas
αEβ7 Caderina Leucócitos
αXβ2 ICAM-1, fibrinogênio Leucócitos
αLβ2 ICAMs Leucócitos
αMβ2 ICAM-2, fibronectina Leucócitos
αDβ2 VCAM-1, vitronectina Leucócitos
* vWF Fator de von Willebrand
60
estruturais dos domínios extracelulares é obtida a partir de dados
cristalográficos de alta resolução, como por exemplo, a cristalografia por raio-X.
A primeira estrutura cristalina completa da caracterização do domínio
extracelular de uma integrina foi publicada em 2001 e, demonstrava a integrina
αVβ3 (XIONG et al, 2001).
Figura 8: Arquitetura de domínio de um heterodímero de integrina. Adaptado de GAHMBERG
et al., 2009.
O domínio extracelular das subunidades α e β é composto por vários
subdomínios organizados em uma porção globular N-terminal de ligação ao
ligante, que se encontra sobre duas longas e estendidas pernas C-terminais
que conectam os domínios transmembranares e citoplasmáticos das
respectivas subunidades, o domínio extracelular encontra-se dobrado no
estado inativo (não ligado a um ligante) e estendido quando está ligado a
algum ligante (XIONG et al, 2001).
A análise estrutural das subunidades α revela a existência de sete
repetições homólogas na sua porção N-terminal que se dobram em sete pás
em uma β-hélice (XIONG ET AL, 2001; SPRINGER, 1997). Os resíduos que
61
participam da ligação ao ligante estão agrupados na superfície superior da β-
hélice enquanto os motivos de ligação para regulação de cátions bivalentes
estão expostos na superfície inferior.
O domínio-I é exposto na superfície superior da β-hélice e está envolvido
diretamente no reconhecimento e ligação ao ligante (KERN; MARCANTONIO,
1998; SPRINGER, 1997). Dentro do domínio-I há a presença de um sítio de
adesão dependente de íon metálico (MIDAS), que se liga a um cátion metálico
bivalente desempenhando papel importante na ligação a uma proteína ligante.
Essa ligação ao ligante altera a coordenação do íon metálico deslocando o
domínio-I e alterando sua conformação, antes fechada, para uma conformação
aberta, resultando assim em um aumento da afinidade ao ligante e, por
consequência, promovendo a ativação de integrina (KANAZASHI et al., 1997;
LIDDINGTON; GINSBERG, 2002). O domínio-I é capaz de dobrar-se
corretamente sem estar associado a uma subunidade β (LU et al., 1998).
A região C-terminal da β-hélice compreende uma região de haste, que
se caracteriza por abranger grande parte do domínio extracelular e pode ser
dividido em três domínios denominados de “coxa”, calf-1 e calf-2. O domínio
“coxa” é semelhante a uma imunoglobulina que, em conjunto com a superfície
inferior da β-hélice, cria uma interface abrangendo dois sítios de ligação ao
cálcio na β-hélice. Já os domínios calf-1 e calf-2 são β-sandwich que juntos
formam contatos hidrofóbicos entre os domínios que fecham a estrutura
(BERTHET et al., 2000; LU et al., 1998).
A subunidade β é composta por um domínio-I-like, com um MIDAS, que
é estruturalmente semelhante ao domínio-I da subunidade α. Este é seguido
por um domínio híbrido, um domínio PSI (plexina, semaforina, integrina), quatro
repetições EGF (Fator de crescimento epidérmico) e um domínio cauda-β
(βTD). A subunidade β desempenha um papel importante na ligação ao ligante
em subunidades α que não possuem o domínio-I. Nos heterodímeros de
integrina, os ligantes se ligam a uma fenda na porção do domínio que está
localizada entre as interfaces das subunidades α e β. O ligante interage com o
domínio MIDAS que está localizado dentro da subunidade β e com o domínio
de β-hélice da subunidade α (SRICHAI; ZENT, 2010; MORGAN et al., 2007).
62
Os domínios transmembranares das integrinas são estruturas que
possuem cerca de 25 a 29 resíduos de aminoácidos que formam α-hélices
espirais enroladas. Diferentemente dos domínios extracelulares, não há
estruturas cristalográficas de alta resolução para este domínio em qualquer
heterodímero da integrina, e grande parte dos dados estruturais são com base
na análise de RMN (Ressonância magnética nuclear) (LAU et al. 2009). Já os
domínios citoplasmáticos da integrina são geralmente curtos, em grande parte
não estruturados e compostos por 10 a 70 resíduos de aminoácidos e, assim
como o domínio transmembranar, também não possuem dados de estruturas
cristalográficas de alta resolução (LI et al., 2001). Entretanto, estudos recentes
demonstraram que a região da cauda do domínio citoplasmático medeia a
ligação entre a integrina e o citoesqueleto sendo, portanto, essencial para a
maioria das funções associadas a integrina.
3.1.2 Funções das Integrinas
As integrinas estão envolvidas em uma gama de atividades biológicas,
abrangendo patrulhamento imunológico, migração celular, forma e definição
celular, regulação do ciclo celular, crescimento, invasão, proliferação,
diferenciação, sobrevivência, apoptose e a ligação a determinados vírus
(DESGROSELLIER; CHERESH, 2010; ASSOIAN; KLEIN, 2008).
Elas atuam como receptores capazes de estabelecer uma comunicação
entre a MEC e a célula. Elas também transportam informação do interior da
célula para o compartimento extracelular. Isso permite a ação de respostas
rápidas e flexíveis em ambas as direções (MEC-célula e célula-MEC). Deste
modo, as integrina podem ter suas funções principais divididas em duas: a
ligação da célula para a MEC e a transdução de sinal da matriz para a célula.
Outra função importante é a de mediação de eventos de sinalização na célula
(STUPACK, 2007). As integrinas agem regulando processos complexos no de
câncer, como a angiogênese, crescimento do tumor e metástases (HYNES,
2002; STUPACK, 2007).
3.1.3 Sinalização Mediada por Integrinas
63
As integrinas são capazes de promover a transdução de sinais
intracelularmente, após a ligação com o ligante (sinalização “outside-in”).
Todavia, ao contrário da maioria dos outros receptores celulares, as integrinas
podem alternar entre conformações de alta ou baixa afinidade para a ligação
com o ligante (sinalização “inside-out”). Dependendo do tipo de célula, as
integrinas podem ser ativadas basalmente, assim como a maioria das células
de adesão que estão ligadas a uma membrana basal, ou inativadas
basalmente, tal como as plaquetas e os leucócitos, que circulam livremente até
serem ativados para promover a agregação plaquetária e mediar uma resposta
inflamatória, respectivamente (HARBURGER; CALDERWOOD, 2009; HYNES,
1992). O heterodímero de integrina αIIbβ3, localizado na superfície celular das
plaquetas, denota a melhor caracterização de integrinas basalmente inativas.
Nestas células, as integrinas apresentam um estado de baixa afinidade, no que
se refere à ligação a um ligante extracelular, dessa forma, são dependentes de
uma sinalização intracelular para que se tornem ativadas (HARBURGER;
CALDERWOOD, 2009; LAU et al, 2009).
As integrinas não têm atividade de quinase, porém têm a capacidade de
fornecer uma conexão entre a matriz extracelular e o citoesqueleto de actina.
Esta conexão permite que as integrinas regulem a organização do
citoesqueleto celular e a motilidade, bem como, alterem fluxos de muitas vias
de sinalização intracelular, incluindo a sobrevivência celular, proliferação
celular, forma da célula e angiogênese (CALDERWOOD, 2004). Os domínios
extracelulares podem se ligar a diversos ligantes, considerando que os
domínios citoplasmáticos intracelulares são âncoras para as proteínas do
citoesqueleto. Esta ligação entre o exterior e o interior da célula acarreta em
uma sinalização bidirecional através da membrana plasmática (HYNES, 2002).
A sinalização inside-out, ou ativação da integrina, tem grande
importância em eventos fisiológicos, tal como nas células sanguíneas, onde as
mesmas estão em estreita proximidade com seus ligantes, porém, as
interações ocorrem apenas após a ativação da integrina em resposta
específica a estímulos externos, como por exemplo, um dano à vasculatura ou
um processo de indução da inflamação (MIRANTI; BRUGGE, 2002).
64
As integrinas por si próprias não têm atividade catalítica intrínseca. A
ligação ao ligante no domínio extracelular das mesmas promove a transdução
do sinal para o citoplasma, na direção de fora para dentro. Estes sinais
intracelulares afetam o crescimento celular, diferenciação e apoptose. A
sinalização é complexa e consideravelmente influenciada pela interferência dos
receptores de fator de crescimento. Além disso, os fatores de adesão focal
(FAs) promovem um eixo para a transmissão de sinais intracelulares. Dentro
dos FAs, as proteínas estão em constante fluxo, agregando-se e dissociando-
se umas das outras incessantemente (HARBURGER; CALDERWOOD, 2009).
Neste contexto a sinalização outside-in interage com os fatores de crescimento
promovendo o controle das vias de sinalização intracelulares. Logo, as
integrinas podem produzir sinais a partir de estímulos localizados na MEC,
assim como também integram sinais mecânicos e químicos devido à sua
associação direta com o citoesqueleto.
3.1.4 Integrina αVβ3
A integrina αvβ3, objeto de estudo neste trabalho, ou receptor de
vitronectina, é uma das mais bem estudadas, principalmente pelo seu papel no
crescimento de tumores, angiogênese, crescimento celular e adesão do
embrião (BEER; SCHWAIGER, 2008). Seus genes estão localizados nos
cromossomos 2 (αV) e 17 (β3). BARCZYK et al. (2010) mostrou que este
receptor reconhece muitas moléculas da matriz, tais como: vitronectina,
fibronectina, fibrinogênio, a laminina, colágeno, fator de von Willebrand e
osteoponina, em uma sequência específica formada por arginina-glicina-ácido
aspártico (RGD) (ZHENG et al., 2014). Os receptores αVβ3 são expressos em
baixos níveis na maioria dos tecidos normais, incluindo intestino, vasos, e no
músculo liso, enquanto que níveis elevados de expressão são limitados aos
tecidos ósseo, o endométrio durante o ciclo menstrual, placenta, em sítios
inflamatórios, e tumores invasivos (glioblastomas, melanomas, ovário, mama e
próstata).
Os tipos de células que expressam elevados níveis desta integrina
incluem osteoclastos de reabsorção óssea, macrófagos ativados, uma pequena
fração de neutrófilos, células endoteliais angiogênicas e células lisas
(HORTON, 1997).
65
Esta integrina modula o crescimento, sobrevivência, motilidade e
diferenciação de um grupo limitado de células. Cerca de 20% de ratos knockout
a integrina αV mostraram defeitos placentários (como a perda fetal),
anormalidades no sistema nervoso central e gastrointestinal, além de
deficiências na coagulação e fenda palatina, enquanto que camundongos
knockout para β3 são férteis, mas estes apresentam defeitos na capacidade de
agregação plaquetária e reabsorção de osteoclastos (osteoporose) (BARCZYK,
et al., 2010).
Neste contexto as integrinas αVβ3 são vistas como importantes
moléculas em abordagens biotecnológicas a nível celular, no que tange o
câncer e terapias anti-angiogênicas (PERLIN; MACNEIL; RIMMER, 2008). Com
base no exposto, drogas e peptídeos que contêm as sequências RGD são
utilizados em associação com fármacos (CORSO et al., 2016; AROSIO;
CASAGRANDE, 2016). Assim, muitos esforços estão sendo são aplicados com
o intuito de obter um bom entendimento do receptor αVβ3 e suas bases
moleculares. Estruturas cristalográficas do domínio extracelular de αVβ3 foram
obtidas por XIONG et al (2001) na presença de cátions de Ca2+ e Mn2+ (XIONG
et al, 2002). A Figura 9 representa a integrina em um complexo com a
sequência RGD na presença de Mn2+, a partir da qual é mostrado que α e β
são subunidades montadas em uma cabeça oval e duas caudas quase
paralelas. A cabeça é constituída de umas sete pás em uma β-hélice em αV e
um domínio βA seguido por um domínio híbrido em β3. A cauda αV consiste em
dois domínios calf, enquanto que a cauda β3 é formada por um domínio
plexina-semaforina-integrinas (PSI). Quando αVβ3 está em complexo com o
pentapeptídeo cíclico arginina-glicina-ácido aspártico (D) fenilalanina (N-metil)
Valina (RGDfV, também conhecido como cilengitide), a sequência RGD da
integrina liga-se através de contatos entre arginina e a β-hélice. Muitas
interações também ocorrem entre a glicina e ambas as subunidades α e β. Já o
ácido aspártico se liga a um sítio de adesão dependente de íon metálico
(MIDAS), através do metal Mn2+.
66
Figura 9: Representação estrutural da integrina em complexo com o cilengitide, são
representadas as subunidades α e β montadas em uma cabeça ovoides e duas caudas quase paralelas (PDB ID: 1L5G) (PROWSE et al., 2011). A bolsa de ligação esférica de raio r também é apresentada nesta figura com um círculo pontilhado em linha na cor preta em torno do ligante
cilengitide.
3.1.5 Cilengitide
Devido a sua expressão primária em células endoteliais ativadas, as
integrinas αVβ3, aVβ5 e α5β1 são alvos atrativos para a terapia do câncer e para
o tratamento de doenças angiogênicas não malignas (KERR; SLEE.; MOUSA,
2002; KOCH, 2003). Especialmente em casos de tumores sólidos, as
moléculas anti-angiogênicas representam um novo conceito de terapia potente.
A inibição das interações integrina-ligante suprime o crescimento celular e
induz a morte celular por apoptose (MEREDITH; FAZELI; SCHWARTZ, 1993).
Atualmente, vários compostos com segmento para integrinas estão em
ensaios clínicos como potenciais fármacos para o tratamento de numerosas
doenças, incluindo o câncer. Entre eles, o cilengitide, que corresponde ao
primeiro antagonista de integrina em fase clínica III para tratamento de
67
glioblastoma e em fase II para vários outros tumores. Esta droga é a única
pequena molécula anti-angiogênica que denota atividade antagonista
subnanomolar para αVβ3 e uma de afinidade nanomolar baixa para αVβ5 e α5β1
(AVRAAMIDES; GARMY-SUSINI; VARNER, 2008). Ele foi desenvolvido no
início dos anos 90 por um novo procedimento, a análise espacial. Esta
estratégia resultou em c(RGDfV), o primeiro inibidor superativo para αVβ3 que
em adição exibe uma elevada seletividade contra o receptor de plaquetas
αIIbβ3. Este peptídeo cíclico foi mais tarde modificado por N-metilação de uma
ligação peptídica para se obter uma ainda maior atividade antagonista em
c(RGDF (NMe) V). Atualmente, o cilengitide está sendo desenvolvido como
droga pela empresa Merck-Serono (Alemanha) (MAS-MORUNO;
RECHENMACHER; KESSLER, 2010).
Estudos demonstram que o cilengitide influencia a adesão celular a
ligantes αVβ3, induzindo um aumento da apoptose e também o bloqueio ao
crescimento de xenoenxertos humanos em ratos (TAGA et al, 2002; PAOLILLO
et al, 2009). Além disso, revelou atividade anti-angiogênica e anti-tumoral em
vários modelos animais. A inibição de integrinas αV resultou numa redução
significativa da densidade de vasos funcionais e atraso no crescimento de
tumores e metástases in vivo (MACDONALD et al., 2001; BUERKLE et al.,
2002).
Como mencionado, o cilengitide demonstra qualidades quanto a inibição
de metástases de tumores em muitos estudos pré-clínicos anti-angiogênicos e
anti-tumorais. Além disso, os antagonistas de integrina parecem conferir
sinergia com terapias já estabelecidas, tais como a radioterapia e a
quimioterapia (TABATABAI et al, 2010).
3.2 Objetivos
3.2.1 Objetivos Gerais
O objetivo deste trabalho é apresentar uma descrição da interação entre
o pentapeptídeo cíclico cilengitide com a integrina αVβ3 através de técnicas de
bioquímica quântica no âmbito da Teoria do Funcional da Densidade (DFT).
Pretendendo assim, identificar os resíduos de maior importância nesta ligação,
68
bem como avaliar as peculiaridades que envolvem o complexo integrina-
cilengitide.
3.2.2 Objetivos Específicos
Quantificar as energias de interação entre os resíduos da integrina αVβ3
e o cilengitide.
Identificar os resíduos mais importantes que perfazem o complexo.
Descrever com base na Teoria da Densidade Funcional (DFT) as
interações mais pertinentes entre os resíduos da integrina e o cilengitide,
caracterizando os tipos de interação que acontecem e avaliá-los de
acordo com a sua importância.
Realizar uma comparação dos dados obtidos com os dados descritos na
literatura.
3.3 Materiais e Métodos
3.3.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica
Os dados cristalográficos utilizados para a realização deste trabalho e
que compreende ao cilengitide co-cristalizado com a integrina αVβ3 foi baixado
do banco de dados PDB (http://www.rcsb.org) sob o código 1L5G. Esta
estrutura foi determinada pela técnica de difração por raio-X e apresenta
resolução de 3.2 Å.
3.3.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização da Estrutura
O estado de protonação do peptídeo (ligante) em pH fisiológico foi obtido
usando o software de Marvin Sketch versão 5.3.2 (Marvin Beans Suite -
ChemAxon). Já quanto aos átomos de hidrogênio não resolvidos pela difração
de raios-x, portanto, ausentes na estrutura do cristal foram adicionados à
estrutura e submetidos a uma otimização de geometria clássica, assim como
os demais outros átomos. A otimização foi realizada utilizando o campo de
força clássico CHARMm (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics), que é
especialmente parametrizada para moléculas orgânicas (MOMANY, F. A;
RONE).
69
3.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional
As energias de interação entre a molécula cilengitide e os resíduos de
aminoácidos da αVβ3 foram calculadas a partir do método MFCC (ZHANG;
ZHANG, 2003; ZHANG; ZHANG, 2005) dentro da abordagem do DFT,
conforme mostramos no capítulo anterior.
O método MFCC tem sido amplamente utilizado para calcular as
energias de ligação entre os complexos proteína-ligante (DANTAS et al., 2015;
MOTA et al., 2016), e entre as três cadeias de colágeno (RODRIGUES et al.,
2013), uma vez que torna possível a investigação de um grande número de
resíduos de aminoácidos numa proteína com pequeno custo computacional e
nenhuma perda de precisão (GORDON, et al., 2012). Este esquema de
fracionamento foi inicialmente destinado a fornecer uma eficiente linearidade de
escala para cálculos de energias de interação proteína-ligante ab initio,
dividindo uma molécula de proteína em fragmentos de aminoácidos
adequadamente cobertos (ZHANG; ZHANG, 2003; ZHANG; ZHANG, 2005). A
diferença significativa entre o método MFCC e outros métodos de
fragmentação, que empregam proteção às extremidades da ligação
fraccionada, é a natureza dos caps utilizados. Ao invés de simples caps de
hidrogênio, os caps do MFCC são partes das seções vizinhas da molécula,
proporcionando eficiente método para representação do ambiente local durante
os cálculos de fragmentos individuais (WU et al., 2007). Nós calculamos a
energia de interação entre o ligante, o pentapeptídeo, e os fragmentos
individuais utilizando a Eq.1.
Os cálculos energéticos para cada resíduo no local de ligação foram
realizados utilizando o módulo G09 (FRISCH et al., 2009), dentro do
formalismo da Teoria do Funcional da Densidade (DFT). Utilizou-se a
Aproximação do Gradiente Generalizado (GGA) aliado ao funcional B97D
(GRIMME, 2006). Este foi recentemente proposto por ANTONY E GRIMME
(2012), juntamente com a correção de dispersão D3, sob modelos no vácuo e
de solvatação COSMO contínuo para calcular a energia de ligação de alguns
complexos ligante-proteína dentro de um esquema de MFCC. Para expandir os
orbitais Khon-Sham para todos elétrons, foi escolhido o conjunto de bases 6-
70
311+G (3df,2pd) para os cálculos. Para evitar perder interações importantes,
utilizamos um estudo de convergência igual ao realizado no capítulo anterior
(COSTA et al, 2012). Assim, alcança-se a convergência quando a variação de
energia no raio subsequente é menor do que 10%. Neste trabalho, o manganês
(Mn2+), íon MIDAS, foi levado em consideração nos cálculos ligado ao resíduo
mais próximo.
3.4 Resultados e Discussões
Os altos níveis dos receptores de integrina αVβ3 e αVβ5 em glioblastomas
e células de melanoma reforçam a proliferação do tumor, bem como a sua
propagação e adesão (VOGETSEDER et al, 2013; TAKAYAMA et al., 2005). A
inibição direta de αVβ3 por antagonistas seletivos em estudos pré-clínicos inibiu
a angiogênese e a adesão de células, levando a uma condição de regressão
do tumor em células cancerosas de mama e melanoma, experimentalmente
(VILORIA-PETIT et al., 2001). O cilengitide, cuja estrutura química está
representada na Figura 9, é um antagonista potente e seletivo de receptores de
integrina αVβ3 e αVβ5. Esta molécula promove a separação de células de
glioblastoma e mesotelioma a partir dos componentes de MEC e, como
consequência, a ativação de apoptose (DESGROSELLIER; CHERESH, 2010).
Além disso, ele apresenta níveis de toxicidades seguros e favoráveis, sem a
dose limitante em ensaios clínicos, aumentando a eficiência da radioterapia na
célula endotelial e em modelos celulares de câncer. Por outro lado, a
exploração de ligantes RGD, como veículos para compostos diferentes mostrou
ser uma estratégia útil para o desenvolvimento de sistemas de entrega para
fármacos ativos ou ferramentas de diagnóstico. A conformação assumida pela
sequência RGD no cilengitide é semelhante ao encontrado na equistatina e na
fibronectina (VAN AGTHOVEN et al., 2014), sugerindo que este pentapeptídeo
de estrutura cíclica possa servir como uma base para compreender as
interações proteína-ligante. Dessa forma, o desenvolvimento de dados
cristalográficos e computacionais tem sido fundamental para prover uma boa
perspectiva no que tange a base molecular que leva o cilengitide (e outras
pequenas moléculas que contem a sequência RGD) a ser reconhecido pela
71
integrina αVβ3 (MARINELLI et al., 2003). O que deve contribuir para o design
racional de novos fármacos com base no RGD e compostos peptido-miméticos.
A fim de proporcionar uma base energética para a interação RGD-
integrina, usamos uma abordagem bioquímica quântica, combinando o
esquema MFCC com o funcional GGA B97D, para descrever a interação
energética entre o pentapeptídeo cíclico cilengitide e os resíduos de
aminoácidos da integrina αVβ3. O domínio extracelular obtido por XIONG et al.
(2001) é composto por 946 (666) aminoácidos da subunidade αV (β3), com 438
(243) formando um domínio β-hélice (βA). Portanto, o critério de convergência
para limitar o número de resíduos utilizados neste trabalho pode ser
contabilizado sem perder as interações importantes da integrina com o
complexo, tendo o motivo RGD. A convergência aqui significa a estabilização
da energia de ligação total por uma variação inferior a 10% do sequencial do
raio r no bolsão de ligação, no qual a energia de ligação total é determinada
somando-se todas as energias dos resíduos-ligante dentro de um raio no
bolsão.
A Figura 10 representa a energia de ligação total, calculada usando o
funcional B97D, como uma função do raio do bolso de ligação, com r variando
de 2.0 Å (-77,996 kcal/mol) e 10.0 Å (-364,533 kcal/mol), a fim de determinar o
melhor valor de r (7.5 Å corresponde a uma energia de -339,653 kcal/mol) a
partir do qual a convergência é alcançada.
O sítio de adesão dependente de íon metálico (MIDAS) é muito
importante para a adesão da integrina. Na integrina αVβ3, o MIDAS é composto
pelos aminoácidos D119, S121, S123, E220 e D25155, cujas distâncias a partir
do cátion manganês Mn2+ ligado ao resíduo S121 são, respectivamente, 3.88
Å, 2.51 Å, 2.68 Å, 2.65 Å e 3.81 Å, (Figura 11).
72
Figura 10: A energia total de interação como uma função raio r no bolso de ligação calculada
utilizando-se o funcional B97D e GGA. Os resíduos de aminoácidos responsáveis pelas regiões da variação negativa e positiva mais acentuada são realçados.
De acordo com a Figura 10, há um aumento acentuado na energia de
ligação total entre r = 2.5 Å (-66,244 kcal/mol) e 3.0 Å (-295,179 kcal/mol),
devido a ocorrência de energias de ligação atrativas dos resíduos D150, S121
e R214 para o cilengitide. Em seguida, há um decréscimo da energia total de
ligação no bolsão de raio r = 3.5 Å (-279,962 kcal/mol) e 4.5 Å (-259,024
kcal/mol), isso acontece porque há a presença de energias repulsivas nos
resíduos D220 e M180, respectivamente. Nenhum resíduo foi encontrado para
r = 4.0 Å. As energias atrativas dos resíduos D219 e P219 aumentam, a
energia total em r = 5.0 Å (-294,253 kcal/mol). Uma pequena estabilidade é
encontrada entre os raios r = 5.0 Å e 5.5 Å (-299,165 kcal/mol) em
consequência de uma semelhante, entretanto oposta, energia de ligação nos
resíduos K125 (atrativa) e D251 (repulsiva), o que mantém a energia deste raio
estável. Contudo, interações com os resíduos A252, D119, L120 e D158 nas
posições 6.0 Å (-317,507 kcal/mol), 6.5 Å (-284,919 kcal/mol), e 7.0 Å (-340,947
kcal/mol), respectivamente, são responsáveis pela quebra da convergência.
73
Depois disso, a partir de r = 7.5 Å para a frente, a energia de ligação total como
uma função de r tende a apresentar pequenas oscilações.
O conhecimento da estrutura do bolsão de ligação a um receptor é um
passo importante na concepção de medicamentos. Muitos trabalhos têm
sugerido um rearranjo dinâmico e dobramento de domínios sob a integrinas na
presença de diferentes ligantes e íons (MORUNO et al., 2010). No entanto, é
evidente que a sequência RGD desses ligantes insere-se na porção superior
da integrina entre entre os domínios β-hélice e βA, ver figura 9, com a ajuda de
um cátion bivalente (KIM; YE; GINSBERGR, 2011). Recentemente,
AGTHOVEN et al (2014) mostraram uma estrutura cristalográfica de um
domínio de fibronectina com alta afinidade (HFN10) indincando que esse
peptídeo se liga a αVβ3 com sua sequência RGD ligada entre os domínios β-
hélice e βA, em uma conformação semelhante ao cilengitide.
Figura 11: Arranjo do sítio de adesão dependente de íons metálicos (MIDAS) e o resíduos de
aminoácidos encontrados na integrina αVβ3.
Conforme resumido na Tabela 4, entre os 76 resíduos dentro do bolsão
no raio r = 10.0 Å, apenas aminoácidos dos domínios β-hélice e βA
(VOGETSEDER et al., 2013) foram selecionados. Além disso, verifica-se que
as regiões III (Asp), IV (D-Phe) e V ([N-Met] Val) do cilengitide interagem
74
apenas com o domínio βA, enquanto que a região I (Arg) interage
principalmente com a β-hélice, apresentando apenas um contato com o
domínio βA. A região II (Gly) faz contato com ambos os domínios de integrina
de acordo com XIONG et al.,(2002). Após somar-se as energias de interação
de cada aminoácido com o cilengitide, as regiões foram classificadas em
termos de energias de ligação como se segue: Região I (E = -179,15 kcal/mol)
> Região III (E = -168,77 kcal/mol) > Região II (E = -47,16 kcal/mol) > Região V
(E = 6,16 kcal/mol) > Região IV (E = 27,69 kcal/mol). Entretanto, comparando-
se o número de contatos feitos com a integrina αVβ3, a classificação é a
seguinte: Região III (38) > Região I (34) > Região II (15) > Região IV (14) >
Região V (1). É importante destacar que as regiões IV e V estão na superfície
da integrina expostos ao solvente e contornado pelos resíduos polares Y122 e
S123 (região IV) e Y178 (região V). Assim, apesar de serem hidrofóbicas, as
regiões IV e V possuem cadeias laterais maiores, quando comparadas à região
II, embora com menos contatos (principalmente os aminoácidos polares).
Até aqui, foram descritas as características gerais do cilengitide no
cenário de ligação. Entretanto, é de grande importância para a concepção de
novos medicamentos e sistemas de distribuição também conhecer como ocorre
as interações entre a droga e os aminoácidos na cavidade de ligação. Assim,
para avaliar cada uma das interações energeticamente mais importantes entre
o cilengitide e a integrina αVβ3 usamos painel gráfico do BIRD (Binding site,
Interaction energy and Residues Domain), apresentado na Figura 12. Esta
figura descreve: (a) a energia de interação (em kcal/mol) do resíduo com os
ligantes, ilustrados pelas barras horizontais, a partir dos quais pode-se atribuir
quantitativamente o papel de cada resíduo na ligação, a sua eficácia, bem
como se eles atraem ou repelem o cilengitide; (b) os resíduos mais importantes
contribuindo para a ligação do lado esquerdo; (c) a região (letras em negrito) e
os átomos do ligante mais próximo de cada resíduo no local de ligação. De
acordo com a Figura 12 foram selecionados, 18 resíduos de aminoácidos como
os mais importantes para o complexo cilengitide-integrina.
75
Tabela 4- Energias dos resíduos, grupo atômico, camada de interação, distância mínima e
ligação MFCC entre cada um dos 76 resíduos de aminoácidos dos domínios β-hélice e βA. Os
valores de energia foram calculados utilizando GGA com o funcional B97D + D3.
De acordo com a Figura 12 foram selecionados, 18 resíduos de
aminoácidos como as mais importantes para o complexo cilengitide-integrina.
Entre eles, 11 mostram energias de ligação atrativas (negativas), são: S121 (-
121,8 kcal/mol) > D218 (-80,44kcal/mol) > L120 (-62,70 kcal/mol) > D150 (-
42,96 kcal/mol) > R214 (-42,37 kcal/mol)> D219 (-23,75 kcal/mol) > K125 (-
14,85 kcal/mol) > D146 (-12,61 kcal/mol) > A252 (-11,89 kcal/mol) > P219 (-
11,21 kcal/mol) > R216 (-9,56 kcal/mol), enquanto 7 resíduos de aminoácido
76
exibem energias de interação de repulsão (positivas): N215 (7,08 kcal/mol) >
Y122 (12,33 kcal/mol) > D158 (14,10 kcal/mol) > M180 (17,21 kcal/mol) > D251
(19,71 kcal/mol) > E220 (20,45 kcal/mol) > D119 (23,76 kcal/mol). Dentre estes
resíduos, apenas quatro (D218, D150, D219 e D146) compreendem o domínio
β-hélice.
As Figuras 13a - 13d apresentam alguns dos principais resíduos de
aminoácidos e suas respectivas interações intermoleculares com o cilengitide.
Tal como observado na Fig. 13a, a Região I esta envolvida por oxigênios
advindos do grupo carboxilato dos quatro ácidos aspárticos, D218, D150, D219
e D146 (β-hélice). Em nossos cálculos, D218 é o resíduo com a segunda
contribuição de energia de ligação mais atrativa. Ele atrai o ligante através de
pontes salinas entre a sua cadeia lateral carregada negativamente e dois
grupos amina pertencentes a cadeia lateral da Região I (arginina), I(N11)H e
I(N9)H, nas distâncias de 1.99 Å e 1.90 Å , respectivamente. O quarto
aminoácido com a energia de ligação mais atraente é o D150, que está
envolvido com uma ponte de salina na Região I[(N10) H] a uma distância de
2.89 Â. D219 e D146 são os sexto e oitavo resíduos mais atrativos,
respectivamente. A cadeia lateral desta última faz contato com I(N10)H a uma
distância de 8.80 Å, enquanto o D219 faz contatos com o cilengitide em
I(N11)H, I(N9)H e II H(C18) a uma distância de 4.51 Å, 6.64 Å e 5.17 Å
respectivamente.
Cálculos utilizando métodos de docking molecular de nove compostos
cíclicos e lineares determinaram um mapa das interações de cada composto
com a integrina αVβ3 (MARINELLI et al., 2003). O papel fundamental
desempenhado pelos resíduos D218 e D150 na ligação também foi observado
em outros compostos com sequência RGD (LIU; PAN; XU, 2010). Análises
realizadas a partir da síntese de 38 agentes anti-câncer sem a sequência RGD,
demonstraram que a interação do resíduo D150 com estes agentes é mantida
em todos os compostos (DAYAM et al., 2006). Além disso, outras análises de
docking molecular e ressonância nuclear magnética foram realizadas para
caracterizar peptídeos lineares baseados na sequência RGD ligada a integrina
αVβ3, mostrando que a variação do grupo fenil ao fenol faz com que estas
moléculas melhorem a sua afinidade de ligação (VASILE et al., 2016). A
77
superposição de estruturas cristalográficas de αVβ3 e αIIbβ3, estruturas
heterodiméricas com a subunidade β3, mostra que a posição do resíduo D218
(αVβ3) é ocupado por uma fenilalanina (αIIbβ3), o que cria uma deficiência
hidrofóbica que impede a ligação ao cilengitide. Outros estudos de docking e
técnicas de dinâmica molecular em peptídeos cíclicos complexados com as
integrinas αVβ3 e αIIbβ3, demonstram que o resíduo Gly (aqui representado na
Região II) é um importante aminoácido de motivo RGD, uma vez que é
susceptível a fazer algumas interações fracas que estabilizam o peptídeo (CαH
· · · O = C) (BELLA; HUMPHRIES, 2005).
Figura 12: BIRD painel gráfico que mostra os mais relevantes resíduos que contribuem para o
complexo de integrina αVβ3 cilengitide, distâncias mínimas entre cada resíduo e o ligante, bem como a região e os átomos dos ligantes mais próximos de cada resíduo no sítio de ligação.
78
Os principais resíduos de aminoácidos e suas respectivas interações
intermoleculares com o complexo cilengitide-integrina αVβ3 na Região II são
apresentados na Figura 13b. A Região II faz 15 contatos com resíduos da
integrina, a maioria deles provenientes de CαH[(C18)H]. Entre os 18
aminoácidos escolhidos como os mais energéticos, quatro fazem contatos com
esta região, cada um denotando interações atrativas com o cilengitide (E220,
S121, A252 e R216). O resíduo E220, juntamente com P219, N215 e D158,
constitui um sítio associado a ligação com o metal (ADMIDAS) ou, como
recentemente denominada, sítio de ligação sinérgica ao íon metálico (SyMBS)
(ZHU; et al., 2008). Este é um sítio regulador positivo que coordena E220 em
direção ao MIDAS, estabilizando a superfície de interação com o ligante
através dos efeitos sinérgicos de baixa concentração (LUO et al., 2007). Para
entender estes efeitos quanto a adesividade das integrinas, mutações
experimentais foram feitas em N215A, E220A e D217A da integrina α4β7
(CHEN; SALAS.; SPRINGER, 2003). Os resultados mostraram que estas
mutações levam a uma perda da função de aderência desta integrina.
S121, A252 e R216 são o primeiro, nono e décimo primeiro resídios
energeticamente mais atrativos, respectivamente, enquanto E220 revela a
segunda energia de ligação mais repulsiva. O resíduo R216 faz pontes de
hidrogênio fraca com as regiões II(C18)H e uma ligação de hidrogénio com
III(N8)H a uma distância de 2.70 Å. Apesar dos resíduos S121 e E220
interagirem com a Região III, eles apresentam energias de interação opostas.
Ademais, uma forma de modificar um ligante para torna-lo mais seletivo para
αVβ3 é a inserção de radicais volumosos devidamente orientados no ligante,
uma vez que a sobreposição de integrinas αVβ3 e integrinas α5β1 mostram que
a substituição de (β3)-Arg214 por (β1)-Gly217 e (β3)-Arg216 por (β1)-Leu219
abre um novo espaço adjacente ao local de ligação de RGD, que está ausente
no receptor αVβ3 mas presente na α5β1 (MARINELLI et al., 2003). O resíduo
S121 forma dois contatos com o carboxilato do cilengitide, uma ligação de
hidrogênio fraca com III(C22)O4 (2,8 Å) e uma ligação mediada com III(C22)O5
(5,1 Å). Já E220 apresenta uma repulsão eletrostática devido à carga negativa
do grupo carboxilato [III(C22) O4]. O A252 resíduo forma poucos contatos com
79
as regiões II(C20)O2 e III(C17)H do cilengitide a distâncias de 5.56 Å e 5.66 Å,
respectivamente.
A Figura 13c mostra uma visão geral das interações entre cilengitide e
os resíduos R214, L125 e D119. R214 e L125 apresentam as quinta e sétima
energias atrativas mais intensas, respectivamente, enquanto D119 é o resíduo
mais repulsivo. Enquanto isso, o resíduo R214 forma dois contatos com o
ligante, uma fraca ligação de hidrogênio com III(C22)O5 (2.5 Å) e uma
interação entre o NH do grupo guanidina e o oxigénio do carbonila da cadeia
principal da região III(C21)O3 a uma distância de 3,8 Å. Carregadas
negativamente as porções carboxilato de D119 e de cilengitide estão face-a-
face [III(C22)O5] a uma distância de 6.14 Â, criando uma repulsão eletrostática
que representa a sua alta energia de repulsão encontrada pelo nosso
resultados.
Os grupos que interagem com os resíduos P219, N215 e D158 são
mostrados na Fig. 13d. Embora o resíduo P219 seja atraente (a sexta mais
atrativa energia), os outros dois possuem energias repulsivas. Como se pode
ver, N215 forma uma ligação de hidrogênio (1.85 Å) entre o seu grupo amino
da cadeia principal e do oxigênio do grupo carboxilato do cilengitide
[III(C22)O5]. Juntamente a isto, dois oxigênios provenientes de sua cadeia
lateral (3.23 Å) e de sua cadeia principal (3.09 Å) estão próximos do mesmo
átomo de oxigênio. Desta forma, apesar de fazer uma ligação de hidrogênio, a
força repulsiva prevalece. D158 interage com III(C22)O4 a uma distância de
6.90 Å, enquanto o resíduo P219 faz dois contatos principais com a glicina de
cilengitide [II(C18)H e II(C20)O2] a distâncias de 4.79 Å e 5.82 Å,
respectivamente.
Por fim, as subunidades αV e β3 são encontradas em diferentes
membros das integrinas, cujo cenário energético de ligação pode distinguir
cada um deles (COX; BRENNAN; MORAN, 2010). Apesar da relevância da
subunidade β3 com o ligante para o mecanismo de acoplamento do ligante,
evidenciado pela presença do sítio MIDAS e LIMBS, sua relevância energética
é de cerca de 25,00 kcal/mol menor do que a αV. Somando-se as energias de
ligação de cada aminoácido por subunidade, αV (β3), temos -194,79 kcal/mol (-
169,74 kcal/mol). Analisando os resíduos mais energéticos, podemos ver que
80
as maiores repulsões são provenientes da subunidade β3, principalmente pelas
interações entre os grupos carboxilato carregados negativamente presentes na
Região III e resíduos de ácido glutâmico e ácido aspártico. Dos 76 aminoácidos
analisados neste trabalho, S121 e D218 são os com a maior contribuição para
a ligação ao cilengitide interagindo com os grupos III(C22)O4; III(C22)O5 e
I(N11)H; I(N9)H, respectivamente. L120, D150, D219 e R214, entre outros,
contribuiem para as interações atrativas, enquanto N215, Y122, D158, M180,
D251, E220 e D119 repeliem o cilengitide, sugerindo que a distribuição de
resíduos carregados negativamente em β3, circundando o ácido aspártico de
RGD pode diminuir a afinidade do complexo.
81
Figura 13: Os principais resíduos de aminoácidos e suas respectivas interações
intermoleculares com o complexo cilengitide- integrina αVβ3 (a) Região I; (b) Região II; (c) as regiões II e III; (d) Região III. Regiões IV e V não são mostradas aqui porque apresentam poucos contatos com resíduos de aminoácidos. Potenciais ligações de hidrogênio são
indicadas por linhas tracejadas.
82
3.5 Conclusões
As integrinas são moléculas de importância incomensurável na adesão
celular visto que são encontradas em praticamente todas as células do
organismo humano. Elas mediam as interações célula-célula e célula-substrato
sendo essenciais para a regulação celular, crescimento e diversas funções
celulares. Imtegrinas são receptoras poderosas para a geração de sinais
intracelulares e sua importância é refletida na gama diversificada de doenças
em que as integrinas desempenham papéis fundamentais incluindo câncer,
trombose e distúrbios autoimunes.
O papel das integrinas em controlar o comportamento celular, faz destas
moléculas alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas apesar das
grandes lacunas no conhecimento das suas propriedades bioquímicas. Embora
as estratégias terapêuticas para direcionar estas moléculas sejam abundantes,
poucas são usadas hoje em dia no tratamento clínico, com muitas delas não
passando das fases iniciais dos ensaios clínicos. A boa notícia é o
aparecimento do antagonista da integrina, um pentapéptido cíclico contendo o
segmento RGD e o primeiro inibidor da integrina em desenvolvimento clínico
para o tratamento do glioblastoma na fase III dos experimentos, e na fase II
para vários outros tumores. Esta droga é a primeira pequena molécula anti-
angiogênica visando as integrinas αVβ5, αVβ3 e αVβ1, cujo design e produção
requer um conhecimento preciso não só da sua estrutura bioquímica, mas
também do seu mecanismo de ligação com a integrina, levando a uma melhor
compreensão de como este complexo influencia os tumores e as suas terapias
anti-angiogênicas, bem como o seu microambiente.
Neste contexto, a modelagem molecular e a simulação, utilizando
biomoléculas surge como um método eficaz no estudo de eventos moleculares
difíceis de serem caracterizados por outros tipos de análises. Este fato tem
estimulado o interesse dos biocientistas em investigar os problemas biológicos,
este entusiasmo vem acompanhado do fortalecimento dos sistemas
computacionais, bem como da diminuição na proporção do preço do hardware.
Este desenvolvimento nos permite, hoje, realizar simulações com resultados
83
significativos a respeito de sistemas biológicos e químicos complexos,
permitindo a compreensão de diversos eventos.
Face ao exposto, denota-se que os métodos computacionais possuem
grande relevância para a pesquisa bioquímica. Assim, este trabalho reforça o
papel da simulação computacional utilizando o nível quântico no entendimento
das interações do sistema aqui analisado. As metodologias empregadas nas
análises das interações proteína-droga, em particular os métodos de
fragmentação, têm-se mostrado bastante eficazes em delinear as interações,
bem como para qualificar a importância de cada uma delas.
Neste trabalho, realizou-se a técnica da fragmentação molecular com
capas conjugadas para determinar quais aminoácidos seriam de maior
importância nas interações entre o composto cilengitide com base no seu
fragmento RGD co-cristalizado à integrina αVβ3 usando cálculos de química
quântica. Depois de um estudo de convergência no tamanho da esfera do
bolsão de ligação, nós consideramos todas as interações ligante-resíduo num
raio de 10.0 Ȧ a partir do ligante. Observamos a necessidade de ter em conta
um cenário de ligação maior, incluindo resíduos de aminoácidos mais distantes
a fim de se obter uma boa correlação entre os dados da simulação e os
achados experimentais. Estabelecemos a ordem decrescente de ligação das
regiões de maior afinidade do Cilengitide, e encontramos região I> III> II> V>
IV. Determinamos também os resíduos da integrina que desempenham papel
mais importante na afinidade da ligação e vimos que as ligações
intermoleculares mais fortes são formadas entre o cilengitide e os aminoácidos
Ser121, Asp218, Leu120, Asp150, Arg214, Asp219, Lys125, Asp146, Ala252,
Pro219, Arg216, Asn215, Tyr122, Asp158, Met180, Asp251, Glu220 e Asp119.
Com base nas informações expostas, inferimos a importância dos
resultados para a análise proposta, visto que o conhecimento das
peculiaridades que envolvem a interação entre a integrina e o fragmento RGD
do Cilengitide podem auxiliar a compreensão de eventos ainda não totalmente
esclarecidos, bem como fornecer dados relevantes sobre os aspectos
particulares do sistema estudado.
84
CONCLUSÃO GERAL E
PESPECTIVAS
_______________________________________________________________
85
Os resultados desta tese mostraram-se bastante promissores,
confirmando dados computacionais, experimentais e clínicos. Vários sistemas
biológicos não possuem um detalhamento preciso pelo não conhecimento do
seu mecanismo de ação, o que dificulta a formulação de fármacos que trariam
a cura de diversas patologias.
Por muito tempo, a indústria farmacêutica baseou-se apenas em
análises experimentais para averiguar a viabilidade de novos fármacos, com
grandes custos e demanda de enorme quantidade de tempo. Hoje, há
computadores que auxiliam em vários passos da pesquisa farmacêutica, desde
a predição de novas moléculas até a simulação do seu comportamento no alvo.
Conhecer as interações específicas de cada ligante é primordial para o
estudo do comportamento do sítio ativo, tendo grande importância no
entendimento dos processos biológicos para o desenvolvimento de novos
medicamentos. Sabemos que uma metodologia que permita a caracterização
das interações que ocorrem no sítio de ligação é extremamente importante,
pois a distinção entre os grupos funcionais que são responsáveis por criar um
maior conjunto de ligações favoráveis pode propiciar ajustes na estrutura do
fármaco que levem a um melhor efeito do mesmo.
Esta dissertação constitui um passo a mais para o completo
entendimento da atuação das drogas nos receptores estrogênicos, podendo
auxiliar no desenvolvimento de novas perspectivas no tratamento do câncer de
mama e de outras patologias estrógeno-dependentes.
Os métodos computacionais de química quântica utilizados neste
trabalho surgiram como uma alternativa simples e eficiente para o
desenvolvimento de novas drogas. Com uma melhor compreensão dos
mecanismos de ligação entre a integrina αVβ3 e o Cilengitide, como também
entre as diversas outras integrinas e seus agonistas e antagonistas, poderemos
decifrar todos os processos que incluem as integrinas. O entendimento desses
mecanismos é de fundamental importância para o tratamento do câncer e
todas as outras patologias que têm na sua fisiopatologia os mecanismos de
adesão celular.
Nossas perspectivas para novos trabalhos em relação ao receptor de
Estrógeno α-Hidroxitamoxifeno podem ser continuadas estudando o
86
tamoxifeno. Apesar de mostrar bons resultados clínicos durante o tratamento
de câncer de mama, o uso contínuo de tamoxifeno tem sido relacionado ao
surgimento do câncer de endométrio. Através de análises moleculares,
observou-se uma prevalência de receptores de estrógeno do tipo beta (ERβ) no
útero, sendo um indicativo de sua ação neste tipo de câncer. Ademais, sabe-se
que o tamoxifeno tem apresentado ação agonista neste receptor.
No caso das integrinas, podemos investigar outras integrinas em
complexo com cilengitide e diferenciar entre os subtipos de receptor,
propiciando assim a obtenção de fármacos com maior seletividade. Sua função
para o reconhecimento de moléculas vem sendo utilizada como base para o
desenvolvimento de terapias com maior precisão em relação ao alvo molecular,
levando a um menor número de efeitos indesejados. É sabido que se formam
vinte e quatro integrinas em humanos, sendo estas divididas por sua sequência
de aminoácidos e pelos ligantes aos quais estas se acoplam. Destas, oito
membros (α5β1, α8β1, αIIbβ3, α5β1, αVβ3, αVβ5, αVβ6 e αVβ8), reconhecem a
sequência RGD.
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109
ANEXO 1
_______________________________________________________________
110
Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27
Contents lists available at ScienceDirect
Computational and Theoretical Chemistry
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s ev i e r . c o m / l o c a t e / c o m p t c
A quantum biochemistry model of the interaction between the estrogen receptor
and the two antagonists used in breast cancer treatment
K.B. Mota a, J.X. Lima Neto
a, A.H. Lima Costa
a, J.I.N. Oliveira
a, K.S. Bezerra
a, E.L. Albuquerque
a,
E.W.S. Caetano b, V.N. Freire
c, U.L. Fulco
d,⇑
a Departamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal-RN, Brazil
b Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará, 60040-531 Fortaleza-CE, Brazil
c Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, 60455-760 Fortaleza-CE, Brazil
d Departamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970 Lagoa Nova, Natal-RN, Brazil
a r t i c l e i n f o Article history: Received 4 April 2016 Received in revised form 3 May 2016
Accepted 8 May 2016 Available online 9 May 2016
Keywords: Quantum biochemistry DFT (Density Function Theory) MFCC
(Molecular Fractionation with Conjugate
Caps) scheme Estrogen receptor
Raloxifene, Tamoxifen
a b s t r a c t In this work we employed quantum biochemistry methods based on the density functional theory (DFT) model and the MFCC
(Molecular Fractionation with Conjugate Caps) scheme to unveil the detailed binding energy features of the tissue-selective
synthetic agents SERMs (selective estrogen receptor modulators) 4-hydroxytamoxifen (OHT) and raloxifene (RAL), widely
used in the breast cancer treatment, co-crystallized with the estrogen receptor a (ERa). Our theoretical/computational results
demonstrated that the total binding energies of OHT and RAL to the ERa ligand-pocket correlate with the experimental
binding affinity. Besides, we found that SERMs-OHT binds stronger when compared to SERMs-RAL, confirming
experimental data, whose main contributions to the total SERMs-ERa binding energy are due to the amino acid residues in
decreasing sequence D351 > E542 > D538 > E353 > E423, an important information to understand their binding mechanisms.
2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Breast cancer is the second most common malignant neoplasms
worldwide and the fifth in cause of deaths [1]. Over the years, some molecular alterations which reflect the biological characteristics of invasive
breast carcinomas have been identified and considered as molecular markers,
such as the estrogen receptors (ERs) [2].
Expressed in approximately 75% of invasive breast tumors [3], ER belongs to the nuclear receptor (NR) superfamily of ligand-activated
transcription factors, like the glucocorticoid receptor (GR), androgen receptor
(AR), retinoic acid receptor (RAR) and orphan receptors [4,5]. Through these
receptors, NR controls the transcription of important genes for developmental, reproductive, neural,
skeletal, grow and cardiovascular processes [6,7], trans-forming them an
important drug target.
Similar to other nuclear receptors, estrogen receptors are char-acterized by
presenting a variable N-terminal transactivation domain, a conserved DNA
binding domain (DBD), a variable hinge region, a conserved ligand binding
domain (LBD), and a variable C-Terminal domain [8]. ER-ligand binding
domain (ER-LBD) is
⇑ Corresponding author.
E-mail address: [email protected] (U.L. Fulco).
http://dx.doi.org/10.1016/j.comptc.2016.05.006 2210-271X/
2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
encoded within a region of about 300 amino acids, and its overall architecture
is comprised of helices 1–12 (H1–H12) and two b-sheet (S1 and S2; see Fig.
1). It possesses the function of ligands recognition and activation of
physiological response [5]. Thus, after ligand docking, there is an LBD rearrangement to active state with a shift at
the position of helix 12. It is followed by a formation of (homo or hetero)
dimers that recognize specific sequences of the genomic DNA with the
binding of many kinds of co-activators or co-repressors, which are related to
transcriptional activation/ repression, in order to mediate the transcription of
various target genes [9].
Estrogen receptor family is composed by estrogen receptor a (ERa) and
estrogen receptor b (ERb), that are expressed in a wide range of tissues and
cell types, sharing some level of sequence homology [10]. ERa is encoded by
ESR1 gene on chromosome 6 and has been found predominantly in bone, testes, epididymis, prostate,
uterus, ovary, liver, mammary gland, adipose tissue, heart, vascular system
and brain. ERb is encoded by ESR2 gene on chromosome 14 and is present in
the bladder, prostate, ovary, colon, adipose tissue, immune system, heart,
vascular system, lung and brain [11]. In breast cancers cases, it is common to
see a decrease of ERb expression and an increase in proliferative response
associated to the ERa activation [12]. Thus, many ERa
111
22 K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27
Fig. 1. Structural representation of the Estrogen Receptors a Ligand-Binding Domain (ERa-
LBD) complexed with 4-hydroxytamoxifen (PDB ID: 3ERT) [19]. The binding pocket sphere
with radius r is also shown in this picture as a circle around the ligand.
antagonists/modulators have been developed to reverse the growth-promoting
effect of estrogen in breast cancer, as the selec-tive estrogen receptor
modulators (SERMs) [7]. SERMs, also called anti-estrogens, are tissue-selective synthetic agents
that modulate estrogen receptor transcriptional activity by acting, depending
on the cellular differences, as agonists or antag-onists such as cell-signalling
pathway, accessory co-factors and DNA response elements [13]. Tamoxifen
and raloxifene are SERMs with broadest utility for health maintenance in
woman [14]. Tamoxifen, a triphenylethylene derivative, is one of the oldest,
most well-known and most prescribed SERMs with remarkable tissue-specific
behavior [15]. It acts as an ER antagonist in breast and decreases the
incidence of invasive and non-invasive breast cancer [16]. However,
tamoxifen is associated with an increase incidence of venous thromboembolic
events, vasomotor symp-toms, stroke, hot flashes and abnormal endometrial
behavior [17]. Raloxifene, a benzothiophene derivative, is used for preven-
tion of osteoporosis [18] and to breast cancer cases [19]. It acts as an ER
agonist at bone and antagonist at breast and endome-trium. Resembling
tamoxifen, raloxifene use also shows increase of vasomotor symptoms and
hot flashes incidence [20].
Selective estrogen receptor modulators are very effective against breast
cancer. However, these drugs have unwanted side effects in non-target tissue,
and the cancer could become resistant to anti-estrogen therapy. Thus, a
number of experimental and the-oretical studies has been carried out to clarify
the mechanism of the ER-ligand binding, and a wide repertoire of structurally
distinct ligands that bind to ER with different degrees of affinity and potency
have been proposed [21–24].
It is the aim of this work to use computational biochemistry techniques,
within the density functional theory (DFT) framework (for a review of these
techniques see [25]), in order to present an adequate description of the
interaction between 4-hydroxytamoxifen (OHT), an active metabolite of
tamoxifen with high affinity to ER, and raloxifene (RAL), a SERMs widely
used in breast cancer treatment and prevention of osteoporosis, co-crystallized
with the estrogen receptor a (ERa). The individual con-tribution of each
amino acid residue was calculated applying the
MFCC (Molecular Fractionation with Conjugate Caps) scheme, con-sidering
residues at the binding site, but also including other rele-vant ones. The
simulations were performed using the X-ray structure of ERa co-crystallized
with OHT [19] and RAL [26] (PDB ID: 3ERT and 1ERR, respectively). A
comparison between our theo-retical binding energies and the experimental
one is also made and their features are discussed.
2. Materials and methods
Crystallographic data of the 4-hydroxytamoxifen (OHT) and raloxifene
(RAL) co-crystalized with ERa were downloaded from the PDB database
(http://www.rcsb.org) under the codes (resolu-tions) 3ERT (1.90 Å) and
1ERR (2.60 Å), respectively. The state of protonation of all ligands in
physiological pH was obtained using the Marvin Sketch code version 5.3.2
(Marvin Beans Suite – ChemAxon).
Hydrogen atoms, not resolved by the X-ray diffraction and therefore
absent in the crystallographic files, were added to the structures and submitted
to a classical geometry optimization fix-ing the other atoms. This optimization
was performed using the classical force field CHARMm (Chemistry at
Harvard Molecular Mechanics), which is especially parametrized for organic
molecules [27].
The interaction energy between each SERMs molecule and the ERa
amino-acid residues were calculated by using the MFCC method [28,29]. The
MFCC method has been widely used to calcu-late protein–ligand binding
energy once it turns possible the inves-tigation of a large number of amino
acid residues in a protein with small computational cost and no loss in
accuracy [30–34]. The convergence study of the total interaction energy as a func-tion of the
ligand binding pocket radius r was performed in order to put a limit in the
number of amino-acid residues to be analyzed without missing important
interactions [35]. In doing that, we have added the individual interaction
energy of the amino-acid residues within imaginary spheres with pocket
radius r centered at the ligand. Considering r ¼ n=2 (where n = 1, 2, 3, 4. . .),
we achieved the converged binding pocket radius when the energy variation
in the subsequent radius is smaller than 10% [36]. Here, we label the ligand
molecule as L and the i-th amino-acid residue interacting with the ligand as Ri
. The Ci 1 (C
iþ1) cap is formed from the neighbor residues covalently bounded
to the amine (carboxyl) group of the residue Ri along the protein chain. For
completeness, we employed the same line of investigation done in our
previous work related to the willardiine-iGluR2 [37], in which the nearest
five amino-acid fragments at each side of the Ri residue were used to build the
Ci
1 and C
iþ1 caps, providing a better description of its electronic
environment. For these fragmented structures, the inter-action energy between
the ligand and the individual fragments, EIðL RiÞ, is calculated according to:
EIðL RiÞ ¼ EðL þ C
1
iR
iC
iþ1Þ EðC
1
iR
iC
iþ1Þ EðL þ C
1
iC
iþ1Þ
þ EðC1
iC
iþ1Þ; ð1Þ
where the first term EðL þ Ci
1R
iC
iþ1Þ is the total energy of the sys-tem
formed by the ligand and the capped residue; the second term, EðCi 1R
iC
iþ1Þ,
is the total energy of the residue with the caps. Also the third term EðL þ Ci
1C
iþ1Þ is the total energy of the system formed by the caps and the ligand,
while the fourth and final term EðCi 1C
iþ1Þ is the energy of the caps with
dangling bonds hydro-genated. The total interaction energy for RAL and OHT
is obtained by adding up the interaction energies with each amino-acid residue
within a given binding pocket radius. Water molecules were taken into
account in the calculation procedures when hydrogen bonds
112
K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27 23 are formed with the residues of interest or with the caps. A hydro-gen bond
length limit of 2.5 Å was adopted in this case. Energetic calculations for each residue at the binding site were performed
using the DMol3 code [38], within the density func-tional theory (DFT)
formalism. The Generalized Gradient Approxi-mation (GGA) Perdew–
Burke–Ernzerhof exchange–correlation functional (PBE) [39] was chosen. In
order to improve the descrip-tion of the non-covalent interactions, Ortmann et
al. [40] and Grimme [41] have developed semi-empirical approaches to pro-
vide a better compromise between the cost of first principles eval-uation of
the dispersion terms. We used the DFT + D method following the GGA–
PBE–Grimme scheme to calculate the interac-tion energies of the OHT and
RAL-ERa complexes. The DNP basis set, which is comparable to the 6 311 þ
G (3df, 2pd) basis set [38,42], was selected for the calculations to expand the
Khon– Sham orbitals for all electrons. The orbital cutoff radius was set to 3.7
Å, and the self-consistent field convergence threshold was adjusted to 10 6
Ha.
3. Results and discussions
Although the first SERMs were identified over 60 years ago, their
molecular basis only began to be unravelled in the last 25 years [43].
Nevertheless, recently computational and crystallo-graphic studies have
reported that the nature of the ligand is a crit-ical determinant of its action in
estrogen receptors [13,43]. Thus, a binding energy scenario, as discussed
here, of the complexes between 4-hydroxytamoxifen (OHT)/raloxifene (RAL)
and estrogen receptors a (ERa) is a crucial step in this process. As shown in
Fig. 2a, these ligands share some chemical features, but they show distinct
agonism/antagonism activity and affinity in different tis-sues and receptors
[44]. Both ligands are subdivided into four regions, as depicted in Fig. 2a, to
facilitate a further analysis. These
selected parts are used to describe the most important residues that interact
with each SERM region. Fig. 2b presents the electron density isosurface for
the OHT and RAL, in order to clarify how the electrons are distributed around
the molecules. All calculations were performed starting from the crystallo-graphic
estrogen receptor a (ERa) structure co-crystallized with 4-hydroxytamoxifen
(OHT) and raloxifene (RAL) that have been deposited in the protein data
bank (PDB ID: 3ERT and 1ERR, respec-tively) [19,26]. The binding energies
between of ERa-LDB and two of its antagonists, 4-hydroxytamoxifen (OHT)
and raloxifene (RAL), were calculated employing the MFCC scheme to
obtain the individ-ual contribution of the amino acid residues inside a binding
pocket with a selected radius, ranked from the most relevant interactions,
since the determination of ligand characteristics linking their affin-ity to ER is
quite important for the development of new therapeutic agents. Each residue
with their distance to OHT and RAL and indi-vidual binding energy are
shown in Tables I and II from the Supple-mental Material, respectively. It is
during the convergence study that the total binding energy for each binding
pocket radius was obtained by adding up the respective individual
contributions. To take into account each significant attractive and repulsive
amino acid residue, we perform a search for an optimal binding pocket radius
for which no significant variation in the total binding energy could be
observed after a radius increase. Fig. 3 presents a compar-ison between the
calculated total interaction energies E(r) for the OHT and RAL as a function
of the binding pocket radius r, which indicate that the converged binding
pocket radius is about 15.0 Å, comprising a total of 138 and 145 amino acids
respectively.
Note that the interaction energy follows the order OHT > RAL for each one of pocket radius r = 4:0; 6:0; 11:5; 13:0 and 15.0 Å ( 18 4.470 kcal/mol > 154.410 kcal/mol, 164.760 kcal/ mol > 121.3 60
kcal/mol, 282.170 kcal/mol > 250.220 kcal/mol, 360.420 k cal/mol > 333.640
kcal/mol, 346.230 kcal/mol >
Fig. 2. Representation of the OHT and RAL at physiological ph and electronic density
distribution. (a) Chemical structure subdivided into four parts to help the analysis of its
interactions with ERa; (b) electron density projected onto an electrostatic potential isosurface
showing negatively and positively charged regions in a red and blue color, respectively. (For
interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web
version of this article.)
113
K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27
Fig. 3. Total SERMs interaction energy for OHT and RAL considering the pocket radius r = 4.0
Å, 6.0 Å, 11.5 Å, 13.0 Å, and 15.0 Å, calculated by using the GGA-PBEGrimme exchange–
correlation functional. The absolute value of EðrÞ obeys the sequence OHT > RAL,
reproducing experimental data [7,44].
327.750 kcal/mol, respectively). These results are in agreement with the
experimental data of Clegg et al. and Kuiper et al. [7,44]. Fig. 4a and b shows a BIRD graphic panel (BIRD being an acro-nym of
the keywords binding site, interaction energy and residues domain) with the
interaction energies between the OHT and RAL and the most important amino
acid residues at the binding region. The panel depicts:
(a) the interaction energy (in kcal/mol) of the residue with the ligands,
illustrated by the horizontal bars, from which one can assign
quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their
effectiveness as well as if they attract or repel this SERMs;
(b) the most important residues contributing to the bonding in the left
side; (c) the region (boldface letters, identified in Fig. 4) and the atoms of the
ligands closer to each residue at the binding site.
As one can see from Fig. 4, the pattern of interaction seems to be simpler
for OHT than for RAL. For OHT, the attractive interactions are predominant,
but we also observe few repulsive one. The resi-dues that bind more
significantly are D351, E542, E353, D538, E423, C381, T347, M388, M543,
M396, M427, M357, M343, L525, L346, I424, F404, H524, R394, R352 and
K529, being the last four in a repulsive way. For RAL, repulsive interactions
appears more frequently when compare to OHT. Its main residues are D351,
E542, D358, E423, E353, F404, T347, M343, L346, L525, H524, I424, R394,
R335, M543, M388, M396, M427, M357, C381 and R352, being the last nine
repulsive. The difference of attractive and repulsive energies proportion
between OHT and RAL may sug-gest why the first binds tighter than the
latter when considering the overall energy.
Crystallographic X-ray structures obtained by Shiau et al. [19] and
Brzozowski et al. [26] do represent the complex structure in which agonists
and antagonists occupy the same ER-LBD binding pocket. From them, we
became aware that the binding of OHT and RAL is guided by their phenolic
ring (Fig. 2a, region i) as well as the bulky side chain, which is involved by
the hydrophobic core of LBD. However, even sharing the same binding site,
agonists and antagonists bring different rearrangements of receptor that are
related to the activation or deactivation of its transcriptional activity. As
shown by crystallographic structures, when estrogen
Fig. 4. BIRD graphic panel showing the most relevant residues of ERa that contribute to the
binding of each ligand: (a) OHT and (b) RAL. receptor a is bound to antagonists, as such OHT and RAL, there is a
reorganization of some helices followed by a motion of helix 12 toward
coactivator-binding groove formed by the residues from helices 3, 4, and 5.
This, in turn, leads the receptor to a deactivate state by mimic the coactivator
helix binding, creating an impair-ment to its attachment [19]. Thus, to
understand the differences between OHT/RAL-ERa complexes it is important
to notice the binding characteristics of these ligands. Each one of the four
regions (i, ii, iii and iv) of the OHT and RAL interacts, at least, with one
amino acid into our binding pocket radius (15 Å). According to the sum of the
values in Table I (see the Supplemental Material), OHT regions (i) and (iv)
are the first and second energetically most relevant regions, while regions (i)
and (ii) are the largest in number of interactions with ERa. Also, as one can
see from Table II in the Supplemental Material, the sum of the energies in
RAL regions (i) and (iv) occupy the first and second positions, respectively,
having also the largest number of interactions reinforcing the importance of
these regions in the recognition of the activities of these SERMs, as stressed
by Shi et al. [45] and Komm and Mirkin [46].
Region (iv) of OHT and RAL is comprised of a positively charged
nitrogen that is stabilized by D351 and other hydrophobic
114
K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27 25 contacts. In our calculation, D351 is the residue with the most intense binding
energy contribution to both ligands, with interac-tion energies of 62.92 (OHT)
and 91.55 kcal/mol (RAL) (see Fig. 4). As observed in Figs. 5 and 6, it
attracts the ligands through a salt bridge between its carboxylate side chain
and region (iv) N24 (N26) H of OHT (RAL) with a distance of 3.40 (1.70) Å.
Crystallo-graphic, mutation and computational analysis have shown that its
position correlates with the entrance of the helix 12 (H12) into the active or
deactive form when the ERs (a and b) are attached with agonists or
antagonists, respectively [47,15]. The second high-est binding energy
contribution to OHT and RAL ( 44.26 and 47.04 kcal/mol, respectively)
belongs to the residue E542, which presents different positions in OHT and
RAL pocket radius distribu-tion (12.5 and 9 Å, respectively), but are closed to
the region (iv), as depicted in Fig. 4. It is followed by the residue D538,
exhibiting the thirst highest binding energy, showing 39.05 ( 42.72) kcal/mol
to OHT (RAL). Note that E542 and D538 are residues highly con-served
which occupy the helix 12 (H12) and create a negatively charged area to co-
activators being, therefore, important residues in ER activation or deactivation
[19,47].
A phenolic ring of estrogen is shared by many selective estrogen receptor
modulators [6,48]. It is seen by forming hydrogen bonds to the carboxylate
group of E353 (H3) and the guanidinium group of R394 (H6) and a water
molecule conserved between E353 and
Fig. 5. Arrangement of the most relevant amino-acid residues involved in the ERa-SERMs
binding. Drug-residue contacts are depicted by dashed lines and their distances. (a) OHT and (b)
RAL.
Fig. 6. Electrostatic potential isosurfaces with the projected electron densities for SERMs
interacting with the most attractive residues: (a) OHT and (b) RAL.
R394 amino acids [5,19,26,51]. As one can see from Figs. 5 and 6, E353 and
R394 interact in a very similar way with our two SERMs through this
hydroxyl phenolic group (region i). It is confirmed by our calculated binding
energies between OHT and RAL, respec-tively, that are closed to each other
(see Fig. 4), with 17.25 (2.08 Å) and 21.54 (2.05 Å) kcal/mol for R394, and
38.06 (1.67 Å) and 35.35 (1.67 Å) kcal/mol for E353 (the fourth most
attractive interaction energy). In our calculations, the conserved water
molecule was attached to the closer residue R394 (E353) for the complex
OHT-ERa (RAL-ERa). Due to the differences in quantity of the
crystallographic water molecules, it is named w2 in the first complex and w3
in the second one. In both cases this water is responsible by forming a water
mediated hydrogen bond, beyond the direct H-bond made by these amino
acids. Beyond the H-bond, the energetic results above are also an electrostatic
effect of the charged region (iv) that shows to be prevalent in both cases.
Thus, even making hydrogen bonds with the same molecular group, we find
opposites binding energies. E423 (H8) is the fifth residue with the most
intense binding energy, with interaction energy of 31.98 and 39.25 kcal/mol,
and radius position in 7.5 Å and 5.5 Å to OHT and RAL SERMs.
One of the traditional biologically important topics of quantum
biochemistry, which is not fully understood so far, is the physical nature of
spontaneous point mutations. A plausible cause of these mutation is the so-
called rare tautomers arising from the proton transfer (PT) reactions between
the base pairs double helix archi-tecture of DNA [49]. Experimental
mutations of H524, with no computer simulation counterpart, was found to
reduce estrogen
115
K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27 binding [50] and it was correlated by Fukuzawa et al. with the key role of hydrogen bond to ligands [51]. Besides, as shown in Fig. 5a, H524 (H11) makes a H-bond with hydroxyl group of the region (ii) of RAL,
mimicking (not mimicking) the binding with oestradiol (OHT) [26]. Thus, the
lost of this binding appears in our results with the increase (decrease) of the
energy (distance) from 0.06 to 4.08 kcal/mol (from 2.5 to 2 Å), between OHT
and RAL. Further-more, the residues L525 ( 6.52 and 4.79 kcal/mol), w383 (
5.52 and 8.70 kcal/mol) and P404 ( 2.83 and 8.52 kcal/mol) are involved (not
involved) in p-sigma interactions with RAL (OHT) at regions (i), (iii), and
(iv). They are part of the helix 11 (H11), helix 5 (H5) and b-sheet 1 (S1),
being very important in the stabilization of the ligands into the binding
pocket, while experimental mutations are related with the decrease of ER
ligand binding [19,26,51,50]. It is important to notice the role played by the
methionine and cysteine residues, namely M343 (H3), M388 (H6), M357
(H3), M427 (H8), M543 (H12), C381 (H5) and M396 (H6), which are among
the most relevant residues in our calcula-tions. However, as we can see from
Fig. 4, they show an opposite energetic behavior, with an attractive
(repulsive) binding energy to OHT (RAL), except to M343.
Concluding, among the amino acids analyzed in this paper our results
show that the strongest attractive energies for both drugs follows the
decreasing sequence D351 > E542 > D538 > E353 > E423, suggesting their
importance to the interaction between ligand and receptor. Except for E423,
all these amino acids, by crys-tallographic and mutation analysis, are relevant
to the recognition of ligands and activation or deactivation of ERa
transcriptional function. When we consider these specific residues, we
observe similar binding energies for the two antagonists. However, we found
considerable differences in other residues that may be related to the charge
distribution, distance between ligand and residue, and the presence of water
molecules. Our results show that the loss of hydroxyl in region (ii) by OHT
decrease its interac-tion energy with H524, which is a member of the H-bond
network in ERa binding pocket (R349, E353, L387 and H524), and is consid-
ered to be very important to the ligands recognition [51]. We also show the
relevance of some methionine and cysteine residues (M343, M388, M357,
M427, M543, C381 and M396), that are attracted by OHT but repelled by
RAL. The existence of more repul-sive energies for RAL might suggest a
reason why it can remain as antagonist when bound to ERb (whereas OHT
plays an agonist role), knowing that the LBD of human’s ERb keeps 55%
homology when compared to ERa [5,10].
4. Conclusions
Summarizing, we have investigated the interactions among SERMs (OHT
and RAL) and ERa binding pocket using quantum bio-chemistry calculations.
We also demonstrated the necessity of tak-ing into account a larger binding
pocket size, including more distant amino acid residues in order to obtain a
good correlation between the experimental and the simulation data. After a convergence study on the size of the binding pocket sphere, we
have taken into account all ligand-residue interactions within a radius of 15 Å
from the ligand. We could notice that SERMs-OHT binds more strongly when
compared to SERMs-RAL, confirming experimental data [7,44]. In addition,
we have estab- lished the main regions of both ligands (regions i and iv) and the residues that
play important role on the binding affinity of ERa with their antagonists.
Through combining these computation techniques to ligand-based
approaches, more accurate models should be possible in order to study and
understand receptor-mediated effects.
Our results suggest that the protonation state of the charged
dimethylaminoethyl/piperazine can have an antagonist effect on ERa of the
studied SERMs. For OHT-ERa (RAL-ERa) complex, the most important
residues affecting the binding mechanism are: D351, E542, E353, D538,
E423, C381, T347, M388, M543, M396, M427, M357, M343, L525, L346,
I424, F404, H524, R394, R352 and K529 (D351, E542, D358, E423, E353,
F404, T347, M343, L346, L525, H524, I424, R394, R335, M543, M388,
M396, M427, M357, C381 and R352), with the main contribution to the total
SERMs-ERa binding energy obeying the decreasing sequence D351 > E542
> D538 > E353 > E423. We hope that the results pre-sented here should
stimulate experimental and bio-engineering developments in breast cancer
treatment, trough a better under-standing of the SERMs-ERa binding
mechanisms.
Acknowledgments
This work was partially financed by the Brazilian Research Agencies
CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio) Simes and Universal
454328/2014-1).
Appendix A. Supplementary material
Supplementary data associated with this article can be found, in the online
version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.comptc.2016.05. 006.
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[52]
117
ANEXO 2
_______________________________________________________________
118
Quantum chemistry computational study of a cilengitide RGD-
based compound bound to integrin†
Kyvia B. Mota,a José X. Lima Neto,a Katyanna S. Bezerra,a Dalila N. Manso,a Jonas I. N.
Oliveira,a Eudenilson L. Albuquerquea and Umberto L. Fulco∗a
In this work we employ quantum biochemistry methods based on the Density Functional Theory (DFT)
within the Molecular Fractional with Conjugate Caps (MFCC) approach to investigate the binding energy
features of cyclic RGD (R: arginine; G: glycine; D: aspartic acid)-based pentapeptide cilengitide compounds
interacting with the vitronectin receptor αV β3, whose crystallographic structure presents cations Mn2+
symbolizing the integrin in complex RGD. Our computational results give a better understanding of the
cilengitide-integrin binding mechanisms, being also an efficient alternative towards the development of
RGD-based drugs, prodrugs, nanoparticles and carriers, leading to new bio-engineering devices for cancer
therapy.
Introduction Integrins are the major family of cell surface adhesion receptors
expressed in metazoans, which regulates a diverse array of cellular
functions, such as cell-cell, cell-matrix, and cell-pathogen interactions,
crucial to the initiation, progression and metastasis of cancerous
tumor, critical for cell migration and adhesion dynamics1. They are
heterodimeric transmembrane glycoproteins assembled in a large
extracellular domain (> 700 residues), a single-pass transmembrane
(TM) domain, and a short cytosolic tail (< 70 residues), which affects
the tumor progression by inducing programmed cell death of
angiogenic blood-vessels, making them an appealing target for cancer
therapy2,3. The heterodimer arises from non-covalent interactions
between eight β subunits and eighteen α subunits, forming 24
different receptors4, each one showing specificity to the extracellular
matrix (ECM) ligands, a cell survival factor5–7. Their functions are
associated with two directions of signalling pathway, namely the
inside-out and the outside-in pathways, presenting different biological
consequences. In the former, signals received by other receptors
activate intracellular signalling that impinge on integrin cytoplasmic
domains, making the extracellular domain competent for ligand
binding8. In the latter, signalling has beginning by integrin binding to
extracellular matrix molecules, followed by the transmission of signals
to the cell interior, organization of cytoskeleton, activation of kinase
signaling cascades, and modu-
aDepartamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil. Fax: +-55-84-32153791; Tel: +-55-84-
32153793; E-mail: [email protected]
‡ This document is a collaborative effort of all authors † Electronic Supplementary Information (ESI) available: [details of any supplementary
information available should be included here]. See DOI: 10.1039/b000000x/
lation of cell cycles and gene expression9. Adhesion mediated by
integrins and signalling events are important in normal physiological
responses, embryonic implantation and development, wound healing,
hemostasis, morphogenesis, immune response, angiogenesis, cell
survival and differentiation (for a review see10), and impairments of its
normal functions have been pointed out in the pathogenesis of many
diseases, including cancer metastasis, auto-immune diseases,
thrombotic vascular diseases, infertility, endometriosis, luteal phase
defects, neoplasia, viral infections, osteoporosis and ischemia-
reperfusion injury11–13. For instance, during the tumor metastasis, a
fine tuned balance between the formation and loosening of adhesive
cell contacts has to occur, a process monitored by the integrins.
Among the 24 members of integrin family, the receptor αV β3, or
vitronectin receptor, is the most well studied, mainly for its role in
tumor growth, progression and angiogenesis, and embryo adhesion14–
16. It is a member of αA-lacking integrin class, with its genes located at
chromosomes 2 (αV ) and 17 (β3). As show by Barczyk et al.17, this
receptor recognizes many ECM molecules, such as vitronectin,
fibronectin, fibrinogen, laminin, collagen, Von Willebrand’s factor and
osteoponin, in a specific Arg-Gly-Asp (RGD) amino-acid sequence18.
Vitronectin receptor αV β3, which is mainly associated and correlates
with ovarian cancer progression, are expressed at low levels in most
normal tissues including intestinal, vascular, and smooth muscle cells,
while high levels of expression is limited to bone, the mid-menstrual
cy-
119
cle endometrium, placenta, inflammatory sites, and invasive tumors
(glioblastomas, melanomas, ovarian, breast and prostate cancers).
The cell types that express high levels of this integrin include
mature, bone resorbing osteoclasts and activated macrophages, a
small fraction of neutrophils, angiogenic endothelial cells, and
migrating smooth cells19,20. It modulates the growth, survival,
motility and differentiation of a limited group of cells. It was found
that 20% of αV integrin knockout mice have showed placental
defects (with fetal loss), abnormalities in central nervous system and
gastrointestinal blood vessels (with hemorrhages), and cleft palate,
whereas β3 integrin knockout mice are fertile and survive, yet
showing defective platelet aggregation and osteoclast resorptive
capacity (increased bone mass), and osteosclerosis17,21.
Integrins αV β3 are nowadays being considered important
molecules in biotechnological approaches within cellular, cancer
and anti-angiogenesis therapies22,23. Many efforts are applied to
understand them, as well as their molecular basis to ligand binding
mechanism. Interaction with ligands triggers tertiary and quaternary
structural rearrangements in integrins that are needed for cell
signalling. Their crystallographic structures extracellular domain
were obtained by Xiong et al. in the presence of the cations Ca2+ and
Mn2+ 11,24. On the other hand, after RGD peptides have been found
to promote cell adhesion25 numerous materials have been RGD
functionalized for medical applications. Accordingly, RGD-based
drugs and peptides containing RGD sequences are used in
association with drugs, at prodrugs, nanoparticles and carriers in
therapies of cancer and anti-angiogenesis (see Refs.26,27 for recent
reviews). Fig. 1 represents integrin in complex with RGD motif in the
presence of the cation Mn2+, from which it is shown that the α and
β subunits are assembled into an ovoid head and two nearly parallel
tails. The head consists of
a seven-bladed β-propeller (βp) from αV and a βA domain followed
by a hybrid domain (H) from β3. The αV tail consists of a tight (T) and
two calf domains (C1 and C2), while the β3 one is formed by a
plexins-semaphorins-integrins (E) domain, four epidermal growth
factor domains (E), and a β-tail domain (βT). When the integrin αV β3
is in complex with cyclic pentapeptide Arg-Gly-Asp acid-
(D)Phenylalanine-(n-methyl)Valine (RGDfV for short, also known as
cilengitide), RGD motif binds the integrin through contacts between
the Arg amino-acid and the β-propeller, allowing many interactions
between Gly amino-acid and both α and β subunits. Besides, the
aspartic acid binds βA domain at a metal ion-dependent adhesion
site (MIDAS for short) through the cation Mn2+. Unfortunately,
despite all these qualitative description, a reliable quantitative
framework of this interaction remain incompletely characterized.
To fill this gap, it is the aim of this work to present an adequate
description of the interaction of cyclic pentapeptide cilengitide with
the integrin αV β3 through quantum biochemistry techniques within
the Density Function Theory (DFT) framework. The individual
contribution of each amino-acid residue was calculated applying the
Molecular Fractional with Conjugate Caps (MFCC) scheme28,29
considering residues at the binding site, but also including other
relevant residues. The simulations were performed using the X-ray
structure of the integrin co-crystallized with cilengitide (PDB ID:
1L5G)24. Our results allow us to provide a detailed energy profile of
the interactions between the residues in the binding site and the
peptide, being essential to identify the residues that contribute
more in the interactive process between the integrin and the
complex RGD, allowing adjustments that can
Fig. 1 (color online) Structural representation of the integrin in complex
with cilengitide, showing the α and β subunits assembled into an ovoid
head and two nearly parallel tails (PDB ID:1L5G)24. The binding pocket
sphere with radius r is also shown in this picture as a black dotted-line
circle around the cilengitide ligand.
be made to improve the effectiveness of new bio-engineering
devices for cancer therapy.
Materials and Methods
Crystallographic data of the cilengitide co-crystalized with integrin
αV β3 was downloaded from the PDB database
(http://www.rcsb.org) under the code (resolution) 1L5G (3.2 Å)24.
The state of protonation of the peptide (ligand) in physiological pH
was obtained using the Marvin Sketch code version 5.3.2 (Marvin
Beans Suite - ChemAxon). Hydrogen atoms, not resolved by the X-
ray diffraction and therefore absent in the crystallographic files,
were added to the structures and submitted to a classical geometry
optimization fixing the other atoms. This optimization was
performed using the classical force field CHARMm (Chemistry at
Harvard Molecular Mechanics), which is especially parametrized for
organic molecules30.
120
The interaction energy between cilengitide molecule and the αV
β3 amino-acid residues were calculated by using the MFCC
scheme28,29 within a DFT framework (for a review see31. MFCC
method has been widely used to calculate binding energies of
protein-ligand complexes32–35, and between the three chains of
collagen36 once it turns possible the investigation of a large number
of amino-acid residues in a protein with small computational cost
and no loss in accuracy37,38. The fractionation scheme was initially
aimed to provide an efficient linear-scaling ab initio calculation of
protein-ligand interaction energies by dividing the protein molecule
into amino-acid fragments properly capped28,39. A significant
difference between the MFCC method and other fragmentation
methods that employ capping of fractionated bonds is the nature of
the caps used. Instead of simple hydrogen caps, the caps in the
MFCC approach are portions of the neighboring sections of the
molecule, providing an efficient method for representation of local
environment during individual fragment calculations40.
Here, we label the ligand pentapeptide as L, and the residue
interacting with the L as Ri (i denotes the index of the i-th aminoacid
residue). The Ci−1 (Ci+1) cap is formed from the neighbour residue
covalently bounded to the amine (carboxyl) group of the residue Ri
along the protein chain, providing a better description of its
electronic environment. For these fragmented structures, the
interaction energy between the ligand and the individual fragments,
EI(L−Ri), is calculated according to:
EI(L−Ri) = E(L+C1−iRiCi+1)−E(C1−iRiCi+1)
− E(L+C1−iCi+1)+E(C1−iCi+1), (1)
where the first term, E(L+Ci−1RiCi+1), is the total energy of the system
formed by the ligand and the capped residue; the second term,
E(Ci−1RiCi+1), is the total energy of the residue with the caps. Also the
third term E(L+Ci−1Ci+1) is the total energy of the system formed by
the caps and the ligand, while the fourth and final term, E(Ci−1Ci+1),
is the energy of the caps with dangling bonds hydrogenated.
Energetic calculations for each residue at binding site were
performed using the G09 code41, within the density functional
theory (DFT) formalism. The generalized gradient approximation
(GGA) functional B97D was chosen42. It was proposed by Grimme
and include dispersion terms in order to improve the description of
the non-covalent interactions, recently used by Antony and
Grimme43 together D3 dispersion correction under vacuum and
COSMO continuum solvation models to calculate the binding energy
of some protein ligand complexes within a MFCC scheme. To expand
the Khon-Sham orbitals for all electrons, we selected the
6−311+G(d,p) basis set for the calculations. To avoid missing
important interactions, a convergence study of the total binding
energy as a function of the ligand binding pocket radius was
performed, limiting the number of aminoacid residues to be
analyzed44. For this, we added the individual interaction energy of
those amino-acid residues within imaginary spheres with a pocket
radius r centered at the ligand, considering r = R/2 (R = 1, 2, 3, 4, ...
Nn, Nn being the next natural numbers in the sequence). Thus, we
achieved the converged binding pocket radius r when the energy
variation in subsequent radius is smaller than 10%. Here, the
manganese (Mn2+) ion of MIDAS was taken into account in the
calculation procedures attached to the nearest residue.
Results and Discussions
High levels of the integrin receptors αV β3 and αV β5 in glioblastoma
and melanoma cells reinforces tumor proliferation as well as its
spread and adhesion45–47. Targeting αV β3 by selective antagonists in
preclinical studies have inhibited angiogenesis and cell adhesion,
leading to tumor regression in experimental breast cancer cells and
melanoma48. Cilengitide, whose chemical structure is depicted in
Fig. 2, is a potent and selective antagonist of αV β3 and αV β5 integrin
receptors. It promotes the detachment of glioblastoma and
mesothelioma cells from the ECM components and, as a
consequence, the activation of apoptosis49. Besides, it shows
favorable safety and no-dose-limiting toxicities in clinical trials,
enhancing radiotherapy efficiency in endothelial cell and non-small-
cell lunger cancer models50. On the other hand, the exploration of
RGD ligands as vehicles for different compounds proved to be an
useful strategy towards the development of delivery systems for
active drugs or diagnostic tools. The conformation assumed by RGD
motif in cilengitide is similar to that found in echistatin and
fibronectin51, suggesting that this cyclic pentapeptide structure can
serve as a basis to understand integrin-ligand interactions. Hence,
development of crystallographic and computational studies have
been pivotal to yield a good insight into the molecular basis that
leads cilengitide (and other small RGDbased molecules) to be
recognized by αV β3 52–54, contributing to the rational design of new
RGD-based drugs and peptide-mimetic compounds with RGD motifs
specifically recognized.
Fig. 2 (color online) Cilengitide chemical structure subdivided into five
regions to help the analysis of its interactions with integrin αVβ3. Regions I-
V correspond to Arginine, Glycine, Aspartic acid, (D)Phenylalanine and (n-
methyl)Valine.
In order to provide an energetic basis for RGD-integrin interaction,
we use a quantum biochemistry approach, combining the MFCC
scheme with the GGA functional B97D to describe the
interaction
121
energy between the cyclic pentapeptide cilengitide and the
amino-acid residues of the αV β3 integrin. Extracellular domain
obtained by Xiong et al.24 is composed by 946 (666) amino acids of
αV (β3) subunit, with 438 (243) of them forming βpropeller (βA)
domain. Therefore, the convergence criterion to limit the number of
residues used in this work can be accounted without loosing the
important interactions in the integrin-RGD motif complex.
Convergence here means the stabilization of the total binding
energy by a variation less than 10% of the sequential pocket radius
r, where the total binding energy is determined by adding up all
residue-ligand energies within a pocket radius. Figure 3 depicts the
total binding energy, calculated by using the GGA functional B97D,
as a function of the pocket radio r varying from from 2.0 Å (-77.996
kcal/mol) to 10.0 Å (-364.533 kcal/mol) in order to determine the
best value of r (7.5 Å corresponding to an energy of -339.653
kcal/mol) from which the convergence is achieved.
Fig. 3 The total interaction energy as a function of the binding pocket radius
r calculated using the GGA functional B97D. Amino-acid residues
responsible for the regions of steepest negative and positive variation are
highlighted.
Metal-ion-dependent adhesion site (MIDAS) is very important to
integrin adhesion, being found in both integrin classes, αA and αA-
lacking. In integrin αV β3, MIDAS is composed of amino acids D119,
S121, S123, E220 and D25155, whose distances from the manganese
cation Mn2+ attached to the residue S121 are, respectively, 3.88,
2.51, 2.68, 2.65, and 3.81, all units in Å (see Fig. 4). According to Fig.
3, there is a sharp increase in the total binding energy between r=
2.5 Å (-66.244 kcal/mol) and 3.0 Å (-295.179 kcal/mol) due to
attractive binding energies of the residues D150, S121 and R214 to
cilengitide. Afterwards, a slight decrease of the total binding energy
is seen at the pocket radius r= 3.5 Å (-279.962 kcal/mol) and 4.5 Å (-
259.024 kcal/mol), due to the repulsive energies of the residues
D220 and M180, respectively. No residue was found in r= 4.0 Å,
while attractive energies of residues D219 and P219 increase the
total energy in r= 5.0 Å (294.253 kcal/mol). A small stability is found
between r= 5.0 Å to 5.5 Å (-299.165 kcal/mol) as a consequence of
a similar, but opposite, binding energies of the residues K125
(attractive) and D251 (repulsive), keeping the energy of this radius
stable. However, interactions with the residues A252, D119, and
L120 and D158 at the positions 6.0 Å (-317.507 kcal/mol), 6.5 Å (-
284.919 kcal/mol), and 7.0 Å (-340.947 kcal/mol), respectively, are
responsible for the breakdown of the convergence. After that, from
r= 7.5 Å onward, the total binding energy as a function of r tends to
present small oscillations.
The knowledge of the structure of the receptor-binding pocket is
an important step in drug design. Many works have suggested a
dynamic rearrangement and bent of integrins domains under the
presence of different ligands and ions56,57. However, it is clear that
RGD motif of these ligands binds in integrin head between the β-
propeller and βA domains with the help of MIDAS bivalent
Fig. 4 (color online) Arrangement of the metal ion-dependent adhesion site
(MIDAS) amino-acid residues found in integrin αVβ3.
cations58. Recently, Agthoven and co-workers51 depicted a
crystallographic structure of a fibronectin domain with high-affinity
(hFN10) showing that this peptide binds to αV β3 with a RGD amino-
acid sequence attached between the β-propeller and βA domains,
in a conformation similar to cilengitide.
As summarized in Table 1 of the Supplemental Material, among the
76 residues within the pocket radius r=10.0 Å only amino acids
of the β-propeller (31) and βA (45) domains were selected. Also,
it is showed that regions III (Asp), IV (D-Phe) and V ([nMet]Val)
from cilengitide interact only with the βA domain, while region
I (Arg) interacts mainly with the β-propeller one, with just one
contact with the βA domain. Region II (Gly) is seen by making
contacts with both domains of integrin in agreement with
Ref.24. After adding up the energies of each amino-acid
interacting with cilengitide, we classified the regions in terms of
the binding energies as following: Region I (E =-179.15 kcal/mol)
> Region III (E =-168.77 kcal/mol) > Region II (E =-47.16
kcal/mol) > Region V (E =6.16 kcal/mol) > Region IV (E =27.69
kcal/mol). Meanwhile, comparing the number of contacts made
with the αV β3 integrin, the rank is as following: Region III (38) >
Region I (34) > Region II (15) > Region IV (14) > Region V (1). It
is important to notice that regions IV and V are in the surface of
the integrin exposed to solvent and surrounded by the polar
residues Y122 and S123 (region IV), and Y178 (region V). Thus,
despite hydrophobic, regions IV and V
122
have larger side chains than region II, although with fewer
contacts (mainly the polar amino acids).
Up to now, we depicted the overall characteristics of the
cilengitide binding scenario. However, it is very important for
rational design of new drugs and delivery systems to be also
acquainted with the interactions between the drug and the amino
acids into the binding pocket. Thus, to evaluate each one of the
energetically most important interactions energies between
cilengitide and the αV β3 integrin we use the BIRD graphic panel
(BIRD being an acronym of the keywords binding site, interaction
energy and residues domain) showed in Fig. 5. The panel depicts: (i)
the interaction energy (in kcal/mol) of the residue with the ligands,
illustrated by the horizontal bars, from which one can assign
quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their
effectiveness as well as if they attract or repel the cilengitide; (ii) the
most important residues contributing to the bonding in the left side;
(iii) the region (boldface letters) and the atoms of the ligands closer
to each residue at the binding site. According to Fig. 5, 18 amino-
acid residues were selected as the most important for cilengitide-αV
β3 integrin complex. Among them, 11 show attractive (negative)
binding energies, according to: S121 (-121.8 kcal/mol) > D218 (-
80.44 kcal/mol) > L120 (-62.70 kcal/mol) > D150 (-42.96 kcal/mol) >
R214 (-42.37 kcal/mol) > D219 (-23.75 kcal/mol) > K125 (-14.85
kcal/mol) > D146 (-12.61 kcal/mol) > A252 (-11.89 kcal/mol) > P219
(-11.21 kcal/mol) > R216 (-9.56 kcal/mol), while 7 amino-acid
residues display repulsion (positive) interaction energies: N215
(7.08 kcal/mol) > Y122 (12.33 kcal/mol) > D158 (14.10 kcal/mol) >
M180 (17.21 kcal/mol) > D251 (19.71 kcal/mol) > E220 (20.45
kcal/mol) > D119 (23.76 kcal/mol). Among them, only four residues
(D218, D150, D219 and D146) comprise the β-propeller domain.
Fig. 5 (color online) BIRD graphic panel showing the most relevant residues
that contribute to the cilengitide-αVβ3 integrin complex. The minimal
distances between each residue and the ligand, as well as the region and
the atoms of the ligands closer to each residue at the binding site are also
shown.
Figure 6a to 6d show some of the main amino-acid residues and
their respective intermolecular interactions with cilengitide. As
observed in Fig. 6a, charged Region I is surrounded by oxygens from
carboxylate moiety of four aspartic acids, D218, D150, D219, and
D146 (β-propeller). In our calculations, D218 is the residue with the
second most attractive binding energy contribution. It attracts the
ligand through salt bridges between its negatively charged side
chain and two amine groups belonging to the side chain of Region I
(arginine), I(N11)H and I(N9)H, at 1.99 Å and 1.90 Å distances,
respectively. The fourth amino-acid with the most attractive binding
energy is D150, which is involved in a salt bridge within Region I
[(N10)H] at a distance of 2.89 Å. D219 and D146 are the sixth and
eighth most attractive residues. The side chain of the latter makes
contact with I(N10)H at a distance of 8.80 Å, while the former (D219)
contacts cilengitide in I(N11)H, I(N9)H and II(C18)H at 4.51 Å, 6.64 Å
and 5.17 Å distances, respectively. Throughout molecular docking
calculations of nine cyclic and linear compounds, it is possible to
determine a map of interactions of each compound with the αV β3
integrin52. The key role played by the residues D218 and D150 in the
binding mechanism was also observed in other RGD-based
compounds59. Synthesizing 38 small anticancer agents without RGD
motif, the interaction of the residue D150 with them is retained in
all compounds used in the docking calculations53. Besides, using
NMR and molecular docking to characterize RGD-based linear
peptides bonded to αV β3 integrin, one can show that the change of
the phenyl group to phenol makes these molecules more
hydrophilic, improving their binding affinity60. Superposition of the
crystallographic structures of αV β3 and αIIbβ3, a heterodimeric
structures with a β3 subunit61, shows that the position of the residue
D218 is now occupied by a phenylalanine, creating a hydrophobic
impairment which hinder the binding to cilengitide. Applying
molecular docking and molecular dynamic techniques in cyclic
peptides into the αV β3 and αIIbβ3 integrins, it is possible to
demonstrate that Gly (here represented as Region II) is an important
amino-acid of RGD motif since it is liable to make some weak
interactions that stabilize the peptide (CαH···O=C)62.
The main amino-acid residues and their respective intermolecular
interactions with the cilengitide-αV β3 integrin complex in
Region II are shown in Fig. 6b. Region II forms 15 contacts with
residues from integrin, most of them coming from CαH [(C18)H].
Among the 18 amino acids chosen as the most energetics, four
make contacts with this region, each one showing attractive
interactions with cilengitide (E220, S121, A252 and R216). The
residue E220, along with P219, D158 and N215, constitutes a
ligand-associated metal binding site (LIMBS) or, as recently
named, synergistic metal ion binding site (SyMBS)63. It is a
positive regulatory site that is expected to coordinate its
orientation toward MIDAS, stabilizing the ligand-binding
surface through synergistic effects of low cation
concentrations5. To
123
understand the effect of LIMBS under integrins adhesiveness,
experimental mutations in N215A, D217A and E220A were made in
α4β7 integrin64. The results showed that these mutations lead to loss
of adhesion function of this integrin, with 52% of the aminoacid
sequence identity being conserved between the β7 and β3 subunits.
S121, A252 and R216 are the first, ninth and eleventh most
energetically attractive residues, respectively, while E220 shows the
second most repulsive binding energy. The residue R216 makes one
weak hydrogen bonds with regions II(C18)H and a hydrogen bond
with III(N8)H at a distance of 2.70 Å. Although the residues S121 and
E220 interact with Region III, they show
Fig. 6 (color online) The main amino-acid residues and their respective
intermolecular interactions with the cilengitide-αVβ3 integrin complex. (a)
region I; (b) region II; (c) regions II and III; (d) region III. Regions IV and V are
not shown here because they present few amino-acid residues contacts
(mainly the polar amino acids). Potential hydrogen bonds are indicated by
dashed lines.
opposite binding energies. Furthermore, one way to become a
ligand selective to αV β1 integrin is the insertion of properly oriented
bulky moieties in the ligand since the superposition of the αV β3 and
α5β1 integrins shows that the replacement of (β3)-Arg214 by (β1)-
Gly217 and (β3)-Arg216 by (β1)-Leu219 opened up a new space
adjacent to the RGD binding site, which is absent in the αV β3
receptor but present in the α5β1 one65. The former residue (S121)
forms two contacts with carboxylate from cilengitide, one weak
hydrogen bond with III(C22)O4 (2.8 Å) and a cation-mediated with
III(C22)O5 (5.1 Å). The latter one (E220) presents an electrostatic
repulsion due to the negatively charged carboxylate group
[III(C22)O4]. The residue A252 forms some contacts with regions
II(C20)O2 and III(C17)H of cilengitide at 5.56 Å and 5.66 Å distances,
respectively.
Figure 6c depicts an overview of the interactions between
cilengitide and the residues R214, L125 and D119. R214 and L125
show the fifth and seventh most intense attraction energies,
respectively, while D119 is the most repulsive one. The residue R214
makes two contacts with the ligand, one weak hydrogen bond with
III(C22)O5 (2.5 Å) and an interaction between its NH from guanidine
group and the oxygen carbonyl from the main chain of III(C21)O3 at
the distance 3.8 Å. Negatively charged carboxylate moiety of D119
and cilengitide are face-toface [III(C22)O5] at a distance of 6.14 Å,
creating an electrostatic repulsion that represents its high repulsion
energy found by our calculations.
The interacting groups of the residues P219, N215 and D158 with
cilengitide are shown in Fig. 6d. Although the residue P219 is
attractive (the sixth most attractive energy), the other two show
repulsive energies (the less and the fifth most repulsive,
respectively). As one can see, N215 forms a hydrogen bond (1.85 Å)
between its amino group of the main chain and the oxygen from
carboxylate group of cilengitide [III(C22)O5]. Besides, two oxygens
from its carbonyl group of the main chain (3.09 Å) and side chain
(3.23 Å) are also in closer contact with the same atom of ligand.
Thus, even making a hydrogen bond, a repulsive binding energy
prevails. D158 interacts with III(C22)O4 at a distance of 6.90 Å, while
the residue P219 makes two main contacts with glicine from
cilengitide [II(C18)H and II(C20)O2] at 4.79 Å and 5.82 Å distances,
respectively.
Lastly, subunits αV and β3 are seen in a different number of integrin
members, whose binding energetic scenario may distinguish
each one of them66. Despite the relevance of the β3 subunit to
ligand binding mechanism (it has 14 more residues than the αV
one), evidenced by the presence of MIDAS and LIMBS sites, its
energetic relevance is approximately 25.00 kcal/mol smaller
than the αV one. Summing the binding energies of each
aminoacid by subunit, the subunit αV (β3) shows -194.79
kcal/mol (169.74 kcal/mol). Looking to the most
124
energetic residues, we can see that the majors repulsions are
coming from the β3 subunit, mainly by interactions between
negatively charged carboxylate groups of Region III and aspartic
acid/glutamic acid residues. Out of the 76 amino-acid residues
analyzed in this work (see Table 1 of the Supplemental Material),
S121 and D218 are the residues with the larger contribution to the
binding of cilengitide interacting with the atom groups III(C22)O4;
III(C22)O5 and I(N11)H; I(N9)H of the ligand, respectively. The
residues L120, D150, R214 and D219, among others, contribute to
attractive interactions, while N215, Y122, D158, M180, D251, E220
and D119 repel cilengitide, suggesting that the distribution of
negatively charged residues in β3 surrounding the aspartic acid from
RGD may decrease the affinity between the cilengitide and αV β3
integrin.
Conclusions
The roles of integrins in controlling cellular behavior have made
these molecules highly attractive drug targets, despite the wide gaps
in the knowledge of their biochemical properties. Although
therapeutic strategies for targeting these molecules abound, only a
few are used in clinical treatment nowadays, with many of them not
going through the early stages of clinical trials. The good news is the
appearance of the integrin antagonist cilengitide, a cyclic RGD
pentapeptide and the first integrin inhibitor in clinical phase III
development for oncology, and in phase II for several other tumors.
This drug is the first anti-angiogenic small molecule targeting the
integrins αV β5, αV β3 and αV β1. Its design and production require a
precise knowledge not only of its biochemical structure, but also its
binding mechanism with the integrin, leading to a better
understanding of how this complex influences the cancer tumor and
its anti-angiogenesis therapies as well as its microenvironment.
Computational tools based on quantum chemistry may be a
promising step in this route, further increased by combination with
other anti-cancer therapies.
In this context, we have investigated the interactions between
the RGD-based compound cilengitide to the integrin αV β3 using
quantum chemistry calculations. We also demonstrated the
necessity of taking into account a larger binding scenario, including
more distant amino-acid residues in order to obtain a good
correlation between the experimental and the simulation data.
After a convergence study on the size of the binding pocket sphere,
we have considered all ligand-residue interactions within a pocket
radius of 10 Å from the ligand.
In addition, we have established the order of binding affinity
regions of the ligands (regions I > III > II > V > IV) and the residues
that play important role on the binding affinity. It is worth highlight
that strong intermolecular contacts are formed between the
cilengitide and the S121, D218, L120, D150, R214, D219, K125, D146,
A252, P219, R216, N215, Y122, D158, M180, D251, E220 and D119
residues.
The quantum chemistry computational methods used in this work
emerged as a simple and efficient alternative for the development
of RGD-based drugs, prodrugs, nanoparticles and carriers. We hope
that the results presented here should stimulate experimental and
bio-engineering developments through a better understanding of
the cilengitide-αV β3 binding mechanisms, of fundamental
importance for the cancer treat0.8ment.
Acknowledgements
This work was partially financed by the Brazilian Research Agencies
CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio)Simes and Universal
454328/2014-1).
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