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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Estudo da Pimenta Malagueta (Capsicum frutescens) e seus Componentes usando a técnica de Ressonância
Magnética Nuclear
Study of chili pepper (Capsicum frutescens) and its components by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
Thays Cardoso Valim
Dissertação de Mestrado em Química
Vitória 2019
2
Thays Cardoso Valim
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química do Centro de
Ciências Exatas da Universidade Federal
do Espírito Santo como requisito parcial
para obtenção do Título de Mestre em
Química.
Área de Concentração: Química
Linha de Pesquisa: Química de Produtos
Naturais.
Orientador: Prof. Dr. Álvaro Cunha Neto
VITÓRIA 2019
3
Ficha catalográfica disponibilizada pelo Sistema Integrado deBibliotecas - SIBI/UFES e elaborada pelo autor
V172eValim, Thays Cardoso, 1992-ValEstudo da Pimenta Malagueta (capsicum frutescens) e seuscomponentes usando a técnica de ressonância magnética nuclear/ Thays Cardoso Valim. - 2019.Val92 f. : il.
ValOrientador: Álvaro Cunha Neto.ValDissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal doEspírito Santo, Centro de Ciências Exatas.
Val1. Resonância Magnética Nuclear de Próton. 2. Pimentamalagueta. 3. Capsaicinóides. 4. Solvente não deuterado. I. CunhaNeto, Álvaro. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centrode Ciências Exatas. III. Título.
CDU: 54
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Estudo da Pimenta Malagueta (Capsicum frutescens) e seus Componentes Usando a Técnica de Ressonância Magnética
Nuclear
Thays Cardoso Valim
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química.
Aprovado(a) em 25/03/2019 por:
__________________________________________ Prof. Dr. Álvaro Cunha Neto
Universidade Federal do Espírito Santo Orientador
__________________________________________ Prof. Dr. Valdemar Lacerda Junior
Universidade Federal do Espírito Santo
__________________________________________ Dra. Carla Santana Francisco
Universidade Federal do Espírito Santo
5
À minha família e amigos.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que em sua infinita graça e misericórdia me permitiu
chegar até aqui.
Aos meus pais (Neri e Marta) e minhas irmãs (Ingrid e Jheniffer) por todo apoio, amor,
paciência, carinho e incentivo em todos os momentos.
À toda minha família, por serem a minha base e a minha melhor referência do que é
ser família, se importando, amando e cuidando uns dos outros.
A todos os meus amigos mais chegados do que irmãos, os de longe e os de perto. A
caminhada com vocês fica muito mais divertida e tranquila. Em especial, deixo minha
gratidão à Thayanny Souza por sempre me ajudar em tudo e se fazer presente
sempre, ainda que distante.
Aos meus irmãos em Cristo, minha família na fé, obrigada por todas orações e
carinho.
Aos meus amigos do Laboratório de Orgânica: Carla, Danyelle, Lucas, Geraldo,
Diana, Natã, Juliana, Gabriel, Clara, Clebson e Raphael. Vocês foram fundamentais
no desenvolvimento desse trabalho! Com vocês eu aprendi, cresci e evolui. Muito
obrigada por tudo!
Ao Prof. Dr. Álvaro Cunha Neto, pela orientação e, por acreditar e confiar em mim.
Ao Prof. Dr. Valdemar Lacerda Júnior e à Dra. Carla Santana Francisco, por aceitarem
o convite de participar dessa banca examinadora, bem como por toda contribuição
prestada.
Aos Laboratórios de Ressonância Magnética Nuclear, ao Laboratório de Produtos
Naturais e ao Laboratório de Cromatografia, pela utilização dos equipamentos e
realização dos testes.
Ao Programa de Pós-Graduação em Química da UFES (PPGQUI) e ao Núcleo de
Competências Químicas do Petróleo (NCQP), pelo apoio institucional e pelo espaço
físico cedido para realização dos experimentos.
À CAPES, CNPQ e FAPES, pelo suporte financeiro disponibilizado.
Por fim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram direta e indiretamente para a
realização desse trabalho. Muito obrigada!
7
“Tudo o que fizerem, façam de todo o coração, como para o Senhor, e não para os
homens, sabendo que receberão do Senhor a recompensa da herança. É a Cristo, o
Senhor que vocês estão servindo.” Colossenses 3:23,24
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Anatomia do fruto Capsicum frutescens (pimenta malagueta). ................. 21
Figura 2. Estrutura química dos principais capsaicinóides. ...................................... 21
Figura 3. Esquema básico de um Cromatógrafo Gasoso. ........................................ 26
Figura 4. Esquema básico de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência. ............ 28
Figura 5. Comportamento dos spins nucleares na ausência do campo magnético
externo (a) e na presença do campo magnético externo (b). .................................... 33
Figura 6. Diferença de energia para I = 1/2, na presença de um campo magnético
externo B0. ................................................................................................................. 34
Figura 7. Movimento de precessão do núcleo. ......................................................... 35
Figura 8. Conjunto de spins no estado a, no equilíbrio, gerando a magnetização
resultante na direção de B0. ....................................................................................... 36
Figura 9. Fenômeno de ressonância – adaptado.65 .................................................. 36
Figura 10. Decaimento de indução livre (DIL) de 1H de uma amostra, obtido no
domínio do tempo, e logo após aplicação da FT para obtenção do espectro. .......... 37
Figura 11. Relaxação longitudinal T1. Retorno dos spins ao equilíbrio térmico inicial.
................................................................................................................................... 38
Figura 12. Processo de Inversão-Recuperação. ....................................................... 38
Figura 13. Processo de relaxação transversal, T2. ................................................... 39
Figura 14. Efeito de blindagem dos elétrons. ............................................................ 40
Figura 15. Quadro de correlação simplificada entre valores de deslocamento químico
de prótons. ................................................................................................................. 40
Figura 16. Número de publicações relacionando as palavras chaves: “capsaicinoids”
e “NMR” - adaptado. (Fonte: Web of Science. Acessado em 26 de fevereiro de 2019)
................................................................................................................................... 41
Figura 17. Curva de calibração demonstrativa sobre o procedimento de cálculo do LD
(a) e LQ (b). – adaptado.92 ......................................................................................... 50
Figura 18. Fluxograma da obtenção do extrato metanólico da pimenta malagueta. 54
Figura 19. Ensaio de linearidade para validação do método de RMNq de 1H para
análise de capsaicinóides em pimentas comerciais. ................................................. 58
Figura 20. Cromatograma do extrato metanólico obtido da pimenta malagueta, na
concentração de 4000 ppm. ...................................................................................... 61
9
Figura 21. Aproximação do cromatograma do extrato metanólico, no intervalo de 23,4
min a 28,4 min. .......................................................................................................... 62
Figura 22. Resultado do espectro de massas obtido das análises de CG-EM para o
extrato metanólico. ..................................................................................................... 62
Figura 23. Cromatograma de CG-EM da fração contendo os capsaicinóides. ......... 63
Figura 24. Cromatograma obtido do CLAE da fração contendo os capsaicinóides e
utilizado para a etapa de purificação dos mesmos. ................................................... 64
Figura 25. RMN de 1H da (a) dihidrocapsaicina e (b) capsaicina, sem uso de solvente
deuterado. .................................................................................................................. 65
Figura 26. RMN de 1H da capsaicina contendo os valores das integrais, deslocamento
químico e expansão das regiões de interesse. .......................................................... 66
Figura 27. RMN de 1H da dihidrocapsaicina contendo os valores das integrais,
deslocamento químico e expansão das regiões de interesse. .................................. 67
Figura 28. RMN de 1H do outro capsaicinóide encontrado, sem uso de solvente
deuterado. .................................................................................................................. 69
Figura 29. RMN de 13C da capsaicina. ...................................................................... 70
Figura 30. RMN de 13C da dihidrocapsaicina. ........................................................... 71
Figura 31. RMN de 13C do capsaicinóide não identificado. ....................................... 71
Figura 32. Sobreposição dos espectros de RMN de 1H da capsaicina,
dihidrocapsaicina e do ácido maleico, mostrando a seletividade do método. ........... 72
Figura 33. Espectro de RMN de 1H da pimenta malagueta para comparação e
confirmação da seletividade. ..................................................................................... 73
Figura 34. Curva de calibração da capsaicina obtida da análise do sinal com
deslocamento químico igual a 5,4 ppm (a) e 6,7 ppm (b), e da dihidrocapsaicina em
6,7 ppm (c). ................................................................................................................ 75
Figura 35. Gráfico de dispersão dos resíduos para a capsaicina em 5,4 ppm (a) e 6,7
ppm (b), e para a dihidrocapsaicina em 6,7 ppm (c). ................................................ 75
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação de pungência baseado em SHU. ......................................... 24
Tabela 2. Valores aproximados de SHU para alguns produtos comerciais à base de
pimenta. ..................................................................................................................... 24
Tabela 3. Atribuição dos sinais obtidos da análise de RMN de 1H para a capsaicina.
................................................................................................................................... 66
Tabela 4. Atribuição dos sinais obtidos da análise de RMN de 1H para a
dihidrocapsaicina. ...................................................................................................... 67
Tabela 5. Análise das Variâncias (ANOVA) da regressão. ........................................ 75
Tabela 6. Valores de Limites de Detecção e Quantificação para a capsaicina e a
dihidrocapsaicina obtida da análise de RMN de 1H, utilizando solvente não deuterado.
................................................................................................................................... 76
Tabela 7. Valores de exatidão (em %) para os analitos em baixa, média e alta
concentração. ............................................................................................................ 77
Tabela 8. Valores de DPR (em %) para os analitos em baixa, média e alta
concentração utilizados nos ensaios de precisão. ..................................................... 77
Tabela 9. Valores das integrais dos sinais das soluções de capsaicina e
dihidrocapsaicina, para avaliação da robustez. ......................................................... 78
Tabela 10. Valores de SHU calculados para 5 tipos de pimentas comerciais. .......... 79
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA – Análise das Variâncias
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC – Associação de Químicos Analíticos Oficiais (Association of Official Analytical
Chemists).
CC – Cromatografia em Coluna
CCD – Cromatografia em Camada Delgada (Thin Layer Chromatography)
CG – Cromatografia Gasosa
CG-EM – Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massas
CL – Cromatografia Líquida
CL-EM – Cromatografia Líquida acoplada ao Espectrômetro de Massas
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High-performance Liquid
Chromatography)
CLC – Cromatografia Líquida Clássica
DIL – Decaimento da Indução Livre (Free Induction Decay)
DPR – Desvio Padrão Relativo
EFS-RMN – Extração de Fase Sólida acoplado à uma sonda de Ressonância
Magnética Nuclear
FM – Fórmula Molecular
FT – Transformada de Fourier
EM – Espectrometria de Massas
IV – Espectroscopia no Infravermelho
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
NIST – Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (National Institute of Standards and
Technology)
PI – Padrão Interno
RD – Tempo de relaxação (Rlaxation delay)
r.f. – Radiofrequência
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de próton
RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de carbono 13
12
RMNq – Ressonância Magnética Nuclear quantitativa
SHU – Escala de Calor de Scoville (Scoville Heat Units)
Ta – Tempo de aquisição
tr – Tempo de retenção
UV – Espectroscopia no Ultravioleta
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LISTA DE SÍMBOLOS
°C – graus Celsius
δ – deslocamento químico
ΔE – diferença de energia
h – constante de Planck
I – spin nuclear
µ - momento magnético
µm – micrometros
µL – microlitros
u - frequência
g - razão giromagnética
A – massa atômica
Ax – área do sinal de 1H de um espectro
B0 – campo magnético
g – grama
H – hidrogênio
Hz – Hertz
J – Joules
K – Kelvin
Kesp – constante do espectrômetro
Kb – constante de Boltzmann
M0 – magnetização resultante
m – massa
M – massa molar
min – minutos
mm – milímetros
mL – mililitros
nm – nanômetros
N – nêutrons
P – pureza
ppm- partes por milhão
R – coeficiente de correlação
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R2 – coeficiente de determinação
s – desvio padrão
T – temperatura
T1 – relaxação longitudinal
T2 – relaxação transversal
Z – prótons
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RESUMO Os capsaicinóides são bem conhecidos por suas propriedades farmacológicas e são responsáveis por darem sabor às pimentas através de seu caráter pungente. Essa pungência, por sua vez, pode ser determinada através da quantificação dos capsaicinóides presentes na pimenta, por meio de técnicas cromatográficas, espectroscópicas, ou análises sensoriais como o Método de Scoville. Sendo assim, este trabalho apresenta um método rápido e simples para quantificação de capsaicinóides em pimentas comerciais, por meio da relação entre a área do analito e a área de um padrão interno obtida da análise de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN de 1H) sem o uso de uma solução com solvente deuterado. Primeiramente foi feita a extração dos capsaicinóides a partir da pimenta malagueta obtida comercialmente. A extração foi feita com metanol e com o auxílio de uma cuba ultrassônica. A partir dos extratos metanólicos, procedeu-se para a purificação e isolamento dos capsaicinóides, o qual foi feito por técnicas cromatográficas. A primeira etapa da purificação foi feita por cromatografia em coluna e a segunda etapa foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Em ambos os processos, o acompanhamento das análises e identificação das frações foi feito por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectômetro de Massas (CG-EM). Após isolados os capsaicinóides, eles foram caracterizados por RMN de 1H. As análises qualitativas e quantitativas de RMN foram feitas com as amostras diluídas em uma mistura de água e metanol não deuterados e comparadas com uma solução de ácido maleico em água deuterada. Para validação do método foram obtidas as figuras de mérito tais como seletividade, linearidade, limites de detecção e quantificação, exatidão, precisão e robustez, para os capsaicinóides: capsaicina e dihidrocapsaicina. O método desenvolvido apresentou excelente linearidade tendo um coeficiente de correlação (R) em torno de 0,9967, boa exatidão para amostras com concentração maiores do que 3 mg.mL-1, com uma faixa de erro em torno de 3%, boa robustez com variação mínima mesmo em análises feitas com amostras estocadas na geladeira durante 1 mês, boa precisão (<1,1%), e, limites detecção e quantificação variando entre 0,639 mg.mL-1 e 2,633 mg.mL-1, respectivamente. Com o intuito de avaliar o método proposto e aplicá-lo à determinação de pungência, foram analisadas amostras das pimentas Malagueta, Habanero, Bhut Jolokia, Trinidad Scorpion e Carolina Reaper, obtidas comercialmente, atribuindo seus respectivos valores de SHU (Escala de Calor de Scoville). Palavras-chave: RMN de 1H, análise quantitativa, solvente não deuterado, capsaicinóides, pimenta malagueta.
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ABSTRACT Capsaicinoids are widely known for their pharmacological properties and are responsible for flavoring peppers through their pungent aroma. In turn, this pungency can be determined by quantifying the capsaicinoids present in peppers by means of chromatographic and spectroscopic techniques, or sensory analysis such as the Scoville Scale. The present research presents a rapid and simple method for capsaicinoids quantification in commercial peppers by way of the relationship between analytes and an internal standard area resulting from 1H Nuclear Magnetic Resonance analysis (1H NMR) without using a deuterated solvent solution. Firstly, it was made the capsaicinoids extraction from the commercial chili pepper. The extraction process was made using methanol as a solvent and with the aid of an ultrasonic cleaner. From the methanolic extracts, it was proceeded to a capsaicinoids purification and isolation using chromatographic techniques. The first purification step was done by column chromatography, and the second one was done by High-performance Liquid Chromatography analysis (HPLC). In both of process, the analyses follow-up and fraction identification were done by Thin Layer Chromatography (TLC) and Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS). After of capsaicinoids isolation, they were characterized by 1H NMR analyses. Qualitative and quantitative 1H NMR analyses were done with samples diluted in a mixture of water and methanol non-deuterated, and then compared to a solution of maleic acid in deuterated water. For validation of the method, figures of merit such as selectivity, linearity, detection, and quantification limits, accuracy, precision, and robustness were obtained for capsaicin and dihydrocapsaicin. The presented method exhibits great linearity, with a correlation coefficient (R) of 0.9967, good accuracy for samples with concentration greater than 3 mg.mL-1, with an error rate close to 3%, good robustness with minimal variation observed even one month after sample stored, good precision (<1%), and detection and quantification limits from 0.639 mg.mL-1 to 2.633 mg.mL-1, respectively. In order to evaluate the proposed method and apply it for pungency determination, analyses were performed in commercially acquired samples of Malagueta, Habanero, Bhut Jolokia, Trinidad Scorpion, and Carolina Reaper peppers to assign respective SHU (Scoville Heat Units) values. Keywords: 1H NMR, quantitative analysis, non-deuterated solvent, capsaicinoids, chili pepper.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 19
1.1 Pimentas (Capsicum spp.) ........................................................................ 20
1.2 Unidade de calor de Scoville (SHU) ......................................................... 23
1.3 Técnicas analíticas aplicadas ao estudo dos alimentos ....................... 25
1.3.1 Cromatografia Gasosa (CG) .................................................................... 25
1.3.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .................................... 27
1.3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .................................................. 30
1.3.3.1 Histórico ………………………………….………………………….. 30
1.3.3.2 Fundamentação teórica da RMN ..……….……………………… 32
1.3.3.3 Aplicações da RMN ……………………………………………….. 41
1.3.3.4 RMN quantitativo (RMNq) ………………………………………… 43
1.3.3.5 Validação de método ……………………………………………… 46
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 52
2.1 Objetivo geral ............................................................................................. 52
2.2 Objetivos específicos ................................................................................ 52
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL .................................................................. 53
3.1 Amostras .................................................................................................... 53
3.2 Reagentes Químicos ................................................................................. 53
3.3 Extração dos capsaicinóides ................................................................... 53
3.4 Purificação dos capsaicinóides ............................................................... 54
3.5 Análises de CG-EM .................................................................................... 55
3.6 Separação dos capsaicinóides ................................................................ 55
3.7 Análises de RMN ....................................................................................... 56
3.7.1 Instrumentação ........................................................................................ 56
3.7.2 RMN quantitativo (RMNq) ........................................................................ 57
3.7.2.1 Seletividade ……………………………………..….………………… 57
3.7.2.2 Linearidade …………………………………………………………… 58
3.7.2.3 Limites de Detecção e Quantificação ……………………………… 58
3.7.2.4 Exatidão ………….……………………………………………………. 59
3.7.2.5 Precisão …………….…………………………………………………. 59
3.7.2.6 Robustez …..……………………………………………………..…… 59
18
3.7.3 Análises de pimentas comerciais ............................................................. 59
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 61
4.1 Extração dos Capsaicinóides ................................................................... 61
4.2 Purificação dos Capsaicinóides .............................................................. 63
4.3 Separação dos capsaicinóides ................................................................ 64
4.4 Análises de RMN ....................................................................................... 65
4.4.1 RMN quantitativo ..................................................................................... 72
4.4.1.1 Seletividade …………………………………………………….…… 72
4.4.1.2 Linearidade …………………………………………………….…… 74
4.4.1.3 Limites de Detecção e Quantificação …………………………… 76
4.4.1.4 Exatidão ……………………………………………………………. 76
4.4.1.5 Precisão …………………………………………………….……… 77
4.4.1.6 Robustez …………………………………………………………… 78
4.4.2 Quantificação dos capsaicinóides em pimentas comerciais e avaliação de
pungência ........................................................................................................... 79
5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 81
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 83
19
1 INTRODUÇÃO
A Ciência dos Alimentos é o ramo da ciência que estuda a composição,
processamento e qualidade dos alimentos desde sua produção até a sua
comercialização.1-2 Uma de suas áreas é a Química dos Alimentos, e o número de
pesquisas voltadas para esse ramo têm crescido consideravelmente, haja visto que
alimentação é uma questão primordial para todo o ser humano. Por esse motivo,
diversos países possuem grande preocupação com políticas e pesquisas voltadas
para este assunto. Questões como segurança alimentar, saúde do consumidor,
agricultura e desenvolvimento, preocupações com o meio ambiente, consumo
sustentável, redução de perdas e desperdício e, redução da demanda de
biocombustível para produção e transporte, são assuntos que estão relacionados à
importância de estudarmos os alimentos consumidos, e fornecer soluções para as
problemáticas existentes.3
Outro assunto que têm despertado o interesse de diversos grupos de pesquisa
é o chamado “alimento funcional”. Este, corresponde ao alimento comum consumido
no cotidiano, e que possui propriedades benéficas além das nutricionais. Podemos
definir também como sendo todos os alimentos e bebidas que possuem ingredientes
específicos, fisiologicamente bons para a nossa saúde.4 As especiarias são um
exemplo comum de alimentos funcionais. Por vários anos, elas foram utilizadas
apenas como moedas de troca, ou como ingredientes que dão aroma, sabor,
pungência e cor aos alimentos. Contudo, diversas pesquisas têm sido desenvolvidas
de modo a reconhecer as propriedades medicinais que elas possuem. Srinivasan
(2005)5 descreve algumas propriedades medicinais de determinados tipos de
especiarias, dentre elas, estão as pimentas, as quais possuem atividade anti-
inflamatória e ajudam no alívio da dor causada por reumatismo, por exemplo. Tais
propriedades vêm dos componentes presentes nesses alimentos, uma vez que os
alimentos são formados por matrizes complexas de diversos componentes
bioquímicos.5
Sendo assim, para um estudo químico eficaz sobre esse assunto, é preciso
conhecer a composição dos alimentos, desenvolver métodos de análise para tal, bem
como métodos de preparação de amostras e selecionar a técnica adequada para esse
fim.6,7 Com intuito de regularizar esses métodos, existem alguns órgãos internacionais
20
(como é o caso da AOAC – Association of Official Analytical Chemists) e nacionais
(ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária), que legislam sobre os
procedimentos de análise referentes ao tipo de produto a ser estudado, tais como:
insumos farmacêuticos, medicamentos, produtos biológicos, alimentos, e outros.6,8,9
Os parâmetros analíticos que esses órgãos mais exigem são robustez, sensibilidade,
eficiência e economia, a fim de garantir qualidade e segurança para os consumidores.
Todos estes parâmetros são avaliados para que um método seja validado.10,11
1.1 Pimentas (Capsicum spp.)
A pimenta é um produto amplamente consumido no mundo todo. Pertence à
família Solanaceae e ao gênero Capsicum, as espécies mais conhecidas são
Capsicum annuum (pimentão), Capsicum frutescens (pimenta malagueta), Capsicum
chinense (habanero) e Capsicum pendulum (pimenta dedo-de-moça).12 Elas variam
em tamanho, forma, cor, sabor e pungência. Dados da Embrapa (2006) relatam que
um quarto da população mundial consome pimenta e seu principal uso é como
condimento, devido a ardência característica do gênero Capsicum.12,13 Essa ardência,
por sua vez, é atribuída a dois dos principais capsaicinóides presentes no fruto, a
capsaicina e a dihidrocapsaicina. A ardência provocada pelas pimentas também pode
ser chamada de pungência ou picância, e é alvo de várias pesquisas desenvolvidas,
principalmente, na década de 20. Um artigo escrito por Maga e Todd, em 1975,12 fala
sobre as propriedades do gênero Capsicum, e relaciona alguns autores que
discutiram, em seus trabalhos, à cerca dessa propriedade sensorial das pimentas.
Maga e Todd12 relatam que autores como Jones e Pyman, em 1925, e Lapworth e
Royle, em 1919, definiram a capsaicina como sendo a substância mais pungente, e
autores como Ott e Zimmermann, em 1921, associaram a pungência à presença da
insaturação existente na estrutura química dos compostos, o que dois anos depois foi
confrontado por Nelson e Dawson, que disseram que a capsaicina e a
dihidrocapsaicina têm o mesmo grau de pungência.12,14
A Figura 1 mostra como exemplo de um fruto do gênero Capsicum, a morfologia
da pimenta malagueta, da espécie Capsicum frutescens. Segundo a Embrapa (2006),
a pimenta malagueta foi considerada uma das pimentas mais fortes conhecidas no
Brasil, ou seja, uma das pimentas com maior quantidade de capsaicinóides.13
Morfologicamente, a pimenta malagueta é composta por cálice, pedúnculo e placenta,
21
sendo esta última, a região que contém a maior quantidade de capsaicinóides.
Kozukue et al. (2005)15 concluíram que 85% dos capsaicinóides estão presentes na
placenta. Pode-se dizer também que a quantidade de capsaicinóides pode variar
conforme o grau de maturidade do fruto e o modo como ele foi cultivado.15-17
Figura 1. Anatomia do fruto Capsicum frutescens (pimenta malagueta).
Em 1979, Iwai et al.18 relataram que apenas cinco capsaicinóides haviam sido
identificados até então, e que esses compostos eram de grande interesse para os
pesquisadores. Sendo assim, com o passar do tempo e o surgimento de novas
pesquisas, essa quantidade aumentou e hoje já se conhecem cerca de 25
capsaicinóides diferentes obtidos de forma natural. Dentre eles, os principais são
capsaicina, dihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina, homodihidrocapsaicina e
nonivamida, sendo a capsaicina a substância mais estudada dentre essas. Suas
respectivas estruturas químicas estão relacionadas na Figura 2. Kenneth T.
Hartman19 relata que a primeira pessoa a cristalizar a capsaicina foi J. C. Thresh, em
1876.18-20
Figura 2. Estrutura química dos principais capsaicinóides.
Placenta Cálice
Pedúnculo
22
Uma busca na literatura revela inúmeros estudos sobre a capsaicina, os quais
dissertam acerca das propriedades físico-químicas dessa substância tais como
solubilidade, massa molar, ponto de fusão e ebulição, entre outras.21-23 Encontram-se
também, informações sobre seu potencial farmacológico21,24-26 e sobre os seus
métodos de análise, a saber: extração, purificação e quantificação.16,27-31
Wilbur Johnson, em 2007,32 publicou um relatório sobre a avaliação de
segurança de diversos produtos provenientes dos frutos do gênero Capsicum e sobre
a capsaicina. Nessa publicação ele descreve as propriedades físicas e químicas, a
composição, os métodos de análise, o uso e propriedades biológicas dos produtos de
Capsicum spp. No que diz respeito à capsaicina, o autor descreve os diferentes nomes
encontrados para esse composto, descreve também a capsaicina como sendo um
alcalóide cristalino de massa molar igual a 305,42 g.mol-1, sendo insolúvel em água,
porém, solúvel em álcoois e acetona, tendo ponto de ebulição entre 210-220°C e
ponto de fusão igual a 65°C.32
O potencial da capsaicina para atividades farmacológicas é constantemente
abordado, e autores relatam que a capsaicina possui uma potente atividade
antineoplásica em uma vasta gama de células cancerígenas humanas.33,34 Lau et al.
(2014)26 e Brown et al. (2010)34 revelam que a capsaicina anula a etapa de
carcinogênese na pele, no pulmão, no cólon, na próstata e na língua. Estes estudos
também revelam que, em altas concentrações, a capsaicina provoca o processo de
apoptose em vários tipos de células cancerígenas humanas, como por exemplo, o
câncer de mama e câncer gástrico. Estudos também destacam que exposições
prolongadas à capsaicina induz o processo de apoptose em câncer de pulmão, células
de leucemia, carcinoma de esôfago, próstata e células de câncer de cólon. Ressalta-
se também que a atividade antineoplásica da capsaicina é específica para células
cancerígenas, fazendo com que células normais permaneçam inalteradas.26,34 O
estudo realizado por Lau et al.26, em 2014, teve como foco principal a ação da
capsaicina em pequenas células do câncer de pulmão. Em 2015, Chen et al.35 também
relataram a atividade anticancerígena da capsaicina, além de avaliar e confirmar o
potencial antioxidante e anti-inflamatório da mesma.35
Quanto aos métodos analíticos empregados no estudo da capsaicina,
encontram-se relatos sobre o uso da cromatografia em camada delgada (CCD),27
cromatografia gasosa (CG),36 cromatografia líquida (CL),15 cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE),31 espectrometria de massas (EM), microextração em fase
23
sólida37 e ressonância magnética nuclear (RMN).38 A partir desses estudos,
encontramos informações qualitativas e quantitativas sobre a substância em questão.
À respeito de suas informações quantitativas, o método mais antigo utilizado foi
desenvolvido por Wilbur L. Scoville, em 1912.39 Apesar desse método estar sendo
substituído por técnicas instrumentais modernas, ele continua sendo empregado e
servindo como base para o aprimoramento de outras técnicas. Esse método relaciona
o grau de pungência com a Unidade de Calor de Scoville (em inglês, Scoville Heat
Units – SHU).39
1.2 Unidade de calor de Scoville (SHU)
A pungência da pimenta é um dos fatores que determinam sua qualidade.40 Ela
pode variar conforme o tipo de pimenta, a forma de cultivo, as condições de
crescimento ou a adulteração.39,41 A determinação da pungência, e
consequentemente, da concentração dos capsaicinóides presentes também é algo
importante para o estudo biológico desses compostos que possuem diversas
atividades farmacológicas, como já mencionado no item anterior.
O primeiro método desenvolvido para avaliar a pungência das pimentas foi
criado em 1912, por Wilbur L. Scoville, e era baseado em um método
organoléptico.39,42,43
Esse método consiste na determinação sensorial da quantidade de açúcar
utilizada para neutralizar o calor da pimenta. A análise é feita com um grupo de
“provadores”, onde uma solução de extrato de pimenta é diluída com soluções de
açúcar e água, em porções definidas. Esse extrato de pimenta é preparado a partir da
maceração de um grão de Capsicum (in natura) em 100 mL de álcool, o qual é
submetido à agitação, e em seguida é filtrado. O provador é responsável por
experimentar a solução de extrato diluída com água adocicada até não sentir mais o
ardor da pimenta. Em seguida, é registrada a quantidade de diluições que foram feitas.
A medida de SHU é baseada nessa quantidade de diluições. Portanto, se uma
determinada pimenta precisa ser diluída 100 mil vezes, sua escala de Scoville será:
100.000 SHU. Uma das desvantagens desse método é a imprecisão, uma vez que
consiste em uma análise fundamentada na percepção humana. Hartman, em 1970,
definiu o método organoléptico desenvolvido por Scoville como um método de
aplicação muito limitada.17,19,39,42,44
24
Em 1977, Todd et al. disseram que a pungência de uma determinada amostra
é obtida pela determinação do conteúdo bruto da capsaicina, multiplicado pelo valor
da pungência da capsaicina pura, a qual ele define como sendo 16,1 x 106. Todd
também cita que um dos primeiros trabalhos a determinar a pungência de produtos à
base de pimenta foi desenvolvido por ele mesmo, em 1958.41
Sendo assim, observa-se na literatura, que a partir do método proposto por
Scoville, diversos outros trabalhos foram sendo desenvolvidos de maneira a obter o
conteúdo de capsaicinóides presentes em uma determinada amostra, e muitos deles
associavam seus resultados com a Unidade de Calor de Scoville (SHU).17,25-29,38,39,41
Assim, foi desenvolvido uma classificação de pungência utilizando a SHU como
unidade de medida, conforme mostra a Tabela 1. Tabela 1. Classificação de pungência baseado em SHU.
Faixa Classificação 0 – 700 SHU Não pungente
700 – 3.000 SHU Levemente pungente
3.000 – 25.000 SHU Moderadamente pungente 25.000 – 70.000 SHU Pungente
Maior do que 80.000 SHU Altamente pungente
Fonte: Babu et. al., 2014,44 González-Zamora et. al., 2013.17
Em 2012, Lau et al.33 mostraram uma escala de pungência para alguns tipos
de pimenta, as quais estão listadas na Tabela 2, sendo a maioria delas altamente
pungentes.33
Tabela 2. Valores aproximados de SHU para alguns produtos comerciais à base de pimenta.
Produtos à base de pimenta Valor aproximados de SHU Jalapeño e Chipottle 50.000
Thai 100.000
Jamaican Hot 210.000
Habanero Laranja 380.000
Habanero Savina Vermelha 600.000
Spray de pimenta utilizado pela polícia 5 x 106 Capsaicina pura 16 x 106
Fonte: Lau et al., 2012.33
25
Apesar do Método de Scoville ainda ser bastante utilizado e servir como base
para a classificação da ardência dos produtos à base de pimenta, esse teste já tem
sido substituído por técnicas mais modernas e eficazes, tais como: Cromatografia
Líquida acoplada ao Espectrômetro de Massas (CL-EM),45 Cromatografia Gasosa
acoplada ao Espectrômetro de Massas (CG-EM)18 e Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE).46,47 Já existem estudos que quantificam os capsaicinóides por
RMN, no entanto, ainda não relacionaram os valores obtidos com o método de
Scoville.38,48
1.3 Técnicas analíticas aplicadas ao estudo dos alimentos
As primeiras análises realizadas, relacionadas à química dos alimentos, foram
feitas por via úmida, por volta do século 20. Essas análises envolviam combinações
de procedimentos analíticos como pesagem, filtração, extração por solvente,
destilação, titulações e outros.6 Ainda que os métodos clássicos por via úmida sejam
amplamente utilizados, com o passar do tempo, as técnicas analíticas baseadas em
análises cromatográficas ou espectroscópicas tornaram-se mais precisas,
melhorando seu limite de detecção e passando a serem utilizadas para uma gama
maior de aplicações alimentares. Estes métodos instrumentais desenvolvidos
aumentaram também a especificidade do analito, reduziram custos, simplificaram o
uso e tornaram-se automatizados.6,10
Cada técnica possui sua especificidade, bem como vantagens e desvantagens.
Atualmente, na química alimentícia, as técnicas instrumentais mais utilizadas são:
espectroscopia no ultravioleta (UV), espectroscopia no infravermelho (IV), CG, CL,
absorção atômica, EM, e RMN, onde esta última tem crescido consideravelmente.
1.3.1 Cromatografia Gasosa (CG)
A Cromatografia Gasosa é uma técnica amplamente presente nos laboratórios
que utilizam análise química. Algumas técnicas semelhantes a ela começaram a surgir
em 1930, contudo, seu real desenvolvimento se deu em 1952, por James e Martin. A
partir desse momento, o crescente interesse pela técnica, desencadeou em grandes
avanços para a mesma. Essa técnica baseia-se na separação de gases ou
substâncias volatilizáveis por uma fase móvel (gasosa) através de uma fase
26
estacionária (sólida ou líquida), onde as substâncias são separadas de acordo com
sua afinidade com a fase estacionária ou com a fase móvel, chegando à saída da
coluna em tempos diferentes, conforme ilustra a Figura 3. Por meio de um detector
adequado, elas são identificadas e também podem ser quantificadas.49,50
Figura 3. Esquema básico de um Cromatógrafo Gasoso.
Tendo como foco a matriz alimentícia escolhida para estudo, uma busca na
literatura revela o amplo uso da CG no estudo das pimentas do gênero Capsicum spp.
Seu uso está relacionado tanto a análises qualitativas quanto a análises quantitativas.
Na década de 70, tanto Hartman (1970)19 quanto Todd et al. (1977)41 utilizaram
o CG para análises quantitativas. Hartman utilizou um cromatógrafo gás-líquido para
quantificar o teor de capsaicina presente em frutos dos gêneros Capsicum, e Todd et
al. utilizou o CG para obter as concentrações de capsaicinóides presentes em
algumas amostras. Ambos converteram os valores de concentração encontrados para
SHU. Todd et al. executou também a metodologia proposta por Wilbur L. Scoville
(1912), a fim de comparar com o método instrumental abordado. Como resultado, a
CG mostrou melhor exatidão, precisão e eficiência frente ao método organoléptico.41
Já Iwai et al. (1979)18 utilizaram o CG-EM apenas qualitativamente, para identificar a
capsaicina e quatro de seus análogos.18
Thomas et al. (1998)51 apresentaram a CG como uma técnica rápida, simples
e segura no que tange à detecção dos capsaicinóides presentes em extratos de
pimenta e à quantificação dos mesmos, associando-os à escala de Scoville. A
27
identificação dos compostos presentes nos extratos foi feita por meio da comparação
entre os tempos de retenção (tr) obtidos para os picos em análise e os tempos de
retenção obtidos para os padrões externos. Além disso, a confirmação estrutural para
os capsaicinóides foi feita utilizando um espectrômetro de massas acoplado ao CG,
como sistema de detecção. Foram analisadas amostras de pimenta dos gêneros
Capsicum frutescens, Capsicum annuum e Capsicum chinense, totalizando 23 tipos
diferentes de pimenta.51
Alguns trabalhos mais recentes como o de Peña-Alvarez et al. (2009),37
Nwoken et al. (2010)40 e Bononi e Tateo (2012)36 também utilizam o CG como uma
ferramenta de quantificação. Peña-Alvarez et al. (2009)36 identificaram e quantificaram
11 variedades de pimentas e 4 molhos de pimenta. A quantificação foi feita por meio
da construção de uma curva de calibração com os padrões de capsaicina e
dihidrocapsaicina, obtendo-se um R2 = 0,9970, demonstrando, portanto, a elevada
linearidade do método. Para este estudo, também foi calculado a precisão, mostrando
o CG como sendo um método instrumental preciso.37 Nwoken et al. propuseram um
método simples de determinação de capsaicina para 5 tipos de pimenta, utilizando um
CG-EM, sem que fosse preciso passar por uma etapa de derivatização. As
concentrações dos capsaicinóides foram obtidas e convertidas em SHU, atribuindo
então, seu grau de pungência.40 Por fim, Bononi e Tateo (2012)36, descrevem a
aplicação do CG como uma ferramenta que pode ser usada em análises de rotina
para controle de qualidade. A quantificação de 10 amostras de pimenta (Capsicum
spp.) foi feita utilizando padrões, e a partir das concentrações obtidas, foi determinada
seu respectivo valor de SHU.36
1.3.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica mais nova,
comparada à CG, e com o passar dos anos têm sofrido algumas modificações para
torná-la uma técnica ainda mais eficiente e com uma gama maior de aplicações. Esta
técnica também é considerada muito importante para os laboratórios analíticos.49
A cromatografia líquida surgiu com a Cromatografia Líquida Clássica (CLC),
também chamada de Cromatografia em Coluna (CC), onde se utiliza uma coluna de
vidro, preenchida com sílica ou um recheio apropriado para a análise a ser realizada,
e a amostra é então aplicada na coluna e eluída com uma proporção adequada de
28
solventes polares e apolares. A vazão do eluente é controlada pela ação da gravidade,
e as frações da amostra são coletadas manualmente.49
A CLAE segue o mesmo princípio da CLC, no entanto, a pressão com que o
eluente flui pela coluna é muito maior, e a coluna utilizada é fechada, recheada com
partículas menores, aumentando a área de contato da amostra com a fase
estacionária, e consequentemente, sua resolução. A Figura 4 mostra um esquema da
CLAE. Seu progresso se deu a partir dos anos 70, e até hoje ela está em constante
aprimoramento, sendo aplicada à diversas áreas de pesquisa.49
No estudo dos alimentos, pode-se dizer que é uma das técnicas mais utilizadas.
Sendo assim, quando trazida para o campo de estudo em questão, uma busca na
literatura revela diversos artigos onde os capsaicinóides são identificados, isolados ou
quantificados pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
Figura 4. Esquema básico de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência.
Attuquayefio e Buckle (1987)52 foram alguns dos primeiros autores a
associarem o uso da CLAE às análises dos frutos do gênero Capsicum. Nesse estudo,
a CLAE foi utilizada como uma técnica de identificação e separação. Para a
identificação foram utilizados padrões dos capsaicinóides, e para a separação foram
utilizados metanol e água (63:37) como fase móvel, e uma coluna C18 (8 mm de
diâmetro interno, 5 µm de tamanho de partícula) como fase estacionária, o método
apresentado mostrou-se rápido, eficiente e seguro.52
Em 1997, Maillard et al.53 utilizaram a CLAE para separar e quantificar os
capsaicinóides encontrados nas oleoresinas obtidas da extração das pimentas. O
estudo foi feito para 11 capsaicinóides presentes nos frutos do gênero Capsicum
frutescens e na pimenta Caiena. Como fase móvel foi utilizado uma mistura de
29
metanol/água/ácido acético, na proporção de 60:39:1, respectivamente. A
quantificação foi feita por meio da construção de uma curva de calibração e a
concentração do analito foi determinada baseado na curva.53
Nyberg et al. (2001)54 abordaram o uso da CLAE para a separação dos
compostos presentes nos extratos da pimenta Habanero (Capsicum chinense),
utilizando como fase móvel 60% acetonitrila e 40% água acidificada com 1% ácido
acético. Dessa forma, o trabalho desenvolvido mostra o uso da CLAE como uma
técnica eficiente para a separação dos capsaicinóides.54
Em 2005, dois trabalhos importantes foram desenvolvidos utilizando a CLAE
acoplada à um espectrômetro de massas para análise de produtos à base de pimenta.
O primeiro, desenvolvido por Kozukue et al.15 abordou a análise de oito capsaicinóides
presentes nas pimentas e em produtos comerciais à base de pimentas. Como fase
móvel foi utilizado uma proporção de acetonitrila e água acidificada com ácido fórmico
1% (45:55). A identificação dos capsaicinóides foi feita com base nos tempos de
retenção e nos espectros de massa obtidos de cada pico representado no
cromatograma, e a quantificação foi feita relacionando a área dos padrões utilizados
com a área dos picos correspondentes nas amostras estudadas, presentes no
cromatograma. Foram analisadas 17 espécies de pimentas e 23 produtos feitos à
base de pimenta. Os autores também utilizaram a CLAE para estudar as diferentes
partes (placenta, sementes e pericarpo) da “Hot Korean Pepper”, e como resultado,
encontraram que a região de maior pungência é a placenta, possuindo cerca de 85%
dos capsaicinóides.15 O segundo, desenvolvido por Schweiggert et al.55 mostrou a
utilização da CLAE acoplada à um espectrômetro de massas, e, também associada à
ionização química à pressão atmosférica. O objetivo do trabalho foi caracterizar os
capsaicinóides extraídos da Capsicum frutescens. Esse tipo de análise se dá por meio
do padrão específico de cada fragmentação. Como resultado, foram detectados 23
compostos, sendo 15 deles pertencentes ao grupo dos capsaicinóides, onde três
deles correspondiam aos capsaicinóides mais comuns.55
Os trabalhos mais recentes desenvolvidos para esse tipo de estudo são os de
Nascimento et al. (2013),16 Kuzma et al. (2014),42 e o de Fan et al. (2017).56 Todos
eles abordam o uso da CLAE como instrumento de quantificação dos capsaicinóides.
Nascimento et al. (2013)16 utilizam a CLAE tanto para identificar quanto para separar
e quantificar os capsaicinóides. Primeiramente é abordada a análise qualitativa da
CLAE em extratos de pimenta malagueta (Capsicum frutescens), e em seguida, o
30
mesmo instrumento é utilizado para separação e quantificação da capsaicina, da
dihidrocapsaicina e do crisoeriol, individualmente. Utilizando substâncias padrões dos
analitos acima, de pureza conhecida, foram obtidas as curvas de calibração por meio
de análises realizadas também com a CLAE. Esse trabalho mostra a versatilidade da
técnica em questão.16 O trabalho abordado por Kuzma et al. (2014)42 mostra todo o
processo de validação de um método de análise de extratos industriais de Capsicum
utilizando a CLAE como técnica de análise. Como resultado, provou-se que o método
é linear, possui boa seletividade, precisão e repetibilidade, além de bons limites de
detecção e quantificação.42 Quanto ao trabalho desenvolvido por Fan et al. (2017)56,
ele é mais voltado para a otimização do processo de extração dos capsaicinóides.
Contudo, os autores utilizaram a CLAE para quantificar o teor de capsaicina obtido,
avaliando seu rendimento e pureza, registrando um rendimento de 95,5% para a
extração da capsaicina.56
Além dos artigos citados, existem ainda outros autores que também utilizam a
CLAE para quantificar os capsaicinóides, e alguns deles também atribuem o valor de
SHU para as concentrações obtidas, são eles: Sato et al. (1999),57 Batchelor e Jones
(2000),43 Kurian e Starks (2002),58 Sanatombi e Sharma (2008),31 Othman et al.
(2011),59 Juangsamoot et al. (2012),46 González-Zamora et al. (2013),17 Babu et al.
(2014),44 Nascimento et al. (2014),60 Popelka et al. (2017)30 e outros. Diante desse
panorama, observa-se o vasto uso dessa técnica no estudo da matriz alimentícia em
questão, a saber: as pimentas (Capsicum spp.).
1.3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
1.3.3.1 Histórico
A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) começou a surgir por volta de 1920,
quando Stern e Gerlach observaram que ao aplicar um campo magnético não-
homogêneo à um feixe de átomos, eles se desviavam e orientavam-se conforme o
campo magnético. Foi então que, em 1924, Pauli sugeriu a existência de campos
magnéticos, os quais agiam como se fossem pequenos ímãs. Assim, em meados de
1930, Stern e Gerlach determinaram a existência dos momentos magnéticos
nucleares, e em 1933, eles introduziram a ideia de que existe um momento dipolo
magnético para núcleos de hidrogênio. Em 1939, Rabi e colaboradores observaram
31
que ao aplicarem uma radiação no domínio das radiofrequências, juntamente com a
aplicação do campo magnético, o feixe de hidrogênios absorvia energia e sofria um
pequeno desvio.61-63
Em meados de 1945 e 1946, Bloch e Purcell, cada um em sua respectiva
Universidade nos EUA, decidiram medir os momentos magnéticos com uma maior
precisão. Foi então que eles observaram sinais de radiofrequência sendo absorvidos
por água (Bloch) e parafina (Purcell).61
No início da década de 50, Packard e outros colaboradores de Bloch fizeram a
medida dos momentos magnéticos com etanol, ao invés de água. Como resultado,
eles observaram que ao invés de um sinal, conforme observado na análise de água,
para o etanol eles obtiveram três sinais provenientes dos núcleos de H. Foi então que
eles perceberam que a intensidade do sinal estava associada aos H presentes na
estrutura do etanol. Essa década foi marcada por diversos avanços no uso da técnica
de RMN, por exemplo, descobriu-se que a frequência de ressonância de um núcleo é
influenciada pelo ambiente químico onde ele está submetido. Outro exemplo é o uso
da rotação da amostra de modo a melhorar a resolução do espectro obtido, uma vez
que ele minimiza o efeito não-homogêneo do campo magnético. Após esses avanços,
seu uso começou a ser aplicado à diversas áreas.61,63
A década de 60 foi marcada pelo uso de computadores associados à RMN.
Eles vieram para melhorar a sensibilidade da técnica, permitindo a combinação de
espectros obtidos repetidas vezes e utilizando a média do sinal obtido. Com isso, foi
possível analisar amostras de menores quantidades. A introdução do processo
conhecido como Transformada de Fourier (FT), tornou a obtenção do sinal um
procedimento mais rápido e eficiente, melhorando a razão sinal/ruído.61-63
Em 1970, o próximo avanço da RMN se deu com a introdução de ímãs
supercondutores responsáveis por gerar um campo magnético mais intenso. Dessa
forma, núcleos com abundância isotópica baixa puderam também ser observados por
RMN. Outro avanço que ocorreu nessa época foi a introdução de técnicas de impulsos
de radiofrequência, em lugar de se utilizar uma fonte de variação contínua de
frequência. Esses avanços corroboraram para o surgimento das técnicas especiais de
ressonância múltipla, bem como para o surgimento da RMN bidimensional.61-63
32
1.3.3.2 Fundamentação teórica da RMN
A técnica de RMN é fundamentada na absorção seletiva de ondas de
radiofrequência (r.f.) por amostras imersas em um campo magnético. Após excitada,
a amostra retorna ao estado inicial emitindo energia no domínio das radiofrequências.
A essência da informação está na determinação da r.f. específica emitida e a
velocidade com que a amostra retorna ao ponto de partida.61-66
Como técnica espectroscópica, a RMN estuda a interação entre energia e
matéria, onde a energia absorvida ou emitida obedece a condição estabelecida por
Bohr (Equação 1): 61-66 |∆𝐸| = ℎ𝜐 (1)
Onde DE é a diferença de energia da matéria em estudo entre os estados inicial e
final, h é a constante de Planck e u é a frequência de radiação. Como DE para as
transições magnéticas nucleares é muito pequeno, a frequência de radiação cairá,
portanto, entre os valores das radiofrequências.61-66
Assim como em outros tipos de análises espectroscópicas, os espectros de
RMN são representados na forma de gráficos que relacionam a probabilidade de
absorção (ou emissão) de energia em função da frequência, u. Essa informação
dependerá da natureza dos núcleos magnéticos.61-66
Para uma molécula ser “ativa” para a RMN, ela precisa possuir núcleos
magnéticos. Esses núcleos, por sua vez, possuem várias propriedades físicas
importantes, tais como: massa, carga elétrica, momento magnético (µ) e spin nuclear.
Dentre esses, os mais importantes para o estudo da RMN são o momento magnético
e o spin nuclear, porque conferem ao núcleo o comportamento semelhante ao de
pequenos ímãs. A Equação 2 mostra a relação entre o momento magnético e o spin
nuclear, e, portanto, somente núcleos com valores de spin nuclear diferente de zero (I
¹ 0) apresentarão propriedades magnéticas.61-66
𝜇 = 𝛾. 𝐼 (2)
Baseado na Equação 2, temos que g é a razão giromagnética e é constante
para cada nuclídeo. Essa equação mostra também a relação diretamente proporcional
33
existente entre o µ e a g, onde, quanto maior for a g, maior será o momento magnético
do núcleo, e consequentemente, haverá maior interação do núcleo com o campo
magnético externo.61-66
A mecânica quântica diz que o spin nuclear determina se a partícula possui ou
não propriedade magnética, uma vez que é uma propriedade intrínseca de cada
núcleo. Sua grandeza é expressa como número quântico de spin nuclear (I), o qual
pode assumir valores maior ou igual a zero, inteiro ou semi-inteiro. Esses valores
variam conforme a quantidade de prótons (Z), nêutrons (N) e a massa (A) de um
núcleo, onde:61-66
o I = 0, se A e Z forem pares;
o I = inteiro, se A for par e Z for ímpar;
o I = meio-inteiro, se A for ímpar.
Esses núcleos, por sua vez, possuem um momento dipolo magnético e na
presença de um campo magnético externo, tendem à orientar-se a favor ou contra a
direção do campo, conforme ilustra a Figura 5. Esse fenômeno ocorre, porque na
ausência do campo magnético (Figura 5a), os núcleos são degenerados, possuem o
mesmo nível de energia e estão em distribuição aleatória. No entanto, ao se aplicar
um campo magnético externo (Figura 5b), a degenerescência é quebrada, o campo
B0 interage com o momento magnético de cada núcleo orientando-os a favor ou contra
a direção do campo magnético externo. Alterar essa orientação exige energia, e como
o momento magnético varia conforme a espécie, a energia necessária para que essa
alteração ocorra, varia de nuclídeo para nuclídeo.61-66
Figura 5. Comportamento dos spins nucleares na ausência do campo magnético externo (a) e na
presença do campo magnético externo (b).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B0 = 0 B0
a) b)
34
Um dos postulados mais importantes da Mecânica Quântica, diz que o
momento angular de uma partícula possui valores definidos, em outras palavras, é
dito que ele está quantizado, ou seja, só determinados níveis energéticos são
possíveis, e essa quantização é referente a energia da partícula. A quantidade de
níveis energéticos é baseada no spin nuclear e calculada pela Equação 3.61-66
Níveis de energia = 2I +1 (3)
Onde I refere-se ao número quântico de spin nuclear.
Dessa forma, para um núcleo 1H, teremos I = ½, e consequentemente, dois
níveis de energia, denominados estados a e b. Os núcleos mais comuns e mais
estudados por RMN são os que apresentam I = ½, como é o caso do 1H e do 13C. Isso
ocorre porque as cargas desses núcleos possuem distribuição uniforme.61-66
A Figura 6 mostra a diferença de energia entre os estados a e b, onde o estado
a corresponde ao estado de menor energia, e é onde os spins estarão orientados à
favor do campo, e o estado b corresponde ao estado de maior energia, e os spins
estarão orientados contra o campo.61-66
Figura 6. Diferença de energia para I = 1/2, na presença de um campo magnético externo B0.
Portanto, como existe diferença de energia, haverá também diferentes
populações presentes nos estados a e b, onde o estado de menor energia (a) terá um
35
pequeno excesso populacional comparado ao estado de maior energia (b). Esse
excesso é definido pela distribuição de Boltzmann, conforme a Equação 4:61-66
-a-b=𝑒
D/012 (4)
Onde Na e Nb correspondem ao número de núcleos para cada estado de energia
respectivo, a e b, KB é a constante de Boltzmann (1,38 x 10-23 J.K-1), T é a temperatura
absoluta (K) e DE é a diferença de energia entre os dois estados (J). Essa diferença
de energia, por sua vez, é considerada pequena, e, portanto, a diferença populacional
existente entre os estados também é pequena. Por esse motivo, a RMN é considerada
uma técnica pouco sensível frente à outras técnicas espectroscópicas.61-66
Além da separação em níveis de energia, a interação entre momento magnético
e campo magnético faz com que os spins adquiram um movimento circular em torno
do campo B0, mantendo o ângulo entre os vetores, constante. Esse movimento é
chamado de movimento de precessão (Figura 7), e a frequência com que o núcleo
precessa é chamada de frequência de Larmor. A mecânica clássica explica que isso
ocorre devido ao torque aplicado pelo campo B0 no núcleo.61-66
Figura 7. Movimento de precessão do núcleo.
Dado que na presença do campo magnético, os núcleos orientam-se a favor ou
contra o campo e, tendo em vista que o estado de menor energia possui mais núcleos,
teremos que, para um conjunto de núcleos haverá, portanto, uma magnetização
36
resultante (M0) ao longo do eixo z, conforme ilustra a Figura 8.61-66
Figura 8. Conjunto de spins no estado a, no equilíbrio, gerando a magnetização resultante na direção
de B0.
A Figura 9 mostra o fenômeno de ressonância. Quando o campo magnético é
aplicado, o núcleo precessa em torno do campo B0, segundo a frequência de Larmor.
Assim, ao aplicar um pulso de radiofrequência, teremos que a componente do campo
elétrico oscilatório da radiação incidente se igualará à frequência do campo elétrico
gerado pelo núcleo que está precessando, fazendo com que os dois campos se
acoplem, absorvendo energia. Esse fenômeno é chamado de ressonância.61-66
Figura 9. Fenômeno de ressonância – adaptado.65
37
Após interromper a aplicação do pulso de r.f., os momentos magnéticos
retornarão à posição de equilíbrio, ou seja, retornarão ao eixo z, emitindo a energia
previamente absorvida. Esse fenômeno é conhecido como relaxação.61-66
Em uma mesma amostra existem muitos núcleos diferentes e, portanto, muitas
frequências de radiação eletromagnética diferentes são emitidas simultaneamente. À
medida que os núcleos perdem a energia, a intensidade da emissão decai com o
tempo (Figura 10). Esse processo é chamado de decaimento da indução livre (DIL),
também conhecido como FID (Free Induction Decay). À partir da transformada de
Fourier, os componentes individuais do FID são separados e convertidos em
frequências, conforme também mostra a Figura 10, originando então o espectro de
RMN.61-66
Figura 10. Decaimento de indução livre (DIL) de 1H de uma amostra, obtido no domínio do tempo, e
logo após aplicação da FT para obtenção do espectro.
No que diz respeito ao processo de relaxação, existem dois tipos: a relaxação
longitudinal (T1) e a relaxação transversal (T2). A relaxação longitudinal T1
corresponde à recuperação total da magnetização dos spins nucleares excitados. Em
outras palavras, é dito que a relaxação longitudinal T1 corresponde ao retorno dos
spins ao equilíbrio térmico inicial, onde ocorre a perda da energia absorvida durante
a excitação (Figura 11). Essa transferência de energia caracteriza o processo como
entálpico. No entanto, não é detectado variação de temperatura, porque essa variação
é muito pequena e, portanto, quase não é notada.61-66
38
Figura 11. Relaxação longitudinal T1. Retorno dos spins ao equilíbrio térmico inicial.
O método mais utilizado para medir T1 é o processo de Inversão-Recuperação,
e a aplicação do pulso ocorre conforme mostra a Figura 12.62,63
Figura 12. Processo de Inversão-Recuperação.
Ao aplicar um pulso de 180º, a magnetização resultante é invertida e retorna
ao eixo z após um tempo t1. Em seguida, aplica-se um pulso de 90º para medir a
intensidade da magnetização, durante um tempo de aquisição ta. RD é chamado de
relaxation delay, que é o tempo de espera para reiniciar o experimento.61-66
A intensidade da magnetização detectada (M) é descrita pela Equação 5.61-66
𝑀(𝑡) = 𝑀7 81 − 2𝑒<=>2> ? (5)
Baseado na equação 5, se t1 = T1 haverá apenas 26% da população de spins
recuperada no eixo z. Contudo, fazendo t1 = 5T1, têm-se que ocorrerá a recuperação
de, aproximadamente, 99% da população de spins. Fazendo o mesmo calculo para t1
= 7T1, têm-se 99,8% dos spins recuperados. Portanto, em análises quantitativas,
39
antes da sequência de pulso ser repetida, é preciso esperar um tempo de, pelo menos,
5T1, a fim de garantir que, praticamente, todos os spins retornaram à magnetização
total.61-66
Quanto à relaxação transversal T2, esta corresponde à perda de magnetização
no plano xy. Também chamada de relaxação spin-spin, esse tipo de relaxação ocorre
sob influência da não-homogeneidade do campo, o qual faz com que os spins
precessem em frequências diferentes, resultando em uma defasagem dos vetores
magnetização individuais. Esse processo acarreta na perda de coerência de fase
entre os momentos magnéticos individuais no cone de precessão, sem alterar a
energia do sistema, caracterizando o processo como entrópico.61-66
A Figura 13 demonstra o processo de relaxação transversal, onde a não-
homogeneidade do campo faz com que os spins experimentem um campo local maior
do que o outro, fazendo com que os primeiros spins tenham uma frequência maior, e
os outros spins experimentem uma frequência menor, ocasionando um “retardo” dos
mesmos.61-66
Figura 13. Processo de relaxação transversal, T2.
Em uma mesma amostra existem diferentes núcleos, ou até mesmo, núcleos
iguais, porém em condições diferentes na molécula. Dessa forma, quando um campo
B0 é aplicado, os elétrons circulam gerando um campo magnético induzido, em
direção contrária ao campo magnético aplicado, caracterizando o efeito chamado
blindagem (Figura 14). Sendo assim, quanto maior for a densidade eletrônica ao redor
do núcleo, maior será o campo induzido contrário à B0, aumentando a blindagem do
núcleo. Essa blindagem, por sua vez, faz com que esses núcleos precessem em
frequências mais baixas. Por outro lado, em alguns casos, a nuvem eletrônica age de
forma contrária, fazendo com que o núcleo seja desblindado, acarretando em uma
frequência maior do que a esperada. Sendo assim, observa-se que o efeito indutivo
40
dos núcleos que estão ligados ao grupo de interesse afetam o grau de blindagem.
Esses fatores interferirão, portanto, no deslocamento químico do núcleo analisado.61-
66
Figura 14. Efeito de blindagem dos elétrons.
O deslocamento químico (d) consiste na diferença entre a frequência de
absorção de um determinado núcleo e a frequência de absorção de um padrão.
Alguns fatores que influenciam no deslocamento químico são: eletronegatividade,
hibridização, ligação de hidrogênio, entre outros. Dessa forma, cada núcleo
apresentará um deslocamento químico diferente, exceto quando eles estão
submetidos às mesmas condições e influências. Na Figura 15, estão relacionados os
tipos de prótons mais essenciais e frequentemente encontrados em compostos
orgânicos. Essa característica torna a RMN uma técnica extremamente importante na
elucidação estrutural.61,64-66
Figura 15. Quadro de correlação simplificada entre valores de deslocamento químico de prótons.
41
1.3.3.3 Aplicações da RMN
Comparado às outras técnicas analíticas, a RMN ainda precisa melhorar em
relação à sua sensibilidade. No entanto, esta técnica é bem abrangente, podendo ser
aplicada a matrizes líquidas ou sólidas, e também produzir resultados qualitativos e
quantitativos em uma mesma análise. Segundo Nazari et al. (2007)38 a RMN de 1H
tem sido usada como um método rápido e eficiente de análise quantitativa, além de
ser uma técnica não destrutiva. McGorrin (2009)6 também acrescenta que uma análise
de RMN requer menos tempo para preparação de amostra, usa pouca quantidade de
solvente, e possui rápido tempo de análise.
Marcone et al. (2013)67 escreve sobre as diversas aplicações da técnica de
RMN no estudo dos alimentos, tais como análise composicional, estrutural, de
inspeção microbiológica, física e química, além de monitorar o processamento dos
experimentos, bem como verificar adulteração e contaminação dos alimentos.67
Aplicada ao estudo dos frutos do gênero Capsicum, observa-se o uso da RMN
como análise qualitativa e quantitativa (RMNq), e, em sua maioria, ela é utilizada para
caracterização ou elucidação estrutural. Sua aplicação relacionada à essa matriz
alimentícia específica, ainda é restrita, possuindo poucos trabalhos nessa área,
conforme é demonstrado na Figura 16. Contudo, o uso da RMNq tem crescido
consideravelmente, sendo aplicado nas diversas áreas da química, biologia e ciências
farmacêuticas.
Figura 16. Número de publicações relacionando as palavras chaves: “capsaicinoids” e “NMR” -
adaptado. (Fonte: Web of Science. Acessado em 26 de fevereiro de 2019)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1994 2002 2003 2004 2006 2009 2011 2016 2017
Qua
ntid
ade
Ano publicado
42
Em 1993, Kirby e Walker mostraram o uso da RMN quantitativa (RMNq) para
verificação da pureza dos capsaicinóides obtidos sinteticamente e fizeram a
comparação das quantidades de E-capsaicina e Z-capsaicina presentes em amostras
naturais de capsaicina.68
Nyberg et al. (2001)54 mostraram o desenvolvimento e o uso de um sistema
composto por um cartucho de extração em fase sólida acoplado à uma sonda de RMN
(EFS-RMN), utilizando solventes deuterados. O produto da extração da pimenta
Habanero (Capsicum chinense) foi submetido à uma etapa de pré-purificação
utilizando a CLAE, e as frações então obtidas foram analisadas no sistema EFS-RMN
desenvolvido. Segundo os autores, o espectro obtido apresentou boa qualidade e as
estruturas dos compostos foram determinadas.54
Em 2003, observa-se dois trabalhos importantes utilizando a RMN. O primeiro
se desenvolveu por Materska et al. (2003)69, onde a RMN foi utilizada em conjunto
com a CLAE e a técnica espectroscópica Ultravioleta (UV) para elucidação estrutural
dos flavonoides e fenólicos extraídos do pericarpo das pimentas pertencentes ao
gênero Capsicum annuum. Para as análises foram utilizados clorofórmio deuterado.
E o segundo trabalho foi desenvolvido por Catchpole et al. (2003)48, abordando o
aspecto quantitativo da RMN de 1H. Os autores avaliaram a extração das pimentas,
da pimenta-do-reino e do gengibre por um método específico, e essa avaliação é feita
por meio do rendimento obtido que, por sua vez, é calculado pela RMNq utilizando
clorofórmio deuterado. Para a validação do método, foram avaliadas três figuras de
mérito, a saber: linearidade, limite de detecção e precisão. A análise de RMNq
apresentou, portanto, boa linearidade (R2 = 0,9989) e baixa precisão. O limite de
detecção apresentou uma proporção de 30:1 e foi obtido através da relação sinal-
ruído. Os autores também disseram que a vantagem da RMNq frente à CLAE é que
a RMNq é um método mais rápido e que não precisa de uma ampla etapa de pré-
purificação.
Em 2006, Thompson et al.23 utilizaram a RMN de 13C para a caracterização de
15 capsaicinóides isolados a partir de uma mistura, e sua identificação foi feita
baseada em seus respectivos deslocamentos químicos. As análises foram feitas
utilizando clorofórmio deuterado.23
No ano seguinte, em 2007, Nazari et al.38 abordaram a RMNq. Contudo,
novamente, o foco do artigo foi dado às técnicas de extração, de modo a otimizar e
definir um melhor método para a extração da capsaicina presente nos frutos do gênero
43
Capsicum frutescens. A análise quantitativa de RMN de 1H foi feita utilizando
clorofórmio deuterado como solvente e mostrou as regiões de deslocamento químico
a serem utilizadas para integração, e consequentemente a obtenção do teor de
capsaicina foi dada por meio dessas regiões. Os autores destacaram também que o
uso da RMNq dispensa a construção da curva de calibração, uma vez que a
quantidade do composto a ser calculado é obtida pela razão entre o valor da integral
do analito e o valor da integral do padrão interno.38
Em 2009, Li et al.70 abordaram apenas o aspecto qualitativo da RMN, utilizando
os dados obtidos da RMN de 1H e RMN de 13C para, juntamente, com os resultados
obtidos do espectrômetro de massas, elucidar as estruturas provenientes do
isolamento e purificação dos capsaicinóides presentes na Capsicum frutescens.70
Por fim, atualmente foi publicado um trabalho por Gómez-Calvario et al.
(2015)20, que reúne informações de análises de RMN de 1H e RMN de 13C de,
aproximadamente, 159 capsaicinóides naturais e sintéticos. Dessa forma, os autores
esquematizam uma tabela com os dados de RMN de diferentes tipos de
capsaicinóides, com o intuito de produzir uma base de dados organizada desse tipo
de dados.
1.3.3.4 RMN quantitativo (RMNq)
A RMN é uma técnica bastante utilizada qualitativamente na elucidação
estrutural de substâncias químicas, principalmente de compostos orgânicos.
Entretanto, sua aplicação para análises quantitativas também tem sido amplamente
empregada, uma vez que ela é uma técnica rápida e eficiente para esse tipo de
análise, além de fornecer informações qualitativas e quantitativas, simultaneamente.
Outra vantagem está em poder quantificar diferentes compostos em uma mesma
matriz sem precisar de padrões químicos idênticos.38,71
A RMNq está fundamentada na relação entre a área do sinal de 1H de um
espectro (Ax) e a quantidade de núcleos que absorvem energia na radiofrequência
para esse sinal (Nx). Essa relação é dada pela Equação 6:
𝐴A = 𝐾CDE. 𝑁A (6)
Onde Kesp é a constante do espectrômetro.11,72,73
44
Para que essa relação seja válida, é preciso que os spins dos hidrogênios
estejam em equilíbrio térmico. Para isso, ao aplicar um pulso de 90°, a magnetização
longitudinal começará a ser lida no ponto nulo e relaxará até retornar ao equilíbrio.
Sendo assim, para que a magnetização seja praticamente completa e ocorra a
relaxação de quase todos os núcleos estudados, ou 99% deles, é preciso aplicar um
tempo de 5T1 na análise, conforme mostra matematicamente na Equação 7. Dessa
forma, aplicando 5T1, temos a garantia que 99% dos hidrogênios analisados
retornaram ao equilíbrio térmico.11,71,73
𝑄𝑢𝑎𝑛𝑑𝑜𝑡M = 5𝑇P,𝑓 = 1 −𝑒<S2>2> (7)
À respeito do sinal a ser utilizado para quantificar, é preciso que o sinal
escolhido entre os demais não esteja sobreposto por outros e que possua a maior
intensidade possível. A quantificação desse sinal se dará pela razão molar do analito
e um padrão interno de massa conhecida, conforme a Equação 8. Onde n refere-se
ao número de mols, A é a área do sinal, N é o número de núcleos que absorvem na
frequência do sinal de ressonância, x corresponde ao analito de interesse, e PI é o
padrão interno.11,73 TUTVW
= XUXVW . -VW-U
(8)
A escolha do padrão interno (PI) é feita utilizando-se uma substância de pureza
e concentração conhecida. É de suma importância que o sinal referente ao PI não
sobreponha ao sinal dos núcleos referentes ao analito de interesse. A maioria das
substâncias utilizadas como padrão interno nas análises de RMNq são substâncias
que produzem espectros simples, com apenas um singleto, como por exemplo,
dimetilfurano, dimetilformamida e ácido maleico. Durante as análises de RMNq, o PI
é analisado ao mesmo tempo que a amostra, estando dentro de um tubo de inserção
coaxial, inserido no tubo que contém a amostra. Dessa forma, o mesmo PI pode ser
utilizado para todas as análises. O tetrametilsilano (TMS) é um padrão bastante
conhecido e utilizado em análises de RMN. Contudo, o uso desse padrão em análises
quantitativas não é adequado, uma vez que ele é altamente volátil, dificultando o seu
preparo como uma solução conhecida e de concentração precisa. 11,73
Partindo da equação 8, utiliza-se uma outra equação para calcular a pureza de
um analito em uma mistura (Equação 9), onde Px corresponde a pureza de um analito,
45
PPI à pureza do padrão interno, M é a massa molar, e m é a massa da amostra.11,73
𝑃A = XU.-VW.ZU.[VWXVW.-U.ZVW.[
. 𝑃\] (9)
Baseado na equação 9, podemos dizer que é possível obter a pureza do analito
sem precisar construir uma curva de calibração, tornando a RMNq mais vantajosa
frente aos métodos cromatográficos e à outras técnicas espectroscópicas.
O primeiro uso da RMNq foi realizado por Jungnickel e Forbes (1963)72, para a
determinação do conteúdo percentual de 26 compostos puros, de modo a verificar a
exatidão do método a ser aplicado e mostrar a eficiência do uso da RMNq em análises
de diferentes compostos. Ainda nesse mesmo ano, Donald P. Hollis (1963)74, utilizou
a RMN para quantificar misturas de aspirina, fenacetina e cafeína. Nesse artigo, o
autor mostra a forma como foi calculado o teor de cada uma dessas substâncias e
define a RMNq como sendo uma análise rápida.72,74
Em 1986, Eberhart et al.75 também quantificaram misturas contendo aspirina,
fenacetina e cafeína, utilizando o 1,3,5-trioxano como padrão interno. O autor também
cita que em comparação com o método original de obtenção do teor de café, a RMNq
se mostra mais exata e precisa.75
Como a RMNq é uma técnica bastante eficiente na obtenção da pureza de
determinados compostos, observa-se então um vasto número de aplicações dessa
técnica no cálculo da pureza de determinados fármacos, substâncias biológicas e
outros, todos utilizando solvente deuterado.76-81
Barthi e Roy, em 2012,82 escreveram uma revisão bibliográfica sobre o uso da
espectroscopia quantitativa de RMN de 1H. Nesse trabalho, eles dissertaram à cerca
dos fundamentos da RMNq, os parâmetros que afetam a exatidão e a precisão da
mesma, suas propriedades físico-químicas, as técnicas de referência utilizadas na
RMNq, alguns outros procedimentos analíticos para essa técnica, falaram também
sobre a RMNq bidimensional, o processo de validação desta, e suas aplicações. Os
autores mostraram uma ampla aplicação da análise quantitativa de RMN, sendo
empregada nas análises farmacêuticas, no estudo dos produtos naturais, sínteses
orgânica, metabolômica, análises cinéticas e no monitoramento das reações, etc. No
que diz respeito à validação do método, os autores explicaram cada parâmetro
requerido (exatidão, precisão, linearidade, reprodutibilidade, seletividade, limites de
46
quantificação e detecção, e robustez) e relataram os fatores que podem influenciar
em suas análises.82
Como já discutido em itens anteriores neste trabalho, para um método ser
eficaz, ele precisa ser validado. Por esta razão, existem alguns artigos que tratam
sobre esse assunto. Um deles foi escrito em 2013, por Godecke et al.83, onde foi
desenvolvido um método genérico de validação para análise quantitativa de RMN de 1H, de produtos naturais. Em 2016, Cerceau et al.84, validaram um método de análise
de RMNq de 1H no estudo de óleos essenciais, mostrando de maneira descritiva a
forma como foi calculado cada parâmetro (seletividade, linearidade, limites de
detecção e quantificação, exatidão, precisão e robustez) utilizado para a validação.
Em 2018, Rocha et al.73, descrevem a validação do método para quantificar a cocaína
e seus adulterantes sem o uso de solvente deuterado. Os parâmetros utilizados para
validação foram detalhados, mostrando cada procedimento realizado.73,83,84
No que diz respeito ao uso da RMNq para análise de alimentos, Simmler et al.
(2014)85, escreveram que a rapidez e a simplicidade da RMNq têm demonstrado um
avanço na ciência alimentícia. Eles argumentam que a crescente busca da técnica de
RMN para análises quantitativas, se dá devido à suas vantagens frente aos métodos
cromatográficos. Os autores citam o uso da RMNq para análises de vinho, leite, chá
e alimentos processados.85 Uma busca na literatura, nos revela outros trabalhos que
utilizam a RMNq para análise de produtos como vinho,86 café,87,88 graviola,89 ovo90 e
pimentas.38,48
No que tange ao estudo da matriz alimentícia em questão, a saber, as pimentas,
verifica-se apenas dois artigos relacionando a análise quantitativa de RMN aos frutos
do gênero Capsicum, sendo eles, os trabalhos desenvolvidos por Catchpole et al.
(2003)46, e por Nazari et al. (2007)38. Ambos desenvolveram a análise de quantificação
baseado na equação de pureza (Equação 5), afirmando que a análise quantitativa de
RMN não requer construção da curva de calibração. Para a validação, apenas
Catchpole et al. (2003)48 citam a obtenção de três figuras de mérito, de modo a provar
a eficiência do método proposto.38,48
1.3.3.5 Validação do método
A fim de garantir a qualidade dos resultados analíticos obtidos, é necessário a
realização da validação do método utilizado. Portanto, segundo a ANVISA (RDC nº
47
166, de 24 de julho de 2017), para que um método seja validado, é necessário analisar
as seguintes figuras de mérito: seletividade, linearidade, limite de detecção, limite de
quantificação, exatidão, precisão e robustez.91
a. Seletividade
A seletividade deve ser demonstrada por meio da comprovação de que o sinal
de interesse utilizado é correspondente exclusivamente ao analito de interesse
presente na amostra, sem interferência de outros compostos presentes, tais como
matriz, impurezas, entre outros.73
b. Linearidade
A linearidade deve ser demonstrada por meio da capacidade de obter respostas
diretamente proporcionais a concentração do analito na amostra. As curvas de
linearidade são obtidas a partir de medições em 5 ou mais concentrações distintas do
analito em amostra de padrões, e a medida deve ser realizada em triplicata. As curvas
de calibração são construídas a partir da razão entre a área do sinal do analito e a
área do sinal do padrão interno, em função da concentração do analito. Além disso, o
coeficiente de correlação linear pode ser calculado de acordo com a Equação 10, onde
R é o coeficiente de correlação, x é a concentração do analito, �̅� é a média das
concentrações, y é a razão das áreas e 𝑦a é a média das razões de áreas:
𝑅 = ∑(AdA̅)(edea)fg(AdA̅)hg(edea)h
(10)
Para que um método seja linear, e portanto, considerado válido, a ANVISA
(RDC no 166, art. 27) dispõe que é preciso que o R seja maior ou igual a 0,990, o
coeficiente angular da curva de linearidade deve ser diferente de zero, também deve
ser apresentado o gráfico de dispersão dos resíduos juntamente com sua avaliação
estatística, e o nível de significância utilizado nos testes estatísticos deve ser de até
5%.91,92 Para modelos de regressão linear, o método de mínimos quadrados ordinários
é o mais utilizado, porque segundo hipótese de independência e avaliação da
homocedasticidade dos resíduos, esse método fornecerá estimadores centrados com
variância mínima.93,94
48
O teste estatístico é feito então, por meio da Análise das Variâncias (ANOVA),
a qual baseia-se na dissolução da variação total da variável resposta em partes que
podem ser conferidas à tratamentos e à erros experimentais. Essa variação é medida
através das somas quadráticas e a soma dos quadrados dos resíduos, as quais
também implicam na obtenção dos quadrados médios de tratamentos e de resíduos,
que quando relacionados com o grau de liberdade, resultam no valor de F. Sendo
assim, por meio do teste F, e baseado no nível de significância escolhido (no caso da
ANVISA, 5%), avalia-se simultaneamente a significância de um conjunto de
parâmetros para análises de regressão linear, simples ou múltipla. Essa avaliação é
dada por meio da comparação entre o Fcalculado e o Ftabelado, onde, se Fcalculado > Ftabelado,
rejeitamos a hipótese nula, afirmando, portanto, que mais significativa e linear é a
regressão. 93,94
Entretanto, ainda que se tenha feito a ANOVA e a avaliação do teste F, é
importante que a normalidade dos erros seja avaliada, é importante considerar a
homegeneidade de variância dos erros. Caso não seja feito esse tipo de avaliação, a
validade dos resultados dos testes e as estimações realizadas podem ser
comprometidas. Para isso, um dos testes utilizados é o Teste de Cochran, o qual avalia
a homocedasticidade ou heterocedasticidade dos dados, ou seja, uma variação
constante ou não dos erros atrelados às variáveis. O caráter homocedástico do
método pode ser calculado tanto avaliando a relação entre a homocedasticidade
calculada e seu valor teórico, como através do gráfico de resíduos. Baseado no Teste
de Cochran, se o valor calculado é menor do que o teórico, teremos uma
homogeneidade na variância dos erros, caracterizando o processo como
homocedástico.95,96
Quanto ao gráfico de dispersão dos resíduos, este representa os resíduos em
função dos valores estimados da variável dependente em relação aos valores de uma
das variáveis independentes. Sendo assim, para que os erros sejam independentes e
de variância constante, é preciso que os pontos do gráfico se distribuam de maneira
aleatória em torno da reta a que se refere o resíduo zero. Dessa forma, é confirmada
a homocedasticidade do método.94
c. Limites de Detecção e Quantificação
O limite de detecção (LD) pode ser descrito como o menor teor do analito
presente na amostra que pode ser detectado pelo método. Ele pode ser obtido através
49
do método visual, da relação sinal-ruído ou baseado em parâmetros da curva
analítica. O último método é considerado mais robusto e estatisticamente mais
confiável, uma vez que é baseado no intervalo de confiança da regressão, e não em
parâmetros qualitativos. Dessa forma, o produto entre o valor adequado de t da
distribuição de Student e o erro padrão associado ao sinal analítico obtido a partir da
equação de regressão, permite calcular o intervalo de confiança da curva analítica.
Nesse intervalo, o intercepto do limite superior do intervalo de confiança superior é o
yc, também conhecido como y crítico, e sua projeção no limite inferior é o valor
encontrado para o LD (Figura 17a), ou seja, a estimativa da concentração mínima do
analito presente na amostra, comprovado estatisticamente. As Equações 11 e 12
descrevem o cálculo de yc e LD, onde a0 é o coeficiente linear, a1 é o coeficiente
angular, N é o número total de amostras utilizadas como padrões de calibração e sy é
o desvio padrão.91,92
𝑦i = 𝑎7 +𝑠e. 𝑡. lmP-n + 1 + A̅h
∑ (AodA̅)hpoq>
(11)
𝐿𝐷 = 2. Dt.uv> . lmP-n + 1 +
(ewdea)h
v>h .∑ (AodA̅)hpoq>
(12)
Já o limite de quantificação (LQ) pode ser descrito como o menor teor do analito
que pode ser quantificado com precisão e exatidão pelo método, o qual foi obtido a
partir das Equações 13 a 15.91 Assim como o LD, o LQ também pode ser obtido pelos
métodos visual, da relação sinal-ruído ou baseado em parâmetros da curva analítica,
onde este último é o mais confiável estatisticamente. LQ é o limite de quantificação,
xc é o valor da concentração (x) no ponto de intercessão entre a0 e a reta de regressão,
e yh é o valor de y para a projeção de xc no limite superior (Figura 17b).92
𝑦x = 𝑎7 +2. 𝑠e. 𝑡. lmP-n + 1 + (AwdA̅)h
∑ (AodA̅)hpoq>
(13)
𝑥i =Dt.uv> . lmP-n + 1 +
A̅h
∑ (AodA̅)hpoq>
(14)
𝐿𝑄 = meydvzv>
n +mDt.uv>n . lmP-n + 1 +
(eydea)h
v>h .∑ (AodA̅)hpoq>
(15)
50
Figura 17. Curva de calibração demonstrativa sobre o procedimento de cálculo do LD (a) e LQ (b). –
adaptado.92
d. Exatidão
A exatidão expressa o grau de concordância entre os valores obtidos individuais
do método em análise em relação a um valor considerado como verdadeiro. A
exatidão pode ser expressa pela razão entre a concentração média determinada
experimentalmente e a concentração teórica, de acordo com a Equação 16, onde C
representa a concentração.91
𝐸𝑥𝑎𝑡𝑖𝑑ã𝑜% = ~�U���o��p=��
~𝑥100 (16)
e. Precisão
A precisão deve demonstrar a proximidade entre os resultados obtidos e ser
expressa por meio da repetibilidade que deve avaliar as mesmas amostras sob as
mesmas condições de preparo, analista, operação e instrumentação em uma única
corrida analítica. 91 As análises são feitas em triplicata, onde a precisão é expressa
por meio do desvio padrão relativo (DPR) calculado de acordo com a Equação 17,
onde s é referente ao desvio padrão e �̅� representa a concentração média do analito.
𝐷𝑃𝑅 = DA̅ . 100 (17)
a) b)
51
f. Robustez
A robustez demonstra a capacidade do método em resistir a pequenas
variações nas condições analíticas. Dessa forma, é importante identificar os possíveis
fatores que afetam os resultados, e avalia-los aplicados à amostra. Como o método é
linear, na RMNq os resultados podem ser expressos tanto em função dos valores das
integrais quanto em função das concentrações calculadas, uma vez que são
diretamente proporcionais. Alguns dos fatores mais utilizados na avaliação da
robustez são: variações de temperatura e tempo de estocagem. Os impactos de tais
variações devem ser avaliados da mesma forma que a exatidão.91
52
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este trabalho teve por objetivo usar a técnica de RMN para identificar os
compostos majoritários extraídos da pimenta malagueta, bem como estudar os
condimentos à base de pimenta, fazendo análises qualitativas e quantitativas. Tendo
como foco o desenvolvimento do processo de validação de quantificação do teor de
capsaicina em condimentos comerciais por RMN de 1H sem o uso de solvente
deuterado.
2.2 Objetivos específicos • Utilizar técnicas simples de extração para obter os compostos presentes na
pimenta malagueta obtida comercialmente.
• Fazer uso de técnicas cromatográficas para isolá-los;
• Utilizar técnicas analíticas como CG-EM e o RMN de 1H e 13C para avaliar a
pureza dos capsaicinóides isolados.
• Análise qualitativa dos resultados obtidos;
• Obtenção das figuras de mérito para validação do método;
• Análise quantitativa dos capsaicinóides e obtenção da SHU, por RMN de 1H.
• Aplicação do método validado à amostras comerciais.
53
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 Amostras
A pimenta malagueta utilizada para extração dos capsaicinóides foi adquirida
in natura, diretamente do produtor rural. Já as pimentas (Malagueta, Bhut Jolokia,
Trinidad Scorpion, Habanero e Carolina Reaper) utilizadas para aplicação da técnica
foram compradas em supermercados locais.
3.2 Reagentes Químicos
Os reagentes metanol, hexano e acetato de etila P.A. utilizados para extração
e pré-purificação dos capsaicinóides foram adquiridos das empresas Dinâmica
Química Contemporânea Ltda, Neon Comercial Ltda e Sigma-Aldrich Brasil Ltda,
respectivamente. A acetonitrila de grau HPLC, empresa Honeywell International Inc,
foi utilizada para purificação dos capsaicinóides. Para a etapa de purificação também
foi utilizada água ultrapura. O metanol de grau HPLC foi adquirido da Sigma-Aldrich
Brasil Ltda e usado como solvente nas análises de RMN.
3.3 Extração dos capsaicinóides
O processo de extração dos capsaicinóides foi feito baseado nos trabalhos de
Thompson e Loa (2011)22 e Nascimento et al. (2013)16. Consistiu na retirada dos
cálices e pedúnculos da pimenta malagueta, restando a placenta, que em seguida
foram colocadas em estufa por, aproximadamente, 24 horas, à uma temperatura de
50°C. Após esse tempo, as pimentas foram retiradas da estufa e trituradas até virarem
pó. A amostra foi então dividida em béqueres contendo, aproximadamente, 30 g de
amostra. Em seguida foram adicionados 150 mL de metanol à cada béquer, os quais
foram deixados no ultrassom por 30 min. Após essa etapa, as amostras foram filtradas
com o intuito de remover os sólidos presentes, obtendo-se, portanto, os extratos de
metanol (Figura 18).
54
Figura 18. Fluxograma da obtenção do extrato metanólico da pimenta malagueta.
3.4 Purificação dos capsaicinóides
Os extratos de metanol foram submetidos a um processo de purificação de modo
a isolar os capsaicinóides presentes. Para isso, esse processo foi realizado utilizando
Cromatografia em Coluna (CC), e a escolha da fase móvel foi feita baseada em
análises prévias dos extratos obtidos utilizando a Cromatografia de Camada Delgada
(CCD). Foram testadas algumas condições experimentais variando o tipo de sílica,
tamanho de coluna e proporção de eluente. Enfim, essa etapa de purificação foi feita
utilizando como fase estacionária sílica flash com as especificações 70-90 µm, 60 Å,
e uma fase móvel gradiente de hexano:acetato de etila nas proporções 7:3, 6:4 e 5:5,
respectivamente. Durante a etapa de purificação por CC foi utilizada a CCD para
identificação dos capsaicinóides (tr = 0,24, tendo como fase móvel hexano:acetato de
etila – 7:3).
55
3.5 Análises de CG-EM
De forma qualitativa, com o intuito de confirmar a presença dos capsaicinóides
nas frações, foi utilizado um CG-EM da marca Agilent 19091S-433 UI, com uma
coluna ultra inert HP-5ms (30m x 250 µm x 0,25 µm). Como gás de arraste utilizou-se
o gás Hélio numa vazão de 1 mL.min-1, pressão de 1,8172 psi e pressão da amostra
em 14,5 psi. A temperatura inicial da coluna foi de 40°C por 1 min, e em seguida, foi
programada uma rampa de aquecimento de 10°C.min-1 até atingir 300°C por 5 min. A
temperatura do injetor foi de 260°C com a taxa de split de 10:1. O potencial de
ionização do EM foi de 70 eV, e a temperatura do detector foi programada para 280°C.
A identificação dos compostos foi feita comparando-se os tempos de retenção e os
cromatogramas de cada capsaicinóide, usando os dados espectrais obtidos da
biblioteca do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST, National Institute of
Standards and Technology). A NIST é uma Biblioteca Espectral de Massa composta
por uma série de dados espectrais referentes à inúmeros compostos presentes no
cotidiano. Baseado nesses dados, essa biblioteca relaciona os dados obtidos com
àqueles provenientes da análise de CG-EM, indicando então, as possíveis opções de
compostos que se referem ao pico selecionado em determinado tempo de retenção.
Sendo assim, utilizou-se dessa metodologia para identificar a presença dos
capsaicinóides no extrato e nas soluções analisadas por CG-EM.
3.6 Separação dos capsaicinóides
Após identificação da fração que continha os capsaicinóides, foi utilizado o
CLAE da Agilent Technologies, modelo 1260 Infinity, para proceder para o isolamento
das substâncias, a saber: capsaicina e dihidrocapsaicina. O equipamento continha
uma bomba de alta pressão, um injetor manual, uma coluna preparativa Zorbax SB-
C18 (21.2 x 250 mm, 7µm de diâmetro de partícula), e o detector foi configurado para
um comprimento de onda de 280 nm. O fluxo foi configurado para 9,0 mL.min-1, e cada
injeção foi feita com 50 µL de extrato dos capsaicinóides. Como fase móvel foi utilizado
acetonitrila e água destilada ultrapura na proporção 55:45, e as frações foram
coletadas manualmente. Após obtenção da capsaicina e da dihidrocapsaicina
individualmente, procedeu-se para a eliminação dos solventes utilizados e em
56
seguida, os analitos foram caracterizados por RMN de 1H.
3.7 Análises de RMN
3.7.1 Instrumentação
Para as análises de RMN foi utilizado um espectrômetro 9.4 T Varian, modelo
VNMRS 400, utilizando uma sonda 5 mm BroadBand 1H/19F/X em uma temperatura
de 25°C. O software usado foi o VNMRj na versão 4.2. As análises de RMN de 1H
foram feitas, primeiramente, para 3 amostras de capsaicinóides solubilizadas em uma
mistura de 600 µL de metanol de grau HPLC e água destilada ultrapura (capsaicina:
18 mg; dihidrocapsaicina: 16 mg; “terceiro” capsaicinóide: 17 mg). Os parâmetros de
análise foram:
o Frequência: 399,80 MHz;
o Janela espectral: 6410,3 Hz;
o Tempo de Aquisição: 3,834 s;
o Tempo de Relaxação: 1,166 s;
o Pulso: 45º;
o Número de transientes (scans): 32.
Essas 3 amostras de capsaicinóides também foram submetidas a análises de
RMN de 13C em solvente não deuterado. Para as análises de RMN de 13C, os
parâmetros foram:
o Frequência: 100,52 MHz;
o Janela espectral: 25000,0 Hz;
o Tempo de Aquisição: 1,311 s;
o Tempo de Relaxação: 1 s;
o Pulso: 45º;
o Núcleo desacoplado: 1H;
o Número de transientes (scans): 2000.
Para o processo de validação, foram realizadas análises de RMN de 1H para
amostras de capsaicina e dihidrocapsaicina nas concentrações de 0,5 mg.mL-1 à 5,0
mg.mL-1 também em solvente não deuterado, e utilizando um tubo de inserção coaxial
57
contendo a solução padrão de ácido maleico. Para essas análises, utilizou-se também
um padrão interno de 80 µL de uma solução de ácido maleico em água deuterada, de
concentração 6,7 mg.mL-1, colocadas em tubo de inserção coaxial.
Para garantir a magnetização de 99% dos núcleos estudados é preciso aplicar
um tempo igual ou maior do que 5T1 na análise, onde T1 é o tempo de relaxação
longitudinal. Dessa forma, foi aplicada a sequência de pulso inversão-recuperação 90°
com supressão do sinal da água (presat), e o tempo de relaxação longitudinal foi
medido para a capsaicina e para a dihidrocapsaicina, em suas concentrações menor
(0,5 mg.mL-1) e maior (5 mg.mL-1). Sendo assim, o tempo de relaxação utilizado foi
7T1, a fim de obter uma magnetização de 99,8% dos núcleos estudados. Portanto, as
análises de validação da capsaicina tiveram um tempo de relaxação de 42 segundos,
e as de dihidrocapsaicina de 49 segundos. Para as análises de RMN de 1H das
amostras de pimentas comerciais, foi utilizado um tempo de relaxação de 49
segundos. O número de scans utilizado foi igual a 64, com uma janela espectral de
6410,3 Hz. O processamento dos espectros de RMN foi feito com as correções
manuais da linha de base e da fase, quando necessário.
3.7.2 RMN quantitativo (RMNq)
A validação do método utilizado para quantificação de capsaicinóides por RMN
de 1H foi desenvolvida baseado nos requisitos exigidos pela ANVISA, em sua
resolução RDC nº 166, de 24 de julho de 2017. Tal resolução exige a análise das
seguintes figuras de mérito, para que o método seja validado: seletividade,
linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão, precisão e
robustez.91
Para tais análises foram utilizadas soluções de capsaicina e dihidrocapsaicina,
nas concentrações de: 0,5 mg.mL-1 (Ponto 1), 1 mg.mL-1 (Ponto 2), 2 mg.mL-1 (Ponto
3), 3 mg.mL-1 (Ponto 4), 4 mg.mL-1 (Ponto 5) e 5 mg.mL-1 (Ponto 6). Estas foram
preparadas por diluição, a partir de uma solução de 5 mg.mL-1, utilizando água
destilada ultrapura e metanol HPLC (1:1) como solvente.
3.7.2.1 Seletividade
Para estudo da seletividade, as amostras padrões de capsaicina e
58
dihidrocapsaicina foram analisadas separadamente por RMN de 1H, a fim de obter os
seus respectivos sinais a serem utilizados para quantificação. Foi obtido também o
espectro de RMN de 1H de uma solução de ácido maleico em água deuterada, e o
espectro de RMN de 1H de uma pimenta comercial em metanol não deuterado.
3.7.2.2 Linearidade
As curvas de linearidade foram obtidas com seis concentrações distintas do
analito (Ponto 1 ao 6), cuja medida foi realizada em triplicata, conforme ilustra a Figura
19. As curvas de calibração foram construídas a partir da razão entre a área do sinal
do analito e a área do sinal do ácido maleico, em função da concentração do analito.
A partir dos dados obtidos para a curva de linearidade, foi construído o gráfico de
dispersão dos resíduos juntamente com sua avaliação estatística baseada na análise
das variâncias (ANOVA), e o nível de significância utilizado foi de 5%.
Figura 19. Ensaio de linearidade para validação do método de RMNq de 1H para análise de
capsaicinóides em pimentas comerciais.
3.7.2.3 Limites de Detecção e Quantificação
Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram calculados baseado na
equação da reta obtida da linearidade e utilizando as Equações de 11 a 15.
5,0 mg mL-1
5,0 mg mL-13,0 mg mL-1 4,0 mg mL-12,0 mg mL-10,5 mg mL-1 1,0 mg mL-1
Leitura 1 Leitura 3
Leitura 2
Leitura 1 Leitura 3
Leitura 2
Leitura 1 Leitura 3
Leitura 2
3 x
59
3.7.2.4 Exatidão
A exatidão do método foi determinada a partir das soluções de concentração
0,5 mg.mL-1, 3 mg.mL-1 e 5 mg.mL-1. As concentrações experimentais foram
calculadas por meio das curvas de calibração obtidas dos ensaios de linearidade para
os dois analitos, os quais foram realizados em triplicatas.
3.7.2.5 Precisão
A precisão foi calculada por meio da repetibilidade, onde as amostras foram
avaliadas sob as mesmas condições de preparo, analista, operação e instrumentação
em uma única corrida analítica. Para tais ensaios foram utilizadas as mesmas
amostras do ensaio de exatidão, a saber, as soluções de concentração 0,5 mg.mL-1,
3 mg.mL-1 e 5 mg.mL-1. As análises foram feitas em triplicata, onde a precisão foi
expressa por meio do desvio padrão relativo (DPR), conforme Equação 17.
3.7.2.6 Robustez
Os ensaios de robustez foram realizados variando os dias das análises e seus
resultados expressos da mesma forma que a exatidão.
3.7.3 Análises de pimentas comerciais
As pimentas Malagueta e Habanero foram adquiridas em conserva. Seu
preparo se deu por meio da maceração dos frutos de cada uma das pimentas, e uma
breve extração das mesmas. As pimentas foram maceradas e pesadas (m @ 1,2g), e
em seguida, adicionaram-se 3 mL de metanol, deixando no ultrassom por 30 min. As
amostras foram então filtradas e submetidas a análises de RMN de 1H.
Para as pimentas Bhut Jolokia, Trinidad Scorpion e Carolina Reaper, as
amostras adquiridas já estavam maceradas e em conserva, assemelhando-se à
molhos de pimenta extrafortes. Assim sendo, seu preparo se deu por meio da
pesagem de, aproximadamente, 0,2 g de amostra e sua posterior extração com 1 mL
de metanol, tendo como auxílio o uso do ultrassom. As amostras foram então, filtradas
e também submetidas à análise de RMN de 1H.
60
A integração foi feita para o sinal da capsaicina em pimentas comerciais, com
deslocamento químico (d) igual a 5,4 ppm, referente aos hidrogênios da insaturação.
Dessa forma, os resultados obtidos foram aplicados à equação da curva de calibração,
resultando assim na concentração de cada amostra analisada.
61
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Extração dos Capsaicinóides
A extração dos capsaicinóides foi feita a partir da amostra in natura de pimenta
malagueta. Dessa forma, como esse tipo de amostra possui bastante água em sua
composição, fez-se necessário o processo de secagem da mesma. Como resultado,
observou-se a perda de aproximadamente 57% em massa, correspondendo à água
presente na amostra. O processo de extração foi desenvolvido utilizando metanol
como solvente e com o auxílio de uma cuba ultrassônica. Após essa etapa, a amostra
foi filtrada, rotaevaporada, submetida à análise de CG-EM, e o resultado está
demonstrado na Figura 20, onde observa-se a presença de 3 picos intensos na região
de tr = 25 – 26,5 min, que segundo a biblioteca NIST corresponde aos capsaicinóides.
Os demais picos existentes no cromatograma são referentes a “impurezas” ainda
presentes na fração analisada.
Figura 20. Cromatograma do extrato metanólico obtido da pimenta malagueta, na concentração de
4000 ppm.
A Figura 21 mostra uma aproximação da região contendo os capsaicinóides e
revela a presença de dois picos mais proeminentes, e outros picos menores. Dessa
forma, usando como base a biblioteca NIST, nota-se que três picos presentes no
intervalo de 24 a 26 min (Figura 21) correspondem aos capsaicinóides: nonivamida
(24,9 min), capsaicina (25,6 min) e dihidrocapsaicina (25,8 min), conforme mostra a
Figura 22 obtida da análise do espectrômetro de massas.
62
Figura 21. Aproximação do cromatograma do extrato metanólico, no intervalo de 23,4 min a 28,4 min.
Figura 22. Resultado do espectro de massas obtido das análises de CG-EM para o extrato metanólico.
(mainlib) Nonivamide80 120 160 200 240 280 320 360 400 440
0
50
100
57 94
137
151
178
195
208 237 264
293
NH
O
O
OH
(mainlib) Capsaicin60 90 120 150 180 210 240 270 300 330
0
50
100
55 69 94122
137
152
168 195220 262
305
OHO
NH
O
(mainlib) Dihydrocapsaicin80 120 160 200 240 280 320 360 400 440
0
50
100
5577 94
122
137
151
178195
208 234 264
307
O
HONH
O
NH
OCH3HO
ONH
OCH3
HO
O
NH
OCH3
HO
O
Nonivamida
Capsaicina
Dihidrocapsaicina
Capsaicina
Dihidrocapsaicina
Nonivamida
63
4.2 Purificação dos Capsaicinóides
Identificados os analitos de interesse, procedeu-se para a etapa de purificação
dos mesmos, de modo a isolá-los. Assim, após algumas análises de CCD do extrato
metanólico, observou-se que um gradiente de hexano:acetato de etila auxiliaria na
purificação do extrato. Dessa forma, prosseguiu-se para a purificação utilizando a
cromatografia em coluna. O acompanhamento da coluna foi feito por CCD e as frações
contendo o mesmo tempo de retenção (tr) foram unidas e novamente analisadas por
CG-EM. A CCD revelou que em hexano:acetato de etila (7:3) os capsaicinóides
possuem tr = 0,24.
A Figura 23 é referente ao cromatograma da fração contendo os
capsaicinóides. Observa-se, portanto, que houve uma “pré-purificação” dos
capsaicinóides, uma vez que, o cromatograma que antes aparecia com diversos picos,
agora aparece apenas com os picos referente aos capsaicinóides.
Figura 23. Cromatograma de CG-EM da fração contendo os capsaicinóides.
Dessa forma, ainda foram feitos alguns testes alterando eluentes, suas
proporções e tamanho de coluna, na tentativa de encontrar uma condição adequada
que separasse os capsaicinóides apenas por cromatografia em coluna. Contudo,
verificou-se que os capsaicinóides sempre estavam na mesma fração coletada. Isso
ocorre porque suas estruturas são muito semelhantes, variando apenas na presença
de uma ou outra insaturação, bem como na presença de um ou outro substituinte na
cadeia alifática presente, e isso faz com que eles apresentem tempo de retenção
64
muito próximos.
Por esse motivo, fez-se necessário o uso da Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) para auxiliar no isolamento e purificação dos capsaicinóides.
4.3 Separação dos capsaicinóides
A CLAE é utilizada para diversos fins, e dentre eles está o isolamento de
compostos. Esse procedimento é, principalmente, realizado em equipamentos que
contém uma coluna preparativa, onde o volume de amostra injetado e coletado é
maior. Por essa razão, utilizou-se a CLAE para separação dos capsaicinóides.
Tendo como referência o trabalho de Babu et al. (2014)44, foi desenvolvido o
método para separação dos capsaicinóides e estes foram coletados separadamente.
A Figura 24 mostra o cromatograma obtido da CLAE, utilizado na separação dos
capsaicinóides. Em seguida, procedeu-se para eliminação do solvente e os
compostos foram isolados, obtendo três capsaicinóides: a capsaicina, a
dihidrocapsaicina, e um terceiro capsaicinóide que, segundo a biblioteca NIST,
correspondia à nonivamida, o que posteriormente, foi confrontado com à análise de
RMN de 1H do mesmo. A caracterização de cada composto se deu por meio da técnica
de RMN de 1H.
Figura 24. Cromatograma obtido do CLAE da fração contendo os capsaicinóides e utilizado para a
etapa de purificação dos mesmos.
Minutos0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
mAU
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
mAU
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
MWD: Sinal B, 282 nm/Lb:4 nm Ref 360 nm/Lb:100 nmPimenta 7_Met3
65
4.4 Análises de RMN
Após a obtenção dos capsaicinóides isolados, procedeu-se para caracterização
dos mesmos, a qual foi realizada por RMN de 1H. Uma dificuldade encontrada durante
as análises foi a solubilização das amostras, e por isso foram feitos alguns testes de
solubilidade. Observou-se, portanto, que as amostras eram parcialmente solúveis em
metanol. Dessa forma, tendo em vista análises futuras a serem realizadas com
amostras comerciais, as quais possuem água em sua composição, as análises foram
realizadas utilizando-se água ultrapura e metanol de grau HPLC (1:1), como solvente.
A Figura 25 mostra os espectros da capsaicina (b) e da dihidrocapsaicina (a)
obtidos isoladamente, sem o uso de solvente deuterado.
Figura 25. RMN de 1H da (a) dihidrocapsaicina e (b) capsaicina, sem uso de solvente deuterado.
Todos os capsaicinóides possuem o mesmo grupo vanilamida variando apenas
na cadeia alifática lateral. Portanto, os sinais referentes aos hidrogênios do anel
aromático (H1 a H3) aparecerão sempre na mesma região (d = 6,5 – 7,0 ppm), para
qualquer capsaicinóide estudado, conforme é observado na Figura 25. A Figura 26
a)
b)
Capsaicina
Dihidrocapsaicina
66
mostra o espectro de RMN de 1H da capsaicina contendo as integrações, a expansão
das regiões de mais difícil visualização, os valores dos deslocamentos químicos, a
multiplicidade e os valores de integração, os quais também estão sumarizados na
Tabela 3. Já a Figura 27 e a Tabela 4 possuem os mesmos dados demonstrados na
figura e tabela citadas anteriormente, porém, mostrando os resultados para a análise
RMN de 1H da dihidrocapsaicina.
Figura 26. RMN de 1H da capsaicina contendo os valores das integrais, deslocamento químico e expansão das regiões de interesse.
Tabela 3. Atribuição dos sinais obtidos da análise de RMN de 1H para a capsaicina.
Deslocamento Químico (δ, ppm) Multiplicidade Integração Hidrogênios correspondentes na
estrutura
1,00 dupleto 5,74 H12 e H13 1,22 multipleto 0,66 H11 1,41 quintupleto 2,28 H7 1,66 quintupleto 2,25 H6 2,02 quadrupleto 2,05 H8 2,26 tripleto 2,65 H5 3,87 singleto 2,97 H14 4,30 singleto 2,00 H4
67
5,40 multipleto 2,19 H9 e H10 6,77 multipleto 2,04 H2 eH3 6,90 singleto 1,00 H1
Figura 27. RMN de 1H da dihidrocapsaicina contendo os valores das integrais, deslocamento químico e expansão das regiões de interesse.
Tabela 4. Atribuição dos sinais obtidos da análise de RMN de 1H para a dihidrocapsaicina.
Deslocamento Químico (δ, ppm) Multiplicidade Integração Hidrogênios correspondentes na
estrutura
0,92 dupleto 5,98 H12 e H13 1,23 multipleto 1,23 H10 1,33 multipleto 5,90 H7, H8 e H9 1,55 octupleto 1,28 H11 1,66 quintupleto 2,10 H6 2,26 tripleto 2,11 H5 3,88 singleto 2,90 H14 4,30 singleto 1,96 H4 6,77 multipleto 1,96 H2 eH3 6,91 singleto 1,00 H1
68
Em 5,4 ppm (Figura 26) temos um multipleto correspondente à insaturação
presente na estrutura da capsaicina. Nota-se, portanto, que esse sinal é um diferencial
entre esses dois capsaicinóides. Em 4,8 ppm temos a presença do sinal referente aos
hidrogênios da água. Como foram utilizados água e metanol não-deuterado como
solvente, durante a realização das análises foi feita a saturação do sinal da água. O
sinal do metanol aparece em 3,3 ppm. Os hidrogênios H4 e H14, em 4,3 ppm e 3,87
ppm, respectivamente, também são comuns a todos os capsaicinóides, uma vez que
fazem parte do grupo vanilamida. Em 2,26 ppm temos um tripleto, correspondente ao
H5, o qual é referente à um CH2 a-carbonílico vizinho a outro CH2. Na região de 0 –
2,0 ppm, encontram-se os hidrogênios alifáticos, e portanto, será a região que haverá
maior alteração de valores de deslocamentos químicos e presença de multiplicidade
diferentes, uma vez que os capsaicinóides variam em quantidade de carbonos e
presença ou ausência de insaturação nessa região. Próximo de 1,0 ppm, nota-se a
presença de um dupleto e que integra para seis hidrogênios, ou seja, corresponde à
dois CH3, vizinhos à um CH, característicos das duas metilas presentes na
extremidade da cadeia lateral.
Baseado na última afirmação feita, e após a análise de RMN de 1H do outro
capsaicinóide encontrado (Figura 28), nota-se que o mesmo não pode referir-se à
nonivamida, segundo indica a biblioteca NIST. Conforme se observa na estrutura da
nonivamida (Figura 2), sua cadeia lateral não contém ramificações, e o espectro da
Figura 28 possui um dupleto em 0,7 ppm, o qual integra para seis hidrogênios, sendo,
portanto, referente à dois CH3 ligados a um CH. Dessa forma, o espectro apresentado
na Figura 28 não pode referir-se à nonivamida. Nota-se também que em 0,8 ppm
existe um outro dupleto, de intensidade menor, o qual indica que esse composto ainda
não está puro.
69
Figura 28. RMN de 1H do outro capsaicinóide encontrado, sem uso de solvente deuterado.
Foram feitos também os espectros de 13C dos capsaicinóides, conforme mostra
as Figuras de 29 a 31. A Figura 29 mostra o espectro de 13C da capsaicina, o qual é
indicado pela quantidade de sinais presentes no espectro, mostrando que o analito
em questão possui 18 carbonos, conferindo portanto com a fórmula molecular (FM)
da capsaicina (C18H27NO3). A Figura 30 mostra o espectro de 13C da
dihidrocapsaicina, de maneira que, semelhante à análise feita para a capsaicina,
temos que a Figura 30 também apresenta 18 carbonos, conferindo, portanto, com a
FM da dihidrocapsaicina (C18H29NO3). Dessa forma, o fator que difere os dois
espectros (Figuras 29 e 30) e os atribuem respectivamente, à capsaicina e à
dihidrocapsaicina, é quantidade de sinais presentes na região de carbonos alifáticos
(d = 20-55 ppm) e aqueles presentes na região de aromáticos e carbonos insaturados.
A Figura 30 revela a presença de uma maior quantidade de carbonos na região de d
= 20-55 ppm do que àqueles presentes na Figura 29. Dessa forma, como a
dihidrocapsaicina possui maior quantidade de carbonos alifáticos, atribui-se o
espectro de RMN de 13C presente na Figura 30 à estrutura da dihidrocapsaicina.
Consequentemente, o espectro de RMN de 13C presente na Figura 29 corresponde à
70
capsaicina. Entretanto, para o espectro de RMN de 13C presente na Figura 31, nota-
se que não foram identificados sinais, dificultando, portanto, a elucidação estrutural
do capsaicinóide desconhecido. A ausência de sinais nesse espectro pode ter ocorrido
devido à baixa solubilidade desse composto no solvente utilizado, e devido à baixa
quantidade de massa utilizada.
Dessa forma, prosseguiu-se para os demais ensaios apenas com a capsaicina
e a dihidrocapsaicina, as quais possuem suas estruturas confirmadas através dos
espectros de RMN de 1H e 13C (Figuras 25-27, 29 e 30). Sendo assim, por serem
também os componentes majoritários dentre os capsaicinóides, correspondendo à
cerca de 90% dos capsaicinóides presentes no fruto, a capsaicina e a
dihidrocapsaicina foram isoladas em maior quantidade e escolhidas para as análises
de RMN quantitativa.35,42
Figura 29. RMN de 13C da capsaicina.
Capsaicina
71
Figura 30. RMN de 13C da dihidrocapsaicina.
Figura 31. RMN de 13C do capsaicinóide não identificado.
Dihidrocapsaicina
72
4.4.1 RMN quantitativo
O método de validação para a análise quantitativa dos capsaicinóides
presentes em pimentas comerciais foi desenvolvido baseado resolução no 166 da
ANVISA.91
4.4.1.1 Seletividade
Com intuito de verificar a seletividade do método, foram obtidos e sobrepostos
os espectros de RMN de 1H para cada um dos padrões e do ácido maleico, conforme
Figura 32. Nota-se, portanto, sinais não sobrepostos em 2,0 ppm e 5,4 ppm, para a
capsaicina, e 1,5 ppm para a dihidrocapsaicina.
Figura 32. Sobreposição dos espectros de RMN de 1H da capsaicina, dihidrocapsaicina e do ácido
maleico, mostrando a seletividade do método.
NH
OCH3
HO
O
NH
OCH3HO
O
O
OH
O
OHCapsaicina Dihidrocapsaicina
Ácido Maleico
73
Dessa forma, para avaliar a aplicação do método, a Figura 33 mostra um
espectro da pimenta malagueta, onde o intervalo de 1,0 – 5,2 ppm apresenta grande
sobreposição de sinais, referente a outros compostos presentes em amostras de
pimentas comerciais, tais como: vitaminas, carotenoides, ácidos graxos e outros. Essa
região, portanto, não será adequada para quantificação dos capsaicinóides. Contudo,
em 5,4 ppm (Figura 32), observa-se a presença do sinal referente à insaturação da
capsaicina, o qual não apresenta sobreposição de sinais. Sendo assim, baseado nos
requisitos para a seletividade, este sinal foi um dos escolhidos para avaliação do
método. Outro sinal avaliado foi aquele presente em 6,7 ppm (Figura 32), referente
aos hidrogênios aromáticos presentes nas estruturas dos capsaicinóides (H2 e H3). A
integração realizada nessa área envolve a quantificação conjunta dessa classe de
compostos.
Figura 33. Espectro de RMN de 1H da pimenta malagueta para comparação e confirmação da
seletividade.
Sinais utilizados
para integração
74
4.4.1.2 Linearidade
Este parâmetro foi avaliado com base na construção da curva de calibração
para a capsaicina e a dihidrocapsaicina, em seis concentrações diferentes, em um
intervalo de 0,5 a 5 mg.mL-1, conforme mostra a Figura 34. O coeficiente de
determinação (R2) foi então obtido, e por conseguinte, o coeficiente de correlação (R)
pôde ser calculado. Como resultado, a capsaicina apresentou R = 0,9967 (5,4 ppm) e
R = 0,9925 (6,7 ppm), e a dihidrocapsaicina R = 0,9901 (6,7 ppm), ambos dentro do
valor exigido pelo órgão de regulamentação. Vários outros autores utilizam técnicas
cromatográficas para esse processo de avaliação, e como resultado, obtiveram
valores de R em torno de 0,992.17, 27,38,42,57,97-100 Dessa forma, nota-se que o
coeficiente de correlação obtido da RMNq foi tão bom quanto aqueles obtidos por
meio das técnicas cromatográficas. Contudo, a linearidade também precisa ser
avaliada com base na obtenção do teste da Análise das Variâncias (ANOVA) e
também pela obtenção do gráfico de dispersão dos resíduos. Sendo assim, a Figura
35 mostra o gráfico de dispersão dos resíduos e a Tabela 5 mostra a análise ANOVA
da regressão para a capsaicina (5,4 ppm e 6,7 ppm) e para a dihidrocapsaicina (6,7
ppm). A Tabela 5 mostra também o valor obtido para o teste de Cochran, com o intuito
de avaliar a homocedasticidade dos dados.
O resultado obtido do Teste de Cochran mostra que os valores calculados para
a homocedasticidade são menores do que o valor teórico, mostrando portanto, que o
método é adequado para a finalidade pretendida, confirmando o caráter
homocedástico dos gráficos de dispersão de resíduos apresentados na Figura 35. A
Tabela 5 também mostra a significância estatística da regressão, a qual é expressa
pelo valor de F, onde Fcalculado > Ftabelado. Dessa forma, é possível rejeitar a hipótese
nula e aceitar a hipótese alternativa, mostrando a existência de uma correlação
significativa entre a concentração e a razão entre as integrações do analito e do
padrão interno.
Sendo assim, diante dos resultados apresentados, nota-se que o uso de
solventes não deuterados não afetou a linearidade do método. Isso ocorre porque a
área do sinal é diretamente proporcional a quantidade de núcleos que absorvem
naquela radiofrequência. Desta forma, o uso de solventes não deuterados, não
interferirá na quantificação.
75
Figura 34. Curva de calibração da capsaicina
obtida da análise do sinal com deslocamento
químico igual a 5,4 ppm (a) e 6,7 ppm (b), e da
dihidrocapsaicina em 6,7 ppm (c).
Figura 35. Gráfico de dispersão dos resíduos
para a capsaicina em 5,4 ppm (a) e 6,7 ppm (b),
e para a dihidrocapsaicina em 6,7 ppm (c).
Tabela 5. Análise das Variâncias (ANOVA) da regressão.
Deslocamento Químico (d)
Grau de Liberdade
Soma Quadrática
Média Quadrática F Homocedasticidade
Capsaicina
5,4 ppm Regressão 1 3,205 3,205 2412 0,298 Residual 16 0,021 1,3 x 10-3
Total 17 3,226
6,7 ppm Regressão 1 0,297 0,297 1052 0,372 Residual 16 4,5 x 10-3 2,8 x 10-4
Total 17 0,302
Dihidrocapsaicina 6,7 ppm Regressão 1 0,250 0,250 792.3 0,351 Residual 16 5,0 x 10-3 3,1 x 10-4
Total 17 0,255 Valores tabelados 4,494 0,616
y = 0,2615x + 1,3368R² = 0,9934
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0,0 2,0 4,0 6,0∫H c
apsa
icin
a / ∫
H a
c.
mal
eico
Concentração (mg.mL-1)
y = 0,0796x + 1,2812R² = 0,985
0,00,51,01,52,02,5
0,0 2,0 4,0 6,0
∫H c
apsa
icin
a / ∫
H a
c.
mal
eico
Concentração (mg.mL-1 )
y = 0,0726x + 1,2062R² = 0,9802
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,0 2,0 4,0 6,0∫H d
ihid
roca
psai
cina
/ ∫H
ac
. mal
eico
Concentração (mg .mL-1 )
-0,08
-0,04
0
0,04
0,08
0 2 4 6Res
idua
is
Concentração
-0,04
-0,02
0
0,02
0,04
0 2 4 6Res
idua
is
Concentração
-0,04
-0,02
0
0,02
0,04
0 2 4 6Res
idua
is
Concentração
a)
b)
c)
a)
b)
c)
76
4.4.1.3 Limites de Detecção e Quantificação
Segundo a ANVISA,91 os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) podem
ser obtidos tanto através da relação entre sinal-ruído quanto por meio da curva de
calibração obtida da linearidade. Dessa forma, os LD e LQ para a capsaicina e a
dihidrocapsaicina foram obtidos estatisticamente a partir da curva de calibração, e os
resultados estão dispostos na Tabela 6.
Tabela 6. Valores de Limites de Detecção e Quantificação para a capsaicina e a dihidrocapsaicina
obtida da análise de RMN de 1H, utilizando solvente não deuterado.
Analito Deslocamento Químico (ppm)
Limite de Detecção (mg.mL-1)
Limite de Quantificação (mg.mL-1)
Capsaicina 5,4 0,639 1,076 6,7 0,960 2,246
Dihidrocapsaicina 6,7 1,111 2,633
Com base nos resultados obtidos, nota-se que o LD e o LQ são maiores do que
a concentração mínima utilizada. Isso também é confirmado por meio das equações
da reta (y = a1.x + a0) obtidas da curva de calibração, onde o coeficiente linear (a0) é
relativamente alto, influenciando no LQ. No entanto, tanto os resultados obtidos para
o LD quanto aqueles obtidos para o LQ, apresentam-se dentro da faixa linear de
trabalho (0,5 – 5,0 mg mL-1). Dessa forma, como o LD e o LQ para a capsaicina em
5,4 ppm é menor, essa região de integração foi escolhida para cálculos envolvendo a
aplicação do método para as pimentas comerciais.
4.4.1.4 Exatidão
A exatidão foi determinada com base na análise, de três pontos utilizados para
a construção da curva de calibração, sendo eles: 0,5 mg.mL-1 (Ponto 1), 3,0 mg.mL-1
(Ponto 4) e 5,0 mg.mL-1 (Ponto 6). Estes pontos representam as concentrações baixa,
média e alta utilizadas na validação do método. Os resultados estão descritos na
Tabela 7.
Dessa forma, observa-se que o Ponto 1 apresenta erros significativos,
próximos ou maiores do que 5%, podendo ser atribuídos aos valores de LQ, uma vez
que a concentração avaliada está abaixo do LQ calculado. Quanto ao ponto 4, nota-
77
se que a validação do método baseada na integração do sinal em 6,7 ppm para ambos
os capsaicinóides apresentaram bons resultados, possuindo erros próximos de 3%.
Entretanto, a integração do Ponto 4 baseada no deslocamento químico de 5,4 ppm da
capsaicina, pode não ser tão exata, uma vez que esta apresentou erro maior do que
5%. Esses erros podem estar associados à etapa de diluição da amostra, para
obtenção das concentrações menores. Quanto ao Ponto 6, observa-se boa exatidão
nas análises desenvolvidas, uma vez que o erro máximo foi da ordem de 3%. Isso
pode ser atribuído à alta concentração presente nessa solução, a qual é maior do que
os valores calculados para LD e LQ (Tabela 6).
Tabela 7. Valores de exatidão (em %) para os analitos em baixa, média e alta concentração.
Analito Deslocamento Químico (ppm) Concentração [mg.mL-1 (%)]
0,5 3,0 5,0
Capsaicina 5,4 95,5 108,0 97,1 6,7 85,2 102,8 98,8
Dihidrocapsaicina 6,7 96,7 96,8 100,4
4.4.1.5 Precisão
O cálculo da precisão foi realizado baseado no parâmetro de repetibilidade,
conforme recomenda a ANVISA, em sua resolução no 166 de 2017.91 Dessa forma,
foram utilizadas nove determinações, sendo analisados os mesmos três pontos da
curva de calibração utilizados na obtenção da exatidão (1, 4 e 6). Estes, por sua vez,
foram analisados em triplicata e cada análise foi realizada também em triplicata. Os
resultados foram então, expressos pelo desvio padrão relativo (DPR), conforme
descrito na Tabela 8, e segundo a Equação 17.
Tabela 8. Valores de DPR (em %) para os analitos em baixa, média e alta concentração utilizados nos
ensaios de precisão.
Analito Deslocamento Químico (ppm) Concentração [mg.mL-1 (% DPR)]
0,5 3,0 5,0
Capsaicina 5,4 0,84 0,39 0,33 6,7 0,89 1,00 0,57
Dihidrocapsaicina 6,7 1,09 1,00 0,98
78
Observa-se, portanto, que todos os desvios ficaram abaixo de 1,10%. Sendo
assim, o método mostrou-se preciso para ambos os analitos, uma vez que a Anvisa
regulamenta um máximo de 5%. Kuzma et al. (2014)42 obtiveram resultados menores
que 2,5% para a precisão, em análises desenvolvidas com a CLAE, e González-
Zamora et al. (2013)17 obtiveram precisão de 5% também utilizando a CLAE. Peña-
Alvarez et al. (2009)37 obtiveram DPR < 8% com análises realizadas através de
cromatografia gasosa acoplada à um espectrômetro de massas. Sendo assim, diante
dos resultados apresentados na literatura, nota-se que o método avaliado de RMNq
apresentou valores excelentes de precisão.
4.4.1.6 Robustez
A avaliação da robustez do método foi desenvolvida com base na análise, em
dias diferentes, das mesmas amostras utilizadas para obtenção da exatidão e
precisão (Pontos 1, 4 e 6). Por 1 mês, as amostras foram estocadas na geladeira à
temperatura de -3 °C, e após esse período, foram novamente analisadas. Então, as
integrações foram mais uma vez obtidas e os resultados foram comparados, conforme
mostra a Tabela 9.
Tabela 9. Valores das integrais dos sinais das soluções de capsaicina e dihidrocapsaicina, para avaliação da robustez.
Analito Deslocamento
Químico (ppm)
1ª análise 2ª análise (1 mês depois)
Ponto 1 Ponto 4 Ponto 6 Ponto 1 Ponto 4 Ponto 6
Capsaicina 5,4 1,46 2,20 2,62 1,46 2,21 2,60 6,7 1,31 1,53 1,68 1,33 1,52 1,66
Dihidrocapsaicina 6,7 1,24 1,42 1,58 1,25 1,41 1,55
A partir dos resultados apresentados, nota-se uma variação mínima nos valores
obtidos para as áreas dos analitos. Isso mostra que a variação de dias e/ou de
temperatura, influenciarão minimamente no método proposto para a RMNq,
evidenciando sua robustez.
79
4.4.2 Quantificação dos capsaicinóides em pimentas comerciais e avaliação de pungência
O método de quantificação proposto, por RMN de 1H sem uso de solvente
deuterado, foi aplicado à 5 tipos de pimentas adquiridas comercialmente, sendo elas:
Malagueta, Habanero, Bhut Jolokia, Trinidad Scorpion e Carolina Reaper. A
concentração obtida para cada uma, foi calculada baseando-se na integração e
obtenção do teor de capsaicina em relação à integração do ácido maleico, utilizado
como padrão interno. Para isto, a integração e os cálculos foram feitos através da
curva de calibração (y = 0,2615x + 1,3368) obtida para o sinal em 5,4 ppm, uma vez
que não foram identificados sinais que o sobrepõe. A concentração experimental
(Cexp) foi obtida por meio da equação da reta, em mg.mL-1. Para o cálculo da Unidade
de Calor de Scoville (SHU), fez-se necessário obter a proporção de capsaicina (em
gramas por grama de amostra de pimenta), e então multiplicá-la pelo fator de calor da
capsaicina, 16,1 x 106.41 Assim sendo, a Tabela 10 mostra os resultados obtidos para
as análises das Pimentas Malagueta e Habanero, compradas em conserva, bem como
os resultados obtidos da análise de molhos das Pimentas Bhut Jolokia, Trinidad
Scorpion e Carolina Reaper. A Tabela 10 também dispõe os valores de SHU
calculados, e aqueles previamente reportados em outros trabalhos. Contudo, os
valores referenciados foram utilizados apenas para efeito de comparação. É preciso
levar em consideração que esses trabalhos foram feitos utilizando o fruto fresco e
cultivado pelos grupos de pesquisa que desenvolveram o trabalho.
Tabela 10. Valores de SHU calculados para 5 tipos de pimentas comerciais.
Tipo de Pimenta Integração Cexp.
(mg.mL-1)
Quantidade de capsaicina (g/g de
amostra) SHU*
Valores de SHU reportados na
literatura** Pimenta
Malagueta 1,54 0,7771 0,0020 31.481 164.000 [101]
Habanero 2,13 3,0333 0,0076 121.633 100.000 - 350.000 [102]
Bhut Jolokia 1,96 2,3832 0,0119 190.986 879.953 - 927.199 [103]
Trinidad Scorpion 2,03 2,6509 0,0133 214.359 1.029.271 [104]
Carolina Reaper 2,21 3,3392 0,0158 254.310 1.046.000 [105]
* Valores calculados para frutos em conserva e molhos. ** Valores calculados para frutos frescos, in natura.
80
Os valores obtidos de SHU, por meio da técnica de RMN de 1H, e os valores
reportados na literatura não podem ser diretamente comparados, porque um é
referente ao fruto em conserva ou molho e o outro refere-se ao fruto fresco, in natura.
O fruto fresco possui uma concentração muito maior de capsaicinóides do que o molho
de pimenta ou a pimenta em conserva, e consequentemente, maior SHU. Os molhos
e pimentas em conservas “perdem” quantidade de capsaicinóides para o meio, ou até
mesmo, como no caso dos molhos, pelo fator diluição. Isso justifica os resultados
encontrados para SHU. Entretanto, através dos valores reportados na literatura é
possível observar uma escala de pungência, onde a pimenta Carolina Reaper mostra-
se como sendo a mais pungente, seguida da Trinidad Scorpion, da Bhut Jolokia, da
Habanero, e por último, da Malagueta. Dessa forma, ao analisar os valores de SHU
obtidos através do método proposto, nota-se que esses valores obedecem à mesma
escala de pungência. Sendo assim, ante aos resultados obtidos para aplicação do
método, observa-se que a RMNq também pode ser usada como um instrumento de
medição de pungência de produtos à base de pimenta.
81
5 CONCLUSÃO
A pesquisa desenvolvida cumpriu com o objetivo proposto de estudar os
produtos à base de pimenta por análises qualitativas e quantitativas de RMN sem o
uso de solventes deuterado.
Primeiramente, foi utilizado um método simples e rápido de extração dos
capsaicinóides utilizando técnica de maceração e uso de uma cuba ultrassônica para
auxiliar na extração, e como solvente extrator foi utilizado o metanol. A extração dos
capsaicinóides foi feita utilizando uma amostra de pimenta malagueta obtida
comercialmente.
Para purificação dos capsaicinóides foi necessário utilizar duas etapas de
purificação, sendo a primeira etapa referente à uma “pré-purificação” realizada por
cromatografia em coluna. Essa etapa foi importante, porque foi possível eliminar todos
os demais compostos presentes nas pimentas, tais como: vitaminas, carotenoides,
ácidos graxos, e outros, deixando os capsaicinóides presentes em uma única fração.
E a outra etapa de purificação foi desenvolvida pela CLAE, originando 3 frações
isoladas. Cabe ressaltar que, após algumas tentativas de diferentes métodos para
encontrar a melhor condição para isolamento dos capsaicinóides, foi utilizado uma
coluna cromatográfica C18 (21.2 x 250 mm, 7µm de diâmetro de partícula), o detector
foi configurado para um comprimento de onda de 280 nm, o fluxo foi configurado para
9,0 mL.min-1, e como fase móvel foi utilizado acetonitrila e água destilada ultrapura na
proporção 55:45.
As análises qualitativas foram desenvolvidas por CG-EM e RMN, onde foram
confirmadas a obtenção da capsaicina e da dihidrocapsaicina em sua forma pura. Foi
descoberto também que a nonivamida, apontada pela NIST nas análises de CG-EM
como uma possível estrutura para o terceiro capsaicinóide, na realidade não
corresponde propriamente à nonivamida, e sim, a outro capsaicinóide. Contudo, este
ainda não foi identificado.
No que diz respeito ao uso da RMNq de 1H para quantificação, nota-se que
esta pode ser uma ferramenta quantitativa tão boa quanto às demais, e ainda
possuindo algumas vantagens tais como: análises rápidas, sem laborioso preparo de
amostra, identifica compostos em uma mesma matriz sem precisar de padrões
químicos idênticos, produz resultados qualitativos e quantitativos simultaneamente,
82
além das análises terem sido feitas sem o uso de solvente deuterado.
Quanto ao processo de validação do método, este apresentou excelente
linearidade com coeficiente de correlação (R), em torno de 0,9967, boa exatidão para
amostras com concentração maiores do que 3 mg.mL-1, com uma faixa de erro em
torno de 3%, boa robustez com variação mínima mesmo em análises feitas com
amostras estocadas na geladeira durante 1 mês, boa precisão (<1,1%), e, limites
detecção e quantificação variando entre 0,639 mg.mL-1 e 2,633 mg.mL-1,
respectivamente. O LD e o LQ são quesitos que ainda precisam melhorar. Contudo,
essa baixa sensibilidade é propriedade intrínseca da técnica. No entanto, tendo em
vista que as análises foram feitas sem o uso de solventes deuterado, é possível dizer
que os resultados apresentados foram bons.
Por fim, a RMN também pode ser utilizada para determinação da pungência de
pimentas comerciais tais como pimentas Malagueta, Habanero, Bhut Jolokia, Trinidad
Scorpion e Carolina Reaper, obtidas comercialmente, e também na atribuição de seus
respectivos valores de SHU.
83
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