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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIAS PARA A SUSTENTABILIDADE
CAMPUS DE SOROCABA
PROGRAMA DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA PLENA EM FÍSICA
ADRIANO MORAES AMARANTE
ESTUDO DE ESTRUTURAS MULTIMÉRICAS DA ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE CARBOXYLTRANSFERASE 2 USANDO DINÂMICA
MOLECULAR
Sorocaba 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIAS PARA A SUSTENTABILIDADE
CAMPUS DE SOROCABA
PROGRAMA DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA PLENA EM FÍSICA
ADRIANO MORAES AMARANTE
ESTUDO DE ESTRUTURAS MULTIMÉRICAS DA ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE CARBOXYLTRANSFERASE 2 USANDO DINÂMICA
MOLECULAR
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Licenciatura Plena em Física. Orientação: Prof. Dr. Fábio de Lima
Leite Co-Orientação: Dr. Guedmiller Souza
de Oliveira
Sorocaba 2013
iv
Ficha Catalográfica
Amarante, Adriano Moraes
Estudo de Estruturas Multiméricas da Enzima Acetil-Coa
Carboxilase Carboxyltransferase 2 Usando Dinâmica
Molecular/ Adriano Moraes Amarante. – – Sorocaba, 2013
46 f. : il. ; 28 cm
Trabalho de Conclusão do Curso de Licenciatura em Física -
UFSCar, Campus Sorocaba, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Fábio de Lima Leite.
Co-Orientador: Dr. Guedmiller Souza de Oliveira
Banca examinadora: Prof. Dr. Fábio de Lima Leite , Prof. Dr.
Tersio Guilherme de Souza Cruz e Prof. Dr. Sérgio Dias
Campos
Bibliografia
1. Dinâmica Molecular. 2 AFM. 3 Enzima ACC. I. Título. II.
Sorocaba-Universidade Federal de São Carlos.
CDD 530
ADRIANO MORAES AMARANTE
ESTUDO DE ESTRUTURAS MULTIMÉRICAS DA ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE CARBOXYLTRANSFERASE 2 USANDO DINÂMICA
MOLECULAR
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como exigência parcial para
obtenção do grau de licenciado no curso de Física – Licenciatura Plena, da
Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba.
Sorocaba, 05 de dezembro de 2013.
Orientador:________________________________
Prof. Dr. Fábio de Lima Leite
Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba
Examinador:_____________________________
Prof. Dr. Tersio Guilherme de Souza Cruz
Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba
Examinador:_______________________________
Prof. Dr. Sérgio Dias Campos
Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba
vi
viii
Aos meus pais Herculano e Sonia.
x
“May the Force be with you”
Yoda
xii
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Herculano e Sonia, e aos meus irmãos Juliano e Natália
pelo apoio incondicional e presença na minha vida a todo o momento.
Agradeço a minha querida avó Lourdes por todo apoio na vida estudantil e
carinho que teve por mim em vida.
Agradeço aos meus mentores e amigos Fábio e Guedmiller por toda confiança e
ensinamentos de vida e profissionais.
Agradeço a todo grupo de NanoNeuroBioFísica que faço parte na UFSCar-SO por
todo apoio.
Agradeço aos meus professores da UFSCar-Sorocaba pelos conhecimentos
transmitidos, apoio e confiança depositada.
Agradeço a todos os meus amigos e companheiros que estiveram comigo nesse
período tão importante da minha vida.
Agradeço, enfim, a todos aqueles que sempre estiveram por perto e que me
ajudaram a chegar aonde cheguei.
xiv
RESUMO
Nanobiossensores são sensores biológicos com a sensibilidade e a
seletividade na nanoescala (compreendidos na escala de 1-100 nm). A resolução
em detecção de forças em microscopia de força atômica (AFM, do inglês Atomic
Force Microscopy) pode ser menor do que a magnitude da ligação química mais
fraca, o que torna possível investigar interações moleculares específicas
baseadas em pontas de AFM funcionalizadas. O objetivo deste trabalho foi
descrever e elucidar as estruturas multiméricas da enzima Acetil-CoA Carboxilase
Carboxiltransferase 2 (ACC 2) utilizando metodologias de simulação
computacional. As simulações computacionais foram usadas para investigar
propriedades termodinâmicas e estruturais destes sistemas químicos complexos
para aplicação direta no desenvolvimento de nanobiossensores e novas
metodologias de funcionalização química de pontas de AFM.
Palavras Chave: Dinâmica Molecular. AFM. Enzima ACC. Estruturas multiméricas
de proteínas.
xvi
ABSTRACT
Nanobiosensors are biological with the sensitivity and selectivity at the
nanoscale sensors (included in the range of 1-100 nm). The resolution in detection
of forces in atomic force microscopy (AFM) can be smaller than the magnitude of
the weaker chemical bond, which makes it possible to investigate specific
molecular interactions based on functionalized chemical AFM tips., The aim of this
work is to describe and elucidate the multimeric structures of the enzyme acetyl -
CoA carboxylase 2 Carboxyltransferase (ACC 2) using computer simulation
methodologies. Computer simulations was used to investigate thermodynamic and
structural properties of these complex chemical systems for application in the
development of nanobiosensors and new methodologies of chemical
functionalization of AFM tips.
Keywords: Molecular Dynamics. AFM. ACC Enzyme. Multimeric protein structures.
xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ângulos principais da ligação peptídica numa proteína. .......................... 28
Figura 2 – Estruturas básicas formadas pelas proteínas .......................................... 28
Figura 3 – Representação geométrica do ângulo de torção entre i, j, k e l ............... 32
Figura 4 – Gráficos de Ramachandran para as estruturas multiméricas .................. 43
Figura 5 – RMSD dos átomos da ACC2 relaxada em água em relação ................... 45
Figura 6 – Potencial eletrostático do dímero da ACC2 ............................................. 49
Figura 7 – RMSD dos átomos dos dímeros ACC2 .................................................... 50
Figura 8 – RMSD dos átomos das cavidades dos sítios ativos da ACC2 ................. 51
xx
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACC – Acetil-coA Carboxilase
ACC1 – Acetil-coA Carboxilase 1
ACC2 – Acetil-coA Carboxilase 2
AFM – Microscópio de Força Atômica
ATP – Adenosina Trifosfato
MMC – Modelagem Molecular Computacional
RMSD – desvio quadrático médio
xxii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 23
2 OBJETIVOS........................................................................................................... 25
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 25
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 25
3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS ................................................................................ 27
3.1 MODELAGEM MOLECULAR COMPUTACIONAL ......................................... 27
3.2 ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS .................................................................... 27
3.3 DINÂMICA MOLECULAR ............................................................................... 29
3.3.1 Definição ..................................................................................................... 29
3.3.1 Potenciais Relacionados ........................................................................... 30
3.3.2 Métodos de Simulação de Dinâmica Molecular ...................................... 33
3.4 A ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE ...................................................... 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 39
4.1 SISTEMAS MOLECULARES .......................................................................... 39
4.2 SIMULAÇÕES DE DINÂMICA MOLECULAR ................................................. 40
4.3 POTENCIAL ELETROSTÁTICO E ENERGIA LIVRE DE SOLVATAÇÃO ...... 41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 43
5.1 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE ESTEREOQUÍMICA DAS SIMULAÇÕES ...... 43
5.2 DESCRIÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS INTRÍNSECAS DA ACC2 .............. 44
5.3 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DOS DÍMEROS NAS ESTRUTURAS
MULTIMÉRICAS ............................................................................................ 50
5.4 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DAS CAVIDADES DOS SÍTIOS
ATIVOS .......................................................................................................... 51
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................... 53
xxiv
7 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS.................................................... 55
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 57
23
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, a cristalografia de Raios-X é uma das ferramentas mais
poderosas na determinação da estrutura molecular tridimensional de proteínas, bem
como das possíveis interações enzima-inibidores, no estado sólido. Entretanto, a
estrutura cristalina fornece informações estruturais estáticas da macromolécula, sem
levar em consideração o efeito do solvente, o qual é a principal influência na
conformação e flutuação térmica do sistema (SMITH et al., 2004). Por este motivo é
estratégico investigar as diferentes características intrínsecas das proteínas
utilizando a Modelagem Molecular.
Dentre as técnicas de Modelagem Molecular existentes atualmente, a
Dinâmica Molecular é uma das mais promissoras e merece grande destaque.
Poderosa e versátil ferramenta no estudo de macromoléculas biológicas, a Dinâmica
Molecular fornece informações sobre o comportamento dinâmico microscópico dos
átomos individuais que compõem um determinado sistema, tendo como base a
Mecânica Clássica (FRENKEL; SMIT, 2001).
A Dinâmica Molecular tem se mostrado uma ferramenta promissora no
desenvolvimento de nanobiossensores1 de ponta de Microscópio de Força Atômica
(AFM, do inglês Atomic Force Microscopy). Os modelos teóricos de usados em
Dinâmica Molecular para modelagem de superfícies de ponta de AFM
funcionalizadas com enzimas Acetil-CoA Carboxilase Carboxiltransferase (ACC),
dependem da geometria e do arranjo multimérico das mesmas (AMARANTE, 2013;
FRANCA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2013). As enzimas ACC1 e ACC2 tem a
mesma função nos organismos, sendo 75% idênticas ao nível de aminoácidos (ABU
et al., 2000), e por este motivo as propriedades e características do arranjo
tridimensional de enzimas ACC2, propriedades estas diretamente relacionadas com
a flutuação conformacional em solução ,foram estudadas no neste trabalho.
1 Sensores biológicos cuja sensibilidade e a seletividade estão na nanoescala (1-100 nm). Alguns
destes sensores podem basear-se em interações específicas similares ao mecanismo anticorpo-antígeno ou enzima-substrato para realizar suas medidas (AMARANTE, 2013; DEDA et al., 2013).
24
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo geral deste trabalho é descrever e elucidar, a nível molecular, as
estruturas multiméricas da enzima ACC 2 utilizando técnicas de simulação
computacional.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Levantamento das estruturas cristalográficas multiméricas das enzimas ACC
1 e ACC 2 disponíveis na literatura;
• Simular pelo menos 1 ns por Dinâmica Molecular as estruturas multiméricas
propostas solvatadas em água;
• Obtenção das informações estruturais das estruturas simuladas por
Dinâmica Molecular;
• Determinação do mapa eletrostático de estruturas multiméricas específicas
antes e depois das simulações por Dinâmica Molecular e identificar possíveis
locais de interação;
• Calcular e energia livre de solvatação para as estruturas multiméricas da
enzima ACC 2 solvatadas em água nas condições termodinâmicas
estabelecidas.
26
27
3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS
3.1 MODELAGEM MOLECULAR COMPUTACIONAL
Com o objetivo de entender e prever o comportamento de sistemas reais, a
modelagem molecular compreende um número de ferramentas e métodos
computacionais que são usados para descrever e prever estruturas moleculares,
propriedades de reações, propriedades termodinâmicas, entre outras. Sendo assim,
a Modelagem Molecular Computacional (MMC) é a modelagem que estuda as
propriedades atomísticas por intermédio do uso de química computacional e
técnicas de visualização gráfica. (SCHLICK, 2010). Esse é um ramo no qual se
estuda sistemas químicos e biológicos mais complexos, com um número elevado de
partículas, da ordem de 1023, podendo realizar cálculos específicos e criar modelos
que seriam impossíveis de serem realizados de outra maneira (MORGON;
COUTINHO, 2007; SANT´ANNA, 2009).
Com o avanço dos recursos computacionais, tratando-se de softwares e
hardwares, a MMC se desenvolveu de maneira surpreendente nas últimas décadas.
No passado, a MMC era restrita ao grupo de pesquisadores e cientistas
responsáveis pelo desenvolvimento dos softwares utilizados. Nos dias atuais,
diversos recursos e softwares de modelagem estão disponíveis gratuitamente na
rede web (ARNOLD, 2006; HUMPHREY et al., 1996; PRONK et al., 2013), sem ter a
necessidade de ter uma pessoa em um grupo de pesquisa destinada
exclusivamente para o desenvolvimento de tais softwares.
3.2 ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
A conformação das proteínas é definida pelos valores de três ângulos
principais, ômega (ω), fi (Φ) e psi (Ψ) (FIG. 1). Já que o valor de ω é fixo, são os
valores de Φ e Ψ que determinam a variação conformacional da cadeia principal, já
que estes dão flexibilidade à cadeia peptídica (NELSON; COX, 2011). A
representação gráfica do ângulo Ψ contra o ângulo Φ define o gráfico de
Ramachandran, o qual evidencia os resíduos em regiões energeticamente
28
favoráveis e desfavoráveis, muito importante na avaliação de modelos
tridimensionais de proteínas (SILVA, 1999).
FIGURA 1 – Representação dos três ângulos principais da ligação peptídica numa
proteína.
Fonte: (OYANEDEL, 2003).
Existem vários níveis de estrutura proteica, e para descrever e entender
essas estruturas são necessários temas que são abordados em diversos níveis de
complexidade (BROWN et al., 2005; VOET et al., 2008). Comumente são definidos
quatro níveis de estrutura básica para as proteínas (FIG. 2) (ATKINS; JONES, 2006).
FIGURA 2 – Estruturas básicas formadas pelas proteínas.
Fonte: Modelagem realizada a partir do Arquivo PDB (do inglês Protein Data Bank) referência 1V4U (“RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB,” 2013).
29
A proteína utilizada na FIG. 2 se trata da subunidade beta da hemoglobina,
proteína transportadora de oxigênio no sistema circulatório. (YOKOYAMA et al.,
2004)
As uniões das cadeias polipeptídicas nas proteínas ocorrem em sua maioria
por ligações de dissulfeto e ligações de hidrogênio. Comumente a subunidade que
forma a estrutura quaternária das proteínas é denominada monômero. Esta estrutura
tridimensional junto com a sequência de aminoácidos confere a proteína sua função
específica (NELSON; COX, 2011; VOET et al., 2008). Algumas destas funções
específicas muitas vezes consistem em catalisar reações químicas, desse modo a
proteína passa a pertencer a uma classe denominada enzima (NELSON; COX,
2011; VOET et al., 2008).
3.3 DINÂMICA MOLECULAR
3.3.1 Definição
A Dinâmica Molecular é uma poderosa e versátil técnica para estudos de
macromoléculas biológicas, tendo como base a Mecânica Clássica. Os métodos
experimentais em geral são capazes de mensurar propriedades que são resultado
da soma de todos os possíveis microestados entrópicos e energéticos que um
conjunto de moléculas pode ocupar. Entretanto, mesmo com a constante evolução
de metodologias experimentais há a necessidade da utilização de modelos teóricos
para previsão de propriedades e compreensão, a nível molecular, dos experimentos
(CORNELL et al., 1995; KALÉ et al., 1997; WOODS et al., 1995). Desta forma, o
comportamento estatístico dos dados experimentais pode ser utilizado na validação
das médias obtidas pelas metodologias teóricas desenvolvidas para realizar
predições relacionadas àquele sistema.
Para sistemas moleculares compostos por centenas, milhares e até milhões
de átomos, como proteínas, não há a possibilidade de caracterizá-los com precisão
em nível de física quântica, porém, a física clássica oferece uma boa aproximação
para a modelagem desses sistemas. Isto é feito devido ao fato dos orbitais
moleculares de tais moléculas serem bem definidos, além de fenômenos de
30
transferência de cargas serem imensuráveis na escala de tempo dos movimentos
atômicos descritos pela Dinâmica Molecular (KALÉ et al., 1997).
3.3.2 Potenciais Relacionados
A primeira aproximação da Mecânica Molecular é considerar os átomos como
esferas rígidas dotadas de carga com posições definidas no espaço por um conjunto
de potenciais harmônicos. Assim, a estrutura molecular é mantida por um campo de
força descrito por potenciais lineares (Vd), angulares (V) e torcionais (Vφ) que visam
reproduzir as interações ligadas da molécula a ser simulada. As interações não
ligadas, ou intermoleculares, são descritas pelos potenciais de Lennard-Jones (VLJ),
ou van der Waals, e de Coulomb (VC), o que permite a construção de uma
expressão completa da energia potencial (Vtotal) do sistema que depende somente
das posições atômicas (Equação 1) (DAVID VAN DER SPOEL, 2006).
φ (1)
Em outras palavras, as moléculas são descritas a partir de um modelo de
esferas indeformáveis dotadas de cargas ligadas por molas devidamente calibradas,
de modo que estas possam descrever as vibrações de ligações químicas e as
barreiras energéticas torcionais e angulares que reconstroem o comportamento da
molécula a ser mimetizada. O somatório dos potenciais ligados e não ligados
compõe o que é denominado campo de força do sistema.
Cada função de energia potencial visa descrever um comportamento
estrutural característico da molécula.
Potencial Harmônico de Ligação (ou Linear): Em métodos de mecânica molecular
as ligações covalentes são descritas como um oscilador harmônico clássico. O
estiramento entre dois átomos é descrito pelo Potencial Harmônico Linear Vd, o qual
descreve a energia associada ao desvio da distância de equilíbrio d0 (Equação 2)
(KOEHLER et al., 1987).
31
(2)
sendo d o comprimento da ligação entre dois átomos i e j (Figura 10) e kd é a
constante elástica da força.
A distância d0 e a constante de força são os parâmetros do campo de força.
Tais parâmetros podem ser obtidos experimentalmente, por intermédio dos
espectros de infravermelho, ou por intermédio da mecânica quântica. A constante kd
varia de acordo com a rigidez da ligação química. Como exemplo, a constante kd de
uma ligação simples entre carbonos C–C é 317 kcal/mol Å2, enquanto que a ligação
dupla C=C é 570 kcal/mol Å2 (CORNELL et al., 1995).
Potencial Harmônico Angular: Este descreve a energia potencial relacionada aos
desvios relativos ao ângulo de referência. Analogamente ao Potencial Harmônico
Linear o Potencial Harmônico Angular pode ser definido pela Equação 3 (CORNELL
et al., 1995).
(3)
Potencial Torcional (ou Diedral): Considerando um conjunto de quatro átomos
ligados, i, j, k e l, como mostrado na FIG. 3, o ângulo diedro φ é definido como o
ângulo entre os planos formados pelos átomos ijk e jkl.
Pode-se entender o potencial torcional Vφ como a representação explicita da
barreira energética atribuída à rotação dos átomos i e l ao redor da ligação j-k, sendo
o mesmo definido pela Equação 4 (CORNELL et al., 1995).
[ ] (4)
sendo kφ a constante que define a altura da barreira energética para uma possível
torção, n é o número de mínimos na curva de energia potencial pelo ângulo de
torção, φ o ângulo diedral da ligação central e em relação a quatro átomos e δ a
diferença de fase do ângulo diedral φ, que pode ser 0º e 180º, dependendo de este
valor ser um ponto de máximo ou de mínimo.
32
FIGURA 3 – Representação geométrica do ângulo de torção entre i, j, k e l.
Fonte: (CORNELL et al., 1995).
A determinação de potenciais torcionais experimentalmente está longe de ser
trivial. Na definição de tais parâmetros para moléculas ainda não descritas (na
maioria das vezes não compostas por aminoácidos), é comum se utilizar de
potenciais diedrais semelhantes aos de uma molécula conhecida e previamente
descrita. Outra estratégia para se determinar os parâmetros kφ, n, e δ é otimizar os
parâmetros para moléculas simples e extrapolar para moléculas complexas com
grupamentos de átomos semelhantes. A curva de energia potencial pode ser obtida
via mecânica quântica, o que é uma grande vantagem pela independência de
valores experimentais (DAVID VAN DER SPOEL, 2006; KOEHLER et al., 1987).
Potencial de Lennard-Jones (ou van der Waals): O potencial de Lennard-Jones é
utilizado para descrever interações intra e intermoleculares do tipo van der Waals.
Este potencial é geralmente utilizado para descrever interações de átomos de uma
mesma molécula se estes estiverem separados por três ou mais ligações
covalentes. A expressão de energia potencial que descreve este tipo de interação
entre dois átomos (i e j ) é dada pela Equação 5 (VERLET, 1966).
[
] (5)
33
sendo rij a distância entre os átomos i e j (FIG. 4), ε a profundidade do poço de
energia potencial e σ o diâmetro de Lennard-Jones, o qual depende das espécies
químicas ligadas. Existem outras formas de abordagem para a descrição deste tipo
específico de interação, no entanto o formato de equação acima apresentado é o
mais simples e geral (CORNELL et al., 1995; VERLET, 1966).
Potencial de Coulomb: As interações de carga que são puramente eletrostáticas
entre dois átomos i e j (FIG. 4) são descritas pela equação de energia potencial
Coulombiana (Equação 6) (CORNELL et al., 1995).
(6)
sendo rij a distância entre os átomos i e j, qi e qj são as cargas dos átomos, ε0 a
permissividade no vácuo e ε a constante dielétrica do meio.
Existe a necessidade de determinar vários parâmetros para a aplicação das
equações que descrevem as energias potenciais para as interações presentes em
sistemas moleculares. Como citado anteriormente, os parâmetros podem ser obtidos
via cálculos ou técnicas experimentais como cristalografia de raios-X, espectroscopia
de infravermelho, ressonância magnética nuclear e muitas outras (CORNELL et al.,
1995).
3.3.3 Métodos de Simulação de Dinâmica Molecular
As metodologias de Dinâmica Molecular são baseadas nas leis da mecânica
clássica (BROOKS et al., 1990). As forças que atuam em cada átomo são baseadas
no conjunto de parâmetros do campo de força, nas coordenadas e nas velocidades
atômicas que são mapeadas durante todo o processo. Em uma simulação por
Dinâmica Molecular, a força F atuante em determinado átomo é expressa em função
do tempo, e é igual ao negativo do gradiente da energia potencial em relação à
posição ri de cada átomo, tal como expressa na Lei de Newton (Equação 7)
(BROOKS et al., 1990).
34
(7)
Em linhas gerais, nos métodos de Dinâmica Molecular, as equações clássicas
de movimento são iterativas e numericamente integradas para cada átomo do
sistema a um determinado tempo, e a cada passo o processo de integração se
repete considerando as posições atômicas e obedecendo a um determinado
incremento no tempo (∆t) o qual é determinado pelo usuário e em geral é na escala
de femtossegundos (10-15 s). Estas escalas de tempo tão pequenas são necessárias
para que o erro relacionado à integração das equações de movimento seja
suficientemente pequeno. Em outras palavras, se o valor de ∆t for grande alguns
eventos moleculares importantes, que ocorrem em escalas de tempo pequenas, não
seriam simulados, criando artifícios computacionais que podem resultar na não
reprodução da realidade pelo modelo proposto. Tais artifícios recorrem a erros
significativos no cálculo das forças, os quais refletem nos valores dos cálculos de
energia livre e na busca dos estados conformacionais de menor energia em um
determinado tratamento termodinâmico.
Outro princípio básico por trás da Dinâmica Molecular é o que a relação entre
os dados teóricos obtidos e experimentais é feito a partir do uso da Hipótese
Ergódica de Boltzmann. Esta hipótese fundamental demonstra que o valor médio de
uma propriedade medida em um pequeno número de partículas por um longo tempo
é equivalente às médias obtidas para um sistema de muitas partículas por um curto
intervalo de tempo. Baseado nisto, as simulações de Dinâmica Molecular que
possuem poucas partículas (comparado a qualquer sistema real) tem que ser
suficientemente longas para que o sistema visite um número suficiente de
conformações representativas para satisfazer este princípio. Esta justificativa teórica
valida as médias obtidas de propriedades termodinâmicas de sistemas simulados
por tempo suficiente num sentido ergódico.
Atualmente, existem vários algoritmos disponíveis que realização a integração
numérica das equações de movimento, sendo os mais comuns os do tipo Verlet. Os
algoritmos de Verlet, Velocity-Verlet e leap-frog são os mais utilizados, pois tem um
custo computacional menor em termos de consumo de memória RAM e tempo de
processamento (ALDER, 1977; VERLET, 1966). Em geral a escolha do algoritmo a
35
ser usado se baseia em duas importantes variáveis: custo computacional e precisão
na integração numérica. O algoritmo Velocity-Verlet utiliza a aceleração, velocidade
e posição dos átomos em determinado tempo o que fornece mais precisão que o
algoritmo de Verlet. Outros algoritmos conseguem ser bem mais precisos quanto à
conservação da energia livre total do sistema, entretanto são bem mais custosos
computacionalmente, como o algoritmo de Beeman (BEEMAN, 1976). A condição
para que se escolha um algoritmo mais leve a um mais preciso é a de que com
menos custo computacional as simulações podem atingir escalas de tempo maior,
logo representam mais microestados entrópicos e energéticos do sistema permitindo
obter ergodicamente médias de propriedade que podem seguramente ser
confrontadas com valores experimentais.
Uma das principais problemáticas envolvida nas simulações de Dinâmica
Molecular é a utilização do solvente e o modelo a ser utilizado. O uso de solvente
aumenta o custo computacional de qualquer simulação, no entanto permite a
descrição precisa de várias propriedades que são diretamente dependes da
interação com solventes. Os modelos de água mais utilizados são o SPC, TIP3P,
TIP4P e TIP5P (BERENDSEN et al., 1987; JORGENSEN et al., 1983; MAHONEY;
JORGENSEN, 2000). O aumento do número de partículas em uma simulação pode
levar a vários problemas na estimativa das forças, devido a possíveis efeitos de
superfície. Uma aproximação que contorna este problema é o uso de condições
periódicas de contorno (MAHONEY; JORGENSEN, 2000). Um espaço de simulação
se torna uma pequena parcela no centro de um número infinito de cópias idênticas
do mesmo em todas as direções. O número de partículas na caixa de simulação é
mantido constante considerando-se constante o número de moléculas que entram e
saem pela caixa. Desta forma os efeitos de superfície são cancelados e a simulação
se dá mimetizando o sistema em solução.
Em suma, simulações computacionais de sistemas com milhares de átomos
podem ser realizadas com o uso de dinâmica molecular considerando fenômenos
que ocorre em alguns nanosegundos sem a quebra ou formação de ligações
químicas. Qualquer propriedade termodinâmica do sistema em questão pode ser
obtida se a simulação considerar um número de estados energéticos
suficientemente grandes para satisfazer a Hipótese Ergódiga. A partir desta
36
poderosa técnica podem-se analisar processos de adsorção, interação e o
comportamento molecular conformacional de sistemas biológicos em geral.
3.4 A ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE
Os lipídeos são formados por moléculas relativamente pequenas que podem
se associar para constituir grandes moléculas que servem, principalmente, como
componentes estruturais das membranas, como forma de armazenamento de
energia e outras funções essenciais (formação de hormônios esteroides, vitaminas,
proteção, material isolante). Os principais lipídeos encontrados em células vegetais
incluem os glicolipídeos e outros derivados de ácidos graxos. Cerca de 5 a 10% da
massa de matéria seca das células vegetais é formado por lipídeos
(CHRISTOFFOLETI et al., 2008).
Neste contexto, pode-se definir a ACC como uma enzima chave no
metabolismo dos ácidos graxos, que regula a biossíntese e oxidação dos lipídeos,
catalisando a carboxilação, dependente de Adenosina Trifosfato (ATP), da acetil-
CoA para produzir malonil-CoA (TAO et al., 2012). Essa reação catalisada pela ACC
é realizada em duas etapas, nas quais primeiramente ocorre a carboxilação
dependente de ATP e de biotina, e a consequente transferência do grupo carboxila a
partir de biotina da acetil-CoA catalisada pela carboxiltransferase (DAVIS et al.,
2000) (FIG. 5). A biotina é o cofator da enzima piruvato carboxilase e é uma
molécula especializada no transporte de dióxido de carbono. Nas células vegetais,
grandes quantidades de malonil-CoA são necessárias nos plastídeos para sustentar
a síntese dos ácidos graxos, além do alongamento de ácidos graxos para a síntese
de flavonóides e fitoalexinas no citosol (JOYARD et al., 2010).
Nos animais, a ACC também está relacionada com a síntese de ácidos
graxos. A interferência da atividade da enzima ACC em animais, seja pela utilização
de inibidores ou silenciamento da expressão genética, demonstrou ser deletéria para
vários tipos de células cancerosas (BECKERS et al., 2007). Assim, os fluxos
reduzidos de conversão da acetil-CoA para malonil-CoA pode ser um dos principais
fatores determinantes para a reprogramação metabólica de uma célula cancerígena.
Estudos recentes também sugerem que a inibição da enzima ACC em animais pode
37
estar ligada às síndromes metabólicas como diabetes tipo 2 e obesidade, bem como
uma maior probabilidade dos pacientes com esses transtornos desenvolverem
episódios de câncer (NATTER; KOHLWEIN, 2013).
A enzima ACC1 é encontrada em grande parte no citossol, sendo a principal
isoforma no tecido adiposo. A enzima ACC2 é predominante no músculo cardíaco e
tecido muscular esquelético (ABU et al., 2000). Bianchi e colaboradores também
observaram a ACC2 no citossol do fígado (BIANCHI et al., 1990). Ambas enzimas
ACC1 e ACC2 são proteínas de alto peso molecular ( ACC1 , 265 kDa ; ACC2 , 275
kDa) e são 60 % idênticas ao nível dos nucleótidos e
75% idênticas ao nível de aminoácidos (ABU et al., 2000).
A Tabela 1 mostra as estruturas cristalográficas multiméricas das enzimas
ACC1 e ACC2 disponíveis na literatura no banco internacional de dados de
estruturas de proteínas: Protein Data Bank (“RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB,”
2013).
38
Tabela 1 – Estruturas cristalográficas multiméricas das enzimas ACCs disponíveis
na literatura no bando de dados de proteínas Protein Data Bank (“RCSB Protein
Data Bank - RCSB PDB,” 2013).
Sistema Representação Enzima ACC1 Enzima ACC2
Monômero
0 0
Dímero
2 1
Trimero
14 0
Tetrâmero 0 1
39
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 SISTEMAS MOLECULARES
A estrutura inicial da enzima ACC 2 foi obtida por intermédio do modelo
experimental de cristalografia de raios-X, disponível na literatura no banco
internacional de dados de estruturas de proteínas: Protein Data Bank (“RCSB
Protein Data Bank - RCSB PDB,” 2013), arquivo PDB: 3FF6. Os resíduos de
aminoácidos não determinados por cristalografia de raios-X foram construídos por
intermédio de modelagem molecular por homologia utilizando o programa Swiss-
PdbViewer (GUEX; PEITSCH, 1997; GUEX et al., 2009). Esta estrutura foi utilizada
como ponto de partida para os cálculos de dinâmica molecular. Os parâmetros foram
implementados no campo de força CHARMM27 (BROOKS et al., 1983;
MACKERELL et al., 2000).
Para a visualização e produção de imagens referentes a todos os sistemas
foram utilizados os programas VMD 1.9.1 (HUMPHREY et al., 1996) e Jmol 10.0.31
(HERRAEZ, 2006).
As moléculas de água presentes na estrutura original, provenientes
cristalografia, foram removidas e átomos de hidrogênio foram adicionados para criar
um modelo atomístico fidedigno ao real, contendo todos os átomos explícitos para
realizar cálculos de Dinâmica Molecular. Os sistemas simulados por Dinâmica
Molecular estão resumidos na TABELA 2.
40
Tabela 2 – Descrição dos sistemas simulados
Sistema no de átomos
de soluto
no de
íons
no de moléculas de
solvente
no de resíduos de
aminoácidos
Monômero 12000 12 113573 755
Dímero 23951 25 134937 1510
Trimero 35812 38 355420 2265
Tetrâmero 47535 50 351703 3020
4.2 SIMULAÇÕES DE DINÂMICA MOLECULAR
Os sistemas modelados (dímero, monômero, trimero e tetrâmero) foram
solvatados preenchendo-se uma caixa com modelos de água do tipo TIP3P
(JORGENSEN et al., 1983; MAHONEY; JORGENSEN, 2000). Íons sódio foram
utilizados para equilibrar os sistemas, os quais foram minimizados utilizando-se
aproximadamente 10.000 passos do algoritmo steepest decent (PRONK et al.,
2013). Após a minimização, o solvente foi equilibrado realizando-se uma simulação
de dinâmica molecular por 100 ps à 150 e 298 K. Depois da equilibração do
solvente, uma simulação por dinâmica molecular foi realizado por 1 ns em um
ensemble isotérmico-isobárico (NPT) utilizando o algoritmo leapfrog (HOCKNEY,
1970) com um tempo de integração de 2 femtonsegundos. As configurações foram
salvas a cada 1 ps para a realização das análises. A temperatura foi mantida a 298
K acoplando o sistema ao termostato de Berendsen (BERENDSEN et al., 1984),
com um tempo de relaxação de 0,1 ps. A pressão foi mantida à 1 bar acoplando ao
barostato de Berendsen (BERENDSEN et al., 1984) via escalonamento isotrópico
com tempo de relaxação de 10 ps e compressibilidade de 4,5x10-6 (kJ.mol-1.nm-3)-1.
Os movimentos vibracionais do sistema foi fixado utilizando o algoritmo LINCS
(HESS et al., 1997). Um raio de corte de 1,4 nm foi utilizado para a caracterização
das interações de van der Waals e interações eletrostáticas de curto alcance. As
41
contribuições eletrostáticas de longo alcance foram tratadas via campo de reação
generalizada (TIRONI et al., 1995), com uma constante dielétrica = 66. Todas as
simulações foram realizadas utilizando o campo de força CHARMM27 (BROOKS et
al., 1983; MACKERELL et al., 2000) e o programa GROMACS 4.5.4 (DAVID VAN
DER SPOEL, 2006; PRONK et al., 2013).
4.3 POTENCIAL ELETROSTÁTICO E ENERGIAS LIVRES DE SOLVATAÇÃO
A distribuição de cargas para a superfície da enzima ACC 2 foi obtida por
intermédio do cálculo do potencial eletrostático resolvendo numericamente a
equação não-linear de Poisson-Boltzmann, aplicando o método de diferença-finita
(DAVIS; MCCAMMON, 1990; NIELSEN et al., 1999) no programa APBS (Adaptive
Poisson-Boltzmann Solver) (HOLST et al., 2000), em conjunto com os parâmetros do
campo de força CHARMM27 (BROOKS et al., 1983; MACKERELL et al., 2000). A
estrutura da enzima ACC 2 em solução aquosa foi obtida usando constante
dielétrica de 78,54 para o solvente e 2,00 para o soluto. O solvente tem as
especificações: tensão superficial 0,105 N/m, raio de corte de 1,4 nm e força iônica
de 100 mM. A contribuição apolar para a energia livre de solvatação foi calculada
utilizando um coeficiente de tensão superficial de 0,105 kJ/mol para o soluto. Os
potenciais tridimensionais foram obtidos utilizando 129 pontos de rede nas direções
de x, y e z.
42
43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE ESTEREOQUÍMICA DAS SIMULAÇÕES
As avaliações estereoquímicas dos sistemas simulados foram realizadas por
intermédio dos gráficos de Ramachandran obtidos pelo programa VMD 1.9.1
(HUMPHREY et al., 1996). A FIG. 4 mostra os gráficos de Ramachandran das
estruturas multiméricas da ACC2 obtidos durante o intervalo 0 e 1 ns de simulação.
Para serem considerados de boa qualidade, os modelos de proteínas
simulados devem possuir mais de 90% dos seus resíduos nas regiões mais
favoráveis (regiões em azul da FIG. 4) e o menor número possível de resíduos nas
regiões menos favoráveis (regiões em verde e branco da FIG. 4) (LASKOWSKI et
al., 1993). Para evidenciar que não houve a desnaturação das enzimas durante as
simulações, os gráficos de Ramachandran não sofreram alterações significativas
dentro do intervalo 0 e 1 ns, o que permite as análises posteriores.
FIGURA 4 – Gráficos de Ramachandran para as estruturas multiméricas
(monômero, dímero, trimero e tetrâmero) da ACC2 relaxadas em água no intervalo t
= 0 e t = 1 ns.
Fonte: Cálculos realizados utilizando o programa VMD 1.9.1 (HUMPHREY et al., 1996).
44
5.2 DESCRIÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS INTRÍNSECAS DA ACC2
De acordo com a literatura (YU et al., 2010), a enzima ACC1 pode existir em
solução em estruturas multiméricas, porém a atividade catalítica se dá na interface
dos dímeros (ZHANG et al., 2004). Apesar da estrutura dimérica ser a mais plausível
de existir na natureza, a proporção de monômeros/dímeros/trimeros/tetrâmeros
encontradas para as enzimas ACC1 e ACC2 (Tabela 1) sugere que a estrutura
existente em maior proporção seja o trimero, este também possuindo atividade
catalítica (YU et al., 2010). A população das estruturas multiméricas de enzimas da
mesma família da ACC pode ser controlada por mutações específicas (SHEN et al.,
2006).
A dinâmica estrutural da ACC2 foi avaliada calculando o desvio quadrático
médio (RMSD, do inglês Root-mean-square deviation) com relação à sua estrutura
inicial durante a simulação por dinâmica molecular. A FIG. 5 mostra a diferença na
flutuação estrutural entre o monômero, dímero, trimero e o tetrâmero em solução
aquosa. O monômero e o trimero ainda não alcançaram uma condição inicial de
equilíbrio estrutural após 1 ns de simulação, e perdem mais de sua estrutura inicial
quando comparados ao dímero e tetrâmero. Por outro lado, o dímero e o tetrâmero
exibiram flutuação conformacional em torno de 0,25 nm, mostrando uma relativa
rigidez estrutural em solução aquosa, cujo aparente equilíbrio foi alcançado somente
após 400 ps. Com estes resultados, pode-se supor que conjuntos de estruturas
monoméricas e diméricas exibem flutuação conformacional mais elevadas devido à
presença do monômero, e estruturas diméricas tendem a ser mais estáveis.
45
Figura 5 – Evolução temporal do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos da
ACC2 relaxada em água em relação à estrutura inicial.
Fonte: Cálculos realizados utilizando o programa GROMACS 4.5.4 (DAVID VAN DER
SPOEL, 2006; PRONK et al., 2013).
A flutuação estrutural e a diferença entre as estruturas multiméricas da
ACCase podem ser atribuídos a dois fatores principais. A primeira é a interação
eletrostática entre grupos carregados de aminoácidos como a arginina (ARG), lisina
(LYS), ácido aspártico (ASP) e ácido glutâmico (GLU). A segunda é a solvatação de
aminoácidos polares, contribuindo para a mobilidade da proteína.
O efeito da solvatação é melhor ilustrado pela análise do número de ligações
de hidrogênio entre moléculas de água as estruturas da ACC2 na TABELA 3. Os
aminoácidos carregados induzem a formação de novas ligações de hidrogênio entre
as moléculas de água e as estruturas da ACC2, resultando na flutuação estrutural
enzimática. A característica intrínseca do monômero de ACC2 em possuir uma área
superficial mais acessível ao solvente por resíduo de aminoácido do que as demais
estruturas implica em um grande número de aminoácidos carregados expostos as
moléculas de água, que estão sobre elevado movimento térmico. Portanto, o efeito
do solvente é o principal fator na explicação da flutuação estrutural da enzima ACC2.
46
Para o dímero e o tetrâmero, a área acessível ao solvente por resíduo de
aminoácido calculadas antes e após a simulação se mantiveram maiores em relação
ao monômero e trimero, tendo as moléculas de água se difundido em maior
proporção nestes. Tendo menor área acessível ao solvente por resíduo de
aminoácido, o dímero e tetrâmero adquirem maior estabilidade em relação às outras
estruturas.
Tabela 3 – Número de moléculas de água realizando ligações de hidrogênio com a
enzima por resíduo de aminoácido e área acessível ao solvente (nm²) por resíduo de
aminoácidos de cada estrutura.
Sistema Tempo Área acessível
ao Solvente por resíduo de
aminoácido (nm²)
Nº de
ligações de
H
Monômero 0 ns 0,197 1479
1 ns 0,196 1520
Dímero 0 ns 0,165 2724
1 ns 0,166 2876
Trimero 0 ns 0,172 3985
1 ns 0,172 4368
Tetrâmero 0 ns 0,160 5340
1 ns 0,161 5732
47
Para descrever detalhadamente o efeito da solvatação na flutuação e na
estabilização conformacional da ACC2 por moléculas de água, a contribuição
eletrostática e polar para a energia livre de soltavatação das estruturas multiméricas
foram calculados via eletrostática de Poisson-Boltzmann, usando o programa APBS
(Holst et al., 2001). As estruturas iniciais, provenientes da cristalográfica, e as
estruturas finais do último 1 ns de simulação, foram selecionadas e calculadas as
energias de solvatação TABELA 4. Apesar de não existir valores experimentais na
literatura para comparar com os valores calculados de energia livre de solvatação,
os resultados podem ser potencialmente utilizados para prever estabilidade de
solvatação relativa das diferentes estruturas multiméricas da ACC2. De acordo com
a TABELA 4, a energia livre de solvatação é principalmente governada pela
contribuição eletrostática, a qual é consistente com o número relativo de
aminoácidos carregados na estrutura enzimática. O aumento (em módulo) da
contribuição eletrostática, de 0 a 1 ns, de 1500, 2800, 6100 e 6100 kJ/mol para o
monômero, dímero, trimero e tetrâmero respectivamente. Em virtude, o aumento do
número de moléculas de água que fazem ligações de hidrogênio com grupos
carregados durante a simulação por Dinâmica Molecular. Por outro lado, a
contribuição apolar apresentou somente uma pequena variação durante a
simulação, de aproximadamente 50, 50, 0 e 100 kJ/mol para o monômero, dímero,
trimero e tetrâmero respectivamente.
48
Tabela 4 – Energia livre de solvatação (kJ/mol) para as estruturas multiméricas da
enzima ACC2 no intervalo t = 0 e t = 1 ns de simulação de dinâmica molecular.
Normalização realizada pela razão entre a G total e o número de resíduos de
aminoácidos de cada estrutura.
Sistema Tempo Gsolv
(ELETROSTATICO)
Gsolv
(APOLAR)
Gsolv
(TOTAL)
Gsolv
(NORMALIZADA)
Monomero 0 ns -2,87x104 4,03x103 -24,67x103 -32,67
1 ns -2,72x104 4,08x103 -23,12x103 -30,62
Dimero 0 ns -4,99x104 6,37x103 -43,53x103 -28,83
1 ns -4.71x104 6.42x103 -40.68x103 -26,94
Trimero 0 ns -6,91x104 1,02x104 -58,90x103 -26,00
1 ns -6,30x104 1,02x104 -52,80x103 -23,31
Tetramero 0 ns -8,65x104 1,24x104 -74,10x103 -24,54
1 ns -8,04x104 1,25x104 -67,90x103 -22,48
As energias livres de solvatação totais mostradas na TABELA 4 confirmaram
que a estrutura enzimática relaxada é energeticamente estabilizada em solução
aquosa, reforçando a hipótese de que a solvatação é o efeito mais importante para a
flutuação estrutural. Isto sugere que as cargas expostas na superfície da ACC 2
foram amplamente solvatadas por moléculas de água, as quais difundiram dentro
das estruturas proteicas, reduzindo a repulsão eletrostática de grupos com cargas
similares, e induzindo mudanças conformacionais na estrutura da proteína.
A dinâmica estrutural da enzima ACC2 evidenciou as flutuações
conformacionais mostradas na FIG. 5, em virtude da solvatação das cadeias polares
49
internas e possíveis repulsões eletrostáticas entre cadeias laterais. Estes efeitos são
responsáveis pela flutuação de cargas ao longo da superfície das estruturas da
ACC2. Espera-se, de acordo com o ponto isoelétrico 6,23 (CHENG et al., 2011), que
a enzima seja levemente carregada negativamente e, ao analisar os potenciais
eletrostáticos das estruturas antes e depois das simulações, foram encontradas
distribuições uniformes de cargas ao longo das superfícies, com exceção das
cavidades dos sítios ativos (FIG. 6), corroborando a hipótese das estruturas
multiméricas serem sintetizadas desta forma.
Figura 6 – Potencial eletrostático do dímero da ACC2.
Nota: kB é a constante de Boltzmann, T a temperatura e e a carga elementar
Fonte: Modelagem realizada a partir do Arquivo PDB 1FF6 (“RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB,” 2013).
50
5.3 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DOS DÍMEROS NAS ESTRUTURAS
MULTIMÉRICAS
A dinâmica estrutural dos dímeros da ACC2 presentes nas estruturas
multiméricas foram avaliadas da mesma forma do item 5.2 calculando o desvio
quadrático médio (RMSD) com relação à sua estrutura inicial. A FIG. 7 mostra as
flutuações estruturais dos dímeros presentes no trimero e no tetrâmero em
comparação com a estrutura dimérica solvata unicamente. Na figura nota-se que os
dímeros tendem a permanecer estáveis em solução aquosa, mesmo que embutidos
em estruturas multiméricas com mais monômeros, validando estudos da enzima
ACC2 que tomam como base a estrutura dimérica (AMARANTE, 2013; OLIVEIRA et
al., 2013).
Figura 7 – Evolução temporal do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos dos
dímeros presentes nas estruturas multiméricas da ACC2 relaxada em água em
relação à estrutura inicial.
Fonte: Cálculos realizados utilizando o programa GROMACS 4.5.4 (DAVID VAN DER
SPOEL, 2006; PRONK et al., 2013).
51
5.4 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DAS CAVIDADES DOS SÍTIOS ATIVOS
Fazendo o mesmo tipo de análise dos itens 5.3 e 5.4, foram estudadas as
flutuações das cavidades do sítio ativo presentes na interface dos dímeros das
estruturas multiméricas (FIG. 8). A relativa estabilidade observada está de acordo
com o resultado esperado, corroborando a hipótese das diferentes estruturas
multiméricas possuírem atividade catalítica (SHEN et al., 2006; YU et al., 2010).
Figura 8 – Evolução temporal do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos das
cavidades dos sítios ativos presentes nas estruturas multiméricas da ACC2 relaxada
em água em relação à estrutura inicial.
Fonte: Cálculos realizados utilizando o programa GROMACS 4.5.4 (DAVID VAN DER
SPOEL, 2006; PRONK et al., 2013).
52
53
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dado o objetivo geral deste trabalho o qual descrever e elucidar as estruturas
multiméricas da enzima ACC 2 utilizando metodologias de simulação computacional,
foi realizado inicialmente um levantamento completo na literatura das estruturas
cristalográficas e informações disponíveis sobre as enzimas da família ACC.
Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que técnicas de
modelagem molecular são extremamente úteis para a realização de previsões de
propriedades estruturais e elétricas de biomoléculas que podem ser utilizadas como
nanobiossensores. Devido ao tamanho das biomoléculas, foram utilizados métodos
de mecânica clássica. As simulações de Dinâmica Molecular foram realizadas
durante 1 ns, com o intuito de relaxar as estruturas enzimáticas em água. Foi
possível mostrar uma primeira evidência de que a enzima ACC2 é mais estável em
solução aquosa na forma de dímeros, permitindo assim o aperfeiçoamento dos
modelos de nanobiossensores de ponta de AFM existentes. O potencial
eletrostático da distribuição de cargas das superfícies diméricas calculado mostrou
uma distribuição uniforme de cargas uniforme, exceto nas cavidades dos sítios
ativos, na superfície da ACC2, o que corrobora modelos existentes (AMARANTE,
2013; OLIVEIRA et al., 2013).
Um dos resultados mais importantes que foram obtidos por este trabalho foi a
confirmação de que a menor estrutura a ser estudada, para a ACC2, no
desenvolvimento de modelos teóricos foi a estrutura dimérica. As estruturas
multiméricas e possíveis “encaixes” entre os dímeros devem ser considerados,
dependendo do modelo tratado, pois, como foi evidenciado, estas estruturas quando
compostas apenas por dímeros, tem relativa estabilidade sendo solvatadas em
água. As análises das flutuações conformacionais também evidenciaram que os
dímeros da ACC2 não perdem atividade catalítica quando embutidos em estruturas
multiméricas com mais monômeros.
Em suma, o uso de métodos de modelagem molecular permitem um ganho de
tempo e esforço na previsão de condições otimizadas para a continuidade dos
estudos e desenvolvimento dos modelos teóricos de novos nanobiossensores de
ponta de AFM que envolvem as enzimas ACC.
54
55
7 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS
Segue abaixo os possíveis trabalhos futuros:
Extensão das simulações de Dinâmica Molecular para 10 ns.
Parametrização de campos de força de novas superfícies e ligantes ainda não
estudados por simulações de Dinâmica Molecular.
Estudar e desenvolver novos sistemas e modelos atomísticos e, disposto dos
roteiros de simulação de Dinâmica Molecular apresentados, entender os estudos
para outras proteínas, ligadas a doenças autoimunes e neurodegenerativas.
56
57
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