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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Ecologia, Conservação e Manejo da Vida Silvestre
Reação de Hipersensibilidade em Terminalia glabrescens
Carlos Henrique Pires Magalhães
Belo Horizonte – MG 2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Ecologia, Conservação e Manejo da Vida Silvestre
Reação de Hipersensibilidade em Terminalia glabrescens
Carlos Henrique Pires Magalhães
Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais como parte dos requisitos para a obtenção do grau de mestre em Ecologia, Conservação e Manejo da Vida Silvestre
Orientador: Dr. Geraldo Wilson Fernandes
Belo Horizonte – MG 2009
Carlos Henrique Pires Magalhães
Reação de Hipersensibilidade em Terminalia glabrescens Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais como parte dos requisitos para a obtenção do grau de mestre em Ecologia, Conservação e Manejo da Vida Silvestre Banca Examinadora:
_______________________________________ Prof. Dr Pablo Cuevas
Professor Visitante (BIG/ICB/UFMG)
______________________________________ Prof. Dr. Marco Antônio Alves Carneiro
Universidade Federal de Ouro Preto
_______________________________________ Prof. Dr. Geraldo Wilson Fernandes
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte - MG, 07 de Maio de 2009
Dedico esta Dissertação a minha atual e a minha futura família
Agradecimentos
Agradeço aos meus pais Carlos Alberto da Silva Magalhães e Maria da
Ascensão Pires Magalhães pela confiança e apoio para que eu pudesse desfrutar de
uma oportunidade que eles não tiveram
Agradeço a meus irmãos por todos momentos vividos, pelas boas prosas e
lembranças.
Agradeço a Larissa pela paciência, apoio e compreensão. Enfeitou minhas
tardes como um girassol.
Agradeço ao Dr. Geraldo Wilson Fernandes, ou simplesmente Geraldinho,
por ter me aceitado como discípulo, agradeço pela confiança e pelas sugestões e
exemplos que me ajudaram a me tornar uma pessoa melhor.
Agradeço ao Programa de Pós Graduação em Ecologia, Conservação e
Manejo de Vida Silvestre.
Agradeço aos colegas de mestrado e aos colegas do Leeb pelos bons
momentos que fizeram os obstáculos parecerem menores.
Agradeço aos colegas de república, especialmente ao Isaac pela amizade e
companheirismo.
Agradeço a minha Tia Elza por ter me acolhido em um momento de
dificuldades para mim, fazendo renovar minhas esperanças. Agradeço também ao
amigo Leivas, que me apoiou num momento que ele também passava por
obstáculos.
Obrigado de coração a todos vocês que me ajudaram a passar por esta etapa.
Sumário CAPÍTULO 1 Resistência induzida (reação de hipersensibilidade) contra a indução de galhas em Terminalia glabrescens (Combretaceae) Resumo 01 Abstract 02 Introdução 03 Material e Método 06 Resultados 09 Discussão 12 Referências 14 CAPÍTULO 2 Dano foliar em T. glabrescens: herbivoria ou defesa contra a indução de galhas? Resumo 19 Abstract 20 Introdução 21 Material e Método 23 Resultados 28 Discussão 35 Referências 38 CAPÍTULO 3 Relação dos nutrientes foliares com a reação de hip ersensibilidade contra a indução de galhas em Terminalia glabrescens Resumo 43 Abstract 44 Introdução 45 Material e Método 48 Resultados 51 Discussão 54 Referências 57
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CAPÍTULO 1
Resistência induzida (reação de hipersensibilidade) contra a indução de galhas
em Terminalia glabrescens (Combretaceae)
Resumo : Este estudo descreve os efeitos de um gradiente de disponibilidade de
água no ataque de insetos galhadores em Terminalia glabrescens e sua reação de
hipersensibilidade (RH) contra o ataque. Dez parcelas de 250 x 100 metros com
árvores de T. glabrescens foram marcadas e determinou-se a distância de cada
árvore até o curso de água. A freqüência de RH foi correlacionada com a distância
de cada árvore até o curso de água através de uma análise de regressão linear. As
freqüências de folhas com RH e o total de folhas atacadas (RH + galhas) se
correlacionaram positivamente com o aumento da distância até o curso de água. No
entanto, os autores não encontraram variações na freqüência de folhas com galhas,
número médio de galhas por folha e número total de galhas com a distância das
árvores ao curso de água. Esses resultados devem ser vistos com cautela, pois
apesar dos autores encontrarem uma freqüência maior de folhas atacadas (RH +
galhas) não foi observado maior número de galhas na porção mais xérica do
gradiente. Novos estudos devem ser realizados para obter resultados mais
consistentes sobre os mecanismos que influenciam a resistência de T. glabrescens
contra o ataque de insetos. É necessário avaliar a arquitetura da raiz de T.
glabrescens bem como empiricamente a disponibilidade de água e nutrientes no
gradiente estudado.
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Abstract : This study describes the effects of a gradient of water availability on galls
attack to Terminalia glabrescens and its hypersensitive reaction (HR) to the attack.
Ten plots of 250 x 100 meters with T. glabrescens trees were marked and the
distance of each tree to the watercourse was determined. The HR frequency was
correlated with the distance of each tree to the watercourse by a linear regression
analysis. The frequencies of both leaves with HR and total leaves attacked (HR +
gall) increased positively with the distance from the watersource. However, the
authors did not find variations in the frequency of leaves with galls, average number
of galls per leaf and total number of galls with the distance of trees to the
watersource. These results must be viewed with caution as the authors found a
higher frequency of attacked leaves (HR + galls) was not observed higher number of
gall most xeric portion of the gradient. Further studies should be conducted to obtain
more consistent results on the mechanisms that influence the resistance of T.
glabrescens against insect attack. Is necessary evaluate the root architecture of T.
glabrescens as well as empirically the availability of water and nutrients in the
gradient studied.
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Introdução
As plantas apresentam muitas respostas evolutivas contra o ataque por inimigos
naturais (Herms e Mattson, 1992; Shewry & Lucas, 1997; De Wit, 2007). Estas
respostas podem envolver mudanças físicas, nutricionais e químicos, mesmo depois
de sofrer danos ou tensões (Karban & Baldwin, 1997). Na defesa constitutiva, as
plantas expressam a resistência de forma contínua, mesmo na ausência de
herbívoros ou outros inimigos naturais (Thaler et al. 1999), enquanto defesa induzida
acontece apenas após a estimulação pelo ataque por herbívoros.
Entre as respostas induzidas, a reação de hipersensibilidade (RH) tem sido
reconhecida como um importante mecanismo pelo qual as plantas se defendem
contra muitos herbívoros sésseis, incluindo insetos galhadores (revisado por
Fernandes, 1990; ver também Fernandes et al 2000, 2003;. Fernandes & Negreiros
2001; Ollerstam et al 2002;. Höglund et al 2005). A reação de hipersensibilidade
envolve uma série de fatores bioquímicos, morfológicos e de processos fisiológicos
que levam à localização, confinamento e morte do tecido atacado e,
conseqüentemente, do intruso (Fernandes, 1990). Ele deve ter evoluído muito cedo
no tempo evolutivo e, provavelmente, contra patógenos e nematóides em primeiro
lugar (Maclean et al 1974;. Fernandes, 1990; Fritig et al 1998;. Romero-Puertas et al
2004;. Takabatake et al 2006;. Baarlen et al . 2007). No caso da interação planta
patógeno, onde é mais bem estudado, um dos primeiros sinais observados no
desencadeamento da RH é a acumulação intracelular de Ca2 + (Baker et al. 1987),
seguida da ativação da H +/K + extracelular (Levine et al. 1996). Este sinal aciona
uma grande e rápida produção de compostos como as Espécies Reativas de
Oxigênio (ROS), incluindo a O2-H2O2 e OH, (Hegedus et al. 2001), enzimas
hidrolíticas, ácido salicílico, proteínas, calose e deposição de lignina; biossíntese de
complexos de antimicrobianos e metabólitos secundários (Lamb & Dixon, 1997;
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Heath 2000; Ollerstam et al 2002;. Ollerstam & Larsson, 2003; Levine 2004, Leitner
et al 2005;. ver Mittapalli et al 2007). O acúmulo de ROS na área de RH pode ser
tóxico para a planta, levando à morte do tecido foliar (necrose localizada, veja cap.2,
3). Em vários casos, o tecido necrótico desprende do limbo foliar em
desenvolvimento ainda deixando uma lacuna que pode ser facilmente confundida
com a herbivoria por insetos mastigadores, como por exemplo em Tapirira
guianensis Aubl. (Anacardiaceae) (Fernandes et al. 2010).
Os recursos são finitos e as plantas dependem deles para seu metabolismo,
crescimento e defesa (Herms & Mattson, 1992). Como as plantas ocupam habitats
com diferentes níveis de disponibilidade de água e nutrientes, defesas contra
herbívoros devem ser influenciadas pela disponibilidade de recursos. Em recentes
estudos sobre a relação entre a ocorrência de RH (necroses localizadas) e
disponibilidade de recursos nutricionais nas folhas de Terminalia glabrescens Mart,
1837 (Combretaceae), Magalhães et al. (Dados não publicados, cap. 3) encontrou
resultados que sugerem que a reação de hipersensibilidade em plantas dessa
espécie está fortemente relacionada à disponibilidade de nutrientes. Nós temos
postulado que o sucesso das reações de hipersensibilidade contra herbívoros deve
ser influenciado pelo ambiente, sendo menos eficiente em ambientes em que a
planta está sob estresse hídrico e nutricional.
Terminalia glabrescens é uma árvore que ocorre ao longo de um gradiente de
disponibilidade de água de à partir de 40 m até 300m de cursos de água no Parque
Nacional da Serra do Cipó, Minas Gerais, Brasil. A árvore é hospedeira de uma
espécie de inseto galhador de folhas e apresenta numerosas reações de
hipersensibilidade visíveis em suas folhas. Como esta planta hospedeira pode ser
encontrada ao longo de um gradiente de disponibilidade de água em algumas
centenas de metros, testamos a hipótese de que a freqüência de galhas em folhas e
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a resistência da planta (hipersensibilidade) variam ao longo do gradiente de água
(veja Fernandes & Price 1988, 1991; Price et al. 1998). Assim, o objetivo deste
estudo foi responder às seguintes perguntas: (1) Qual é a freqüência de galhas e de
HR na população de T. glabrescens, e (2) como a resistência induzida contra insetos
galhadores (reação de hipersensibilidade) varia ao longo do gradiente de
disponibilidade de água.
A grande maioria dos estudos sobre HR são baseados em sistemas
agronômicos (Klement & Goodman, 1967; Marmey et al 2007). Estudos sobre
reação de hipersensibilidade em ambientes naturais são raros. Poucos estudos
enfatizam a ecologia da reação de hipersensibilidade, embora o mecanismo de
defesa seja reconhecido como de grande importância e ocorrência em sistemas
naturais (Fernandes & Negreiros, 2001). Este estudo apesar de inicial e descritivo, é
um subsídio para futuros estudos sobre a ocorrência e os aspectos ecológicos
envolvidos na reação de hipersensibilidade.
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Material e métodos
Terminalia glabrescens é uma árvore comum caracterizada por indumento
tomentoso-ferruginoso, especialmente nos ramos, pecíolos e ao longo das nervuras
na face abaxial das folhas (Figura. 1A). Pode ser encontrada nos estados de Goiás,
Bahia, Minas Gerais, Rio de Janeiro (Silva, 1984) e São Paulo (Mattos 1969). Na
Serra do Cipó, muitas vezes é encontrada ao longo de matas ciliares (Kawasaki
1996).
Figura. 1: Terminalia glabrescens. a) indivíduos; b) folha com galhas de Cecidomyiidae sp.; c) folha com RH.
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O estudo foi realizado em uma população de T. glabrescens localizada ao longo
do rio Cipó e córrego das Pedras (curso de água, 19 º 36 '39 "S, 43 º 59' 93" W) no
interior do Parque Nacional da Serra do Cipó, Sudeste do Brasil. A temperatura varia
pouco durante o ano, enquanto que a precipitação tem uma variação forte e larga
entre as estações, com um verão chuvoso (novembro-janeiro) e inverno seco
(fevereiro-abril) (Madeira & Fernandes 1999). A média anual de precipitação é 1374
milímetros. Para responder nossas questões, dez parcelas de 250 × 100 metros
foram marcados ao longo do curso de água (Figura 2). A área de amostragem tem
um único tipo de solo e topografia. Em cada parcela, todos os indivíduos de T.
glabrescens foram marcados e georreferenciado para obter a distância de cada
indivíduo para o curso de água (n = 40 indivíduos).
Figura 2: Área de estudo. Os pontos pretos representam os indivíduos de T. glabrescens amostrados.
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As galhas que ocorrem nas folhas de T. glabrescens são esféricas, verdes,
glabras, medindo cerca de 2,0 ± 0,5 mm de largura, induzidas por uma espécie não
descrita de Cecidomyiidae (Diptera) (Fig. 1B). As reações de hipersensibilidade do
hospedeiro contra a indução de galhas foram reconhecidas como manchas
necróticas marrom escuro ou vermelhas, geralmente circulares, sobre a superfície
foliar (ver Fernandes et al. 2000, Fernandes & Negreiros 2001) (Fig. 1C). Para
analisar a freqüência de galhas e de RH na população de T. glabrescens, nós
coletados aleatoriamente cinco ramos terminais ao redor da coroa de todos os
indivíduos (n = 40). Em cada ramo contamos o número total de folhas, número de
folhas com galhas, número de folhas com reações de hipersensibilidade, e o número
de folhas atacadas nos ramos terminais (galhas e reações de hipersensibilidade).
Para se responder como a RH varia de acordo com o gradiente de disponibilidade
de água, a ocorrência de reações de hipersensibilidade foi correlacionada com a
distância de cada individuo de T. glabrescens até o curso de água por regressão
linear simples. Os valores de freqüência e incidência de RH foram transformados em
arc-sen da raiz quadrada devido a normalidade dos dados.
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Resultados
A altura dos indivíduos de Terminalia glabrescens variou de 1 a 5 metros (2,90 ±
0,18 m, n = 40) e teve uma média de 0,1620 ± 0,0152m (n = 40) de circunferência à
altura do peito. A distância média entre indivíduos foi de 14,20 ± 2,90m (n = 40). Os
indivíduos foram distribuídos na área de estudo entre 40 a 250m da fonte de água
(média de 139,80 ± 10.30m, n = 40).
Poucas galhas foram encontradas na população de T. glabrescens estudada.
Galhas foram encontradas em apenas nove dos 40 indivíduos de T. glabrescens
presentes na área de estudo (22,5%). O número de galhas por folha variou de 0 a 4
(n 0,01 ± 0,037, = 1,322), enquanto apenas 0,2% ± 0,75 (n = 1322) das folhas foram
atacadas. Todavia, todos os indivíduos de T. glabrescens amostrados apresentaram
reação de hipersensibilidade (manchas necróticas), e foram encontrados em 51,6 ±
13,3% (n = 40) das folhas. O número de reações de hipersensibilidade por folha em
cada planta variou de 0 a 122, com uma média de 1,70 ± 0,20 (n = 40) reações por
folha (Figura 3).
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O número total de reações de hipersensibilidade por planta (p = 0,48, F = 0,51, n
= 40) e a média das reações de hipersensibilidade por folha (p = 0,64, F = 0,21, n =
40) não variaram com a distância do curso de água. Todavia, a freqüência de folhas
com reação de hipersensibilidade (r2 = 0,17, p = 0,006, F = 8,24, y = 0,34 + 0.0013x,
n = 40), e a freqüência do total de folhas atacadas (reação de hipersensibilidade +
galhas) cresceu positivamente com a distância do curso de água (R2 = 0,19, p =
0,0035, F = 9,62, y = 0,31 + 0,0019 x, n = 40, Figura 4).
Figura 3: A) Frequência de HR e galhas em indivíduos de Terminalia glabrescens; B) Frequência de HR e galhas em folhas de Terminalia glabrescens; C) Média de HR e galhas por folha de Terminalia glabrescens.
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Figura 4: Frequência relativa de galhas (R2 = 0.17, p = 0.006, F = 8.24, y = 0.34 + 0.0013x, n=40) e reações de hipersensibilidade + galhas (R2 = 0.19, p = 0.003, F = 9.62, y = 0.31 + 0.0019 x, n=40) em Terminalia glabrescens as em função da distância do curso de água.
Não houve variação significativa na freqüência de folhas com galhas (R2 = 0,05,
p = 0,13, F1, 4 = 2,33, y = 2,90 - 0.01x, n = 40), número médio de galhas por folha
(R2 = 0,02, p = 0,36, F = 0,84, y = 0,02 - 0.00008x, n = 40), e número total de galhas
(R2 = 0,01, p = 0,44, F = 0,58, y = 0,58 - 0.0021x, n = 40) com a distância dos
indivíduos de T. glabrescens até o curso de água, indicando que a distância até a
água não teve nenhum efeito sobre o sucesso na indução de galhas.
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Discussão
O maior número de reação de hipersensibilidade em relação à indução de
galhas indica a importância deste mecanismo de defesa induzido. Fernandes (1990),
Fernandes e Negreiros (2001) e Fernandes et al. (2003), entre outros estudos,
destacaram a importância deste mecanismo pelo qual as plantas localizam e
eliminam as tentativas de indução de galhas por insetos galhadores.
A abundância de galhas do Cecidomyiidae não variou com a distância da planta
hospedeira para a água. Fernandes & Price (1988, 1991) propuseram a hipótese de
que a maior abundância de insetos galhadores deve ser esperada em condições
mais xéricas (ver também Cuevas et al. 2003), mas os dados sobre T. glabrescens
não oferecem suporte para esta hipótese. No entanto, esses resultados devem ser
vistos com cautela, pois a freqüência de galhas na população foi muito baixa
(apenas 0,2% das folhas amostradas), talvez impedindo a detecção de qualquer
tendência. Além disso, podemos descartar a hipótese alternativa de que as espécies
hospedeiras tem profundas raízes que lhes permitam obter água do subsolo
(Goldstein et al. 2008). A espécie de hospedeira é uma árvore que pode possuir um
sistema radicular bem desenvolvido e, dada a relativa proximidade da fonte de água,
eles poderiam obter água a uma distância moderada no solo. Futuros estudos
deverão abordar tal questão.
As reações envolvidas no processo de RH são sub-produtos da regulação do
metabolismo celular, mas sua produção pode ser geradas ou ampliadas quando as
plantas são submetidas a vários fatores de estresse, tais como a exposição à luz
alta, seca, temperaturas extremas, e também em resposta a estresses bióticos, tais
como ataque de patógenos (Mallick & Rai 1999; Breusegem et al 2001;. Mateo et al
2004, Kariola et al 2005).
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O estresse por água pode causar estresse nutricional indiretamente, pois as
plantas absorvem os nutrientes através da umidade. As deficiências nutricionais
podem prejudicar a comunicação celular gerando ineficiência no processo de reação
de hipersensibilidade. Durante a reação de hipersensibilidade, Ca2 + intracelular
aumenta (Baker et al. 1987), ocorrendo também a ativação da H + / K +
extracelulares (Levine et al. 1996). Assim, é provável que a deficiência desses
nutrientes limitem o levantamento das reações de hipersensibilidade (revisado por
Walters & Bingham, 2007). Sabe-se que a resistência das plantas contra patógenos
e alguns insetos pode ser aumentada com a disponibilidade de nutrientes, como
potássio (Mandahar et al 1998;. Orober et al 2002;. Mitchell & Walters, 2004;
Klikocka et al 2005), enxofre e nitrogênio (Dietrich et al 2004, 2005;. revisado por
Walters & Bingham, 2007). Os resultados devem ser vistos com cuidado, pois
encontramos uma freqüência maior de folhas com galhas e reações de
hipersensibilidade (ataque total) na porção mais xérica do gradiente. Assim, os
resultados de maior número de reações necróticas na porção xérica podem ser o
resultado de maior freqüência de ataques de fêmeas em hospedeiros, indicando a
preferência da fêmea (ver Santos et al. 2008), ou ainda que um gradiente de
estresse hídrico na verdade não existe para essa espécie. Estudos futuros deverão
avaliar a arquitetura de sistemas radiculares de T. glabrescens empiricamente bem
como a disponibilidade de água e nutrientes no gradiente estudado.
Agradecemos a D Negreiros, MAA Carneiro, P Cuevas-Reyes e dois revisores
anônimos por sugestões em versões inicias deste manuscrito. Pelo suporte logistico
providenciado no Parque Nacional da Serra do Cipó. Este estudo foi suportado pelo
CNPq (309633/2007-9. 476178/2008-8) e FAPEMIG (EDT-465/07, APQ-01278/08).
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Referencias:
Allan, A. C. & R. Fluhr. 1997. Two distinct sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells. Plant Cell 9: 1559–1572.
Baarlen, P. V.; E. J. Woltering; M. Staats & J. A. Kan. 2007. Histochemical and genetic analysis of host and non-host interactions of Arabidopsis with three Botrytis species: an important role for cell death control. Molecular Plant Pathology 8:41–54.
Baker, C. J; M. M. Atkinson & A. Collmer.1987. Concurrent loss in Tn5 mutants of Pseudomonas syringae pv. syringae of the ability to induce the HR and host plasma membrane K+/H+ exchange mechanism. Plant Physiology 79: 1268–1272.
Breusegem, F. V.; E. Vranová; J. F. Dat & D. Inzé. 2001. The role of active oxygen species in plant signal transduction. Plant Science 161: 405–414.
Cuevas-Reyes, P.; C. Siebe; M. Martínez-Ramos & K. Oyama. 2003. Species richness of gall-forming insects in a tropical rain forest: correlations with plant diversity and soil fertility. Biodiversity and Conservation 12: 411–422.
De Wit, P. J. G. 2007. How plants recognize pathogens and defend themselves. Cellular and Molecular Life Sciences 64: 2726–2732.
Dietrich, R.; K. Ploss & M. Heil. 2004. Constitutive and induced resistance to pathogens in Arabidopsis thaliana depends on nitrogen supply. Plant, Cell and Environment 27: 896–906.
Dietrich, R.; K. Ploss & M. Heil. 2005. Growth responses and fitness costs after induction of pathogen resistance depend on environmental conditions. Plant, Cell and Environment 28: 211–222.
Fernandes, G. W. 1990. Hypersensitivity: a neglected plant resistance mechanism against insect herbivores. Environmental Entomology 19: 1173-1182.
Fernandes, G. W. & D. Negreiros. 2001. The occurrence and effectiveness of Hypersensitive Reaction against galling herbivores across host taxa. Ecological Entomology 26: 46–55.
15
Fernandes, G. W.; H. M. Duarte & U. Lüttge. 2003. Hypersensitivity of Fagus sylvatica l. against leaf galling insects. Trees 17: 407–411.
Fernandes, G. W. & P. W. Price. 1988. Biogeographical gradients in galling species richness: tests of hypotheses. Oecologia 76: 161–167.
Fernandes, G. W. & P. W. Price.1991. Comparisons of tropical and temperate galling species richness: The roles of environmenlal harshness and plant nutrient status, p. 91–115. In: P. W. Price; T. M. Lewinsohn; G. W. Fernandes & W. W. Benson (ed). Plant-animal interactions: Evolutionary ecology in tropical and temperate regions. Wiley and Sons, New York. New York. USA. 640 p.
Fernandes, G. W.; T. G. Cornelissen; R. M. S. Isaias & A. C. F. Lara. 2000. Plants fight gall formation: Hypersensitivity. Ciência e Cultura 52: 49–54.
Fritig, B.; T. Heitz; M. Legrand .1998. Antimicrobial proteins in induced plant defence. Current Opinion in Immunology 10:16–22.
Goldstein, G.; F. C. Meinzer; S. J. Bucci; F. G. Scholz; A. C. Franco & W. A. Hoffmann. 2008. Water economy of Neotropical savanna trees: six paradigms revisited. Tree Physiology 28: 395–404.
Heath, M. C. 2000. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology 44:321–334.
Hegedus, A.; S. Erdei & G. Horváth .2001. Comparative studies of H2O2 detoxifying enzymes in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Science 160:1085–1093.
Herms, D. A. & W. J. Mattson. 1992. The dilemma of plants: to grow or defend. Quarterly Review of Biology 67: 283–335.
Höglund, S., Larsson, S. & G. Wingsle. 2005. Both hypersensitive and non-hypersensitive responses are associated with resistance in Salix viminalis against the gall midge Dasineura marginemtorquens. Journal of Experimental Botany 56: 3215–3222.
Karban, R. & I. T. Baldwin. 1997. Induced responses to herbivory. Chicago, The University of Chicago Press, ix+319 p.
16
Kariola T; G. Brader; J. Li & T. Palva. 2005. Chlorophyllase 1, a damage control enzyme, affects the balance between defense pathways in plants. Plant Cell 17: 282–294.
Kawasaki, M. L. 1996. Flora da Serra do Cipó, Minas Gerais: Combretaceae. Boletim de Botânica, Universidade de São Paulo 15: 101–108.
Klement, Z & R. N. Goodman. 1967. The Hypersensitive Reaction to Infection by Bacterial Plant Pathogens. Annual Review of Phytopathology 5: 17–44.
Klikocka, H; S. Haneklaus; E. Bloem & E. Schnug. 2005. Influence of sulphur fertilisation on infection of potato tubers with Rhizoctonia solani and Streptomyces scabies. Journal of Plant Nutrition 28: 819–833.
Lamb, C. & R. A. Dixon. 1997. The oxidative burst in plant disease resistance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48:251–75.
Leitner, M.; W. Boland & A. Mithöfer. 2005. Direct and indirect defences induced by piercing-sucking and chewing herbivores in Medicago truncatula. New Phytologist 167:597–606.
Levine, A .2004. Programmed cell death in plant response to biotic stress (pathogen attack), p. 213–250. In: Gray J. (ed.) Programmed cell death in plants. Ohio, Blackwell Publishing, 287p.
Levine, A.; R. I. Pennell; M. E. Alvarez; R. Palmer & C. Lamb. 1996. Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistant response. Current Biology 6: 427–37
Maclean, D. J.; J. A. Sargent; I. C. Tommerup & D. S. Ingram .1974. Hypersensitivity as the primary event in resistance to fungal parasites. Nature 249:186–187.
Madeira, J. A. & G. W. Fernandes. 1999. Reproductive phenology of sympatric taxa of Chamaecrista (Leguminosae) in Serra do Cipó, Brazil. Journal of Tropical Ecology 15: 463–479.
Mallick, N. & L. C. Rai. 1999. Response of the antioxidant systems of the nitrogen fixing cyanobacterium Anabaena doliolum to the copper. Journal of Plant Physiology 155:146–149.
17
Mandahar, H. K.; H. J. Lyngs-Jorgensen; S. B. Mathur. & V. Smedegaard-Petersen. 1998. Resistance to rice blast induced by ferric chloride, di-potassium hydrogen phosphate and salicylic acid. Crop Protection 17: 323–329.
Marmey, P.; A. Jalloul; M. Alhamdia; K. Assigbetse; J. Cacas; A. E. Voloudakis; A. Champion; A. Clerivet; J. Montillet & M. Nicole. 2007. The 9-lipoxygenase GhLOX1 gene is associated with the hypersensitive reaction of cotton Gossypium hirsutum to Xanthomonas campestris pv malvacearum. Plant Physiology and Biochemistry 45: 596–606.
Mateo, A.; P. Mühlenbock; C. Rusterucci; C. C. Chang; Z. Miszalski; B. Karpinska; J. E. Parker; P. M. Mullineaux & S. Karpinski. 2004. Lesion simulating disease is required for acclimation to conditions that promote excess excitation energy. Plant Physiology 136: 2818–2830.
Mattos, N. F. 1969. Combretaceae do Estado de São Paulo. Arquivos de Botânica do Estado de São Paulo 4: 237–241.
Mitchell, A. F. & D. R. Walters. 2004. Potassium phosphate induces systemic protection in barley to powdery mildew infection. Pest Management Science 60: 126–134.
Mittapalli, O.; J. J. Neal & R. H. Shukle. 2007. Antioxidant defense response in a galling insect Proceding of the national academy of sciences of the united states of America. PNAS 104:1889–1894.
Ollerstam, O.; O. Rohfritsch; S.Höglund & S. Larsson. 2002. A rapid hypersensitive response associated with resistance in the willow Salix viminalis against the gall midge Dasineura marginemtorquens. Entomol. Exp. Appl. 102:153–162.
Ollerstam, O. & S. Larsson S. 2003. Salicylic acid mediates resistance in the willow Salix viminalis against the gall midge Dasineura marginemtorquens. Journal of Chemical Ecology 29:163–174.
Orober, M.; J. Siegrist & H. Buchenauer. 2002. Mechanisms of phosphate-induced disease resistance in cucumber. European Journal of Plant Pathology 108: 345–353.
18
Price, P. W.; G. W. Fernandes; A. C. F Lara; J. Brawn; H. Barrios; M.G. Wright; S.P. Ribeiro & N. Rothcliff. 1998. Global patterns in local number of insect galling species. Journal of Biogeography 25:581–591.
Roberts, M. R. & N. D. Paul. 2006. Seduced by the dark side: integrating molecular and ecological perspectives on the influence of light on plant defence against pests and pathogens. New Phytol 170: 677–699.
Romero-Puertas, M. C.; M. Perazzolli; E. D. Zago & M. Delledonne. 2004. Nitric oxide signalling functions in palnt-pathogen interactions. Cellular Microbiology 9:795–803.
Santos, J. C.; F. A. O. Silveira & G. W. Fernandes. 2008. Long term oviposition preference and larval performance of Schizomyia macrocapillata (Diptera: Cecidomyiidae) on larger shoots of its host plant Bauhinia brevipes (Fabaceae). Evolutionary Ecology 22: 123–137.
Shewry, P. R. & J. A. Lucas. 1997. Plant proteins that confer resistance to pests and pathogens. advances in botanical research incorporating advances. Plant Pathology 26: 135–192.
Silva, M. F. 1984. Combretaceae do Estado do Rio de Janeiro. Subtribo Terminaliinae. Rodriguésia 36: 91–104.
Takabatake, R.; S. Seo; N. Ito; Y. Gotoh; I. Mistuhara & Y. Ohashi. 2006. Involvement of wound-induced receptor-like protein kinase in wound signal transduction in tobacco plants. The Plant Journal 47:249–257.
Thaler, J. S.; A. L. Findantsef; S. S. Duffey & R. M. Bostock. 1999. Trade-offs in plant defense against pathogens and herbivores: A field demonstration using chemical elicitors of induced resistance. J. Chem. Ecol. 25: 1597–1610.
Walters, D. R. & I. J. Bingham. 2007. Influence of nutrition on disease development caused by fungal pathogens: implications for plant disease control. Annals of Applied Biology 151: 307–324.
19
CAPÍTULO 2
Dano foliar em T. glabrescens: herbivoria ou defesa contra a indução de galhas?
Resumo: A reação de hipersensibilidade (RH) é acionada em resposta a patógenos
e / ou ataque de insetos, causando mudanças em torno do local do ataque,
resultando em morte do tecido e, em seguida, o tecido atacado se converte em um
tecido necrosado que pode sofrer abscisão causando furos nas folhas que podem
ser confundidos com a remoção de área foliar causado por herbívoros mastigadores
e, portanto, não estão sendo computados corretamente. Este estudo teve como
objetivos: (1) Avaliar se as necroses (RH) em folhas de T. glabrescens são
causados, em resposta ao ataque de insetos galhadores, (2) identificar se os danos
são causados por queda de folhas de tecido necrótico ou são causadas pela
remoção de insetos mastigadores e (3) indicar que inseto (s) que estão causando as
reações de hipersensibilidade. Para configurar esse tipo de experimento as folhas
foram monitorados nos primeiros estágios de desenvolvimento em dois grupos: 1)
folhas expostas ou 2) protegidos contra o ataque de invertebrados. O número de
buracos nas folhas aumentou com o número de necroses (RH) diminuiu nas folhas
protegida de ataques externos, assim, indicando que os furos foram causados pelo
colapso do tecido necrosado. Folhas nascidas protegidas não desenvolveram
reações de hipersensibilidade e nem buracos, enquanto as reações (p = 0,0004) e
danos (p = 0,006) nas folhas expostas aumentou durante as quatro semanas de
estudo. Os únicos insetos que tiveram seus ovos ou larvas eclodidos nos
tratamentos em que as folhas eram protegidas ao ataque de insetos galhadores
foram Diptera Cecidomyiidae.
20
Abstract: The hypersensitivity reaction (HR) is triggered in response to pathogens
and/or insects attack causing changes around the site of attack resulting in death of
tissue and then attacked in a necrotic tissue that can undergo abscission causing
holes in leaves that may be confused with the removal of leaf area caused by
chewing herbivores and thus are not being computed correctly. This study aimed to:
(1) Evaluate whether the necroses (HR) in leaves of T. glabrescens are caused in
response to attack by galling insects, (2) identify whether the damages are caused by
leaf fall of necrotic tissue or are caused by the removal of chewing insects and (3)
indicate the insect(s) that are causing the hypersensitivity reactions. To set up such
an experiment where leaves were monitored at early stages of development into two
groups: 1) leaves exposed or 2) leaves protected against the attack of invertebrates.
The number of holes in the leaves increased as the number of necroses (HR)
decreased in the leaves protected from external attack, thus, indicating that the holes
were caused by the collapse of the necrotic tissue. Born in the leaves protected were
not provided with invertebrates of hypersensitivity reactions and no holes in any
sheet bagged, while reactions (p = 0.0004) and damage (p = 0,006) were exposed in
the leaves during the 4 weeks of study. The only insects that had their eggs or larvae
hatched in the treatments in which the leaves were protected to the attack were
foreign galling Cecidomyiidae Diptera.
21
Introdução
Embora herbívoros removam em média cerca de 10% da área foliar, a perda
da folhagem pode chegar a 100% em alguns casos (Schowalter et al. 1986, Aldea et
al. 2005, Rogers & Siemann, 2005). A herbivoria pode ter profundo impacto no
crescimento, na reprodução e até mesmo na capacidade de competição das plantas
(Coley 1983, Rosenthal & Kotanen 1994, Krupnick et al. 1999). Assim, a pressão
dos herbívoros sobre suas plantas hospedeiras tem conduzido a evolução de
defesas químicas, mecânicas e fenológicas (Price 1991). Em alguns casos, a
interação negativa entre plantas e herbívoros fez com que as plantas
desenvolvessem defesas induzidas contra estes (Karban & Baldwin 1997).
Especificamente, as respostas induzidas contra a formação de galhas são relatadas
como uma das mais importantes causas de mortalidade de insetos galhadores
(Fernandes 1990, 1998). Dentre as várias reações induzidas, a reação de
hipersensibilidade tem sido reportada como o principal mecanismo pelo qual as
plantas se defendem do ataque e minimizam os danos causados por insetos
herbívoros (Fernandes 1990, Rossi & Stiling 1998, Fernandes & Negreiros 2001,
Fernandes et al. 2003).
Ao ser desencadeada a RH contra patógenos, observam-se uma série de
alterações ao redor do sítio de ataque (Levine 2004, Leitner et al. 2005, Mittapalli et
al. 2007). Dado a enorme diversidade de insetos galhadores (veja Espirito santo &
Fernandes 2007), espera-se que este fenômeno de resistência fosse bastante
comum e antigo na natureza (Fernandes e negreiros 2001). Todavia, são poucos os
relatos da ocorrência deste tipo de defesa induzida. Uma hipótese foi levantada
recentemente por Fernandes et. al. (2009) que mostraram que buracos em folhas da
espécie Tapirira guianensis (Anacardiaceae) são o resultado da queda do tecido
necrótico em resposta a indução de galhas por um Cecidomyiidae em tecidos
22
indiferenciados e/ou patógenos e não por herbívoros de vida livre. Fernandes e
colaboradores (2009) afirmaram que investigações cautelosas durante as fases
iniciais de desenvolvimento das folhas seriam fundamentais para desvendar as
taxas reais de dano na área foliar causada por insetos indutores de galhas daquela
causada por herbívoros mastigadores, bem como daquela por patógenos.
Observações casuais indicaram que a árvore Terminalia glabrescens
(Combretaceae) apresenta uma grande frequência de reações de hipersensibilidade
(necroses) e danos (furos circulares) em suas folhas (Figura 1a, b). Além disto, é
atacada por pelo menos três espécies de insetos galhadores ainda não identificados
da família Cecidomyiidae (Díptera). Este sistema oferece uma boa oportunidade
para a observação da origem e autoria do tecido necrótico que se assemelha às
reações de HR (sensu Fernandes 1990) bem como dos numerosos furos circulares
nas folhas.
Assim, este trabalho teve por objetivo: (1) Determinar a frequência da reação
de hipersensibilidade e danos foliares causados por herbívoros de vida livre na
população de T. glabrescens estudada; (2) Avaliar se as reações de
hipersensibilidade nas folhas de T. glabrescens são causadas como reposta ao
ataque por insetos galhadores; (3) Identificar se os danos foliares são causados pela
queda do tecido necrótico da reação de hipersensibilidade ou são caudados pela
remoção por insetos mastigadores e (4) Apontar o(s) inseto(s) que estariam
desencadeando as reações de hipersensibilidade.
23
Material e método
Terminalia glabrescens Mart. (Combretaceae) é uma árvore que ocorre com
frequência nas matas ciliares da Serra do Cipó em Minas Gerais, Brasil (Kawasaki
1996). A espécie é caracteriza-se pelo indumento ferrugíneo-tomentoso,
especialmente nos ramos, pecíolos e junto às nervuras na face abaxial das folhas,
com folhas obovais a oblanceoladas, pecíolos de até 1cm comprimento e frutos
alados (Cielo-Filho & Santin 2002).
A área estudada localiza-se às margens do rio do Cipó entre as coordenadas
19° 21’ 53,0’’S e 43° 36’ 03,1’’W. A precipitação apresenta forte sazonalidade e
ampla variação, com um período chuvoso no verão e período seco no inverno. A
média anual de precipitação é de 1.374mm (veja Madeira & Fernandes 1999). Os
indivíduos da população de T. glabrescens estudada apresentaram 3 espécies de
insetos galhadores de folhas. As galhas induzidas pela espécie 1 (Figura 1e) são as
mais abundantes, esverdeadas, glabras, esféricas (1.00±0.3mm de diâmetro).
Aquelas induzidas pela espécie 3 são bastante raras. As galhas da espécie 2 são
induzidas por um Cecydomyiidae ainda não identificado; sem pêlos, cônicas
(4,10±0,4mm de comprimento / 2.00±0.24mm de largura; Figura 1f). Enquanto a
espécie 3 apresenta galhas esféricas, avermelhadas, com pêlos, medindo cerca de
4,12±0.30mm de diâmetro (Figura 1g). Todas as 3 espécies de galhas ocorreram
tanto na face abaxial quanto adaxial das folhas.
As reações de hipersensibilidade foram reconhecidas como manchas marrons
ou avermelhadas, circulares nas folhas de T. glabrescens medindo 5.41±0.27 mm2
(n = 185; Figura 1a). As bordas externas destas reações apresentaram-se de
coloração mais escura e de forma circular. Os danos foliares foram reconhecidos
como furos geralmente circulares nas folhas medindo cerca de 7.32±1.3 mm2 (n =
24
e f g
a b
d c
75; Figura 1b), sem apresentar alterações perceptíveis no tecido foliar que margeia
os furos. Quando os furos surgem na borda foliar ou em estágios iniciais de
expansão foliar, aqueles podem se apresentar ovais ou disformes (Figura 2C,D),
indicando a ocorrência de coalescência.
Figura 1. (a) Reação de hipersensibilidade; danos foliares: (b) furo circular, (c,d) furos amorfos; e galhas: (e) espécie 1, (f) espécie 2, (g) espécie 3, em T. glabrescens
25
Para responder as perguntas, foram localizados 50 indivíduos de T.
glabrescens, dos quais 20 indivíduos foram aleatoriamente selecionados para os
experimentos. A montagem do experimento e a coleta dos dados foram realizados
durante três meses consecutivos (outubro e dezembro) em 2007 quando as folhas
encontravam-se no seu início de desenvolvimento. O experimento foi dividido em
duas partes. Na primeira, os ramos foram divididos em 3 tratamentos, os quais
foram feitos em duas réplicas por planta (6ramos/planta). A média de folhas
ensacadas sadias por ramo foi de 2.78±0.20 e a média de folhas ensacadas com
hipersensibilidade por ramo foi de 1.97±0.19 no tratamento 1. Neste tratamento foi
ensacada uma média de 9.43±0.50 folhas por árvore (n = 20). No tratamento 2
foram ensacados apenas ramos com folhas sadias (4.47±0.23, n = 20)
No tratamento 1 foram selecionados e ensacados ramos que continham tanto
folhas sadias quanto ramos com hipersensibilidade e danos por herbivoria. A média
de folhas ensacadas sadias por ramo foi de 2.78±0.20 e a média de folhas
ensacadas com hipersensibilidade por ramo foi de 1.97±0.19 no tratamento 1. Neste
tratamento foi ensacada uma média de 9.43±0.50 folhas por árvore (n = 20). No
tratamento 2 foram ensacados apenas ramos com folhas sadias (4.47±0.23, n = 20).
O ensacamento (tratamentos 1 e 2) foi realizado com Organza (tecido fino e
transparente, de trama simples e permitiu o isolamento das folhas do ataque por
qualquer invertebrado). Antes do ensacamento (tratamentos 1 e 2) foram removidos
todos insetos, ovos e formas imaturas de insetos das folhas. O tratamento 3
também apresentou tanto ramos com folhas sadias (3.7±0.17) quanto com marcas
de hipersensibilidade (1.9±0.14)(10.75±0.66 folhas por árvore, n = 20 árvores);
porém os mesmos não foram ensacados.
A segunda parte do experimento foi realizada em novembro, no começo do
período de chuvas, utilizando-se os mesmos indivíduos de T. glabrescens para
26
testar se as reações de hipersensibilidade que viessem a surgir nos ramos do
primeiro experimento acima fossem provenientes de estímulos anteriores à
montagem do experimento. Assim, ramos secundários e folhas originadas em todos
tratamentos foram também monitorados, o que evidenciaria a importância do contato
com insetos para a indução da hipersensibilidade e furos nas folhas. Assim, para se
responder se insetos estão relacionados com a reação de hipersensibilidade o
experimento foi monitorado semanalmente. Os resultados observados foram
submetidos a teste de normalidade e posteriormente comparados através de Análise
de Variância (Anova).
Para responder se os danos foliares (furos circulares/buracos) são causados
pela queda de tecidos necróticos da reação ou por insetos mastigadores observou-
se o surgimento de danos foliares nas folhas ensacadas (protegidas contra insetos)
e naquelas expostas ao ataque de insetos tanto na primeira quanto na segunda
parte do experimento. Oportunamente para se testar se os danos foliares seriam
causados pela expansão da área sadia (o tecido morto necrótico não se expande) e
o consequente desprendimento do tecido necrótico, o maior comprimento e maior
largura (mm) tanto da área circular de tecido necrótico causada pela reação de
hipersensibilidade (área necrótica propriamente dita) e da área de tecido sadio
imediatamente após a borda da reação de hipersensibilidade foram medidos
semanalmente em quatro folhas por árvore do tratamento 3 do experimento 1 (n =
20 indivíduos, 80 folhas). Para este experimento forma selecionadas folhas que
ainda encontravam-se em fase inicial de expansão da lâmina foliar até o término
desta (outubro a novembro). Os dados foram comparados através de regressão
linear simples.
Para responder se insetos seriam os responsáveis pelas reações de
hipersensibilidade, observou-se semanalmente a presença de ovos ou
27
desenvolvimento de larvas de insetos, que poderiam estar previamente presentes
nas folhas utilizadas nos dois experimentos. Assim, postulou-se que a espécie que
se desenvolvesse nas folhas ensacadas de T. glabrescens seria considerada a
espécie relacionada à reação de hipersensibilidade.
28
Resultados
Todos os indivíduos de T. glabrescens observados apresentaram tanto tecidos
necróticos típicos da reação de hipersensibilidade quanto danos (i.e., furos
circulares/buracos) nas folhas (n = 20 árvores). A média geral de reações de
hipersensibilidade por folha foi de 4.9±1.2 (n = 2921) enquanto a de danos foi de
3.2±0.6 (n = 1907) (n = 596 folhas, 20 árvores). O número de RH foi de 0 a 27 e de
0 até 18 danos por folha.
As reações de hipersensibilidade e furos nas laminas foliares surgiram durante o
período de estudo tanto nas folhas dos ramos ensacados (tratamentos 1 e 2) quanto
nas folhas dos ramos expostos (tratamento controle). Todavia, o aumento no
número de furos nas laminas foliares e a diminuição no número de reações de
hipersensibilidade nos tratamentos nos quais as folhas foram protegidas do ataque
externo é indicativo de que os furos seriam causados pela queda do tecido
necrótico. O número de reações diminuiu no experimento 1, onde as folhas foram
ensacadas, passando de 175 na primeira semana para 149 na semana 11. No
mesmo período, o número de furos passou de 0 para 102 (Figura 2a).
No tratamento onde folhas sadias foram ensacadas (tratamento 2), tanto
reações de hipersensibilidade quanto furos na lamina foliar surgiram a partir do início
do experimento. As reações de hipersensibilidade foram observadas a partir da
segunda semana enquanto os furos nas laminas foliares surgiram a partir da terceira
semana após o início deste tratamento. Na terceira semana foram registradas 31
reações de hipersensibilidade e danos foliares nas folhas. Este número não se
alterou até o final do experimento. Contudo, o número de reações de
hipersensibilidade que inicialmente era de 21 diminuiu para 16 ao final do
experimento, enquanto o número de furos passou de 10 para 15 (Figura 2b).
Figura 2. (a) Média de reações de hipersensibilidade e danos por folha de glabrescens ensacada sadia ou com reação; (b) ensacadas sadias; (c) e desprotegidas sadias ou com reação em cada semana de estudo. Os pontos representam a média de furos e HR, e as barras vpadrão.
0
2
4
6
8
Aver
age/
Leaf
b Caged (healthy)
0
1
2
3
4
5
6
Aver
age/
Leaf
a Caged (healthy + damaged)
012345678
Aver
age/
Leaf
c Exposed
a) Média de reações de hipersensibilidade e danos por folha de ensacada sadia ou com reação; (b) ensacadas sadias; (c) e
desprotegidas sadias ou com reação em cada semana de estudo. Os pontos representam a média de furos e HR, e as barras verticais representam o erro
Caged (healthy)
Caged (healthy + damaged)
Week
29
a) Média de reações de hipersensibilidade e danos por folha de T. ensacada sadia ou com reação; (b) ensacadas sadias; (c) e
desprotegidas sadias ou com reação em cada semana de estudo. Os pontos erticais representam o erro
HRHoles
30
No início do experimento do tratamento 3 nos quais as folhas ficaram expostas
haviam 191 reações de hipersensibilidade nas folhas (0.88±0.7 reações/folha). O
número de reações aumentou até o total de 247 (1.14±0.5 reações/folha) até a
semana 11. Da mesma forma, o número de furos aumentou de 0 para 202
(0.93±0.42) até a semana 11. Assim houve aumento constante no número tanto das
reações de hipersensibilidade quanto de furos nas folhas expostas (Figura 2c),
indicando a necessidade de estímulos externos no desenvolvimento de reações de
hipersensibilidade e bem como no surgimento de furos nas laminas foliares de T.
glabrescens.
O número total de reações (F1,27 = 1.5, p = 0.2) e furos (F1,27 = 2.2, p = 0.1) tanto
em folhas expostas quanto protegidas do ataque não diferiu entre os tratamentos.
Todavia, o surgimento de reações (F1,18 = 23.1, p = 0.0001) e furos (F1,18 = 19.2, p =
0.0003) nas folhas protegidas (tratamentos 1 e 2) foi significativamente maior nas
duas primeiras e menor nas ultimas nove semanas restantes do estudo (Figura 3).
Figura 3. (a). Média de novas reações e novos danos nas folhas ensacadas, nas duas primeiras e nas nove ultimas semanas de estudo. As barras verticais representam o erro padrão.
05
1015202530354045
10-17/out 24/out-19/dez
Aver
age/
Leaf
Weeks
HR
Holes
31
Nas duas primeiras semanas de estudo não houve diferença significativa entre
número de reações (F2,3 = 0.6, p = 0.6) e furos nas laminas foliares (F2,3 = 1.5, p =
0.4) em todos tratamentos realizados (Figura 4a). Todavia, diferenças
estatisticamente significativas foram observados entre o número de reações (F1,21 =
9.4, p = 0.001) e furos (F1,21 = 10.7, p = 0.0006) nas ultimas nove semanas (Figura
4b). Estes resultados indicam que nos tratamentos nos quais as folhas foram
ensacadas as folhas já haviam sido estimuladas, porém as reações não eram
visíveis a olho nu.
32
Figura 4. (a) Média de reações e danos em cada tratamentos durante as duas primeiras semanas. (b) Média de reações e danos em cada tratamento durante as ultimas nove semanas. As barras verticais representam o erro padrão.
Durante a segunda parte do experimento foram avaliadas as folhas que
nasceram protegidas do contato com invertebrados. Neste estudo de quatro
semanas não surgiram reações de hipersensibilidade e nem furos em nenhuma
0
20
40
60
80
100
120Average/Leaf
a HR
Holes
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Healthy + Damaged Healthy Exposed
Average/Leaf
Caged
b
33
folha ensacada, enquanto reações (85) e danos (29) surgiram nas folhas expostas
(Figura 5). O número de reações (F1,10 = 27.6, p = 0.0004) e furos (F1,10 = 12.2, p
= 0.006) observado nas folhas expostas diferiu significativamente do observado nas
folhas ensacadas. Os furos apareceram uma semana após o aparecimento das
reações de hipersensibilidade, indicando que as reações surgem devido a fatores
externo e que são formadas a partir das reações de hipersensibilidade.
Figura 5. Número de reações e danos nas folhas de T. glabrescens nascidas ensacadas ou expostas. As barras verticais representam o erro padrão.
Os únicos insetos que tiveram suas larvas ou ovos eclodidos no tratamento nos
quais as folha foram protegidas ao ataque externo foram pequenos Dípteros
galhadores da família Cecidomyiidae. Os três tipos de galhas foram observados em
dois diferentes ramos ensacados em dois indivíduos de T. glabrescens. As galhas
observadas pertenciam a espécie 2 (Figura 1f).
0
20
40
60
80
100
7/nov 14/nov 21/nov 28/nov
Tota
l num
ber
Weeks
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Holes (caged)
HR (caged)
Holes (exposed)
HR (exposed)
34
A área necrótica resultante da reação de hipersensibilidade não apresentou
relação positiva com o aumento da área foliar total (r2 = 0.015, F1,78 = 1.2, p = 0.3).
Todavia, a área ocupada pelos furos na lamina foliar aumentou com o aumento da
área foliar total (r2 = 0.34, F1,78 = 40.0, p = 0.001, y = 5.22 + 0.03x).
35
Discussão
As plantas apresentam fina sintonia evolutiva com seus insetos herbívoros,
principalmente aqueles que podem infringir grandes danos, como o caso dos insetos
galhadores. A reação de hipersensibilidade apresentada pelas plantas se destaca
como o mais efetivo mecanismo de resistência da planta contra estes insetos
(Fernandes 1990, 1998) e está amplamente distribuída entre as plantas (Fernandes
& negreiros 2001). No sistema estudado, durante as duas primeiras semanas o
surgimento de reações de hipersensibilidade e furos nas laminas foliares expostas e
ensacadas foi semelhantes. Todavia, da terceira à décima primeira semana de
observação não houve a indução de reações de hipersensibilidade nos tratamentos
nos quase ramos e folhas foram ensacados. Estes resultados indicam a presença
de estimulo externo, ou seja, ovos ou larvas dos insetos galhadores, nestas folhas
antes do início do experimento. Embora todas as folhas ensacadas estivessem
intactas, havia a possibilidade destas conterem ovos ou pequenas larvas presentes
antes do início do experimento. Larvas de primeiro instar e ovos de Cecidomyiidae
são extremamente pequenas e de dificílima observação no campo. Tal tarefa torna-
se mais complexa quando as folhas apresentam tricomas em sua superfície, como
em T. glabrescens. Nenhuma reação de hipersensibilidade surgiu nas folhas que
nasceram após o isolamento (n = 211; 126 ensacadas e 85 expostas). Porém, tanto
reações quanto danos surgiram nas folhas expostas indicando a necessidade de um
fator externo como ovos ou larvas para a indução das reações de hipersensibilidade
e furos circulares (Fernandes 1998). Durante as observações semanais da eclosão
de ovos ou larvas nas folhas expostas ou ensacadas utilizadas nos dois
experimentos observou-se unicamente a indução de 8 galhas, sendo 3 em folhas de
ramos ensacados e 5 em folhas de ramos expostos, sugerindo que a reação de
36
hipersensibilidade em T. glabrescens está relacionada a insetos galhadores
(Fernandes 1998).
O estímulo inicial para a reação de hipersensibilidade poderia tanto ser o início
da manipulação do tecido foliar pelo inseto galhador ou a invasão do sítio de
oviposição por patógenos durante os estágios iniciais da indução da galha
(Fernandes 1990, Fernandes et al. 2000). Mesmo se a reação de hipersensibilidade
for desencadeada por patógenos transportados pelo inseto galhador, a morte do
sítio de oviposição provavelmente causaria a morte dos ovos e/ou larvas.
Os furos comumente observados nas folhas de T. glabrescens são causados
pela abscisão do tecido necrótico onde se desencadeou a reação de
hipersensiblidade. Na área de necrose localizada causada pela reação de
hipersensibilidade não há divisão celular, assim também não há crescimento do
tecido foliar (Fernandes et al. 2000, Somssich et al. 1988, Shmelzer et al. 1989,
Fritig et al. 1998, Heath 2000, Mittapalli 2007). Como o tecido sadio ao redor da
área necrótica continua seu desenvolvimento e crescimento, há muitas vezes o
rompimento deste do tecido necrótico resultando no aparecimento de furos na
lamina foliar. Estes furos podem ser arredondados ou, quando adjacentes
coalescem e assim apresentam formas diferentes. Em alguns casos podem ficar
maiores que as áreas de reação (necrose localizada) dependendo da expansão
foliar após o surgimento da reação ou necrose (Fernandes et al. 2009), e assim
serem facilmente confundidas com danos causados por folívoros. Quando não há,
ou há pouca expansão foliar após o surgimento da reação não há formação de furos,
como em folhas mais velhas. Em alguns casos as reações de hipersensibilidade
surgem tardiamente após a expansão foliar completa.
37
Padrões gerais de herbivoria por insetos mastigadores de folhas indicam valores
médios que vão desde 7.1% (florestas temperadas) até 14.2% (florestas tropicais
secas) (Coley & Barone, Kursar & Coley 2003). De tal modo, é possível que estes
padrões estejam sobreestimados devido a alta frequência de reação de
hipersensibilidade em plantas (Fernandes 1990).
Uma conseqüência imediata dos resultados aqui apresentados é a necessidade
de investigações mais aprofundadas em estudos sobre danos foliares e herbivoria,
principalmente quando as plantas forem hospedeiras de insetos galhadores, pois os
danos nas laminas foliares podem ser causados pela abscisão do tecido necrótico
das áreas de reação de hipersensibilidade e não por insetos mastigadores.
Agradecemos a P Cuevas-Reyes pelas sugestões em versões anteriores do
manuscrito. Agradecem também ao Programa de Pós Graduação em Ecologia,
Conservação e Manejo de Vida Silvestre e ao IBAMA (Parque Nacional da Serra do
Cipó) pelo suporte logístico no local de trabalho. Este trabalho contou com suporte
do CNPq (309633/2007-9) e Fapemig (EDT 465/07).
38
Referências:
Baarlen P V, Woltering E J, Staats M et al (2007) Histochemical and genetic analysis
of host and non-host interactions of Arabidopsis with three Botrytis species: an
important role for cell death control. Molecular Plant Pathology 8:41–54
Bentur J S, Kalode M B (1996) Hypersensitive reaction and induced resistance in rice
against the Asian rice gall midge Orseolia oryzae. Entomologia experimentalis et
applicata, 78: 77–81
Coley P D, Barone J A (1996) Herbivory and palnt defenses in tropical forests.
Annual review of ecology and systematics 27: 305–335
Coulson R N, Witter J A (1984) Forest entomology: Ecology and Management, John
Wiley & Sons, Canada
Eichler A G (1867) Combretaceae. In C.F.P. Von Martius (ed.) Flora brasiliensis
14:77–128
Elmon S, Susanne K, Klaus H (1989) Temporal and spatial patterns of gene
expression around sites of attempted fungal infection in parsleu leaves. The Plant
Cell. Vol. 1: 993
1001
Fernandes G W (1990) Hypersensitivity: a neglected plant resistance mechanism
against insect herbivores. Environ Entomol 19: 1173–1182
Fernandes G W (1998) Hypersensitivity as a phenotypic basis of plant induced
resistance against a galling insect (Diptera: Cecidomyiidae). Environ Entomol
27:260–267
39
Fernandes G W, Negreiros D (2001) The occurrence and effectiveness of
hypersensitive reaction against galling herbivores across host taxa. Ecological
Entomology 26: 46–55
Fernandes G W, Cornelissen T G, Isaias R M S et al (2000) Plants fight gall
formation: hypersensitivity. Cienc Cult 52:49–54
Fernandes G W, Duarte H M, Lüttge U (2003) Hypersensitivity of Fagus sylvatica L.
against leaf galling insects. Trees 17:407–411
Fritig B, Heitz T, Legrand M (1998) Antimicrobial proteins in induced plant defence.
Current Opinion in Immunology 10:16–22
Garza J C, Williamson E G (2001) Detection of reduction in population size using
data from microsatellite loci. Molecular Ecology 10:305–318
Madeira J A, Fernandes G W (1999) Reproductive phenology of sympatric taxa of
Chamaecrista (Leguminosae) in Serra do CipoÂ, Brazil. Journal of Tropical Ecology
15:463–479
Karban R, Baldwin I T (1997) Induced responses to herbivory. The University of
Chicago, Chicago. 319pp.
Kawasaki M L (1996) Flora da serra do cipó, Minas Gerais: Combretaceae. Bolm.
Botânica, Univ. S. Paulo 15: 101–108
Krypinick G A l, Weis A E, Campbell D R (1999) The consequences of floral
herbivory for pollinator service to Isomeris arborea. Ecology 80:125–134
Lamb C, Dixon R A (1997) The oxidative burst in plant disease resistance. Annual
Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48:251–75
40
Larson K C, Whitham T G (1997) Competition between gall aphids and natural plant
sinks: plant architecture affects resistance to galling. Oecologia 109:575–582
Levine A (2004) Programmed cell death in plant response to biotic stress (pathogen
attack). In: Gray J, ed. Programmed cell death in plants. Blackwell Publishing, 213–
250
Maclean D J, Sargent J A, Tommerup I C et al (1974) Hypersensitivity as the primary
event in resistance to fungal parasites. Nature 249:186–187
Romero-Puertas M C, Perazzolli M, Zago E D et al (2007) Nitric oxide signalling
functions in plant–pathogen interactions. Dipartimento Scientifico e Tecnologico,
Università
Leitner M, Boland W, Mithöfer A (2005) Direct and indirect defences induced by
piercing-sucking and chewing herbivores in Medicago truncatula. New Phytologist
167:597–606
Ollerstam O, Rohfritsch O, Höglund S et al (2002) A rapid hypersensitive response
associated with resistance in the willow Salix viminalis against the gall midge
Dasineura marginemtorquens. Entomologia Experimentalis et Applicata 102:153–162
Ollerstam O, Larsson S. (2003) Salicylic acid mediates resistance in the willow Salix
viminalis against the gall midge Dasineura marginemtorquens. Journal of Chemical
Ecology 29:163–174
Mittapalli O, Neal J J, Shukle R H (2007) Antioxidant defense response in a galling
insect Prodeding of the national academy of sciences of the united states of America.
PNAS 104:1889–1894
41
Heath M C (2000) Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology
44:321–334
Cielo Filho R, Santin D A (2002) Estudo florístico e fitossociológico de um fragmento
florestal urbano - Bosque dos Alemães, Campinas, SP1. Revista Brasil. Bot. 25:291–
301
Rosenthal J P, Kotanen P M (1994) Terrestrial plant tolerance to herbivory. Science
9:145–148
Santos J C, Silveira F A O, Fernandes G W (2008) Long term oviposition preference
and larval performance of Schizomyia macrocapillata (Diptera: Cecidomyiidae) on
larger shoots of its host plant Bauhinia brevipes (Fabaceae). Evolutionary ecology
22:123–137
Schowalter T D, Hargrove W W, Crossley-Jr D A (1986) Herbivory in forested
ecosystems. Annual Review of Entomology 31:177–196
Shukle R H, Grover Jr P B, Mocelin G (1992) Responses of susceptible and resistant
wheat associated with hessian fly (Diptera: Cecidomyiidae) infestation.
Environmental Entomology 21:845–853
Somssich I E, Schmelzer E, Kawalleck P et al (1988) Gene structure and in situ
transcript localization of pathogenesisrelated protein 1 in parsley. Molecular and
General Genetics, 213:93–98
Williams A G, Whitham T G (1986) Premature leaf abscission: an induced plant
defense against gall aphids. Ecology 67:1619–1627
42
Takabatake R, Seo S, Ito N et al (2006) Involvement of wound-induced receptor-like
protein kinase in wound signal transduction in tobacco plants. The Plant Journal
47:249–257
43
CAPÍTULO 3
Relação dos nutrientes foliares com a reação de hip ersensibilidade contra a
indução de galhas em Terminalia glabrescens
Resumo . Reação de hipersensibilidade (RH) é reconhecida como um importante
mecanismo pelo qual as plantas se defendem contra muitos herbívoros sésseis,
incluindo insetos galhadores. A RH resulta de uma série de fatores bioquímicos,
morfológicos e de processos fisiológicos levando à localização, confinamento e
morte do tecido atacado e consequentemente do intruso. O presente estudo
investigou a relação entre as concentrações de nutrientes foliares e a incidência de
RH contra a indução de galhas (Diptera, Cecidomyiidae) em Terminalia glabrescens
Mart. (Combretaceae). A comparação das concentrações de macro e
micronutrientes, entre os "saudáveis" e as folhas que apresentaram RH revelaram
uma menor concentração de Fe nas folhas que haviam desenvolvido RH. Além
disso, a área foliar tomada por RH se associou negativamente com as
concentrações de Fe, Cu e Mn, o que pode estar relacionado com a função de
desintoxicação desempenhado por esses metais, evitando a morte celular e
transformando o RH em uma reação assintomática. Além disso, as plantas com
maior concentração de S apresentou menor área de RH, mas, de fato, as defesas da
planta relacionados com a S não estão associados à formação de RH. Além disso,
as concentrações de Ca foram positivamente associado com a área de RH, e as
concentrações de K foram negativamente relacionada à RH, que está de acordo
com as mudanças na permeabilidade do Ca2 + e canais de K + durante a RH. Estes
resultados sugerem que micro e macronutrientes podem desempenhar um papel
importante na reação de hipersensibilidade em folhas de T. glabrescens.
44
Abstract. Hypersensitive Reaction (HR) has been recognized as an important
mechanism by which plants defend against many sessile herbivores, including galling
insects. HR results from a series of morphological, biochemical and physiological
processes leading to the localization, confinement and death of the attacked tissue
and intruders. The present study investigated the relationship between leaf nutrients
concentrations and the incidence of a gall midge (Diptera, Cecidomyiidae) induced
HR in Terminalia glabrescens Mart. (Combretaceae). Comparisons of macro and
micronutrients concentrations between “healthy” leaves and those presenting HR
revealed a lower concentration Fe in leaves which had developed HR. In addition,
leaf HR area was negatively associated to Fe, Cu and Mn concentrations, what can
be related to the detoxification function played by these metals, preventing cell death
and turning the HR into a symptomless reaction. Also, plants with higher
concentrations of S presented smaller area of HR, but, indeed, plant's defenses
related to the S are not associated to the formation of HR. In addition, the Ca
concentrations were positively associated to HR area while K concentrations were
negatively related to HR, what is in accord to the changes in permeability of the Ca2+
and K+ channels during HR. These results suggest that micro and macronutrients
may play a role in the Hypersensitive Reaction on the leaves of T. glabrescens.
45
Introdução
A porcentagem de área foliar removida por herbívoros varia enormemente entre
espécies de plantas e entre regiões biogeográficas, atingindo até 100% em alguns
casos (Schowalter et al, 1986;. Rogers & Siemann, 2003). O impacto da perda de
tecido na planta hospedeira diz respeito não apenas à quantidade removida, mas
também a capacidade da planta hospedeira em tolerar o ataque. A herbivoria pode
ter um impacto significativo no crescimento das plantas, reprodução e capacidade
competitiva (Coley, 1983; Rosenthal & Kotanen, 1994; Krupnick et al, 1999). Em
resposta à perda dos tecidos valiosos, as plantas desenvolveram defesas induzida
contra o ataque por herbívoros (Williams & Whitham, 1986; Karban & Baldwin, 1997;
Fernandes & Negreiros, 2001; Santos et al, 2008).
Entre as respostas induzidas, a reação de hipersensibilidade (RH) tem sido
reconhecida como um importante mecanismo pelo qual as plantas se defendem
contra muitos herbívoros sésseis, incluindo insetos galhadores (revisado por
Fernandes, 1990, ver também Fernandes et al, 2000, 2003;. Fernandes & Negreiros,
2001; Ollerstam et al, 2002;. Höglund et al, 2005)..A RH resulta de uma série de
fatores bioquímicos, morfológicos e de processos fisiológicos que levam à
localização, confinamento e morte do tecido atacado e, conseqüentemente, do
intruso (Fernandes, 1990). Ele deve ter evoluído muito cedo no tempo evolutivo e,
provavelmente, contra patógenos e nematóides em primeiro lugar (Maclean et al,
1974;. Fernandes, 1990; Fritig et al, 1998;. Romero-Puertas et al, 2004;. Takabatake
et al. 2006; Baarlen et al, 2007).
No caso da interação planta patógeno, onde é mais bem estudado, um dos
primeiros sinais observados no desencadeamento da RH é a acumulação
intracelular de Ca2 + (Baker et al., 1987), seguida da ativação da H + extracelular / K +
46
(Levine et al., 1996). Este sinal aciona uma grande e rápida produção de compostos
como as Espécies Reativas ao Oxigênio (ROS), incluindo a O2-H2O2 e OH,
(Hegedus et al., 2001), enzimas hidrolíticas, ácido salicílico, proteínas, lignina e
deposição de calose; biossíntese de complexos de antimicrobianos e metabólitos
secundários (Lamb & Dixon, 1997; Heath, 2000;. Ollerstam et al, 2002; Ollerstam &
Larsson, 2003; Levine, 2004; Leitner et al, 2005;. ver Mittapalli et al. , 2007). O
acúmulo de ROS na área de RH pode ser tóxico para a planta, levando à morte do
tecido foliar (necrose localizada). Em vários casos, o tecido necrótico desprende do
limbo foliar em desenvolvimento deixando uma lacuna que pode ser facilmente
confundida com a herbivoria por insetos mastigadores, como reportado em Tapirira
guianensis Aubl. (Anacardiaceae) (Fernandes et al. 2010).
As plantas também apresentam mecanismos para minimizar os danos causados
por esses compostos tóxicos que acompanham a RH. Entre eles, o superóxido
dismutase (Baker & Orlandi, 1995), uma classe de enzimas cofactorada com um
metal (Cu / Zn, Mn e Fe), o ciclo glutationa-ascorbato (Yoshimura et al, 2000.),
Catalase (Breusegem et al., 2001) e β-carotens (Baker & Orlandi, 1999). Além disso,
a resistência aos inimigos naturais podem ser melhorados com a disponibilidade de
nutrientes como o potássio (K) (Mandahar et al, 1998;. Orober et al, 2002;. Mitchell &
Walters, 2004), enxofre (S) (Bourbos et al, 2000;. Klikocka et al, 2005) e nitrogênio
(N) (Dietrich et al, 2004, 2005;.revisado por Walters & Bingham, 2007).
Terminalia glabrescens Mart. 1837 (Combretaceae) é uma árvore comum na
base da Serra do Cipó, sudeste do Brasil, que apresenta sinais de notáveis RH
contra o mosquito galhador (Diptera, Cecidomyiidae) em suas folhas (Magalhães et
al. 2010). Observações casuais também indicam que um grande número de buracos
encontrados na lâmina foliar são causados pela queda de tecidos necróticos
resultantes da RH, apesar de se parecer com o dano causado por insetos folivorous
47
(ver Fernandes et al. 2010). Com base nas premissas acima postulamos que a
incidência da RH pode estar relacionada à concentração de nutrientes nas folhas. O
presente estudo teve como objetivos: primeiro, comparar a área foliar perdida por
RH e por insetos mastigadores em T. glabrescens. Este estudo pode ser de grande
importância, pois lança luz sobre os impactos causados por insetos galhadores
sobre suas plantas hospedeiras, assim como separá-las do ataque de outras guildas
de herbívoros. Em segundo lugar, testar a hipótese de que as concentrações de
nutrientes são maiores nas folhas que haviam desenvolvido o RH em relação às
folhas em que o RH não foi induzida. Por último, verificar se existem relações entre a
indução de RH e as concentrações de nutrientes nos diferentes ramos
48
Material e métodos
O Parque Nacional da Serra do Cipó está localizado na porção sul da Serra do
Espinhaço, em Minas Gerais, Brasil. A área tem um clima do tipo Cwb de Köppen,
marcado por invernos secos (maio-setembro) e verões chuvosos (novembro-janeiro),
fortemente influenciado pela latitude e altitude (Schulz & Machado, 2000).
Precipitação média anual é de cerca de 1,250-1,550 mm e temperatura média por
volta de 18-19 º C (Madeira & Fernandes, 1999). O estudo foi feito em 2008, em um
período em que a precipitação média anual atingiu apenas 0,930 milímetros, e a
temperatura média foi de 18,6 º C (ICMBIO, 2010). A área amostrada é de cerca de
800 m a.s.l.
Terminalia glabrescens é uma árvore que pode chegar a 8-12 metros de altura,
é caracterizada pelo indumento tomentoso-ferruginoso, especialmente nos pecíolo e
próximo às nervuras abaxiais da folha, folhas obovadas a oblanceoladas, pecíolos
de até 1 centímetro de comprimento; frutos alados de 0,5 x 1,5 cm de comprimento
(Cielo-Filho & Santin, 2002). Sua distribuição se estende ao longo dos estados do
Maranhão, Ceará, Bahia, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Distrito Federal, Goiás,
Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo e Paraná (Marquete 1995).
Nestes estados a árvore se desenvolve em áreas de Floresta Estacional
Semidecidual e Formações de Cerrado (Von Linsingen 2009). Na Serra do Cipó, e
também é freqüentemente encontrado em matas ciliares (Kawasaki, 1996).
Para esta pesquisa, foram selecionados ao acaso 30 indivíduos de T.
glabrescens de uma população encontrada perto do Córrego das Pedras (19 ° 20'45
.00 "S, 43 ° 36'30 .00" W) (19 º 21'15 .00 "S, 43 º 36'00 .00" W). Dez ramos terminais
foram coletados aleatoriamente em torno da copa de cada indivíduo (n = 300), cada
ramo teve todas as suas folhas contadas (n = 1675, média: 5,58 ± 0,09 folhas por
49
ramo; ± EP). Os ramos foram marcados, prensados no jornal e transportados para o
laboratório para secagem em estufa, sob temperatura constante de 48 º C até atingir
peso constante.
Para calcular as áreas de necrose e perda (tanto pela queda e removidas por
folívoros) as folhas secas, foram digitalizadas usando um scanner de computador e
as imagens foram analisadas com o software Image Tool para Windows 3.0. Em
cada ramo, foram avaliados: i) a área foliar total, ii) a área de RH (necrose localizada
+ abcisão), e iii) área removidas por folívoros. As RH foram identificadas como
manchas circulares marrons ou avermelhados. As áreas necróticas abscisadas
foram reconhecidas como furos redondos sem alterações perceptíveis no tecido
adjacente. Quando os buracos são formados na ponta da folha ou em estágios
iniciais de expansão foliar, podem ter um formato ovalado ou deformados. As perdas
foliares que não se encaixaram na RH foram consideradas como removidas por
insetos folívoros.
Entre as folhas coletadas, 60 folhas por indivíduo foram selecionadas
aleatoriamente e divididos em dois tratamentos: i) apresentação de RH (n = 30
folhas por árvore) e ii) "saudável" (sem sinais de clorose, necrose ou herbivoria) (n =
30 folhas por árvore). As folhas foram moídas, o material resultante em pó foi
enviado para análise de macro (N, P, K, Ca, Mg, S) e micronutrientes (Fe, Zn, Cu,
Mn). Uma análise unidirecional de variância foi utilizada para testar se as
concentrações de nutrientes foram maiores nas folhas com RH quando comparados
com aqueles em que não tinha sido induzida RH. Para verificar se havia uma relação
entre a RH e a concentração de nutrientes nos ramos, os resultados das análises
nutricionais foram comparados com a área de RH (necrose + abscisão) no
tratamento "i" por meio de regressão linear e correlação de Pearson. Além disso,
50
uma Análise de Componentes Principais (PCA) foi usada para observar a variação
dos nutrientes e da área de RH no tratamento "i" (com RH).
51
Resultados
No presente estudo, um total de 4.97m2 (2.968,46 ± 450 mm2, ± EP, n = 1675)
de folhas de T. glabrescens foi coletado, no qual foi medido o tecido removido por
insetos folivoros, necroses localizadas e perda de tecido foliar devido à abscisão de
áreas de necrose. A área foliar removida por folívoros (34318mm2; 114,39 ± 17,34
mm2, ± EP, n = 300; 54,42% da área removida) apresentaram valores ligeiramente
superiores aos da área de RH (necrose + abscisão) (28738mm2; 96,43 ± 8.09mm2,
± EP, n = 300; 45,58% da área removida), embora a diferença não seja
estatisticamente significativa (F1.596 = 0,87, p = 0,35).
Somente a concentração de Fe nas folhas foi estatisticamente diferente entre os
tratamentos, sendo menor nas folhas em que a RH foi induzida (F 1,57 = 4,24, p =
0,04). As concentrações dos nutrientes N, P, K, Ca, Mg, S, Zn, Cu e Mn não foram
estatisticamente diferentes entre os dois tratamentos (com e sem RH; Tabela 1).
Embora as concentrações da maioria dos nutrientes não tenha sido correlacionados
com a área de RH (necrose + abscisão) (p> 0,05), menor área de RH foi observada
em plantas com maiores concentrações de enxofre (r = -0,39, p = 0,038) e Mn ( r = -
0,37, p = 0,045).
Tabela 1. Análise de variância folhas com necrose localizada (RH) e folhas saudáveis.
Factor
HR (
N 1.42%
P 0.11 %
K 0.76 %
Ca 0.28 %
Mg 0.09 %
S 0.07 mg/kg
Zn 11.72 mg/kg
Fe 418.65 mg/kg
Cu 7.87 mg/kg
Mn 603.92 mg/kg
A relação entre a concentração
abscisão) nas folhas de T. glabrescens
Wilks> 0,05; KMO> 0,5; Bartlett Test <0,001), que explicaram cerca de 74,1% da
variação da área de RH
agrupou com a variação do Ca, K e Mn formando um segundo componente
(18,78%). A RH foi se
negativamente com a concentração de K e Mn. A variação da área de RH também
se agrupou com a variação das
Tabela 1. Análise de variância fatorial (ANOVA) da concentração de nutrientes em folhas com necrose localizada (RH) e folhas saudáveis.
Concentration
HR ( ) Healty ( ) F(1,57)
1.42% 1.36 % 0.44
0.11 % 0.11 % 0.16
0.76 % 0.81 % 0.77
0.28 % 0.27 % 0.03
0.09 % 0.10 % 0.02
0.07 mg/kg 0.07 mg/kg 0.38
11.72 mg/kg 11.89 mg/kg 0.02
418.65 mg/kg 574.48 mg/kg 3.89
7.87 mg/kg 7.81 mg/kg 0.005
603.92 mg/kg 599.19 mg/kg 0.006
A relação entre a concentração de nutrientes e a área de RH (necrose +
T. glabrescens foram agrupadas em quatro fatores (Shapiro
> 0,05; KMO> 0,5; Bartlett Test <0,001), que explicaram cerca de 74,1% da
de RH (Fig. 1). A variação da área de RH (necrose + abscisão)
com a variação do Ca, K e Mn formando um segundo componente
se associou positivamente com as concentrações de Ca e
negativamente com a concentração de K e Mn. A variação da área de RH também
com a variação das concentrações de Fe e Cu, formando o quarto
52
ão de nutrientes em
F(1,57) p
0.44 0.50
0.16 0.68
0.77 0.38
0.03 0.84
0.02 0.87
0.38 0.53
0.02 0.86
3.89 0.044*
0.005 0.94
0.006 0.93
a área de RH (necrose +
s em quatro fatores (Shapiro-
> 0,05; KMO> 0,5; Bartlett Test <0,001), que explicaram cerca de 74,1% da
RH (necrose + abscisão) se
com a variação do Ca, K e Mn formando um segundo componente
positivamente com as concentrações de Ca e
negativamente com a concentração de K e Mn. A variação da área de RH também
de Fe e Cu, formando o quarto
53
componente (13,99%), indicando que quanto menor a concentração destes
nutrientes, maior a área de RH total.
Figura 1. Análise de Componentes Principais (PCA) da área de RH (necrótico+abscisado) e nutrientes foliares
54
Discussão
A reação de hipersensibilidade é reconhecida como uma necrose localizada, de
aspecto circular marrom ou vermelho-escuro (Fernandes et al., 2000). Esse tecido
pode se destacar do limbo deixando um buraco que poderia ser facilmente
confundido com herbivoria por insetos mastigadores (Fernandes et al., 2010). O
presente estudo, discrimina a remoção do tecido foliar por folívoros da desfolha
causada pela abscisão da área de necrose resultante da RH. Os sinais de herbivoria
e RH são frequentemente observados em várias espécies de plantas e famílias
(Fernandes & Negreiros, 2001). Da mesma forma, os indivíduos de T. glabrescens
amostrados na população estudada na Serra do Cipó apresentaram tanto marcas de
HR quanto perda de tecido necrótico por abscisão. Se neste estudo não tivéssemos
discriminado a origem dos buracos nas folhas de T. glabrescens, as estimativas de
área foliar removida por folívoros seriam superestimadas em cerca de 100% do valor
real, mascarando ou mesmo sugerindo falsos padrões e pressões na natureza.
Como esperado, os ramos que haviam desenvolvido RH (abscisão + necrose)
apresentaram maiores concentrações de Ca e menores de K nas folhas. O cálcio
(Ca 2 +) é um nutriente essencial para as plantas, crucial em funções de estrutura
celular, funcionamento da parede e membranas orgânicas e inorgânicas, além de
trabalhar como mensageiro intracelular no citoplasma (Marschner, 1995; revisado
por White & Broadley 2003). O potássio é um íon orgânico predominante nas células
vegetais, onde desempenha um papel fundamental no controle da pressão de
turgescência (hidrostática) e no crescimento dos tecidos. As mudanças no potencial
elétrico da membrana celular podem levar ao influxo e / ou de efluxo de íons de
cálcio e / ou de potássio das células através de canais iónicos permeáveis,
tonoplastos e / ou retículo endoplasmático (White, 2000; Sanders et al, 2002 ;
Michard et al, 2005). Genes envolvidos com a reação de hipersensibilidade podem
55
alterar a permeabilidade dos canais de Ca2 + e K +, alterando suas concentrações no
tecido atacado. Alguns dos primeiros eventos de sinalização detectados durante a
RH são o influxo de Ca2 + e H + e efluxo de K + (Atkinson et al, 1990;. Guidetti-
Gonzale et al, 2007). A explosão oxidativa (produção de ROS), que ocorre durante o
RH pode, eventualmente, ser estimulada pelo rápido aumento de Ca2 + no tecido
(Lamb & Dixon, 1997). Plantas que crescem em ambientes naturais com
concentrações adequadas de Ca apresentam concentrações de cerca de 0,1 a 5%
d.wt por ramo (Marschner, 1995). As concentrações dos íons Ca nos tecidos
analisados indicam que eles seriam suficientes para desencadear a RH em T.
glabrescens. No entanto, bioensaios são necessários para a compreensão da
bioquímica dessas reações.
As superóxido dismutase (SOD) são enzimas que se combinam com um metal
(Cu / Zn, Mn e Fe) e catalisam a dismutação do H2O2 em O2- e HO2
+. As plantas têm
geralmente Cu / Zn-SOD no citosol, Cu / Zn e / ou Fe-SOD no cloroplasto e Mn-SOD
na mitocôndria (Baker & Orlandi, 1995). Portanto, a maior concentração de Fe nas
folhas saudáveis e a relação inversa entre o Mn, Cu e Fe e a área de RH pode ser
explicado pela função de detoxicação desempenhado por estes metais associados
com a superóxido dismutase. No ciclo glutationa-ascorbato quatro enzimas são
usadas: ascorbato peroxidase (APX) e redutase da dehydroascorbate (DHAR),
redutase monodehydroascorbate (MDA) e glutationa redutase. O H2O2 pode ser
reduzido e removido pela APX com ascorbato como redutor, formando o radical
monodehydroascorbate (MDA) (Yoshimura et al., 2000). As plantas mostram
múltiplas isoformas de catalases, que estão presentes no peroxissomos e
glioxisomes. O β-carotens são agentes eficazes de detoxicação do O2. Os
carotenóides participam do sistema antena dos cloroplastos, na absorção de luz e
de transferência de energia para os centros de reação. No entanto, os carotenóides
56
também podem dissipar energia durante o estresse foto-oxidativo (Baker & Orlandi,
1999). Assim, a compreensão das reações bioquímicas envolvidas com a RH e a
química nutricional da planta hospedeira são profundamente necessárias.
O enxofre (S), na forma de compostos como fitoalexinas, glucosinolatos e H2S,
funciona como um mecanismo de defesa das plantas contra os inimigos naturais
(Schnug et al, 1995;. Bourbos et al, 2000;. Bloem et al, 2004.; Klikocka et al., 2005).
No entanto, as defesas da planta relacionados com a S não estão associados à
formação de RH (áreas de necrose). Assim, neste estudo, as plantas com maiores
concentrações de S apresentaram menor RH, possivelmente devido à resistência
não relacionada a hipersensibilidade (Höglund et al., 2005).
Estes resultados sugerem que micro e macronutrientes podem desempenhar um
papel importante na reação de hipersensibilidade em folhas de T. glabrescens,
embora estudos mais aprofundados sobre a reação de hipersensibilidade da planta
contra a indução de galhas são necessários, especialmente nos sistemas naturais.
Os autores agradecem a dois revisores anônimos pelas sugestões em versões
anteriores do manuscrito e do apoio logístico fornecido pelo Parque Nacional da
Serra do Cipó. O presente estudo foi financiado pelo CNPq (309633/2007-9.
476178/2008-8) e FAPEMIG (EDT-465/07, APQ-01278/08).
57
Referências:
Atkinson M.M., Keppler L.D., Orlandi E.W., Baker C.J. & Mischke C.F. 1990.
Involvement of plasma membrane calcium influx in bacterial induction of the K1/H1
and hypersensitive responses in tobacco. Plant Physiol 92:215–221.
Baarlen P.V., Woltering E.J., Staats M. & Kan J.A.L.V. 2007. Histochemical and
genetic analysis of host and non-host interactions of Arabidopsis with three Botrytis
species: an important role for cell death control. Molecular Plant Pathology 8:41–54.
Baker C.J., Atkinson M.M. & Collmer A. 1987. Concurrent loss in Tn5 mutants of
Pseudomonas syringae pv. syringae of the ability to induce the HR and host plasma
membrane K+/H+ exchange mechanism. Plant Physiology 79:1268–1272.
Baker C.J. & Orlandi E.W. 1995. Active oxygen in plant pathogenesis. Annu Rev
Phytopathol 33:299–321.
Baker C.J. & Orlandi E.W. 1999. Sources and effects of reactive oxygen species in
plants. In: Gilbert D. & Colton C. (eds.): Reactive Oxygen Species in Biological
Systems. Plenum Publishing. pp. 481–501.
Bloem S, Carpenter J.E., Bloem K.A., Tomlin L. & Taggart S. 2004. Effect of rearing
strategy and gamma radiation on field competitiveness of mass-reared codling moths
(Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Economic Entomology 97:1891–1989.
Bourbos V.A., Skoudridakis M.T., Barbopoulou E. & Venetis K. 2000. Ecological
control of grape powdery mildew (Uncinula necator). http://www.landwirtschaft-
lr.badenwuerttemberg.de/la/lvwo/kongress/SULPHUR.html.
Breusegem F., Vranová E., Dat J.F. & Inzé D. 2001. The role of active oxygen
species in plant signal transduction. Plant Science 161:405–414.
58
Cielo Filho R. & Santin D.A. 2002. Floristic and phytosociological study of an urban
forest fragment - Bosque dos Alemães, Campinas, SP. Revista Brasil. Bot. 25:291–
301. (in Portuguese, English abstr.).
Coley P.D. 1983. Herbivory and defensive characteristcs of tree species in lowland
tropical forest. Ecological Monographs 53:209–233.
Dietrich R., Ploss K. & Heil M. 2004. Constitutive and induced resistance to
pathogens in Arabidopsis thaliana depends on nitrogen supply. Plant, Cell and
Environment 27:896–906.
Dietrich R., Ploss K. & Heil M. 2005. Growth responses and fitness costs after
induction of pathogen resistance depend on environmental conditions. Plant, Cell
and Environment 28:211–222.
Fernandes G.W. 1990. Hypersensitivity: a neglected plant resistance mechanism
against insect herbivores. Environ Entomol 19:1173–1182.
Fernandes G.W., Cornelissen T.G., Isaias R.M.S. & Lara A.C.F. 2000. Plants fight
gall formation: hypersensitivity. Ciência e Cultura 52:49–54.
Fernandes G.W., Duarte H. & Lüttge U. 2003. Hypersensitivity of Fagus sylvatica L.
against leaf galling insects. Trees 17:407–411.
Fernandes G.W. & Negreiros D. 2001. The occurrence and effectiveness of
hypersensitive reaction against galling herbivores across host taxa. Ecological
Entomology 26:46–55
Fritig B., Heitz T. & Legrand M. 1998. Antimicrobial proteins in induced plant defence.
Current Opinion in Immunology 10:16–22.
59
Guidetti-Gonzalez1 S., Freitas-Astúa J., Amaral A.M., Martins N.F., Mehta A., Silva
M.S. & Carrer H. 2007. Genes associated with hypersensitive response (HR) in the
citrus EST database (CitEST). Genet. Mol. Biol. 30: 943–956.
Heath M.C. 2000. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology
44:321–334.
Hegedus A., Erdei S. & Horváth G. 2001. Comparative studies of H2O2 detoxifying
enzymes in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant
Science 160:1085–1093.
Höglund S., Larsson S. & Wingsle G. 2005. Both hypersensitive and non-
hypersensitive responses are associated with resistance in Salix viminalis against the
gall midge Dasineura marginemtorquens. Journal of Experimental Botany 56:3215–
3222.
ICMBIO. 2010. Meteorological data from Serra do Cipó National Park.
http://www.ufmg.br/pos/ecologia/usfish/index.php/dados-meteorologicos
Karban R & Baldwin I.T. 1997. Induced responses to herbivory. The University of
Chicago, Chicago, 319pp.
Kawasaki M.L. 1996. Flora of Serra do Cipó, Minas Gerais: Combretaceae. Bolm.
Botânica, Univ. S. Paulo 15:101–108. (in Portuguese, English abstr.).
Klikocka H., Haneklaus S., Bloem E. & Schnug E. 2005. Influence of sulfur
fertilization on infection of potato tubers with Rhizoctonia solani and Streptomyces
scabies. J Plant Nutr 28: 819–833.
Krupnick G.A., Weis A.E. & Campbell D.R. 1999. The consequences of floral
herbivory for pollinator service to I. arborea. Ecology 80:125–134.
60
Lamb C. & Dixon R.A. 1997. The oxidative burst in plant disease resistance. Annual
Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48: 51–75.
Leitner M., Boland W, & Mithöfer A. 2005. Direct and indirect defences induced by
piercing-sucking and chewing herbivores in Medicago truncatula. New Phytologist
167:97–606.
Levine A .2004. Programmed cell death in plant response to biotic stress (pathogen
attack). In: Gray J. (eds): Programmed cell death in plants. Blackwell Publishing, pp.
213–250.
Levine A., Pennell R.I., Alvarez M.E., Palmer R. & Lamb C. 1996. Calcium-mediated
apoptosis in a plant hypersensitive disease resistant response. Current Biology 6:
27–437.
Maclean D.J., Sargent J.A., Tommerup I.C. & Ingram D.S. 1974. Hypersensitivity as
the primary event in resistance to fungal parasites. Nature 249:186–187.
Madeira J.A. & Fernandes G.W. 1999. Reproductive phenology of sympatric taxa of
Chamaecrista (Leguminosae) in Serra do Cipó, Brazil. Journal of Tropical Ecology
15:463–479.
Mandahar H.K., Lyngs-Jorgensen H.J., Mathur S.B. & Smedegaard-Petersen V.
1998. Resistance to rice blast induced by ferric chloride, di-potassium hydrogen
phosphate and salicylic acid. Crop Protection 17:323–329.
Marquete N.F.S. 1995. Combretum Loefling-Southeast of Brazil (Combretaceae).
Arquivos do Jardim Botânico do Rio de Janeiro 33: 55–107. (in Portuguese, English
abstr.).
61
Marschner H. 1995. Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London, 889
pp.
Michard E., Lacombe B., Poree F., Mueller-Roeber B., Sentenac H, Thibaud J.B. &
Dreyer I. 2005. A unique voltage sensor sensitizes the potassium channel AKT2 to
phosphoregulation. J Gen Physiol 126:605–617.
Mitchell A.F. & Walters D.R. 2004. Potassium phosphate induces systemic protection
in barley to powdery mildew infection. Pest Management Science 60:126–134.
Mittapalli O., Neal J.J. & Shukle R.H. 2007. Antioxidant defense response in a galling
insect Prodeding of the National Academy of Sciences of the United States of
America. PNAS 104:1889–1894.
Ollerstam O. & Larsson S. 2003. Salicylic acid mediates resistance in the willow Salix
viminalis against the gall midge Dasineura marginemtorquens. Journal of Chemical
Ecology 29:163–174.
Ollerstam O., Rohfritsch O., Höglund S.& Larsson S. 2002. A rapid hypersensitive
response associated with resistance in the willow Salix viminalis against the gall
midge Dasineura marginemtorquens. Entomol. Exp. Appl. 102:153–162.
Orober M., Siegrist J.& Buchenauer H. 2002. Mechanisms of phosphate-induced
disease resistance in cucumber. European Journal of Plant Pathology 108:345–353.
Rogers W.E. & Siemann E. 2003. Effects of simulated herbivory and resources on
Chinese tallow tree (Sapium sebiferum, Euphorbiaceae) invasion of native coastal
prairie. American Journal of Botany 90:243–249.
Romero-Puertas M.C., Perazzolli M., Zago E.D. & Delledonne M. 2004. Nitric oxide
signalling functions in palnt-pathogen interactions. Cellular Microbiology 9:795–803.
62
Rosenthal J.P. & Kotanen P.M. 1994. Terrestrial plant tolerance to herbivory. Trends
in Ecology & Evolution 9:145–148.
Sanders D., Pelloux J., Brownlee C. & Haper J.F. 2002. Calcium at the crossroad of
signaling. Plant Cell 14:401–417.
Santos J.C., Silveira F.A.O. & Fernandes G.W. 2008. Long term oviposition
preference and larval performance of Schizomyia macrocapillata (Diptera:
Cecidomyiidae) on larger shoots of its host plant Bauhinia brevipes (Fabaceae).
Evolutionary ecology 22:123–137.
Schowalter T.D., Hargrove W.W. & Crossley-Jr D.A. 1986. Herbivory in forested
ecosystems. Annual Review of Entomology 31:177–196.
Schnug E., Heym J. & Murphy D.P. 1995. Boundary line determination technique. In
Robert P.C., Rust R.H. & Larson W.E. (Eds) 1995. Site-Specific Management for
Agricultural Systems ASA/CSSA/SSSA, Madison, WI, pp. 899–908.
Schulz R. & Machado M. 2000. Uebelmannia and their environment. Schulz
Publishing, São Paulo, 160pp.
Takabatake R., Seo S., Ito N., Gotoh Y., Mitsuhara I. & Ohashi Y. 2006. Involvement
of wound-induced receptor-like protein kinase in wound signal transduction in
tobacco plants. The Plant Journal 47:249–257.
Von Linsingen, L., Cervi, A.C. & Guimaraes O. 2009. Taxonomic synopsis of the
family Combretaceae R. Brown in southern Brazil. Acta Bot. Bras. 23:738–750 . (in
Portuguese, English abstr.).
63
Walters I.J. & Bingham. 2004. Influence of nutrition on disease development caused
by fungal pathogens: implications for plant disease control. Annals of Applied Biology
151:307–324.
White P.J. 2000. Calcium channels in higher plant. Biochimica et biophysica acta.
1465:171–189.
White P.J. & Broadley M.R. 2003. Calcium in plants. Annals of botany 92:487–511.
Williams A.G. & Whitham T.G. 1986. Premature leaf abscission: an induced plant
defense against gall aphids. Ecology 67:1619–1627.
Yoshimura K., Yabuta Y., Ishikawa T. & Shigeoka S. 2000. Expression of spinach
ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stresses. Plant
Physiology 123:223–234.