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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE FÍSICA
SAULE VIGANÓ NETO
ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NO ESPECTRO FOTOACÚSTICO DA
PELE HUMANA CAUSADAS PELA DROGA CICLOPIROX OLAMINA
Campo Grande – MS 2009
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SAULE VIGANÓ NETO
ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NO ESPECTRO FOTOACÚSTICO DA
PELE HUMANA CAUSADAS PELA DROGA CICLOPIROX OLAMINA
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Física Aplicada da Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Física, sob a
orientação do Professor Dr. Carlos Alberto Vinha.
Campo Grande – MS 2009
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SAULE VIGANÓ NETO
ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NO ESPECTRO FOTOACÚSTICO DA
PELE HUMANA CAUSADAS PELA DROGA CICLOPIROX OLAMINA
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Física Aplicada da Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Física, sob a
orientação do professor Dr. Carlos Alberto Vinha.
Data da defesa: __/__/2009
Prof. Dr. Carlos Alberto Vinha (UFMS)
Julgamento: ____________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. Jorge João Chacha (UFMS)
Julgamento: ____________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. Sandro Marcio Lima (UEMS)
Julgamento: ____________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. Hamilton Germano Pavão (UFMS)
Julgamento: ____________________ Assinatura: ___________________
4
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Valdir e Vilma, pelo apoio irrestrito em todos os momentos de minha
vida.
Carinhosamente à minha esposa Hevelyne e a minha filha Júlia, que juntas formam a
minha razão de ser.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a princípio a Deus, que me permitiu a inteligência, além de guiar todos os
passos da minha vida dando-me sua graça sempre.
Ao Professor Dr. Carlos Alberto Vinha, pela orientação, dedicação, revisão do texto
final, compreensão nos momentos difíceis que passei durante este trabalho, além de sua
valiosa amizade.
Ao Mestrando Geraldo Majella, pela providencial ajuda nos experimentos e por
proporcionar longas e valiosas conversas sobre Física e principalmente sobre a vida.
Ao Valdeir e ao Evaldo, técnicos do laboratório de Física que estavam sempre prontos
para nos atender.
Ao Elias, secretário do Mestrado em Física, sempre esclarecendo todas as dúvidas.
Ao meu pai, pelo auxílio técnico durante a elaboração dos desenhos.
Aos meus familiares, que sempre compreenderam como foi difícil esta caminhada, em
especial ao meu irmão Valdir Jr. pelo apoio nas longas horas de trabalho.
Ao grande Scott, pela valiosa e sincera amizade que temos desde a graduação.
Agradeço carinhosamente a minha amada esposa Hevelyne, que me acalmou durante
os momentos de nervosismo, me alegrou durante os momentos tristes, que sorriu nos
momentos alegres, e que tornou possível a realização deste sonho. Muito obrigado.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho fica registrado o meu muito obrigado.
6
RESUMO
Uma das características da Técnica Fotoacústica é a possibilidade da realização de
análises utilizando amostras em sua forma intacta, dispensando a utilização de pré-
tratamentos, solventes, etc. Portanto, essa técnica tem sido amplamente utilizada em estudos
envolvendo uma grande variedade de materiais biológicos, em particular a pele humana.
No Brasil, as micoses superficiais constituem um problema de saúde pública,
ocupando o segundo lugar em incidência, de acordo com a Sociedade Brasileira de
Dermatologia. Para seu tratamento existem diversos antifúngicos e dentre eles podemos citar
o ciclopirox olamina.
No presente trabalho, buscou-se avaliar as alterações no espectro fotoacústico da pele
humana causadas pelo fármaco ciclopirox olamina.
As análises na região do ultravioleta e visível propiciaram a identificação de picos
espectrais associados à pele humana e ao fármaco. A monitoração das intensidades e
comprimentos de ondas desses picos permitiram acompanhar a evolução temporal da presença
do fármaco na pele.
Na região do infravermelho próximo foi possível identificar várias absorções
espectrais correspondentes aos constituintes da pele humana, bem como à água e o álcool
presentes na composição da droga.
Esses resultados, em conjunto, confirmam que a técnica apresenta potencial para
constituir-se em importante ferramenta para estudos envolvendo substâncias veiculadas
através da pele humana.
Palavras chaves: Espectroscopia Fotoacústica; Pele humana; Ciclopirox Olamina.
7
ABSTRACT
One of the features of Photoacoustics is the possibility of analysis using samples in
their intact form, being dispensed pre-treatments, solvents, etc. Therefore, the technique was
widely used in studies involving a large number of biological materials, particularly the
human skin.
In Brazil, the superficial mycoses are a problem of public health, attaining the second
place in incidence, according to the Brazilian Society of Dermatology. For treatment, several
antifungal drugs are employed and among them the ciclopirox olamine.
In this work, we tried to evaluate changes in the photoacoustic spectrum of human
skin caused by the medicament ciclopirox olamine.
Analysis in the ultraviolet and visible regions led to the identification of spectral peaks
related to human skin and to the medicament. The monitoring of intensities and wavelengths
of these peaks allowed the determination of the time evolution of the presence of the drug in
the skin.
In the near infrared region, several spectral absorptions corresponding to human skin
composition, as well as to water and alcohol present in the drug, were identified.
These results as a whole confirm the potential of the technique as an important tool for
studies involving substances diffused through the human skin.
Keywords: Photoacoustic Spectroscopy; Human skin; Ciclopirox olamine.
8
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
1 Estrutura da pele humana............................................................................................. 15
2 Vias de penetração de fármacos através do estrato córneo ........................................ . 17
3 Instrumentação utilizada na realização de varreduras espectrais ............................... . 22
4 Detalhes da célula fotoacústica utilizada para espectroscopia ................................... . 25
5 Detalhes do porta-amostra.......................................................................................... . 26
6 Amostras de pele antes da manipulação..................................................................... . 27
7 Amostras após manipulação ....................................................................................... . 27
8 Amostra assentada no porta-amostra.......................................................................... . 28
9 Espectro fotoacústico, nas regiões do ultravioleta e visível, para efeito
de comparação entre as amostras................................................................................ . 31
10 Espectro fotoacústico, nas regiões do ultravioleta e visível,
da droga ciclopirox olamina ....................................................................................... . 32
11 Espectro fotoacústico, nas regiões do ultravioleta e visível,
da pele tratada logo após a aplicação.......................................................................... . 33
12 Espectro fotoacústico, nas regiões do ultravioleta e visível,
da droga ”in-situ” na pele ........................................................................................... . 34
13 Espectros fotoacústicos, nas regiões do ultravioleta e visível,
da pele tratada com a droga em três instantes distintos............................................... 35
14 Comportamento do deslocamento do máximo em função do tempo ......................... . 36
15 Cronologia da presença da droga na pele ................................................................... . 38
16 Espectro fotoacústico, na região do infravermelho próximo,
da droga ciclopirox olamina e da água destilada........................................................ . 40
17 Espectro fotoacústico, na região do infravermelho próximo, da pele desidratada ..... . 41
18 Espectro fotoacústico, na região do infravermelho próximo,
da amostra de pele utilizada como controle................................................................ . 42
19 Espectro fotoacústicos, na região do infravermelho próximo,
da amostra de pele tratada com a droga...................................................................... . 42
20 Espectro fotoacústicos, na região do infravermelho próximo,
para efeito de comparação entre as amostras.............................................................. . 45
9
21 Espectros fotacústicos, na região do infravermelho próximo,
da pele controle em dois instantes distintos ............................................................... . 46
22 Espectros fotoacústicos, na região do infravermelho próximo,
da pele tratada em dois instantes distintos ................................................................. . 46
23 Representação de uma célula fotoacústica fechada.................................................... . 50
24 Relação entre a espessura da amostra (l ) e o comprimento
de absorção óptica (βl ) .............................................................................................. . 53
25 Comportamento do comprimento de difusão térmica ................................................. 55
26 Representação fasorial da variação de pressão........................................................... . 59
27 Representação vetorial do sinal fotoacústico.............................................................. . 60
10
LISTA DE TABELAS
TABELA PÁGINA
1 Classificação dos fototipos de pele .............................................................................. 18
2 Informações técnicas do fármaco ciclopirox olamina..................................................20
3 Relação entre a posição do máximo (comprimento de onda)
e o tempo de aplicação ................................................................................................. 35
4 Intensidades espectrais em 303 nm.............................................................................. 37
5 Intensidades espectrais em 322 nm.............................................................................. 38
6 Relação entre comprimento de onda (pico de absorção aproximado)
e a substância ou estrutura à qual a absorção é atribuída ............................................ 39
7 Comprimentos de onda e respectivas intensidades espectrais
para a droga ciclopirox olamina, água destilada, pele desidratada,
pele controle e pele tratada no intervalo entre 1000nm e 1600nm.............................. 43
8 Identificação de alguns dos picos encontrados no espectro
de absorção fotoacústico da pele.................................................................................. 44
9 Comprimentos de onda e respectivas intensidades espectrais
para a pele controle e pele tratada no intervalo entre 1000nm e 1600nm ................... 47
10 Grandezas utilizadas no equacionamento do fenômeno fotoacústico.......................... 51
11 Casos limites do efeito fotoacústico............................................................................. 58
11
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................13
1 A PELE HUMANA .......................................................................................................... 15
1.1 A pele humana ..................................................................................................... 15
1.2 Vias de penetração cutânea.................................................................................. 17
1.3 Classificação quanto aos tipos de pele................................................................. 18
2 A DROGA CICLOPIROX OLAMINA .......................................................................... 19
2.1 Introdução ............................................................................................................ 19
2.2 Mecanismo de ação.............................................................................................. 19
2.3 Informações técnicas ........................................................................................... 19
2.4 Características farmacológicas ............................................................................ 20
2.5 Indicações, contra-indicações e apresentações disponíveis................................. 21
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 22
3.1 Aparelhagem utilizada ......................................................................................... 22
3.2 Preparação e manipulação das amostras.............................................................. 26
3.2.1 Amostras de pele........................................................................................ 26
3.2.2 O fármaco utilizado ................................................................................... 28
3.3 Análise espectral no ultravioleta e visível ........................................................... 29
3.4 Análise espectral no infravermelho próximo.......................................................30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................... 31
4.1 Avaliação da cronologia da presença da droga na pele – Análise no
ultravioleta e visível......................................................................................... 31
4.2 Identificação de características espectrais associadas à composição
da pele humana e do fármaco – Análise no infravermelho próximo............... 39
4.2.1 Espectroscopia no infravermelho próximo................................................. 39
4.2.2 Análise espectral no infravermelho próximo.............................................. 40
12
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS DE ESTUDOS........................................................ 48
APÊNDICE A – GENERALIDADES SOBRE A TÉCNICA FOTOACÚS TICA ........ 49
A.1 Histórico ............................................................................................................. 49
A.2 O efeito fotoacústico........................................................................................... 50
A.3 Teoria do efeito fotoacústico .............................................................................. 51
A.3.1 Absorção óptica ......................................................................................... 52
A.3.2 Difusão térmica.......................................................................................... 54
A.4 Equação de difusão de calor – Modelo R-G ....................................................... 55
A.5 Espectroscopia fotoacústica................................................................................ 60
A.6 Estudos em pele utilizando a técnica fotoacústica.............................................. 61
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 63
ANEXO A ............................................................................................................................. 68
13
INTRODUÇÃO
As micoses superficiais se destacam entre as doenças dermatológicas mais prevalentes
no Brasil, ocupando o segundo lugar em incidência, tanto nos serviços públicos quanto nos
privados, segundo o Censo Dermatológico realizado em maio de 2006 pela Sociedade
Brasileira de Dermatologia (SDB). Trata-se de um grupo de infecções causadas por fungos
capazes de utilizar a queratina da camada córnea da pele, unhas e cabelos como nutrientes. Os
fungos podem estar presentes no solo, na água, no ar, nos animais e no próprio ser humano.
Porém, quando encontram condições favoráveis, excesso de calor e umidade, se desenvolvem
e proliferam rapidamente desenvolvendo a doença. Acometem igualmente indivíduos do sexo
masculino e feminino, de todas as idades e classes sociais e constituem assim, um problema
de saúde pública em nosso país (CARDOSO, 2006).
Um importante progresso no tratamento de micoses ocorreu nas últimas três décadas
com a introdução de novos agentes antifúngicos, e entre eles podemos citar o ciclopirox
olamina.
Este e outros agentes antifúngicos tem sido objeto de estudo de vários pesquisadores
em diversas áreas das ciências básicas e aplicadas. Contudo, as pesquisas científicas
relacionadas à dermatologia que utilizavam metodologias não invasivas, baseavam-se, na
maioria das vezes, na observação clínica, o que pode ser considerado um método subjetivo.
Com os avanços tecnológicos, surgiram metodologias não invasivas, embasadas
cientificamente, e que não causam nenhum tipo de trauma ou dor e em muitos casos nem
desconforto aos pacientes ou voluntários que participam da pesquisa.
A Espectroscopia Fotoacústica (PAS)∗ surge como uma valiosa ferramenta de
pesquisa para análise de tecidos biológicos como a pele, oferecendo em muitos casos,
significantes vantagens sobre outras técnicas. A PAS baseia-se na absorção de luz modulada
por uma amostra e na subsequente conversão desta energia em calor. Uma das vantagens
provém do fato de ser uma medida direta da absorção, de modo que a luz espalhada, refletida
ou transmitida em geral não interfere nas medidas. A técnica permite também, que se obtenha
o espectro de absorção óptica de substâncias mesmo quando estas estão localizadas no interior
da amostra. É possível selecionar a espessura de prova da amostra através do ajuste da
frequência de modulação da luz incidente. Podemos obter informações através da intensidade
∗ Sigla em inglês para Espectroscopia Fotoacústica
14
do sinal e também por sua fase. Possibilita analisar não só as propriedades ópticas das
amostras, mas também as térmicas.
Os objetivos deste trabalho são utilizar a Espectroscopia Fotoacústica para avaliar a
evolução temporal da concentração do fármaco ciclopirox olamina na pele humana após sua
primeira aplicação e identificar picos espectrais que possam estar associados com substâncias
ou estruturas presentes na pele humana e no fármaco e que venham a ser úteis na identificação
de efeitos da droga.
15
1 A PELE HUMANA
1.1 A Pele Humana
A pele é o maior órgão do corpo humano correspondendo a 15% do seu peso corporal.
É o órgão que reveste o organismo, determina o seu limite com o meio exterior e exerce
diversas funções, como: proteção – constitui a barreira de proteção para as estruturas internas
do organismo evitando a penetração de agentes externos de qualquer natureza; proteção
imunológica – é um órgão onde atuam intensamente os componentes da imunidade humoral e
celular; termorregulação – graças a sudorese, constrição e dilatação da rede vascular cutânea,
a pele processa o controle homeostático da temperatura orgânica; percepção – é o órgão
receptor sensitivo do calor, frio, dor e tato; secreção – a secreção sebácea é importante para a
manutenção eutrófica da própria pele, evitando a perda de água (SAMPAIO e RIVITTI,
2008).
A pele é composta basicamente por três camadas: a epiderme, a derme e a hipoderme,
da mais externa para a mais profunda, respectivamente, como mostra a figura 1.
Figura 1 – Estrutura da pele humana
Fonte: Piatti (2008)
16
A epiderme é a camada mais externa da pele, sendo constituída por células epiteliais
(queratinócitos, melanócitos, células de Langerhans e células de Merkel). É geralmente muito
delgada (menor que 0,12mm na maior parte do corpo) mas em áreas de constante pressão ou
fricção, tais como as solas dos pés e as palmas das mãos, é consideravelmente espessa
(atingindo 1,5mm). Nessas áreas mais espessas é possível identificar cinco camadas: a
camada basal, espinhosa, granulosa, lúcida e camada córnea. As camadas espinhosa e basal
juntas formam uma outra camada comumente chamada de germinativa. Como o nome indica,
é nesta camada que ocorre a mitose, fornecendo células para substituir aquelas que são
perdidas na camada mais superficial da epiderme. A camada granulosa é composta de células
que contém grânulos de querato-hialina no citoplasma; com a expansão dos grânulos, os
núcleos das células se desintegram causando a morte das células mais externas. A camada
lúcida é uma banda clara, superficial à camada granulosa, sendo que as células desta camada
tornam-se continuamente parte da camada córnea através da presença de uma substância
chamada eleidina, que é transformada em queratina. A camada córnea é a mais externa,
composta de células mortas intimamente unidas e cheias de proteína fibrosa (queratina). Esta
camada desempenha um papel de importância relevante na função protetora da pele graças às
suas várias propriedades: impermeabilidade relativa à água e eletrólitos, resistência relativa a
agentes danosos corrosivos, alta impedância elétrica que restringe a passagem de corrente
elétrica através da pele, superfície relativamente seca que retarda a proliferação de
microorganismos e, quimicamente, representa uma membrana limitadora à passagem de
moléculas.
Na epiderme não há vasos sanguíneos. Logo, o único meio pelo qual suas células
podem obter alimento é por meio da difusão a partir dos leitos capilares da derme.
A derme está localizada abaixo da camada germinativa sendo a segunda principal
camada da pele. É responsável pela resistência e elasticidade da pele. É uma camada de tecido
conjuntivo composta por um sistema integrado de estruturas fibrosas, filamentosas e amorfas
(AZULAY e AZULAY, 2006). A derme corresponde à maior parte da pele, com espessura
variável ao longo do organismo, desde 1 até 4 mm, e compõe-se de três porções: a derme
papilar, a derme perianexial e a derme reticular.
A hipoderme, ou panículo adiposo, é a camada mais profunda da pele, de espessura
variável, composta exclusivamente por tecido adiposo, isto é, células repletas de gordura.
Funcionalmente, a hipoderme, além de depósito nutritivo de reserva, participa no isolamento
térmico e na proteção mecânica do organismo às pressões e traumatismos externos e facilita a
mobilidade da pele em relação às estruturas subjacentes.
17
1.2 Vias de penetração cutânea
A penetração de fármacos na pele, seja para um tratamento tópico ou transdérmico,
baseia-se na difusão do fármaco através das diversas camadas da epiderme. O extrato córneo é
a principal barreira limitante à difusão percutânea de fármacos devido à sua estrutura e
composição. Um fármaco pode atravessar o extrato córneo através de três vias diferentes: via
intercelular, via transcelular e via apêndices.
Figura 2 – Vias de penetração de fármacos através do estrato córneo.
Fonte: Moser et al. (2001).
• Via intercelular: o fármaco difunde-se ao redor dos corneócitos, permanecendo
constantemente dentro da matriz lipídica
• Via transcelular: o fármaco passa diretamente através dos corneócitos e da
matriz lipídica intercelular intermediária.
• Via apêndices: rota paralela, na qual os fármacos podem ser absorvidos pelo
folículo piloso, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas.
18
A importância de cada via de permeação depende das propriedades físico-químicas do
fármaco e das características da membrana.
1.3 Classificação quanto aos tipos de pele
Uma classificação dos fototipos de pele, baseada na reatividade cutânea à exposição
solar, foi desenvolvida e proposta por Fitzpatrick em 1976 (FITZPATRICK apud GUIRRO e
GUIRRO, 2004) e está simplificada a seguir:
Tabela 1 – Classificação dos fototipos de pele.
A cor da pele pode ser classificada como constitutiva, que depende de fatores
genéticos, ou facultativa quando depende de fatores como exposição ao sol e envelhecimento.
Grupo Eritema Bronzeado Sensibilidade
I Branca Sempre Nunca Muito sensível
II Branca Sempre Às vezes Sensível
III Morena clara Moderado Moderado Normal
IV Morena moderada
Pouco Sempre Normal
V Morena escura Raro Sempre Pouco sensível
VI Negra Nunca Pele muito pigmentada
Insensível
19
2 A DROGA CICLOPIROX OLAMINA
2.1 Introdução
Existem em nosso planeta 200 mil espécies de fungos, a grande maioria incapaz de
causar infecção em humanos por falta de adaptação ao organismo dos mamíferos. A
temperatura corpórea de aproximadamente 37°C é um eficiente mecanismo de defesa que nos
protege de fungos não-termotolerantes. Entretanto, cerca de 200 espécies fúngicas
conseguiram evolutivamente adaptar-se e sobreviver no ambiente hostil de nosso organismo
superando diversos mecanismos de defesa (QUEIROZ, 2004). Em humanos, as infecções
causadas por fungos variam de micoses simples, superficiais e de fácil tratamento até micoses
sistêmicas, disseminadas a vários órgãos e que são potencialmente fatais (SILVA, 2002).
Um importante progresso no tratamento das micoses superficiais e sistêmicas ocorreu
nas últimas três décadas com a introdução de novos agentes antifúngicos (ARAÚJO e
SILVEIRA, 1996).
O ciclopirox olamina foi sintetizado e introduzido na terapêutica em 1973, época em
que a maioria dos estudos sobre o mecanismo de ação deste fármaco foi publicada
(DITTMAR e LOHAUS,1973; NIEWERTH et al., 2003).
2.2 Mecanismo de ação
O mecanismo de ação do ciclopirox olamina consiste na inibição do transporte de
substâncias essenciais, como aminoácidos, para o interior das células fúngicas. Interfere na
biossíntese de proteínas, RNA e DNA destes microorganismos (ABRAMS et al., 1992).
2.3 Informações Técnicas
A tabela 2 apresenta as características gerais do fármaco ciclopirox olamina (BRITISH
PHARMACOPOEIA, 2006).
20
OH
H2N . CH3
Tabela 2 – Informações Técnicas do fármaco ciclopirox olamina.
2.4 Características Farmacológicas
O ciclopirox olamina tem atividade antifúngica de amplo espectro (GUPTA, 2001).
É fungicida para:
• Candida albicans;
• Epidermophyton floccosum;
• Microsporum canis;
• Trichophyton mentagrophytes;
• Trichophyton rubrum;
NOME QUÍMICO Sal etanolamínico de 6-cicloexil-1-hidroxi-4-metil-2-piridona
FÓRMULA
MOLECULAR
C12H17NO2C2H7NO
MASSA MOLECULAR 268,35 g/mol
ESTRUTURA QUÍMICA
APARÊNCIA Pó cristalino branco ou amarelo claro
SOLUBILIDADE Pouco solúvel em água e em acetato de etila;
Muito solúvel em etanol e cloreto de metileno;
Praticamente insolúvel em cicloexano.
DERIVAÇÃO É um derivado de hidroxipiridona
MEIA-VIDA 1,7 horas
21
É fungistático para:
• Pityrosporum orbiculare.
Apresenta efeito antiflogístico e antibacteriano sobre:
• Ampla variedade de bactérias Gram-positivas e negativas.
2.5 Indicações, contra-indicações e apresentações disponíveis.
O ciclopirox olamina é um antimicótico tópico usado no tratamento das micoses
superficiais:
• Tineas;
• Candidíase;
• Pitiríase versicolor.
O fármaco é contra-indicado nos casos de hipersensibilidade conhecida a qualquer
componente da formulação.
As formas farmacêuticas disponíveis são: creme, solução tópica, esmalte, xampu e pó.
22
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Aparelhagem utilizada
O aparato experimental utilizado para a realização das medidas de espectroscopia pode
ser visto na figura 3. Descreveremos a seguir a composição deste espectrômetro.
Amplificador síncrono Fonte
Modulador da luz
Célula
Fotoacústica
Lâmpada
Suspensãoantivibração
Monocromador
Modulador
Feixe de Luz
Microfone
Computador
Impressora
.
Amplificador síncrono Fonte
Modulador da luz
Célula
Fotoacústica
Lâmpada
Suspensãoantivibração
Monocromador
Modulador
Feixe de Luz
Microfone
Computador
Impressora
.
Figura 3 – Instrumentação utilizada na realização de varreduras espectrais.
A iluminação é feita por luz branca de alta intensidade e ampla faixa de espectro
proveniente de uma lâmpada de arco de Xenônio de 1000 W, marca Oriel modelo 6269, a
qual é acondicionada em um compartimento Oriel, modelo 66021. Este compartimento por
23
sua vez, possui em sua saída um sistema ótico condensador por onde a luz é conduzida até
incidir em uma fenda regulável na entrada de um monocromador Oriel, modelo 77200, onde,
através de redes de difração, é feita a seleção dos comprimentos de onda da luz que serão
utilizados.
Nas medidas realizadas na região do ultravioleta e visível utilizou-se uma rede de
difração da marca Oriel, modelo 77231 com 1200 linhas. Para as medidas realizadas na região
do infravermelho próximo, utilizou-se uma rede de difração da marca Oriel, modelo 77234,
com 600 linhas.
Na saída do monocromador, a luz passa por outra fenda regulável que permite
selecionar a banda passante. Em seguida o feixe atravessa um filtro, que é escolhido conforme
a faixa de comprimento de onda utilizada a fim de eliminar ordens superiores de difração.
Após isso, atravessa um modulador mecânico (chooper) da marca Stanford Research, modelo
SR 540, que consiste de um disco circular de metal com sulcos e obstáculos distribuídos
alternadamente e radialmente, capaz de girar com velocidade constante e controlável. Através
de um fotodiodo existente no modulador, é gerado um sinal de referência da frequência de
modulação, em relação ao qual é estabelecida a fase do sinal acústico.
Este sinal é enviado a um amplificador síncrono (lock-in) modelo SR 530 da Stanford
Research, o qual possibilita a leitura da fase e da frequência de modulação.
O feixe, agora monocromático e modulado, é direcionado por meio de um espelho até
a célula fotoacústica e, após atravessar uma janela de quartzo fixada na peça que conduz a
entrada da luz, atinge a amostra que repousa num suporte de alumínio. O sinal fotoacústico é
gerado no interior da célula e captado por um microfone condensador modelo 4166 da marca
Brüel & Kjäer, instalado no bloco metálico que contém a célula. O microfone e seu pré-
amplificador, que constituem um módulo único instalado na célula, são alimentados por uma
fonte da marca Brüel & Kjäer modelo 2804. Através de uma conexão existente nessa fonte, o
sinal fotoacústico é enviado ao amplificador síncrono.
No monocromador, os comprimentos de onda utilizados para irradiar a amostra podem
ser selecionados manualmente, mas geralmente são controlados através do software TSPEC
desenvolvido no laboratório e que possibilita varreduras espectrais com taxa de variação
constante no tempo. A programação via computador permite a obtenção de espectros de
intensidade fotoacústica versus comprimento de onda e também da fase fotoacústica versus
comprimento de onda. Para a manipulação dos espectros obtidos e realização de análises
posteriores dos dados obtidos foi utilizado o software Origin 8®, da empresa Microcal
Software, Inc.
24
O amplificador síncrono tem como característica realizar detecção em torno da
frequência do sinal modulado, funcionando como um filtro. O sinal fotoacústico processado
pelo amplificador síncrono origina um nível DC que possui uma intensidade e também uma
fase, que pode ser interpretada como o atraso na geração do sinal em relação à iluminação da
amostra.
Como a intensidade da luz varia com o comprimento de onda, é necessária a correção
do sinal fotoacústico gerado pela amostra em cada comprimento de onda. Para isso, é obtido
previamente o espectro de uma amostra de carvão vegetal em pó, no mesmo intervalo de
comprimento de onda. Durante a varredura do espectro da amostra em estudo, o sinal
fotoacústico é dividido ponto a ponto, através do software TSPEC, pelo sinal do carvão,
sendo esse processo denominado de normalização do espectro.
A célula fotoacústica utilizada para espectroscopia é composta basicamente por quatro
partes que funcionam encaixadas: a tampa, a canaleta, o porta-amostra e o cilindro de latão.
Junto à canaleta existe uma mola que, sob pressão mecânica mantém a célula fechada e
vedada evitando o contato da câmara de ar com o meio externo. Outro detalhe é a presença de
pinos na parte externa do cilindro de latão, que permitem a fixação da tampa no cilindro,
mantendo a canaleta presa entre as duas peças. Uma janela de quartzo é instalada dentro da
canaleta para a entrada do feixe (figura 4).
Na parte inferior do cilindro de latão existe um compartimento onde o microfone é
instalado. Este compartimento é ligado à câmara de gás através de um duto, permitindo que o
sinal gerado seja conduzido até o microfone. Uma cavidade lateral com rosca comunica o
duto com o meio externo. A utilização de um parafuso removível nesta cavidade atua como
válvula, permitindo que a câmara de gás fique aberta durante a instalação ou troca de amostra,
impedindo impactos de pressão que possam danificar o microfone durante a abertura ou
fechamento da célula.
Na figura 5 observa-se um dos vários porta-amostras disponíveis no laboratório, os
quais diferem entre si apenas na profundidade, o que permite a escolha do que melhor se
ajuste ao tipo de amostra utilizada. O corte lateral funciona como um prolongamento do duto
que liga a câmara de gás ao microfone.
25
(B)
Parafuso de descompressão
(A)
Tampa
Canaleta de Entrada do Feixe de luz
Mola
Porta-amostra
Anel de borracha
Cilindro De latão
Parafuso de descompressão
Porta-amostra
(C)
Canaleta de Entrada do Feixe de luz
Mola
Anel de borracha
Tampa
Microfone
Janela de quartzo
Cilindro De latão
Figura 4 – Detalhes da célula fotoacústica utilizada para espectroscopia: (A) – vista das partes (tampa, canaleta, porta-amostra, e cilindro de latão), (B) – vista externa das partes unidas; (C) – vista em corte das partes unidas e das estruturas internas.
As condições experimentais utilizadas na região do ultravioleta e visível foram:
frequência de modulação de 37 Hz, constante de tempo de 10 s, banda passante de 10 nm e
velocidade de varredura de 24 nm/min. Na região do infravermelho próximo, banda passante
de 20 nm e velocidade de varredura de 48 nm/min.
26
Porta-amostrade alumínio
Corte de acessoao microfone
12 mm
8 mm
2 m
mAmostra2mm
a 5mm
Figura 5 – Detalhes de um porta-amostra, que consiste de uma estrutura de alumínio na qual são ajustadas amostras para posterior inserção na célula fotoacústica. Na parte lateral do porta-amostra existe um corte que conduz, através de um duto existente no bloco da célula, as vibrações sonoras do interior da câmara fotoacústica até o microfone.
3.2 Preparação e manipulação das amostras
3.2.1 Amostras de pele
Utilizou-se neste trabalho amostras de pele tipo I segundo a classificação de
Fitzpatrick, proveniente de cirurgia plástica reparadora de abdome (figura 6). O paciente que
submeteu-se à cirurgia reparadora que deu origem às amostras foi orientado em relação aos
objetivos da pesquisa e assinou o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo A).
As amostras receberam a seguinte manipulação: com o auxílio de um bisturi cirúrgico,
previamente esterilizado, o excesso de tecido adiposo (gordura) foi retirado, e o sangue
proveniente do processo cirúrgico foi removido com o uso de soro fisiológico.
As amostras, cortadas em pedaços menores, foram acondicionadas em recipiente
adequado e mantidas sob refrigeração de -18,6 °C permanecendo no mesmo por um período
máximo de quatro dias até sua utilização (figura 7).
27
Figura 6 – Amostras de pele antes da manipulação.
Figura 7 – Amostras de pele após manipulação.
Com o auxílio de um perfurador metálico (vazador), as amostras foram cortadas de
forma a se encaixar perfeitamente no porta-amostra (figura 8).
É importante que as condições iniciais das amostras utilizadas sejam as mesmas ou as
mais próximas possíveis. Deste modo, realizou-se inicialmente o espectro de cinco amostras
intactas (sem a droga). Após comparação, foi feita a escolha de dois exemplares cujos
28
espectros mais se assemelharam. Uma das amostras selecionadas recebeu a aplicação da droga
e a outra não tratada, foi utilizada como controle.
Na tentativa de avaliar o estado de hidratação das amostras e também variações no teor
de substâncias e estruturas constituintes da pele, se fez necessário obter o espectro de uma
amostra de pele desidratada. Para tal, a pele foi cortada em pequenos pedaços e levados a uma
estufa a 40ºC, permanecendo por um período de quatro dias, para posterior obtenção do
espectro.
Figura 8 – Amostra assentada no porta-amostra.
3.2.2 O fármaco utilizado
Utilizou-se o fármaco ciclopirox olamina, adquirido no comércio local.
Cada ml da solução tópica contém:
• Ciclopirox olamina.......................................................................10mg
• Excipiente q.s.p...............................................................................1ml
Os excipientes são: álcool isopropílico, macrogol 400 e água purificada.
É importante salientar que quando nos referimos neste trabalho à palavra droga,
estamos considerando o conjunto de substâncias que constituem o produto utilizado e não
apenas ao seu princípio ativo, o ciclopirox olamina.
29
Apesar do fabricante não especificar o volume a ser aplicado, em nossos experimentos
controlamos este parâmetro com o auxílio de uma micropipeta, adotando como critério uma
quantidade suficiente para que o produto aplicado no extrato córneo fosse difundido até a base
da derme.
As amostras possuíam 8 mm de diâmetro e aproximadamente 3 mm de espessura,
resultando em um volume aproximado de 150 µl. A quantidade de droga utilizada foi 25 µl.
Foram realizadas medidas com outras quantidades de droga, mais precisamente 12,5 µl e 37,5
µl, porém a única alteração observada nos espectros é com relação à amplitude do sinal
obtido. Todavia, a quantidade de 25 µl pareceu-nos ser a mais próxima da dose comumente
aplicada pelos pacientes, além de satisfazer o critério acima.
3.3 Análise Espectral no Ultra-violeta e Visível
Procedeu-se inicialmente às varreduras espectrais da derme intacta (amostra controle),
da pele tratada e da droga, a fim de avaliar suas propriedades e a abordagem conveniente para
a análise espectral.
O intervalo de 250 a 600 nm foi utilizado para avaliar a cronologia da permanência da
droga na pele. Foram realizadas varreduras consecutivas da amostra controle e da pele tratada
num total de dez varreduras de cada par. Cada varredura individual demandou
aproximadamente 20 minutos, incluindo a troca de amostra, de modo que as varreduras de
cada par controle-amostra tratada levaram aproximadamente 40 minutos. Para efeito de
lançamento em tabelas e representações gráficas foi considerado que essas varreduras foram
realizadas simultaneamente, tomando-se o instante inicial (t = 0) com o correspondente ao
primeiro par e adicionando-se 40 minutos a cada medida subsequente. O experimento teve
uma duração aproximada de 6 horas.
Para a obtenção da cronologia de permanência da droga na pele, os espectros foram
submetidos ao seguinte tratamento matemático:
1. Foi subtraída a intensidade mínima de cada espectro, a fim de corrigir ou compensar
efeitos de “back-ground”, tais como fatores de forma e absorção por outras
substâncias presentes na célula, além da pele.
2. Para cada par de varreduras espectrais foi obtido o chamado espectro “in-situ” da
droga na pele. Isto é feito calculando-se a diferença entre o espectro da pele tratada e o
30
espectro da pele controle. Este cálculo quando realizado para os dez pares de
varreduras espectrais fornece a evolução temporal da droga na pele.
3. A partir dos dados do item 2, foi possível obter a curva que representa a cronologia da
presença da droga na pele. A barra de erro nas intensidades foi obtida através da
análise da região espectral próxima de 600 nm. Esta região foi ampliada permitindo
avaliar o ruído do sinal. O valor encontrado foi multiplicado por 4, devido às
operações matemáticas realizadas até a obtenção da curva. A barra de erro para o
comprimento de onda foi tomada como sendo um passo de varredura espectral.
3.4 Análise espectral no Infravermelho Próximo
Procedeu-se inicialmente às varreduras da derme intacta (amostra controle), da pele
tratada, da droga e da água.
As varreduras foram realizadas no intervalo de 1000 a 1600 nm, no intuito de
identificar picos correspondentes às substâncias e estruturas constituintes da pele. Foram
realizadas varreduras consecutivas da pele controle e da pele tratada, num total de oito
varreduras para cada par.
Efeitos de “back-ground” também foram corrigidos ou compensados para estes
espectros, ou seja, foi subtraída a intensidade mínima de cada espectro. Para a análise, foram
lançados em um mesmo gráfico todos os espectros corrigidos da pele controle e em outro,
todos os espectros corrigidos da pele tratada. Foi também realizada a varredura espectral de
uma amostra de pele desidratada com o objetivo de identificar alterações nos espectros pela
presença da água e da droga na pele.
31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da cronologia da presença da droga na pele – Análise no ultravioleta e
visível
1 Inicialmente, cinco amostras de pele foram comparadas para que pudéssemos escolher
duas, cujas condições iniciais fossem as mais próximas possíveis. O espectro das amostras
escolhidas está representado na figura 9.
Figura 9 – Espectros fotoacústicos para efeito de comparação entre duas amostras.
Podemos observar que as condições iniciais das amostras são bem próximas, mas não
idênticas, sendo a intensidade do sinal fotoacústico ligeiramente maior para a amostra 2. Após
vários ensaios, notou-se a dificuldade de obter-se amostras cujos espectros fossem idênticos.
Este fato ocorre inclusive para amostras obtidas de partes adjacentes da pele.
1 *Detalhes sobre a unidade utilizada são fornecidos no Apêndice A, seção A.5
250 300 350 400 450 500 550 600
0
2
4
6
8
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2u.
a.)*
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
amostra 1 amostra 2
32
É possível observar que a pele intacta apresenta um pico de absorção máximo centrado
em 303 nm. Nesta região as absorções são atribuídas a transições eletrônicas de substâncias e
estruturas presentes nas amostras. Para o caso da pele, queratina, ceramida e lipídeos são as
principais (SAMPAIO e RIVITTI, 2008). Cabe ressaltar que o comprimento de onda de
máxima intensidade depende da região do corpo da qual é retirada a pele. Durante os
primeiros ensaios, nos quais utilizamos pele da região das pálpebras, esse pico se apresentou
em 288 nm. O deslocamento para 303 nm é justificado pelo alto teor de gordura existente nas
amostras de pele da região abdominal.
O espectro fotoacústico da droga está representado na figura 10, onde identificamos
um pico com máximo centrado em 322 nm.
Figura 10 – Espectro fotoacústico da droga ciclopirox olamina
A droga quando aplicada à pele, é rapidamente absorvida. É o que mostra a figura 11,
onde está representado o espectro de pele logo após a aplicação. É possível observar que a
intensidade quase dobra, quando comparada com a pele intacta. Observa-se também que
devido à presença da droga na pele, o máximo ocorre para o comprimento de onda de 316 nm,
ou seja, deslocado em relação ao máximo observado no espectro da pele controle.
250 300 350 400 450 500 550 600-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2u.
a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
33
Figura 11 – Espectro fotoacústico da pele tratada logo após a aplicação.
A amostra 1 da figura 9 foi escolhida para a aplicação da droga.
Os efeitos relacionados com a atividade e consumo do fármaco na pele podem ser
avaliados através do espectro da droga “in-situ” na pele. Esse espectro é obtido através da
diferença entre o espectro da pele tratada e da pele controle e está representado na figura 12.
Pode-se observar, que o sinal é máximo no comprimento de onda correspondente a
322 nm, justamente o comprimento de onda onde está centrado o pico da droga, como
mostrado na figura 10. O espectro “in-situ” mostra a presença da droga incorporada à pele.
Com o objetivo de avaliar a cronologia da presença da droga na pele, foram realizadas
varreduras consecutivas da amostra controle e da amostra tratada com a droga, num total de
dez varreduras para cada par.
250 300 350 400 450 500 550 600-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
S
INA
L F
OT
OA
CÚ
ST
ICO
(10
-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA(nm)
34
Figura 12 – Espectro da droga ”in-situ” na pele
A figura 13 permite visualizar o comportamento dos espectros da pele tratada em
função do tempo. São apresentados três espectros obtidos em tempos distintos, relativos à
primeira, quinta e última varredura, correspondendo aos seguintes instantes após a aplicação:
imediatamente após a aplicação, 160 minutos e 360 minutos após a aplicação,
respectivamente. Notamos que entre a primeira e a última medida o pico de absorção máximo
sofre um deslocamento. Na primeira medida o pico está centrado em 316 nm, que é próximo
do pico da droga (322 nm) enquanto que na última medida o pico se encontra em 307 nm,
mais próximo do pico apresentado pelo controle (303 nm). Portanto, com o passar do tempo o
espectro da pele tratada vai se aproximando do espectro da pele controle, o que indica que a
droga está sendo consumida.
250 300 350 400 450 500 550 600-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
35
Figura 13- Espectros da pele tratada com a droga em três instantes distintos.
A monitoração do deslocamento do pico com o passar do tempo também pode
evidenciar a presença da droga na pele. A tabela 3 apresenta a posição do máximo em cada
espectro em função do tempo de aplicação da droga.
Tabela 3 – Relação entre a posição do pico (comprimento de onda) e o tempo de aplicação.
Tempo (minutos) Comprimento de onda (nm)
0 316
40 314
80 310
120 309
160 309
200 308
240 308
280 308
320 307
360 307
250 300 350 400 450 500 550 600-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA(nm)
1ª Medida 5ª Medida 10ª Medida
36
Essa evolução temporal do comprimento de onda de máxima intensidade é mostrada
graficamente na figura 14, para todas as medidas realizadas.
Figura 14 – Comportamento do deslocamento do máximo em função do tempo.
A tabela 4 apresenta as intensidades corrigidas dos picos da amostra controle e da
amostra tratada no comprimento de onda correspondente à pele (303 nm), bem como a
diferença (∆I) entre estas intensidades. Aparentemente, essa diferença representaria no
instante considerado o efeito da droga sobre as substâncias formadoras da pele. Deve-se,
entretanto, levar em conta que neste comprimento de onda a droga também contribui para a
geração do sinal, o que não nos permite tirar conclusões sobre possíveis alterações nas
substâncias que compõem a pele. Outro fato importante, é que alterações desta natureza
devem ocorrer após um período prolongado de uso do medicamento (o tratamento dura em
média 21 dias), não sendo notório em uma única aplicação.
Observam-se pela tabela 4 pequenas variações nas intensidades da amostra controle,
apresentando tendência de elevação do sinal no período final do experimento. Atribuímos este
aumento a alterações na amostra, provavelmente gerada pelo processo de desidratação natural
e exposição à radiação.
-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400306
308
310
312
314
316
C
OM
PR
IME
NT
O D
E O
ND
A(n
m)
TEMPO(minutos)
37
Tabela 4 – Intensidades corrigidas da amostra controle e da amostra tratada para comprimento de onda correspondente à pele (303 nm), no instante em que foram realizadas as medidas. O índice I representa a intensidade do sinal.
A cronologia do consumo do fármaco na pele tratada pode ser obtida efetuando-se a
diferença entre as intensidades da pele tratada e da pele controle no comprimento de onda
correspondente à droga (322 nm). Essa diferença ∆I (322) representa no instante considerado
o efeito sobre o pico da droga, relacionado com o seu consumo e atividade. Quando realizado
para os dez pares de varreduras, demonstra a cronologia do consumo do fármaco na pele
tratada durante a atividade da droga. Essas informações são apresentadas na tabela 5.
A partir da diferença ∆I (322) obtemos a curva de evolução temporal do sinal
fotoacústico através de um ajuste exponencial decrescente. O resultado se encontra na figura
15. O tempo de meia-vida encontrado é em torno de 320 minutos, três vezes maior que o
fornecido na literatura consultada (GOODMAN e GILMAN, 1996). Em trabalho realizado
sobre penetração de corantes, foi mostrado que a penetração do produto aplicado à pele é
cerca de dez vezes mais rápida para as medidas “in-vivo” do que para as medidas em pele
extraída (BERNENGO et al., 2001). Esta diferença pede ser atribuída à fatores como a
microcirculação, nas medidas “in-vivo”. Embora nosso foco não seja a penetração do fármaco,
acreditamos que fatores como a microcirculação possam influenciar no consumo da droga na
pele. Seria então necessário realizar medidas “in-vivo” para que fatores como este pudessem
ser considerados.
Tempo (min) Icontrole (10-2u.a.) Itratada(10-2u.a.) Diferença ∆I ± 0,6(10-2u.a.)
0 7,844 14,313 6,469
40 7,500 14,572 7,072
80 7,442 13,727 6,285
120 8,033 13,880 5,847
160 7,150 13,472 6,322
200 7,630 12,991 5,361
240 7,513 13,278 5,765
280 7,735 12,795 5,06
320 8,146 12,883 4,737
360 8,774 12,760 3,986
38
Tabela 5 – Intensidades corrigidas da amostra controle e da amostra tratada para comprimento de onda correspondente à droga (322nm), no instante em que foram realizadas as medidas. O índice I representa a intensidade do sinal.
Figura 15 – Cronologia da presença da droga na pele. A curva foi ajustada através de uma exponencial decrescente.
Tempo (min) Icontrole(10-2u.a.) Itratada(10-2u.a.) Diferença ∆I ± 0,6(10-2u.a.)
0 5,194 16,453 11,259
40 5,367 16,072 10,705
80 5,465 13,395 7,930
120 5,647 13,223 7,576
160 4,363 12,327 7,964
200 4,943 11,911 6,968
240 5,521 12,551 7,03
280 5,677 11,776 6,099
320 5,773 11,268 5,495
360 5,890 11,259 5,369
0 50 100 150 200 250 300 3504
5
6
7
8
9
10
11
12
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
TEMPO(minutos)
intensidade ajuste exponencial
39
4.2 Identificação de absorções espectrais associadas à composição da pele humana e ao
fármaco – Análise no infravermelho próximo
4.2.1 Espectroscopia no infravermelho próximo
Na região do espectro infravermelho próximo, as absorções são atribuídas a overtones
(harmônicos de ordem superior) e bandas de combinação de vibrações fundamentais
excitáveis em comprimentos de onda mais longos e relacionadas especialmente com grupos
hidrogênicos tais como C-H, O-H e N-H (ASHWORTH et al., 1978; CASTLEDEN et al.,
1980; KIRKBRIGHT e MENON, 1982; NATALE e LEWIS, 1982). A intensidade resultante
em um determinado comprimento de onda é determinada pela concentração desses grupos
(VINHA et al., 1989; HAAS e VINHA, 1995). Portanto, a espectroscopia fotoacústica pode
fornecer importantes informações sobre a concentração relativa dos materiais onde esses
grupos estão presentes.
No caso da pele humana os comprimentos de onda das absorções correspondentes aos
seus principais constituintes isolados foram determinados, sendo os resultados apresentados
na tabela 6.
Tabela 6 – Relação entre comprimento de onda (pico de absorção aproximado) e a substância a qual a absorção é atribuída.
Comprimento de onda (nm) Substância ou estrutura absorvedora
1065 Ceramida, esfingosina
1156 Queratina
1370 H2O monomérica
1445 H2O associada
1520 Queratina, ceramida
1580 Queratina, ceramida, esfingosina
1850 Lipídios, ceramida, esfingosina
1930 H2O, queratina, lipídios, esfingosina
2050 Queratina, lipídios, ceramida, esfingosina
2180 Queratina, lipídios, ceramida, esfingosina
2596 Queratina, lipídios, ceramida, esfingosina
2660 Queratina
Fonte: Comunicação pessoal de Ulrich Haas – Instituto de Física – Universidade de Hohenheim – Stuttgart – Alemanha
40
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
Droga ciclopirox olamina Água destilada
A tabela 6 mostra que a água se apresenta na parte superior da pele em duas formas
diferentes, a água monomérica (ou livre) e a água associada (ou ligada) ao estrato córneo. Na
frequência de modulação de 13 Hz, situação em que a resposta fotoacústica ocorre em todo o
estrato córneo a absorção está centrada em 1445 nm, revelando a presença de água ligada à
essa estrutura. Para uma frequência de 1500 Hz a absorção máxima ocorre em 1370 nm,
sendo causada pela água superficial ou adsorvida (livre) (HAAS et al., 1988).
4.2.2 Análise espectral no infravermelho próximo
Para a identificação de características espectrais associadas à composição da pele
humana e do fármaco, procedeu-se inicialmente às varreduras da derme intacta (amostra
controle), da pele tratada, da pele desidratada, da droga e da água.
A figura 16 mostra os espectros da droga ciclopirox olamina e da água destilada.
Figura 16- Espectro fotoacústico da droga ciclopirox olamina e da água destilada
41
Pode-se notar no espectro da droga a presença de um intenso pico centrado em 1424
nm e que não existe no espectro da água. Esse pico pode ser atribuído ao álcool presente na
composição da droga, em bom acordo com a literatura (GODDU e DELKER, 1960).
Nas figuras 17, 18 e 19 são mostrados os espectros da pele desidratada, pele controle e
pele tratada, respectivamente.
As posições e intensidades dos picos são apresentadas na tabela 7.
Um fato marcante é que as intensidades espectrais para a pele controle e tratada, em
comparação com a pele desidratada, são drasticamente reduzidas no intervalo de 1000 nm e
1200 nm, onde a água destilada e a droga possuem baixa absorção. Essa redução nas
intensidades não é tão evidenciada para o restante do intervalo espectral, onde a água e a
droga passam a apresentar absorções intensas.
Figura 17 – Espectro fotoacústico da pele desidratada.
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
42
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
Figura 18 – Espectro fotoacústico da amostra de pele utilizada como controle.
Figura 19 – Espectro fotoacústico da amostra de pele tratada com a droga.
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2 u
.a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
43
Tabela 7 – Comprimentos de onda e respectivas intensidades espectrais para a droga ciclopirox olamina, água destilada, pele desidratada, pele controle e pele tratada no intervalo entre 1000 nm e 1600 nm.
*Estes comprimentos de onda não representam picos e foram listados para informar a baixa absorção nesta região espectral.
Material Comprimento de onda (nm)
Intensidade espectral (10-2 u.a.)
Droga 1066* 0,010
1092* 0,014
1116* 0,010
1180* 0,203
1190 0,274
1238 0,173
1276 0,191
1384 1,045
1424 2,015
1488 1,781
1556 0,992
Água destilada
1066* 0,005
1092* 0,001
1066* 0,005
1180* 0,080
1192 0,115
1280 0,109
1388 0,5265
1442 1,757
1490 2,255
1554 1,054
Pele desidratada
1066 2,290
1092 3,075
1116 2,354
1180 5,223
1238 1,473
1270 4,239
1370 3,978
1424 3,837
1480 3,926
1559 2,989
Pele controle
1068 0,243
1098 0,276
1126 0,207
1186 0,450
1238 0,198
1276 0,322
1378 0,564
1432 1,367
1486 1,804
1554 0,947
Pele tratada
1068 0,108
1096 0,144
1126 0,112
1186 0,444
1238 0,186
1274 0,358
1376 0,625
1430 1,584
1484 2,094
1552 1,072
44
Devido ao seu mecanismo de ação, que consiste em inibir o transporte de substâncias
essenciais para o interior da célula, e também por utilizar o álcool como veículo, um dos
efeitos da terapêutica completa da droga, que dura em média 21 dias, é a intensa desidratação
da porção de pele onde ela é aplicada.
Consequentemente, pode-se, através da realização de espectroscopia contínua da pele
sob tratamento (análise “in-vivo”), estabelecer uma correlação entre intensidade espectral e
evolução do tratamento, a partir do monitoramento das variações das intensidades espectrais
causadas pela desidratação.
Os comprimentos de onda e substâncias e estruturas correspondentes a esses picos
estão listados na tabela 8 e mostram boa concordância com as absorções mostradas
anteriormente na tabela 6, ocorrendo pequenos deslocamentos nos comprimentos de onda.
Deve-se levar em conta que a posição dos picos na região do infravermelho próximo é afetada
pela vizinhança dos grupos moleculares e que os dados da tabela 6 foram obtidos a partir de
materiais isolados. É importante salientar que o preciso conhecimento de propriedades
espectrais desses constituintes da pele pode ser de grande utilidade na monitoração de efeitos
de fármacos sobre os mesmos, o que não foi possível neste trabalho, devido a ser considerada
apenas a primeira aplicação do fármaco.
Tabela 8 – Identificação de alguns dos picos encontrados no espectro fotoacústico da pele.
Comprimento de onda (nm) Substância ou estrutura atribuída
1068 Ceramida, esfingosina
1098 ---------------
1126 Queratina
1186 Queratina
1238 ---------------
1276 ---------------
1378 H2O monomérica
1432 H2O associada
1486 ---------------
1554 Queratina, ceramida, esfingosina
Com o objetivo de analisar uma possível alteração no processo de desidratação da pele
causada pela ação da droga, foram realizadas varreduras consecutivas da pele controle e da
pele tratada, num total de oito varreduras para cada par.
45
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
S
INA
L F
OT
OA
CÚ
ST
ICO
(10-2
u.a.
)
COMPRIMENTO DE ONDA(nm)
amostra 1 amostra 2
O procedimento inicial de comparação entre amostras também foi realizado neste
caso. Os espectros das amostras escolhidas se encontram na figura 20.
Figura 20 – Espectros para efeito de comparação entre as amostras.
As figuras 21 e 22 apresentam, respectivamente, os espectros da pele controle e da
pele tratada para dois instantes distintos. Apesar de termos realizado oito varreduras para cada
amostra, optamos por apresentar apenas duas, a primeira e a última, para melhor visualização.
O intervalo de tempo entre as medidas apresentadas é de aproximadamente oito horas.
Os comprimentos de onda e respectivas intensidades espectrais para a amostra controle e
amostra tratada para as duas varreduras apresentadas estão listados na tabela 9, a qual permite
analisar o processo de desidratação da pele, e evidencia a ação da droga neste processo. Nota-
se que o efeito global é o mesmo para ambas as amostras: as intensidades espectrais sofrem
uma elevação no intervalo entre 1000 nm e 1200 nm, e uma redução para absorções acima de
1274 nm. Contudo, a redução nas intensidades espectrais é mais acentuada para a pele tratada,
confirmando a premissa de que a droga atua inibindo o transporte de substâncias essenciais
para o interior da célula, acelerando o processo de desidratação. A intensidade do pico
centrado em 1484 nm sofre uma redução em torno de 30% para a pele tratada e 15% para a
pele controle.
46
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2u.
a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
1ª medida 8ª medida
Pele controle
Figura 21 – Espectros da pele controle em dois instantes distintos.
Figura 22 – Espectros da pele tratada em dois instantes distintos.
Novamente, pode-se, através da realização de espectroscopia contínua (analise “in-
vivo”), estabelecer uma correlação entre intensidade espectral e evolução do tratamento,
monitorando a redução das intensidades espectrais nesta região.
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
SIN
AL
FO
TO
AC
ÚS
TIC
O (
10-2u.
a.)
COMPRIMENTO DE ONDA (nm)
1ª medida 8ª medida
Pele tratada
47
Tabela 9 – Comprimentos de onda e respectivas intensidades espectrais para a pele controle e pele tratada no intervalo entre 1000nm e 1600nm.
Amostra Comprimento de onda (nm)
Intensidade espectral (10-2 u.a.)
Pele controle
1ª Medida 1066
0,175
1098
0,222
1126
0,160
1186
0,491
1238
0,148
1274
0,372
1378
0,565
1430
1,616
1484
2,087
1554
1,000
8ª Medida 1068
0,233
1098
0,255
1126
0,189
1186
0,436
1238
0,184
1274
0,317
1380
0,538
1432
1,362
1486
1,773
1552
0,931
Pele tratada
1ª Medida 1068
0,102
1096
0,134
1126
0,105
1186
0,435
1238
0,192
1274
0,359
1378
0,635
1430
1,657
1484
2,187
1552
1,085
8ª Medida 1068
0,187
1096
0,230
1126
0,173
1186
0,425
1238
0,174
1274
0,357
1378
0,794
1430
1,244
1486
1,542
1556
0,841
48
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS DE ESTUDOS
O trabalho baseou-se em análises espectrais da pele humana, após a primeira aplicação
da droga ciclopirox olamina.
Na região do ultravioleta e visível essas análises permitiram monitorar, utilizando o
espectro “in-situ” da droga na pele, a evolução temporal da concentração da droga. A partir de
medidas espectrais, foi possível obter um ajuste exponencial das intensidades em função do
tempo após a aplicação da droga. Foi monitorada também a evolução temporal do
comprimento de onda de máxima absorção, que pode indicar o consumo do fármaco na pele.
Na região do infravermelho próximo foram identificados vários picos correspondentes
à composição da pele citados na literatura. Também foi possível detectar picos associados à
composição da droga, em particular os correspondentes à água e ao álcool. O monitoramento
de um pico nesta região evidenciou que a presença da droga pode levar a uma intensificação
na desidratação da pele, em comparação com uma amostra controle sem droga.
Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam a potencialidade da técnica
fotoacústica na detecção de substâncias veiculadas na pele humana. Os estudos certamente
seriam enriquecidos com a construção de uma célula fotoacústica adequada à realização de
medidas “in-vivo”, durante toda a terapêutica de utilização dessas drogas, que propiciariam
identificar efeitos mais tardios e que não se manifestam na primeira aplicação.
49
APÊNDICE A – GENERALIDADES SOBRE A TÉCNICA FOTOACÚS TICA
A.1 Histórico
A incidência de luz solar modulada (1000Hz) em uma substância sólida em forma de
diafragma, conectado a um tubo acústico, gera no ar em sua volta um som audível. Isto foi o
que Alexander Graham Bell percebeu, quando em 1880 investigava a possibilidade de
comunicação à distância utilizando a luz, descobrindo o Efeito Fotoacústico (BELL, 1880).
Em uma série de experimentos posteriores, Bell demonstrou que o efeito fotoacústico em
sólidos dependia da absorção da luz pela amostra (BELL, 1881). O efeito fotoacústico em
líquidos e gases também foi investigado neste trabalho. No mesmo ano outros pesquisadores
também investigaram o efeito fotoacústico em gases (TYNDALL, 1881; ROENTGEN, 1881).
Particularmente no caso de amostras sólidas na forma de discos finos e flexíveis, Bell,
em concordância com Lord Rayleigh, considerava como fonte primária do sinal fotoacústico a
vibração mecânica do disco, devido ao aquecimento desigual do mesmo, quando iluminado de
forma intermitente. Em contrapartida, Mercadier e Preece sustentaram a hipótese de que o
sinal fotoacústico era gerado pelo movimento vibratório do gás, principalmente da camada
adjacente à superfície da amostra, em função do aquecimento e resfriamento alternados
(ROSENCWAIG, 1980). Esta teoria é a que mais se aproximou da explicação moderna do
fenômeno.
Para realizar seus experimentos, Bell utilizava o próprio ouvido como detetor, o que
dificultava a obtenção de dados quantitativos e certamente contribuiu para que o fenômeno
fosse considerado uma mera curiosidade. Com o desenvolvimento de microfones sensíveis, o
interesse pelo estudo da fotoacústica foi retomado. Em 1938 Viengorov utilizou o fenômeno
para estudar a absorção de luz no infravermelho por gases (VIENGEROV, 1938).
Analisadores de gases baseados no efeito fotoacústico foram desenvolvidos em seguida
(PFUND, 1939). Porém, entre 1950 e 1970 com o desenvolvimento de técnicas mais precisas
estes foram substituídos, sendo novamente utilizados com o surgimento de fontes de laser.
Em 1973, o efeito fotoacústico voltou a ser investigado em amostras sólidas, e Parker
mostrou que a parcela referente às vibrações mecânicas da amostra é quase desprezível frente
ao efeito térmico (PARKER, 1973). Pouco tempo depois, Rosencwaig e Gersho apresentaram
a teoria do efeito fotoacústico em sólidos (ROSENCWAIG e GERSHO, 1976) culminando
nas mais variadas aplicações da técnica. Como exemplos, podem ser citados a espectroscopia
50
de absorção em uma ampla faixa de comprimentos de onda, estudo de propriedades térmicas e
elásticas, de reações químicas, de ressonância magnética, de processos radiativos, de
eficiência quântica, de superfície, de espessura de camadas e de microscopia em materiais
orgânicos e inorgânicos (ROSENCWAIG, 1980).
A.2 O efeito fotoacústico
O efeito fotoacústico consiste na geração de um sinal acústico em um gás contido no
interior de uma célula fechada, decorrente de uma oscilação térmica na superfície da amostra
em virtude da absorção da radiação incidente. A figura 23 representa um modelo
unidimensional padrão de célula fotoacústica. Dentro da célula encontra-se uma amostra do
material a ser investigado. O restante do volume interno é ocupado pelo gás que pode ser o
próprio ar.
Figura 23 – Representação de uma célula fotoacústica fechada, com a superfície da amostra na origem do eixo x. Os comprimentos da câmara de gás, da amostra e do suporte valem, respectivamente, gl , sl e ( )sll − . O significado preciso das grandezas
gπµ2 e sπµ2 será abordado na seção A.3.2.
A radiação, que tem sua intensidade modulada de forma mecânica por uma pá
giratória, incide na amostra através de uma janela transparente, geralmente de quartzo, onde é
absorvida e transformada em calor. Com o aquecimento periódico da amostra, uma camada
Luz modulada
Microfone
Janela transparente
Gás (ar)
Amostra Suporte
g -ℓ -2πµ 0 2πµ ѕ ℓ ℓ ѕ g x
51
relativamente fina de gás adjacente à superfície do sólido responde às variações de
temperatura do material, expandindo-se e contraindo-se periodicamente, funcionando como
um “pistão vibratório” capaz de gerar ondas de pressão (ondas acústicas) que se propagam
pelo gás. Um microfone acoplado à célula detecta as ondas de pressão fornecendo o sinal
fotoacústico.
A.3 Teoria do efeito fotoacústico
A seguir serão apresentados alguns conceitos que servem de base para a teoria do
efeito fotoacústico proposta por Rosencwaig e Gersho (Teoria R-G). A tabela 10 lista os
parâmetros a serem utilizados.
Tabela 10 – Grandezas utilizadas no equacionamento do fenômeno fotoacústico. O índice i será substituído por g no caso do gás, por s no caso da amostra e por b no caso do suporte. Símbolo/Fórmula Nome Unidade
K i Condutividade térmica Cal/cm.s.°C
iρ Densidade g/cm3
Ci Calor específico (pressão constante) Cal/g.°C
iiii CK ./ ρα = Difusividade térmica cm2/s
iia
αω
2= Coeficiente de difusão térmica cm-1
( ) ii ai+= 1σ Coeficiente complexo de difusão térmica cm-1
ii a
1=µ Comprimento de difusão térmica cm
iβ Coeficiente de absorção óptica cm-1
i
iβ
β1=l Comprimento de absorção óptica cm
52
A.3.1 Absorção óptica
O primeiro processo físico a ser analisado é a absorção da luz pela amostra. O
comprimento de absorção óptica (βl ) é definido como sendo a distância que o feixe luminoso
incidente penetra na amostra, até que sua intensidade (I) se reduza a 1/e da sua intensidade
inicial (I0). Este parâmetro (βl ) é definido desta forma, pois na maioria dos casos, a radiação
não é totalmente absorvida na superfície da amostra e, à medida que os fótons penetram no
material, vão interagindo com as moléculas do mesmo e sendo absorvidos, fazendo com que a
intensidade do feixe luminoso diminua de maneira exponencial, como mostra a equação 1.
( ) xeIxI feixeβ−= 0 (equação 1)
Para uma profundidade x da amostra a intensidade I de luz absorvida pode ser
expressa por:
( )
−−= xeIxI β10 (equação 2)
A partir do comprimento de absorção óptica (βl ) podemos determinar a profundidade
que o feixe penetra na amostra. Este fato é importante, pois é nesta região que o calor é
gerado. A relação entre a espessura da amostra (l ) e o comprimento de absorção óptica (βl )
conforme a figura 24, classifica a amostra em três categorias (ROSENCWAIG, 1980).
I – Se l » βl : a amostra é opaca. Ou seja, I( l ) « ( 1/e ) I0.
II – Se l ≈ βl : a amostra é absorvedora. Ou seja, I( l ) ≈ ( 1/e ) I0.
III – Se l « βl : a amostra é transparente. Ou seja, I( l ) » ( 1/e ) I0.
53
ℓβ
ℓβ
ℓ ℓβ
ℓ
ℓ
ℓ >> ℓβ
ℓ ≈ ℓβ
ℓ << ℓβ
Figura 24 – Classificação da amostra a partir da relação entre a espessura da amostra (l ) e o comprimento de absorção óptica (βl ). Fonte: Adaptado de PEDROCHI (2004).
A radiação ao interagir com a molécula excita um estado eletrônico (para a região de
luz visível ou ultravioleta) ou vibracional (para a região do infravermelho). O elétron, após ser
excitado retorna rapidamente ao estado fundamental (em tempos menores que 10-8 segundos)
e a não ser que um novo fóton seja emitido (luminescência) ou uma reação fotoquímica
estimulada, a energia será transferida para os estados vibracionais da molécula o que gera um
aumento de temperatura em um ponto da amostra (PESSOA JR., 1985). Assim, a partir de um
ponto da amostra, ocorre um processo de transferência de energia térmica por condução.
54
A.3.2 Difusão Térmica
A difusão térmica é o processo no qual a energia térmica gerada em um ponto da
amostra é transferida para os pontos vizinhos.
Para medir a velocidade com o que o calor se espalha na amostra utiliza-se o
parâmetro denominado difusividade térmica α dado pela equação 3.
(equação 3)
onde K é a condutividade térmica, ρ é a densidade e Cp é o calor específico do material.
A quantidade de calor armazenada por volume a uma dada temperatura é expressa por
pCρ . Um ponto, ao ser aquecido, difundirá seu calor para outros pontos da amostra. Estes
sofrerão um aumento e uma diminuição de temperatura semelhante a um pulso.
A difusão do calor, a partir de um ponto, se dará em ciclos correspondentes à
frequência de modulação da luz, pois pontos dentro do comprimento de absorção óptica
geram calor de forma periódica. Logo, a magnitude de oscilação térmica sentida em um ponto
da amostra (na superfície, por exemplo) dependerá da distância entre os pontos e da
frequência ( f = ω/2π ) de modulação da luz.
A distância na qual a magnitude de oscilação térmica transmitida se atenua a um valor
de 1/e é definida pelo parâmetro denominado comprimento de difusão térmica µ dado pela
equação 4.
ωαµ 2= (equação 4)
Apenas a luz modulada absorvida dentro de uma profundidade 2πµs na amostra,
contribui significativamente para a oscilação de temperatura na interface com o gás, e
somente o volume de gás cuja distância à superfície da amostra for menor que 2πµg é capaz
de responder termicamente à oscilação de temperatura na superfície da amostra contribuindo
significativamente para a geração do sinal fotoacústico (ROSENCWAIG, 1980).
Pode ser visto na equação 4 que o comprimento de difusão térmica varia com o
inverso de ω . Deste modo, é possível selecionar o sinal de camadas cada vez mais
pC
K
ρα =
55
superficiais através do aumento da frequência de modulação, determinando assim, um perfil
de profundidade da amostra. Este fato permite ainda fazer uma análise detalhada de uma
amostra composta de duas camadas e espectros distintos (HELANDER et al.,1981;
MANSANARES et al.,1990), obtendo o espectro composto e o espectro isolado da camada
superior.
A figura 25 representa o comportamento do comprimento de difusão térmica em
função da frequência de modulação, onde pode ser visto que a espessura da amostra que
contribui para a geração do sinal fotoacústico é menor à medida em que a frequência aumenta.
A amostra pode ser classificada através de seu comportamento térmico em função de
sua espessural :
I – Se l > 2πµs: a amostra é considerada termicamente grossa.
II – Se l « µs: a amostra é considerada termicamente fina.
Figura 25 – Comportamento do comprimento de difusão térmica
Apresentaremos na seção seguinte uma descrição do modelo proposto por Rosencwaig
e Gersho (modelo R-G) para a teoria da geração do sinal fotoacústico.
A.4 Equação de difusão de calor – Modelo R-G
Consideremos a situação física esquematizada na figura 23, na qual temos uma
amostra sólida de comprimento sl no interior de uma célula cilíndrica, repousando em um
suporte de comprimento ( sll − ). O tamanho da coluna de gás dentro da câmara é gl . Vamos
supor que a intensidade do feixe luminoso que incide na superfície da amostra seja dada por:
Camada 1
Camada 2
f1 > f2 > f3 > f4
µ
µ µ
µ
1
2 3
4
ℓ
56
tieII ω0= (equação 5)
onde I0 é a intensidade da radiação incidente e ω sua frequência de modulação. Para o caso
unidimensional a equação de difusão do calor pode ser escrita como:
( ) ( ) ( ) 0,,1,
2
2
=+∂
∂−∂
∂txf
t
tx
x
tx θα
θ (equação 6)
onde o termo ( )txf , refere-se à taxa de geração de calor por unidade de tempo no meio
considerado. No nosso caso temos uma amostra na qual a geração de calor se dá devido à
absorção dianteira da radiação incidente, e a componente espacial de ( )txf , é dada por:
( ) ( ) xeI
KxI
dx
d
Kxf
ss
ββ −== 0
1 (equação 7)
As condições de contorno a serem aplicadas (condições de contorno de Rosencwaig e
Gersho) supõem a continuidade da temperatura e do fluxo de calor nas superfícies de
separação entre dois meios adjacentes i e j.
=
=
dx
dK
dx
dK j
ji
i
ji
θθ
θθ
(equação 8)
Aplicando as condições de contorno dadas, a solução do equacionamento pode ser
encontrada aplicando-se o método das funções de Grenn. As expressões para a oscilação de
temperatura e para a oscilação de pressão na câmara fotoacústica são dadas por:
( ) ( )F
g
tixgaeetx
φωθθ +−= )0(, (equação 9)
57
( ) ( )( )( ) ( )( ) ( )
( )( ) ( )( )
−−−++
−+−+−+−−
=−
−−
ssss
sssss
ss ebgebg
erbebrebr
K
Ill
lll
σσ
βσσ
σββθ
1111
211112
022
0
)(
0
0
2
)0()( F
ggV
PP
tie
TaC
PCt
φωθδ +=l
( ) ( )FpP
tiet
φωδδ +=r
(equação 10)
onde Cp e Cv correspondem aos calores específicos, T0 a temperatura média na superfície da
amostra e P0 representa a pressão ambiente.
O fator θ(0) representa a amplitude da temperatura em x = 0 (na interface amostra-gás)
sendo dado por:
(equação 11)
onde ;ss
bb
K
Kb
σσ= ;
ss
gg
K
Kg
σσ
= s
rσβ=
A equação 10, na íntegra, é bastante complexa, mas pode ser simplificada em alguns
casos limites que dependem dos parâmetros físicos envolvidos no experimento. A tabela 11
apresenta os casos limites (PESSOA JR., 1985).
Podemos escrever a equação 10 na forma abreviada:
(equação 11)
sendo pδ a amplitude da oscilação da pressão, definida como:
( )0
0
2
0
TaC
PC
ggV
PP
l
θδ ≡ (equação 12)
58
Tabela 11 – Casos limites do efeito fotoacústico. A constante Y é dada por: 0
0 TP
C
CY
g
g
V
P
l
α=
Termicamente Grosso Termicamente Fino PROPRIEDADES
TÉRMICAS ℓS >> µS ℓS << µS
FS GERAL
COM CONDIÇÕES
R.G.
( )( ) ( )∫+
=−− l
0
4/2/1
1dxxfe
g
eYS x
S
i
FSσ
π
σω
( )
( ) ( )∫+=
−− l
0
4/2/1
dxxfbg
eYS
S
i
F σω π
FS COM
ABSORÇÃO DE BEER
( ) ( )( )
1
1
2 2204/2/1
+−
−= −−
g
r
K
IeYS
SS
iF σβ
βω π ( ) ( ) ( )104/2/1 −+
= −−− lβπ
σω e
bgK
IeYS
SS
iF
FASE ( )1/arctan += SF aβφ oF 90=φ
PROP. ÓPTICAS ℓβ >> µS ℓβ << µS ℓβ >> ℓS ℓβ << ℓS
FS ( )iK
YIS
S
SF +
−= 1
24
20
ωβµ
i
K
YIS
s
sF ω
µ4
20−=
iK
YIS
b
bF ω
µβ4
20 l−= iK
YIS
b
bF ω
µ4
20−=
FASE oF 45=φ o
F 90=φ oF 90=φ o
F 90=φ
DEPENDÊNCIA C/
FREQUÊNCIA 2
3−∝ ωFI
1−∝ ωFI 1−∝ ωFI 1−∝ ωFI
DEFINIÇÃO DO ESPECTRO Resolvido Saturado Resolvido Saturado
Transparente Opaco Opaco Transparente Transparente Opaco PROPRIEDADES
ÓPTICAS ℓS << ℓβ ℓS >> ℓβ ℓβ << µS ℓβ >> µS
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
LUZ
ℓβ ℓS
µS
LUZ
ℓS ℓβ µS
LUZ
ℓS µS ℓβ
LUZ
µS ℓβ ℓS
LUZ
ℓβ µS ℓS
LUZ
µS ℓS
ℓβ
59
F
R
(ωt+ Fφ )
p δ
Im
p δ
Pode-se então representar essa variação de pressão, que é o próprio efeito fotoacústico,
em um diagrama de fasores no plano complexo (figura 26).
Figura 26 – Representação fasorial da variação da pressão.
A detecção dessa variação de pressão é realizada por um microfone sensível, sendo
uma primeira medida do efeito fotoacústico. A amplitude do sinal dependerá das
especificações do microfone, isto é, seu quociente sinal eletrônico/amplitude de pressão,
normalmente especificado em milivolts/pascal. Esse sinal pode ser visualizado, após uma
amplificação, na tela de um osciloscópio. Entretanto, devido à baixa amplitude desse sinal, ele
é muito suscetível a fontes de ruído eletrônico, acústico, vibrações, etc., o que requer uma
detecção síncrona ou sintonizada com a frequência de modulação. Para a realização dessa
detecção, utiliza-se um modulador (chopper) que, além de produzir a modulação da luz
incidente na amostra, gera também um sinal de referência (onda quadrada), a partir da
interrupção alternada da luz de um diodo (led) incidente em um fotodiodo. Normalmente
haverá uma defasagem entre esse sinal e o sinal fotoacústico, e essa defasagem é considerada
como a fase do sinal fotoacústico. Observa-se, portanto, que a fase do sinal fotoacústico é
uma grandeza relativa, dependente da particular montagem do aparato experimental. Contudo,
a diferença de fase entre dois sinais, desde que detectados a partir de uma mesma montagem,
é uma grandeza absoluta.
Para a medida prática do sinal fotoacústico, tanto o sinal proveniente do microfone
quanto o sinal da referência, são inseridos em um amplificador síncrono ou sintonizado
(lock-in). Através de uma combinação de ambos (produto), realizada pelas suas características
60
Y
S F
X
F S
Fϕ
eletrônicas, o amplificador fornecerá em sua saída um nível DC, correspondente ao módulo
do sinal fotoacústico (SF) e um valor angular, que corresponderá à fase desse sinal ( Fϕ ). O
amplificador síncrono também limitará a faixa de frequência de detecção a um valor em torno
da frequência de modulação, funcionando como um filtro, o que melhorará drasticamente a
relação sinal/ruído. Desta forma, a representação mais apropriada para o sinal fotoacústico,
como detectado, é a de um vetor fixo no plano XY, constituído de uma magnitude e uma fase
(figura 27).
Figura 27 – Representação vetorial do sinal fotoacústico após o processamento do detector síncrono. O sinal torna-se independente do tempo.
A.5 Espectroscopia fotoacústica
Sucintamente, podemos dizer que espectros de absorção óptica gerados pelo sinal
fotoacústico numa determinada faixa de comprimento de onda, caracteriza a técnica
Espectroscopia Fotoacústica.
Para que o sinal fotoacústico seja gerado, é necessário a absorção da radiação pela
amostra. A intensidade do sinal depende da quantidade de calor gerado na amostra, e este por
sua vez varia com a mudança do comprimento de onda da radiação modulada incidente. A
variação do coeficiente de absorção óptica via mudança do comprimento de onda da radiação
incidente permite realizar a espectroscopia da amostra. Nos espectros fotoacústicos as
intensidades espectrais, ou seja, o sinal fotoacústico para cada comprimento de onda, são
especificadas em unidades arbitrárias, abreviadas por (u.a.). Unidades relativas seria uma
especificação mais adequada, uma vez que as intensidades são normalizadas em relação ao
espectro do carvão, o que possibilita compensar a variação nas intensidades da lâmpada de
61
Xenônio, utilizada como fonte de luz. Entretanto é de uso geral o termo (u.a.), que decidimos
manter neste trabalho.
A espectroscopia fotoacústica apresenta uma série de vantagens em relação à
espectroscopia convencional (de transmissão, reflexão e espalhamento), dentre as quais
podemos citar:
� Por se tratar de uma medida direta da absorção, a luz transmitida, refletida ou
espalhada em geral não interfere nas medidas.
� A informação é oferecida pela intensidade e também pela fase do sinal.
� É uma técnica relativamente sensível, geralmente capaz de detectar a presença de
baixas concentrações dos componentes absorvedores na amostra.
� Permite analisar o perfil de profundidade da amostra.
� As propriedades ópticas e térmicas da amostra são passiveis de estudo.
� É uma técnica não destrutiva. As amostras não necessitam de nenhum ou quase
nenhum tratamento prévio.
A.6 Estudos em pele utilizando a técnica fotoacústica
No final da década de 70, Rosencwaig iniciou os estudos em dermatologia utilizando a
técnica fotoacústica. Desde então, muitos pesquisadores tem se utilizado da técnica nos mais
variados trabalhos envolvendo materiais biológicos como a pele. Este fato se justifica devido
às vantagens que a fotoacústica apresenta em relação aos outros métodos de pesquisa. A
fotoacústica permite a análise de tecidos biológicos intactos, o que constitui uma importante
ferramenta de pesquisa. Outra vantagem é que o sinal produzido depende da radiação
efetivamente absorvida pela amostra sob estudo, permitindo o estudo mesmo de amostras
altamente espalhadoras como é o caso de tecidos biológicos (ANJOS et al., 2004).
A técnica fotoacústica tem sido utilizada na caracterização da pele humana, no estudo
de penetração de fármacos de uso tópico, aplicação de cosméticos e protetores solares, entre
outros (ROSENCWAIG, 1980). Dentre estes trabalhos, podemos citar: A classificação de
fototipos de pele (MOTA e BARJA, 2006), análise do perfil de profundidade em células de
mamíferos (NARAYANAN et al., 1997), medidas de difusividade térmica da pele (BROWN
et al., 1993), medidas da efusividade térmica da pele humana e cinética de penetração de
hidratantes em diferentes formulações (LOBATO e BARJA, 2007), estudo da variação da
62
fase fotoacústica com a frequência de modulação no estrato-córneo e na epiderme (BAESSO
et al., 1994).
Na área de dermatologia, a técnica revelou-se capaz de fornecer relevantes
informações. Dois trabalhos de referência na área tiveram como objetivo determinar a taxa de
difusão de tetraciclina usada topicamente (CAMPBELL et al., 1979) e realizar um perfil de
profundidade do β-caroteno na pele (ANJO e MOORE, 1984). Estes trabalhos demonstram a
potencialidade da técnica fotoacústica para o estudo da pele humana.
63
REFERÊNCIAS
ABRAMS, B. B.; HANEL, H.; HOEHLER, T. Ciclopirox Olamine: A hydroxypyrydone
antifungal agent. Clinics in Dermatology, 9, 471-477, 1992.
ANJO, D. M.; MOORE, T. A. A photoacoustic depth profile of β-carotene in skin.
Photochemistry and photobiology, 39(5), 635-640, 1984.
ANJOS, F. H.; ROMPE, P. C. B.; MANSANARES, A. M.; SILVA, E. C.; AVALOS, D. A.;
BARJA, P. R. Sunscreen effects in skin analyzed by photoacoustic spectroscopy. Optical
diagnostics and sensing, 5325, 143-149, 2004.
ARAÚJO, M. G.; SILVEIRA, M. A. Gênese de antifúngicos. Revista de Farmácia e
Bioquímica da Universidade de São Paulo, 32, 1-10, 1996.
ASHWORT, C. M.; KIRKBRIGHT, G. F.; SPILLANE, D. E. M. Quantitative examination of
polyester-cotton by near-infrared photoacoustic spectroscopy. Analyst, 108, 1481-1484,
1978.
AZULAY R. D; AZULAY D. R. Dermatologia. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2006, 1-15.
BAESSO, M. L; SHEN, J.; SNOOK, R. D. Laser-induced photoacoustic signal phase study of
stratum corneum and epidermis. Analyst, 119, 561-562, 1994.
BELL, A. G. On the production and reproduction of sound by light. American Journal of
Science, 120, 305-324, 1880.
BELL, A. G. The production of sound by radiant energy. Science, 2(49), 242-253, 1881.
BERNENGO, J. C.; BISSCHOP, E.; COMMANDRÉ, F. Eletrofisioterapia. São Paulo:
Santos, 2001, 65-69.
64
BRITISH PHARMACOPOEIA 2006, London: Her Majesty Stationery Office, London, 2006.
BROWN, S. M.; BAESSO, M. L.; SHEN, J.; SNOOK, R. D. Thermal diffusivity of skin
measured by two photothermal techniques, Analytica Chimica Acta, 282, 711-719, 1993.
CAMPBELL, S. D.; YEE, S. S.; AFROMOWITZ, M. Applications of photoacoustic
spectroscopy to problems in dermatology research. Transactions on Biomedical
Engineering, 26(4), 220-227, 1979.
CARDOSO, L. S. Abordagem introdutória às micoses superficiais e aspectos relacionados.
Revista Racine, 94, 24-32, 2006.
CASTLEDEN, S. L.; KIRKBRIGHT, G. F.; MENON, K. R. Determination of moisture in
single-cell protein utilizing photoacoustic spectroscopy in the near-infrared region. Analyst,
105, 1076-1081, 1980.
DITTMAR, W.; LOHAUS, A. New antimycotic compound with a broad antimicrobial
spectrum. Drug Research, 23, 670-674, 1973.
GODDU, R. F.; DELKER, D. A. Spectra struture correlations for the near-infrared region.
Analytical Chemistry, 32, 140-141, 1960.
GOODMAN, L. S.; GILMAN, A. G. As bases farmacológicas da terapêutica. 9 ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.
GUIRRO, E.; GUIRRO, R. Fisioterapia Dermatofuncional. 3 ed. São Paulo: Manole, 2004,
72-75.
GUPTA, A. K. Ciclopirox: an overview. International Journal of Dermatology, 40, 305-
310, 2001.
HAAS, U.; FRANZ, J.; NIMMERFALL, F. Photoacoustic in vitro investigation of human
skin. Springer Series in Optical Sciences, 58, 552-553, 1988.
65
HELANDER, P.; LUDSTROM, I.; MCQUEEN, D. Photoacoustic study of layered samples.
Journal of Applied Physics, 52, 1146, 1981.
KIRKBRIGHT, G. F.; MENON, K. R. The determination of combined vinil-acetate in
polyvinyl-chloride polyvinyl acetate co-polymer by near-infrared photoacoustic spectrometry
and diffuse reflectance spectrometry. Analytica Chimica Acta, 136, 373-377, 1982.
LOBATO, C. A.; BARJA, P. R. Efeito fotoacústico da cinética de penetração de hidratantes
em diferentes formulações. In: XI Congresso Latino-Americano de Iniciação Científica e
VII Encontro de Pós-Graduação – O Paradigma do Desenvolvimento Sustentável, São
José dos Campos. Anais de Trabalhos Completos. São José dos Campos : UNIVAP, 497-500,
2007.
MANSANARES, A. M.; BENTO, A. C.; VARGAS, H.; LEITE, N. F.; MIRANDA, L. C. M.
Photoacoustic Measurements of the Thermal Properties of Two-Layer System. Physical
Review, 42, 4477-4486, (1990).
MOSER, K.; KRIWET, K.; NAIK, A.; KALIA, Y. N.; GUY, R. H. Passive skin penetration
enhancement and its quantification in vitro. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, 52, 103-112, 2001.
MOTA, J. P.; BARJA, P. R. Classificação de Fototipos de Pele: análise fotoacústica versus
análise clínica. VI Encontro Latino Americano de Pós-Graduação, 2006, São José dos
Campos. Revista Univap, 13, 2561-2564, 2006.
NARAYANAN, K.; CHANDANI, S.; RAMAKRISHNA, T.; RAO, M. C. Depth profiling of
mammalian cells by photoacoustic spectroscpy: Localization of ligants, Biophysical Journal,
72, 2365-2368, 1997.
NATALE, M.; LEWIS, L. N. Application of PAS for the investigation of overtones and
combinations in the near IR. Applied Spectroscopy, 36(4), 410-413, 1982.
NIEWERTH, M.; KUNZE, D.; SEIBOLD, M.; SCHALLER, M.; KORTING, H. C.; HUBE,
B. Ciclopirox Olamine treatment affects the expression pattern of Cândida albicans genes
66
encoding virulence factors, iron metabolism proteins and resistance factors. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 47, 1805-1817, 2003.
PARKER, J. G. Optical absorption in glass: investigation using an acoustic technique.
Applied Optics, 12, 2974-7, 1973.
PEDROCHI, F. Estudo de sistemas biológicos “in vitro” e “in vivo” utilizando a
Espectroscopia Fotoacústica. Dissertação de Mestrado – Universidade Estadual de Maringá-
PR, 2004.
PESSOA JR., O. Aplicações de medidas de fase do efeito fotoacústico. Dissertação de
Mestrado – Instituto de Física Gleb Wataghim, Unicamp, Campinas, 1985.
PESSOA JR., O.; CÉSAR, C. L.; PATEL, N. A.; VARGAS, H. Two beam photoacoustic
phase measurements of thermal diffusivity of solids. Journal of Applied Physics, 59(4),
1316-1318, 1986.
PFUND, A. H. Atmospheric Contamination. Science, 90, 326, 1939.
PIATTI, I. L. Nanotecnologia na estética: a ciência que conduz a beleza. Disponível em
http://www.revistapersonalite.com.br/nanotecnologia_49.php. Acesso em 10 nov. 2008.
QUEIROZ, T. F. Infecção por fungos filamentosos invasores. Revista Prática Hospitalar,
Ano VI, 36, 13-15, 2004.
ROENTGEN, W. C. On tones produced by the intermittent irradiation of a gas. Philosophical
Magazine, 11(5), 308, 1881.
ROSENCWAIG, A.; GERSHO, A. Theory of photoacoustics effect with solids. Journal of
Applied Physics, 47(1), 64-69, 1976.
ROSENCWAIG, A. Photoacoustic and Photoacoustic Spectroscopy. New York: John
Wiley & Sons, 1980.
67
SAMPAIO, S. A. P.; RIVITTI, E. A. Dermatologia. 3.ed. São Paulo: Artes Médicas, 2008.
SILVA, P. Farmacologia. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
TYNDALL, J. F. R. S. Action of an intermittent beam of radiant heat upon gaseous matter.
Proceeding of the Royal Society of London, 31, 307-317, 1881.
VIENGEROV, M. L. New method of gas analysis based on Tyndall-Roentgen optoacoustic
effect. Dokl. Akad. Nauk, SSSR, 19, 687, 1938.
VINHA, C. A.; HAAS, U. Qualitative and semiquantitative analysis of annatto and its content
in food additives by photoacoustic spectrometry. Analyst, 120, 351, 1995.
VINHA, C. A.; HENNIES, C. E.; SILVA, E. C.; VARGAS, H.; REIS, F. A. M.; CORTEZ, J.
G. An investigation of adulterants in ground coffee using photoacoustic spectroscopy in the
near-infrared region. Revista de Física Aplicada e Instrumentação, 4 (3), 267, 1989.
68
ANEXO A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu, ___________________________________________________________, declaro
ter sido informado(a) do projeto de pesquisa intitulado “Análise de alterações no espectro
fotoacústico da pele humana causadas pela droga ciclopirox olamina” , inclusive de sua
justificativa, objetivos, metodologia e procedimentos de coleta de dados, sendo a pesquisa
realizada com o objetivo de avaliar a evolução temporal da concentração do fármaco
ciclopirox olamina na pele humana após sua primeira aplicação e avaliar os efeitos sobre a
desidratação da pele humana devido à ação do fármaco; estando assim plenamente
esclarecido(a) das implicações de minha participação na pesquisa. Minha assinatura neste
documento é de livre e espontânea vontade, estando ciente que os resultados da pesquisa
poderão ser divulgados e utilizados em estudos e publicações futuras. Ficam-me assegurados
os seguintes direitos: liberdade para interromper a pesquisa em qualquer fase, no momento em
que julgar necessário; sigilo da minha identidade e o reconhecimento dos resultados obtidos
quando por mim solicitado.
Campo Grande, ___ de _____________ de 2008.
____________________________________ Assinatura
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