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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
ESTUDO DE HIDROXIMETILNITROFURAL (NFOH) NA FASE
CRÔNICA DA DOENÇA DE CHAGAS EM MODELO ANIMAL
CAUÊ BENITO SCARIM
ARARAQUARA - SP
2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
ESTUDO DE HIDROXIMETILNITROFURAL (NFOH) NA FASE
CRÔNICA DA DOENÇA DE CHAGAS EM MODELO ANIMAL
CAUÊ BENITO SCARIM
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de
Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e
Medicamentos, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, UNESP, como parte dos
requisitos para obtenção do titulo de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Profa. Dra. Chung Man Chin
ARARAQUARA - SP
2016
Ficha Catalográfica
Cauê Benito Scarim
Cauê Benito Scarim
ESTUDO DE HIDROXIMETILNITROFURAL (NFOH) NA FASE
CRÔNICA DA DOENÇA DE CHAGAS EM MODELO ANIMAL
Essa dissertação foi julgada e aprovada para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas no Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP.
( X ) APROVADO ( ) REPROVADO
Profa. Dra. Chung Man Chin
(Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento de Fármacos e Medicamento,
UNESP, Araraquara/SP)
(Presidente/Orientadora)
Prof. Dr. Cleverton Roberto de Andrade
(Faculdade de Odontologia, Departamento de Fisiologia e Patologia, UNESP,
Araraquara/SP)
Prof. Dr. João Aristeu da Rosa
(Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento de Biociência e Biotecnologias
Aplicadas à Farmácia, UNESP, Araraquara/SP)
Araraquara, 15 de fevereiro de 2016.
Dedicatória
Cauê Benito Scarim
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito.
não sou o que deveria ser,
mas graças a Deus não sou o que era antes.”
(Martin Luther King)
Este trabalho é dedicado a meus avós Divaldo e Antônia, Thomaz e Maria Rosa,
aos meus pais Antônio Roberto e Débora Renata,
que um dia sonharam e hoje compartilham comigo este importante momento.
Obrigado pela oportunidade, pelo apoio, incentivo,
suporte, confiança e amor incondicional.
Agradecimentos
Cauê Benito Scarim
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Antônio Roberto e Débora Renata, pela educação que me deram, por
sempre me apoiarem e me oferecer às condições para que eu pudesse estudar e chegar
cada vez mais longe, devo a eles tudo que conquistei em minha vida.
Aos meus irmãos Caio e Glauco, por representarem uma fonte inspiratória em minha vida.
A minha querida noiva Paula, pelo companheirismo, eterno amor, apoio, cumplicidade,
carinho e principalmente sua infinita paciência durante a realização deste trabalho.
A minha orientadora, profª Dra. Chung Man Chin, pelos ensinamentos, orientação, apoio e
pela confiança em meu trabalho.
Ao prof. Dr. João Aristeu da Rosa e a profª. Dra. Márcia Graminha e a todos do Laboratório
de Parasitologia por permitir a utilização de seu laboratório para a realização de ensaios
biológicos.
A profa. Dra. Rosangela Peccinini e a todos do Laboratório de Toxicologia por permitir a
utilização de seu laboratório para a realização de ensaios bioquímicos.
Ao prof. Dr. Cleverton Roberto de Andrade, por toda a ajuda, colaboração e paciência para a
realização dos ensaios histopatológicos deste projeto.
Aos companheiros do laboratório, alunos de iniciação cientifica e pós-graduação, Paulo,
Rafael, Daniela, Thais, Guilherme, Diego, Karina, Luiz, Juliana, Aylime, Marcella, João,
Maria, Aline, Zé Ricardo, Priscila e outros que passaram por aqui, pela ajuda oferecida e
também pelos momentos de amizade.
Ao técnico Matheus Scontri e Marileide pela ajuda e suporte no laboratório e pela amizade.
Aos Professores Dr. Cleverton Roberto de Andrade e a Dra. Elizabeth Igne Ferreira, por
terem aceitado fazer parte da minha banca de qualificação e aos Professores Dr. João
Aristeu da Rosa e Dr. Cleverton Roberto de Andrade, que foram parte da minha banca de
defesa, por todo o ensinamento e apoio oferecidos.
A CAPES e CNPQ, pelo apoio financeiro, através do oferecimento de bolsa de estudos.
“Não tenhamos pressa, mas não percamos tempo”
(José Saramago)
Epígrafe
Cauê Benito Scarim
Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades,
lembrai-vos de que as grandes proezas da história
foram conquistas daquilo que parecia impossível.”
(Charles Chaplin)
“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas,
mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito,
que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta,
onde não conhecem nem vitória, nem derrota.”
(Theodore Roosevelt)
Resumo
Cauê Benito Scarim
Resumo
A tripanosomíase americana ou doença de Chagas é uma zoonose endêmica em 21
países das Américas do Sul e Central, apontada como uma grave doença parasitária
resultante da infecção pelo parasito hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi
que utilizam insetos triatomíneos como vetores. Existem dois fármacos para o
tratamento dessa enfermidade, o nifurtimox (NFX) e o benznidazol (BNZ), ativos
apenas na fase aguda da doença, sendo que no Brasil apenas o BNZ é
comercializado. Em busca de novas alternativas para o tratamento, destaca-se o
hidroximetilnitrolfural (NFOH), ativo contra as formas tripomastigotas e amastigotas
em ensaio in vitro e in vivo. O objetivo deste trabalho foi realizar ensaios in vivo em
camundongos Balb/c, na fase crônica da doença de Chagas. Neste sentido foi
padronizado o ensaio em fase crônica, utilizando a cepa Y de T.cruzi, com inóculos
de 102 formas tripomastigotas. Os animais foram tratados durante 60 dias com
NFOH e BNZ seguido de imunossupressão induzida por dexametasona durante 14
dias. Ao final do protocolo os animais foram eutanasiados, pesados, realizado as
análises bioquímicas (TGO, TGP, CK–MB, e GGT) e histopatológica. Os resultados
demonstraram que nos animais tratados com NFOH e BZN não foi observada a
reativação da parasitemia após a imunossupressão, enquanto no controle positivo
houve reativação em 55,5% dos animais. Os ensaios bioquímicos não
demonstraram alteração nos valores em todos os grupos. Os pesos relativos bem
como a análise macroscópica do coração, vesícula biliar, baço e rins do grupo
NFOH foram similares ao grupo controle negativo enquanto o grupo BZN foi
semelhante ao grupo controle positivo. Na analise histopatológica, o grupo NFOH
apresentou apenas a presença de um amastigota em um coração dentre oito
animais (1/8) enquanto o grupo BZN foi observado presença de um à dois ninhos em
quatro corações (4/8) e no fígado (1/8) comparados com o controle positivo, em que
observou-se a presença e inúmeros ninhos amastigotas no coração (5/9) e também
no fígado (2/9). Foi observada, também, a presença de ninhos de amastigotas em
torno do plexo intestinal do grupo controle positivo (1/9), mas ausente no grupo
NFOH, sugerindo que o NFOH é um potencial candidato a fármaco para utilização
em fase crônica da doença de Chagas.
Abstrat
Cauê Benito Scarim
Abstrat
The American trypanosomiasis or Chagas disease is an endemic zoonosis in 21
countries of South and Central America, identified as a serious parasitic disease
resulting from infection by the hemoflagellate parasite called Trypanosoma cruzi,
which use triatomine insects as vectors. There are two drugs for treatment of Chagas
disease, nifurtimox (NFX) and benznidazole (BNZ), that are active only in the acute
phase of the disease,, and in Brazil only the BNZ is marketed. In search of new
alternatives for treatment, there is the hidroximetilnitrolfural (NFOH), which was
active against trypomastigotes and amastigotes form during in vitro and in vivo
assay. The aim of this work was to evaluate NFOH in an in vivo chronic phase assay
of Chagas disease, using BALB / c. It has been standardized a chronic phase assay,
using Y strains of T. cruzi with inocula of 102 trypomastigotes. The animals were
treated for 60 days with NFOH and BNZ followed by immunosuppression induced by
dexamethasone for 14 days. At the end of the protocol, the animals were euthanized,
weighed, performed the biochemical (ALT, AST, CK-MB, and GGT) and
histopathological analysis. The results showed that in animals treated with NFOH
and BZN were not observed reactivation of the parasitemia after
immunosuppression, while in positive control was observed reactivation in 55.5% of
animals. The biochemical assays demonstrated no alteration in the values in all
groups. The relative weights as well as the macroscopic examination of the heart,
gallbladder, spleen, and kidneys of NFOH group were similar to negative control
group while BZN group was similar to the positive control group. In the
histopathological analysis, the NFOH group showed only the presence of
amastigotes in one heart of eight animals (1/8), while in BZN group was observed the
presence of one to two nests in four hearts (4/8) and in the liver (1 / 8) compared to
positive control, which could be observed the presence of several amastigotes nests
in the heart (5/9) and also in liver (2/9). It was also observed the presence of
amastigotes nests around the intestinal plexus in positive control group (1/9), but not
in NFOH group, suggesting that NFOH is a potential drug candidate for treatment in
chronic phase of Chagas disease.
Lista de Figuras
Cauê Benito Scarim
Lista de Figuras
Figura 1 - Jornal da Tarde, 7 de maio de 1979. Berenice, uma criança em 1909, foi o
primeiro caso descrito da doença de Chagas. Foi ao óbito por insuficiência cardíaca,
aos 82 anos, em junho de 1981. ............................................................................... 17
Figura 2 - Distribuição global de casos de infecção por T. cruzi ............................... 18
Figura 3 - Rota migratória da América Latina e estimativa de infectados pelo T. cruzi
em áreas não endêmicas .......................................................................................... 19
Figura 4 - Triatoma infestans .................................................................................... 20
Figura 5 - Formas de T.cruzi .................................................................................... 21
Figura 6 - Ciclo de vida do T. cruzi ........................................................................... 22
Figura 7 – a. Sinal de Romaña (edema de pálpebras). b. Chagoma (edema no local
da infecção) ............................................................................................................... 23
Figura 8 - Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram
por: (A) morte súbita (B) megacólon ou mega-esôfago (C) insuficiência cardíaca
congestiva ................................................................................................................. 24
Figura 9 - Análise de imagem por técnica de ressonância magnética (MRI) do baço
de ratos. .................................................................................................................... 25
Figura 10 - Representação esquemática da organização do sistema nervoso
entérico (SNE) em um tecido saudável. .................................................................... 26
Figura 11 - Imagem por ressonância magnética (MRI) com sobreposição
tridimensional do colón, rim e bexiga de ratos. ......................................................... 27
Figura 12 - História natural da doença de Chagas no homem. ................................ 28
Figura 13 - Alvos terapêuticos da via da biossíntese de ergosterol .......................... 29
Figura 14 - Estrutura química da lovastatina ............................................................ 30
Figura 15 - Estruturas química do risedronato .......................................................... 31
Figura 16 - Estrutura química dos compostos E5700 e ER-119884 ......................... 31
Figura 17 - Estrutura química do posaconazol ......................................................... 32
Figura 18 - Redução de tripanotiona dissulfeto para ditiol tripanotiona pela enzima
tripanotiona redutase. ................................................................................................ 33
Figura 19 - Estruturas químicas do nifurtimox e benznidazol ................................... 34
Figura 20 - Estrutura química dos compostos nitro-heterociclicos utilizados como
antiprotozoários e antimicrobianos ............................................................................ 36
Figura 21 - Estrutura química do nitrofural (NF) ....................................................... 37
Lista de Figuras
Cauê Benito Scarim
Figura 22 - Estrutura química do NFOH ................................................................... 37
Figura 23 - Mecanismo de reação do NF em NFOH (base de Mannich) .................. 38
Figura 24 - Efeito de 5 μM NF, 10 μM NF, 5 μM NFOH e 10 μM BZN) em
porcentagem de tripomastiggotas pós-infecção das células com formas
tripomastigotas de T. cruzi. Controle positivo não expresso: 100%. ......................... 39
Figura 25 - Efeito de 5 μM NF, 10 μM NF, 5 μM NFOH e 10 μM BZN em
porcentagem de amastigotas pós-infecção das células com formas amastigotas de
T. cruzi. Controle positivo não expresso: 100%. ....................................................... 39
Figura 26 - Docking do NF (A) e NFOH (B), sob a enzima cruzaína presente no
T.cruzi ....................................................................................................................... 41
Figura 27 - Mapas dos potenciais eletrostáticos (MEP) do NF e NFOH. .................. 41
Figura 28 - Atividade mutagênica (S. typhimurium cepa TA98) do
hidroximetilnitrofural em comparação ao nitrofural em ensaios com e sem ativação
metabólica (S9) ......................................................................................................... 42
Figura 29 - Atividade mutagênica (S. typhimurium TA102) do hidroximetilnitrofural
em comparação ao nitrofural em ensaios com e sem ativação metabólica (S9) ....... 43
Figura 30 - Freqüência média de reticulócitos micronucleados (MNRET) e desvio
padrão para 1000 células obtidas de camundongos tratados com 50, 100, 250 e 500
mg/kg de BNZ, NF e NFOH. ...................................................................................... 44
Figura 31 - Principais trabalhos realizados com o candidato a fármaco
Hidroximetinitrofural NFOH em relação ao Nitrofural (NF) e o Benznidazol (BNZ) ... 48
Figura 32 - Esquema de Síntese do NFOH. ............................................................ 51
Figura 33 – Protocolo Experimental (cepa Y) ........................................................... 53
Figura 34 - Representação dos cortes histopatológicos seriados (3mm). ................ 59
Figura 35 - Curva de calibração para a enzima TGO (U/L). ..................................... 63
Figura 36 - Curva de calibração para a enzima TGP (U/L). ..................................... 64
Figura 37 - Níveis parasitêmicos individuais (n = 12) observadas em camundongos
BALB/c inoculados com [102 formas] a cepa Y do T. cruzi – Grupo controle positivo
(Fase aguda). ............................................................................................................ 68
Figura 38 - Níveis parasitêmicos individuais do grupo NFOH observadas em
camundongos BALB/c inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi (n=12)
(Fase aguda). ............................................................................................................ 69
Figura 39 - Níveis parasitêmicos individuais do Grupo BZN. em camundongos
BALB/c inoculados com [102 formas] da cepa Y do T. cruzi (n=12) (Fase aguda). .. 70
Lista de Figuras
Cauê Benito Scarim
Figura 40 - Média por grupo sob o acompanhamento parasitêmico durante fase
aguda, fase crônica (tratamento 60 dias) e imunossupressão (Balb/c - cepa Y de
T.cruzi).. .................................................................................................................... 72
Figura 41 - Média e desvio padrão do peso relativo corporal dos camundongos
BALB/c infectados com 102 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do T cruzi
e tratados com NFOH e BZN. ................................................................................... 75
Figura 42 - Média e desvio padrão do peso relativo do baço (cepa Y de T. cruzi). .. 77
Figura 43 - Análise macroscópica dos baços analisados (cepa Y de T. cruzi). ........ 78
Figura 44 - Análise histopatológica do baço dos animais submetidos ao protocolo
com a cepa Y de T. cruzi, coloração hematoxilina/eosina. ........................................ 79
Figura 45 – Imagens da análise histopatológica do baço dos grupos controle
positivo, NFOH, BZN e controle negativo (cepa Y de T. cruzi).................................. 80
Figura 46 - Média e desvio padrão do peso relativo do coração (cepa Y de T. cruzi).
.................................................................................................................................. 81
Figura 47 - Análise histopatológica do coração dos animais submetidos ao protocolo
com a cepa Y de T. cruzi, coloração hematoxilina/eosina. ........................................ 83
Figura 48 – Imagens da análise histopatológica do coração dos grupos controle
positivo, NFOH, BZN. e controle negativo (cepa Y de T. cruzi)................................. 84
Figura 49 - Acompanhamento macroscópico, que sugere alteração no trato
gastrointestinal seguido de tratamento da área inflamada após tratamento com
NFOH (imagens do mesmo animal infectado com cepa Y de T. cruzi). .................... 85
Figura 50 - Análise histopatológica do colón dos animais submetidos ao protocolo
com a cepa Y de T. cruzi, pela técnica de cortes em series e 3 mm para melhor
análise histológica do órgão. Coloração hematoxilina/eosina. 86
Figura 51 – Imagens da análise histopatológica do colón dos grupos controle
positivo, NFOH, BZN e controle negativo (cepa Y de T. cruzi).................................. 88
Figura 52 - Média e desvio padrão do peso relativo do fígado (cepa Y de T. cruzi). 89
Figura 53 - Análise Histopatológica do fígado dos animais submetidos ao protocolo
com a cepa Y de T. cruzi, coloração hematoxilina/eosina. ........................................ 90
Figura 54 – Imagens da análise histopatológica do fígado dos grupos controle
positivo, NFOH, BZN e controle negativo (cepa Y de T. cruzi).................................. 91
Figura 55 - Média e desvio padrão do peso relativo dos rins (cepa Y de T. cruzi). .. 92
Figura 56 - Média e desvio padrão do peso relativo do cérebro (cepa Y de T. cruzi).
.................................................................................................................................. 93
Lista de Figuras
Cauê Benito Scarim
Figura 57 - gráfico representativo da média do volume da vesícula biliar nos
respectivos grupos (cepa Y de T. cruzi). ................................................................... 95
Figura 58 - Média e desvio padrão do marcador hepático TGO (cepa Y de T. cruzi).
.................................................................................................................................. 98
Figura 59 - Média e desvio padrão do marcador hepático TGP (cepa Y de T. cruzi)
.................................................................................................................................. 99
Figura 60 - Média e desvio padrão do marcador hepático, a enzima GGT (cepa Y de
T. cruzi) ................................................................................................................... 100
Figura 61 - Média e desvio padrão do marcador cardíaco, a enzima CK-MB (cepa Y
de T. cruzi). ............................................................................................................. 101
Lista de Tabelas
Cauê Benito Scarim
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Valores de absorbância, em triplicata, para confecção de curva de
calibração para TGO (U/L). ....................................................................................... 63
Tabela 2 - Valores de absorbância, em triplicata, para confecção de curva de
calibração para TGP (U/L)......................................................................................... 64
Tabela 3 - Resultados do acompanhamento parasitêmico e taxa de letalidade
durante a fases aguda e crônica da doença (cepa Y de T. cruzi). ............................ 67
Tabela 4 - Número de parasitos do Grupo Controle positivo em camundongos
BALB/c inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi. .................................... 69
Tabela 5 - - Número de parasitos do Grupo NFOH em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi. ............................................... 70
Tabela 6 - Número de parasitos do Grupo BZN em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi. ................................................ 71
Tabela 7 - Avaliação da média do peso corporal (g) ± desvio padrão, ração (g) dos
grupos avaliados durante a fase aguda, sem tratamento (1° - 7° semana), ao longo
da fase crônica, com tratamento (8° - 16° semana), e imunossupressão (17° - 19°
semana). ................................................................................................................... 74
Tabela 8 - Análise macroscópica individual da vesícula biliar por grupo analisado. . 94
Tabela 9 - Comparação entre os valores de TGO dos grupos Controle, NFOH e NF.
Valores absolutos/animal, médias e desvio padrão dos grupos. ............................... 97
Tabela 10 - Comparação entre os valores de TGP dos grupos Controle, NFOH e
NF. Valores absolutos/animal, médias e desvio padrão dos grupos. ........................ 97
Lista de Anexos
Cauê Benito Scarim
Lista de Anexos
Anexo 1 - Análise macroscópica e mensuração (comprimento x largura x altura em
centímetros) de órgãos do grupo controle positivo - cepa Y de T. cruzi. ................. 123
Anexo 2 - Análise macroscópica e mensuração (comprimento x largura x altura em
centímetros) de órgãos do grupo NFOH - cepa Y de T. cruzi.. ............................... 124
Anexo 3 - Análise macroscópica e mensuração (comprimento x largura x altura em
centímetros) de órgãos do grupo BZN - cepa Y de T. cruzi.. .................................. 125
Anexo 4 - Análise macroscópica e mensuração (comprimento x largura x altura em
centímetros) de órgãos do grupo controle NEGATIVO - cepa Y de T. cruzi............126
Anexo 5 - Codificação dos achados histopatológicos para análise estatística (baço,
coração, colón e fígado)...........................................................................................127
Anexo 6 - Parecer do comitê de ética (Protocolo CEUA/FCF/CAr nº 39/2014).....128
Sumário
Cauê Benito Scarim
Sumário
1. Introdução ......................................................................................................... 16
1.1. Doença de Chagas....................................................................................... 17
1.2. Vias de Transmissão .................................................................................... 19
1.3. Ciclo Biológico do parasito ........................................................................... 21
1.4. Patogênese e manifestações clínicas .......................................................... 23
1.5. Imunossupressão na doença de Chagas crônico ........................................ 27
1.6. Alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novos fármacos contra doença
de Chagas .............................................................................................................. 29
1.7. Realidade terapêutica contra Chagas e novas perspectivas .......................... 33
2. Objetivo Geral ................................................................................................... 49
2.1. Objetivos específicos ..................................................................................... 49
3. Material e Métodos............................................................................................ 50
3.1. Reagentes ....................................................................................................... 50
3.2. Equipamentos ................................................................................................. 50
3.3. Metodologia sintética para obtenção de NFOH............................................... 51
3.3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD) ............................................... 51
3.3.2. Determinação da Faixa de Fusão ............................................................. 52
3.4. Ensaios biológicos .......................................................................................... 52
3.4.1. Animais utilizados ..................................................................................... 52
3.4.2. Diagramas dos Protocolos Experimentais ................................................ 52
3.4.3. Protocolo Experimental ............................................................................. 54
3.4.4. Sobrevida dos animais. ............................................................................. 57
3.4.5. Necropsia dos animais utilizados .............................................................. 57
3.5. Peso relativo (FRANCISCO, 2007) ................................................................. 58
3.5.1. Peso relativo corpóreo .............................................................................. 58
Sumário
Cauê Benito Scarim
3.5.2. Peso relativo dos Órgãos .......................................................................... 58
3.6. Estudo histopatológico .................................................................................... 58
3.6.1. Registro das amostras e cortes histológicos seriados .............................. 59
3.6.2. Processo de desidratação e parafinização ............................................... 59
3.6.3. Cortes histológicos - micrótomo ................................................................ 59
3.6.4. Colorações histopatológicas ..................................................................... 60
3.6.5. Análises histopatológicas .......................................................................... 60
3.7. Estudos dos Parâmetros Bioquímicos ............................................................ 62
3.7.1. Curva de Calibração - TGO e TGP ........................................................... 62
3.8. Análises Macroscópica ................................................................................... 65
3.9. Análises Estatísticas ....................................................................................... 65
4. Resultados e Discussão ................................................................................... 66
5. Conclusões ..................................................................................................... 103
6. Referências Bibliográficas ............................................................................. 105
7. Anexos ............................................................................................................. 123
16
Introdução
Cauê Benito Scarim
1. Introdução
Doenças negligenciadas (DN) são denominadas como uma classe de
doenças infecciosas que atinge preferencialmente países tropicais, principalmente
países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Apesar de serem endêmicas em
aproximadamente 149 países, afetando mais de 1,4 bilhões de pessoas, além de
custar bilhões de dólares por ano, não possuem incentivo em pesquisa e
desenvolvimento de novos fármacos pela indústria farmacêutica. Recentemente,
diferentes parcerias público-privadas, sem fins lucrativos, foram criadas e voltadas
para pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das
DN. Por consequência também foi observado um aumento da aplicação de capitais
públicos no combate dessas doenças (FEASEY et al., 2010; COHEN, et al., 2014;
WHO, 2015).
Segundo Pedrique e colaboradores (2013), de 850 novos produtos
terapêuticos (candidatos a fármacos, produtos com novas indicações, novas
formulações e vacinas), que foram registradas pela “European Medicines Agency
(EMA) e U.S. Food and Drug Administration (FDA)”, entre 2000 e 2011, apenas 39
(4 %) dos fármacos registrados foram destinados para doenças negligenciadas, 29
fármacos e oito vacinas. Em condições de aprovação, de 336 novas entidades
químicas aprovadas, somente 4 (1%) foram aprovados para doenças como malária
(3) e doenças diarreicas (1), e nenhum fármaco para doença tropicais
negligenciadas. Neste trabalho também se observou que de 148.445 ensaios
clínicos realizados entre 2000 e 2011, apenas 2.016 foram para doenças
negligenciadas, novamente 1%.
Trabalho recentemente publicado por Coah et al., (2014), complementa o
trabalho anterior, pois foram avaliados os compostos aprovados de 2009 a 2013,
mostrando 20 novos medicamentos, sendo 15 destes para doenças como HIV/AIDS,
tuberculose e malária as quais não são consideradas doenças tropicais
negligenciadas pela OMS, sendo assim, apenas cinco novos medicamentos foram
lançados para doenças negligenciadas nesse período.
Os trabalhos são baseados em um estudo pioneiro publicado em 2002 por
membros do “Drugs for Neglected Diseases” (DNDi), no qual observou-se que de
17
Introdução
Cauê Benito Scarim
1.393 novos fármacos aprovados, entre 1975 e 1999, apenas 21 eram voltados às
doenças negligenciadas.
Um documento do MSF (Médicos Sem Fronteiras) e DNDi indicam que o
número de novos fármacos desenvolvidos para as doenças negligenciadas continua
o mesmo há mais de duas décadas (WILLYARD, 2013; DNDi,2002).
1.1. Doença de Chagas
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é
uma das principais patologias do continente americano, foi descrita pelo médico e
pesquisador brasileiro Carlos Justiniano Ribeiro Chagas, em 1909, que efetuou as
primeiras investigações sobre tal parasitose, durante expedição à pequena cidade
de Lassance – MG. O cientista descreveu o agente etiológico (Trypanosoma cruzi) e
a toda cadeia epidemiológica dessa zoonose, ou seja, o vetor, reservatórios e
afecção humana (Malafaia & Rodrigues, 2010; Chagas, 1909). O primeiro caso
descrito por Carlos Chagas foi o de uma criança, em 14 de fevereiro de 1909. Ao
observar seu sangue sob lâmina/lamínula deparou-se com formas tripomastigotas
de T. cruzi (figura 01).
Figura 1 - Jornal da Tarde, 7 de maio de 1979. Berenice, uma criança em 1909, foi o primeiro caso descrito da doença de Chagas. Foi ao óbito por insuficiência cardíaca,
aos 82 anos, em junho de 1981.
Fonte: Extraído de http://www.submarino.net/cchagas/artigos/art1.htm (acesso em 04/10/2015).
Toda sua competência e dedicação aos estudos colaboraram para seu
reconhecimento tanto em nível nacional quanto internacional. Seu estudo mais
conceituado levou seu nome e ficou conhecido como doença de Chagas. Isso em
um período que o Brasil, assim como outros países, convivia com graves problemas
de saúde relacionados a doenças transmissíveis, transmitindo este impacto a níveis
18
Introdução
Cauê Benito Scarim
de economia social e política do País. Assim como também não havia recursos
tecnológicos para caracterização da doença (GOLDBAUM & BARRETO, 2008).
De acordo com dados recém-publicados existem em torno oito milhões de
pessoas infectadas pela doença de Chagas no mundo (figura 2), principalmente
entre o México e a Argentina, onde a parasitose é endêmica e 75 a 90 milhões de
pessoas estejam expostas à infecção. No Brasil, os casos crônicos da doença de
Chagas são predominantes, com um número aproximado de três milhões de
indivíduos contaminados pelo parasito (WHO, 2015; BRASIL, 2015; COURA & DIAS,
2010).
Figura 2 - Distribuição global de casos de infecção por T. cruzi
Fonte: Extraído e adaptado de WHO, 2013.
Contudo, devido ao avanço da globalização, houve um intenso movimento
migratório de pessoas provenientes de áreas endêmicas para as demais regiões do
mundo, onde a doença não é endêmica, como países da America do Norte, Europa,
Ásia e até da Oceania (figura 3) (COURA, VIÑAS, 2010).
19
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 3 - Rota migratória da América Latina e estimativa de infectados pelo T. cruzi em áreas não endêmicas
Fonte: Extraído de COURA; VIÑAS, 2010.
A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é uma zoonose
endêmica, que não apresenta variações cíclicas ou sazonais de importância
epidemiológica, apontada como uma grave doença parasitária resultante da infecção
pelo protozoário parasito hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi. Essa
doença apresenta como vetores os triatomíneos (URBINA, 2002).
1.2. Vias de Transmissão
A principal via de transmissão é vetorial, por meio do contato direto de fezes
contaminadas do inseto, que é hematófago, com orifício da picada ou regiões de
mucosa (BARRETT, 2003). Diversas espécies são consideradas hospedeiros
invertebrados do parasito, de forma que as mais importantes são Triatoma dimidiata,
Rhodnius prolixus e Triatoma infestans (figura 4), sendo a última a mais encontrada
no sul da América do Sul. As outras duas são prevalente na região norte da América
do Sul e na América Central. Os triatomíneos pertencem à família Reduviidae e
subfamília Triatominae, (SHERLOCK, 1999; RASSI JR; RASSI, A.; MARIN-NETO,
2010; WHO, 2002).
20
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 4 - Triatoma infestans
Fonte: Extraído de http://web.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2004/Trypanosomiasis/vector.htm (acesso em
01/10/2015)
Existem outras formas de infecção por T.cruzi, além da forma vetorial, como
transmissão congênita, ingestão de alimentos contaminados, transfusão sanguínea,
transplante de órgãos e acidente laboratorial (RASSI JR; RASSI, A.; MARIN-NETO,
2010).
Sobre a transmissão congênita estudos apontam que cerca de 5% dos bebês
nascem infectados pelas mães portadoras da doença na fase crônica. Quanto maior
o número de formas tripomastigotas circulantes na mãe, maior pode ser o risco de
infecção (WENDEL, 2010; BERN, 2009; BRUTUS et al., 2010; HOWARD et al.,
2013). Assim como a transmissão congênita, a transmissão por transfusão
sanguínea também exige triagem para prevenir futuros casos da doença. (RASSI
JR; RASSI, A.; MARIN-NETO, 2010; WENDEL, 2010).
A infecção por meio de transplantes de órgãos sólidos e de medula óssea
ocorre quando o órgão em questão está infectado com formas amastigotas de
T.cruzi, uma vez que essas se transformam em tripomastigotas, ficando livres para
infectar outras células (VILLALBA et al., 1992; CDC, 2006; KIRCHHOFF, 2011).
A infecção oral acontece por meio do consumo de alimentos contendo fezes
ou o próprio inseto (moído) contaminado, como o açaí e a cana de açúcar. Foi
relatada infecção pela ingestão de carne crua e demonstrada experimental e
clinicamente, sendo de importância nos casos de morbidade e mortalidade nos
casos de infecção aguda da doença associada a elevadas concentrações de
parasito. Em 2005, houve um surto de contaminação oral na região Sul do Brasil,
atingindo atenção internacional, uma vez que afetou um grupo de turistas e
21
Introdução
Cauê Benito Scarim
apresentou alta morbidade e mortalidade com 45 casos suspeitos, sendo 31 casos
confirmados e cinco mortes. No entanto este tipo de propagação da doença é mais
frequente e evidente na região da Amazônia (RASSI JR; RASSI, A.; MARINNETO,
2010; BRASIL, 2015; PÉREZ-GUTIÉRREZ, 2006; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005).
1.3. Ciclo Biológico do parasito
O ciclo de vida de T. cruzi é complexo, com diversas etapas de multiplicação
no vetor e no hospedeiro vertebrado. No vetor, o parasito se encontra nas formas
epimastigota e tripomastigota metacíclica. Já no hospedeiro vertebrado, o parasito
encontra-se na sua forma infectante, a tripomastigota e sua forma intracelular,
amastigota (Figura 5). Durante a fase aguda, qualquer célula nucleada pode ser
infectada (RASSI JR; RASSI, A.; MARIN-NETO, 2010).
Figura 5 - Formas de T.cruzi
Fonte: http://web.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2004/Trypanosomiasis/morphology.htm (acesso em 02/10/2015)
O ciclo biológico tem início durante o repasto sanguíneo do hospedeiro
invertebrado sadio em hospedeiro vertebrado infectado. O vetor acaba por ingerir a
forma tripomastigota metaciclica do parasito. Ao chegar ao estômago do inseto as
formas tripomastigotas transformam-se em esferomastigotas e epimastigotas, as
quais migram para o intestino. Dessa maneira, as formas epimastigotas sofrem
divisão binária no local e, ao migrarem para o reto, transformam-se novamente na
forma infectante, tripomastigotas metacíclicos. Essas são capazes de infectar o
hospedeiro vertebrado saudável (ESCH & PETERSEN, 2013; MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2005).
22
Introdução
Cauê Benito Scarim
No hospedeiro vertebrado, o ciclo inicia-se quando as formas tripomastigostas
eliminadas pelo triatomíneo são inoculadas no hospedeiro vertebrado. Essa forma
do parasito tem a capacidade de penetrar em qualquer célula nucleada e
desenvolver-se. Após aderir-se à membrana da célula, o parasito é fagocitado e
começa a se transformar na forma amastigota e simultaneamente destrói a
membrana do fagócito. Já no citoplasma, a forma amastigota inicia divisão celular
binária e continua nesse processo por vários dias no interior da célula. Após,
aproximadamente, cinco dias, as formas amastigotas iniciam o processo de
transformação na forma tripomastigota. Neste estágio, o parasito estimula
movimentos com seu flagelo de maneira intensa, levando ao rompimento da célula,
liberando os parasitos no meio extracelular. Tanto as formas amastigotas quanto as
formas em transição e formas tripomastigotas têm a capacidade de infectar outras
células do ambiente ou atingir a corrente sanguínea e distribuir-se por todo o
organismo (SOUZA, 1999). A figura a seguir representa esquematicamente o ciclo
evolutivo da doença de Chagas, tanto no hospedeiro vertebrado quanto no
invertebrado (figura 6).
Figura 6 - Ciclo de vida do T. cruzi
Fonte: Extraído e modificado de CDC, 2009.
23
Introdução
Cauê Benito Scarim
1.4. Patogênese e manifestações clínicas
De um modo geral, a doença de Chagas pode ser dividida em duas fases
distintas – aguda, e crônica (indeterminada ou determinada). O quadro clínico da
fase aguda é determinado pelo número de parasitas presentes na corrente
sanguínea, que podem infectar uma vasta gama de tecidos, comprovada pela
demonstração através de métodos diretos de exame. Essa fase é relativamente
curta em humanos, aproximadamente de dois meses, podendo ser assintomática ou
sintomática, quando há presença de sintomas (febre prolongada, mal-estar,
hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, miocardite, eletrocardiograma alterado e
edema subcutâneo localizado ou generalizado) e está diretamente relacionada à
parasitemia no indivíduo infectado (DIAS e COURA, 1997; ANDRADE, 2000).
No caso da infecção por via vetorial, o paciente pode apresentar sinais
aparentes no local de entrada do parasito, infecção que quando ocorre na pele é
conhecida como chagoma (geralmente permanece por duas semanas ou mais), e
quando a infecção ocorre nas membranas oculares, denomina-se sinal de Romaña
(edema bipalpebral unilateral com adenite satélite pré-auricular) (figura 7). A fase
aguda pode acarretar em manifestações do comprometimento cardíaco, como uma
miocardite aguda difusa, a qual pode levar ao óbito. Em aproximadamente 90% dos
casos sintomáticos (fase aguda) se solucionam de maneira natural. (COURA, 2007;
DIAS et al., 2009; RASSI JR; RASSI, A.; MARIN-NETO, 2010; RASSI et al., 2012).
Figura 7 – a. Sinal de Romaña (edema de pálpebras). b. Chagoma (edema no local da infecção)
Fonte: Extraídos e adaptados de http://www.cpqrr.fiocruz.br/informacao_em_saude/CICT/Doenca_de_chagas.htm (acesso em
03/10/15) e KINHITA-YANAG et al., (2009), respectivamente.
a b
24
Introdução
Cauê Benito Scarim
Logo o quadro tende a evoluir para uma fase crônica indeterminada (período
de latência), caracterizada pela ausência ou baixa parasitemia, responsável por
aproximadamente 50%-70% dos doentes. Em um “terceiro” estágio da doença (20-
30%), fase crônica determinada, o indivíduo parasitado pode apresentar
sintomatologia que envolve cardiopatias, megacólon ou megaesôfago (figura 7)
(FUENTES et al., 2012; HABERLAND et al., 2013).
O acometimento cardíaco de tal patógeno pode ser explicado por duas
supostas hipóteses: a primeira seria devido a lesões nos tecidos cardíacos
decorrentes ao processo imunológico, devido a presença de parasitos intracelulares.
Já a segunda, em virtude do próprio parasitismo nas células cardíacas, que causam
danos teciduais (BERN et al., 2007; DIAS et al., 2009).
A cardiopatia chagásica crônica é definida como miocardiopatia inflamatória,
evolutiva, recoberta por redes de fibrina, que destrói progressivamente o miocárdio e
compromete o sistema de formação e de condução do estímulo cardíaco, cujos
principais sintomas são: arritmia, dilatação das paredes do órgão em questão,
ocasionando insuficiência cardíaca e tromboembolismo (ANDRADE & ANDRADE,
1998; PRATA, 2001; BERN et al., 2007). O coração infectado pode apresentar-se
com tamanho e peso (volume) normal ou gradualmente aumentado (DIAS &
MACEDO, 2005; JELICKS & TANOWISZ, 2011). O principal motivo de morte em
indivíduos chagásicos cardiopáticos é morte súbita, cerca 66%, seguido de
insuficiência cardíaca e tromboembolismo (RASSI JR; RASSI, S.; RASSI, A., 2001;
RASSI JR; RASSI, A.; MARINNETO, 2009). A figura 8 representa os corações de
pacientes chagásicos em diferentes estágios da doença.
Figura 8 - Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram por: (A) morte súbita (B) megacólon ou mega-esôfago (C) insuficiência cardíaca
congestiva
Fonte: http://www.uftm.edu.br/instpub/fmtm/patge/imagem/mac0220.jpg, (acesso em: 09/10/2015).
25
Introdução
Cauê Benito Scarim
As alterações hemodinâmicas decorrentes de insuficiência cardíaca
congestiva em pacientes chagásicos podem, por consequência, induzir a
esplenomegalia congestiva, caracterizada por hiperplasia das células e
desorganização dos folículos linfáticos do baço assim como a diminuição da
densidade dos mesmos, aumento da polpa vermelha e diminuição da polpa branca,
favorecendo uma provável associação do comprometimento cardíaco com o volume
e situação morfológica do baço (figura 9) (PEREIRA et al., 2002; JELICKS &
TANOWISZ, 2011).
Figura 9 - Análise de imagem por técnica de ressonância magnética (MRI) do baço de ratos.
. (A) não infectados e (B) infectados cronicamente com T.cruzi. (C) ilustração da diferença no volume do baço de ambos os grupos.
Fonte: Extraído de JELICKS & TANOWISZ, 2011).
O trato gastrointestinal (TGI) é composto pela cavidade oral, faringe, esôfago,
estômago, intestino delgado e grosso, reto e ânus,que são constituídos por mucosa,
submucosa, muscular e serosa, além de órgãos glandulares associados como
fígado, vesícula biliar, pâncreas e glândulas salivares. A função do TGI compõe de
digestão e absorção de moléculas biologicamente ativas (nutrientes), que envolve
episódios de motilidade, peristaltismo, secreção de substâncias (água e enzimas) e
26
Introdução
Cauê Benito Scarim
digestão química, funções estas controladas por órgãos glandulares associados,
produzindo hormônios regulatórios como o caso do pâncreas. Além do controle
hormonal, existe ainda o controle neural do TGI efetuado pelo o sistema nervoso
autônomo (SNA) - simpático ou parassimpático - além do sistema nervoso entérico
(SNE), sendo este disseminado ao longo do TGI (figura 10). O SNE e o SNA
dempenham suas funções de maneira dependente um do outro, uma vez que os
neurônios do SNE são atingidos por axônios de neurônios sensoriais extrínsecos
originados no sistema nervoso simpático (SNS) ou parassimpático (SNP), desta
maneira o SNE regula a secreção, motilidade, fluxo sanguíneo e controle
imunológico. (FURNESS et al., 2000; HANSEN et al., 2003).
Figura 10 - Representação esquemática da organização do sistema nervoso entérico (SNE) em um tecido saudável.
Fonte: Extraído e adaptado de PAIVA, 2011.
Relacionado aos TGI, destaca-se outra importante manifestação clinica da
doença de Chagas crônica, a forma digestiva, principalmente megacolon (figura 11)
e megaesôfago, (10 – 15% dos casos crônicos) em que se observar o aumento do
volume do órgão, alterações na motilidade, dores, regurgitação, hipertrofia da
musculatura lisa e atrofia da mucosa causada em virtude da destruição neural (SNE)
27
Introdução
Cauê Benito Scarim
dos plexos mucoso, submucoso e mientérico, alterações essas que podem ser
geradas por meio de processo imunológico, em razão da presença de parasitos
intracelulares ou correspondente ao próprio parasitismo celular que causam danos
nos tecidos (RASSI JR et al., 2010; JELICKS & TANOWISZ, 2011; PAIVA et al.,
2014).
Figura 11 - Imagem por ressonância magnética (MRI) com sobreposição tridimensional do colón, rim e bexiga de ratos.
(A) não infectados e (B) infectados cronicamente com T.cruzi. Fonte: Extraído de JELICKS & TANOWISZ, 2011.
A localização da dilatação relacionada com a doença de Chagas crônica
digestiva permanece desconhecida, embora já se saiba que a destruição dos
neurônios e diminuição das células intersticiais de Cajal, hiperplasia das células
musculares associadas à fibrose. Apesar de obter um papel fisiológico crucial, o
SNE pode não ser o único responsável pelos danos causados no megacolon ou
megaesôfago (JABARI et al., 2013).
1.5. Imunossupressão na doença de Chagas crônico
Nos dias atuais devido ao grande número pacientem portadores de doenças
imunossupressoras, como HIV/AIDS, e o aumento no uso de medicamentos que
28
Introdução
Cauê Benito Scarim
acarretam em um efeito imunossupressor, como corticoide, a infecção pelo parasito
tem sido considerada oportunista por alguns autores, ou até mesmo ocasionar
reativação da doença, como parasitemia, mesmo na ausência de sintomas
(ANDRADE et al., 1997; TANIWAKI et al., 2011; PINAZO et al., 2013).
Há relatos de uma gradual relação da doença de Chagas com manifestações
neoplásicas em pacientes infectados. Limitado são os conhecimento sobre tal
relação, e a respeito de como a resposta imune induzida pela parasitose altera o
desenvolvimento das neoplasias. Estudos recentes apontam três possibilidades: a
neoplásia como uma possível causa de imunossupressão seguida de reativação da
infecção surgimento das doenças neoplásicas por consequência do tratamento com
benzidazol, associado ou não com fármacos imunossupressoras; e por fim seria a
neoplasia como uma condição de maior incidência sobre os indivíduos infectados
(PINAZO et al., 2013) . O fluxograma (diagrama) a seguir representa a evolução
clinica da doença de Chagas, fatos até então compreendidos (figura 12).
Figura 12 - História natural da doença de Chagas no homem.
Infecção humana a T. cruzi (vetorial, através de transfusão, transplante de órgãos, congênita, oral ou acidental)
Não infectado
Infecção aguda Chagas(assintomática ou sintomática)
Cura ( 50% –80% dos casos)
Tratamento
antiparasitário
<5% -10% dos
Casossintomáticos
Morte de miocardite ou
meningoencefalite
Fase crônica -Indeterminante
Cura (20% –60% dos casos)
Tratamento
antiparasitário
Fase crônica -determinante
10 – 30 anos
Tratamento
antiparasitário
Cura (menor proporção dos casos)
Permanência da forma indeterminada
Imunossupressão
Reativação •Cardíaco•Digestivo
•Cardíodigestivo
Fonte: Extraído e adaptado de HABERLAND et al., (2013).
29
Introdução
Cauê Benito Scarim
1.6. Alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novos fármacos
contra doença de Chagas
Estão descritas a seguir as vias metabólicas e alvos terapêuticos explorados
no planejamento e elaboração de novos fármacos antichagásicos.
Biossíntese do Ergosterol:
T.cruzi é dependente de uma variedade esteróis específico, como o
ergosterol, essencial para a formação de membranas. Atuam na estabilização,
fluidez e permeabilidade e ainda modulam as atividades de receptores e canais
iônicos, ou seja, desempenham papel importante no desenvolvimento e proliferação
do parasito (LEPESHEVA et al., 2007). Os principais alvos dessa via metabólica
estão expressos a seguir (figura 13):
Figura 13 - Alvos terapêuticos da via da biossíntese de ergosterol
Fonte: Extraído e adaptado de SÁNCHEZ-SANCHO et al., 2010.
30
Introdução
Cauê Benito Scarim
Um modelo de fármaco que atua sob a enzima hidroxi-metilglutaril-CoA
redutase em T.cruzi é a lovastatina (figura 14). Em estudos in vitro e in vivo, Urbina
et al., (2003) demonstraram atividade da lovastatina na inibição da biossintese do
ergosterol, atuando na inibição da enzima CYP450. Observou-se inibição total da
lovastatina em doses diferentes, 50 μM e 70 μM com 144 h e 96 h de exposição, e
associado com cetoconazol em 144 h de exposição. Já quando avaliados quanto a
inibição das formas amastigotas, não se mostrou efetiva utilizando doses de até 1
μM pois, acima disso apresentou-se citotóxica. Na avaliação in vivo, a lovastatina
sozinha apresentou 50% de mortalidade, enquanto quando associada ao
cetoconazol sobe para 100% de sobrevida (URBINA et al., 2003).
Figura 14 - Estrutura química da lovastatina
Fonte: Autor
Estudos de derivados bifosfonados, como exemplo o risedronato (figura 15),
foram realizados quanto à inibição da enzima farnesil pirofosfato sintase (FPFS),
resultando em uma atividade inibitória (IC50) de 0,037±0,003 μM, do T.cruzi em
modelo in vitro (MONTALVETTI et al., 2001). Posteriormente Garzoni e
colaboradores (2004), avaliaram a atividade tripanomicida do resedronato in vitro em
formas epimastigotas e amastigotas, e constataram inibição dose dependente para
ambas formas, sem indícios tóxicos para as células hospedeira empregada. Em
outro estudo, utilizando resedronato em modelo agudo – 10 mg/kg/dia por 7 dias - (in
vivo) apontou diminuição de 96,6% da parasitemia em relação ao controle e também
a diminuição da mortalidade de 90% para 10%, comparando os grupos controle e
tratado (Garzoni et al., 2004) .
31
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 15 - Estruturas química do risedronato
Fonte: Autor
Dois compostos derivados quinuclidínicos, o E5700 e ER-119884 (figura 16),
foram avaliados quanto à atividade inibitória da enzima esqualeno sintase, os quais
apresentaram IC50 na faixa de nanomolar, e na avaliação in vitro
(epimastigotas)ambos tiveram atividade (IC50 = 8 nM do E5700 e IC50 = 11 nM do
ER-119884) (URBINA, 2004).
Figura 16 - Estrutura química dos compostos E5700 e ER-119884
Fonte: Autor
Representantes azóis (cetoconazol, itraconazol, posaconazol) possuem
atividade perante a enzima esterol C14-α demetilase, em estudos realizados por
Sanchez-Sancho et al (2010) apontam atividade do posaconazol (figura17) contra o
T. cruzi em estudos in vivo em modelo crônico, sendo até utilizado em estudos de
fase clínica para o tratamento da doença.
32
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 17 - Estrutura química do posaconazol
Fonte: Autor
Glicólise
O parasito necessita de energia para sua sobrevivência, sendo assim ele
utiliza a via glicolítica como principal fonte energética, e contêm enzimas as quais
são estruturalmente diferentes dos mamíferos, possibilitando assim o estudo,
planejamento e desenvolvimento de moléculas ligantes especificas. Como o caso
das enzimas hexoquinase e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, já aplicadas
como alvos terapêuticos (SÁNCHEZ-SANCHO et al., 2010).
Absorção de purinas:
A impossibilidade do parasito em sintetizar purinas, torna-o competente e
habilitado para absorver essas substâncias de seus hospedeiros, no caso os
mamíferos, sendo um sistema obrigatório para sua sobrevivência. Um exemplo
dessa via de absorção de purinas é a HGPRT (hipoxantina/guanidina
fosforribosiltransferase), que se destaca como alvo terapêutico (SÁNCHEZ-
SANCHO et al., 2010).
Cisteína protease
A cruzipaina ou cruzaina são císteinas proteases encontradas em T.cruzi.
Estudos apontam que essas enzimas, quando danificadas por inibição ou deleção
de genes, geram desordem significante na capacidade infectante e de sobrevivência
do parasito (LIMA et al., 2013).
33
Introdução
Cauê Benito Scarim
Tripanotiona redutase
A tripanotiona é uma substância que atua como a glutationa, sendo a
segunda presente em diversos organismos. A tripanotiona possui massa molecular
relativamente baixa e apresenta funções específicas no organismo do parasito,
como participação em processos regulatórios, defesa contra agentes oxidantes,
metais pesados e outros xenobióticos (FAIRLAMB; CERAMI, 1992; FLOHÉ, 2012). A
redução do substrato tripanotiona dissulfeto, este catalizado pela tripanotiona
redutase por meio de mecanismo NADPH dependente (figura 18), é fundamental
para a manutenção e conservação do ambiente intracelular do T. cruzi (KRAUTH-
SIEGEL & INHOFT, 2003; PITA & PASCUTTI, 2012).
Figura 18 - Redução de tripanotiona dissulfeto para ditiol tripanotiona pela enzima tripanotiona redutase.
Fonte: extraído e adaptado de (KRAUTH-SIEGEL & INHOFT, 2003).
Outros alvos terapêuticos incluem o ácido siálico transferase, a biossíntese de
lipídeos assim como os ligantes de DNA, o metabolismo de poliaminas e a via das
pentoses fosfato.
1.7. Realidade terapêutica contra Chagas e novas perspectivas
Posterior à descoberta da doença de Chagas, em 1909, houve uma vasta
busca por moléculas eficazes para regular ou combater tal parasitose. As moléculas
pioneiras para os testes com T.cruzi foram o cloreto de mercúrio, fucsina, tartarato
34
Introdução
Cauê Benito Scarim
de antimônio potássico e arsênico, porém nenhuma molécula demonstrou atividade.
Até 1960, um número inestimável de substâncias químicas, extratos e combinações
foram testados em ensaios in vitro e in vivo e clinicamente, obtendo resultados
questionáveis, duvidosos e grande parte inexpressivos (ANDRADE et al., 1996;
COURA & CASTRO, 2002; COURA, 2009).
Apesar da evolução na ciência investigativa para compreensão de tal
patologia, como o amplo conhecimento sobre seus alvos terapêuticos, mutações e
tropismo das cepas, na doença de Chagas ainda há pouco incentivo na pesquisa e
desenvolvimento para novas moléculas terapêuticas, bem como a falta interesse de
indústrias farmacêuticas em investir na pesquisa e desenvolvimento de novas
moléculas direcionadas para doenças negligenciadas (URBINA, 2010)
O tratamento da doença de Chagas continua um desafio para a ciência.
Desde a década de 70 até os dias atuais, apenas dois fármacos foram aprovados no
mundo para o tratamento da doença, o nitrofurano nifurtimox [3-metil-
4(nitrofurfurilideneamino) tetrahidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dióxido], e o benznidazol [N-
benzil-2-nitroimidazol acetamida], um derivado nitroimidazólico (Figura 19) (CASTRO
et al., 2006; WHO, 2015).
Figura 19 - Estruturas químicas do nifurtimox e benznidazol
Fonte: Autor
Esse fato comprova a falta de incentivo no tratamento dessa enfermidade.
Outra evidência foi à retirada do produto benznidazol do mercado, em 2008, pela
indústria farmacêutica Roche em virtude da baixa rentabilidade. Desta maneira o
produto passou a ser produzido pelo LAFEPE (Laboratório Farmacêutico de
Pernambuco, 2013), uma instituição público-privada, sendo esse o único produtor
mundial do medicamento em questão (Governo do Estado de Pernambuco, 2013).
Em 2008, a produção do medicamento na dose infantil foi aprovada em parceira do
35
Introdução
Cauê Benito Scarim
DNDi e o LAFEPE, que passaram a distribuí-las em 2011 (DNDi, 2008; PORTAL
BRASIL, 2011).
O mecanismo de ação do nifurtimox é baseado na formação de radicais livres,
superóxidos e peróxido de hidrogênio, os quais atuam danificando macromoléculas
como proteínas, lipídios e até mesmo DNA, por meio da ação das nitrorredutases
presentes no interior das células (MAYA et al., 2007). No entanto, sua
comercialização é restringida aos Estados Unidos, uma vez que as cepas brasileiras
passaram a desenvolver resistência ao fármaco (Coura, 2009).
Contudo, o mecanismo de ação do benznidazol é diferente do nifurtimox,
sendo este independente da formação de radicais livres. Acredita-se que sua ação
esta associada à ligação covalente das macromoléculas (proteínas, lipídios e DNA)
aos metabólitos formados da redução pelas nitrorredutase. Constatou-se a inibição
da enzima NADH-furamato redutase do T.cruzi pelo benznidazol, além de favorecer
a fagocitose e intensificar a atividade do interferon γ (IFN-γ) contra o parasito. (DÍAZ
DE TORANZO et al., 1988; MAYA et al., 2007).
Ainda que existam fármacos para o tratamento da doença, esses não atuam
na forma crônica da doença de Chagas, além de apresentarem diversos efeitos
adversos indesejáveis ao organismo, que quando graves tendem a interromper o
tratamento. Entre os efeitos adversos estão: anorexia e perda de peso, náusea e
vômitos, excitação nervosa, insônia, depressões, convulsões, vertigens, cefaléias,
sonolência, mialgias, perda de equilíbrio, desorientação, esquecimento, parestesias,
adinamias, neuropatias periféricas, gastralgia, edema de mucosa, intolerância
hepática e manifestações cutâneas (COURA; CASTRO, S., 2002, URBINA et al.,
2003; CASTRO, J.; MECCA; BARTEL, 2006). Apesar dos inconvenientes efeitos
adversos, até o momento não existem fármacos aprovados com atividade superior
ao nifurtimox e ao benznidazol (MAYA, 2010).
Estudos realizados por Raether & Hanel (2003) apontam os compostos nitro-
heterocíclicos, como agentes terapêuticos utilizados contra uma grande variedade
de protozoários e bactérias anaeróbias, patogênicas em humanos e animais. Como
o benznidazol, nifurtimox (figura 19), há furazolidona, metrozidazol, secnidazol,
ornidazol e tinidazol (figura 20), sendo todas moléculas derivados dos 5- e 2-
nitroimidazol e do 5-nitrofurano.
36
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 20 - Estrutura química dos compostos nitro-heterociclicos utilizados como antiprotozoários e antimicrobianos
Fonte:extraído e adaptado de Raether & Hanel (2003)
Compostos com grupo nitro (NO2) são conhecidos por apresentar maior
toxicidade. No entanto, existem muitos exemplos desse grupo na terapêutica. (Paula
et al, 2009; Bosquesi, 2009). O nitrofural ou nitrofurazona (NF) (figura 20) (5-nitro-4-
furaldeído-semicarbazona), foi o primeiro derivado nitrofurânico introduzido na
terapia, sintetizado em 1944 por Dodd e Stilman. Em 1961, Brener demonstrou que
o nitrofural era eficaz na inativação do T. cruzi em um experimento in vivo, em que o
NF foi administrado durante 53 dias (100 mg/kg/dia) em ratos infectados com T.cruzi,
observado-se a cura de 95,4% dos animais.
Outro estudo realizado em 1969, ANDRADE & BRENER mostrou que a
atividade tripanossomicida do nitrofural (figura 21) tornava o T. cruzi inativo. O
mecanismo de ação do NF se dá por meio da redução do grupamento nitro por
enzimas nitrorredutases, levando à produção de espécies reativas de oxigênio,
ocasionando estresse oxidativo que causa desequilíbrio nas defesas antioxidantes
do T.cruzi. Segundo estudos recentemente publicados, o NF age inibindo a enzima
tripanotiona redutase e a enzima cruzipaína presente no parasito (HENDERSON et
al., 1988; LA SCALEA, 2005; IGOILLO-ESTEVE et al., 2007; TROSSINI et al.,
2010).
37
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 21 - Estrutura química do nitrofural (NF)
Fonte: Autor
Em busca de uma nova terapêutica para doença de Chagas, Chung (1996)
sintetizou uma serie de pró-farmacos recíprocos de nitrofural (NF) e primaquina,
utilizando como grupo espaçante aminoácidos e dipeptídeos, aplicando a técnica de
modificação molecular denominada de “latenciação”. Essa ferramenta transforma
quimicamente o fármaco em uma espécie inativa (pró-fármaco), que, in vivo, e
perante ação química ou enzimática, se converte na forma ativa, melhorando as
propriedades físico-quimicas, biodisponibilidade com diminuição de toxicidade.
Neste estudo identificou-se atividade do intermediário de síntese,
hidroximetilnitrofural (NFOH) (figura 22), como um potencial agente tripanomicida em
ensaios in vitro.
Figura 22 - Estrutura química do NFOH
Fonte: Autor
O mecanismo de reação do NF, K2CO3 e formaldeído em água para
obtenção do NFOH (formação a base de Mannich) esta representado a seguir
(figura 23).
38
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 23 - Mecanismo de reação do NF em NFOH (base de Mannich)
Fonte: Extraído e adaptado de TROSSINI, 2010.
O NFOH foi identificado por ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e
13C, análise elementar, espectrometria no infravermelho e massas (MS): 1H RMN
(DMSO-d6) d 7.81 (s, 1H, CH), 7.77–7.75 (d, 1H, Het- H), 7.68–7.61 (t, 1H, NH),
7.22–7.20 (d, 1H, Het-H), 4.62–4.59 (d, 1H, CH2); 13C RMN (DMSO-d6) d 127.89
(C2), 112.72 (C3), 115.17 (C4), 151.36 (C5), 152.86 (C6), 154.60 (C7), 63.22 (C8);
analise elementar: 37.20% C; 3.26% H; 24.09% N; IR (KBr, ν, cm_1): 3410 (νOH),
3334 e 3162 (νNH), 2980 e 2860 (νCH), 1674 (νCO), 1522 e 1359 (νNO2); MS: m/z: 228
[M+], 210, 198, 155 (Chung et al., 2003)
Chung e colaboradores (2003) realizaram ensaios in vitro com as formas
tripomastigotas, no qual o intermediário de síntese NFOH, na concentração de 5 μM,
apresentou atividade equivalente ao NF, este com o dobro da concentração (10 μM)
(figura 24).
39
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 24 - Efeito de 5 μM NF, 10 μM NF, 5 μM NFOH e 10 μM BZN) em porcentagem de tripomastiggotas pós-infecção das células com formas tripomastigotas de T. cruzi.
Controle positivo não expresso: 100%.
Fonte: Extraído e adaptado de Chung et al., 2003.
No mesmo estudo foi avaliada, in vitro, a atividade destes compostos
conforme atividade contra formas amastigotas (figura 25) apontando o NF e o seu
derivado (NFOH) com 97.2%, 99.6%, e 100% para 5 μM NF, 10 μM NF e 5 μM
NFOH, respectivamente, já o composto padrão (BZN 10 μM) apresentou atividade
significativamente inferior (81,1%) (CHUNG et al., 2003).
Figura 25 - Efeito de 5 μM NF, 10 μM NF, 5 μM NFOH e 10 μM BZN em porcentagem de amastigotas pós-infecção das células com formas amastigotas de T. cruzi. Controle
positivo não expresso: 100%.
Fonte: Extraído e adaptado de Chung et al., 2003.
40
Introdução
Cauê Benito Scarim
Esses trabalhos deram inicio a uma série de estudos do efeito do NFOH
realizado no Lapdesf, Laboratório de Pesquisa de Novos Fármacos, FCF-UNESP e
com apoio de colaboradores de nossa e de outras instituições.
Maturação de pré-RNAm em tripanossomatídeos ocorre através de um
processo chamado de trans-splicing, que envolve a excisão de íntrons e união dos
exons em duas transcrições independentes. Baseado neste processamento Barbosa
e colaboradores (2007) estudaram a capacidade de NF e NFOH para atuar no
processamento de RNAm durante as reações de trans-splicing, em um estudo in
vitro, utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida corado com prata. Além disso,
o efeito destes compostos nas três estádios de desenvolvimento de T. cruzi foi
avaliado. Os resultados obtidos mostraram que NFOH interfere no processamento
de RNA por uma inibição parcial da reação de trans-splicing, em cepas de T.cruzi Y
e NCS. A atividade de NFOH é dependente da dose e é mais elevada do que a
atividade de NF 12,5 uM. As bandas de RNA, também foram quantificadas por
absorbância a confirmação da variação da concentração de RNA. A atividade
biológica em culturas de células demonstraram que 5 uM de NFOH foi tão eficaz
como o dobro da concentração de NF em todas as fases do parasita, afetando desta
maneira, o processamento de RNA nestes parasitas. Além disso, observou-se que
após 15 dias de tratamento, a eficácia do NFOH foi ainda maior.
O NFOH teve sua estrutura elucidada mediante cristalografia de raio-X por
Doriguetto e colaboradores (2005). Tossini et al. (2010), realizaram estudos de
modelagem molecular de estrutura cristalográfica, em que o derivado NFOH possui
sua carbonila mais suscetível ao ataque nucleofílico da Cys25 da cruzaína em
relação ao NF, desta maneira, certificou-se como possível responsável pela
formação do ânion nitro-radical., podendo assim operar na inibição de cruzaína e de
tripanotiona redutase.
A capacidade de inibição da enzima cruzaína foi testada por Trossini et al.
(2010), o qual pode ser observado inibição de 60% e 30 % para NFOH e NF
respectivamente (figura 26).
41
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 26 - Docking do NF (A) e NFOH (B), sob a enzima cruzaína presente no T.cruzi
Fonte: Extraído de TROSSINI et al., 2010
Os mapas de potenciais eletrostáticos (MEP) de ambas as moléculas estão
expressos na figura 27, que sugere que o encaixe destas moléculas com a enzima
cruzaína pode apresentar maior afinidade de Cys-25 de cruzaína para a unidade de
carbonila do NFOH, em virtude de uma menor densidade eletrônica quando
comparada com o NF.
Figura 27 - Mapas dos potenciais eletrostáticos (MEP) do NF e NFOH.
A)
B)
C)
D)
NF NFOH
A)
B)
C)
D)
NF NFOH
Fonte: Extraído de Trossini et al., 2010.
42
Introdução
Cauê Benito Scarim
Os nitro-compostos (NO2) na maioria dos casos pode gerar um alto índice de
toxicidade, no entanto, existem muitos exemplos desse grupo na terapêutica,
provavelmente ligados à presença de dois grupamentos com potenciais reativos: o
grupo nitro na posição 5 e os grupos substituintes na posição 2 do anel furânico.
(Bosquesi, 2009).
O teste de mutagenicidade (teste de Ames), in vitro, foi realizado utilizando-se
Salmonella typhimurium (cepa TA98 e TA102 – figura 28 e 29, respectivamente) na
ausência e presença da fração S9 de fígado de rato. Os resultados obtidos por
GUIDO e colaboradores (2001) sugerem que a adição do grupamento hidroximetil
no NF por latenciação, formando assim o NFOH, foi responsável por diminuir a
atividade mutagênica em cerca 4 vezes, nos ensaios com e sem ativação
metabólica, em ambas linhagens testadas.
Figura 28 - Atividade mutagênica (S. typhimurium cepa TA98) do
hidroximetilnitrofural em comparação ao nitrofural em ensaios com e sem ativação metabólica (S9)
Fonte: Extraído e adaptado de GUIDO et al., 2000 (* óbito animal).
43
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 29 - Atividade mutagênica (S. typhimurium TA102) do hidroximetilnitrofural em comparação ao nitrofural em ensaios com e sem ativação metabólica (S9)
Fonte: Extraído e adaptado de GUIDO et al., 2000.
. O teste de Ames suporta a hipótese de que o pró-fármaco possui uma
característica menos mutagênica à célula quando comparado ao seu recíproco em
ambas as cepas analisadas.
Os compostos foram analisados, in vivo (micronúcleo), utilizando o modelo de
genotoxicidade em micronúcleo, e foram avaliados quanto a capacidade de induzir
mutações cromossômicas durante a fase de divisão celular. Enquanto foram
encontrados presença de micronúcleo nos grupos BZN e NF, obteve-se ausência
total de células micronucleadas no grupo NFOH, este apresentou o perfil mutagênico
semelhante à água (figura 30) (Bosquesi, 2009).
44
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 30 - Freqüência média de reticulócitos micronucleados (MNRET) e desvio padrão para 1000 células obtidas de camundongos tratados com 50, 100, 250 e 500
mg/kg de BNZ, NF e NFOH.
Fonte: Extraído de BOSQUESI, 2009.
Além disso, o NFOH foi avaliado quanto à sua segurança em testes de
mutagenicidade e de toxicidade aguda. A mutagenicidade foi avaliada e comparada
ao nitrofural por dois ensaios, pelo teste de Ames e do micronúcleo. Em ambos, foi
demonstrado que NFOH é quatro vezes menos mutagênico que seu composto de
partida. Já no teste de toxidade aguda, o derivado foi considerado pouco tóxico,
segundo critérios da OMS, com DL50 (dose letal para 50%) superior a 2000 mg/kg
(MELO, 2006).
Testes de toxicidade aguda (14, 28 e 60 dias), realizados com camundongos
por vias oral, indicaram baixa toxicidade do derivado NFOH (DL50 > 2000 mg/kg) e
alta para NF (DL50 556,3 mg/kg). Do mesmo modo, quando comparado via
45
Introdução
Cauê Benito Scarim
intraperitoneal o NFOH apresentou DL50 327 mg/kg enquanto o NF demonstrou DL50
197,2 mg/kg por esta via. Estes resultados justificam a continuidade dos testes pré-
clínicos em outras espécies animais, como ratos e cães (MELO, 2006).
Recentemente em 2014, Davies et al. avaliaram a hepatotoxicidade do NFOH
em modelos in vitro e in vivo. No ensaio in vitro foram utilizadas cultura de células
HepG2 e os fármacos testados foram NFOH e BZN nas concentrações de 5 mM, 50
mM e 100 mM, com objetivo de avaliar a quantidade gerada de espécies reativas de
oxigênio e de danos ao DNA celular. Apesar das células tratadas com BZN não
manifestarem variação na capacidade de gerar espécies reativas de oxigênio, esta
se mostrou capaz de diminuir a viabilidade celular, exibindo 33% de morte celular
quando administrado em dose de 100 mM. Já os resultados obtidos com NFOH
sugerem uma ligeira hepatotoxicidade, porem, em contraste ao BZN, o NFOH não
demonstrou citoxicidade hepática, não influenciando na viabilidade celular.
No mesmo estudo, no entanto, em análise in vivo onde foram avaliados
grupos com administração de NFOH (150 mg/kg/dia), BZN (150 mg/kg/dia) e
controle positivo durante dois períodos distintos, sendo um de curto prazo (21 dias) e
outro de longo prazo (60 dias). O objetivo deste trabalho foi avaliar os danos no
tecido hepático quanto às enzimas TGO e TGP, medida de mieloperoxidase (MPO),
atividade e estresse oxidativo, citocina antiinflamatória TNF-α e por fim análise
histopatológica. Os resultados obtidos revelaram aumento dos níveis de TGP no
grupo tratado com BZN em longo prazo, no entanto, o NFOH não apresentou
variação significativa nos níveis de TGO e TGP, tanto para curto quanto para longo
prazo de tratamento, quando comparados aos controles. O grupo BZN no tratamento
tanto a curto prazo, mais principalmente a longo prazo acarretou em uma vasta
concentração de citocina antiinflamatória TNF-α e infiltrados inflamatórios em
relação ao grupo NFOH. Por fim, pode-se concluir que o tratamento com BZN induz
a inflamação crônica e lesão hepática, diferentemente do NFOH que não apresentou
hepatotoxicidade.
Estudando o comportamento voltamétrico do NF e do NFOH por voltametria
cíclica, LA-SCALEA et al. (2005) observou redução do NF pH-dependente. Em meio
ácido este forma como principal produto o derivado hidroxilamínico, a qual envolve 4
elétrons. Em meio alcalino, a redução do NF primeiramente envolve um elétron para
formar o nitro-radical aniônico e a segunda etapa corresponde à formação da
hidroxilamina, estes com prévio tratamento do eletrodo de carbono vítreo. O NFOH
46
Introdução
Cauê Benito Scarim
apresentou comportamento voltamétrico similar e, de forma análoga, manifestando a
mesma eletroatividade e capacidade de estabilização do nitro-radical, indicando que
a modificação molecular do NF, adição do grupo hidroximetil, não introduziu
alterações no seu comportamento voltamétrico (LA-SCALEA et al., 2009).
Os dados, in vivo, tem relação à farmacocinética do composto o qual aponta
que o NFOH atinge um Tmax de concentração plasmática em 1 hora contra 4 horas
do NF, sugerindo absorção mais rápida para o NFOH. Sendo assim, o NFOH
apresentou-se 20 x mais biodisponível em relação ao NF, em ratos, e T ½ pH
1,2=1,5 h; T ½ pH 7,4=134 h; T ½ em plasma de rato = 48 h. Já em coelhos a
biodistribuição do NFOH foi 10% maior em relação ao NF (SERAFIM, 2013;
SERAFIM, 2008).
Nogueira-Filho e colaboradores (2013), realizou ensaios farmacocinéticos pré-
clínicos em coelhos albinos, avaliando desta maneira o perfil farmacocinético quanto
a administração do NFOH oral, NF proveniente de NFOH oral, NF oral, NFOH i.v. e
NF proveniente de NFOH i.v. e por fim NF i.v. Dentre todos os resultados obtidos, o
mais satisfatório foi a biodisponibilidade oral do NF a partir do NFOH, sendo esta de
60%
Também utilizando modelo in vivo, Davies e colaboradores (2010) induziram a
infecção por T.cruzi, inoculando 103 formas tripomastigotas da cepa Taluhen, e
dividiu o trabalho em quatro grupos (n = 12), sendo estes grupos tratados com
NFOH (150 mg/kg/dia), NF(150 mg/kg/dia), BZN (60 mg/kg/dia) e um grupo controle
positivo (Veículo – 5% NaCl em tween 80). Já nos grupos dos animais não
infectados, grupos estes para avaliação da enzima TGO em relação ao uso dos
compostos, todos os grupos permaneceram com a mesma concentração, com
exceção do grupo NF que após observação de um grande numero de óbitos nos
animais infectados que recebiam 150 mg/kg/dia, a concentração diária foi reduzida
para 45 mg/kg/dia. Ambos os protocolos, com infecção e sem infecção, receberam
seis doses por semana até completarem 60 dias de tratamento. O tratamento teve
inicio após cinco dias da infecção e todos os compostos foram administrados por via
oral.
Os resultados apontam similaridade entre os grupos NFOH e BZN no
combate à parasitemia (fase aguda), visto que houve ausência de formas circulantes
de T.cruzi durante as análises parasitemicas e com exame de PCR negativos. E em
relação à taxa de mortalidade, destacou-se o grupo NFOH (16%), sendo que os
47
Introdução
Cauê Benito Scarim
níveis para BZN, NF e controle positivo foram de 33%, 75% e 66% respectivamente.
As analises histopatológicas foram realizadas após 180 dias de protocolo, as quais
demonstraram grande quantidade de ninhos amastigotas no músculo esquelético e
tecido cardíaco em relação aos demais grupos.
Os resultados obtidos até o momento sugerem o NFOH como um potencial
candidato para estudos clínicos. Entretanto, outros ensaios pré-clínicos ainda devem
ser realizados no sentido de se conhecer este composto na fase crônica da doença.
A figura a seguir demonstra esquematicamente todos os principais estudos a
respeito do NFOH, realizados por nosso laboratório e colaboradores de 1996 até os
dias atuais, sem os quais não seria possível a realização deste projeto (figura 31).
48
Introdução
Cauê Benito Scarim
Figura 31 - Ensaios realizados com o candidato a fármaco Hidroximetilnitrofural NFOH em relação ao Nitrofural (NF) e o Benznidazol (BNZ)
Síntese e caracterização
• Síntese e identificação (CHUNG,
1996);
• Mesmo comportamento
voltamétrico entre o NF e o NFOH
(LA_SCALEA et al, 2005; 2009);
• Determinação da solubilidade
(MELO, 2006);
• Estudo computacional indica:
ataque nucleofílico da Cys25 da
cruzaína a carbonila do NFOH
(TROSSINI et al., 2010);
• Otimização da síntese do NFOH (TROSSINI et al., 2010);
Toxicidade e Farmacocinética
• Teste de Ames (mutagenicidade – in
vitro): NFOH 4 vezes menos mutagênico
que o NF (GUIDO et al.. 2001);
• Ensaio in vivo de DL50 > 2000 mg/kg
do NFOH (MELO, 2006);
• Ensaio de genotoxicidade (micronúcleo
– in vivo): NFOH não é genotóxico,
resultado comparado a água
(BOSQUESI, 2009);
• 20 x mais biodisponível em relação ao
NF e T ½ pH 1,2=1,5 h; T ½ pH 7,4=134
h; T ½ em plasma de rato =48 h
(SERAFIM, 2013; 2008);
• Biodisponibilidade oral do NF a partir
do NFOH é de 60%; aumento de 10% na
biodistribuição em coelhos (NOGUEIRA-
FILHO, 2013);
•NFOH não alterou significativamente os
níveis de AST e ALT. Houve lesão
cardíaca, porem não houve grupo
controle (MACHADO, 2013);
• Leve hepatotoxicidade durante 21 dias
e normalizado quando feito 60 dias de
tratamento – não hepatotoxico (DAVIES
et al, 2014);
Atividade Biológica
•Atividade tripanomicida contra formas
amastigotas e tripomastigotas (in vitro):
mais ativo que o BZN (CHUNG et al.,
2003);
• NFOH interfere no processamento do
RNAm (BARBOSA et al., 2007;
AMBROSIO et al., 2004);
• Inibição cruzipaína: NF 30% e NFOH
60% (TROSSINI et al., 2010);
• Atividade sub crônica (in vivo) e
diminuição da mortalidade no grupo NFOH
(DAVIES et al., 2010);
Demais Estudos• Formação de pró-fármacos dendriméricos (fármacos dirigidos
dendriméricos) (GIAROLLA et al., 2012; 2013);
• Inclusão de complexo ciclodextrina aumentou a citotoxicidade(GRILLO et al, 2007; 2008).
Fonte: Autor.
49
Objetivos
Cauê Benito Scarim
2. Objetivo Geral
Estudo da atividade de NFOH ensaio em fase crônica da doença de
Chagas com cepa Y de T. cruzi em camundongos BALB/c
2.1. Objetivos específicos
Padronizar ensaio in vivo para indução de fase crônica da doença de
Chagas (cepa Y de T. cruzi) em camundongos BALB/c,
Estudo do efeito de NFOH e benznidazol no ensaio em fase crônica da
doença de Chagas em modelo padronizado.
Parâmetros analisados
Parasitemia (fase aguda e imunossupressão)
Comportamento, peso médio e consumo de ração, observados
semanalmente, durante o período de infecção e tratamento.
Peso relativo dos órgãos ao final do experimento
Avaliação bioquímica das seguintes enzimas: AST, ALT, CK-MB,
GGT;
Avaliação macroscópica dos órgãos: coração, cérebro, rim,
cólon, fígado e baço;
Avaliação histopatológica dos órgãos: coração, baço, fígado e
colón, esfregaços corados com hematoxilina-eosina (HE);
Observação da condição geral do animal durante o experimento.
50
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3. Material e Métodos
3.1. Reagentes
Formaldeído p.a. (Merck)
Metanol p.a. (Synth)
Acetona p.a (Synth)
Xilol (Synth)
Ácido acético (Synth)
nitrofural p.a. (Merck)
benznidazol (Sigma)
Cabonato de potássio p.a.
(Synth).
Clorofórmio p.a. (Synth)
Água destilada
Soro fisiológico (0,9% - NaCl)
dexametasona (Achē)
Goma arábica (Sigma)
Etanol 70%, 80%, 90% e absoluto.
Hematoxilina
Eosina
Parafina (Merck)
3.2. Equipamentos
Aparelho de ponto de fusão capilar modelo SMP3 da Bibby Stuart Scientific®;
Balança analítica Marte® - modelo AY 220
Balança semi-analítica Gehaka® modelo BG 200
Sonicador Unique® modelo UltraSonic Cleaner
51
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.3. Metodologia sintética para obtenção de NFOH
A preparação de NFOH seguiu conforme obtido por Chung (1996), este
demonstrado no esquema abaixo (Figura 32):
Figura 32 - Esquema de Síntese do NFOH.
Fonte: Autor.
O NFOH foi preparado à temperatura ambiente, sob agitação durante 48
horas, pela reação de 1,08 g de nitrofural com 18 ml de formaldeído em presença de
0,7g de K2CO3 e 10 ml de H2O. Após completar a reação, a suspensão foi filtrada e
em seguida foi realizado recristalização do produto a fim de obter o produto puro.
Desde modo, misturaram-se 40 mL de acetona e 120 mL de metanol
(25:75/v:v) a 80 °C, respectivamente, e adicionou-se 1,0 g de NFOH. Após total
solubilização do NFOH, esperou-se a saturação da reação para então ser resfriada
em banho de gelo. Posterior à precipitação ocasionada pelo choque, o produto foi
filtrado, obtendo dessa maneira, 65% de rendimento do produto puro. O produto foi
analisado por CCD utilizando-se como sistema solvente CHCl3:MeOH:CH3COOH
(95:5:3/v:v:v) e faixa de fusão.
3.3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)
Foram utilizadas placas de sílica gel G-60, com 0,25 mm de espessura, e
placas Alugram Nano-Sil G/UV 254 da Merck para o acompanhamento das reações,
com os seguintes sistemas de eluentes (v/v/v): CHCl3/MeOH/CH3COOH (95:5:3);
52
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
(85:10:5); (70:20:10). As placas cromatográficas foram reveladas e observadas com
iodo e/ou radiação UV.
3.3.2. Determinação da faixa de fusão
A faixa de fusão experimental do produto obtido foi determinada em aparelho
para determinação de ponto de fusão capilar modelo SMP3 da Bibby Stuart
Scientific, sem correção.
3.4. Ensaios biológicos
3.4.1. Animais utilizados
Foram utilizados camundongos machos da linhagem BALB/c isogênicos com
21 dias de idade e faixa de peso entre 18 – 21 g obtidos junto ao CEMIB
(UNICAMP), Campinas - SP. Os animais foram mantidos em condições controladas
de temperatura (23 ± 1 °C), umidade (55% ± 5%), iluminação automática (ciclo de 12/12
horas), água e ração ad libitum. O modelo experimental empregado foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Araraquara – UNESP (Protocolo CEUA/FCF/CAr nº 39/2014 e parecer 78/2015).
Os animais eram pesados semanalmente para o controle do peso, assim
como a quantidade de ração consumida durante o decorrer dos ensaios.
3.4.2. Diagramas dos protocolos experimentais
O protocolo experimental realizado esta resumido no diagrama a seguir
(figuras 33), a partir dos resultados dos ensaios de padronização do método, o qual
foi baseado nos trabalhos de DAVIES et al. (2010), RIBEIRO (2010) e PEREIRA et
al. (2008).
53
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
Figura 33 – Protocolo Experimental (cepa Y de T. cruzi)
Inoculo de 102
formas (cepa Y de T. cruzi)
Acompanhamento parasitêmico(MARTINEZ, 2004) semanal (Fase aguda – sete semanas)
Parasitemia negativa (Fase crônica)
Imunossupressão farmacológica (PEREIRA et al, 2008) (Dexametasona – 14 dias)
Eutanásia e Necropsia(19° semana)
Protocolo esquemático modelo animal em fase crônica da doença de Chagas1
sem
an
a
2
sem
an
a
3
sem
an
a
4
sem
an
a
5
sem
an
a
6
sem
an
a
7
sem
an
aTratamento - 60 dias (DAVIES et al, 2010) consecutivos:• Controle positivo- Soro Fisiológico (NaCl 0,9%);• NFOH (150 mg/kg/dia); • BZN (60 mg/kg/dia). •Controle negativo - Soro Fisiológico (NaCl 0,9%), sem infecção.
•Parasitemia
•Bioquímicos
•Histopatologia
Fonte: dados da dissertação.
54
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.4.3. Protocolo Experimental
3.4.3.1. Caracterização biológica da cepa utilizada
O presente ensaio foi realizado no laboratório de Parasitologia da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, Departamento de Ciências
Biológicas, com a colaboração do Prof. Dr. João Aristeu da Rosa.
A cepa Y de T. cruzi, isolada de um caso humano, por xenodiagnostico
(SILVA & NUSSENZWEIG, 1953) tem como característica o predomínio de formas
delgadas no inicio da fase aguda, apresentando, posteriormente, as formas largas
(ANDRADE, 1974). Para a avaliação da atividade antichagásica in vivo, foi
necessário o isolamento de cepas de T. cruzi (cepas Y) bem como sua padronização
para o inóculo desejado, método adaptado de Martinez (2004).
As formas flageladas das cepas utilizadas foram isoladas do intestino
posterior dos triatomíneos e depositadas em meio de cultura axênico (LIT). Após o
isolamento, os parasitos foram inoculados via intraperitoneal em camundongos, e
mantidos por repiques sucessivos de cultura (LIT), e, no decorrer do pico
parasitêmico (fase aguda). O repique foi realizado através de punção cardíaca e
inoculação do sangue infectado via i.p. em outros camundongos jovens.
3.4.3.2. Padronização do inóculo
As contagens das formas tripomastigotas foram feitas de acordo com o
método de Brener, 1962 (BELDA NETO, 1973; ANDRADE, 1974). Com uma
micropipeta de 5 µL colheu-se o sangue do animal por meio de corte na cauda e
depositou-se em uma lâmina de vidro de 26 x 76 mm recobrindo-a com uma
lamínula de dimensões 22 x 22 mm, de modo a se obter uma camada delgada e
homogênea de sangue em toda a superfície da lamínula (MARTINS, 1999).
55
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.4.3.3. Contagem intercampos/formas tripomastigotas (BRENER,
1962)
Examinaram-se as lâminas em microscópio óptico Carl Zeiss JENA-
JENAVAL, com objetiva de 40X e ocular de 10X, contando 20 campos em cada um
dos quatro cantos da lamínula e mais 20 campos na parte central, totalizando 100
campos microscópicos analisados. Considerando que a superfície da lamínula
utilizada com a correção dos intercampos corresponde, no aumento empregado, a
cerca de 1555 campos microscópicos, basta multiplicar o número de flagelados
encontrado no exame de 100 campos pelo fator 15,55 e obtém-se o número de
formas tripomastigotas presentes em 5 µL (MARTINS, 1999).
3.4.3.4. Infecção com T.cruzi
A indução da doença iniciou-se com inoculação de 102 formas
tripomastigotas, em 0,3 ml de sangue diluído, por via intraperitoneal, com seringa de
vidro tipo tuberculina e agulha BD 10x5 (MOLINA BERRIOS, 2013; BUSTAMANTE,
2007).
3.4.3.5. Avaliação da infecção (fase aguda) – Exame de sangue
direto (RIBEIRO, 2010)
O padrão de infecção foi realizado através do acompanhamento parasitêmico
por meio de esfregaços de sangue fresco obtidos pelo corte da cauda dos
camundongos. Os esfregaços foram examinados, a partir do 3° dia pós-infecção,
uma vez por semana, até a ausência de formas tripomastigotas móveis do sangue
periférico, confirmados por três exames negativos, em dias alternados.
As fases da parasitemia foram classificadas como período pré-patente,
período patente e pico máximo de parasitemia, de acordo com ANDRADE, 1974;
FRANCISCO, 2007; RIBEIRO, 2010.
56
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
Período pré-patente: corresponde ao período compreendido entre a
inoculação e o primeiro dia de detecção do parasito no sangue periférico do
animal.
Período patente: período compreendido entre o primeiro dia de exame a
fresco positivo até a completa ausência de formas tripomastigostas no sangue
(fase aguda).
Pico máximo de parasitemia: correspondente à quantidade máxima de
parasitos no sangue e expresso em número de tripomastigotas sanguíneos /
5μl de sangue.
Taxa de letalidade: refere-se ao número de óbitos observados durante as
fases aguda e crônica da doença (com tratamento).
3.4.3.6. Determinação da infecção na fase crônica
A fase crônica foi considerada após três exames parasitêmicos negativos em
dias alternados.
3.4.3.7. Tratamento
O tratamento adaptado de Davies et al. (2010), teve inicio após a confirmação
de todos os animais na fase crônica da doença e foi mantido por 60 dias
consecutivos. Estabeleceram-se quatro grupos de animais para a cepa estudada,
sendo 12 o número de animais nos grupos I, II e III (n = 12) e seis animais para o
grupo IV (n = 6).
Grupo de animais infectados com a cepa Y:
Grupo I controle positivo: soro fisiológico (NaCl 0,9%);
Grupo II : 150 mg/kg/dia de NFOH (6,58x10-4g/mol);
Grupo III: 60 mg/kg/dia de BNZ (2,29x10-4 g/mol);
Grupo IV Controle negativo: soro fisiológico (NaCl 0,9%).
57
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.4.3.8. Preparo dos compostos para administração no modelo
Animal
Os compostos utilizados no ensaio foram preparados diariamente, sendo
suspensos em goma arábica 5% e colocado cinco minutos no Sonicador Unique®
sem alterar a temperatura para que sejam completamente solubilizados. A
administração foi realizada por gavage (via oral).
3.4.3.9. Imunossupressão induzida farmacologicamente
Após os 60 dias de tratamento os animais foram induzidos à
imunossupressão utilizando dexametasona (5 mg/kg/dia), por via intraperitoneal,
durante 14 dias (PEREIRA, 2008).
3.4.4. Sobrevida dos animais.
Foi acompanhada diariamente durante todo o curso da infecção em todos os
grupos experimentais e determinada através da mortalidade cumulativa após fim do
protocolo. Esta foi devido a brigas territoriais, macho alfa, ou por debilitação
(doente).
A taxa de letalidade foi calculada levando-se em consideração o número de
óbitos observados durante o experimento dividido pelo número de animais vivos no
inicio do experimento.
3.4.5. Necropsia dos animais utilizados
Após eutanásia por CO2, realizou-se análise externa dos animais sacrificados,
constatando alterações relacionadas ao estado nutricional, presença de
ectoparasitas, escaras e escoriações, cicatrizes, presença de neoplasia, alterações
cadavéricas, exame da cavidade oral e situação das mucosas (oral, ocular, vaginal,
peniana e anal).
58
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
Em seguida, o animal foi posicionado sob decúbito dorsal com os membros
fixados por um elástico e realizou-se uma incisão mentopubiana superficial no
animal, para a retirada dos órgãos desejados, estes já descritos anteriormente.
3.5. Peso relativo (FRANCISCO, 2007)
3.5.1. Peso relativo corpóreo
Semanalmente, pesaram-se os animais, em balança analítica e o peso
relativo dos animais foi calculado, subtraindo-se o peso final do peso inicial do
animal dividido pelo peso inicial. Os resultados foram expressos em porcentagem de
ganho ou perda de peso corporal.
3.5.2. Peso relativo dos órgãos
Após a eutanásia dos animais, foi realizada a retirada dos seguintes órgãos:
coração, cérebro, fígado, rins e baço. Estes órgãos foram pesados em balança
analítica para avaliar seus respectivos pesos relativos, estes expressos em
porcentagem (peso órgãos / peso animal x 100).
3.6. Estudo histopatológico
O processamento das peças foi realizado no Laboratório de
Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia – UNESP – Araraquara, com
colaboração do Prof. Dr. Cleverton Roberto de Andrade.
Os tecidos analisados foram: coração, cólon, fígado e baço. Os órgãos em
questão foram removidos e pesados após a eutanásia dos animais e imediatamente
acondicionados em solução de formalina a 10% tamponada por um período mínimo
de duas horas e máximo de 24 horas. Após este período, os órgãos foram
transferidos para álcool 70% até o processamento histológico.
59
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.6.1. Registro das amostras e cortes histológicos seriados
Os órgãos foram recebidos no laboratório e procedeu-se a análise
macroscópica dos mesmos, registrando comprimento, largura e altura e possíveis
lesões. Além disso, especificamente para cólon e coração, os órgãos foram
seccionados a cada 3 mm de modo a propiciar a análise completa dos mesmos.
Posteriormente, adicionaram-se em cassetes para processamento histológico
devidamente codificado para evitar identificação de grupos no momento da análise
histopatológica (avaliador cego).
3.6.2. Processo de desidratação e parafinização
O processamento histológico envolve a desidratação (concentrações
crescentes de álcool) dos órgãos com posterior substituição por xilol (crescentes
concentrações) e, por fim, parafina de inclusão. O processo todo se inicia com a
lavagem dos tecidos com a finalidade de remover resíduos de formol (12 horas em
água corrente).
3.6.3. Cortes histológicos - micrótomo
Os tecidos, devidamente emblocados em parafina, foram cortados em
micrótomo rotativo na espessura de 5 μm. Na sequência, as lâminas obtidas foram
mantidas em estufa a 60 oC por 12 horas com o objetivo de remover o excesso de
parafina. Órgãos como coração, baço e colón foram analisados como um todo por
meio de cortes seriados de 3mm de diamentro (figura 34).
Figura 34 - Representação dos cortes histopatológicos seriados (3mm).
Fonte: Autor
60
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.6.4. Colorações histopatológicas
A coloração padrão para a análise histopatológica geral dos órgãos foi a de
hematoxilina & eosina. Sendo o corante hidrofílico, o processo envolve a retirada da
parafina utilizando xilol, substituição por álcool e posterior reidratação. Na
sequência, os cortes passaram novamente pela desidratação e retorno ao xilol,
realizando-se por fim, a montagem das lâminas utilizando Permont (R) e lamínulas de
vidro.
3.6.5. Análises histopatológicas
Os tecidos foram analisados quanto à presença dos parasitos, realizadas em
objetivas de 10, 20x e 40x. A presença de ninhos de formas amastigotas
caracterizou a presença do parasito no tecido analisado.
Além disso, também analisamos a presença de resposta inflamatória,
considerando intensidade (leve (1), moderado (2) e forte (3) e tipo (agudo(1),
crônico (2) e misto (3)). Também, foi verificada a presença de áreas de necrose nos
tecidos analisados.
Além disso, parâmetros específicos da cada órgão que analisamos foram
abordados, conforme se encontra descrito abaixo:
O cólon: Foram analisadas as seguintes estruturas morfológicas:
Epitélio (atrófica, normal, ou hipertrófico/hiperplásico), Tecido
conjuntivo de submucosa (frouxo ou denso e infiltrado inflamatório,
intensidade e tipo), GALT (órgãos linfoides do trato gastrointestinal,
presença (sim ou não) e organizado ou desorganizado, além de atrofia
epitelial relacionada à região de GALT (sim ou não), Tecido
conjuntivo profundo, analisando, vasos sanguineos (estase ou
normais), camada muscular lisa (atrófica, normal,
hipertrófica/hiperplásica), presença de macrófagos e por fim a
presença de ninhos amastigotas de T. cruzi (quantidade de ninhos
amastigotas encontrados no plexo entérico).
O baço: este órgão, de extrema importância para doenças infecciosas
em estágios crônicos, principalmente quando imunossuprimidos, tende
61
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
a ter suas estruturas modificadas, portanto, foram analisadas as
morfologias de sua cápsula (integra, parcialmente rompida ou
rompida), sua espessura (delgada, normal ou espessa) e presença de
abscesso subcapsular (sim ou não). Na polpa branca e vermelha
(reduzido, normal ou aumentada) e, especificamente para a polpa
branca, nos folículos (organizados ou desorganizados). Além disso,
verificamos a presença de granulomas, congestão, seios venosos e
presença de ninhos amastigotas.
O Fígado: responsável pelo metabolismo de muitos fármacos torna
esse órgão um importante aliado na detecção da toxicidade dos
compostos estudados, analisando a manutenção geral da estrutura do
fígado hepatócitos e sinusóides hepáticos (sim ou não), alterações
celulares nos hepatócitos (picnose, lipidose e necrose (sim ou não)),
presença de congestão em espaço porta ou veia do centro lobular
(sim ou não), quantificação e qualificação de aglomerados
inflamatórios presentes no parênquima hepático (agudo, misto e
crônico) e a presença de ninhos amastigotas.
O coração: este órgão é um dos principais alvos do parasito estudado,
sendo assim esperamos encontrar alterações nos tecidos cardíacos
causadados pelo parasitismo intracelular ou pela defesa imunológica
perante este. Para tanto foram analisados quanto a presença de
hipertrofia do músculo cardíaco (sim ou não), quantificação e
qualificação de infiltrados e aglomerados inflamatórios (agudo,
misto ou crônico e leve, moderado ou intenso), além da presença de
ninhos amastigotas e calcificações celulares.
Vale realçar que para os resultados histopatológicos encontrados, foi
empregado o teste de concordância entre analisadores, conhecido como índice
kappa (k), que estabelece um avanço em relação à taxa geral de concordância, uma
vez que determinada medida for frequentemente semelhante entre os analisadores o
índice é positivo. Quando houve discrepância entre os dados obtidos por meio de
interobservadores, foi realizada uma terceira análise, mais detalhada, para que
62
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
então possa chegar a um resultado confiável (GALPARSORO & FERNÁNDEZ,
1999)
3.7. Estudos dos Parâmetros Bioquímicos
A avaliação enzimática foi realizada no Laboratório de Toxicologia da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara, com colaboração da
Profa. Dra. Rosângela Gonçalves Peccinini. As enzimas analisadas foram: aspartato
amino transferase (TGO), transaminase pirúvica (TGP), gamaglutamiltransferase
(GGT) e creatina quinase (isoforma CK-MB) (MACHADO, 2013; DAVIES et al,
2014). Todos os ensaios bioquímicos realizados são colorimétricos com exceção do
CK-MB, que é um método enzimático, ensaios estes realizados de acordo com os
padrões dos kits da Labtest.
As amostras de sangue foram devidamente identificadas de acordo com o
animal, o grupo que pertenciam e o dia de exposição, e, posteriormente, foram
submetidos à centrifugação em 2.500 rpm, durante 10 minutos, para a obtenção do
plasma para análise. O plasma foi removido com o auxílio de uma micropipeta de 50
uL e acondicionado imediatamente em freezer a -80 °C, com exceção da enzima
CK-MB a qual foi realizada análise imediatamente após centrifugação das amostras.
3.7.1. Curva de Calibração - TGO e TGP
Para que seja realizada a interpretação dos dados adquiridos por meio de
absorbâncias expressas no espectrofotômetro é indispensável a elaboração de
curvas de calibração, curvas essas, facilmente executáveis e compreensíveis, uma
vez seus valores de referências estão especificados nos manuais do kit Labtest®. A
constatação de cada valor de referência é necessária para a correta conversão da
absorbância em unidades de atividade enzimática por litro de sangue, experimento
este realizado em triplicatas, para as absorbâncias, que originaram as curvas nas
tabelas 1 e 2.
63
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
Tabela 1 - Valores de absorbância, em triplicata, para confecção de curva de calibração para TGO (U/L).
Fonte: dados da pesquisa
Com as medidas de absorbância estabelecidas, e tomando os valores de
referência correspondentes, construímos a curva de calibração para a enzima TGO
(figura 35) utilizando o software OriginPro®:
Figura 35 - Curva de calibração para a enzima TGO (U/L).
Fonte: dados da pesquisa.
TGO
Valor de
referência
(U/L)
0 24 61 114 160
Abs 1 317 409 484 542 596
Abs 2 318 395 468 519 593
Abs 3 327 388 464 522 582
Média 320 397 472 527 591
Desvio
Padrão 0,005 0,010 0,010 0,012 0,006
64
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
Tabela 2 - Valores de absorbância, em triplicata, para confecção de curva de calibração para TGP (U/L).
Fonte: dados da pesquisa.
Utilizando os valores de referência estabelecidos para esta enzima, e tendo
em mãos as medidas de absorbância, construirmos também a curva de calibração
para a enzima TGP (figura 36) utilizando o software OriginPro®:
Figura 36 - Curva de calibração para a enzima TGP (U/L).
Fonte: dados da pesquisa.
TGP
Valor de
referência
(U/L)
0 28 57 97 150
Abs 1 338 423 483 554 619
Abs 2 317 397 461 53 592
Abs 3 313 394 455 527 593
Média 322 404
466 537 601
Desvio
Padrão 0,013 0,015 0,014 0,014 0,015
65
Material e Métodos
Cauê Benito Scarim
3.8. Análises Macroscópica
Devido ao alto índice de hiperplasia das células, provocado na fase crônica da
doença de Chagas, diversos órgãos podem ter seu volume alterado, em virtude de
um diferencial na pressão sanguínea, modificando o sistema hemodinâmico ou pela
destruição do plexo mientérico no caso dos órgãos do TGI. Os órgãos em questão
são coração, colón e esôfago ou simplesmente aumentar o volume dos órgãos
secundários a esses como o baço, rins, bexiga e vesícula biliar (JELICKS &
TANOWISZ, 2011; PAIVA, 2011). Deste modo torna-se imprescindível a análise
macroscópica destes órgãos.
3.9. Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico
GraphPad Prism 5.01 aplicando-se análise de variância com determinação do nível
de significância a 5% (p<0,05), através de comparações múltiplas pelo teste de
Tukey e Anova (Bonferroni posttests). Os resultados foram expressos como média ±
erro padrão da média (EPM).
66
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
4. Resultados e Discussão
O NFOH foi obtido e apresentou-se como um pó amarelo-castanho com faixa
de fusão de 180-184 ºC, Rf = 0,63, sendo que o composto de partida NF apresentou
faixa de fusão de 222-231 ºC. Os espectros de absorção infravermelho e
espectrometria de RMN (1H e 13C) foram realizados por trabalhos anteriores
(CHUNG, 1996; TROSSINI, 2010). O produto obtido foi confirmado por meio da
faixa de fusão e Rf da cromatografia em camada delgada e comparados com os
valores da literatura.
Para o ensaio biológico, embora se possam usar outros animais, dá-se
preferência a camundongos jovens, com cerca de 20 dias de idade, para evitar a
resistência devido à idade (BARRETTO, 1965). O modelo animal utilizado teve
como base estudos que apontam resistência e controle sob a infecção por T. cruzi,
devido às suas características multigênicas. De acordo com Pereira et al. (2008) a
linhagem BALB/c mostra-se como o protótipo mais utilizado e consequentemente o
mais suscetível para o estudo da infecção pelo parasito T. cruzi.. Desta maneira, a
escolha deste modelo torna-se fundamental para a compreensão da patogenia
observada.
A forma tripomastigota de T. cruzi, parasita presente em diversos mamíferos,
dentre eles o homem, pode apresentar variações em sua morfologia, como
observado por Chagas, em 1909. A cepa Y, isolada por xenodiagnóstico, de um
caso humano, em 1950, por Nussenzweig (SILVA & NUSSENZWEIG, 1953) tem
como característica o predomínio de formas delgadas no inicio da fase aguda,
apresentando, posteriormente, as formas largas (ANDRADE, 1974).
O acompanhamento parasitêmico foi realizado a partir do terceiro dia de
infecção, sendo esSe executado semanalmente, até desaparecimento das formas
tripomastigotas de T.cruzi do sistema circulatório. A tabela a seguir demonstra
resumidamente o acompanhamento da parasitemia (tabela 3). O período pré-patente
foi de uma semana como já esperado segundo a literatura (ANDRADE, 1974;
RIBEIRO, 2010) e o pico parasitêmico variou entre a terceira e quinta semana pós-
infecção. Não houve óbito durante os tratamentos, apenas na fase aguda da
doença. A fase aguda permaneceu de 5 a 7 semanas, a evolução dos animais para
67
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
a fase crônica da doença foi de 75% para todos os grupos infectados. Não houve
carga parasitêmica e nem morte no grupo controle negativo.
Tabela 3 - Resultados do acompanhamento parasitêmico e taxa de letalidade durante a fases aguda e crônica da doença (cepa Y de T.cruzi).
Grupos % de
infecção
Taxa de
letalidade
ausência
de
tratamento
(fase
aguda)
Período
pré-
patente
Pico
parasitêmico
Duração
da fase
aguda
Taxa de
letalidade
durante o
tratamento
(fase
crônica)
Controle
negativo 0 0 0 0 0 0
Controle
positivo 100% 25% 1ª semana
3ª – 5ª
semanas
5ª – 7ª
semanas
0
NFOH 100% 25% 1ª semana
3ª – 4ª
semanas
5ª – 7ª
semanas
0
BNZ 100% 25% 1ª semana
3ª – 4ª
semanas
5ª – 7ª
semanas
0
Fonte: dados da pesquisa.
A ampla variação dos níveis parasitêmicos em animais inoculados com cepas
de T. cruzi é observada por diferentes autores, tais como Barretto (1965), Belda
Neto (1973), Andrade (1975), Belda Neto et al. (1975), Schalemper Jr. et al. (1986),
Barata et al. (1988), Pinto (2000), tanto para amostras isoladas de humanos, quanto
de silvestres ou vetores.
A cepa estudada apresentou período pré-patente relativamente curto, cerca
de uma semana, sendo o mesmo observado por Pinto et al. (1986) ao estudar o
comportamento desta cepa em camundongos. O grupo controle positivo apresentou
metade dos animais (seis) com pico parasitêmico na 3° semana cinco na 4° semana
e apenas um animal na 5° semana pós infecção. (Figura 37, tabela 4) O grupo
68
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
NFOH (Figura 38, tabela 5) apresenta cinco animais com o pico parasitêmico na 3°
semana e sete animais na 4° semana respectivamente. E por fim o grupo BZN
apontou seis animais na 3° e 4° semana pós infecção (Figura 39, tabela 6).
Figura 37 - Níveis parasitêmicos individuais (n = 12) observadas em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi – Grupo controle positivo (Fase aguda).
Grupo controle positivo - cepa Y
1° sem
ana
2° sem
ana
3° sem
ana
4° sem
ana
5° sem
ana
6° sem
ana
7° sem
ana
0
1
2
3
41
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Animal
semana pós-infecção
par
asit
os/
ml s
ang
ue
(M lo
g)
Fonte: dados da pesquisa.
69
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Tabela 4 - Número de parasitos do Grupo Controle positivo em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi.
Grupo Positivo (animal)
1° semana
2° semana
3° semana
4° semana
5° semana
6° semana
7° semana
1 0 171 1.135 2.037 7.028 0 0
2 0 202 3.638 4.058 0 - -
3 0 124 1.555 2.223 0 46 0
4 0 186 1.601 3.623 - - -
5 0 249 2.208 2.052 0 0 0
6 0 389 3.747 1.150 0 0 0
7 0 342 2.005 1.321 777 0 0
8 0 124 1.352 3.250 15 0 0
9 0 217 1.570 886 108 15 0
10 0 171 1.430 - - - -
11 0 186 1.166 1.135 171 0 0
12 0 78 1.228 1.492 155 0 0
( - ) óbito. Fonte: dados da pesquisa
Figura 38 - Níveis parasitêmicos individuais (n = 12) observadas em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi – Grupo NFOH (Fase aguda)
Fase aguda - NFOH
1° sem
ana
2° sem
ana
3° sem
ana
4° sem
ana
5° sem
ana
6° sem
ana
7° sem
ana
0
1
2
3
4 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
semana pós-infecção
Animal
para
sit
os/m
l san
gu
e (
M lo
g)
Fonte: dados da pesquisa
70
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Tabela 5 - - Número de parasitos do Grupo NFOH em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi.
Grupo NFOH
(animal)
1° semana
2° semana
3° semana
4° Semana
5° semana
6° semana
7° semana
1 0 109 3.747 1.679 108 0 0
2 0 186 1.415 3.545 15 31 0
3 0 248 3.265 1.197 15 0 0
4 0 217 1.632 1.150 0 0 0
5 0 78 1.135 1.586 590 0 0
6 62 93 4.618 - - - -
7 0 124 824 373 31 0 0
8 0 109 1.181 2.534 31 0 0
9 0 78 2.161 4.680 0 0 0
10 0 62 2.876 3.327 0 - -
11 31 78 1.057 6.997 - - -
12 0 93 1.135 2.814 0 0 0
( - ) óbito. Fonte: dados da pesquisa
Figura 39 - Níveis parasitêmicos individuais (n = 12) observadas em camundongos BALB/c
inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi – Grupo BZN (Fase aguda).
Fase aguda - BZN
1° s
eman
a
2° s
eman
a
3° s
eman
a
4° s
eman
a
5° s
eman
a
6° s
eman
a
7° s
eman
a
0
1
2
3
41
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Animal
semana pós-infecção
para
sit
os/m
l san
gu
e (
M lo
g)
Fonte: dados da pesquisa.
71
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Tabela 6 - Número de parasitos do Grupo BZN em camundongos BALB/c inoculados com [102 formas] da cepa Y de T. cruzi.
Grupo BZN
(animal)
1° semana
2° semana
3° semana
4° semana
5° semana
6° semana
7° semana
1 0 155 1.477 668 575 0 0
2 0 217 917 513 31 15 0
3 0 186 1.104 1.772 1.057 0 0
4 0 140 2.379 1.399 48 0 0
5 0 326 5.909 3.980 - - -
6 0 171 2.037 4.773 - - -
7 0 93 995 1.959 0 0 0
8 15 124 1.290 1.275 699 0 0
9 0 109 1.415 4.618 140 0 0
10 15 311 1.275 - - - -
11 0 62 1.057 3.234 0 0 0
12 0 93 840 964 217 0 0
( - ) óbito. Fonte: dados da pesquisa
A imunossupressão altera o desenvolvimento natural da enfermidade,
predeterminando o desenvolvimento ou reativação de infecções oportunistas, com
especial a doença de Chagas (COSTA, 2000). Neste caso, ocorre a reativação da
doença com o aumento da parasitemia, a qual pode ser detectada por exame
parasitológico de sangue direto (parasitemia), mesmo sem a demonstrar sinais
clínicos (SATORI, 1995). Assim, o presente protocolo experimental, buscou incluir
fase de imunossupressão para a garantia de uma fase crônica da doença, após
negativação da parasitemia.
Perante tal proposta de ensaio, foi observada a presença de formas
tripomastigotas móveis no sangue periférico de cinco animais do grupo controle
positivo após a imunossupressão, sendo encontrado parasito em dois animais, na
17° semana do protocolo e em três animais na 18° semana do mesmo, isto é 7 e 14
dias após a imunossupressão. Não foram encontradas formas tripomastigotas após
imunossupressão nos grupos tratados com NFOH e BZN (figura 40), o que significa
ação dos compostos sob a fase crônica da doença de Chagas.
72
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 40 - Acompanhamento parasitêmico durante fase aguda, fase crônica (tratamento 60 dias) e imunossupressão (Balb/c - cepa Y de T. cruzi).
Fonte: dados da pesquisa.
73
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Durante a fase aguda da doença, sem tratamento, houve três mortes em cada
um dos três grupos (controle positivo, NFOH e BZN). Durante os dias de tratamento
(fase crônica) não foram registrados óbitos em qualquer grupo analisado. Já em
estudos realizados por Davies e colaboradores (2010) utilizando as mesmas
concentrações, apontam taxa de letalidade de 66% no controle positivo, 33% no
grupo tratado com BZN e 16% com NFOH e 75% com NF. No penúltimo dia (131°
dia pós-infecção), isto é, 13° dia de imunossupressão houve óbito de um
camundongo do grupo NFOH e outro do grupo BZN. Estas mortes estão descritas
como esperadas, segundo a literatura, que relata de 6 – 25% de óbitos durante a
imunossupressão (ANDRADE et al., 1997).
Ao final de 19 semanas de acompanhamento dos animais do grupo controle
positivo, verifica-se redução de motilidade (movimentos de andar e levantar para se
alimentar), perda de peso, piloereção e sugerindo debilidade física geral do animal.
Este efeito deve-se provavelmente, à redução do consumo de alimentos, os quais
foram ocasionados pela reativação da doença por imunossupressão. Os animais do
grupo controle negativo não sofreram óbitos e passaram a perder peso apenas no
período de imunossupressão induzida farmacologicamente.
Antes da infecção todos os animais apresentaram peso corporal similar (19 –
22 g). A tabela 7 apresenta a média dos pesos dos animais e do consumo de ração
verificadas semanalmente durante todo o protocolo.]
A avaliação feita neste ensaio demonstra diferença estatística, na primeira
semana, entre o grupo controle negativo (branco) e o grupo BZN, sendo o primeiro
grupo com maior média de peso e consumo de ração. Entretanto não houve
diferença estatística durante a 2°- 3° semana nos grupos analisados.
74
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Tabela 7 - Avaliação da média do peso corporal (g) ± desvio padrão, ração (g) dos grupos avaliados durante a fase aguda, sem tratamento (1°
- 7° semana), ao longo da fase crônica, com tratamento (8° - 16° semana), e imunossupressão (17° - 19° semana).
Fonte: dados da pesquisa.
Semanas
Controle Negativo
(Média ± Desvio
Padrão)
Sem infecção
Ração
(Média)
Controle Positivo
(Média ± Desvio
Padrão)
Com infecção
Ração
(Média)
NFOH (Média ±
Desvio Padrão)
Ração
(Média)
BNZ (Média ±
Desvio Padrão)
Ração
(Média)
1 22,2 ± 2,19 34,36 20,75 ± 1,25 20,25 21,20 ± 1,87 19,83 19,47 ± 1,53 22,25
2 24,8 ± 2,31 33,27 25,91 ± 1,89 17,5 26,11 ± 2,13 19,91 24,72 ± 1,71 19,75
3 26 ± 2,85 34,09 23,83 ± 2,49 15,66 24,2 ± 2,84 18,36 23,2 ± 2,32 15
4 27,3 ± 3,06 32,63 22,2 ± 3.02 17,27 22,1 ± 3,76 15,91 21,76 ± 2,75 21,9
5 28,6 v 3,03 31,72 22,26 ± 4,3 22,4 20,89 ± 3,97 34,2 21,91 ± 2,58 33,77
6 29,2 ± 2,96 32,54 23,54 ± 5,03 26,2 22,69 ± 4,3 32,3 24,12 ± 2,26 36
7 29,6 ± 2,65 35 24,51 ± 2,72 23,44 24,01 ± 3,01 32,11 24,65 ± 1,77 33,11
8 30,2 ± 2,9 30,81 26,17 ± 2,65 27,77 26,37 ± 3,06 39,66 26,2 ± 2,2 41,66
9 30,2± 2,87 32,36 26,68 ± 2,37 32,77 26,61 ± 2,66 33,22 26,67 ± 1,69 34,22
10 30,1 ± 2,96 31,36 27,3 ± 1,99 26,66 27,06 ± 2,65 29,77 26,67 ± 2,18 28,11
11 30 ± 2,63 32,9 26,81 ± 1,97 20,77 27,33 ± 2,25 25,33 26,13 ± 1,95 17,77
12 30,7 ± 3,06 36,45 27,96 ± 1,8 24,44 28,54 ± 2,34 24 26,73 ± 2.88 25,55
13 31,3 ± 2,58 37,72 28,22 ± 1,33 34,66 29,01 ± 2,17 36 27,86 ± 2,11 28,77
14 32,1 ± 2,65 37,1 28,97 ± 1,61 33,22 30,2 ± 2,06 36,44 28, 24 ± 1,81 37,11
15 30,75 ± 2,18 36,5 28,65 ± 1,43 32,44 30,36 ± 2,28 34,44 27,83 ± 1,55 34,22
16 33,93 ± 2,03 29 29,12 ± 1,75 25,11 30,18 ± 2,29 36,11 28,33 ± 1,55 36
17 34,38 ± 2,06 34,3 26,4 ± 1,69 31,33 27,4 ± 1,87 31,77 26,3 ± 1,42 28
18 31,18 ± 2,32 28,6 25,3 ± 1,55 16,77 26 ± 1,67 27,33 25,5 ± 1,38 20,44
19 31,25 ± 1,72 * 25,5 ± 1,56 - 26,2 ± 1,9 - 24,5 ± 1,41 -
Imunossupressão
-
Pós-Tratamento
Fase Crônica -
Com Tratamento
Fase Aguda -
Sem Tratamento
75
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Ao longo de oito semanas consecutivas (4-11° semana) foi constatado
diferença estatísticamente significante entre o grupo controle negativo e os demais
grupos, assim como na 13° semana. Muito provavelmente, devido aos níveis de
parasitos no sangue os quais em humanos, podem ou não causar sintomas como
febre, náuseas e vomito, perda de peso e de apetite. (BAHIA et al., 2014; TIMM et
al., 2014).
Na 12° semana, quinta semana de tratamento, o grupo NFOH demonstrou
tendência a equalizar seus resultados com o grupo controle negativo, a qual se
mostrou mais evidente, ao final do experimento, com o surgimento de diferença
estatisticamente significante entre os grupos NFOH e BZN, em relação ao peso e ao
consumo de ração, sendo constatada uma maior média no peso dos animais do
grupo NFOH em relação ao grupo BZN, assim como o consumo de ração, sugerindo
que maior recuperação do estado físico dos animais tratados com NFOH.
O peso relativo representa a porcentagem da diferença de peso inicial e final.
Neste contexto, não houve diferença estatística entre os grupos NFOH, BZN,
controle negativo e positivo, (figura 41). Porém, apesar da semelhança nos pesos
relativos entre os grupos, observou-se macroscopicamente que os órgãos dos
animais do grupo NFOH aparentavam-se mais saudáveis (ausência de manchas e
deformações) em relação aos demais grupos.
Figura 41 - Média e desvio padrão do peso relativo corporal dos camundongos BALB/c infectados com 102 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do T cruzi
e tratados com NFOH e BZN.
Contr
ole p
ositiv
o
contr
ole n
egat
ivo
NFO
HBZN
0
10
20
30
40
Peso relativo
Po
rcenta
gem
Fonte: dados da pesquisa.
76
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Os animais tratados com BZN apresentaram uma piloereção mais acentuada
em relação aos demais grupos (inclusive em relação ao grupo controle positivo)
assim como letargia, contrações abdominais, desorientações do SNC e aparências
físicas gerais debilitadas, características essas expressas, também, em alguns
animais do grupo controle positivo e ausentes no grupo tratado com NFOH e
controle negativo. Estes dados corroboram com Castro & Diaz (1988) que
observaram efeitos adversos do BZN durante tratamento clínico em pacientes na
fase aguda e crônica da Doença de Chagas, tais como anorexia e perda de peso
corpóreo, náuseas e vômitos, excitação nervosa, insônia, depressão psique,
convulsões, vertigem, dor de cabeça, sonolência, mialgias, artralgias, perda de
equilíbrio, desorientação, esquecimento, parestesias, adinamia, neuropatias
periféricas, gastralgia, edema da mucosa, manifestações cutâneas e intolerância ao
álcool.
A seguir estão apresentados os resultados dos pesos relativos as análises
macroscópicas e histopatológicas de cada órgão estudado,
BAÇO:
O baço possui papel importante na resposta imune e remoção do T. cruzi,
sendo ao mesmo tempo alvo e componente ativo de resistência à infecção pelo T.
cruzi, maior e mais complexo órgão linfoide secundário do organismo em mamíferos,
(OLIVIERI et al., 2002; REECE, 2006). A figura 42 mostra os pesos relativos do
baço após o tratamento com NFOH e BZN.
77
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 42 - Média e desvio padrão do peso relativo do baço (cepa Y de T.cruzi).
Peso relativo - Baço
contr
ole p
ositiv
o
contr
ole n
egat
ivo
NFO
HBZN
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0a/b
aa
Po
rcenta
gem
(a) = estatisticamente diferente controle negativo; (b) estatisticamente diferente dos grupos NFOH e.BZN.
Fonte: dados da pesquisa.
Segundo a literatura, a infecção por T.cruzi, na fase crônica da doença,
ocasiona um aumento no volume do baço, devido à resposta imunológica crônica
durante tal enfermidade (ANDRADE et al., 2003; PEREIRA et al., 2002; PEREIRA et
al., 1999), o que explica o aumento no baço dos animais controle positivo.
O grupo controle negativo apresenta uma média do peso relativo do baço
significativamente inferior em relação aos grupos controle positivo, NFOH e BZN.
Estes resultados são esperados para o controle negativo, tendo em vista que os
mesmos não foram infectados (FRANCISCO, 2007, PEREIRA, et al., JELICKS &
TANOWITZ , 2011).
O peso relativo dos baços nos grupos NFOH e BZN demonstrou-se menor
quando comparados com o controle positivo, entretanto, foi possível observar
diferença estatisticamente significativa apenas entre o grupo controle positivo e o
grupo NFOH, o qual apresenta a menor média relativa dos pesos dos baços entre os
grupos controle positivo e BZN.
O peso relativo do baço variou de 0,405 a 0,854% no grupo controle positivo,
0,253 a 0,348% no grupo controle negativo, sendo esta variação de 0,408 a 0,602%
e 0,469 a 0,655% para os grupos NFOH e BZN, respectivamente.
78
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
A figura a seguir mostra esplenomegalia nos grupos controle positivo e BZN
quando comparados ao grupo NFOH e controle negativo, observadas durante a
análise macroscópica, sendo a ordem dos grupos em relação ao tamanho do baço:
controle positivo > BZN > NFOH > controle negativo (figura 43).
Figura 43 - Analise macroscópica dos baços analisados (cepa Y de T.cruzi)..
(A) = grupo controle positivo; (B) = NFOH; (C) = BZN; (D) = grupo controle negativo; Fonte: dados da pesquisa.
As análises histopatológicas dos baços também mostraram resultados
promissores (figura 44):
79
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 44 - Análise histopatológica do baço dos animais infectados com a cepa Y de T.cruzi e submetidos ao tratamento com NFOH e BZN, coloração hematoxilina/eosina.
Análises histológicas - baço (cepa Y de T. cruzi)
Cápsula
Espessa/Norm
al/Delg
ada
Polpa B
ranca
Polpa V
ermelh
a
Zona marg
inal
Org
anização d
os folíc
ulos
0
1
2
3
4Controle Positivo - cepa Y
NFOH
BZN
Controle negativo
* * *
* * *
*
* *
*
*
**
* *
*
** **
** **
****
** ******
*C
odifi
caçã
o p
ara
aná
lise
est
atís
tica
(*) = estatisticamente diferente do grupo controle negativo; (**) = estatisticamente diferente do controle positivo; (***) = estatisticamente diferente do grupo NFOH. Codificação para análise histopatológica = anexo 5.
Fonte: dados da pesquisa.
80
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
A cápsula fibroso-elástica não demonstrou diferença entre os grupos
infectados, apresentando-se integra e hipertrófica com pouca ou nenhuma presença
de abscessos subcapsulares.
Este tecido esplênico é dividido em polpa branca e polpa vermelha. A polpa
vermelha é formada por cordões esplênicos, cujo sua função é a destruição de
hemácias defeituosas ou velhas (120 dias) (JUNQUEIRA, 2004; MCGAVIN &
ZACHARY, 2012; GUYTON & HALL, 2006). A polpa branca formada por tecido
linfoide, onde os linfócitos são produzidos e armazenados (MEBIUS & KRAAL,
2005).
Na região da polpa branca, verificou-se que o grupo controle positivo
apresentou polpa reduzida, a qual foi estatisticamente diferente dos grupos NFOH e
BZN, que demonstraram polpa branca aumentada em relação aos controles
negativo e positivo. Este resultado foi corroborado pela análise da polpa vermelha,
que apresentou resultados espelhados, manifestando aumento na região da polpa
vermelha no grupo controle positivo e reduzida nos grupos NFOH e BZN.
Na análise de folículos linfoides, observou-se organização em ordem
crescente para os grupos: Controle positivo < BZN < NFOH = Controle negativo
O grupo controle positivo, todos os animais apresentaram-se com folículos
desorganizados, BZN, 50% desorganizado e 50% organizados, comparados com os
NFOH e controle negativo, todos os animais com folículos organizados.
Não foi observado a presença de granulomas, congestão vascular, presença
de ninhos amastigotas ou alterações em trabéculas de tecidos conjuntivo durante a
análise no tecido esplênico (fibras elásticas + vasos linfáticos + vasos sanguíneos +
nervos). A seguir as imagens da análise histopatológica com aumento de 10X (figura
45).
Figura 45 – Imagens da análise histopatológica do baço dos grupos controle positivo, NFOH, BZN e controle negativo (cepa Y de T.cruzi).
(A) = grupo controle positivo com desorganização dos folículos e aumento da polpa vermelha (10X); (B) = grupo NFOH com folículos organizados e diminuição da polpa vermelha (10X); (C) = grupo BZN
com folículos meramente organizados e diminuição da polpa vermelha (10X); (D) = grupo controle negativo com polpas normais e folículos organizados (10X).
Fonte: dados da pesquisa.
81
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
CORAÇÃO
A análise histopatológica do tecido cardíaco é de extrema importância para
este trabalho, pois o coração é um dos órgãos mais atingidos por T.cruzi,
principalmente a cepa Y. Brener e colaboradores (2000) observaram acentuadas
lesões inflamatórias, tanto na fase aguda como crônica, variando de grau leve,
moderado e intenso, e parasitismo cardíaco.
Conforme descrito por Dickerson et al. (2014), Tassi et al. (2014), Marin-
Neto et al. (2006) e Anderson et al. (2003) a fibrose miocárdica é diretamente
proporcional às disfunções ventriculares, consequentemente, aumenta as arritmias
cardíacas, os quais podem levar ao aumento do volume tecidual. Os resultados
observados para o peso médio relativo do coração não foi estatisticamente
diferente para todos os grupos apesar do grupo controle positivo possuir a maior
variação (figura 46).
Figura 46 - Média e desvio padrão do peso relativo do coração (cepa Y de T. cruzi).
Peso Relativo - Coração
Con
trole p
ositivo
cont
role n
egat
ivo
NFO
HBZN
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Po
rcenta
gem
Fonte: dados da pesquisa.
82
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Entretanto, todos os grupos infectados apresentaram hipertrofia na
musculatura cardíaca quando comparadas ao grupo controle negativo, que não
possui infecção e suas células musculares do coração apresentam-se normais. Na
análise de infiltrados inflamatórios, todos os grupos infectados expressaram-se de
maneira crônica e leve (tipo/intensidade), sendo estatisticamente significante em
relação ao grupo controle negativo, o qual não possui infiltrado inflamatório (figura
47).
83
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 47 - Análise histopatológica do coração dos animais infectados com a cepa Y de T.cruzi e submetidos ao tratamento com NFOH e BZN, coloração hematoxilina/eosina.
Análises histológicas - coração (cepa Y de T. cruzi)
Hipertr
ofia
Infla
mação ti
po
Infla
mação in
tensid
ade
Aglom
erados/in
filtra
do difu
so
Infil
trado in
flam
atório
no p
ericard
io
Presença d
e am
astigota
s
Calcifi
cação
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5controle positivo
NFOH
BZN
controle negativo
* * *
* * * * * * ** *
* **
** **
******
***
Cod
ifica
ção
para
aná
lise
esta
tístic
a
(*) = estatisticamente diferente do grupo controle negativo; (**) = estatisticamente diferente dos grupos NFOH; (***) = estatisticamente diferente do grupo controle positivo. Codificação para análise histopatológica= anexo 5.
Fonte: dados da pesquisa...
84
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Na pericardite crônica constritiva, observa-se a presença de calcificação
pericárdica, diagnosticada por eletrocardiograma ou por estudo histopatológico
(BUYSSCHAERT et al, 2012). Neste experimento, foi observada a presença de
calcificação distrófica, pós-necrose, muito semelhante ao quadro de pericardite
crônica constritiva. Foram encontrados em 4/9 animais do grupos controle positivo,
2/8 animais do grupo NFOH e 1/8 animais do grupo BZN sendo ausente no grupo
controle negativo. Estes resultados sugerem que os danos cardíacos causados pelo
parasito pode ter sido agravado durante a fase crônica da doença, o qual não
ocorreu nos grupos tratados com NFOH e BZN, sendo estes estatisticamente
significantes quando comparado ao grupo controle positivo.
Já as presenças de ninhos amastigotas foram encontrados em 5/9 animais
dos grupos controle positivo, 4/8 animais do grupo BZN, apenas 1/8 animais do
grupo NFOH e ausente no grupo controle negativo. Ressalta-se que nos grupos
controle positivo e BZN foram encontrados mais de um nicho de amastigotas
enquanto que no grupo NFOH foi encontrado apenas 1 amastigota (não observado a
presença de nichos) na região próximo à calcificação distrófica. A figura 48 mostra
as fotografias dos corações.
Figura 48 – Imagens da análise histopatológica do coração dos grupos controle positivo, NFOH, BZN. e controle negativo (cepa Y de T.cruzi).
(A) = grupo controle positivo com presença de ninhos amastigotas (seta) e células cardíacas hipertróficas; (B) = grupo NFOH com ausência de ninhos amastigotas e células cardíacas
hipertróficas; (C) = grupo BZN células cardíacas hipertróficas (D) = grupo NFOH com ausência de ninhos amastigotas e células cardíacas saudáveis.
Fonte: dados da pesquisa.
85
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
COLÓN
O peso relativo dos cólons não foi considerado, tendo em vista a variação
entre os animais devido à presença de fezes, o qual interefere nos resultados finais.
Porém, durante protocolo experimental foi realizado o acompanhamento de todos
animais, observando-se macroscopicamente a presença de inflamação e inchaço na
região anal , como observado por OLIVEIRA, et al., 2008, por destruição do plexo
mioentérico intestinal.
Durante o processo de infecção, dois animais apresentaram esta alteração
(figura 49). Um animal, sem tratamento, foi à óbito enquanto o outro animal recebeu
tratamento com NFOH. Este animal não veio a óbito durante toda a fase
experimental, sendo possível observar melhora e cura da região do plexo. O mais
interessante deste resultado foi a observação histopatológica, o qual mostrou a
presença de nichos amastigotas ao longo do plexo mesentérico tanto do grupo
controle positivo quanto do BZN, mas não para o grupo NFOH.
Figura 49 - Acompanhamento macroscópico, que sugere alteração no trato gastrointestinal seguido de tratamento da área inflamada após tratamento com
NFOH (imagens do mesmo animal).
Fonte: dados da pesquisa.
A figura a seguir mostra os resultados da análise histopatológica dos cólons
analisados (figura 50).
86
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 50 - Análise histopatológica do colón dos animais infectados com a cepa Y de T.cruzi e submetidos ao tratamento com
NFOH e BZN, coloração hematoxilina/eosina..
Análises histológicas - colon (cepa Y de T. cruzi)
Mucosa
Submucosa - infilt
rado infla
m.
Submucosa - conjuntiv
açãoGALT
Camada muscular li
sa
Quantidade de ninhos amastig
otas0
1
2
3
4 Controle positivo
NFOH
BZN
Controle negativo
*
**
Codi
ficaç
ão p
ara
análi
se e
statís
tica
(*) = estatisticamente diferente do controle negativo; (**) = estatisticamente diferente dos grupos NFOH, BZN e controle negativo. Codificação para análise histopatológica= anexo 5.
Fonte: dados da pesquisa.
87
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Os resultados demonstraram não haver diferença na análise do tecido
conjuntivo submucoso, que se apresentou como de característica frouxa (normal)
em todos os grupos. Na análise do infiltrado inflamatório submucoso, observou-se
características misto e leve em todos os grupos, embora o controle positivo tenha
apresentado ligeira maior intensidade, em consonância com a literatura (PAIVA et
al., 2014).
A análise do GALT, tecido linfoide associado ao intestino, os grupos BZN e
controle positivo demonstraram desorganização dessa estrutura em graus variáveis
e superior aos grupos NFOH e controle negativo, mas sem diferença estatística. Em
apenas um animal, observamos atrofia epitelial associada à região de GALT (G3.1,
BZN), mas também sem diferença estatística. Na túnica serosa, o conjuntivo
apresentou-se descolado em todos os grupos analisados. Na mesma região,
analisamos os vasos que se demonstraram, em sua maioria, sem estase,
novamente sem diferença estatística entre os grupos.
A musculatura lisa mostrou hipertrófica em todos os grupos infectados em
praticamente todos os animais, e normal nos animais do grupo controle negativo.
Por fim, analisando a presença de macrófagos, todos os animais apresentaram
macrófagos na região de túnica serosa.
Por outro lado, foi observado diferença estatisticamente significativa quanto à
presença de atrofia/hipertrofia do epitélio da mucosa. Verificou-se que NFOH
apresentou epitélio com mais hipertrofia quando comparado com o grupo controle
negativo (mucosa normal). Os grupos controle positivo e BZN apresentaram mucosa
mais atrófica em relação aos demais grupos (figura 51). Segundo dados obtido por
Silveira et al. (2007), Nascimento et al. (2010) e Fonseca et al. (2014) detectaram
atrofia e metaplasia na mucosa intestinal de animais e pacientes cronicamente
infectados pela doença de Chagas, e com evolução clinica gastrointestinal
(megacolon). Do mesmo modo, Barbosa et al. (1993) relatou atrofia na mucosa de
47% dos pacientes com manifestação digestiva da doença, assim como 15% nos
estudos realizados por Fonseca et al. (2014). Em contraste, porém na fase
indeterminada da doença, Oliveira e colaboradores (1997) não encontraram atrofia e
metaplasia intestinal em pacientes chagásicos.
88
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 51 – Imagens da análise histopatológica do colón dos grupos controle positivo, NFOH, BZN e controle negativo (cepa Y de T.cruzi).
(A) = grupo controle positivo (5X), atrofia da mucosa e ninhos amastigotas (seta); (B) = grupo controle positivo (40X), atrofia da mucosa e ninhos amastigotas (seta); (C) = grupo NFOH, hipertrofia da
mucosa (5X); (D) = grupo NFOH, hipertrofia mucoso (10X); (E) = grupo BZN, atrofia mucosa (10X); (F) = grupo BZN, atrofia mucosa (40X); (G) = grupo controle negativo com mucosa normal (5X); (H) =
grupo controle negativo com estruturas normais (10X); Fonte: dados da pesquisa.
Ao analisar a presença de carga parasitária no tecido (colón) observou-se
que apenas o grupo controle positivo apresentou ninhos de amastigotas, sendo
ausentes nos demais grupos analisados.
FÍGADO
Houve diferença estatística significativa quando comparamos a média do
peso relativo do fígado dos grupos BZN e controle negativo aos demais grupos
analisados, sendo estes os grupos com as menores médias em relação ao peso
relativo do fígado (figura 52). Do mesmo modo Francisco (2007) também observou
diminuição no peso relativo do fígado de animais tratados com BZN (100
mg/kg/dia) durante 21 dias quando comparados com o grupo controle positivo. No
entanto, todos os pesos relativos dos fígados analisados estão acima do esperado
pela literatura, sendo estes maiores que 4,096% ± 0,296 respectivamente, dados
estes do grupo controle negativo, sem imunossupressão, obtido por Rui et al.
89
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
(2011), resultados que diferem do controle negativo, o qual foi submetido à
imunossupressão.
Figura 52 - Média e desvio padrão do peso relativo do fígado (cepa Y de T.cruzi).
Peso relativo - fígado
Con
trole p
ositivo
cont
role n
egat
ivo
NFO
HBZN
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
a
a
Po
rcenta
gem
Fonte: dados da pesquisa.
As análises histopatológicas dos fígados encontram-se na figura 53, os quais
constataram manutenção da estrutura geral e a presença de sinusóides hepáticos
em todos os grupos. Os hepatócitos também se apresentaram normais, mas em
algumas regiões isoladas, verificou-se picnose (diminuição do núcleo), em todos os
grupos.
Observou-se em todos os grupos analisados, uma ligeira presença de
infiltrado inflamatório agudo, com diferença estatística significativa na presença de
infiltrado inflamatório crônico, em que o grupo controle positivo exibiu maiores
números de infiltrados crônicos quando comparado aos demais grupos. Do mesmo
modo, a presença de infiltrado inflamatório misto também foi observada em maior
frequência nos grupos controle positivo e NFOH, sendo ausente no controle negativo
(figura 53)
90
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 53 - Análise histopatológica do fígado dos animais infectados com a cepa Y de T.cruzi e submetidos ao tratamento com NFOH e BZN, coloração hematoxilina/eosina.
Análises histológicas - fígado (cepa Y de T.cruzi)
Picnose
Lipid
ose
Infilt
rado
s Agu
dos
Infilt
rado
s Crô
nicos
Infilt
rado
s M
istos
Prese
nça d
e nin
hos am
astig
otas
0
2
4
6
Controle positivo - cepa Y
NFOH
BZN
Controle negativo
*
** **
******
Cod
ifica
ção
para
aná
lise
esta
tístic
a
(*) = estatisticamente diferente dos grupos NFOH, BZN e controle negativo; (**) = estatisticamente diferente dos Grupos BZN e controle negativo; (***) = estatisticamente diferente dos grupos NFOH e controle negativo. Codificação para análise histopatológica= anexo 5.
Fonte: dados da pesquisa..
91
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Merece realçar que a concentração em mg/mmol de NFOH administrada
diariamente neste protocolo foi cerca de três vezes maior em relação ao BZN, como
descrito anteriormente em nosso protocolo (Davies et al., 2010). O BZN, quando
administrado, sob as mesmas concentrações do NFOH (150 mg/kg/dia), tanto para
21 dias quanto para 60 dias de tratamento, demonstrou-se mais agressivo ao tecido
hepático e o NFOH apresentou ligeiro acúmulo de gordura no fígado, quando
comparado com o BZN (DAVIES et al., 2014), confrontando com os resultados
obtidos neste trabalho em que os hepatócitos demonstraram acúmulos de gordura
em células esporádicas e não foram observadas áreas de necrose. Em todos os
grupos verificou-se congestão na região de espaço porta e veia centrolobular.
Para a presença de ninhos de amastigotas, verificou-se a presença nos
grupos controle positivo e BZN, o que não foi evidenciado nos grupos NFOH e
controle negativo. Entretanto, este resultado não se demonstrou estatisticamente
significante, embora apresente importância clínica. A figura 54 mostra as fotografias
das análises histopatológicas obtidas nos fígados
Figura 54 – Imagens da análise histopatológica do fígado dos grupos controle positivo, NFOH, BZN e controle negativo (cepa Y de T.cruzi).
.
(A) = grupo controle positivo com presença de infiltrado inflamatório crônico (40X).; (B) = grupo controle positivo com áreas de necrose (40X).; (C) grupo NFOH com infiltrado inflamatório misto
(40X).; (D) = grupo NFOH com área normal (40X).; (E) = grupo BZN com área normal (40X); (F) = grupo BZN com área normal(40X); (G) = grupo controle negativo, hepatócitos normais (10X); (H) =
grupo controle negativo sem presença de infiltrados inflamatórios. Fonte: dados da pesquisa.
92
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Para os seguintes órgãos: rins, e cérebro, foram analisados apenas os pesos
relativos e para a vesícula biliar análise macroscópico, sendo apresentados a seguir:
RINS
Na figura 55, encontram-se as médias dos pesos relativos dos rins. Os
resultados demonstram que o grupo tratado com NFOH é semelhante ao controle
negativo os quais são estatisticamente significativos quando comparado aos grupos
controle positivo e BZN, ou seja, possui um menor peso relativo de seus rins em
relação aos demais grupos. De acordo com a literatura (JELICKS & TANOWITZ,
2011), espera-se um aumento do volume renal de animais infectados cronicamente
com T.cruzi,
Figura 55 - Média e desvio padrão do peso relativo dos rins (cepa Y de T.cruzi).
Peso relativo - Rins
Con
trole p
ositivo
cont
role n
egat
ivo
NFO
HBZN
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
a/ba/b
a/b
Po
rcenta
gem
(a) = estatisticamente diferente do grupo controle negativo; (b) = estatisticamente diferente do grupo NFOH. Fonte: dados da pesquisa.
93
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
CÉREBRO
A média dos pesos relativos dos cérebros dos animais dos grupos controle
positivo e BZN são estatisticamente maiores em relação ao controle negativo, sendo
que este último não possui diferença significativa quando comparado ao grupo
NFOH. Segundo Andrade et al. (1997) a imunossupressão em animais cronicamente
infectados com T.cruzi causa uma alta taxa de lesões cerebrais, os quais podem ser
os responsáveis pela grande instabilidade no peso dos cérebro nos animais
infectados e não tratados, como é o caso do grupo controle positivo (figura 56),
dados estes que podem ser confirmados após análise histopatológica. Na figura
abaixo, observa-se a média do peso relativo do cérebro nos grupos estudados:
.
Figura 56 - Média e desvio padrão do peso relativo do cérebro (cepa Y de T.cruzi).
Peso relativo - cérebro
Con
trole p
ositivo
cont
role n
egat
ivo
NFO
HBZN
1.0
1.5
2.0
2.5
a
a
Po
rcenta
gem
(a) = estatisticamente diferente do grupo controle negativo. Fonte: dados da pesquisa.
94
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
VESÍCULA BILIAR
Durante a análise macroscópica dos fígados analisamos a presença e a
característica da vesícula biliar, a qual foi descrita como: normal (+), aumentada (++)
e aumentada divulsionando lobos hepáticos (+++). Tendo em vista que durante a
fase crônica da doença de chagas, quando esta atinge o trato gastro intestinal,
ocorre destruição das células nervosas do plexo mioentérico de seus principais
órgãos, tais como esôfago, estomago, vesícula biliar, duodeno, jejuno e/ou colón, ou
seja, dilatação dos órgãos prevalentes do sistema digestivo (MATSUDA et al., 2009).
A tabela a seguir contém as observações macroscópicas individuais da vesícula
biliar, onde o grupo controle positivo apresentou quatro animais com a vesícula biliar
aumentada e tão divulsionando lobos hepáticos, dois animais com a vesícula
aumentada e três animais normais (tabela 8). O NFOH apresentou 100% dos
animais com normalidade neste órgão, resultado este similar ao do controle
negativo. E o grupo BZN apresentou um animal com a vesícula biliar aumentada e
outro com esta aumentada e divulsionando os lobos hepáticos.
Tabela 8 - Análise macroscópica individual da vesícula biliar por grupo analisado.
Controle positivo Controle negativo NFOH BZN
Animal Vesícula
biliar Animal
Vesícula
biliar Animal
Vesícula
biliar Animal
Vesícula
biliar
01 + 01 + 01 + 01 +
02 ++ 02 + 03 + 02 +
05 + 03 + 04 + 03 +++
06 + 04 + 05 + 04 +
07 +++ 05 + 07 + 07 ++
08 +++ 06 + 09 + 08 +
09 +++ - - 10 + 09 +
11 +++ - - 12 + 12 +
12 ++ - - - - - -
Avaliando-os em: normal (+), aumentada (++) e aumentada divulcionando lobos hepáticos (+++). Fonte: dados da pesquisa.
95
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Vale realçar a grande importância deste dado com os resultados já descritos,
a figura a seguir indica a média e desvio padrão dos grupos investigados
evidenciando a considerável diferença estatística entre o grupo controle positivo e os
grupos NFOH e controle negativo, onde os dois últimos grupos citados apresentam
todos animais com suas vesículas biliares regulares, não havendo qualquer variação
na análise realizada (figura 57), sendo a ordem dos grupos em relação ao tamanho
da vesícula biliar: controle positivo > BZN > NFOH = controle negativo.
Figura 57 - gráfico representativo da média do volume da vesícula biliar nos respectivos grupos (cepa Y de T.cruzi)..
controle
positi
vo - cepa Y
NFOHBZN
controle
negativ
o0
1
2
3
Vesícula Biliar (volume macroscópico)
* *
(*) = estatisticamente diferente do grupo controle positivo. Fonte: dados da pesquisa.
‘Os resultados macroscópicos apresentados até então, apontam equivalência
nos grupos NFOH e controle negativo quanto ao peso relativo do coração, cérebro,
baço e rins, assim como macroscopia da vesícula biliar, órgãos estes de extrema
importância clínica no quadro de evolução crônica desta doença. Desta maneira,
Após eutanásia dos animais foi obtidos o sangue dos mesmos, para então
separar o plasma biológico, sendo este utilizado para as análises bioquímicas
enzimáticas cinéticas e calorimétricas propostas.
96
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
ANÁLISES BIOQUÍMICAS
A AST, Aspartato Amino Transferase, também conhecida como TGO, catalisa
a transaminação de L-aspartato para 2-oxoglutarato gerando oxalacetato e L-
glutamato, com grande importância nos ciclos não apenas hepático, mas também,
de tecidos musculares e cardíacos. Caso a alteração tenha origem hepática, deve-
se quantificar também ALT, caso seja muscular o marcador CK pode auxiliar na
interpretação (BURTIS, ASHWOOD & BRUNS 2006).
A ALT, também conhecida como TGP (transaminase pirúvica), é uma enzima
que catalisa a transaminação da L-alanina para 2-oxoglutarato(2-cetogrutarato)
formando piruvato e L-glutamato; deste modo o piruvato pode ser consumido na
gliconeogênese além de ter papel importante no transporte de nitrogênio entre as
células. Esta transaminase é localizada preferencialmente no fígado e nos rins,
dependendo da espécie animal, devido a sua importância no metabolismo é
encontrado em menor quantidade nos demais tecidos. (KANEKO, HARVEY &
BRUSS, 2008). Com a obtenção das respectivas curvas de calibração, foi possível
determinar os valores de atividade, em U/L, das enzimas TGO e TGP
correspondentes aos grupos controle positivo, controle negativo NFOH e BZN. As
tabelas adiante apresentam, respectivamente, os valores de TGO e TGP,
individuais, medidos ao final do protocolo (tabela 9 e 10).
97
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Tabela 9 - Comparação entre os valores de TGO dos grupos Controle, NFOH e NF. Valores absolutos/animal, médias e desvio padrão dos grupos.
Controle positivo Controle negativo NFOH BZN
Animal TGO
(U/L) Animal
TGO
(U/L) Animal
TGO
(U/L) Animal
TGO
(U/L)
01 * 01 * 01 143,9 01 126,75
02 102,13 02 137,13 03 101,35 02 88,07
05 * 03 129,63 04 64,42 03 *
06 * 04 109,46 05 * 04 131,5
07 139,64 05 119,15 07 159,37 07 *
08 187,17 06 123,84 09 115,13 08 95,3
09 * - - 10 110,11 09 *
11 126,75 - - 12 138,6 12 106,06
12 138,92 - - - - - -
Média 112,85 Média 123,84 Média 106,32 Média 94,15
Desvio
padrão 65,99
Desvio
padrão 10,47
Desvio
padrão 46,29
Desvio
padrão 41,39
(*) = animais cujo plasma não foi suficiente para análise. Fonte: dados da pesquisa.
Tabela 10 - Comparação entre os valores de TGP dos grupos Controle, NFOH e NF. Valores absolutos/animal, médias e desvio padrão dos grupos.
Controle positivo Controle negativo NFOH BZN
Animal TGP
(U/L)
Animal TGP
(U/L)
Animal TGP
(U/L)
Animal TGP
(U/L)
01 76,51 01 22,32 01 80,42 01 31,47
02 55,61 02 50,16 03 68,49 02 38,99
05 86,84 03 32,28 04 58 03 43,75
06 * 04 51,99 05 43,31 04 31,47
07 60,43 05 39,19 07 51,86 07 39,84
08 71,64 06 * 09 * 08 27,83
09 - - - 10 31,47 09 40,22
11 53,73 - - 12 * 12 38,14
12 - - - - - - -
Média 67,46 Média 39,19325 Média 68,15 Média 36,47
Desvio
padrão
13,06 Desvio
padrão
12,41619 Desvio
padrão
28,03 Desvio
padrão
5,5
(*) = animais cujo plasma não foi suficiente para análise. Fonte: dados da pesquisa..
98
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Em estudos realizados por Davies e colaboradores (2014) o tratamento com
NFOH (150 mg/kg/dia) durante 21 dias e 60 dias foi similar ou inferior ao grupo
positivo quanto ao estresse oxidativo, inflamação e remodelação de tecidos
hepáticos e menor quando comparado ao grupo BZN (150 mg/kg/dia) o qual também
apresentou maior toxicidade hepática, ensaio estes de hepatoxicidade (in vitro e in
vivo) realizado sob as mesmas concentrações molares.
Os resultados apresentados neste trabalho apontam que não houve diferença
estatística no marcador hepático TGO entre os grupos apresentados, e verificou-se
diferença estatística entre o grupo controle positivo e os grupos BZN e controle
negativo na análise do TGP, no entanto todos os valores (figuras 58 e 59), tanto
para TGO quanto para TGP estão dentro dos valores descritos na literatura (MELO,
2006).
Figura 58 - Média e desvio padrão do marcador hepático TGO (cepa Y de T.cruzi).
TGO
contr
ole p
ositiv
o - ce
pa Y
NFO
H (1
50 m
g/kg/d
ia)
BZN
(60
mg/k
g/dia
)
contr
ole n
egat
ivo
0
50
100
150
200
Méd
ia e
nzim
ati
ca (
U/L
)
Fonte: dados da pesquisa.
99
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
Figura 59 - Média e desvio padrão do marcador hepático TGP (cepa Y de T.cruzi).
TGP
contr
ole p
ositiv
o - ce
pa Y
NFO
H (1
50 m
g/kg/d
ia)
BZN
(60
mg/k
g/dia
)
contr
ole n
egat
ivo
0
20
40
60
80 *
Média
enzim
atica (
U/L
)
(*) = estatisticamente diferente dos grupos BZN e controle negativo. Fonte: dados da pesquisa.
Melo (2006) realizou estudo de toxicidade hepática com doses múltiplas em
camundongos e em ratos. Após 60 dias de tratamento com NFOH (100 mg/kg/dia)
seus resultados não apontaram diferenças significativas nos valores da enzima TGP,
quando comparados a um grupo de animais que recebeu DMSO e água. No entanto,
houve alterações dos valores nos níveis de TGO do grupo controle DMSO e da dose
de 100 mg/kg, resultados estes fora da faixa de normalidade. Sendo assim,
presumiu-se que a seguinte alteração das enzimas pelo DMSO, e
consequentemente decisiva para os resultados obtidos pelo NFOH. Logo, sugeriu-se
a utilização do teste utilizando outro solvente, como a goma. Tendo em vista os
resultados obtidos por Melo (2006), adaptou-se para este protocolo goma arábica
5% como veículo, porém com 150 mg/kg/dia de NFOH (Davies, 2010), levando em
consideração as faixas de normalidade de TGO (77-383 U/L) e TGP (40-189 U/L)
(MELO, 2006). Considerando a concentração três vezes maior de NFOH/dia, pode-
se dizer que a administração do NFOH não altera os níveis hepáticos de TGP e
TGO em camundongos Balb/c, assim como os demais grupos estudados.
A gamaglutamiltransferase (GGT ou gama GT) é considerada um importante
marcador de lesão hepatobiliar. Embora possua maior concentração no tecido renal,
100
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
está relacionada com lesões hepáticas e biliares. Seu substrato a glutationa ainda
tem suas funções amplamente investigadas. Sua atribuição como marcador de lesão
hepático é de alta sensibilidade e baixa especificidade, uma vez que, na grande
maioria dos pacientes com doença hepática sua concentração sérica é elevada,
independentemente da causa do dano (Whitfield, 2001). Conforme apresentado na
figura 60, a média dos níveis séricos de GGT não apresenta variações significativas
para nenhum dos grupos de animais utilizados pelo estudo, demonstrando
similaridade com os dados apresentados por Machado (2013). O grupo controle
negativo não obteve plasma suficiente para esta analise.
Figura 60 - Média e desvio padrão do marcador hepático, a enzima GGT (cepa Y de T. cruzi).
GGT
contr
ole p
ositiv
o - ce
pa Y
NFO
H (1
50 m
g/kg/d
ia)
BZN
(60
mg/k
g/dia
)
0
2
4
6
8
10
Méd
ia e
nzim
ati
ca (
U/L
)
Fonte: dados da pesquisa.
A enzima creatina quinase (CK), armazenada no interior do citoplasma e
mitocôndria celular, é rapidamente liberada quando há dano muscular sendo esta
que transfere um grupamento fosfato da creatina fosfato para a adenosina trifosfato.
A CK é caracterizada como biomarcador de lesões no músculo esquelético e
cardíaco. No entanto, os avanços na quantificação da isoforma CK-MB possibilitou a
obtenção de resultados mais específicos para músculo cardíaco, devido ao fato
desse tipo de musculatura possuir níveis mais elevados de CK-MB (25- 30%)
quando comparada à esquelética (1%). Desta forma, a quantificação da CK-MB se
101
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
faz uma ferramenta mais específica para diagnóstico de infarto agudo do miocárdio.
(Aldous, 2012).
Apesar dos resultados apontarem a baixa concentração de CK-MB no grupo
BNZ em relação aos demais grupos, todos os grupos estudados não são
estatisticamente diferentes e possuem os níveis de CK-MB dentro dos parâmetros
apresentados na literatura (333.996 ± 23.193) (RUI et al, 2011; FU et al, 2014). As
médias dos níveis séricos de CK-MB obtidos pelo presente estudo estão expressas
na figura 61. O grupo controle negativo não obteve plasma suficiente para esta
analise.
Figura 61 - Média e desvio padrão do marcador cardíaco, a enzima CK-MB (cepa Y de T. cruzi).
CK MB
contr
ole p
ositiv
o - ce
pa Y
NFO
H (1
50 m
g/kg/d
ia)
BZN
(60
mg/k
g/dia
)
0
100
200
300
Méd
ia e
nzim
ati
ca U
/L
Fonte: dados da pesquisa.
Os resultados demonstram benefícios com o tratamento com o NFOH, com
vantagens em relação ao tratamento convencional com BZN. O trabalho de
Fernandes e colaboradores (2008), que trataram 80 pacientes assintomáticos
(crônicos) com BZN (5 mg/kg duas vezes ao dia, por 60 dias) Após 3 anos,
observou-se a negativação (cura) em apenas 4 pacientes, demonstrando eficácia de
5%. Os resultados deste trabalho, considerando que o coração, onde foi encontrado
1 amastigota, inferimos a cura em 7/8 animais (87%) com NFOH; 4/8 com BZN
(50%) e 4/9 controle positivo (45%), demonstrando eficiência na fase crônica, em 5%
apenas, similar ao observado por Fernandes e cols contra 42% de eficácia quando
102
Resultados e Discussão
Cauê Benito Scarim
tratado com NFOH. Além disso, o desaparecimento de amastigostas no plexo
intestinal sugere a reversão desta lesão, pelo NFOH. Assim, o NFOH possui
potencial como candidato a fármacos para continuidade dos ensaios in vivo.
103
Conclusões
Cauê Benito Scarim
5. Conclusões
Foi realizado com sucesso a padronização do modelo experimental em
camundongos Balb/c, da Doença de Chagas na fase crônica, com inoculos de 102
formas tripomastigostas de T.cruzi (cepa Y) tratamento (60 dias) e imunossupressão
com dexametasona (14 dias);
Todos os animais infectados apresentaram níveis parasitêmicos, confirmando
infecção. Ausente no grupo controle negativo;
Ao final do experimento, não se observou formas tripomastigotas após
imunossupressão nos grupos NFOH, BZN, sendo a reativação da doença,
encontrada apenas no grupo controle positivo;
No peso relativo do baço, o grupo NFOH é estatisticamente menor quando
comparado ao grupo controle positivo; e na analise histopatológica os
animais tratados com BZN mostraram-se com alterações nos folículos e distribuição
das polpas, semelhantemente ao controle positivo, enquanto os animais tratados
com NFOH mostraram comportamento normal e idem ao controle negativo;
Na análise histopatológica do coração encontrou-se ninhos amastigotas em
5/9 animais dos grupos controle positivo, 2/8 animais do BZN, 1/8 animais do NFOH
e ausentes no controle negativo. E em relação aos achados de calcificações no
tecido cardíaco, observou-se 4/9 animais do controle positivo, 2/8 do NFOH, 1/8 do
BZN e ausentes no controle negativo;
Na análise histopatológica do fígado foram encontrados ninho amastigota nos
grupos controle positivo e BZN, e estavam ausentes nos grupos NFOH e controle
negativo. O grupo controle positivo apresentou maior concentração de infiltrados
inflamatórios nos tecidos hepáticos;
Na análise histopatológica do colón apenas o grupo controle positivo
apresentou ninhos amastigotas, assim como uma mucosa mais atrófica em relação
ao NFOH. Após suposta alteração plexo mioentérico do trato gastrointestinal,
seguido de acompanhamento macroscópico e confirmação microscópica, os
resultados sugerem eficácia e tratamento desta região após tratamento com NFOH;
104
Conclusões
Cauê Benito Scarim
Na análise do peso relativo dos rins os grupos NFOH e controle negativo são
estatisticamente menores em relação aos grupos controle positivo e BZN;
Na análise do peso relativo dos cérebros o grupo controle negativo é
estatisticamente menores em relação aos grupos controle positivo e BZN;
Observou durante análise macroscópica da vesícula biliar que o grupo NFOH não
apresentou irregularidades em nenhum animal, resultado similar ao controle negativo,
enquanto foi observado aumento deste órgão em 66% e 25% dos animais grupo controle
positivo e BZN, respectivamente;
Os ensaios bioquímicos não demonstraram diferenças nas análises de TGO,
GGT e CK-MB. Para a enzima TGP observou aumento no grupo controle positivo em
relação aos grupos controle negativo e BZN;
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123
Anexos
Cauê Benito Scarim
7. Anexos
Anexo 1 - Análise Macroscópica dos órgãos analisados por animal, estes em comprimento x
largura x altura (cm). Grupo controle positivo - cepa Y.
Grupo
Controle
Positivo
(animal)
Fígado Baço Coração Rim Cérebro Cólon
Musculo
Esquelét
ico
01 2,2 x 3,0
x 0,8
1,5 x 0,5
x 0,3
0,9 x 0,6
x 0,6
1,1 x 0,6
x 0,6
1,4 x 1,0
x 0,5
5,9 x 0,4
x 0,3
2,7 x 1,2
x 0,6
02 2,3 x 2,9
x 1,1
1,5 x 0,6
x 0,3
1,1 x 0,6
x 0,6
1,1 x 0,6
x 0,5
1,1 x 0,9
x 0,7
5,3 x 0,3
x 0,3
1,6 x 0,8
x 0,8
05 3,0 x
2,3 x 1,1
1,8 x 0,6
x 0,2
1,0 x 0,6
x 0,6
1,3 x 0,8
x 0,6
1,1 x 0,9
x 0,6
6,0 x 0,3
x 0,3
1,7 x 1,1
x 1,0
06 2,2 x 2,9
x 1,2
1,9 x 0,7
x 0,4
1,0 x 0,6
x 0,6
1,2 x 0,7
x 0,6
1,1 x 1,0
x 0,7
5,4 x 0,3
x 0,3
2,4 x 1,2
x 0,8
07 2,2 x 2,4
x 1,3
1,7 x 0,5
x 0,2
1,0 x 0,6
x 0,6
1,0 x 0,5
x 0,6
1,2 x 1,0
x 0,7
5,7 x 0,3
x 0,3
1,5 x 1,0
x 0,7
08 1,8 x 2,3
x 1,4
1,7 x 0,6
x 0,3
1,0 x 0,5
x 0,7
1,2 x 0,7
x 0,7
1,2 x 1,0
x 0,6
5,0 x 0,4
x 0,3
2,0 x 1,1
x 0,9
09 2,3 x 2,5
x 1,6
2,1 x 0,7
x 0,3
1,0 x 0,6
x 0,7
1,2 x 0,7
x 0,5
1,1 x 1,0
x 0,7
6,3 x 0,3
x 0,3
2,6 x 1,3
x 0,9
11 1,9 x 1,6
x 1,5
1,7 x 0,5
x 0,3
0,9 x 0,5
x 0,5
1,0 x 0,6
x 0,5
1,2 x 1,0
x 0,7
6,9 x 0,4
x 0,4
2,2 x 1,0
x 1,0
12 2,2 x 2,1
x 1,1
1,8 x 0,7
0,4
0,9 x 0,6
x 0,5
1,1 x 0,6
x 0,6
1,1 x 1,0
x 0,7
5,2 x 0,4
x 0,4
2,0 x 1,1
x 0,7
Fonte: dados da pesquisa.
124
Anexos
Cauê Benito Scarim
Anexo 2 - Análise Macroscópica dos órgãos analisados por animal, estes em
comprimento x largura x altura (cm). Grupo NFOH - cepa Y.
Grupo
NFOH
(animal)
Fígado Baço Baço Coração Rim Cérebro Cólon
Musculo
Esqueléti
co
01
2,3 x
2,0 x
1,1
1,4 x
0,5 x
0,2
1,6 x
0,6 x
0,3
0,9 x
0,6 x
0,6
0,9 x
0,5 x
0,5
1,1 x
0,9 x
0,6
6,0 x
0,4 x
0,3
2,4 x
1,1 x
0,7
03
2,4 x
1,8 x
1,4
1,2 x
0,5 x
0,2
1,5 x
0,5 x
0,3
0,9 x
0,5 x
0,5
1,0 x
0,6 x
0,5
1,2 x
1,0 x
0,7
6,8 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,1 x
0,7
04
2,6 x
1,9 x
1,2
1,5 x
0,6 x
0,3
1,6 x
0,5 x
0,3
0,8 x
0,5 x
0,7
1,0 x
0,5 x
0,5
1,1 x
0,9 x
0,7
5,4 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,2 x
0,8
05
2,4 x
1,5 x
1,4
1,6 x
0,4 x
0,2
1,6 x
0,6 x
0,3
0,9 x
0,5 x
0,6
1,0 x
0,5 x
0,5
1,2 x
1,1 x
0,5
5,5 x
0,3 x
0,3
1,6 x
0,9 x
0,7
07
2,5 x
2,0 x
1,7
1,6 x
0,4 x
0,2
1,6 x
0,6 x
0,3
0,8 x
0,5 x
0,6
1,1 x
0,7 x
0,4
1,2 x
1,0 x
0,7
5,0 x
0,3 x
0,3
1,7 x
1,2 x
0,7
09
1,7 x
1,9 x
1,4
1,6 x
0,5 x
0,3
1,6 x
0,5 x
0,2
0,9 x
0,6 x
0,6
1,2 x
0,7 x
0,5
1,1 x
1,0 x
0,7
4,5 x
0,3 x
0,3
2,3 x
1,5 x
0,7
10
2,2 x
2,3 x
1,5
1,5 x
0,5 x
0,3
1,6 x
0,5 x
0,2
0,9 x
0,6 x
0,6
1,0 x
0,6 x
0,5
1,2 x
1,2 x
0,6
5,0 x
0,4 x
0,4
1,7 x
1,1 x
0,7
12
2,3 x
1,8 x
1,2
1,5 x
0,5 x
0,3
1,6 x
0,6 x
0,3
0,9 x
0,6 x
0,7
1,0 x
0,5 x
0,5
1,2 x
1,1 x
0,6
5,9 x
0,4 x
0,4
1,8 x
1,2 x
0,7
Fonte: dados da pesquisa.
125
Anexos
Cauê Benito Scarim
Anexo 3 - Análise Macroscópica dos órgãos analisados por animal, estes em
comprimento x largura x altura (cm). Grupo BZN - cepa Y.
Grupo
BZN
(animal)
Fígado Baço Baço Coração Rim Cérebro Cólon
Musculo
Esquelé
tico
01
2,3 x
1,9 x
0,9
1,6 x
0,6 x
0,3
1,4 x
0,5 x
0,2
0,9 x
0,5 x
0,5
1,0 x
0,6 x
0,5
1,1 x
1,0 x
0,6
6,5 x
0,2 x
0,2
2,4 x
1,5 x
1,0
02
2,0 x
1,6 x
1,0
1,5 x
0,5 x
0,3
1,2 x
0,5 x
0,2
0,9 x
0,6 x
0,5
1,0 x
0,6 x
0,4
1,1 x
0,9 x
0,6
6,0 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,2 x
0,7
03
1,9 x
2,2 x
1,1
1,6 x
0,5 x
0,3
1,5 x
0,6 x
0,3
0,9 x
0,6 x
0,5
0,9 x
0,6 x
0,5
0,9 x
1,0 x
0,6
6,0 x
0,3 x
0,3
2,1 x
1,3 x
0,7
04
1,9 x
1,7 x
1,0
1,6 x
0,6 x
0,3
1,6 x
0,4 x
0,2
0,9 x
0,5 x
0,6
1,1 x
0,5 x
0,6
1,1 x
1,0 x
0,6
4,5 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,3 x
0,7
07
2,0 x
1,7 x
0,9
1,6 x
0,6 x
0,3
1,6 x
0,4 x
0,2
1,0 x
0,6 x
0,5
1,1 x
0,6 x
0,6
1,0 x
1,0 x
0,5
6,0 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,6 x
0,6
08
2,3 x
2,1 x
1,0
1,6 x
0,5 x
0,2
1,6 x
0,5 x
0,3
0,9 x
0,6 x
0,6
1,2 x
0,6 x
0,5
1,0 x
1,0 x
0,7
5,0 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,0 x
0,7
09
2,0 x
1,6 x
1,0
1,6 x
0,5 x
0,2
1,5 x
0,5 x
0,3
0,9 x
0,6 x
0,5
1,2 x
0,7 x
0,6
1,0 x
1,0 x
0,6
6,0 x
0,3 x
0,3
2,2 x
1,1 x
0,7
12
2,1 x
1,6 x
1,0
1,6 x
0,6 x
0,3
1,5 x
0,5 x
0,3
1,0 x
0,6 x
0,5
1,2 x
0,7 x
0,5
1,0 x
0,9 x
0,6
6,5 x
0,3 x
0,3
2,1 x
1,0 x
0,7
Fonte: dados da pesquisa.
126
Anexos
Cauê Benito Scarim
Anexo 4 - Análise Macroscópica dos órgãos analisados por animal, estes em
comprimento x largura x altura (cm). Grupo controle negativo, sem infecção.
Grupo
Controle
Negativo
(animal)
Fígado Baço Coração Rim Cérebro Cólon
Musculo
Esqueléti
co
01 2,2 x 1,9
x 0,9
0,9 x 0,5
x 0,3
0,9 x 0,5
x 0,5
0,9 x 0,7
x 0,4
1,1 x 1,0
x 0,6
5,5 x 0,2
x 0,2
2,1 x 2,2
x 1,4
02 1,8 x 1,5
x 1,1
1,2 x 0,3
x 0,2
0,9 x 0,6
x 0,6
1,1 x 0,6
x 0,5
1,1 x 0,9
x 0,5
5,2 x 0,2
x 0,2
2,7 x 2,2
x 1,5
03 1,7 x 1,9
x 0,9
1,3 x 0,3
x 0,2
0,9 x 0,5
x 0,5
1,2 x 0,6
x 0,5
0,9 x 0,9
x 0,6
5,4 x 0,2
x 0,2
2,1 x 1,6
x 0,9
04 1,8 x 1,8
x 1,1
1,1 x 0,5
x 0,2
0,9 x 0,5
x 0,5
1,0 x 0,5
x 0,6
1,1 x 0,9
x 0,5
4,7 x 0,2
x 0,2
2,3 x 1,6
x 0,9
05
2,4 x 2,1
x 1,6
1,5 x 0,5
x 0,3
0,8 x 0,6
x 0,6
1,0 x 0,6
x 0,6
1,0 x 1,0
x 0,6
5,0 x 0,2
x 0,2
1,9 x 1,3
x 0,8
06
1,6 x 1,8
x 1,5
1,5 x 0,5
x 0,3
0,9 x 0,6
x 0,5
1,1 x 0,6
x 0,6
1,1 x 1,1
x 0,6
4,4 x 0,2
x 0,2
2,4 x 1,5
x 0,9
Fonte: dados da pesquisa.
127
Anexos
Cauê Benito Scarim
Anexo 5 - Codificação dos achados histopatológicos para análise estatística (baço,
coração, colón e fígado)
Codificação para análise histopatológica - Baço
Parâmetros histopatológicos
analisados Codificação
Capsula Espessa = 1 Normal = 2 Delgada = 3
Polpa branca Diminuída = 1 Normal = 2 Aumentada = 3
Polpa vermelha Diminuída = 1 Normal = 2 Aumentada = 3
Zona Marginal Diminuída = 1 Normal = 2 Aumentada = 3
Organização dos folículos Desorganizados = 0 Organizados = 1
Presença de amastigotas Média sob o número total de ninhos amastigotas encontrados
Codificação para análise histopatológica - Coração
Parâmetros histopatológicos
analisados Codificação
Hipertrofia - musculatura lisa Ausente = 1 Presente = 2
Infiltrado inflamatório - tipo Crônico = 1 Agudo = 2 Misto = 3 Ausente = 0
Infiltrado inflamatório -
intensidade Leve = 1 Moderado = 2 Intenso = 3 Ausente = 0
Aglomerados inflamatórios Ausente = 0 Presente = 2
Infiltrado inflamatório (pericárdio) Média sob o número total de infiltrados encontrados
Presença de amastigotas Média sob o número total de ninhos amastigotas encontrados
Calcificação distrófica Média sob o número total de calcificações encontradas
Codificação para análise histopatológica - Colón
Parâmetros histopatológicos
analisados Codificação
Mucosa Atrofia = 1 Normal = 2 Hipertrofia = 3
Submucosa – Infiltrado Agudo = 1 Crônico = 2 Misto = 3
Submucosa - conjuntivação Frouxo = 1 Denso = 2
GALT Ausente = 0 Organizado = 1 Desorganizado = 2
Camada muscular lisa Atrofia = 1 Normal = 2 Hipertrofia = 3
Presença de amastigotas Média sob o número total de ninhos amastigotas encontrados
Fonte: dados da pesquisa.
Codificação para análise histopatológica – Fígado
Parâmetros histopatológicos
analisados Codificação
Picnose/Necrose Presente = 1 Ausente = 0
Lipdose Presente = 1 Ausente = 0
Infiltrado agudo Média sob o número total de infiltrados encontrados
Infiltrado misto Média sob o número total de infiltrados encontrados
Infiltrado crônico Média sob o número total de infiltrados encontrados
Presença de amastigotas Média sob o número total de ninhos amastigotas encontrados
128
Anexos
Cauê Benito Scarim
Anexo 6 - Parecer do comitê de ética (Protocolo CEUA/FCF/CAr nº 39/2014).