universidade do vale do itajaí desenvolvimento de derivados
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
LILIANI CAROLINI THIESEN
DESENVOLVIMENTO DE DERIVADOS VEGETAIS COM POTENCIAL
ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETOR
Itajaí
2013
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
LILIANI CAROLINI THIESEN
DESENVOLVIMENTO DE DERIVADOS VEGETAIS COM POTENCIAL
ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETOR
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Profª. Drª. Tania Mari Bellé Bresolin Co-orientador: Profª. Drª. Angélica Garcia Couto
Itajaí, Dezembro de 2013
AGRADECIMENTOS
Agradeço...
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado a chance de ser aquilo que
escolhi, que iluminou meu caminho durante essa caminhada.
A minha Família, por terem sempre me apoiado, dando força, amor e carinho.
A minha vó Apolonia, pelo amor, carinho, dedicação, apoio e pela certeza de que
alcançaria mais um objetivo.
Ao meu namorado Brunno, pelo carinho, dedicação, compreensão nos momentos
complicados, amor e pelo companheirismo nas vindas aos finais de semana na UNIVALI.
Agradeço a Profª. Dra Tania M. B. Bresolin e a Profª. Dra Angelica G. Couto
pelos conhecimentos adquiridos, orientação, paciência, confiança e amizade.
A Profª. Dra. Caroline Valente, pela ajuda, conhecimento e auxilio na parte com as
células, além de toda compreensão, dedicação, paciência e amizade.
Ao Prof. Mr. Rene Ferreira, pela ajuda na caracterização botânica da planta.
A Profª. Dra Chistiane Meyre e a Profª. Dra Ruth Meri Lucinda pelas
contribuições desde o começo, quando esta dissertação ainda era um projeto.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo
carinho, apoio e ensinamentos.
Às profissionais Luciana C. Block e Eliziane M. Ribas pelo grandioso apoio e
demonstração de carinho, sempre dispostas a ajudar.
A Extratos da Terra pelo incentivo, ajuda e oportunidade no início deste percurso.
A todos os meus amigos, que me ajudaram, que sempre me deram palavras de
ânimo, apoio e torceram por mim.
E todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho
fosse concluído com sucesso.
O meu sincero obrigado a todos!!
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DESENVOLVIMENTO DE DERIVADOS VEGETAIS COM POTENCIAL
ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETOR
Liliani Carolini Thiesen Dezembro/2013
Orientador: Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora. Co-orientador: Angélica Garcia Couto, Doutora. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 112 O interesse crescente de antioxidantes de origem vegetal direcionou os estudos com uma planta medicinal caracterizada por apresentar compostos polifenólicos com propriedades antirradicalares, como procianidina A2 (PA2) e epicatequina (EPI). Este trabalho visou contribuir para o desenvolvimento de derivados vegetais, com potencial antioxidante e fotoprotetor. Foi desenvolvido e validado um método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para a quantificação dos marcadores EPI e PA2. Foi realizado um estudo preliminar para escolha do solvente (3 níveis de etanol), monitorado pelo método DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina). Após, foi realizada uma otimização 3 x 2² da extração, monitorando o resíduo seco, pH, perfil em cromatografia em camada delgada e perfil e teor de marcadores por CLAE. A melhor condição de extração foi empregada para obter o extrato mole (EM), determinando o Fator de Proteção Solar Espectrofotométrico (FPSE), a citotoxicidade e a atividade fotoprotetora em células L929, no UVA. A condição de extração selecionada foi a de 5 h de maceração, com relação droga:solvente de 5%, empregando etanol 70 °GL como solvente. As soluções extrativas mostraram atividade antioxidante pelo método de DPPH (CI50 de cerca de 10 µg/mL). O método por CLAE mostrou ser preciso, exato, seletivo e robusto para ambos os marcadores, com teor de EPI de 14 mg/g e de PA2 de 17 mg/g no EM. O EM a 1 mg/mL apresentou FPSE 18, não foi citotóxico na faixa de 5-150 µg/mL, e na fotoproteção apresentou viabilidade celular (5 µg/mL) similar às células não tratadas e ao controle (Tinosorb M®, 10 µg/mL). Os resultados apontam o potencial dos derivados vegetais em estudo para o desenvolvimento de formulações cosméticas antioxidantes e fotoprotetoras. Palavras-chave: Derivado Vegetal. Atividade antioxidante. Fotoproteção. Cosméticos.
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DEVELOPMENT HERBAL DERIVATIVES WITH ANTIOXIDANT AND
PHOTOPROTECTOR EFFECTS
Liliani Carolini Thiesen December/2013
Adviser: Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora. Co-adviser:Angélica Garcia Couto, Doutora. Area of concentration: Natural Products and Synthetic Bioactives Substances
Number of pages: 112 The growing interest in antioxidants from herbal sources has guided studies a medicinal plant with polyphenolic compounds, which present antiradical property, such as procyanidin A2 (PA2) and epicatechin (EPI). This work aims to contribute to the development of plant derivatives with antioxidant and photoprotectionpotential. A method was developed and validated for High Performance Liquid Cromatotography (HPLC) for the quantification of markers EPI and PA2. A preliminary study was carried out to determine the choice of solvent (three levels of ethanol) monitored by the DPPH (1,1- diphenyl-2- picrylhydrazyl) method was performed. Optimization (3 x 2 ²) of the extraction was performed by monitoring the dry weight, pH, chromatographic profile by thin layer chromatography and profile and content of the markers by HPLC. The best condition of extraction was used to obtain the soft extract (EM), determining the Spectrophotometric Sun Protection Factor (SSPF), cytotoxicity and photoprotective activity in L929 cells under UVA radiation. The selected extraction condition was: maceration for 5 h, drug:solvent of 5%, using 70° GL ethanol as solvent. The extractive solutions showed antioxidant activity by the DPPH assay (IC50 of about 10 mg/mL). The HPLC method proved to be precise, accurate, selective and robust for both markers, with EPI content of 14 mg/g and PA2 of 17 mg/g in EM. At 1 mg/mL the EM showed SSPF of 18, was not cytotoxic in the range of 5-150 µg/mL, and showed cell viability (at 5 µg/mL) in the photoprotection test, similar to untreated cells and to the control (TinosorbM® 10 µg/mL). The results indicate the potential of herbal derivatives of L. chinensis to develop antioxidants and photoprotective cosmetic formulations. Key-words:Herbal derivative. Antioxidant activity. Photoprotection. Cosmetics
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LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BCRJ - Banco de Células do Rio de Janeiro
CI50 – Concentração com inibição de 50%
CCD - Cromatografia em camada delgada
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DCFH-DA - (2,7-diacetato de diclorofluoresceina)
DL50 – Dose que causa morte em 50%
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO - Dimetilsulfóxido
DPPH - 1,1-difenil-2-picrilhidrazina
DPR - Desvio padrão relativo
DV - Droga vegetal
EPI - Epicatequina
EM – Extrato Mole
ERO - Espécies Reativas de Oxigênio
ERN - Espécies Reativas de Nitrogênio
FPSE - Fator de Proteção Solar Espectrofotométrico
HBR - Herbário Barbosa Rodrigues
HEPES - N-(2-hidroxietil) piperazina N´(ácido 2-etano sulfônico)
HPLC – High Performance Liquid Chromatography - Cromatografia líquida de alta
eficiência
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia
LD - Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
MTT - (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio])
NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas
OMS – Organização Mundial da Saúde
PA2 – Procianidina A2
PBS - Tampão Fosfato-Salino
r - Coeficiente de correlação
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r² - Coeficiente de determinação
RDC - Resolução de Diretoria Colegiada
RE - Resolução Específica
RPM - Rotações por minuto
RMN - Ressonância Magnética Nuclear
ROS – Reactive Oxidative Species – Espécies reativas de oxigênio
RS – resíduo seco
Rf - Fator de retenção
SA - Solução Amostra
SE - Solução Extrativa
SFB – Soro Fetal Bovino
SP - Solução Padrão
SPE - Solução Padrão Estoque
USP – United States Pharmacopeia
UV - Ultravioleta
VIS - Visível
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 19
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 19
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 19
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 21
3.1 Plantas medicinais ............................................................................................ 21
3.2 Fitocosméticos ................................................................................................. 22
3.3 Estresse Oxidativo ............................................................................................ 23
3.4 Antioxidantes ..................................................................................................... 25
3.5 Fotoproteção ..................................................................................................... 26
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 29
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 31
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3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Plantas medicinais
Por longos períodos na história, o homem buscou no reino vegetal recursos,
principalmente através de plantas medicinais para sua sobrevivência, seja para a
sua alimentação, como também, para o alivio e cura de suas enfermidades
(MOREIRA; SALGADO; PIETRO, 2010). A busca pelo alívio e a cura de
enfermidades através da ingestão de preparações de ervas e folhas, pode ter sido
uma das primeiras formas de sua utilização. Esta é uma prática baseada na crença
popular e nas várias formações culturais que as utilizam como recurso terapêutico
(VIEGAS Jr.; BOLZANI; BARREIRO, 2006)
Desta forma, as pessoas mantêm em ênfase a prática do consumo de plantas
medicinais, tornando válidas as informações terapêuticas que foram sendo passadas
de geração a geração. Ainda hoje, nas regiões mais pobres e até mesmo nas
grandes cidades, o uso de plantas medicinais ocorre, sendo comercializados em
feiras livres, mercados populares ou até mesmo encontradas em quintais
residenciais (LACERDA et al., 2013; MACIEL; PINTO; VEIGA JR., 2002).
De maneira indireta, a cultura medicinal desperta o interesse de
pesquisadores a buscarem a comprovação de sua eficácia. A própria Organização
Mundial de Saúde (OMS), reconhece o conhecimento popular e a biodiversidade
como um importante instrumento no desenvolvimento de novos produtos
farmacêuticos para o controle e combate de doenças (WHO, 2002).
O Brasil apresenta em torno de 15 a 20% da biodiversidade mundial (BRASIL,
2006). Estima-se que o país possua mais de 55.000 espécies de plantas, muitas
delas com propriedades medicinais (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Dessas plantas
são obtidos derivados vegetais (extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco, e outros)
para a fabricação de fitoterápicos, medicamentos e cosméticos.
O mercado de medicamentos fitoterápicos movimenta globalmente US$ 21,7
bilhões por ano. No Brasil, estimavam-se valores em torno de US$ 160 milhões por
ano (CARVALHO et al., 2008). Em 2011, o mercado brasileiro de fitoterápicos
movimentou cerca de R$ 1,1 bilhão, em relação ao ano anterior teve um aumento de
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13%, comercializando cerca de 45 milhões de unidades. No acumulado dos últimos
cinco anos, o segmento de fitoterápicos cresceu 10,5% (SCARAMUZZO, 2012).
Como os fitoterápicos apresentam uma parcela significativa no mercado de
medicamentos no Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que é
o principal órgão responsável pela regulamentação de plantas medicinais e seus
derivados vegetais fez várias regulamentações, para o registro de medicamentos,
exigindo a comprovação da qualidade, dos efeitos terapêuticos e segurança de uso
para a população (BRASIL, 2013).
Os fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de processos tecnologicamente
adequados, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais, com
finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico. Não se considera
medicamento fitoterápico aquele que, na sua composição, inclua substâncias ativas
isoladas, de qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais. Os
marcadores são componentes presentes na matéria-prima vegetal,
preferencialmente o próprio princípio ativo, utilizados como referência no controle de
qualidade da matéria-prima vegetal e dos medicamentos fitoterápicos (ANVISA,
2013b).
3.2 Fitocosméticos
Os fitocosméticos são cosméticos que contêm princípios ativos extraídos de
vegetais, visando à higiene, estética, correção e manutenção da pele. Vários
extratos e óleos de plantas têm sido utilizados em produtos cosméticos para tais
finalidades (ARAÚJO et al., 2010; ISAAC et al., 2008). Possivelmente, pomadas e
óleos contendo substâncias de origem natural representam as formas farmacêuticas
mais antigas usadas em cosmética (CUNHA et al., 2004).
A existência de inúmeras plantas com as mais variadas aplicações em
cosmética promoveu o desenvolvimento de inúmeros novos produtos, nas mais
diferentes formas cosméticas tais como xampus, condicionadores, sabonetes,
cremes, loções, óleos, geis, leite de limpeza, entre outros. Dentre as matérias-primas
utilizadas para o desenvolvimento desses produtos, destacam-se os frutos, as
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folhas, as flores, os óleos vegetais e essências, os corantes naturais, os diferentes
tipos de extratos, as resinas e as fibras (RUIVO, 2012; ARAÚJO et al., 2010).
As principais plantas nativas do Brasil utilizadas na fabricação e
industrialização de cosméticos são: Andiroba (Carapa guianensis Aublet.), Aroeira
(Schinus terenbinthifolius Raddi), Açaí (Euterpe oleracea Mart.), Babaçu (Orbignya
spp.), Maracujá (Passiflora edulis Sims; P. Edulis Flavicarpa Deg.), a Pitanga
(Eugenia uniflora) e a Castanha do Pará (ARAÚJO et al., 2010), além do Buriti
(Mauritia flexuosa), Cupuaçu (Theobroma grandiflorum), Guaraná (Paullinia cupana),
Macela (Achyrocline satureioides), Alecrim (Rosmarinus officinalis); Arnica (Arnica
montana); Calêndula (Calendula officinalis); Centela Asiática (Centella asiatica);
Ginkgo (Ginkgo biloba); Ginseg (Panax ginseg); Hamamelis (Hamamelis virginiana);
Jojoba (Simmondsia); Ricino (Ricinus communis) e Soja (Glycine max) (ANVISA,
2013a; CUNHA et al., 2004). Já as plantas exóticas usadas em cosméticos, e
cultivadas em nosso país, incluem a babosa (Aloe vera), a amêndoa-doce (Prunus
dulcis), o cacau (Theobroma cacao), a camomila (Matricaria recutita), a erva-doce
(Pimpinella anisum), a laranja (Citrus x sinensis), e a aveia (Avena fatua) (ARAÚJO
et al., 2010).
3.3 Estresse Oxidativo
As espécies reativas são moléculas orgânicas ou inorgânicas independentes,
formadas por átomos com elétrons desemparelhados, altamente instáveis e com
meia-vida curtíssima. São produzidas constantemente durante os processos
metabólicos e exercem ação como mediadores para a transferência de elétrons em
diversas reações bioquímicas, desta forma desempenham funções ao metabolismo
humano (ALVES et al., 2010).
Existem vários tipos de espécies reativas, as que metabolizam o oxigênio,
nitrogênio, cloro, enxofre, entre outras. As principais são as espécies reativas de
oxigênio (ERO) e as de nitrogênio (ERN), sendo que as ERO distribuem-se em dois
grupos: os radicalares, como hidroxila, superóxido, peroxila e alcoxila, e os não-
radicalares, como oxigênio, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Já dentre as
ERN, incluem-se ainda o óxido nítrico, óxido nitroso, ácido nitroso, nitritos, nitratos e
peroxinitritos (CADENAS; DAVIES, 2000; VASCONCELOS et al., 2007).
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A fonte de geração das espécies reativas pode ser endógena ou exógena. A
primeira é produzida pelo próprio organismo, resultante da atividade de algumas
enzimas, como citocromo P450-oxidase, monoaminoxidase e xantina oxidase.
Também podem ser geradas nos peroxissomos, nos processos inflamatórios e na
respiração aeróbica. Já a última pode ser gerada por substâncias tóxicas, como as
contidas no cigarro, poluentes, solventes orgânicos, pesticidas utilizados na
produção de alimentos, nos alimentos, bebidas, medicamentos e de forma
importante, na radiação ultravioleta (SANTOS, 2006).
Para combater as espécies reativas, o organismo dispõe de um sistema
antioxidante que produz substâncias que são capazes de regenerar ou prevenir os
danos oxidativos, conseguindo assim controlar e restabelecer o equilíbrio (ALVES et
al., 2010; VASCONCELOS et al., 2007).
Por outro lado, quando a produção de espécies reativas é exacerbada, ocorre
um desequilíbrio denominado de estresse oxidativo, ou seja, a quantidade de
antioxidantes produzidos pelo organismo é insuficiente para combater os radicais
livres produzidos. Isto pode se dar tanto pelo aumento na formação destas espécies
quanto pela queda na capacidade antioxidante celular (ALVES et al., 2010).
O estresse oxidativo apresenta efeitos nocivos ao organismo, podendo causar
danos em lipídios, proteínas, enzimas, carboidratos e DNA em células e tecidos, que
resulta em danos de membrana, fragmentação de ligação de moléculas como o
DNA, enzimas e proteínas estruturais, e até mesmo levar à morte celular induzida
pela fragmentação do DNA e peroxidação (ALVES et al., 2010).
Estas consequências do estresse oxidativo se encontram envolvidas em
diversas patologias como o desenvolvimento de câncer, desordens
neurodegenerativas crônicas, doenças cardiovasculares, complicações da diabetes
mellitus, choque hemorrágico, catarata, disfunções cognitivas, desordens auto-
imunes, danos à estrutura do DNA, processos inflamatórios com a redução do poder
das células de defesa e o envelhecimento precoce (ALVES et al., 2010;
HALLIWELL, 1996; RATNAN et al., 2006).
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3.4 Antioxidantes
Os antioxidantes são substâncias que, quando presentes em concentrações
ideais em relação aos radicais livres, inibem ou atrasam significativamente os
processos oxidativos, ou seja, previnem os danos causados pelos mesmos. Eles
agem no organismo por meios de diferentes mecanismos, tais como: a complexação
de íons metálicos, a captura de radicais livres, a decomposição de peróxidos, a
inibição de enzimas responsáveis pela geração de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio e a modulação de vias sinalizadoras celulares (OLIVEIRA et al., 2009).
O sistema antioxidante é classificado em enzimático e não enzimático. O
enzimático constitui a primeira defesa endógena a agir contra os ataques das
espécies reativas, evitando o acúmulo de ânion radical superóxido e do peróxido de
hidrogênio. É representado principalmente pelas enzimas superóxido dismutase
(transforma o radical superóxido em peróxido de hidrogênio), catalase (degrada o
peróxido de hidrogênio a água) e glutationa peroxidase e redutase (dupla que atua
na remoção de hidroperóxidos orgânicos formados durante a lipoperoxidação dos
lipídios) (HARRIS, 2003; RATNAM et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2007). Já o
não-enzimático é formado por substâncias de baixo peso molecular, pequenas
moléculas que se encontram através de compostos presentes em determinados
alimentos e que agem na detoxificação das ERO, doando seus elétrons para as
moléculas radicalares, interrompendo sua reatividade (RATNAM et al., 2006;
VASCONCELOS et al., 2007).
Um dos principais aspectos relacionados ao efeito protetor dos frutos e
vegetais tem sido atribuído à presença de compostos antioxidantes, dentre os quais
se destacam os compostos fenólicos, carotenoides, vitamina C e E (HALLIWELL,
1996).
A vitamina E é um antioxidante lipídico, entre os quais o α-tocoferol é a forma
mais ativa. É encontrada nas membranas das lipoproteínas e em tecidos como
fígado, rins e tecido adiposo adrenal, sendo capaz de estabilizar camadas lipídicas
da epiderme e de inibir a peroxidação lipídica em animais. Já a vitamina C ou ácido
ascórbico é uma vitamina hidrofílica, essencial na síntese de colágeno, que atua
como um antioxidante in vivo e age contra danos causados pela exposição solar.
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Os carotenoides são pigmentos encontrados em alimentos de origem vegetal,
com as colorações amarela, alaranjada e vermelha e atuam protegendo os lipídios
dos danos peroxidativos inativando o oxigênio singleto, sem sofrer degradação,
através da reação com os radicais peroxila, hidroxila e superóxido. Os principais
carotenoides presentes nos alimentos são o betacaroteno e licopeno, quedesativam
radicais livres e interagem com espécies reativas inibindo os processos oxidativos
(GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007; SOUZA et al., 2007; VANNUCCHI
et al., 1998;).
Os compostos fenólicos são uma classe extensa de antioxidantes, estando
amplamente distribuídos no reino vegetal. Estes compostos se enquadram em
diversas categorias, como fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ácidos
benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonoides, estilbenos, taninos condensados e
hidrolisáveis, lignanas e ligninas e que são encontrados em frutos frescos, entre
outros vegetais, chás e vinhos tintos. A capacidade antioxidante dessas substâncias
deve-se à capacidade de neutralizar ou sequestrar os radicais livres e a quelação de
metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do
processo oxidativo (SOUZA et al., 2007).
Os taninos representam compostos polifenólicos heterogêneos
hidrossolúveis, de elevado peso moleculares com ampla presença nas plantas, nas
quais desempenham várias funções como antioxidantes, defesa química contra
predadores e radiação UV. Segundo a sua estrutura química, são classificados em
dois grupos: hidrolisáveis e condensados. Os taninos hidrolisáveis são formados por
ácidos gálicos glicosilados, os quais são divididos em galotaninos e elagiotaninos
que produzem, após a hidrólise, os ácidos gálico e elágico. Os taninos condensados
ou proantocianidinas são polímeros de flavan-3-ol e/ou flavan-3,4-diol,
representados pelos taninos catéquinos e pelas procianidinas oligoméricas como a
procianidina A2 e a procianidina B2 (MONTEIRO et al., 2005; LEITE., 2009) .
3.5 Fotoproteção
A radiação ultravioleta (UV) é responsável por uma grande variedade de
diferentes efeitos agudos e crônicos sobre a pele. Esta funciona como uma interface
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entre o corpo e o ambiente, atuando como uma barreira para os efeitos nocivos,
exógenos, físicos e químicos (NIKOLIC et al., 2011).
O raio UV é dividido em UVC (200-290 nm), UVB (290- 320 nm) e UVA (320 –
400 nm) (BRASIL, 2012b). A radiação UVC é absorvida pelo oxigênio e pela camada
de ozônio. A radiação UV que atinge a superfície terrestre contém aproximadamente
6% dos raios UVB e 94% dos raios UVA. Em um nível molecular, as radiações UVA
e UVB diferem entre si pelo grau das lesões e nível de penetração na pele, pois a
UVB tem maior capacidade de causar danos às células, sendo a mais genotóxica,
principalmente na camada basal da epiderme devido ao menor poder de penetração
na pele. A radiação UVB induz a queimaduras solares, inflamação, danos ao DNA,
estresse oxidativo, produção de radicais livres, imunossupressão,
fotoenvelhecimento e câncer, enquanto a UVA causa o fotoenvelhecimento devido a
produção de radicais livres (AFAQ, 2010; PSOTOVA et al.,2006).
As primeiras alterações induzidas pela exposição solar na pele são a
inflamação caracterizada por eritema, edema e calor. As espécies reativas de
oxigênio são as principais responsáveis por essa inflamação, devido à formação do
estresse oxidativo e a vários processos da carcinogênese. Dentre estes processos
destacam-se a indução de alterações estruturais do DNA, que resulta em mutações,
ou seja, alterações genéticas (GUARATINI et al., 2009).
Uma das alternativas terapêuticas e profiláticas para a redução dos danos da
radiação UV é o uso de antioxidantes por via tópica ou oral. Outra é o uso de
fotoprotetores, que atuam de maneira preventiva no tecido cutâneo. Estes podem
ser classificados como químicos, moléculas foto estáveis que possuem grupos
cromóforos os quais absorvem a radiação, ou físicos, que atuam como barreira
mecânica impedindo a penetração da radiação na pele (GUARATINI et al., 2009).
Embora a pele possua um sistema antioxidante elaborado para lidar com UV
induzida por dano oxidativo, o uso de ativos fotoprotetores é recomendado. Nos
últimos anos, compostos naturais, que possuem potencial antioxidante, propriedades
anti-inflamatórias, antimutagênicas, anticancerígenas e imunomoduladoras, e que
têm a capacidade de exercer esses efeitos inibitórios sem diversos eventos celulares
e moleculares, estão ganhando considerável atenção para a prevenção de danos à
pele induzida por radiação UV (AFAQ, 2010).
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Existem vários estudos referentes à avaliação da eficácia fotoprotetora,
envolvendo técnicas para as avaliações de Fator de Proteção Solar (FPS) (UVB) e
FPA (Fator de Proteção UVA) tanto in vitro como in vivo (VELASCO et al., 2011).
No Brasil, a determinação do FPS e FPA deve ser realizada seguindo
unicamente métodos in vivo, recomendados pelos órgãos regulamentais americano
Food and Drug Administration (FDA) ou europeu, European Cosmetics Trade
Association (COLIPA) (BRASIL, 2002). O princípio da avaliação do FPS envolve o
aparecimento do eritema na pele, decorrente da exposição à radiação UVB e cuja
intensidade é proporcional à dose recebida. O valor de FPS consiste na razão entre
o tempo de exposição à radiação UVB necessário para desenvolver eritema na pele
protegida pelo fotoprotetor. Para a avaliação da proteção UVA, o princípio se
baseia na resposta de pigmentação tardia ou persistente da pele frente à radiação
UVA, pois seu escurecimento é uma das respostas mais imediatas a esse tipo de
exposição (VELASCO et al., 2011; ARAÚJO; SOUZA, 2008).
Para a determinação do FPS in vitro, o método mais comumente utilizado é o
de Mansur, que utiliza a espectrofotometria, pela qual se calcula o Fato de proteção
espectrofotométrico (FPSE), a partir das leituras da absorbância de 290 a 320 nm
das soluções diluídas, calcula-se o (VELASCO et al., 2011).
Hupel e colaboradores (2011) determinaram o FPS baseado na técnica de
degradação da clorofila, empregando uma câmara UV. A fonte de luz foi utilizada na
proporção de 0,5 UV-A/UV-B. A duração de exposição foi fixada em 2 h e a câmara
estava equipada com um arrefecimento externo para manter a temperatura das
amostras abaixo de 40 ºC.
Outra metodologia in vitro, empregada por Ropke e colaboradores (2010) foi o
substrato Vitro-skin® e o uso de um medidor de transmitância mostrando a correção
do método in vitro com o FPS in vivo para uma loção contendo mistura de dois
extratos, a Cynara scolymus e Echinacea purpurea.
Outra possibilidade de avaliar o efeito fotoprotetor in vitro baseia-se no cultivo
de células, expostas à radiação UV. Zanatta e colaboradores (2010) utilizaram dois
tipos de linhagem de células, queratinócitos (HaCaT) e fibroblastos (3T3), expostas à
radiação UVA e UVB, a 2,5 J/cm2, para avaliar a fotoproteção do óleo de buriti em
emulsões no pré e pós-tratamento. A fotoproteção é expressa como percentual de
viabilidade das células tratadas em relação às células irradiadas e não tratadas.
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6 CONCLUSÕES
• A droga vegetal foi caracterizada e apresentou conformidade quanto às
características físicas e físico-químicas mediante os limites pré-
estabelecidos.
• A caracterização macroscópica e microscópica apresentaram dados
complementares para a identificação das folhas.
• O método por CLAE foi validado e mostrou ser linear na faixa de 10-100
μg/mL de EPI e PA2, sem influência da matriz na linearidade do método,
preciso,exato, sensível e robusto.
• A exposição da droga vegetal às radiações UV e VIS não provocou alteração
no teor de ambos os marcadores, indicando que a mesma é fotoestável.
• Com o estudo preliminar e otimização do processo de extração, o solvente
selecionado foi o etanol 70 ºGL, relação droga:solvente de 5% e tempo de
5h.
• O EM mostrou absorção no UVB (290-320 nm) e no UVA (320 – 400 nm), na
concentração de 1 mg/mL. Nas concentrações de 0,5 e 0,25 mg/mL o perfil
foi semelhante, porém a absorção na região do UVA foi menor.
• Na determinação de FPSE pelo método de Mansur, entre 290-300 nm
(UVB), o EM nas concentrações 1,0, 0,5 e 0,25 mg/mL apresentou FPSE
18,9 ± 0,4 (DPR = 2,1%), 11,6 ± 0,03 (DPR = 0,3%) e 6,7 ± 0,03 (DPR =
0,5%), dando indicativo de fotoproteção.
30
• O EM nas concentrações 5, 10, 50, 100 e 150 µg/mL não apresentaram
citotoxicidade. Em relação aos filtros solares o que melhor apresentou
viabilidade foi o Tinosorb M® a 10 µg/mL.
• Na fotoquimioproteção, a concentração de 5 µg/mL do EM e o Tinosorb M®
a 10 µg/ml foram semelhantes, e não diferiram das células não tratadas e
não irradiadas.
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