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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
TALITA DACROCE TONIN
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E CICATRIZANTE IN VIVO E
IN VITRO DO EXTRATO METANÓLICO e NIGA-ICHIGOSÍDEO F1
OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DE Rubus imperialis Cham.
Schl. (Rosaceae)
Itajaí (SC)
2016
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
TALITA DACROCE TONIN
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E CICATRIZANTE IN VIVO E
IN VITRO DO EXTRATO METANÓLICO e NIGA-ICHIGOSÍDEO F1
OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DE Rubus imperialis Cham.
Schl. (Rosaceae)
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí para exame de defesa para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Santin Co-orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero
Itajaí (SC)
Março de 2016
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AGRADECIMENTOS
Embora uma dissertação de mestrdo seja pela sua finalidade acadêmica
um trabalho individual, há contributos de natureza diversa que não podem nem
devem deixar de ser realçados. Por essa razão, desejo expressar os meus
agradecimentos:
Primeiramente aos meus pais pela minha formação pessoal e
principalmente por respeitarem e acreditarem nas minhas decisões.
Ao meu marido Tiago Loredan Tonin, por sempre estar ao meu lado e ter
muita paciência comigo! Amo você!
A todos meus amigos, pois como diria Vinicius de Moraes, mesmo que as
pessoas mudem e suas vidas se reorganizem, os amigos devem ser amigos para
sempre, mesmo que não tenham nada em comum, somente compartilhar as
mesmas recordações.
O orientador deste trabalho, Prof Dr. José Roberto Santin e sua esposa
Prof Dra. Isabel Daufenback Machado, pelo apoio durante o mestrado e
sobretudo a sincera amizade e incentivo contínuo.
Aos professores da banca examinadora Prof Dra Nara, Prof Dr
Alessandro, Prof Dr Valdir e em especial ao meu Co-orientador Prof Dr. Rivaldo
Niero, pelas considerações e contribuições para a melhoria deste trabalho.
Aos demais docentes e funcionários do programa de mestrado em
Ciências Farmacêuticas que, em maior ou menor grau, contribuíram para minha
formação e que sempre estiveram abertos às minhas indagações.
A querida amiga e colega de mestrado Marina Goss, pela força, amizade
verdadeira e colaboração em todos os experimentos. Também aos acadêmicos
do curso de Biomedicina Maria Luiza e Marcos Paulo pela parceria no tratamento
e cuidados com os animais utilizados.
A CAPES pelo apoio financeiro.
E sobretudo ao universo pela luz e sabedoria necessária permitindo a
conclusão desta etapa tão especial em minha vida!
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“ A distância entre o sonho e a conquista chama-se atitude!”
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ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E CICATRIZANTE IN VIVO E IN VITRO DO EXTRATO METANÓLICO e NIGA-ICHIGOSÍDEO F1
OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DE Rubus imperialis Cham. Schl. (ROSACEAE)
Talita Dacroce Tonin
March/2016
Orientador: José Roberto Santin, Dr. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de páginas: 84 A inflamação é uma resposta fisiopatológica causada por infecção ou dano tecidual, no qual o sistema imune orquestra um processo com várias fases visando neutralizar o agente causador e retomar a homeostasia. Diante da necessidade da busca por princípios ativos que atuem na inflamação, o presente trabalho visou esclarecer a atividade anti-inflamatória e cicatrizante in vivo e in vitro do extrato metanólico obtido das partes aéreas de R. imperialis e do composto isolado NI-F1. Neste aspecto, foi realizado em camundongos Balb/C machos o modelo de bolsa de ar, os quais foram tratados por via oral com extrato metanólico de R. imperialis (EMB) ou NI-F1, após uma hora, o processo inflamatório foi induzido pela injeção de lipopolissacarídeo de E. coli (LPS) ou carragenina no tecido subcutâneo dorsal. O número total de leucócitos foi quantificado no exsudato inflamatório e os parâmetros hematológicos foram avaliados no sangue periférico. A atividade anti-inflamatória in vitro foi investigada na cultura de neutrófilos isolados da cavidade peritoneal e incubados com veículo, EMB de R. imperialis ou NI-F1 na presença ou ausência de LPS ou carragenina. O óxido nítrico (NO) foi mensurado no sobrenadante e a viabilidade celular foi avaliada pelo método de exclusão com azul de trypan. A atividade fagocítica foi avaliada em macrófagos recrutados para o peritônio pela ação do tioglicolato de sódio (3%, i.p.) e em neutrófilos recrutados pela ação do glicogênio de ostra (1%, i.p.). Ensaio de citotoxicidade in vitro foi realizado em células de fibroblasto murino (L929) e células de carcinoma hepatocelular (HepG2) utilizando a metodologia de MTT. O ensaio de hemólise foi baseado na quantificação de hemoglobina liberada e quantificada por espectrofotometria. Foram realizados ensaios para avaliar a migração celular in vitro, através do ensaio de scratch e a atividade cicatrizante in vivo no modelo de úlcera cutânea em camundongos. Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com EMB de R. imperialis ou NI-F1 reduz o influxo de neutrófilos. De encontro a isto dados do hemograma demostram que animais tratados com EMB de R. imperialis apresentaram neutrofília no sangue periférico. Este resultado pode explicar, em partes, a menor migração de células para o foco de lesão. A eferocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos aumentou nos animais tratados, diminuindo a secreção de citocinas pró-inflamatórias e estimulando a secreção de fatores de crescimento. De encontro a estes dados, no experimento in vitro, o EMB de R. imperialis e o NI-F1, reduziram a produção de NO sem ocasionar citotoxicidade em neutrófilos nem às células L929, estimulando a migração desta em modelo de scratch. No ensaio de cicatrização in vivo ocorreu
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reparo tecidual após o tratamento com EMB de R. imperialis nas concentrações de 1 e 2,5% incorporado a um creme base, o qual teve sua toxicidade testada previamente pelo ensaio de agarose overlay. Conclui-se que o EMB de R. imperialis e o composto NI-F1 tem efeito terapêutico em doenças de origem inflamatória, tanto na indução do processo como na resolução do mesmo. Palavras-chave: Inflamação. Neutrófilos. Niga-ichigosideo F1. Macrofágos. Cicatrização.
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IN VIVO AND IN VITRO ANTI-INFLAMMATORY AND WOUND HEALING ACTIVITY OF THE METHANOLIC EXTRACT AND
NIGA-ICHIGOSÍDE F1 OBTAINED FROM AERIAL PARTS OF Rubus imperialis Cham. Schl. (ROSACEAE).
Talita Dacroce Tonin
March/2016
Supervisor: José Roberto Santin, Dr. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 84
Inflammation is a pathophysiological response caused by infection or tissue damage, in which the immune system orchestrates a process with several stages, to neutralize the causative agent and restore homeostasis. In view of the need to search for active compounds that act on inflammation, this study aimed to clarify the in vivo and in vitro anti-inflammatory and wound healing activity of the methanolic extract obtained from aerial parts of R. imperialis and NI-F1 (Niga-ichigoside). The air pouch model was performed, using Balb/c mice. The animals were treated orally with methanolic extract of R. imperialis (EMB) or NI-F1, and after one hour, the inflammatory process was induced by injecting lipopolysaccharide of E. coli (LPS) or carrageenan into the dorsal subcutaneous tissue. The total leukocyte count was quantified in the inflammatory exudate, and the hematological parameters were evaluated in the peripheral blood. The in vitro anti-inflammatory activity was investigated in the neutrophils culture isolated from the peritoneal cavity and incubated with vehicle, EMB R. imperialis or NI-F1, in the presence or absence of LPS. The nitric oxide (NO) was measured in the supernatant, and cell viability was evaluated by the trypan blue exclusion-test. Antioxidant activity was evaluated in the DPPH model and cytoprotective assay with H2O2 in the mouse fibroblast cells (L929). Phagocytic activity was evaluated with macrophages recruited to the peritoneum by the action of sodium thioglycolate (3%, ip) and neutrophils recruited by oyster glycogen (1%, ip). In vitro cytotoxicity tests were performed in mouse L929 and hepatocellular carcinoma cells (HepG2) by the MTT method. The hemolysis assay was based on the quantification of hemoglobin released, and quantified by spectrophotometry. Tests were performed to assess cell migration in vitro, through the scratch test and healing activity in vivo using the skin ulcer model in mice. The results demonstrated that treatment with EMB of R. imperialis or NI-F1 reduces the influx of neutrophils to the lesion site, leading to neutrophilia in the peripheral blood, and showing an effect on leukocyte migration mechanisms. Additionally, the EMB of R. imperialis promotes a decrease in NO production by neutrophils, and an increase in efferocytosis of apoptotic neutrophils by macrophages. The EMB of R. imperialis showed antioxidant and cytoprotective activity, and also evoked an increase in cell migration, without promoting cytotoxicity in the scratch assay. The in vivo healing assay for the EMB of R. imperialis (1 and 2.5%), incorporated in a cream base, presented healing activity without toxicity in the agarose overlay model. Together, the data demonstrate that the EMB of R. imperialis exhibits anti-inflammatory and antioxidant activity, modulating neutrophil migration to the lesion site and decreasing the release of chemical mediators. In addition to these effects, the EMB of R. imperialis acts in
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the resolution of inflammation, promoting an increase in efferocytosis and fibroblast migration.
Keywords: Inflammation. Neutrophils. Niga-ichigoside F1. Macrophages. Healing.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Imagem ilustrativa do processo de recrutamento dos neutrófilos do
meio intravascular para o tecido. ...................................................................... 20
Figura 2. Imagem ilustrativa do processo de resolução da inflamação. .......... 24
Figura 3. Imagem das partes aéreas (folhas e caules) de R. imperialis. ......... 31
Figura 4. Estruturas moleculares dos fitoconstituintes presentes nas partes
áereas de R. imperialis. .................................................................................... 32
Figura 5. Fluxograma resumido da preparação do EMB e obtenção das frações.
......................................................................................................................... 36
Figura 6. Estrutura molecular do ácido 23-hidroxitormêntico-28-O-glicosídeo
(NI-F1). ............................................................................................................. 37
Figura 7. Delineamento experimental do modelo de bolsa de ar ..................... 39
Figura 8. Imagem das células L929 confluentes. ............................................ 45
Figura 9. Formação do rasgo na monocamada de células L929. .................... 45
Figura 10. Esquema de tratamento das células. ............................................. 46
Figura 11. Confecção das úlceras cutâneas no dorso do animal. ................... 50
Figura 12. Efeitos do EMB e do NI-F1 no modelo de bolsa de ar induzida por
LPS. ................................................................................................................. 52
Figura 13. Efeitos do EMB e do NI-F1 no modelo de bolsa de ar induzida por
carragenina. ..................................................................................................... 55
Figura 14. Viabilidade celular de neutrófilos tratados com EMB e do NI-F1. ... 56
Figura 15. Efeitos do EMB e do NI-F1 na produção de NO em neutrófilos
estimulados com LPS. ...................................................................................... 57
Figura 16. Efeitos do EMB sobre a capacidade de sequestar o radical livre DPPH
e de proteger células L929 contra a citotoxicidade induzida por peroxido de
hidrogênio......................................................................................................... 59
Figura 17. Efeitos do EMB e do NI-F1 na fagocitose de neutrófilos apoptóticos.
......................................................................................................................... 61
Figura 18. Viabilidade de células L929 tratadas com EMB e NI-F1. ................ 63
Figura 19. Efeitos do EMB e do NI-F1 no ensaio de migração celular. ........... 64
Figura 20. Porcentagem de migração celular após tratamento com diferentes
concentrações do EMB e NI-F1. ...................................................................... 64
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Figura 21. Imagem ilustrativa dos halos de toxicidade no ensaio de agarose
overlay .............................................................................................................. 65
Figura 22. Aparência do remodelamento cicatricial in vivo após o tratamento com
o placebo e o EMB em diferentes concentrações incorporado ao creme. ....... 66
Figura 23. Área da lesão em mm2 do processo cicatricial in vivo após o
tratamento com creme incorporado com EMB. ................................................ 67
Figura 24. Percentual de hemólise após tratamento com EMB. ...................... 68
Figura 25. Viabilidade de células HepG2 tratadas com EMB e NI-F1. ............ 68
Figura 26. Esquema representativo dos resultados obtidos que mostram os
efeitos do EMB no modelo estudado. ............................................................... 69
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LISTA DE ABREVIATURAS
AA Ácido Ascórbico
AINES Anti-inflamatórios não-esteroidais
ANXA1 Anexina A1
ATP Adenosina trifosfato
APCs Células apresentadoras de antígenos
C5a Fração 5ª do sistema complemento
cAMP amp cíclico
CD18 β2-integrina
CD36 Cluster of differentiation 36 ou FAT (fatty acid translocase)
CD62L L-selectina
CD62E E-selectina
CD62P P-selectina
CEUA Cômite de ética em uso de animais
COX-2 Ciclooxigenase 2
DAMPs Danos moleculares associados a patógenos
DMEN Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimetilsulfóxido
DO Densidade ótica
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EGF Fator de crescimento endotelial
EMB Extrato metanólico bruto
EROs Espécie reativa de oxigênio
FGF Fator de crescimento de fibroblasto
FPR Receptor de peptídeos formilados
FPR2 Receptor de peptídeos formilados 2
G-CSF Fator estimulante de colônias granulocítico
HEPG2 Células de carcinoma hepatocelular
HOCl Ácido hipocloroso
ICAM Molécula de adesão intercelular
Ig Imunoglobulinas
IFN-γ Interferon-γ
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IKK I kapa B quinase
IL Interleucina
iNOS Óxido nítrico síntase induzível
IRAK Receptor de IL associados a quinases
IRFs Fator regulador da transcrição de interferon
JNK quinase c-Jun-N-terminal
L929 Células fibroblasto murino de tecido conectivo adiposo
LLCPK Células epiteliais renais
LPS Lipopolissacarídeo
LTB4 Leucotrieno B4
MAPK 38 Proteína quinase p38 ativada por mitógenos
MIP-1β Proteína inflamatória do macrófago
MPO Mieloperoxidase
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Br)
MYD88 Myeloid differentiation primary response gene 88
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxigenase
NF-ĸB Fator nuclear Kappa B
NI-F1 Niga-ichigosídeo F1
NLRP3 NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3
NO Óxido nítrico
PAF Fator de ativação plaquetária
PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos
PBS Solução tamponada com fosfato
PDGF Fator de crescimento derivado de plaqueta
PECAM-1 Molécula de adesão plaqueta endotelial
PRRs Receptor padrão de reconhecimento
SOD Superóxido dismutase
TGF-1β Fator de crescimento tecidual 1β
TLR Toll like receptor
TNF Fator de necrose tumoral
TRAF-6 Fator 6 associado ao receptor de TNF
UTP Uridina trifosfato
VCAM-1 Molécula de adesão celular vascular 1
VEGF Fator de crescimento de células endoteliais
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SUMÁRIO
SUMÁRIO ........................................................................................................ 13
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 15
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 17
2.1 Objetivo Geral .................................................................................. 17
2.2 Objetivos específicos ...................................................................... 17
3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 18
3.1 Inflamação ........................................................................................ 18
3.2 Resolução do processo inflamatório ............................................ 23
3.3 Novos tratamentos para a inflamação ........................................... 27
3.4 Plantas medicinais .......................................................................... 28
3.5 Rubus imperialis Cham. Schl ......................................................... 31
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 35
4.1 Fármacos, reagentes e solventes .................................................. 35
4.2 Obtenção do material botânico e preparação do EMB de R.
imperialis ................................................................................................ 35
4.3 Obtenção do composto NI-F1......................................................... 36
4.4 Animais ............................................................................................. 37
4.5 Questões éticas ............................................................................... 37
4.6 Doses ................................................................................................ 38
4.7 Atividade anti-inflamatória in vivo - Inflamação no tecido
subcutâneo dorsal ................................................................................. 38
4.7.1 Contagem total e diferencial de leucócitos....................................... 39
4.7.2 Determinação do número de leucócitos circulantes e eritrograma 39
4.8 Atividade anti-inflamatória in vitro ................................................ 40
4.8.1 Obtenção de neutrófilos migrados para o peritônio ........................ 40
4.8.2 Viabilidade celular (neutrófilos) ......................................................... 40
4.8.3 Determinação do NO ........................................................................... 41
4.9 Estudo in vitro da atividade sequestradora de radicais livres
(DPPH) .................................................................................................... 41
4.10 Ensaio de atividade citoprotetora ................................................ 42
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4.11 Ensaio de fagocitose in vitro ........................................................ 42
4.12 Ensaio de viabilidade celular (L929 e HepG2) ............................ 43
4.12.1 Linhagem celular e condições de cultivo ....................................... 43
4.12.2 Viabilidade celular (MTT) .................................................................. 43
4.13 Ensaio de migração celular in vitro ............................................. 44
4.13.1 Preparo da placa de cultivo .............................................................. 44
4.13.2 Scratch in vitro .................................................................................. 45
4.13.3 Análises dos dados e apresentação dos resultados ..................... 46
4.14 Desenvolvimento de formulação semissólida (creme) de uso
tópico contendo EMB de R. imperialis ................................................ 47
4.15 Ensaio de irritação (agarose overlay) .......................................... 48
4.16 Ensaio de hemólise ....................................................................... 49
4.17 Ensaio de cicatrização in vivo ...................................................... 49
4.18 Análise estatística ......................................................................... 50
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 51
6 CONCLUSÕES .................................................................................... 70
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 71
ANEXOS .......................................................................................................... 84
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1 INTRODUÇÃO
A inflamação é um mecanismo de resposta tecidual dinâmico que
desenvolveu-se ao longo da evolução humana para defender o hospedeiro
contra invasão por patógenos e outros agentes não infecciosos. Todos os
animais têm mecanismos inatos para neutralizar o agente causador da lesão
tecidual ou infecção. Organismos superiores não só são capazes de sentir e
reagir a presença do patógeno, mas também orquestram um sistema de reparo
tecidual, visando a retomada da homeostase. Um processo inflamatório
desregulado ou persistente é componente importante na patogênese de uma
série de doenças, tais como artrite reumatoide, asma, doenças inflamatórias
intestinais, aterosclerose e câncer (GILROY; MAEYER, 2015; HEADLAND;
NORLING, 2015).
O evento inflamatório possui sinais característicos como dor, calor,
rubor, tumor e perda de funçao que estão intrinsecamente associados ao tráfego
de leucócitos, vasodilatação e edema (GILROY; MAEYER, 2015; VESTWEBER,
2015). O tecido exposto à infecção, trauma ou outro estímulo conduz as células
residentes a produzir e secretar citocinas, metabólitos do ácido araquidônico,
espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, além de outros mediadores
(BARIONI et al., 2013; KRUGER et al., 2015). Além disso, leucócitos circulantes,
especialmente neutrófilos ativados, migram para a área inflamada e secretam
uma variedade de mediadores pró-inflamatórios, como por exemplo o óxido
nítrico (NO) (LI et al, 2012; SILVA et al., 2015).
Todos estes eventos, assim como a sinalização inflamatória não
resolvida, podem ocasionar danos ao tecido do hospedeiro, podendo gerar
doenças inflamatórias crônicas ou auto-imunes com eventual perda de função
dos órgãos. Desta forma, neutralizar estes estímulos lesivos, controlar a
produção de mediadores pró-inflamatórios e principalmente regular a migração
de leucócitos polimorfonucleares no foco de lesão é determinante para o
processo de resolução da inflamação (ALESSANDRI et al., 2013;
KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
A resolução do processo inflamatório possui células, mediadores,
receptores e vias de ativação próprias. Este processo é divido em três diferentes
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fases: redução da sinalização pró-inflamatória, apoptose de leucócitos e a
fagocitose de leucócitos apoptóticos por macrófagos teciduais (eferocitose). O
conjunto destes eventos asseguram que as células apoptóticas sejam
eficientemente removidas do tecido, minimizando danos teciduais e evitando a
perpetuação da resposta inflamatória além de induzir a secreção de mediadores
resolutórios, os quais contribuem para a cicatrização tecidual e o retorno da
homeostasia (HEADLAND; NORLING, 2015; LEE; SURH, 2012).
Atualmente não existe fármaco que atue nestes três eventos. Sendo
assim, a busca por novos tratamentos que atuem no processo de resolução da
inflamação é de extrema importância (GILROY; MAEYER, 2015). Nesse
contexto as plantas medicinais ganham grande relevância, uma vez que muitos
extratos e/ou compostos isolados têm apresentado resultados promissores em
diferentes modelos de inflamação.
A diversidade de plantas encontradas no Brasil permite o isolamento de
diversas substâncias biologicamente ativas. R. imperialis, uma das espécies da
família Rosacea e conhecida popularmente como amora-branca, amora-do-mato
ou amora-brava, ocorre abundantemente no sul do Brasil, sendo empregada
popularmente para o tratamento de diabetes (KANEGUSUKU et al., 2002). Um
dos componentes ativos identificados no extrato metanólico bruto de R.
imperialis (EMB) é o triterpeno niga-ichigosídeo F1 (NI-F1) o qual foi isolado com
alto rendimento das partes aéreas (ARDENGHI et al., 2006).
Estudos recentes demonstraram que o EMB apresenta atividade
antinociceptiva e gastroprotetora nos modelos de úlcera induzida por etanol e
anti-inflamatório não esteroidal indometacina, reportando também que o
tratamento com o extrato apresenta atividade curativa no modelo de úlcera
crônica induzida por ácido acético (ARDENGHI et al., 2006; BERTÉ et al., 2014).
Estes dados, em conjunto, sugerem que o EMB, bem como o NI-F1, possa ter
efeito terapêutico em diferentes doenças de origem inflamatória, atuando
principalmente na resolução do mesmo.
Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade
anti-inflamatória e cicatrizante do EMB obtido das partes aéreas de R. imperialis
e do composto isolado NI-F1 utilizando metodologias in vivo e in vitro de
citotoxicidade, migração e cicatrização celular.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a atividade anti-inflamatória e cicatrizante do EMB e do composto
isolado NI-F1 obtidos das partes aéreas de R. imperialis utilizando metodologias
in vivo e in vitro.
2.2 Objetivos específicos
a) Avaliar os efeitos do EMB e do composto NI-F1 sobre a migração de
neutrófilos no modelo de bolsa de ar induzido por LPS e carragenina;
b) Verificar a atividade anti-inflamatória e citotoxicidade in vitro do EMB e do
composto NI-F1 em neutrófilos;
c) Avaliar a fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos tratados
com EMB ou NI-F1;
d) Verificar a atividade antioxidante e citoprotetora do EMB utilizando o
ensaio de DPPH e modelo do peroxido de hidrogênio, respectivamente;
e) Avaliar a atividade do EMB e do composto NI-F1 na migração celular pelo
modelo de scratch e a citotoxicidade pelo modelo de MTT em células de
fibroblasto murinho L929;
f) Avaliar toxicidade cutânea da formulação semi-sólida (creme) de EMB e a
atividade cicatrizante in vivo no modelo de úlcera cutânea em
camundongos;
g) Verificar a atividade citotóxica do EMB e do composto NI-F1 em células de
carcinoma hepatocelular HepG2 e eritrócitos.
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3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Inflamação
Inflamação é uma resposta fisiopatológica causada por uma infecção ou
dano tecidual, a qual consiste em eventos celulares e moleculares com intuito de
eliminar o estímulo causador e retornar a homeostasia (ORTEGA-GÓMEZ, A.;
PERRETTI, M.; SOEHNLEIN, 2013). Contudo, a inflamação inicialmente é um
processo benéfico, que quando não resolvido pode vir a desenvolver uma
patologia e progredir para uma doença inflamatória como por exemplo, asma,
aterosclerose, artrite reumatoide, esclerose múltipla e rinite (ALESSANDRI et al.,
2013).
Macroscopicamente a inflamação é reconhecida pelos sinais cardinais,
calor, rubor, tumor, dor e perda de função (SMITH, J. A., 1994). Nos estágios
iniciais do processo inflamatório ocorrem modificações na hemodinâmica da
rede microcirculatória (caracterizadas pela constrição e subsequente dilatação
dos vasos da microcirculação, em especial das vênulas pós-capilares) e
aumento de permeabilidade vascular, sendo que este último ocorre pela
contração das células endoteliais. Neste processo, há aumento do fluxo
sanguíneo para o local da inflamação e extravasamento de proteínas
plasmáticas para o interstício extravascular, ocasionado por diferença de
pressão osmótica entre os compartimentos (GREEN et al., 2004).
A reação inflamatória acontece de maneira dinâmica, onde substâncias
químicas de origem celular secretadas por células residentes na área de
inflamação, da circulação e da parede microvascular contribuem para a
instalação e desenvolvimento da resposta inflamatória. Neste contexto,
participam da inflamação aminas vasoativas, como a histamina, serotonina e
bradicinina; substância P; fator de ativação plaquetária (PAF); derivados do
ácido araquidônico; óxido nítrico (NO); citocinas; componentes ativos do sistema
complemento; e fatores de coagulação (GREEN et al., 2004). A ação dos
mediadores químicos contribui para o processo de marginação de leucócitos
sobre a parede de vênulas e para subsequente migração destas células para o
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foco da lesão (KANTARI; PEDERZOLI-RIBIEL; WITKO-SARSAT, 2008;
VESTWEBER, 2015).
O início da resposta inflamatória deve ser bem regulado para evitar danos
colaterais consideráveis. Sinais moleculares gerados em resposta a danos no
tecido e/ou invasão microbiana são reconhecidos por células apresentadoras de
antígenos (APCs), tais como macrófagos e células residente do tecido que,
devido à sua localização estratégica em estreita proximidade com o local da
lesão, são as células indutoras de uma reação inflamatória (SOEHNLEIN;
LINDBOM, 2010).
As células que entram em apoptose ou morte celular resultante da
infecção ou lesão tecidual sofrem um rompimento das membranas celulares e
ocorre a liberação de componentes citoplasmáticos e nucleares conhecidos
como danos moleculares associados a patógenos (DAMPs). DAMPs são
reconhecidos por receptores de reconhecimento padrão (PRRs), tais como toll
like receptor 9 (TLR9), expressos por leucócitos que promovem a produção de
citocinas pró-inflamatórias como a interleucina-1β (IL-1β) (SOEHNLEIN;
LINDBOM, 2010; VESTWEBER, 2015).
Ainda, padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) também
podem iniciar uma resposta imune através da ativação dos PRRs nas APCs. Um
exemplo típico é a ativação do receptor de superfície do tipo toll por LPS, que
promove a produção e liberação de citocinas pró-inflamatórias, como fator de
necrose tumoral (TNF). Estas alterações moleculares e a concomitante liberação
de citocinas induzem o recrutamento de neurófilos para o sítio inflamatório
(KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; SOEHNLEIN; LINDBOM, 2010;
VESTWEBER, 2015).
Os neutrófilos são as primeiras células da circulação a interagirem com o
endotélio microvascular inflamado e migrarem em direção aos tecidos. Este tipo
celular representa em torno de 50-70% das células circulantes e são facilmente
mobilizadas e recrutadas. Além de estarem envolvidas no processo inflamatório,
estas células também auxiliam na eliminação de patógenos por vários
mecanismos, tanto intracelular quanto extracelular (MANTOVANI et al., 2011).
Neutrófilos são provenientes da medula óssea, se originam de células
tronco e desenvolvem-se em um processo chamado de granulopoese. O fator
estimulador de colônia granulocítico (G-CSF) regula o ciclo de vida do neutrófilo,
20
aumentando a proliferação celular, sobrevivência, diferenciação, tráfego e
mobilização para manutenção do pool medular e periférico (KRUGER et al.,
2015). No entanto, esta manutenção da população de neutrófilos medular e
periférico pode ser regulada por diferentes vias, tanto em condições fisiológicas
como patológicas (VESTWEBER, 2015).
Durante a inflamação, o número de neutrófilos é severamente aumentado.
Com alterações do fluxo sanguíneo pela ação de mediadores inflamatórios, os
neutrófilos circulantes passam a marginar o endotélio microvascular inflamado.
Para tal, neutrófilos devem aderir fortemente ao endotélio, para que não sejam
arrastados pela circulação sanguínea e retornem ao lúmen do vaso. Os
neutrófilos aderidos devem, então, ultrapassar a parede vascular e migrar para
os tecidos subjacentes (Figura 1) (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Figura 1. Imagem ilustrativa do processo de recrutamento dos neutrófilos do meio intravascular para o tecido.
Fonte: LEY et al., (2007).
Os neutrófilos circulantes passam a marginar o endotélio microvascular em um movimento chamado de rolling através da expressão de L-selectina, ao mesmo tempo em que o neutrófilo rola ao longo do endotélio há, também, a ativação das células endoteliais por diversos fatores quimioatráticos. A ligação destes fatores a receptores da membrana dos neutrófilos induz uma alteração conformacional nas moléculas de adesão ICAM-1 e VCAM-1 da membrana do neutrófilo, além das integrinas, as quais estabilizam a adesão do neutrófilo à célula endotelial fazendo com que o neutrófilo transmigre através da parede do vaso para os tecidos e exerça sua função.
21
O processo de extravasamento dos neutrófilos pode ser dividido em
quatro etapas sequenciais: (1) rolamento (rolling), (2) ativação por estímulos
quimioatráticos, (3) aprisionamento e adesão e (4) migração transendotelial
(KUBY et al., 2003). Estes fenômenos são dependentes de adesões celulares
de diferentes intensidades, mediadas por receptores expressos nas membranas
celulares e denominados de moléculas de adesão. Durante a resposta
inflamatória, as citocinas e outros mediadores atuam no endotélio local,
induzindo a expressão de moléculas de adesão da família das selectinas (CD62E
e CD62P), e nos leucócitos circulantes, levando a expressão da L-selectina
(CD62L) (KOLACZKOWSKA et al., 2013; MANTOVANI et al., 2011; ORTEGA-
GÓMEZ, A.; PERRETTI, M.; SOEHNLEIN, 2013).
A L-selectina é exclusivamente expressa na membrana de leucócitos, e
na vigência de um estímulo inflamatório, medeia a captura inicial de neutrófilos
à parede dos vasos. Após a ativação ela é clivada pela ação de
metaloproteinases de membrana e sua expressão portanto é passageira. A P-
selectina é encontrada em plaquetas e células endoteliais. Na vigência de um
estímulo, esta molécula é mobilizada para a membrana permitindo sua interação
com neutrófilos circulantes (ISHII et al., 2010). Estas moléculas ligam-se a
carboidratos existentes nas membranas celulares e medeiam o rolamento de
leucócitos (SMALLEY; LEY, 2005).
Ao mesmo tempo em que o neutrófilo rola ao longo do endotélio há,
também a ativação das células endoteliais por diversos fatores quimioatráticos.
Estes podem estar permanentemente na superfície das células endoteliais ou
podem ser secretados localmente pelas células envolvidas na resposta
inflamatória (VESTWEBER, 2015).
Entre os fatores quimioatráticos pode-se citar os membros da família das
quimiocinas como a interleucina-8 (IL-8), proteína inflamatória do macrófago
(MIP), algumas anafilotoxinas (C5a, C3a e o C5b67), fatores de ativação de
plaquetas (PAF), além de vários receptores de peptídeos formilados (FPR)
produzidos pela degradação de proteínas bacterianas durante a infecção. A
ligação destes mediadores a receptores de membrana dos neutrófilos
desencadeia um sinal de ativação que induz uma alteração conformacional nas
moléculas de adesão da membrana do neutrófilo, as integrinas, aumentando a
22
sua afinidade com as moléculas de adesão da superfamília das imunoglobulinas
(Ig), no endotélio (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
A subsequente interação entre as integrinas e as moléculas de adesão
celular (CAM’s) da superfamília das Ig estabilizam a adesão do neutrófilo à célula
endotelial, permitindo que a célula fagocítica fique aderida firmemente ao
endotélio. Posteriormente, o neutrófilo transmigra através da parede do vaso
para os tecidos. A passagem através da camada de células endoteliais pode
ocorrer tanto paracelular (entre as células endoteliais) ou transcelular (através
de uma célula endotelial). A transmigração paracelular ocorre preferencialmente
nas margens do endotélio, onde há menos proteínas de junção e onde o
alinhamento de células endoteliais é menos ordenado (KOLACZKOWSKA;
KUBES, 2013; PEREZ; VAGO; ATHAYDE, 2014; VESTWEBER, 2015).
No local da lesão, os neutrófilos secretam mediadores químicos a fim de
contribuir para a destruição do agente lesivo. No entanto, neste processo, em
especial nos de longa duração, os neutrófilos secretam e liberam uma variedade
de agentes químicos que contribuem para a lesão tecidual (GREEN et al., 2003,
2004; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Uma vez ativados, os neutrófilos
promovem o aumento da atividade e liberação da enzima mieloperoxidase
(MPO), uma protease presente nos grânulos azurófilos que tem importante
participação no mecanismo da resposta imune devido a formação de
substâncias oxidantes microbicidas e de espécies reativas de oxigênio (EROs)
(MALLE et al., 2007). Durante a fagocitose ocorre a ativação do sistema
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxigenase (NADPH), que está
envolvida na produção de EROs. A NADPH oxidase reduz o oxigênio molecular
ao radical ânion superóxido que é convertida em peróxido de hidrogênio pela
superóxido dismutase (SOD), o qual destrói diretamente as bactérias, ou após a
sua conversão em íons hidroxila ou ácido hipocloroso (HOCl) (KLEBANOFF et
al., 2013; PEREZ; VAGO; ATHAYDE, 2014).
Embora o recrutamento de neutrófilos durante a infecção seja essencial
para a atividade do sistema imune inato, o recrutamento exacerbado causa um
desequilíbrio nos processos inflamatórios, podendo ser muito prejudicial. Na
obesidade, por exemplo, há uma inflamação de baixo grau constante, ou seja,
sem resolução. Isto ocorre devido a liberação de DAMPs que induzem a ativação
23
da NLRP3 (proteína da família NLR) e aumentam a expressão de integrinas,
gerando aumento na adesão dos neutrófilos no endotélio e consequente
disfunção vascular (BHARGAVA et al., 2012, KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Após o estímulo inflamatório inicial, a resposta inflamatória em curso deve
ser resolvida para evitar dano tecidual excessivo e dar início ao processo de
cura. Assim, a eferocitose e o bloqueio na migração de neutrófilos para o tecido
lesado é um fator importante na resolução do processo inflamatório
(ALESSANDRI et al., 2013; BYSTROM et al., 2008).
3.2 Resolução do processo inflamatório
A resolução do processo inflamatório possui células, mediadores,
receptores e vias de ativação própria, que diferem dos processos de indução da
inflamação (SERHAN, 2007; NATHAN; DING, 2010; RECCHIUTI, 2013).
Atualmente, a resolução do processo inflamatório é dividida em três
diferentes fases: redução na sinalização pró-inflamatória, apoptose de leucócitos
e fagocitose de leucócitos apoptóticos por macrófagos teciduais (eferocitose),
seguida da migração para os linfonodos onde ocorre a apresentação dos auto-
antigenos (Figura 2) (GILROY; MAYER, 2015; LEE; SURH, 2012; SANTIN,
2013).
24
Figura 2. Imagem ilustrativa do processo de resolução da inflamação.
Fonte: SANTIN, (2013).
A resolução da inflamação inicia com a diminuição da sinalização pró-inflamatória e a liberação de mediadores anti-inflamatórios, visando inibir o influxo de neutrófilos; neutrófilos apoptóticos passam a expressar sinais de find me e eat me, alterações responsáveis pelo reconhecimento das mesmas por fagócitos para que realizem a eferocitose, assim, deixando de ser um macrófago pró-inflamatório M1 tornando-se um macrófago de reolução M2.
A fase inicial da resolução envolve a supressão da sinalização pró-
inflamatória e a liberação de mediadores anti-inflamatórios, como interleucina-10
(IL-10), fator transformador de crescimento - β (TGF-1β), enzimas proteolíticas e
mediadores lipídicos por células residentes e macrófagos. A supressão visa inibir
o influxo de neutrófilos, que é pré-requisito para a resolução da inflamação (LEE;
SURH, 2012).
No entanto, a inibição no recrutamento de neutrófilos é somente uma das
etapas importantes para o retorno da homeostasia tecidual, sendo necessária
ainda, a efetiva apoptose de neutrófilos e a eferocitose destes por macrófagos
residentes para a finalização do processo inflamatório (ORTEGA-GÓMEZ;
PERRETTI; SOEHNLEIN, 2013). Interessantemente, os neutrófilos em
processos de apoptose atenuam a inflamação por diferentes mecanismos, sendo
relevante a inversão (switch) na produção de mediadores pró para anti-
25
inflamatórios, que interferem negativamente na migração de neutrófilos. Neste
contexto, os neutrófilos secretam a proteína anexina A1 (ANXA1) (RAYNAL;
POLLARD, 1994).
A síntese da ANXA1, um anti-inflamatório endógeno é regulada
principalmente pela ação dos glicocorticóides, sendo uma importante proteína
na ação anti-inflamatória tanto dos glicocorticóides sintéticos, como endógenos
(HEADLAND; NORLING, 2015; PERRETTI; D`ÁQUISICTO, 2004; 2009;
SOLITO et al., 2006; WEIN et al., 2004).
Em condições basais, ANXA1 é encontrada no citoplasma de neutrófilos,
macrófagos e monócitos de humanos e murinos. Em condições de ativação
celular, a ANXA1 é rapidamente deslocada do citoplasma para a membrana,
secretada e liga a um receptor de sete domínios transmembrana acoplado a
proteína G, o receptor de peptídeo formilado 2 (FPR2) (PERRETTI, et al., 1996;
VONG et al., 2007).
A atuação da ANXA1 está relacionada com a sua capacidade de interagir
com as membranas celulares. Em condições inflamatórias, principalmente por
mecanismo justácrino, esta interação é reversível e regulada especialmente por
modificações pós-translacionais, como a fosforilação, da porção N-terminal
(SCHLAEPFER; HAIGLER, 1987). A interação da ANXA1 com o receptor FPR2
é importante na resolução do processo inflamatório modulando a adesão e
migração de leucócitos, além de promover a apoptose de neutrófilos e a
eferocitose destes por macrófagos (HEADLAND; NORLING, 2015; ORTEGA-
GÓMEZ; PERETTI; SOEHNLEIN, 2013; PERRETTI et al., 2002; SOLITO, 2006;
SCANNELL et al., 2007).
Durante o processo de apoptose ocorrem alterações na expressão de
moléculas na superfície de células em processo de morte, sendo estas
alterações responsáveis pelo reconhecimento das mesmas por fagócitos
(FADOK et al., 1998; GARDAI et al., 2006; GREGORY; POUND, 2010).
Neutrófilos apoptóticos passam a expressar sinais de find me e eat me,
as sinalizações de find me são fatores secretados pelo neutrófilo que atraem
macrófagos. Quatro sinais de find me estão bem descritos na literatura, sendo
estes a lisofosfatidilcolina, esfingosideo 1-fosfato, fractalcina e os nucleotídeos
adenosina trifosfato (ATP) e uridina trifosfato (UTP) (ELLIOTT et al., 2009; GUDE
et al., 2008; LAUBER et al., 2003; TRUMAN et al., 2008). As sinalizações de eat
26
me são marcadores de superfície que permitem a identificação da célula em
apoptose. São moléculas expostas na membrana da célula ou que sofrem
modificações durante apoptose, como por exemplo, os peptídeos derivados do
domínio N-terminal da ANXA1. O mais conhecido e descrito sinal de eat me é a
fosfatidilserina (BLUME et al., 2012; FOX et al., 2010).
Assim, a interação entre os sinais de eat me das células apoptóticas e o
reconhecimento deste por receptores nos macrófagos levam a firme adesão
celular e a subsequente ativação das vias de fagocitose. Em conjunto, estes
eventos asseguram que as células apoptóticas sejam eficientemente removidas
do tecido, antes da ruptura de membranas com a liberação de mediadores
citotóxicos, minimizando danos aos tecidos e evitando a perpetuação da
resposta inflamatória (ALESSANDRI et al., 2013).
Os macrófagos, responsáveis pela eferocitose de neutrófilos apoptóticos,
são células que possuem importante plasticidade funcional e fenotípica, que se
torna aparente durante a fase de resolução do processo inflamatório (CHANG;
LEE; KIM, 2014; ORTEGA-GÓMEZ; PERETTI; SOEHNLEIN, 2013). No
processo de resolução da inflamação, os macrófagos se apresentam como
peças chave no processo regulatório do reparo, apresentando ação fagocitica
degradando e removendo componentes de tecido conjuntivo danificado. Além
disso, os macrófagos atuam secretando fatores de crescimento responsáveis
pela proliferação celular e prostaglandinas que funcionam como potentes
vasodilatadores, afetando a permeabilidade da rede microcirculatória
(MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).
Os macrófagos possuem um fenótipo de plasticidade que explica o seu
papel protetor. Eles são classificados como alternativamente ou classicamente
ativado. O perfil "ativação clássica" (M1) é caracterizado pela expressão de
citocinas do tipo 1 (IFN-γ, TNF). Assim, as células M1 desempenham um papel
importante na proteção contra agentes patogênicos, produzindo altos níveis de
IL-1β, IL-6, e IL-12, por exemplo. Adicionalmente, estas células expressam níveis
elevados de ciclooxigenase-2 (COX-2) e exercem atividade antiproliferativa e
citotóxica. Os macrófagos de resolução (M2) possuem propriedades bactericidas
mais fraca e expressão de IL-4 e IL-10. Este fenótipo eleva os níveis de AMP
cíclico intra-celular (cAMP) estimulando a imunidade adquirida através de
27
recrutamento de linfócitos e interrupção de tráfego de células inflamatórias
(BYSTROM et al., 2008).
Após a eferocitose de neutrófilos apoptóticos ocorre a inibição na
produção de citocinas pró-inflamatórias e de mediadores lipídicos, com
concomitante aumento na transcrição de citocinas anti-inflamatórias em
macrófagos, que se caracteriza principalmente pela liberação de IL-10, TGF-1β
e fator de crescimento de células endoteliais (VEGF) (FADOK et al., 1998). A
liberação destes mediadores é extremamente importante para o retorno da
homeostasia e também para o reparo tecidual (LASKIN et al., 2011; MARLOW;
VAN GENT; FERGUSON, 2013).
A fagocitose de células apoptóticas não só previne que os macrófagos
ativados mantenham células residentes do tecido mas também provoca a
liberação no endotélio vascular de VEGF e outros fatores de crescimento que
são cruciais para o reparo tecidual (SOEHNLEIN; LINDBOM, 2010).
Macrófagos também são importantes por produzirem uma diversidade de
fatores de crescimento, dentre os quais se incluem: fator de crescimento
endotelial (EGF), fator de crescimento dos fibroblastos (FGF), fator de
crescimento derivado das plaquetas (PDGF), TGF-1β e VEGF. A quimiotaxia de
fibroblastos e sua proliferação é uma das funções dos fatores de crescimento,
sendo que FGF também atua positivamente na migração e proliferação de
queratinócitos, e TGF-1β na deposição de elementos da matriz pelos
fibroblastos. Ainda, o VEGF e o FGF atuam como potentes fatores angiogênicos.
Juntos, estes eventos colaboram para a correta cicatrização e reparo tecidual
(ENOCH; LEAPER, 2008; FRANÇA, 2015).
3.3 Novos tratamentos para a inflamação
A compreensão das etapas do processo inflamatório que envolvem o
processo de iniciação por células fagocíticas, controle, progressão e finalmente
a resolução é importante para a melhoria das intervenções terapêuticas,
permitindo o desenvolvimento de terapias específicas com efeitos secundários
limitados para tratar os processos inflamatórios.
28
Os farmácos anti-inflamatórias não esteroidais (AINES) e esteroidais são
eficazes no tratamento dos sintomas clínicos específicos. No entanto, estas
abordagens se concentram em controlar os sinais cardinais da inflamação,
principalmente antagonizando caminhos específicos que são envolvidos na
inflamação aguda e a maioria delas apresentam efeitos adversos indesejáveis.
Neste sentido, a busca por novas terapias tem como foco a outra extremidade
da cascata de inflamação, ou seja, a resolução da resposta inflamatória
(ALESSANDRI et al.,2013; HEADLAND; NORLING, 2015).
Cada estágio da cascata de resolução da inflamação representa uma
oportunidade para impulsionar a inflamação em curso para a via de resolução.
No entanto, não será o mesmo caminho para todas as doenças inflamatórias,
tendo em vista que os processos de resolução podem variar de tecido para tecido
e ser dependente da natureza do estímulo prejudicial (GILROY; MAEYER, 2015;
SOEHNLEIN; LINDBOM, 2010;).
No contexto da busca por novos tratamentos, as plantas medicinais
ganham grande importância, já que muitos extratos e/ou compostos isolados têm
apresentado resultados promissores em diferentes modelos de inflamação, e
podem atuar em diferentes etapas do processo de resolução da mesma.
3.4 Plantas medicinais
O uso de plantas medicinais pela humanidade ocorre desde os primórdios
da civilização e, durante séculos as plantas eram a única fonte de agentes
terapêuticos para o homem (CALIXTO et al., 2008). O estudo das drogas
vegetais surgiu como uma necessidade do homem em separar as plantas
comestíveis das tóxicas. Posteriormente, este estudo empírico passou ao
objetivo de proteção e cura contra enfermidades. A história do desenvolvimento
das civilizações oriental e ocidental possui exemplos do emprego dos recursos
naturais na medicina, como o uso da morfina isolada a partir da Papaver
somniferum em 1804 (ALVES, 2001; BARREIRO; BOLZANI, 2009).
A química farmacêutica desenvolveu-se no início do século XIX e
estabeleceu o uso de plantas como fonte de escolha para a obtenção de
princípios ativos para o desenvolvimento de medicamentos. As plantas, cujas
29
propriedades terapêuticas são conhecidas e amplamente utilizadas na medicina
popular para o tratamento de diversas patologias recebem a denominação de
plantas medicinais (BOORHEM; LAGE, 2009).
Pesquisas tem evidenciado que quando se procura obter substâncias
ativas através de plantas, é muito provável encontrar atividade biológica
naquelas orientadas pelo seu uso popular do que nas escolhidas ao acaso
(YUNES; CECHINEL FILHO, 2001).
Um exemplo do papel da etnomedicina em guiar a descoberta e
desenvolvimento de novos medicamentos está relacionado aos fármacos
antimaláricos. Nas cascas de espécies de Cinchona officinalis foi isolado o
composto quinina, tradicionalmente utilizada por grupos indígenas na região
amazônica para o tratamento da febre, e consequentemente servindo de base
para síntese de cloroquina. Pesquisas posteriores realizadas por cientistas
chineses, permitiram isolar da Artemisia annua o composto artemisinina, com o
qual formularam novas drogas antimaláricas. Porém, o aumento da prevalência
de malária bem como a resistência que o parasita adquiriu perante as drogas
disponíveis, demandou a descoberta de novos compostos e possíveis análogos
sintéticos antimaláricos como o febrifugine e halofugine, isolados da Dichroa
febrífuga na última década, que atuam sobre três estágios do parasita (CRAGG;
GROTHAUS; NEWMAN, 2012; PINES; SPECTOR, 2015).
A biodiversidade do Brasil é considerada uma fonte de substâncias
biologicamente ativas e sua preservação é fundamental tanto pelo valor
intrínseco dessa imensa riqueza biológica como pelo seu enorme potencial de
fonte para novos fármacos. As populações das zonas rurais e florestas do Brasil
dependem da medicina popular e tradicional para o tratamento de muitas
doenças infecciosas. Algumas espécies são incluídas nas prescrições para fins
terapêuticos, como a cicatrização de feridas, inflamação, infecções microbianas
ou parasitárias, lesões de pele e úlceras (ABREU et al., 2015; ALVES; ROSA,
2007; ARAUJO,1979; MAZZARI; PRIETO, 2014).
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
(BRASIL, 2014), são considerados medicamentos fitoterápicos aqueles obtidos
com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e
30
segurança sejam baseadas em evidencias clínicas e que sejam caracterizados
pela constância de sua qualidade.
O desenvolvimento do setor de plantas medicinais e fitoterápicos
configura-se como importante estratégia para o enfrentamento das
desigualdades regionais existentes em nosso país, podendo prover a
ampliação das opções terapêuticas ofertadas aos usuários do Sistema Único de
Saúde (SUS), com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e
serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade (ABREU
et al., 2015; YAZBEK et al., 2015).
Diante desta realidade, várias pesquisas de bioprospecção dos nossos
biomas vêm sendo incrementadas objetivando a busca racional de bioprodutos
de valor agregado, bem como desenvolvimento tecnológico e conhecimento
científico sobre as plantas resultando em inovação e isolamensto de compostos
terapeuticamente eficazes para o tratamento de diferentes patologias
(BARREIRO; FRAGA, 1999; COSTA, 2002).
Um resultado notável envolvendo a parceria de uma indústria e uma
universidade é o produto Acheflan®, um eficiente anti-inflamatório tópico
desenvolvido a partir do α-humuleno, um flavonóide extraído das folhas da planta
Cordia verbenacea. Compostos fenólicos, tais como catequinas e outros
flavonóides, são capazes de inibir a expressão de genes alvos que são
indispensáveis para a produção de vários mediadores inflamatórios tais como,
prostaglandinas e a expressão de moléculas de adesão (CRAGG; GROTHAUS;
NEWMAN, 2014; SALDANHA et al., 2015).
A utilização de substância protótipo ou das plantas medicinais como
fitoterápico, evidencia a importância da investigação científica para o
desenvolvimento de um medicamento. Estas pesquisas devem ser direcionadas
à valorização e modulação da atividade farmacológica a ser explorada,
garantindo a ação terapêutica, a segurança de utilização, bem como a viabilidade
de produção (BALUNAS et al., 2005; YAZBEK et al., 2015).
31
3.5 Rubus imperialis Cham. Schl
O gênero Rubus pertencente à família Rosacea é constituído de muitas
espécies empregadas na medicina popular em vários países para o tratamento
de diferentes patologias, especialmente como agente hipoglicemiante no
tratamento da Diabetes mellitus. Rubus é um dos cem gêneros da família
Rosaceae, com diversas classes de compostos com atividades biológicas
comprovadas (ALVES et al., 2014; NIERO; CECHINEL-FILHO, 2008).
Estudos fitoquímicos e farmacológicos têm mostrado que algumas
espécies produzem princípios ativos que exercem atividade gastroprotetora,
antioxidante, antitumoral e anti-inflamatória (ALVES et al., 2014; PATEL;
ROJAS-VERA; DACKE, 2004). Pesquisas atuais com o gênero Rubus,
demonstraram a atividade anti-proliferativa da espécie Rubus fairholmianus em
células de carcinoma colorretal por meio de indução de apoptose (PLACKAL
GEORGE; TYNGA; ABRAHAMSE, 2015). Já a Rubus coreanus reduziu a
expressão e a produção de vários mediadores inflamatórios, através da
supressão da ativação do fator nuclear κB (NF-ĸB) (LEE et al., 2014).
R. imperialis ocorre abundantemente no sul do Brasil, sendo conhecida
como amora-do-mato, amora-branca, amora rosa ou amora-brava (NIERO et al.,
1999). É uma planta arbustiva, de ramos angulosos com flores de pétalas
brancas. O fruto é composto de inúmeras drupas verde-amareladas, são
saborosos, suculentos e adocicados, esta espécie possui grande potencial para
a utilização em geléias, doces em calda e outros derivados ou até mesmo para
consumo in natura (Figura 3) (BIANCHINI, 2010).
Figura 3. Imagem das partes aéreas (folhas e caules) de R. imperialis.
Fonte: SILVA-LOPES, (2010).
32
Estudos fitoquímicos realizados por pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI,
demonstraram a presença de alguns terpenos e derivados do ácido elágico
(Figura 4), como o NI-F1 (niga-ichigosídeo F1 ou ácido 23-hidroxitormêntico-28-
O-glicosídeo) (1), ácido 23-hidroxitormêntico (2), ácido 4’metil-3-O-metilelágico
(3) e ácido 3-O-metil-4’-O-α-ramnose elágico (4) (BELLA CRUZ et al., 2006).
Figura 4. Estruturas moleculares dos fitoconstituintes presentes nas partes áereas de R. imperialis.
1 2
34
OH
OH
OH
OH
COOGlicose
OH
OH
OH
COOH
OH
O
OH
OH
OH
O
O O
OH
O
O
O
OO
O
O
OH
O
O
OOH
Fonte: BELLA CRUZ et al., (2006).
Os extratos obtidos de diferentes partes da planta (folhas, caule e raiz)
foram testados em alguns modelos de dor específicos (contorções
abdominais induzidas por ácido acético e dor induzida por formalina) os quais
mostraram-se ativos. O principal componente ativo foi identificado como o
triterpeno NI-F1, o qual foi isolado com alto rendimento das folhas. Este
composto foi aproximadamente 30 vezes mais potente que a aspirina e o
paracetamol no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético em
camundongos, além de prevenir tanto a dor de origem neurogênica como a dor
de origem inflamatória do teste da formalina (NIERO et al., 1999).
Um estudo de Müller (2007), demonstrou que o extrato metanólico bruto
das partes áereas de R. imperialis foi ativo contra o vírus herpes simples tipo 1.
Para este gênero, a ocorrência de taninos e flavonóides foi relatado, o que leva
33
a propor que estes compostos podem estar relacionados com a atividade
antiviral detectada (GUDEJ; TOMCZYK, 2004).
Alves e colaboradores, (2014) realizaram a avaliação genotóxica e os
resultados indicaram que a mistura de compostos encontrados no EMB não foi
capaz de induzir um aumento significativo no número de células com quebras no
DNA ou micronúcleos, quando administrada em doses únicas de 50 mg/kg de
peso corporal. Doses testadas de EMB não mostraram efeitos genotóxicos em
leucócitos de células sanguíneas ou hepáticas periféricas pelo teste do cometa,
sem qualquer diferença significativa na média de contagens obtidas, quando
comparados com aqueles obtidos com o controle.
Ardenghi e colaboradores (2006), demonstraram que o composto NI-F1
presente na R. imperialis exerce um efeito antinociceptivo sistêmico em modelos
de dor em camundongos induzidos por formalina, glutamato e capsaicina. Em
relação ao mecanismo de ação do NI-F1, os resultados mostram que parece
estar relacionado com diferentes sistemas, tais como a via dopaminérgica,
taquicininérgica, L-arginina-óxido nitrérgica e glutamatérgica, cujos efeitos
farmacológicos podem ser mediados centralmente por um mecanismo não
específico. Estes resultados são de interesse porque suportam que o NI-F1 é útil
no desenvolvimento de novas drogas analgésicas para a gestão de vários tipos
de dor.
O composto NI-F1 também foi isolado da espécie R. coreanus, e este
mostrou-se efetivo inibindo inflamação em modelos animais de artrite reumatóide
e também reduzindo lesões gástricas em modelo de úlcera induzida por etanol
em ratos (NAN et al., 2006).
Berté e colaboradores (2014) demonstraram que o EMB de R. imperialis
apresenta atividade gastroprotetora nos modelos de úlcera induzida por etanol e
AINES, além de promover aumento no pH gástrico. Ainda, este trabalho reporta
que o tratamento com o extrato apresenta atividade curativa no modelo de úlcera
crônica induzida por ácido acético, ou seja, apresenta atividade na resolução do
processo inflamatório.
Estes dados, em conjunto, sugerem que o EMB e o NI- F1 possam ter
efeito terapêutico em diferentes doenças de origem inflamatória, tanto na
indução do processo como na resolução do mesmo. Assim, este projeto visou
34
investigar o efeito anti-inflamatório e cicatrizante do EMB e do NI-F1 utilizando
técnicas in vitro e in vivo.
35
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Fármacos, reagentes e solventes
Indometacina, carragenina, lipopolissacarideo, glicogênio de ostra e
tioglicolato foram adquiridos da Sigma Aldrich. Água ultra-pura foi obtida
utilizando sistema Milli-Q (Millipore, Massachusetts, USA). Todos os outros
reagentes e solventes empregados foram de grau analítico.
4.2 Obtenção do material botânico e preparação do EMB de R. imperialis
A preparação do EMB e a obtenção do NI-F1 foram realizados
previamente por Silva-Lopes (2010), como parte da monografia de conclusão do
curso de Farmácia pela UNIVALI.
Partes aéreas de R. imperialis foram coletadas na localidade de São
Sebastião, no município de Treze de Maio (SC) em agosto de 2008. Após a
coleta, o material foi limpo e seco em estufa a 40°C e então triturado em moinho
de martelos. O peso total foi de 1,1 kg. Uma exsicata foi depositada no Herbário
Barbosa Rodrigues sob número VC-Filho nº 036 (SILVA-LOPES, 2010).
O material vegetal foi submetido à maceração por 12 dias em percolador
empregando-se o metanol como líquido extrator. Após este período, todo o
solvente foi removido resultando numa massa total de 127,5 g (12,7 %) de
extrato metanólico bruto (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998, SILVA-LOPES,
2010).
A partir do EMB foram realizadas sucessivas partições líquido/líquido com
os solventes hexano clorofórmio e acetato de etila. Todas as frações também
foram concentradas em rota evaporador a pressão reduzia para manter a
integridade das mesmas. Essa etapa visa uma pré-purificação do extrato bruto,
separando os compostos químicos por afinidade pelo solvente em questão
(CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998, SILVA-LOPES, 2010).
Um fluxograma das operações realizadas encontra-se na figura 5.
36
Figura 5. Fluxograma resumido da preparação do EMB e obtenção das frações.
Fonte: SILVA-LOPES (2010).
4.3 Obtenção do composto NI-F1
O NI-F1 foi obtido da fração de acetato de etila, através de cromatografia
em coluna aberta utilizando-se uma mistura de clorofórmio e metanol em
diferentes proporções como fase móvel. Esta coluna forneceu 146 frações onde
a subfração 93-119 apresentou maior grau de pureza e foi identificado como o
triterpeno niga-ichigosídeo F1 (Figura 6) com massa de 140mg. Este composto
Cromatografia de
coluna aberta CCA
(CHCl3:MeOH)
Composto
isolado NI – F1
(140mg)
Frações 93-119
37
já tem sido isolado em outros trabalhos desenvolvidos pelo NIQFAR (SILVA-
LOPES, 2010; BERTÉ, 2014).
Figura 6. Estrutura molecular do ácido 23-hidroxitormêntico-28-O-glicosídeo (NI-F1).
1
OH
OH
OH
OH
COOGlicose
Fonte: BELLA CRUZ et al., (2006).
4.4 Animais
Para realização dos experimentos, camundongos Balb/C machos com 2
a 3 meses de idade e peso entre 25 e 35 g foram fornecidos pelo Biotério da
Universidade do Vale do Itajaí - UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas
de polipropileno, em salas com controle de temperatura (22-25ºC), umidade (40-
60%) e ciclos controlados (claro/escuro, 12 horas cada), tendo ração e água ad
libitum. Os animais foram ambientados por um período de 5 dias antes da
realização dos experimentos.
Os procedimentos experimentais foram realizados após indução de
anestesia com cloridrato de ketamina (7 mg/kg) e cloridrato de xilazina (0,7
mg/kg) administrados pela via intraperitoneal.
4.5 Questões éticas
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios
éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O presente projeto foi
38
submetido e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade
do Vale do Itajaí - UNIVALI (Protocolo CEUA/UNIVALI 022/14) (Anexo 1).
4.6 Doses
As doses empregadas no presente trabalho foram baseadas em estudos
anteriores. Para os ensaios in vivo foi utilizada a menor dose com efeito
farmacológico significativo (BERTÉ et al., 2014, NIERO et al., 1998). As doses
utilizadas in vitro foram escolhidas com base em estudos publicados
recentemente utilizando técnicas similares a deste projeto (SILVA et al., 2015).
4.7 Atividade anti-inflamatória in vivo - Inflamação no tecido subcutâneo
dorsal
Um compartimento estéril denominado bolsa de ar, foi desenvolvido pela
administração de 3 mL de ar estéril utilizando filtro (TPP Spritzen-Syringe-Filter
0,22 µm) acoplado a uma seringa no tecido subcutâneo da região dorsal de
camundongos Balb/C, os quais foram anestesiados previamente a este
procedimento. Três dias após a primeira injeção de ar, um reforço foi realizado
pela injeção de mais 3 mL de ar estéril, segundo o procedimento descrito por
Sedgwick (1986) e por Jain e Parmar (2011).
Seis dias após a primeira injeção, os animais foram pré-tratados por via
oral com EMB (100 mg/kg), NI-F1 (60 mg/kg), indometacina (30 mg/kg, controle
positivo) ou com veículo solução tamponada de fosfato (PBS, controle negativo).
Animais sham receberam somente PBS e a anestesia para a coleta do lavado
da bolsa de ar, e não receberam tratamentos farmacológicos. Uma hora após os
tratamentos, uma solução de LPS (150 mg/mL por animal) ou carragenina (1%)
foi injetada diretamente na bolsa de ar. Quatro horas mais tarde, após a injeção
de LPS ou carragenina, uma pequena incisão foi realizada na bolsa de ar para
obtenção do lavado do infiltrado inflamatório (Figura 7).
39
Figura 7. Delineamento experimental do modelo de bolsa de ar
Seis dias após a primeira injeção de ar estéril no tecido subcutâneo, os animais foram pré-tratados por via oral com soluções de EMB (100 mg/kg), NI-F1 (60 mg/kg), indometacina (30 mg/kg, controle positivo) ou com o veículo (PBS, controle negativo). Uma ou quatro horas após a injeção de LPS ou carragenina, os animais foram anestesiados, eutanasiados e uma pequena incisão foi realizada na bolsa de ar para obtenção do lavado do infiltrado inflamatório.
4.7.1 Contagem total e diferencial de leucócitos
Com o conteúdo coletado da bolsa de ar, foram confeccionados os
esfregaços celulares para a contagem diferencial dos leucócitos. Após o preparo
dos esfregaços, estes foram corados pelo método de May-Grünwald-Giemsa. A
contagem celular diferencial (polimorfonucleares e mononucleares) foi realizada
em microscópio óptico comum, com auxílio de objetiva de imersão (aumento de
1000 vezes), contando-se 100 células por lâmina. A contagem de leucócitos
totais foi determinado em câmara de Neubauer. Os resultados foram expressos
em número total de células por mL.
4.7.2 Determinação do número de leucócitos circulantes e eritrograma
Após os tratamentos com o EMB, NI-F1, indometacina ou veículo, os
animais foram anestesiados e o sangue foi coletado em EDTA 10% por punção
da veia cava abdominal para a contagem de leucócitos totais, diferencial e
40
eritrograma. Em seguida os animais foram eutanasiados por exsanguinação pela
secção das artérias carótidas, e da veia cava abdominal.
O número de leucócitos totais e o eritrograma foi determinado em
equipamento de hematologia automatizado (Celldyn 3000 - Abbott). A contagem
diferencial foi realizada em esfregaços corados por panótico em microscopia
óptica.
4.8 Atividade anti-inflamatória in vitro
4.8.1 Obtenção de neutrófilos migrados para o peritônio
Foram injetados 3 mL de solução de glicogênio de ostra (1%, i.p.) para
estimular o recrutamento de leucócitos para cavidade peritoneal. Após um
período de quatro horas, os animais foram novamente anestesiados e
exsanguinados por secção da artéria carótida. Em seguida, 3 mL de PBS foram
injetados na cavidade peritoneal e após suave massagem, as células foram
removidas com auxílio de pipeta Pasteur. As células obtidas foram submetidas
à centrifugação (600 g, 15 min, 4ºC) e o pellet formado foi ressuspendido em 1
mL de meio DMEN (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado com
10% de Soro Fetal Bovino. A quantificação total de neutrófilos foi feita em câmara
de Neubauer. Um total de 1 x 106 neutrófilos foram adicionados por poço em
placas de cultura de 96 poços, com volume final completado para 300 µL com
meio DMEN, para obtenção da cultura celular empregada nos ensaios descritos
abaixo.
4.8.2 Viabilidade celular (neutrófilos)
Para excluir possíveis efeitos citotóxicos do EMB e do composto NI-F1
sobre neutrófilos, ensaios de viabilidade celular foram realizados. Para tanto,
neutrófilos foram mantidos em cultura por 18 horas com incubação simultânea
de EMB, NI-F1 e LPS (5 µg/mL), em estufa de CO2 atmosfera úmida, a 37 ºC 5%
CO2. Vale ressaltar que este foi o maior período de incubação empregado neste
estudo. Após o período de incubação, 10 µL de suspensão de neutrófilos foram
41
acrescidos a 10 µL de azul de tripan e a quantificação das células viáveis (não
coradas) foi realizada em câmara de Neubauer.
4.8.3 Determinação do NO
O NO foi indiretamente quantificado pela formação de seus metabólitos
nitrato (NO3-) e nitrito (NO2-), utilizando a reação de Griess (GREEN et al., 1982).
Para a quantificação indireta da produção de NO, neutrófilos foram mantidos em
cultura por dezoito horas com incubação simultânea do EMB ou do composto NI-
F1 (1,10 e 100 µM) estimulados ou não com LPS (5 µg/mL), em estufa de CO2.
Após a incubação, a concentração de nitrito (NO2-) foi determinada no
sobrenadante das culturas de neutrófilos utilizando a reação de Griess (1% de
sulfanilamida com 0,1% de α-naftil etilenodiamida, preparado no momento do
uso) em placa de 96 poços.
A reação de NO2- com esse reagente produz uma coloração rósea, que
foi quantificada por meio da leitura das densidades óticas. Após 10 minutos de
incubação em temperatura ambiente, a absorbância de cada amostra foi
determinada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 550nm.
Curvas-padrão com concentrações previamente conhecidas de NO2- (0 - 150
µM) também tiveram as densidades óticas determinadas, permitindo a
quantificação dos valores de nitrito/nitrato, em µM, com auxílio da equação da
reta.
4.9 Estudo in vitro da atividade sequestradora de radicais livres (DPPH)
Este procedimento foi realizado de acordo com o método descrito por
Blois (1958) e por Chen et al. (2005), com algumas modificações. O potencial
redutor do radical livre estável 2,2-diphenil-1-picrilhydrazil (DPPH) do EMB foi
determinado a partir das absorbâncias medidas em espectrofotômetro a 517 nm.
Solução de 750 µL do extrato em diferentes concentrações (0,01, 0,1, 1,
10, 100 e 1000 µg/mL) foram misturados a 250 µL de solução metanólica de
DPPH (1 mg em 25 mL). Após cinco minutos, o decréscimo da absorbância foi
mensurado. Solução de ácido ascórbico (AA: 50 µg/mL) foi utilizada como
42
controle positivo do teste e água purificada grau analítico I como controle
negativo.
4.10 Ensaio de atividade citoprotetora
O ensaio de atividade citoprotetora para investigar os efeitos protetores
do EMB perante a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio (H2O2) foi realizado
utilizado um protocolo de pré tratamento de células L929, as quais foram
semeadas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEN e incubadas
durante 24h (37 °C e 5% CO2). Posteriormente as células foram cultivadas na
presença ou ausência de diferentes concentrações do EMB (0,1, 1, 10 ou 100
µg/mL) e em seguida foi adicionado 200 µM de H2O2 por duas horas. Após este
período, as células foram lavadas com PBS e adicionou-se em todos os poços
solução de MTT (5mg/mL) e as mesmas foram mantidas em estufa a 37°C, por
uma hora. A absorbância foi determinada e a viabilidade celular foi quantificada
por MTT.
4.11 Ensaio de fagocitose in vitro
Os macrófagos foram obtidos através da injeção intraperitoneal de
tioglicolato de sódio 4% em camundongos Balb/C. Quatro dias após a injeção de
tioglicolato os animais foram anestesiados e a cavidade peritoneal foi lavada com
PBS estéril. Após a centrifugação, as células foram ressuspendidas em meio
RPMI. A suspensão celular (1x106 células/poço) foi incubada em placa de 24
poços, sobre lamínula de vidro redonda, por duas horas, 37 ºC com 5% CO2 para
a aderência dos macrófagos. Após este período, os poços foram lavados três
vezes com PBS estéril para a retirada das células não aderidas e adicionados
os tratamentos, R. imperialis (1, 10 e 100 µg/mL) ou NI-F1 (1,10 e 100 µM) após
uma hora foram adicionados os neutrófilos senescentes (1x106 neutrófilos/poço).
Os neutrófilos senescentes foram obtidos previamente da cavidade
peritoneal de camundongos Balb/c através da administração de glicogênio de
ostra (0,1%, i.p.) e incubados em placa de 24 poços, com meio DMEN (1x106
neutrófilos/mL), por 18 horas a 37ºC com 5% CO2 para atingirem o estado de
43
senescência. As lamínulas foram lavadas 1 vez com PBS para retirada do
excesso de neutrófilos senescentes e coradas com solução corante de May
Grumwald-Giemsa modificada (ROSENFELD, 1947).
Posteriormente, as lamínulas secas foram coladas inversamente em
lâminas de vidro com Bálsamo do Canadá. A leitura das lâminas montadas foi
realizada em microscópio óptico com objetiva de imersão. Foram observados
500 macrófagos e o resultado da fagocitose de neutrófilos senescentes foi
expressa em porcentagem
4.12 Ensaio de viabilidade celular (L929 e HepG2)
4.12.1 Linhagem celular e condições de cultivo
As células utilizadas foram adquiridas do banco de células do Rio de
Janeiro, fibroblastos murino linhagem NCTC clone 929 [L CELL, L-929], de
origem de tecido conectivo adiposo e células de carcinoma hepatocelular
(HepG2) (ATCC: HB-8065).
No cultivo celular in vitro, células de fibroblasto murino L929 e HepG2
desenvolveram-se como culturas aderentes cultivadas em garrafas plásticas
(poliestireno) estéreis da Techno Plastic Products (TPP). O meio de cultura
DMEM (Vitrocell®) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Gibco®)
foi adicionado às garrafas. As células foram mantidas em estufa sob atmosfera
contendo 5% de CO2 à temperatura de 37°C. A subcultura foi realizada de acordo
com a confluência das células na garrafa, utilizando-se a solução de tripsina-
EDTA para desprender as células aderidas. Para o armazenamento das
linhagens, as células, foram suspensas em meio de cultura suplementado com
10% SFB e 10% de DMSO (Dimetilsulfóxido) e armazenadas em nitrogênio
líquido.
4.12.2 Viabilidade celular (MTT)
As culturas celulares foram mantidas em estufa a 37 °C com 5% de CO2.
As células L929 e HepG2 foram plaqueadas (50.000 células/poço) em
44
microplacas de 96 poços (TTP) e mantidas a 37°C com 5% de CO2. Após duas
horas, foram adicionados 10 µL do EMB (0,1, 1, 10, 100 µg/mL) ou NI-F1 (0,1,
1, 10 e 100 µM). Como controle positivo de citotoxicidade foi empregado
dimetilsufóxido a 10% (DMSO). O crescimento celular foi revelado pelo ensaio
de redução do (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Br)
(MTT) (Sigma Inc.). Após 21 horas de incubação a 37°C com 5% CO2 foram
adicionados 10 µL de MTT (5 mg/mL) e a placa mantida mais três horas em
estufa a 37°C e com 5% CO2. Ao término desse período, o sobrenadante foi
retirado, e para a dissolução dos cristais de formazan formados pela redução do
MTT foi adicionado 100 µL de DMSO. A densidade óptica (DO) de cada poço foi
determinada em espectrofotômetro de microplacas em 570 nm (Asxys Expert
Plus, Microplate Reader G020 150, Eugendorf, Salzburg, ÁUSTRIA) (BABICH;
BORENFREUND, 1992; DENIZOT; LANG, 1986).
Os resultados em densidade ótica (DO) realizados em quadruplicata
foram analisados após eliminação do background de migração das células de
cada experimento, empregando como indicador a percentagem de migração foi
calculada de acordo com Florão e colaboradores (2007).
4.13 Ensaio de migração celular in vitro
4.13.1 Preparo da placa de cultivo
Após crescimento celular em alta confluência em monocamada mantida
na garrafa de cultivo, células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 24
poços e mantidas em estufa até atingirem máxima confluência, como
demonstrado na figura 8.
45
Figura 8. Imagem das células L929 confluentes.
4.13.2 Scratch in vitro
Após confluência na placa de 24 poços, o meio de cultivo foi retirado dos
poços e com o auxílio de uma ponteira (tip 200) foi realizado um risco contínuo
na superfície medial de cada poço, de acordo com a figura 9. Este procedimento
ocasiona uma ruptura do contato entre as células e a retirada destas de uma
determinada região da placa, resultando na formação de uma lesão mecânica
na monocamada (VEDULA et al., 2013).
Figura 9. Formação do rasgo na monocamada de células L929.
Fonte: Adaptado de VEDULA et al., (2013).
Após confluência na placa de 24 poços cada poço (A) foi submetido ao stress mecânico através da ruptura da monocamada com um “rasgo” contínuo utilizando uma ponteira de micropipeta (B), após a retirada das células desaderidas as céulas adjacentes tendem a migrar em direção ao espaço livre na placa (C).
Seguindo o experimento, os poços foram lavados com PBS para remoção
das células debridadas, após foi realizado o tratamento das células com EMB (1,
10 e 100 µg/mL) ou NI-F1 (1, 10 e 100 µM), imediatamente após o tratamento os
poços foram fotografados seguindo o protocolo demostrado na figura 10.
46
Posteriormente, foi feito o acompanhamento avaliando a migração das células
adjacentes em direção ao espaço livre na placa conforme a figura 9.
Figura 10. Esquema de tratamento das células.
É importante ressaltar que antes do plaqueamento das células, foi
realizada uma marcação central utilizando um marcador permanente objetivando
uma melhor padronização na confecção do rasgo e das medidas. Esta marcação
estabelece um campo visual no poço, o qual foi analisado posteriormente após
o estabelecimento do rasgo na monocamada, em tempo zero e 24 horas.
4.13.3 Análises dos dados e apresentação dos resultados
O cultivo com os tratamentos foi mantido e controlado após scratch pelo
período de 24 horas. A condição controle foi realizada com veículo de diluição
dos componentes (PBS). Nos tempos zero (logo após o trauma mecânico) e 24
horas o ensaio foi analisado utilizando microscópio de contraste de fase
(Olympus CKX 41) e as imagens capturadas com uma câmera digital acoplada
ao microscópio, com aumento final de 100x. As análises foram realizadas
medindo a área sem migração, obtida na região do “risco” em mm2 utilizando o
software ImageJ1.46r. A análise dos resultados foi realizada a partir do cálculo
da % área de cobertura de migração usando a fórmula abaixo:
% da área de cobertura 24 h = Área em 24 h x 100
Área em T0
- 100
47
4.14 Desenvolvimento de formulação semissólida (creme) de uso tópico
contendo EMB de R. imperialis
Esta etapa foi desenvolvida no laboratório de tecnologia farmacêutica do
Programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas com a orientação da
Profª. Drª. Ruth Meri Lucinda Silva, Profª. Drª. Angelica e da doutoranda Ana
Flávia Fischer.
Foi desenvolvida uma formulação semi-sólida do tipo creme na qual foi
incorporado o EMB nas concentrações 1 e 2,5%, conforme tabela abaixo:
Tabela 1. Composição do creme base contendo EMB
Componentes Concentração (%)
EDTA 0,1
Phenonip® 0,7
Polymol® 0,9
BHT 0,003
Propilenoglicol 5
Água purifica Qsp
EMB de R. imperialis 1
EMB de R. imperialis 2,5
Hostacerim® 12
Os componentes (phenonip®, EDTA, BHT, polymol® e água) foram
aquecidos e dissolvidos separadamente em banho-maria. Após resfriarem a
temperatura ambiente, foi adicionado a esta mistura o EMB já levigado com
propilenoglicol e por último esses componentes foram incorporados ao creme
base hostacerim®.
Após o preparo, os cremes de EMB foram acondicionados em recipiente
plástico de 50g com tampa e mantidos sob refrigeração.
48
4.15 Ensaio de irritação (agarose overlay)
A linhagem celular de fibroblasto murino L929, na concentração de 3,0 ×
105 células/mL foi semeada em placas de 6 poços e incubada durante 24h a
37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após esse período, com a
monocamada de células já formada, o meio de cultura foi desprezado e
adicionado meio DMEM contendo 0,01% de vermelho neutro como corante vital
por uma hora no escuro.
Posteriormente o excesso de corante vital foi removido e lavado com PBS,
em seguida foi adicionado em cada poço 3 mL da mistura de agarose com meio
DMEM (1:1,2 de meio agarose:meio DMEM - mistura overlay) e incubado por 30
minutos até a solidificação. As amostras do creme base com EMB foram
incorporadas em discos de papel (0,54 cm), previamente esterilizados e
colocados no meio dos poços das placas. Como controle positivo foi utilizado
Triton-X® e como controle negativo o meio DMEM. As placas foram incubadas
por 24 horas em estufa (37 °C com 5% CO2).
O grau de irritação foi avaliado pela zona de lise (ausência de
incorporação do corante vital) por meio do uso de paquímetro, segundo a
classificação descrita pela Farmacopéia Americana (United States
Pharmacopeia, 2006) (quadro 1).
Quadro 1: Classificação do grau de irritação cutânea.
Classificação Reatividade Descrição da zona de reatividade
0 Nenhum Nenhuma reatividade ao redor da amostra
1 Leve Alguma má formação ou degeneração ao redor da
2 Médio Zona limitou a área ao redor da amostra
3 Moderado Zona estende 0,5 a 1,0 cm além da amostra
4 Severo Zona estende maior que 1,0 cm além da amostra
49
4.16 Ensaio de hemólise
A atividade hemolítica do EMB e do NI-F1 foi investigada de acordo com
o método de Parnham Wetzig, (1993). O sangue de dois animais foi coletado em
tubos heparinizados e centrifugados a 1000g durante 10 minutos. O sedimento
foi lavado três vezes com PBS (pH 7,4) gelado através de centrifugação a 1000g
durante 10 minutos e re-suspendidas com o mesmo tampão. Diferentes doses
do EMB em PBS (1, 10, 100 e 1000 µg/mL) e de NI-F1 (1, 10, 100 e 1000 µM)
foram adicionados à suspensão de eritrócitos que foi incubada durante uma hora
a 37˚C. Após o período de incubação, as células foram centrifugadas e o
sobrenadante foi usado para mensurar a absorbância da hemoglobina liberada
em 540 nm. O valor médio foi calculado a partir de ensaios em duplicata. A
hemólise completa foi realizada utilizando 0,2% de Triton X-100 obtendo-se o
100% como valor de controle positivo. Foram utilizados também tubos contendo
apenas PBS como controle negativo. Menos de 10% de hemólise foi considerada
efeito não-tóxico. Os dados observados foram expressos como % de liberação
de hemoglobina em comparação com 100% de hemólise do mesmo número de
células utilizando 0,2% de Triton X-100 e 2% de Triton X-100 (PARNHAM E
WETZIG, 1993).
4.17 Ensaio de cicatrização in vivo
Com a finalidade de avaliar a atividade do EMB sobre a regeneração
tecidual foi realizado o modelo de cicatrização de úlcera cutânea em
camundongos, segundo metodologia descrita por Cross, Thompson e Roberts
(1996).
Para o experimento foram utilizados 10 camundongos Balb/c macho, os
quais foram separados em três grupos: grupo I (placebo, creme base), grupo II
creme com EMB a 1% e grupo III creme com EMB a 2,5%. Passado o período
de aclimatação dos animais, estes foram anestesiados por via intraperitoneal,
procedeu-se então em todos os animais a tricotomia e demarcação da área de
produção das úlceras. Após assepsia por álcool 70% uma excisão cirúrgica foi
feita com auxílio de um punch de um 1,5 cm de diâmetro, sendo retirados pele e
gordura subcutânea com auxílio de tesoura e pinça anatômica (Figura 11).
50
Figura 11. Confecção das úlceras cutâneas no dorso do animal.
(A) Tricotomia do dorso; (B) Determinação do local para confecção da úlcera; (C) Confecção da
úlcera com o punch.
Posteriormente ao procedimento cirúrgico, durante os 10 dias seguintes
as úlceras cutâneas foram tratadas uma vez ao dia mediante os tratamentos
descritos anteriormente e fotografadas separadamente com auxílio de uma
régua de 30 cm perpendicular a úlcera para a padronização da unidade de área
das lesões, em milímetros. Percorridos os períodos estabelecidos de tratamento,
foi realizado a eutanásia dos animais e as análises morfométricas das feridas. A
partir das fotografias, as áreas das úlceras foram calculadas pelo software EARP
em mm2.
4.18 Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos como média ±
erro padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por análise de
variância com comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário, foram
utilizados como pós-teste o Teste de Tukey-Kramer ou Dunett. Os dados foram
analisados no programa GraphPad Prism, admitindo como significativamente
estatístico o p<0,05. Os resultados obtidos neste estudo foram correlacionados
com dados de estudos prévios reportados pela literatura.
51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Células fundamentais para a resposta inflamatória inata, os neutrófilos
apresentam a característica de responder rapidamente a estímulos lesivos e,
assim, são as primeiras células a chegarem ao foco de lesão, exercendo
atividades secretória, fagocíticas e microbicidas, na tentativa de eliminar o
agente lesivo (ALESSANDRI et al., 2013). No entanto, a exacerbação das ações
neutrofílicas durante o processo inflamatório podem ser prejudiciais às células
do hospedeiro. Desta forma, os neutrófilos são células alvo importantes para a
ação de agentes terapêuticos, sendo o controle da migração de neutrófilos para
o local da lesão um fator importante para limitar o evento inflamatório e induzir a
resolução do processo (ALESSANDRI et al., 2013, ORTEGA-GÓMEZ, A.;
PERRETTI, M.; SOEHNLEIN, 2013).
Os neutrófilos são células polimorfonucleares que possuem meia vida
curta, cerca de 6 a 8 horas, sendo constantemente produzidos pela medula
óssea (BORREGAARD, 2010; SEELY; PASCUAL; CHRISTOU, 2003).
Aproximadamente 108 a 1011 neutrófilos são produzidos diariamente em
humanos e integram três populações distintas: 1) na medula, de granulócitos
maduros, prontos para serem recrutados; 2) em vasos da microcirculação de
alguns tecidos; e 3) o circulante. Durante um processo inflamatório, o número
destas células na circulação aumenta significativamente e este é um parâmetro
indicativo de resposta inflamatória (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2010; KRUGER
et al., 2015). Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que o EMB de
e o composto NI-F1 exercem efeitos sobre as funções neutrofílicas ligadas a
capacidade destas células migrarem para o foco da lesão inflamatória. Uma vez
que o efeito do EMB e do composto NI-F1 sobre a migração de neutrófilos in vivo
foi avaliado no tecido subcutâneo dorsal de camundongos na vigência de ação
do LPS ou carragenina. O modelo de bolsa de ar é útil para a triagem de novos
fármacos anti-inflamatórios, particularmente aqueles derivados de plantas
medicinais (SALEH; CALIXTO; MEDEIROS, 1996). O LPS é um
lipopolisacarídeo encontrado na parede celular de bactérias gram-negativa e é
capaz de desencadear uma importante resposta inflamatória a partir da ativação
de receptores tipo Toll (TRLs) que são expressos na membrana celular de
52
neutrófilos. Após a ativação específica do TLR4 pelo LPS, ocorre a ativação de
vias inflamatórias, principalmente a via do NF-κB, a qual desempenha um
importante papel regulatório na expressão de genes pró-inflamatórios e induz a
liberação de mediadores que promovem a quimiotaxia de leucócitos para o foco
de lesão (ALESSANDRI et al., 2013; VESTWEBER, 2015).
Os dados obtidos mostram que o pré-tratamento com EMB ou NI-F1
reduziu de maneira significativa o número de leucócitos migrados para a bolsa
de ar. O EMB apresentou melhor atividade anti-inflamatória quando comparado
aos dados obtidos em animais pré-tratados com controle positivo do
experimento, o fármaco indometacina (Figura 12). Já o composto NI-F1
apresentou valores equivalentes ao controle positivo (Figura 12). A análise
diferencial das células migradas para a bolsa de ar demonstrou que o tratamento
com o EMB e NI-F1, bem como a indometacina reduziram a migração de
leucócitos (Figura 12A), especificamente neutrófilos (Figura 12B) para o foco de
lesão. Ainda, dados de hemograma (Tabela 2) demostram que animais pré-
tratados com EMB apresentam neutrofilia no sangue periférico, este resultado
pode sugerir uma menor migração de células para o foco de lesão.
Figura 12. Efeitos do EMB e do NI-F1 no modelo de bolsa de ar induzida por LPS.
Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Balb/C. Os animais receberam os tratamentos por via oral uma hora antes da injeção de 2 mL de LPS, o lavado do infiltrado inflamatório foi coletado 4 horas após a injeção de LPS nas bolsas de ar. A determinação do número total de células do exsudato (A) foi realizado em câmara de Neubauer por microscopia óptica e o valor diferencial (B) foi realizado em esfregaços corado pelo Pánotico por microscopia óptica. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 5 animais em cada grupo. **p<0,01 e *** p<0,001 vs grupo veículo.
53
Tabela 2. Efeitos do tratamento com EMB e NI-F1 sobre os parâmetros eritrocitários e leucocitários.
Grupos Naive Veículo Indometacina EMB NI-F1
RBC 106/mm3 7,510 ± 0,19 7,580 ± 0,52 7,69 ± 0,28 7,060 ± 0,60 8,550 ± 0,23
Hemoglobina g/dL 12,70 ± 0,24 12,90 ± 0,95 13,00 ± 0,58 11,90 ± 0,80 14,10 ± 0,51
Hematócrito % 39,60 ± 1,00 37,60 ± 2,88 39,75 ± 1,89 33,70 ± 3,19 46,20 ± 1,50
Plaquetas /mm3 396,0 ± 58,2 405,0 ± 24,5 404,0 ± 58,5 420,0 ± 64,2 325,0 ± 21,8
Leucócitos /mm3 2,200 ± 0,37 1,100 ± 0,13 2,000 ± 0,33 1,000 ± 0,29 1,100 ± 0,20
Neutrófilos % 12,00 ± 5,46 15,00 ± 2,96 7,500 ± 1,11 29,00 ± 7,02* 14,00 ± 1,14
Linfócitos % 82,00 ± 6,34 82,00 ± 3,83 84,00 ± 2,70 67,00 ± 7,61* 81,00 ± 1,66 Dados expressos como média ± e.p.m. de cinco animais por grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA seguido do pós-teste de Tukey. *p > 0,05 vs veículo.
Uma hipótese para explicar este evento seria de que o extrato altera a
expressão de moléculas de adesão, como a CD62 e a CD18, moléculas
importantes e responsáveis pelo processo de migração das células
polimorfonucleares da circulação para o tecido inflamado. No entanto, não há
dados na literatura demonstrando os efeitos de extrato do gênero Rubus sobre
a expressão destas moléculas.
A molécula de adesão CD62L é exclusivamente expressa na membrana
de leucócitos e medeia o comportamento de rolamento dos neutrófilos na parede
do vaso. Esta molécula de adesão se torna altamente expressada na membrana
celular quando ocorrem alterações hemodinâmicas ou pela ativação de
mediadores inflamatórios. Após o processo de ativação, a CD62L é clivada pela
ação de metaloproteases de membrana, regulando a distribuição de células
polimorfonucleares no organismo (CHAVAKIS; CHOI; CHAVAKIS, 2009; KAMP
et al., 2012).
Na sequência dos eventos do processo de transmigração, os neutrófilos
se tornam hábeis à responder a substâncias quimiotáxicas, como por exemplo,
o LTB4, a fração 5a do sistema complemento (C5a) e/ou quimiocinas. Estas
substâncias induzem a expressão das integrinas, moléculas que medeiam à
firme adesão dos leucócitos ao endotélio vascular para posterior transmigração
para o foco de lesão (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Em se tratando de
neutrófilos, as integrinas de maior interesse são as da família das β2-integrinas.
As β2-integrinas ligam-se a diferentes componentes da membrana celular e às
moléculas de adesão da superfamília das imunoglobulinas (ICAM1 e 2, VCAM-
54
1 e PECAM-1) presentes no endotélio. A expressão destas moléculas no
endotélio quiescente é baixa, no entanto, durante um processo inflamatório suas
expressões são aumentadas, promovendo assim a firme adesão dos neutrófilos
no endotélio vascular e a sua posterior transmigração. Já na matriz
extravascular, os leucócitos migram de forma orientada em direção ao foco de
lesão em resposta a agentes quimiotáxicos secretados por células residentes
(VESTWEBER, 2015).
A deficiência na adesão em leucócitos prejudica o processo de rolamento
e adesão de leucócitos às células endoteliais e causa grave imunodeficiência. A
relevância das moléculas de adesão no tráfego de leucócitos para o tecido
inflamado é demonstrada em humanos portadores de mutações no gene que
codifica a cadeia que compõe as β2-integrinas em leucócitos e medeia a adesão
vascular. Estes indivíduos apresentam deficiência na adesão leucocitária,
neutrofília e escassez de neutrófilos circulantes (ETZIONI, 2009; VESTWEBER,
2015).
Resultados semelhantes aos obtidos no modelo de bolsa de ar induzido
por LPS foram obtidos no modelo de bolsa de ar induzido por carragenina (Figura
13).
Diferente da ação do LPS, a carragenina produz reação inflamatória não
imunólogica, caracterizada pela produção acentuada de mediadores
inflamatórios, incluindo prostaglandinas, leucotrienos e citocinas, bem como
influxo significativo de leucócitos, principalmente de neutrófilos para o foco de
lesão (FRÖDE; SOUZA; CALIXTO, 2002).
O pré-tratamento com EMB e NI-F1 reduziu significativamente a migração
de células para a bolsa de ar, principalmente de neutrófilos, quando comparado
ao grupo veículo, apresentando efeitos semelhantes a indometacina (Figura 13).
Este dado é interessante, pois evidencia que ambos, EMB e NI-F1, não atuam
somente em uma via de sinalização. Ainda, os resultados obtidos corroboram
com dados da literatura que demonstram que o extrato de Rubus coreanus, outra
espécie do gênero Rubus, e o composto NI-F1 apresentam atividade anti-
inflamatória e antinociceptiva (NAN et al., 2006).
55
Figura 13. Efeitos do EMB e do NI-F1 no modelo de bolsa de ar induzida por carragenina.
Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Balb/C. Os animais receberam os tratamentos por via oral uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina, o lavado do infiltrado inflamatório foi coletado 4 horas após a injeção de carragenina nas bolsas de ar. A determinação do número total de células do exsudato (A) foi realizado em câmara de Neubauer por microscopia óptica e o valor diferencial (B) foi realizado em esfregaços corado pelo Pánotico por microscopia óptica. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 5 animais em cada grupo. **p<0,01 e *** p<0,001 vs grupo veículo.
Para complementar os resultados obtidos in vivo, ensaios in vitro foram
realizados para avaliar a atividade anti-inflamatória do EMB e do NI-F1.
Inicialmente foi realizado um ensaio para avaliar a citotoxicidade do EMB e do
NI-F1 em neutrófilos. Os dados obtidos demonstraram que ambos, extrato e NI-
F1, não apresentam citotoxicidade significativa em neutrófilos, uma vez que
mesmo a maior concentração de extrato (100 �g/mL) ou do composto (100 �M)
utilizada não provocou alteração da viabilidade celular (Figura 14). Este dado é
importante, pois possibilitou concluir que os demais resultados deste estudo não
refletem citotoxicidade em neutrófilos do extrato e do composto isolado.
56
Figura 14. Viabilidade celular de neutrófilos tratados com EMB e do NI-F1.
Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Balb/C machos (glicogênio de ostra 1%, 4 horas). Neutrófilos (1x 106) foram incubados na presença ou ausência de LPS (5 µg/mL) juntamente com EMB (1, 10 e 100 µg/mL) ou NI-F1 (1, 10 e 100 µM) por um período de 18 horas. A quantificação da viabilidade celular foi realizada pela técnica de exclusão com azul de trypan. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 5 a 7 animais em cada grupo.
Como já citado anteriormente, a ligação do LPS ao receptor TLR-4 ativa
vias intracelulares, dependente ou não da molécula adaptadora myeloid
differentiation primary response gene 88 (MyD88). Na via dependente de MyD88,
o receptor de IL-1 associados a quinases 4 e 1 (IRAK-1 e IRAK-4) é recrutado
para a molécula MyD88, onde resíduos de aminoácidos são fosforilados e
recrutam o fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF-6). Tanto o IRAK-1
quanto o TRAF-6 dissociam-se do receptor, o qual nesta condição ativa o
complexo IKK, resultando na translocação dos dímeros p50/p65 do NF�B para
o núcleo. Além da ativação do NF�B, a via dependente de MyD88 ativa proteínas
quinases p38, ativadas por mitógenos (MAPK 38) e a quinase c-Jun-N-terminal
(JNK). Na via independente de MyD88, o TLR-4 ativado recruta a molécula
adaptadora TRIF, levando à indução de IRFs e a translocação tardia de NF�B.
Ambas as vias resultam na ativação do NF�B, levando à síntese gênica de
moléculas pró-inflamatórias, à expressão e ativação de enzimas, como a COX-
2, expressão de moléculas de adesão e produção de NO a partir da óxido nítrico
síntase induzida (iNOS) (MIDWOOD et al., 2009; HE et al, 2013).
A síntese de NO não é regulada unicamente pela quantidade de iNOS,
mas também pela disponibilidade de cofatores que participam desta síntese
como NADPH, cálcio, L-arginina e BH4. O tetracofactor BH4 é necessário para
a produção de NO pela iNOS. Quando diminuem os níveis deste cofator a
57
enzima iNOS se desacopla diminuindo a produção de superóxido, portanto,
níveis normais de BH4 são necessários para a manutenção da função vascular
do NO (MCNEILL; CHANNON, 2012).
A produção de NO pelo endotélio vascular é um regulador fundamental
da homeostase vascular. Doenças vasculares também estão associadas com
inflamação sistêmica, refletindo, por exemplo, em níveis elevados de
marcadores tais como a proteína C reativa, e produção de NO a partir da iNOS.
Assim, o NO tem múltiplas e complexas funções no organismo, tanto na
patofisiologia vascular como na resposta inflamatória local e sistêmica
(GRANGER; KVIETYS, 2015).
O mediador inflamatório NO, que se encontra aumentado em processos
inflamatórios, se mostrou reduzido em neutrófilos tratados com EMB e NI-F1. Os
dados apresentados na figura 15 mostram que o LPS induziu a produção de NO,
quantificado indiretamente pela concentração de nitrito no sobrenadante das
culturas celulares pelo método de Griess. O tratamento com o EMB (10 e 100
µg/mL) e o composto NI-F1 (10 e 100 µM) reduziram de maneira significativa a
produção de NO em neutrófilos estimulados com LPS (Figura 15), sendo o EMB
mais efetivo do que o NI-F1.
Figura 15. Efeitos do EMB e do NI-F1 na produção de NO em neutrófilos estimulados com LPS.
Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Balb/C machos (glicogênio de ostra 1%, 4 horas). Neutrófilos (1x 106) foram incubados na presença ou ausência de LPS (5µg/mL) juntamente com EMB (1, 10 ou 100 µg/mL) ou NI-F1 (1, 10, 100 µM) por um período de 18 horas. A quantificação de nitrito foi realizada pela reação de Griess. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 3 a 7 animais em cada grupo. ##p<0,01 vs controle basal; **p<0,01 vs respectivo controle basal.
Este resultado está de acordo com o trabalho de Lee e colaboradores
(2014) que demostraram que o extrato de Rubus coreanus atenua a resposta
58
inflamatória induzida por LPS em macrófagos por diminuir a produção de
mediadores inflamatórios, principalmente de NO. O mesmo efeito foi observado
com Rubus idaeus, Rubus occidentalis e Rubus fruticosus, onde o tratamento
com estes extratos diminui a produção de NO em células RAW264.7 estimuladas
com LPS (LI et al., 2014). Cuevas-Rodrigues e colaboradores (2010), citam que
este efeito na produção de NO é devido a uma diminuição na expressão gênica
da enzima iNOS, com consequente diminuição na expressão proteica.
O NO é caracterizado como o mais importante fator relaxante derivado do
endotélio, e exerce funções autócrinas e parácrinas mantendo o tônus vascular
e a permeabilidade microvascular. Os efeitos do NO na resposta inflamatória são
complexos e envolvem a quimiotaxia de leucócitos e o aumento da
permeabilidade vascular, o que acaba por favorecer o aumento da exsudação
(VON KNETHEN; SOLLER; BRUNE, 2007). Quando o processo inflamatório é
estabelecido, a enzima iNOS é expressada nas células endoteliais e é a principal
fonte geradora de NO (LUIKING; ENGELEN; DEUTZ, 2010). Os macrófagos e
as células endoteliais estimulados por citocinas pró-inflamatórias, como o TNF e
a IL-1β, induzem a ativação da enzima iNOS, e consequentemente ocorre
aumento nas concentrações de NO (VAJDOVICH, 2008).
Assim como o aumento na síntese e liberação do NO, bem estabelecido
em processos inflamatórios, existe também a síntese e liberação de outros
importantes sinalizadores inter e intracelulares, os quais têm a função principal
de amplificar o processo inflamatório, com destaque para as citocinas pró-
inflamatórias. Dentre as citocinas pró-inflamatórias, destacam-se o TNF e a IL-
1β que possuem papel preponderante em diversas doenças de caráter
inflamatório. O TNF e a IL-1β induzem a produção/liberação de outras citocinas
e quimiocinas, expressão de moléculas de adesão, angiogênese e mediacção
de efeitos inflamatórios sistêmicos, como a febre, a hipotensão além de
promoverem a neutrofilia (FERRANTE, 1992; TINCANI et al., 2007).
Adicionalmente, o EMB apresentou atividade antioxidante no modelo de
DPPH (Figura 16A) nas doses de 10 – 1000 µg/mL. Neste método ocorre a
doação de um elétron para o radical DPPH estabilizando-o, e por isso este passa
da coloração violeta para amarelo, cuja a alteração de cor pode ser monitorada
espectrofotometricamente (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005). Ainda, o EMB de
apresentou efeito citoprotetor em células L929 expostas a H2O2 (Figura 16B).
59
Juntos, estes resultados reforçam claramente que a redução em dano oxidativo
está correlacionado com as propriedades antioxidantes do EMB, incluindo a
atividade sequestrante.
Figura 16. Efeitos do EMB sobre a capacidade de sequestar o radical livre DPPH e de proteger células L929 contra a citotoxicidade induzida por peroxido de hidrogênio.
A) Atividade sequestradora do radical livre DPPH pelo EMB (1-1000 µg/mL) e do ácido ascórbico (50 µg/mL) in vitro. B) Efeito protetor do EMB de R. imperialis contra a citotoxicidade do peroxido de Hidrogênio em células L929. As células foram co-tratadas com EMB e 200 µM de H202. Resultados são apresentados como média ± E.P.M.. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Tukey. *p< 0,05; **p< 0,01; ***p< 0,001 vs. grupo veículo ou basal.
Os métodos utilizados para avaliar a capacidade antioxidante visam
determinar a habilidade que os antioxidantes têm em sequestrar os radicais livres
gerados durante a reação. A inflamação é uma patologia associada aos danos
ocasionados pelos EROs, onde ocorre aumento da expressão de quimiocinas,
provocam ativação de proteases e lesão tissular. Estudos indicam uma
correlação importante da atividade antioxidante e anti-inflamatória de diversas
espécies de produtos naturais (ERKAN; AYRANCI; AYRANCI, 2008).
Dados da literatura utilizando a espécie fruticosus, conhecida como
amora, demonstraram que o extrato das folhas apresenta forte atividade
antioxidante evidenciada em diferentes métodos (DENEV et al., 2014).
Na continuidade do processo inflamatório, os macrófagos apresentam-se
como peças chave no processo de regulação do reparo, apresentando ação
fagocitária degradando e removendo componentes de tecido conjuntivo
danificado. Além disso, macrófagos atuam produzindo e secretando fatores de
60
crescimento, como EGF, FGF, PDG, TGF-1β e VEGF que estimulam a
proliferação celular e a angiogênese (ENOCH; LEAPER, 2008; MENDONÇA;
COUTINHO-NETTO, 2009).
Os macrófagos possuem um fenótipo de plasticidade que explica estas
ações. Atualmente os macrófagos são classificados como alternativamente ou
classicamente ativados. O perfil "ativação clássica" ou tipo M1 é caracterizado
pela expressão de citocinas como interferon-γ (IFN-γ) e TNF, ou seja, um
macrófago que desempenha papel pró-inflamatório. Já, os macrófagos do tipo
M2 ou macrófagos de resolução possuem propriedades bactericidas mais fraca
e expressão de IL-4 e IL -10, tendo assim uma função anti-inflamatória
(BYSTROM et al., 2008).
Macrófagos do tipo M1, após a fagocitose de neutrófilos apoptóticos, em
um processo denominado eferocitose, mudam seu perfil fenotípico para o tipo
M2, ocasionando a inibição na produção de citocinas pró-inflamatórias e de
mediadores lipídicos, com concomitante aumento na transcrição de citocinas
anti-inflamatórias e fatores de crescimento (FADOK et al., 1998). A liberação
destes mediadores é extremamente importante para o retorno da homeostasia e
também para o correto reparo tecidual (MARLOW; VAN GENT; FERGUSON,
2013).
A fagocitose de células apoptóticas não só previne a eliminação das
células pelos macrófagos ativados, como também provoca a liberação no
endotélio vascular de VEGF e outros fatores de crescimento (SOEHNLEIN,
LINDBOM; 2010). A deficiência na eliminação de neutrófilos apoptóticos tem sido
associada com a autoimunidade e inflamação crônica e a remoção eficiente
destas células apoptóticas por macrófagos é crucial para a resolução do
processo inflamatório (ALESSANDRI et al., 2013).
Os dados aqui obtidos mostram que o EMB e o NI-F1 favorecem a
eferocitose (Figura 17), ou seja, estimulam a atividade de macrófagos para que
fagocitem neutrófilos apoptóticos.
61
Figura 17. Efeitos do EMB e do NI-F1 na fagocitose de neutrófilos apoptóticos.
Macrófagos de animais Balb/C foram tratados ou não com EMB de R. imperialis ou NI-F1 durante 1 hora. Os neutrófilos foram incubados por 18 horas para se tornarem apoptóticos e incubados com os macrófagos por 2 horas. Dados expressos como média ± e.p.m. de macrófagos obtidos de cinco animais por grupo. Análise estatística realizada utilizando ANOVA seguida dos pós-teste de Tukey. *p<0,05 vs basal.
Este aumento na fagocitose evocado pelos tratamentos pode ser
decorrente do aumento na expressão de proteínas de membrana, como a
fosfatidilserina e a CD36, que são importantes mediadores na sinalização de eat
me do processo de eferocitose. É importante ressaltar que esta é a primeira vez
que se reporta esta atividade ao EMB e ao NI-F1. Após a eferocitose, os
macrófagos sinalizam a inibição da secreção de citocinas pró-inflamatórias, e
passam a sinalizar para secreção de citocinas anti-inflamatórias, mediadores
lipídicos e fatores de crescimento (FADOK et al., 1998). Com base nisto, a
próxima etapa do estudo foi avaliar os efeitos do EMB e do NI-F1 no processo
de migração celular.
A fibroplasia é uma etapa fundamental na formação de um novo tecido,
sendo caracterizada pela migração e proliferação de células, principalmente de
fibroblastos, os quais irão formar o tecido de granulação (ENOCH; LEAPER,
2008; SINGER; CLARK, 1999). A proliferação celular é um processo central em
condições fisiológicas e possui papel essencial no processo de reparo tecidual
(WALSH; FAN, 1997).
62
Um modelo amplamente empregado e de baixa complexidade para o
estudo da migração celular é o “scratch assay” (SUDSAI et al., 2013;
TEWTRAKUL et al., 2015). Este método e muito útil para estudar o potencial de
extratos e ou compostos isolados no reparo de feridas (BALEKAR et al., 2012).
Neste ensaio uma monocamada de células em estado confluente é
submetida a uma lesão mecânica promovendo a descontinuidade da adesão
celular, fazendo com que as células presentes na borda do rasgo migrem para o
lado posterior ocasionando o preenchimento do espaço até que novos contatos
célula-célula sejam estabelecidos (LOO; HALLIWELL, 2012). Para a
mensuração dos resultados, imagens são capturadas no início do ensaio (logo
após o “rasgo”) e em intervalos regulares durante a migração celular até o
fechamento do espaço criado pela ruptura na monocamada. Comparando as
imagens, durante o período, pode-se quantificar a taxa de migração celular
(LIANG; PARK; GUAN, 2007).
No entanto, primeiramente é importante avaliar se o tratamento com EMB
e NI-F1 não apresentam citotoxicidade sobre as células empregadas no ensaio
de scratch. Para verificar a citotoxicidade foi empregado o ensaio de MTT. Este
método quantifica a coloração formada em espectrofotômetro a partir da redução
do MTT pela atividade da succinato desidrogenase mitocondrial das células
vivas, sendo convertido em sal formazan, formando cristais de coloração azulada
que, após dissolução com DMSO, permite a quantificação (MOSMANN, 1983).
Para grande maioria das linhagens celulares, há uma relação linear entre
a quantidade formazan formado e o número de células vivas. Quando as células
morrem elas perdem a capacidade de reduzir o MTT a cristais púrpuros de
formazan, assim a cor púrpura serve como marcador de células vivas. Portanto,
a porcentagem de crescimento obtida corresponde ao número de células
presentes no cultivo celular e indica o efeito induzido pelo composto adicionado
ao cultivo celular (ESTEVES-SOUZA et al., 2002; MANOSROI et al., 2005;
RISCO et al., 2003; SUNILA; KUTTAN, 2004; XU et al., 1999).
Os dados apresentados na figura 18 (A e B) demostram que EMB não
apresenta citotoxicidade em fibroblastos L929 após 24 horas em todas as doses
avaliadas. No entanto, o NI-F1 demonstrou citotoxicidade na menor e maior dose
63
empregada. Com base nestes dados foi realizado o ensaio de scratch para
verificar se o extrato e o NI-F1 induzem a migração de L929.
Figura 18. Viabilidade de células L929 tratadas com EMB e NI-F1.
Dados expressos como média ± e.p.m. Análise estatística realizada utilizando ANOVA seguida dos pós-teste de Tukey. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs Basal.
Os dados obtidos no modelo de scratch demonstram que o tratamento
com EMB promoveu aumento na migração celular de células L929, enquanto o
NI-F1 não apresentou alteração significativa (Figura 19).
Os dados até aqui obtidos, em conjunto, demonstram que o EMB e o NI-
F1 atuam em diferentes etapas do processo de resolução do processo
inflamatório: a) bloqueio da migração de células; b) diminuição na produção de
NO; c) diminuição do estresse oxidativo; d) aumento da fagocitose de células
apoptóticas; e) aumento da migração celular.
64
Figura 19. Efeitos do EMB e do NI-F1 no ensaio de migração celular.
Ilustração das imagens do cultivo celular utilizando o software ImageJ1.46r para avaliação. Imagem da monocamada no tempo zero e 24 h após a execução do scratch com e sem adição de tratamento. A seta indica a diminuição da área e um subsequente aumento na área de cobertura do rasgo através da migração celular.
Figura 20. Porcentagem de migração celular após tratamento com diferentes concentrações do EMB e NI-F1.
Os valores representam a média ± e.p.m. da % de migração das células L929 em 24 após o scratch em relação ao tempo zero (n = 3). A análise estatística foi realizada com ANOVA seguida do pós-teste de Tukey.*p<0,05 e *p<0,01 vs basal.
65
Desta forma, na continuidade do trabalho foi avaliada a capacidade
cicatrizante in vivo do EMB, visto que, o extrato apresentou resultados mais
significativos quando comparado ao composto NI-F1 e não apresentou
citotoxicidade em nenhuma dose empregada nos ensaios. Deste modo, foi
desenvolvida uma forma semi-sólida (creme) com o extrato incorporado em
diferentes concentrações (1 e 2,5%), afim de melhor avaliar os efeitos
cicatrizantes in vivo do EMB.
No entanto, segundo a ANVISA para a avaliação da segurança de
produtos, é essencial o uso de metodologias alternativas que reduzam a
pesquisa com animais. Neste contexto, a utilização de culturas celulares com
corante vermelho neutro tem excelente aplicabilidade para testar a
citotoxicidade. Deste modo, foi realizado o ensaio de agarose overlay, o qual
consiste de um ensaio de difusão em gel, onde o material é aplicado � superfície
de um gel de agarose em contato com células de tecido conjuntivo de
camundongo (L929) e a citotoxicidade é avaliada através da observação do
di�metro médio do halo de lise celular revelado pela coloração. Os dados obtidos
utilizando esta técnica demostraram que o creme contendo EMB não apresenta
citotoxidade, sendo enquadrado na classificação zero, ou seja, não apresenta
nenhuma reatividade (Figura 21).
Figura 21. Imagem ilustrativa dos halos de toxicidade no ensaio de agarose overlay
66
Uma vez que o creme contendo EMB não apresentou tocixidade no ensaio
de agarose overlay, foi realizado o ensaio de cicatrização in vivo. Os dados
obtidos durante o experimento, reportam visualmente que o EMB incorporado a
formulação semi-sólida de um creme apresenta efeitos cicatrizante in vivo
quando comparado ao grupo tratado com placebo (creme base) (Figura 23). Por
meio da análise de dados e cálculo da área de lesão (Figura 22), onde
comparamos a área no dia inicial com a área no dia final do experimento,
também foi possível concluir uma diminuição da área de lesão confirmando a
presença do processo cicatricial. Este efeito deve-se a ação da base
farmacotécnica semissólida de um creme, a qual contribuiu para a melhor
entrega do composto na epiderme, corroborando assim com dados da literatura
que apontam sobre a atividade cicatrizante in vivo de espécies do gênero Rubus
(PLACKAL GEORGE et al., 2014; PLACKAL GEORGE; TYNGA; ABRAHAMSE,
2015; SUNTAR et al., 2011).
No estudo de Suntar e colaboradores (2011) um creme elaborado com
1% de extrato de Rubus sanctus apresentou potente atividade cicatrizante,
similar ao controle positivo Madecassol®, um produto natural a base de Centella
asiática.
Figura 22. Aparência do remodelamento cicatricial in vivo após o tratamento com o placebo e o EMB em diferentes concentrações incorporado ao creme.
67
Figura 23. Área da lesão em mm2 do processo cicatricial in vivo após o tratamento com creme incorporado com EMB.
Dados expressos como média ± e.p.m. de cinco animais por grupo. Análise estatística realizada utilizando ANOVA seguida dos pós-teste de Tukey.
Adicionalmente aos ensaios farmacológicos foram realizados ensaios
toxicológicos in vitro com o intuito de complementar os dados já disponíveis na
literatura. O primeiro ensaio realizado foi para avaliar a atividade hemolítica, uma
vez que o extrato pode ser administrado por via oral e/ou tópica, sendo assim
capaz de atingir a circulação sanguínea. Os eritrócitos são estruturas simples,
assim, se tornam um modelo simples, prático e específico de avaliação
toxicológica. Embora não tenham toda a maquinaria para síntese proteica como
outros tipos de células, as suas membranas celulares estão associadas às
mesmas funções: o transporte celular e a produção do gradiente elétrico iônico
(SUWALSKY, 2007).
O ensaio de hemólise realizado por método espectroscópico é eficaz para
a determinação quantitativa de hemólise sendo um importante indicador de
atividade citotóxica para as células. Esta metodologia fornece a avaliação do
efeito de diferentes concentrações de um extrato sobre os eritrócitos humanos
(BHASKARA RAO; KUMAR; KARTHIK, 2011; SILVA; SHAHGALDIAN;
COLEMAN, 2004). Nesse sentido, na triagem de atividades toxicológicas de
extratos vegetais, faz-se necessária a verificação da atividade hemolítica da
espécie estudada. Os dados obtidos demonstraram que o extrato somente
induziu hemólise em doses elevadas (a partir de 2000 µg/mL) uma vez que a
hemólise de até 5% é considerada normal (Figura 24).
68
Figura 24. Percentual de hemólise após tratamento com EMB.
Resultados expressos como Média ± e.p.m. A análise estatística foi realizada com ANOVA seguida do pós-teste de Tukey. *p<0,05; ***p<0,001 vs Triton-X.
No entanto, no ensaio de MTT realizado com células HepG2, o extrato
apresentou citotoxicidade na maior dose empregada (Figura 25). Assim, se torna
importante realizar uma melhor avaliação da possível hepatotoxicidade deste
extrato em concentrações mais elevadas.
Figura 25. Viabilidade de células HepG2 tratadas com EMB e NI-F1.
Os resultados são representados por média ± e.p.m. Análise estatística realizada utilizando ANOVA seguida dos pós-teste de Tukey. *p<0,05, **p<0,01 vs basal.
Em estudo desenvolvido por Alves (2014) com o EMB obtido das partes
aéreas da R. imperialis não mostraram que o mesmo apresenta efeitos
genotóxicos em leucócitos do sangue periférico ou células do fígado pelo teste
do cometa. No entanto o teste micronúcleo mostrou um aumento na frequência
de micronúcleos nas duas doses mais elevadas testadas, indicando que este
69
extrato tem efeitos clastogênicos e aneugênicos em células da medula em doses
elevadas.
Estudos envolvendo o potencial genotóxico ou mutagênico de plantas
do gênero Rubus são escassos na literatura. O potencial mutagênico do extrato
Rubus idaeus foi investigado por Kreander e colaboradores em 2006 e os
resultados obtidos não mostraram qualquer efeito mutagênico, bem como
nenhuma citotoxicidade contra células Caco-2 (KREANDER et al., 2006).
Juntos, os dados aqui apresentados mostram que o EMB apresenta
atividade anti-inflamatória e antioxidante, modulando a migração de neutrófilos
para o foco de lesão e diminuindo a liberação de mediadores químicos. Além
destes efeitos o EMB atua no processo de resolução do processo inflamatório
promovendo o aumento da efereocitose e a migração de fibroblastos (Figura 26)
Figura 26. Esquema representativo dos resultados obtidos que mostram os efeitos do EMB no modelo estudado.
70
6 CONCLUSÕES
Os dados obtidos no presente trabalho permitem concluir que o
tratamento in vivo com o EMB e o composto NI-F1 exerce efeitos sobre as
funções neutrofílicas, em condições de não toxicicidade, ligadas à migração de
células polimorfonucleares, fagocitose e migração celular tendo em vista que:
1. Reduziram o recrutamento de neutrófilos para o tecido subcutâneo
dorsal na vigência de ação do LPS ou carragenina;
2. O mediador inflamatório NO, se mostrou reduzido em neutrófilos
tratados com EMB e o NI-F1;
3. O EMB de R. imperialis apresentou atividade antioxidante no modelo
de DPPH;
4. A eferocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos foi favorecida
pelo EMB e o NI-F1;
5. No modelo de scratch o tratamento com EMB promoveu aumento na
migração celular de células L929.
Paralelamente aos dados da literatura, os resultados aqui obtidos
permitem concluir que o EMB de R. imperialis e o composto NI-F1 atuam em
várias etapas do processo de resolução da inflamação, apresentando ação
também sobre macrófagos, tornando-os ativados auxiliando nos mecanismos de
reparo tecidual e cicatrização.
71
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ANEXOS
Anexo A – Parecer de aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética
em Pesquisa (CEP) da UNIVALI