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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA VIDA
MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E SAÚDE
Luiz Fernando Gonçalves
PREVALÊNCIA E GENOTIPAGEM DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO
(HPV) NA REGIÃO CERVICOVAGINAL DAS MULHERES ATENDIDAS
EM CLÍNICA PRIVADA DE GINECOLOGIA NO MUNICÍPIO DE
JOAÇABA, SC.
DISSERTAÇÃO
Joaçaba, SC
2016
Luiz Fernando Gonçalves
PREVALÊNCIA E GENOTIPAGEM DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO
(HPV) NA REGIÃO CERVICOVAGINAL DAS MULHERES ATENDIDAS
EM CLÍNICA PRIVADA DE GINECOLOGIA NO MUNICÍPIO DE
JOAÇABA, SC.
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado de Biociências e Saúde, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Biociências e Saúde, da
Universidade do Oeste de Santa Catarina.
Orientador: Prof. Dr. Glauber Wagner
Joaçaba, SC
2016
Luiz Fernando Gonçalves
PREVALÊNCIA E GENOTIPAGEM DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO
(HPV) NA REGIÃO CERVICOVAGINAL DAS MULHERES ATENDIDAS
EM CLÍNICA PRIVADA DE GINECOLOGIA NO MUNICÍPIO DE
JOAÇABA, SC.
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado de Biociências e Saúde, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Biociências e Saúde, da Universidade do Oeste de Santa Catarina.
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Glauber Wagner
Universidade:
Prof. Dr. Antônio Euclides Pereira de Souza Júnior
Universidade:
Prof. Dr. Edison Natal Fedrizzi
Universidade:
Dedico este trabalho à minha família.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me concedeu saúde, determinação, e esteve sempre presente
em minha vida.
À minha mãe Ione, ao meu pai Paulo e ao meu irmão Guilherme, que desde
cedo me mostraram qual era o caminho certo e me forneceram ferramentas para
percorrê-lo.
À Flavia Strohdiek, com quem quero dividir esta vida, pelos vários fins de
semana que estive ausente.
Ao professor Glauber Wagner, orientador e amigo que, com boa vontade,
compartilhou seus conhecimentos e experiências, possibilitando chegarmos ao final
de cada etapa deste estudo.
Aos funcionários e estudantes do laboratório de doenças infecto-parasitárias
da Unoesc, por todo o apoio oferecido, em especial aos acadêmicos Cristiane
Cousseau, Alessandra dos Passos e Luís Paulo Andrioni.
Às minhas pacientes, motivo de todo o meu estudo e dedicação.
À Nádia Aparecida Lorencette e ao Instituto de Patologia Joaçaba, pelo apoio
fornecido.
“O nascimento de uma criança é a certeza de
que Deus não desistiu de nós.”
(Dr. Acioli Antônio Vieceli)
RESUMO
Introdução: A prevalência da infecção cervicovaginal pelo Papiloma Vírus Humano
(HPV) varia muito ao redor do mundo e sofre influência de diversos fatores, entre
eles o nível socioeconômico da população estudada. Países desenvolvidos e com
melhor acesso à saúde possuem uma prevalência menor quando comparados a
países em desenvolvimento. Objetivo: Avaliar a prevalência da infecção
cervicovaginal pelo HPV entre pacientes atendidas em uma clínica privada de
ginecologia no Município de Joaçaba, SC, bem como realizar a genotipagem das
amostras positivas. Além de comparar os resultados obtidos com o encontrado em
estudos nos quais a procedência das pacientes foi o sistema público de saúde.
Métodos: Trata-se de um estudo transversal, em que foram avaliadas 150 mulheres
que buscaram atendimento em clínica privada de ginecologia do Município de
Joaçaba, Santa Catarina, Brasil, entre os meses de janeiro e junho de 2015. Após as
pacientes responderem um questionário sobre os fatores de risco relacionados ao
HPV, amostras de material cervicovaginal foram coletadas. Realizou-se a extração
do DNA das amostras cuja qualidade foi verificada por meio da amplificação do gene
ß-globina humana e a realizou-se a pesquisa do DNA-HPV pela técnica de Reação
em cadeia de Polimerase (PCR) utilizando-se os primes MY09 e MY11. O genótipo
do vírus foi determinado por intermédio de sequenciamento dos amplicons e com
análise na base de dados PaVE (Papilome Virus Genome Database) e por meio de
árvores filogenéticas para comprovar a relação com os genótipos de referência. Foi
efetuada uma análise comparativa com os resultados encontrados em outros
trabalhos realizados no Brasil cujas pacientes eram oriundas do sistema público de
saúde. Resultados: Das 150 amostras coletadas, 111 amplificaram o gene da ß-
globina humana e compuseram a amostra final. Entre as 111 amostras, 16 (14,41%)
foram positivas para a infecção pelo HPV, sendo que das amostras genotipadas,
45,45% representavam tipos de baixo risco, e 54,55%, tipos de alto risco
oncogênico. Os tipos 53, 54 e 58 foram os mais prevalentes. Foi observado,
também, que infecção pelo HPV tem correlação com a história pregressa ou atual de
alteração no exame colpocitológico (p<0,05). Contudo, não foi possível observar
uma correlação entre a infecção pelo HPV e os demais fatores de risco analisados,
como idade, estado civil, escolaridade, renda mensal e tabagismo. Conclusão: A
prevalência da infecção cervicovaginal pelo HPV na população estudada foi de
14,41%, inferior ao encontrado em trabalhos cuja origem da população foi o sistema
público de saúde, e, além disso, os tipos virais mais prevalentes neste estudo – 53,
54 E 58 – diferem dos principais tipos encontrados em mulheres advindas da rede
pública de saúde.
Palavras-chave: HPV. Genotipagem. Fatores de risco.
ABSTRACT
Objective: The global prevalence of cervicovaginal infections caused by the Human
papillomavirus (HPV) varies widely and is influenced by several factors, including the
social and economic status of the populations studied. Developed countries with
adequate access to health care have a lower prevalence of HPV than developing
countries. The aim of this study was to assess the prevalence of HPV infection
among patients treated in a private gynecologic clinic and genotyping of the positive
samples. Methods: This cross-sectional study included 150 women who sought care
in a private gynecologic clinic in the city of Joaçaba, Santa Catarina, Brazil from
January to June 2015. The patients answered a questionnaire about risk factors
related to HPV, and cervicovaginal samples were collected. The DNA was extracted,
and the sample quality was assessed by amplification of the human ẞ-globin gene.
HPV deoxyribonucleic acid (DNA) was amplified via polymerase chain reaction
(PCR) using primers MY09 and MY11. The viral genotype was identified by amplicon
sequencing and sequence analysis using the papilloma virus genome database and
confirmed with phylogenetic analysis using HPV genome references. Our results
were compared with other studies conducted in Brazil with patients treated in the
public health system. Results: Of the 150 samples collected, 111 had the human ẞ-
globin gene amplified and were included. Of the 111 samples, 16 (14.41%) were
positive for HPV; of the genotyped samples, 45.45% and 54.55% represented low-
risk and high-risk (oncogenic) types, respectively. Types 53, 54, and 58 were the
most prevalent. In addition, HPV infection was correlated with colpocytological
changes in the Papanicolaou test (p < 0.05). However, HPV infection was not
correlated with the other risk factors analyzed, such as age, marital status, education
level, salary, and smoking. Conclusion: The prevalence of HPV was 14.41%, which
was lower than that recorded in studies where patients were assisted in the public
health care system. The most prevalent viral types in our study differed from those
found in women assisted in the public health care system.
Keywords: HPV. Genotyping. Risk factors.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema do genoma do HPV 16 com suas três regiões: Regulatória
(LCR), Precoce (E) e tardia (L) ................................................................. 19
Figura 2 – Prevalência do HPV em mulheres de acordo com a idade ...................... 21
Figura 3 – Perfil eletroforético de amostras representativas ..................................... 32
Figura 4 – Cladograma demonstrando a posição taxonômica das 11 amostras
sequenciadas em relação as 182 amostras de HPV ................................ 36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Variáveis sem significância estatística entre mulheres atendidas em
clinica privada de ginecologia de acordo com presença ou ausência do
DNA-HPV ................................................................................................. 33
Tabela 2 – Variáveis com significância estatística entre mulheres atendidas em
clínica privada de ginecologia de acordo com presença ou ausência do
DNA-HPV ................................................................................................. 35
Tabela 3 – Distribuição dos genótipos e classificação quanto ao risco oncogênico
das amostras HPV positivas de mulheres atendidas em clínica privada de
ginecologia ............................................................................................... 35
Tabela 4 – Comparação entre estudos realizados no Brasil sobre a prevalência e a
genotipagem do HPV .................................. Erro! Indicador não definido.
LISTA DE ABREVIATURAS
ASCUS Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CH Captura Híbrida
CMJ Centro Médico Joaçaba
CO Colpocitologia oncológica
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DST Doença Sexualmente Transmissível
FDA Food and Drug Admnistration
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HPV Papiloma Vírus Humano
IARC International Agency for Research on Cancer
LDIP Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias
LIE Lesão Intraepitelial
MG Estado de Minas Gerais
MS Ministério da Saúde
OMS Organização Mundial da Saúde
PA Estado do Pará
PaVE Papillomavirus Episteme
Pb Pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction
PNI Programa Nacional de Imunizações
Rb Proteína de Retinoblastoma
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RJ Estado do Rio de Janeiro
RNA Ácido Ribonucleico
RO Estado de Rondônia
RS Estado do Rio Grande do Sul
SC Estado de Santa Catarina
SUS Sistema Único de Saúde
UF Unidade da Federação
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Unoesc Universidade do Oeste de Santa Catarina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 15
1.1 DELIMITAÇÃO DO TEMA .................................................................................................. 15
1.2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................... 16
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 18
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................... 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 19
3.1 O PAPILOMA VÍRUS HUMANO ....................................................................................... 19
3.2 PREVALÊNCIA ...................................................................................................................... 20
3.3 HISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO HPV ................................................................. 22
3.4 INVESTIGAÇÃO DIAGNÓSTICA ..................................................................................... 25
3.5 TRATAMENTO E PREVENÇÃO DA INFECÇÃO PELO HPV ................................ 26
4 METODOLOGIA .................................................................................................................... 28
4.1 DELINEAMENTO DA AMOSTRA E COLETA DE DADOS...................................... 28
4.2 COLETA, PROCESSAMENTO E EXTRAÇÃO DO DNA NO MATERIAL
CERVICOVAGINAL .............................................................................................................. 28
4.3 SEQUENCIAMENTO E GENOTIPAGEM DO HPV .................................................... 30
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................................... 31
5 RESULTADOS ...................................................................................................................... 32
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 37
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 44
8 CONSIDERAÇÕES A RESPEITO DA INTERDISCIPLINARIDADE ................... 45
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 46
APÊNDICE A – Instrumento de pesquisa ................................................................. 57
APÊNDICE B – Termo de consentimento livre e esclarecido .......................... 58
ANEXO A – Parecer Consubstanciado CEP ............................................................ 59
ANEXO B – Comprovante de submissão do artigo científico à Revista
Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia ........................................... 60
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 DELIMITAÇÃO DO TEMA
A partir dos estudos do médico alemão Harald Zur Hausen, publicados no
início da década de 1980, o qual caracterizou a presença de DNA viral em verrugas
genitais, muito se descobriu sobre o Papilomavírus Humano (HPV).1 Tal descoberta
representou um marco no entendimento do processo de carcinogênese do colo
uterino, uma vez que existem evidências epidemiológicas consistentes de que a
infecção pelo HPV, sobretudo quando persistente, é condição necessária para o
surgimento do câncer cervical.2
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS),3 ocorrem
aproximadamente 530.000 casos novos de câncer de colo uterino a cada ano em
todo o mundo. Cerca de 270.000 mulheres morrem anualmente em decorrência
desta patologia, das quais, 80% vivem em países em desenvolvimento, como no
caso do Brasil.
Além de determinar o câncer cervical, os HPVs chamados de alto risco
oncogênico são os agentes de uma proporção significativa de outros tumores,
incluindo uma parte dos cânceres de vulva, vagina, pênis e ânus, além de tumores
da orofaringe, afetando, portanto, mulheres e homens. Não obstante, este vírus
também é capaz de determinar patologias benignas, tanto em mucosas quanto em
epitélios cutâneos, destacando-se as verrugas genitais e as papilomatoses
respiratórias recorrentes.4
A prevalência da infecção cervicovaginal pelo HPV varia muito ao redor do
mundo, atingindo taxas superiores a 30% no Caribe e na África e inferiores a 10%
na América do norte e Europa.5 Além disso, sofre influência de diversos fatores,
como baixo nível socioeconômico, início precoce da atividade sexual, multiplicidade
de parceiros sexuais, tabagismo, entre outros.6
O tipo viral mais prevalente no Brasil é o 16,7-12 o qual possui um risco relativo
para o câncer cervical em torno de 434 vezes.13 Entre os tipos com baixo risco
oncogênico, associados sobretudo a verrugas genitais, merecem destaque o 6 e o
16
11. É exatamente contra estes tipos (6, 11, 16, e 18) que se desenvolveu a vacina
quadrivalente contra o HPV,14 a qual faz parte do Programa Nacional de
Imunizações (PNI)15 do Ministério da Saúde do Brasil (MS) desde 2014 e
corresponde à importante medida de prevenção primária desta infecção.
Para o diagnóstico precoce, os métodos moleculares de detecção do DNA
viral ganham cada vez mais notoriedade. O rastreamento por citologia, importante
nas lesões intraepiteliais e em virtude de seu baixo custo, continua sendo
procedimento fundamental. Contudo, exames como a captura híbrida (CH), a
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e até mesmo técnicas envolvendo o RNA
mensageiro, as quais permitem a detecção do vírus, associados ou não às técnicas
de genotipagem, vêm se tornando cada vez mais empregadas na prática clínica.16
Apesar de ainda não propiciarem a erradicação do HPV, todos esses
avanços, seja na prevenção primária seja na detecção precoce, são um alento para
as gerações futuras no que se refere à infecção viral e ao câncer cervical. Mesmo
que estes ainda não possam ser extintos, esses avanços contribuem para, como diz
Villa,4 deixar o “monstro” chamado HPV sob controle!
1.2 JUSTIFICATIVA
A íntima associação entre o HPV e o câncer genital, sobretudo em mulheres,
por si só, expõe a relevância de estudos sobre esse tema. Estudos epidemiológicos
sobre o HPV, tanto prospectivos quanto retrospectivos, em busca de maiores
conhecimentos sobre esse vírus, são fundamentais para que se possa compreender
a sua importância em termos de saúde pública.17
É importante salientar que, no Brasil, diversos estudos avaliaram a
prevalência e a história natural da infecção pelo HPV a partir de pacientes atendidas
pelo sistema público de saúde (SUS),8,9,11 Essas pacientes, pelas condições
socioeconômicas e de cuidados pessoais mais desfavoráveis, possuem maior risco
de infecção pelo HPV. Apesar da tentativa em refletir a prevalência na população
geral, esses estudos não consideram em sua amostragem mulheres atendidas em
consultórios privados ou na saúde suplementar. Destaca-se que aproximadamente
17
50,3 milhões de brasileiros, o equivalente a 26,3% da população, receberam
atendimento médico por meio da saúde suplementar no ano 2015.18 Esse grupo de
pacientes possivelmente não recorreu ao SUS para rastreamento e tratamento das
alterações induzidas pelo HPV, portanto, esses pacientes não estariam
representados nas estatísticas sobre a infecção por este vírus. Além disso, quando
se analisam estudos nos quais a seleção das pacientes ocorreu por meio do SUS,
encontra-se como principais genótipos os HPVs do tipo 16, 31, 53 e 18, o que não
necessariamente representa os tipos encontrados nas pacientes assistidas na saúde
suplementar.10,12,19
Neste contexto, conhecer a prevalência da infecção cervicovaginal pelo HPV
em nosso meio, bem como determinar os tipos de maior circulação torna-se
fundamental e vem ao encontro do proposto por autores pesquisados,20 os quais
ratificam que pesquisas de prevalência e epidemiologia do HPV são a chave para o
entendimento das amplas variações na incidência do câncer cervical ao redor do
mundo.
18
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Determinar a prevalência da infecção cervicovaginal pelo HPV em mulheres
atendidas em clínica privada de ginecologia do Município de Joaçaba, SC.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar a genotipagem e classificar, quanto ao risco oncogênico, as
amostras consideradas positivas para a infecção cervicovaginal pelo HPV.
Correlacionar as amostras positivas para a infecção cervicovaginal pelo HPV
com os principais fatores de risco para o câncer de colo uterino.
Comparar os resultados obtidos com os resultados encontrados em estudos
semelhantes, cuja origem das pacientes tenha sido o sistema público de saúde.
19
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 O PAPILOMA VÍRUS HUMANO
O Papilomavírus Humano é um vírus formado por dupla fita de DNA circular
protegida por cápsula proteica e pertencente à família Papillomaviridae. Trata-se de
um vírus com cerca de 55 ηm, de formato icosaédrico com 72 capsômeros, não
envelopado e que não possui enzimas ou glicoproteínas.21
O DNA do HPV contém 7.900 pares de bases (pb) com nove genes e pode
ser dividido em três regiões distintas: região regulatória (LCR – log control region),
região precoce (Early – E1 a E7) e região tardia (Late – L1 e L2) (Figura 1). Na
região LCR estão os genes que codificam proteínas com funções regulatórias da
atividade celular, como a replicação e a transcrição, enquanto os genes da região L
codificam as proteínas do capsídeo viral.22
Fonte: Passos et al.23
Figura 1 – Esquema do genoma do HPV 16 com suas três regiões: Regulatória (LCR), Precoce (E) e tardia (L)
20
Até o momento, mais de 200 tipos do HPV foram identificados. Destes,
aproximadamente 45 (pertencentes ao gênero alfa-papilomavirus) podem infectar a
região anogenital tanto em homens quanto em mulheres.24
O HPV pode ser classificado tanto pelo seu tropismo epitelial quanto pelo seu
potencial oncogênico. Quanto ao tropismo, os tipos classificam-se em
cutaneotrópicos ou mucosotrópicos, infectando os tecidos cutâneos ou as mucosas,
respectivamente. Em relação ao potencial oncogênico, classificam-se em HPVs de
baixo e alto risco, e existe uma relação direta entre os vírus com preferência
cutaneotrópica e o baixo risco oncogênico, assim como o padrão mucosotrópico e o
alto risco oncogênico.25
De acordo com as suas respectivas sequências de nucleotídeos, consideram-
se HPVs de alto risco os tipos: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59. Os
tipos 26, 53, 66, 68, 73 e 82 são classificados como provavelmente de alto risco,
enquanto os tipos 6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89 são os chamados
HPVs de baixo risco oncogênico. Existem, ainda, os tipos que possuem um potencial
indeterminado: 30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90, e 91.13
O papel que a infecção pelo Papilomavírus Humano desempenha no contexto
das Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST) e na capacidade de determinar
doenças crônicas, sejam as verrugas genitais seja o câncer genital, é responsável
pela grande importância clínica desse grupo de vírus.23
3.2 PREVALÊNCIA
A infecção pelo HPV é considerada a doença de transmissão sexual mais
frequente no mundo.26 O Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 27
acredita que pelo menos metade das mulheres sexualmente ativas irão adquirir HPV
em algum momento de suas vidas, e estima que aproximadamente 6,2 milhões de
novos casos de infecção pelo HPV ocorrem a cada ano nos EUA.
No Brasil há cerca de 10 milhões de infectados, com 700 mil novos casos ao
ano.28 Já em relação às verrugas genitais, não possuímos dados brasileiros, mas de
21
Figura 2 – Prevalência do HPV em mulheres de acordo com a idade
acordo com estimativas de outros países em desenvolvimento, acredita-se que
ocorra 1,9 milhão de casos novos a cada ano.29
Para a International Agency for Research on Cancer (IARC),30 a frequência na
infecção pelo HPV varia muito de acordo com a idade e com a origem geográfica da
população estudada. Entre mulheres assintomáticas da população geral, a
prevalência da infecção pelo HPV varia entre 2 e 44%.31 Cerca de 291 milhões de
mulheres estão atualmente infectadas pelo HPV ao redor do mundo.32
Mulheres jovens, com menos de 25 anos, apresentam as maiores taxas de
infecção. Observa-se um declínio constante nesses índices com o passar dos anos,
porém em países em desenvolvimento e por motivos ainda não esclarecidos, existe
um novo pico de crescimento na prevalência desta infecção após os 50 anos de
idade.5 A Figura 2 mostra e prevalência da infecção pelo HPV entre mulheres de
acordo com a idade e a região estudadas.
Fonte: Forman et al.5
22
3.3 HISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO HPV
A forma mais comum da transmissão do HPV é pela atividade sexual, a qual
infere tanto intercurso vaginal quanto anal.32 As formas não sexuais da transmissão,
seja através de fômites contaminados, seja pela autoinoculação, seja por
transmissão perinatal (da mãe para o feto), apesar de possíveis, são extremamente
raras e dificilmente promoveriam infecção persistente.32,33
Por se tratar de uma infecção por contato, acometendo na mulher
principalmente o colo uterino, a vagina, a vulva e o epitélio anal, o HPV pode ser
adquirido mesmo sem ter ocorrido penetração vaginal, o que diminui o efeito protetor
dos preservativos de látex.33
Uma vez ocorrido o contato e na presença de pequenos traumatismos na
superfície da pele e mucosas, o HPV atinge a camada basal do epitélio, beneficia-se
do citomorfismo dessas células germinativas e passa a acompanhar o processo de
diferenciação celular e a se replicar.34 A partir desse momento, o HPV pode
determinar uma infecção produtiva, estimulando mitoses celulares e proporcionando
o surgimento de lesões benignas, chamadas condilomas, ou uma ação não
produtiva, na qual ocorrerá integração do genoma viral com o genoma humano,
passando a ser transmitida como um caráter mendeliano célula a célula.23
No processo da carcinogênese gerado pelo HPV destaca-se a ação de duas
oncoproteínas virais, conhecidas como E6 e E7. Ambas as proteínas atuam
sinergicamente no processo de transformação e imortalização das células
infectadas, promovendo a inativação e a degradação dos supressores tumorais p53
e Rb (proteína de retinoblastoma), especialmente em tipos de HPVs de alto risco. As
bases moleculares para compreender os motivos pelos quais o E6 dos HPVs de
baixo risco não degrada a p53 ainda permanecem desconhecidas.35
A proteína p53 é responsável pela regulação do mecanismo de reparo do
DNA quando este sofre qualquer tipo de dano. Além disso, esta proteína tem papel
fundamental na indução da apoptose celular. O HPV, por meio da proteína E6,
inativa o p53, fazendo com que a célula não consiga mais entrar em apoptose. Esse
processo leva a célula infectada à senescência, mantendo a integridade do genoma
viral.23
23
Já a proteína Rb, a qual sofre ação da fração E7 do HPV, é responsável pelo
bloqueio de reguladores gênicos conhecidos como E2F, que atuam na indução da
replicação do material genético, fase essencial para a replicação celular. Na
inatividade da pRb, a célula é estimulada a transcrever, e a multiplicação celular
ocorre de forma desordenada, promovendo fixação de mutações.23
O período de latência entre a infecção pelo HPV e as alterações celulares
iniciais é desconhecido, já o período de transformação das células até o câncer
cervical, complicação mais temida do HPV, pode levar muitos anos e, na maioria das
vezes, está associado a outros fatores que não apenas a infecção persistente pelo
HPV.33
Sabe-se que coinfecções genitais têm importância na proliferação celular
associada ao HPV; entre elas pode-se destacar a sífilis, a herpes simples, a
gonorréia, a clamídia e o HIV. Todas podem contribuir para que as lesões de HPV
evoluam, provavelmente por atuarem como cofatores na ativação dos mecanismos
de transformação celular ou depressão da imunidade do trato genital.36
Outros fatores também estão envolvidos no processo de carcinogênese, entre
eles o início precoce da atividade sexual, o número de parceiros e o tabagismo.
Estudo com mais de 8.600 mulheres, realizado por Roteli-Martins et al.,37 mostrou
que quanto mais precoce o início da atividade sexual, maior a prevalência da
infecção pelo HPV e maior a possibilidade de alterações citológicas.
O habito de fumar também contribui para a perpetuação da infecção do HPV
e as consequentes modificações celulares HPV induzidas. A nicotina exerce papel
carcinogênico cervical por meio de ação direta sobre o DNA das células epiteliais do
colo uterino e, além disso, promove uma diminuição das células de Langerhans,
determinando imunossupressão.36
Por fim, para que se compreenda a evolução natural da infecção pelo HPV,
torna-se necessária a abordagem da resposta imune do hospedeiro. O entendimento
do processo imunológico envolvido na infecção pelo HPV é de extrema
importância.23 Nesse contexto, indivíduos imunocompetentes produzirão
imunoglobulinas de ação imediata que prevenirão a disseminação do HPV.
Associada a isso, a resposta celular com linfócitos T citotóxicos (CD8+) e T
auxiliares (CD4+) promoverá a eliminação do vírus em até 80% dos casos. Nesses
indivíduos, o vírus é eliminado em um período de aproximadamente dois anos, sem
deixar sequelas e, muitas vezes, sem manifestar qualquer sintoma.14 Por outro lado,
24
pacientes imunodeficientes poderão mais facilmente evoluir com infecção
persistente pelo HPV e, consequentemente, para lesões intraepiteliais e câncer
genital. Um trabalho publicado por Rocha-Brischiliari et al.38 em 2014 mostrou que
pacientes HIV+ com contagem de linfócitos T CD4+ entre 200-350 células/mm³
possuem duas vezes mais riscos de contraírem o HPV do que pacientes com
contagem superior a 350 células/mm³, deixando claro, mais uma vez, a importância
do status imunológico na infecção pelo HPV.
Uma vez no trato anogenital da mulher, o HPV pode permanecer em estado
de latência, que se refere a uma infecção sem multiplicação, ou pode determinar
uma infecção persistente, com multiplicação, originando processos clínicos ou
subclínicos. A maioria das infecções genitais pelo HPV é latente ou subclínica e
pode regredir espontaneamente em qualquer fase desta evolução.22
Nas infecções latentes não existe crescimento ou evidência microscópica da
presença do vírus; nesses casos, pela escassez de material genético, o diagnóstico
apenas pode ser realizado por intermédio de teste de biologia molecular com
pesquisa do DNA-HPV, em que os mais utilizados são a captura híbrida (CH) e a
reação em cadeia de polimerase (PCR).39,40
Em outras situações pode ocorrer a chamada infecção subclínica. Nesse tipo
de apresentação a manifestação clinica é tão discreta que sua visualização não é
possível a olho nu, sendo necessário o uso de colposcópio.23 A forma subclínica é
suspeitada por alterações na citologia ou no exame histopatológico realizado por
meio de uma biopsia guiada pela colposcopia.41
Já a forma clínica é representada pelas lesões verrucosas identificadas
facilmente pela inspeção genital e conhecidas como verrugas genitais ou condiloma
acuminado. No condiloma acuminado, o HPV determina espessamento da
epiderme, hiperplasia do estrato córneo e graus variados de hiperceratose.23
Nos casos de infecção persistente pelo HPV, sobretudo associada à
imunodeficiência do hospedeiro e à presença de cofatores, pode ocorrer a interação
do DNA viral com o material genético celular e determinar atipias no epitélio
acometido. Essas lesões, conhecidas como lesões intraepiteliaias (LIE) de baixo ou
alto grau, possuem caráter pré-cancerígeno.40 A descrição das lesões intraepiteliais
e do carcinoma induzido pelo HPV foge do escopo desta revisão.
25
3.4 INVESTIGAÇÃO DIAGNÓSTICA
As verrugas genitais, determinadas em quase 90% das vezes pelos HPVs 6 e
11, são de diagnóstico clínico, feito por meio da inspeção genital. Os testes de
pesquisa do DNA-HPV não são indicados nesses casos, uma vez que seu resultado
não modificará o manejo dessa condição.3
Já as lesões subclínicas requerem exames citológicos (exame Papanicolaou)
e histológicos para o seu diagnóstico. O uso de solução de ácido acético 3 a 5%, o
qual causa alteração de coloração das células infectadas pelo HPV, tem sido
adjuvante na avaliação de casos suspeitos.3
Contudo, foi a partir do desenvolvimento de técnicas de biologia molecular
que se tornou possível identificar, com maior sensibilidade, a presença do DNA-HPV
em pacientes assintomáticos e não apenas com as alterações celulares tardias
decorrentes da ação do HPV.42 Embora não seja universalmente utilizado como
método de triagem para lesões HPV-induzidas, a associação de testes de biologia
molecular ao exame citológico rotineiro permitiu uma melhor avaliação do risco de
malignidade em virtude de diminuir os números de falso negativos apresentados
pela citologia43. As principais técnicas de biologia molecular utilizadas para a
detecção do HPV são a Captura híbrida e a Reação em cadeia de Polimerase.42
A captura híbrida é um método seguro, preciso e reprodutível para a detecção
do HPV. Contudo, permite a detecção de 18 tipos desse vírus, sem determinar
especificamente qual tipo está presente na amostra. Essa técnica determina apenas
se o DNA encontrado caracteriza um vírus de alto ou baixo risco oncogênico.44
Já a PCR, que é considerada a técnica mais sensível na identificação do DNA
do HPV, é executada inteiramente in vitro, possibilitando a síntese de fragmentos de
DNA utilizando uma enzima chamada Taq DNA Polimerase. Essa enzima, em
associação com os chamados iniciadores (primers), amplificará uma determinada
sequência do DNA em bilhões de cópias.45
Após o processo de PCR, os produtos amplificados podem ser clivados com
enzimas de restrição, e os fragmentos obtidos são comparados para a identificação
específica do tipo viral, técnica conhecida como RFLP (do inglês, Restriction
Fragment Length Polimorphysm). Além do RFLP, outras técnicas podem ser
26
empregadas com o objetivo de proceder a genotipagem do HPV, destacando-se o
sequenciamento direto. Ambos os métodos são capazes de identificar infecções por
múltiplos tipos de HPV e classificar o seu grau de risco oncogênico.42 Além disso,
permitem prover informações detalhadas e que são difíceis de serem obtidas, a
custos similares, por outras técnicas.46
3.5 TRATAMENTO E PREVENÇÃO DA INFECÇÃO PELO HPV
O tratamento das lesões causadas pelo HPV baseia-se na exérese da lesão,
na sua destruição, por métodos físicos ou químicos, em medidas de
imunomodulação, ou na combinação dessas modalidades terapêuticas.47 Além
disso, ele depende do tipo de lesão, de sua localização e extensão e visa à
erradicação das lesões e à eliminação viral.48
A ablação cirúrgica da lesão mantém-se como abordagem básica para a
maioria das lesões anogenitais causadas pelo HPV.23
Entre os métodos destrutivos que utilizam agentes físicos destacam-se a
eletrocoagulação, a crioterapia e a laserterapia.49 Já os agentes químicos mais
utilizados envolvem o 5-fluororacil, a podofilotoxina e o ácido tricloroacético.23
Como a doença induzida pelo HPV possui base imunológica, os
imunomoduladores, os quais promovem estímulo da resposta imune do hospedeiro,
são ferramentas importantes no tratamento das lesões e na erradicação do vírus.
Nessa classe terapêutica destaca-se o Imiquimode, por ter a sua apresentação na
forma de creme, pode ser aplicado pela própria paciente.50 Além disso, a
suplementação de oligoelementos com ação antioxidante também modula a
resposta imune e interfere na evolução desta infecção.51
Os tratamentos das lesões intraepiteliais e do carcinoma de colo uterino não
estão no objetivo desta revisão.
Em relação à prevenção da infecção pelo HPV, desde 2006 o Food and Drug
Administration (FDA) americano recomenda a vacinação rotineira com a vacina
27
quadrivalente contra o HPV em meninas entre 11 e 12 anos, sendo esta a melhor
forma de prevenção primária.52
Atualmente no Brasil existem duas vacinas comercializadas, uma conhecida
como bivalente, por atuar contra os HPVs 16 e 18, e outra como quadrivalente, que
atua contra os tipos 6, 11, 16 e 18 e encontra-se no Programa Nacional de
Imunizações (PNI) desde 2014.15 Em breve haverá uma nova apresentação em
circulação, denominada vacina nonavalente, a qual oferecerá proteção contra um
número ainda maior de tipos do HPV, em especial os HPVs 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45,
52 e 58.53
28
4 METODOLOGIA
4.1 DELINEAMENTO DA AMOSTRA E COLETA DE DADOS
Este trabalho trata-se de um estudo transversal, realizado entre 01 janeiro e
30 de junho de 2015, com o intuito de avaliar a prevalência da infecção
cervicovaginal pelo HPV entre mulheres atendidas em clínica privada de ginecologia
no Município de Joaçaba, Santa Catarina, Brasil.
As pacientes foram selecionadas ao acaso por ocasião de consulta
ginecológica realizada no Centro Médico Joaçaba (CMJ). Pacientes que não haviam
iniciado atividade sexual no momento da coleta do material e pacientes com idade
superior a 70 anos foram excluídas da amostra.
A coleta dos dados ocorreu por meio de entrevista direta com as participantes
seguindo protocolo previamente estabelecido (Apêndice A), o qual considerou
fatores demográficos e comportamentais, bem como os principais fatores de risco
para o câncer de colo uterino.6
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
do Oeste de Santa Catarina de Joaçaba (Unoesc), Santa Catarina, Brasil, em 16 de
dezembro de 2014, sob protocolo n. 1.131.845 (Anexo A). Para a participação no
estudo, as pacientes leram, discutiram e assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE) (Apêndice B).
4.2 COLETA, PROCESSAMENTO E EXTRAÇÃO DO DNA NO MATERIAL
CERVICOVAGINAL
O material cervicovaginal foi coletado utilizando-se espéculo vaginal
descartável Vagispec®, e foi armazenado em meio líquido do Kit coletor ThinPrep®
29
(HOLOGIC). Parte do material foi utilizado para o exame citológico, o qual se
realizou no Instituto de Patologia Joaçaba, com aspiração do conteúdo e confecção
da lâmina de forma automatizada por equipamento específico (HOLOGIC), seguida
por coloração pelo método de Papanicolaou.54 O material remanescente foi
encaminhado ao laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias (LDIP) da
Unoesc, onde ocorreu a extração do DNA.
Aproximadamente 5 mL da amostra coletada no ThinPrep foram submetidos à
centrifugação a 500 x g por 15 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante
foi descartado, e o precipitado foi suspenso com 180 µL de PBS 7,4 estéril. Na
sequência, foram adicionados 20 µL de proteinase K (Ludwig®) e 180 µL de Buffer Al
(Quiagen®). O material foi homogeneizado em vórtex e incubado a 42 ºC por, pelo
menos, 12 horas. Após esse período, o material foi incubado a 90 ºC por 1 hora e
recebeu 40 µL de Acetato de Sódio 3M pH 5,2. Em seguida, as amostras foram
homogeneizadas em vórtex por 15 segundos, incubadas em gelo por 5 minutos e
submetidas à centrifugação a 14.000 x g por 3 minutos. Então, o sobrenadante foi
transferido para um novo tubo, e a este foram adicionados 600 µL de Isopropanol
100%; após homogeneização por inversão, a amostra foi centrifugada por 3 minutos
a 14.000 x g. O DNA foi, então, lavado com etanol 70% e ressuspendido com TE. O
DNA foi quantificado em espectrofotômetro (A280).
A pesquisa do DNA-HPV foi realizada por meio da técnica de reação em
cadeia de polimerase (PCR);55 para a amplificação do DNA foi utilizado um conjunto
de iniciadores para HPV MY09 (5‟-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3‟) e MY11 (5‟-
CMCAGGGWCATAAYAATGG-3‟), os quais amplificam um fragmento de
aproximadamente 450 pares de bases (pb).56 Para tal, a reação da amplificação foi
realizada com aproximadamente 50-100 ηg de DNA, 0,8 μM de cada um dos
iniciadores, 0,25 mM de cada DNTp (Ludwig Biotecnologia, Porto Alegre, Brasil), 1,5
mM de MgCl2, 2,5 unidades (U) de Taq DNA Polimerase (Ludwig Biotecnologia,
Porto Alegre, Brasil) e 1X do tampão da enzima. A ciclagem de temperatura foi
realizada em termociclador Biocycler® nas seguintes condições: 94 °C por 5 minutos,
35 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 56 °C por 30 segundos e 72 °C por 30
segundos, seguidos por uma extensão final a 72 °C por cinco minutos.
A integridade do DNA extraído foi observada por meio da amplificação de um
fragmento de 501 pb do gene da β-globina nas condições similares às descritas
30
anteriormente, utilizando-se os iniciadores β1 (5‟-TCAACCCTACAGTCACCCAT-3‟)
e β2 (5‟-CTAACAATTACGAACAGCAATGAG-3‟).
Em torno de 10 µL dos produtos de PCR foram revolvidos em eletroforese em
gel de agarose 2%, corados com Brometo de etídio (0.1%) e visualizados em luz
ultravioleta em transiluminador Vilber Lourmat®.
4.3 SEQUENCIAMENTO E GENOTIPAGEM DO HPV
As amostras positivas para o DNA-HPV foram sequenciadas no Laboratório
de Protozoologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Para tal, a
região do gel de agarose contendo o amplicom de aproximadamente 450 pb foi
excisada, e o DNA foi purificado utilizando-se o kit GFX™ PCR DNA and Gel Band
Purification (GE Healthcare), conforme especificações do fabricante. Então, aos
produtos de PCR foram sequenciados utilizando-se os iniciadores MY09 e MY11 e
kit DYEnamic® ET Dye Terminator (GE Healthcare), conforme as instruções do
fabricante, em equipamento ABI 3500 (Applied Biosystems).
Para a determinação dos tipos de HPV, as sequências geradas foram
avaliadas quanto à qualidade e agrupadas utilizando-se o pacote
Phred/Phrap/Consed.57 Apenas as amostras com boa qualidade (Phred>20) foram
utilizadas para a genotipagem do HPV por meio da análise de similaridade pelo
algoritmo blastn do programa Blast disponível no Papilloma Virus Episteme
(PaVE),58 utilizando critérios de similaridade acima de 95% e valores de e inferior a
10 e-5. Também foram realizadas análises filogenéticas utilizando 182 sequências do
gene L1 de genomas de referências de cada genótipo de HPV disponíveis no PaVE.
Para tal, as amostras dos pacientes com boa qualidade foram alinhadas com os
genomas de referência utilizando o Programa MAFFT (Multiple Alignment using Fast
Fourier Transform);59 em seguida, os alinhamentos foram utilizados para as
inferências evolutivas desses grupos com o auxílio do Programa MEGA 7.60 As
inferências filogenéticas foram realizadas utilizando-se o método de Neighbor-
Joining, e as distâncias evolutivas foram inferidas pelo método de Jukes-Cantor,
31
considerando-se distribuição normal de taxas de mutação entre os sítios, e sítios
com menos de 95% de deleção foram desconsiderados da análise, totalizando 471
posições analisadas.
Ressalta-se que quando a PCR se apresentou positiva para o HPV, mas não
se identificou o tipo viral, a amostra foi considerada HPV positiva, porém sem
genótipo definido.
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As variáveis de interesse foram analisadas por intermédio dos testes
estatísticos de qui-quadrado (χ2), teste exato de Fischer, teste G e teste de
correlação de Pearson,61 utilizando-se o Programa GraphPad Prism 2007® e
considerando-se nível de significância de 95% (p<0,05).
32
5 RESULTADOS
Foram entrevistadas 150 mulheres que procuraram o serviço de atendimento
médico da clínica ginecológica participante neste estudo, das quais foram coletadas
amostras cervicovaginal. Dessas amostras, 111 (74%) apresentaram amplificação
para o gene da ß-globina humana e passaram, então, a compor as amostras válidas
para o presente estudo. Do total de 111 amostras válidas, o DNA-HPV foi
amplificado em 16, correspondendo a uma prevalência de 14,41% (Figura 1).
Figura 3 – Perfil eletroforético de amostras representativas Nota: Amplicon obtido a partir da amplificação do fragmento de 501 pb da b-tubulina (gel superior) e do fragmento de, aproximadamente, 450 pb correspondente a uma região do gene L1 de HPV (gel inferior). (-) controle negativo, (+) controle positivo; amostras positivas (7, 22, 26), amostras negativas (19, 20, 21, 23 e 24) e amostras descartadas (25 e 27). As amostras foram resolvidas em gel de agarose 2% e coradas com brometo de etídeo. O marcador de tamanho molecular (MW) utilizando foi o 100bp (Ludwig Biotecnologia).
Além da presença do HPV, foram avaliadas as informações fornecidas pelas
pacientes durante a entrevista (Tabela 1). A faixa etária variou entre 17 e 69 anos,
com média de 35,4 anos e mediana de 33 anos, sendo a faixa etária mais prevalente
entre 21 e 40 anos. Entre as pacientes HPV positivo, 12 (75%) encontravam-se
nessa faixa etária.
Também foi observado que a maioria das pacientes possui relação conjugal
estável, nível superior de escolaridade e renda familiar mensal superior a mais de
cinco salários mínimos, não sendo observada diferença estatística entre os grupos
HPV positivo e HPV negativo nessas variáveis. Assim como o hábito de fumar, que
33
foi admitido por 11 pacientes (9,9%) e também não representou diferenças
estatísticas entre os grupos (Tabela 1).
O comportamento sexual, avaliado por meio da idade da sexarca, e a
paridade também foram variáveis que mostraram distribuição equivalente entre o
grupo de mulheres com e sem a infecção pelo HPV. Ressalta-se que, do total de
pacientes, 97 (87,4%) iniciaram a atividade sexual antes dos 21 anos de idade e que
entre o grupo HPV positivo, sete (43,75%) nunca engravidaram.
A presença de outras DSTs, verrugas genitais ou a realização de
cauterizações no colo uterino foram variáveis que não apresentaram diferenças
estatísticas entre os grupos, assim como em relação à flora vaginal, em que os
Lactobacillus representaram as bactérias mais prevalentes entre todas as pacientes
(Tabela 1).
Tabela 1 – Variáveis sem significância estatística entre mulheres atendidas em clinica privada de ginecologia de acordo com presença ou ausência do DNA-HPV
Variável DNA HPV (+) DNA HPV (-) Total
n % n % n %
Idade (anos)1
<20 2 66,7 1 33,3 3 2,7
20 – 40 12 15,0 68 85,0 80 72,1
>40 2 7,1 26 92,9 28 25,2
Estado civil2
União estável 15 14,7 87 85,3 102 91,9
Sem união estável 1 11,1 8 88,9 9 8,1
Escolaridade3
Fundamental 0 0,0 8 100,0 8 7,2
Médio 5 15,2 28 84,8 33 29,7
Superior 11 15,7 59 84,3 70 63,1
Renda (sal. mín.)1
1 0 0,0 2 100,0 2 1,8
2 – 3 4 16,0 21 84,0 25 22,5
4 – 5 3 10,3 26 89,7 29 26,1
> 5 9 16,4 46 83,6 55 49,6
Tabagismo2
Não 12 12,0 88 88,0 100 90,1
Sim 4 36,4 7 63,6 11 9,9
Paridade2
Nulípara 7 20,6 27 79,4 34 30,6
Um filho 8 16,7 40 83,3 48 43,2
Mais que um filho 1 3,4 28 96,6 29 26,2
Sexarca2
< 21 anos 16 16,5 81 83.5 97 87,4
≥ 21 anos 0 0,0 14 100,0 14 12,6
34
DST1
Não 13 13,5 83 86,5 96 86,5
HSV2 0 0,0 3 100,0 3 2,7
HPV 3 25,0 9 75,0 12 10,8
Verrugas2
Não 15 14,3 90 85,7 105 94,6
Sim 1 16,7 5 83,3 6 5,4
Cauterização prévia2
Não 11 15,5 60 84,5 71 64,0
Sim 5 12,5 35 87,5 40 36,0
Flora1
Lactobacillus 14 16,7 70 83,3 84 75,7
Cocos 1 7,1 13 92,9 14 12,6
Gardnerella/Mobiluncus 1 9,1 10 90,9 11 9,9
Candida 0 0,0 2 100,0 2 1,8
Nota: 1
Não significante pelo Teste-G (p > 0.05); 2 Não significante pelo Teste Exato de Fischer (p >
0.05); 3 Não significante pelo Teste de Qui-Quadrado (p > 0.05).
A história clínica de exame colpocitológico prévio positivo para lesão
intraepitelial, bem como alterações citológicas pré-neoplásicas encontradas no
exame colpocitológico atual apresentaram diferenças estatisticamente significativas
entre os grupos (P < 0,05). Contudo, em 12 (75%) pacientes HPV positivas não
foram evidenciadas alterações citológicas no exame atual (Tabela 2), demonstrando
a importância das técnicas de biologia molecular na identificação do HPV.
Em relação à genotipagem, 5 (31,25%) amostras foram consideradas HPV
positivo, mas sem genótipo definido. As outras 11 (68,75%) amostras foram
genotipadas (Figura 4) e apresentam sua distribuição de genótipos e risco
oncogênico descritos na Tabela 3. Destacam-se, ainda, que 6 (54,54%) amostras
sequenciadas evidenciam HPVs com alto risco oncogênico, ao passo que 5
(45,45%) apresentam HPVs considerados de baixo risco para câncer. Não foram
identificadas pacientes com infecção por múltiplos tipos do HPV no presente estudo.
Na Tabela 4 apresenta-se uma comparação entre os resultados obtidos neste
estudo e em outros importantes trabalhos realizados no Brasil sobre o tema,
classificando as pacientes, quanto à origem entre oriundas do sistema público de
saúde e do sistema privado.
35
Tabela 2 – Variáveis com significância estatística entre mulheres atendidas em clínica privada de ginecologia de acordo com presença ou ausência do DNA-HPV
Variável DNA HPV (+) DNA HPV (-) Total p n % n % n %
CO1 prévia alterada
2 < 0,05*
Nunca 12 16,7 60 83,3 72 64,9 Já teve inflamação 0 0,0 24 100,0 24 21,6 Já teve ASCUS
3 1 14,3 6 85,7 7 6,3
Já teve LIE4 3 37,5 5 62,5 8 7,2
CO
1 atual
2 < 0,05*
Negativo 12 11,5 92 88,5 104 93,7 ASCUS
3 1 25,0 3 75,0 4 3,6
LIE4 3 100,0 0 0,0 3 2,7
Nota: 1 CO: exame citopatológico;
2 Significância estatística pelo Teste-G (p < 0.05);
3 ASCUS: atipias
celulares de significado indeterminado; 4 LIE: lesão intraepitelial.
Tabela 3 – Distribuição dos genótipos e classificação quanto ao risco oncogênico das amostras HPV positivas de mulheres atendidas em clínica privada de ginecologia
Tipo Número de amostras Percentual (%) Risco oncogênico
6 1 6,25 Baixo
16 1 6,25 Alto
42 1 6,25 Baixo
49 1 6,25 Baixo
53 2 12,5 Alto
54 2 12,5 Baixo
58 2 12,5 Alto
82 1 6,25 Alto
ND 1 5 31,25 -
Nota: 1 ND: Tipo não determinado.
36
Figura 4 – Cladograma demonstrando a posição taxonômica das 11 amostras sequenciadas em relação as 182 amostras de HPV
Nota: A árvore foi elaborada utilizando-se o método de Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram inferidas por meio do método de Jukes-Cantor, considerando distribuição normal de taxas de mutação entre os sítios, e sítios com menos de 95% de deleção foram desconsiderados da análise, gerando um total de 471 posições analisadas em cada sequência.
37
6 DISCUSSÃO
A prevalência da infecção pelo HPV sofre influência de diversos fatores,
podendo apresentar amplas variações nas suas estimativas de acordo com a idade
da população estudada e a sensibilidade do método utilizado na detecção do vírus.28
Esse fato pode ser demonstrado por meio do estudo realizado por Pariz-Silva et
al.,62 os quais compararam a prevalência da infecção pelo HPV utilizando métodos
moleculares como a PCR e CH; a PCR detectou 43,22% das amostras avaliadas
como positivas para HPV, ao passo que, quando submetidas à CH, as mesmas
amostras se mostraram positivas em apenas 35%. Nesse sentido, na casuística do
presente estudo foi empregada a técnica de PCR e foi possível observar uma
prevalência de 14,41% da infecção cervicovaginal pelo HPV.
A prevalência global do HPV na população feminina varia entre 2 e 44%.31
Contudo, em países com baixo desenvolvimento socioeconômico, como é o caso do
Gabão, essa prevalência pode apresentar taxas ainda maiores, chegando a 60% da
população feminina.63 Em contrapartida, países desenvolvidos, que propiciam
melhor acesso à saúde e, principalmente, países que instituíram campanhas de
vacinação contra o HPV apresentam uma queda nas taxas de infecção pelo vírus e
nas doenças HPV-induzidas. Nos Estados Unidos, a prevalência da infecção, que
era de 11,5% nos anos que antecederam a vacinação, reduziu para 5,1% após a
instituição da vacina e pode reduzir até 70% dos casos de câncer cervical.64 Nesse
contexto, fica evidente a associação entre as condições sociais, econômicas e de
acesso à saúde de uma população e a prevalência da infecção HPV.
O cenário atual da assistência à saúde no Brasil encontra-se dividido, com a
maioria da população utilizando o Sistema Único de Saúde (SUS), o qual possui
financiamento público e garante atendimento universal.65 Contudo, em razão de
seus inúmeros problemas, esse modelo de atenção à saúde afasta uma parcela
importante de brasileiros, os quais passam a buscar atendimentos na chamada
saúde privada ou suplementar. Via de regra, as pessoas de melhor nível
socioeconômico tendem a buscar atendimento na saúde suplementar, ao passo que
a população de baixa renda se utiliza basicamente do sistema público. Nesse
sentido, como grande parte dos estudos de prevalência da infecção pelo HPV no
38
Brasil utilizou como fonte de dados pacientes oriundas do SUS, é desconhecido o
percentual de infecção nas pacientes atendidas na rede privada de saúde, bem
como inexistem trabalhos comparativos entre esses dois grupos. Apresentamos, a
seguir, uma tabela comparativa entre diversos trabalhos realizados no Brasil sobre a
prevalência da infecção cérvicovaginal pelo HPV.
Tabela 4 – Comparação entre estudos realizados no Brasil sobre a prevalência e a genotipagem do HPV
Estudo UF1 Origem paciente Amostragem Prevalência Genótipos
2
Gonçalves et al. SC Privado 111 14.4% 53, 54 e 58
Fedrizzi et al.20
SC Privado e SUS 100 21%3 -
Dos Santos et al.7
RO SUS 334 31%4 16, 18 e 56
Pariz Silva et al.62
SC SUS 118 43.2%4 -
Oliveira G et al.8
RS SUS 302 18.2%3 16, 58 e 6
Ceccato Jr et al.9
MG SUS 171 37.1%4 16, 33 e 56
Coser et al.10
RS SUS 337 34%4 16, 31 e 62
Noronha et al.11
PA SUS 1021 12.4%3 18, 52 e 53
Oliveira L et al.12
RJ SUS 266 27.4%4 16, 31 e 66
Nota: 1 Unidade da Federação;
2 Três genótipos mais frequentes;
3 Não significante (p > 0.05);
4
Significante (p < 0.001).
Entre os estudos apresentados na Tabela 4, o que obteve a menor taxa de
infecção pelo HPV11 apresentou uma prevalência de 12,4%, similar à observada
neste estudo (p > 0,05). Nesse mesmo estudo,11 as pacientes avaliadas eram
oriundas do SUS e tinham entre 30 e 45 anos, o que pode ter sido determinante na
baixa prevalência da infecção viral encontrada pelos autores, uma vez que, de
acordo com Forman et al.,5 a infecção pelo HPV na América latina possui sua maior
prevalência entre mulheres abaixo de 25 anos, com tendência à queda com a
progressão da idade, voltando a subir, possivelmente em virtude de mudanças no
comportamento sexual, após os 45 anos. Outros dois estudos pesquisados,20,28
apesar de apresentarem uma frequência superior ao encontrado neste estudo, não
obtiveram diferença estatisticamente significativa em relação à casuística do
presente estudo. Ressalta-se que um dos trabalhos citados20 avaliou pacientes
oriundas tanto do sistema público quanto do sistema privado de saúde. Todos os
demais estudos analisados obtiveram uma taxa de infecção viral superior aos
14,41% encontrados na casuística da presente pesquisa, com P < 0,001. O fato de,
nesta amostra, serem incluídas exclusivamente mulheres atendidas em clínica
privada, o que infere uma melhor condição socioeconômica, parece ter sido
39
determinante na baixa prevalência quando comparada aos demais estudos
realizados no Brasil.
Neste estudo, a média de idade encontrada foi de 35,4 anos, sendo a média
de idade das pacientes positivas para o HPV de 31,6 anos, similar à observada por
outros autores.20 Merece destaque o fato de que entre as pacientes com idade
inferior a 20 anos, duas (66%) foram positivas para a presença do HPV, reforçando
a susceptibilidade das adolescentes a esta infecção, o que se explica principalmente
pela atividade biológica aumentada no colo uterino das pacientes jovens, com maior
frequência de ectopias e metaplasia imatura, fornecendo ambiente propício para a
infecção pelo HPV, bem como pelo maior número de parceiros sexuais.66
Além do baixo nível socioeconômico, inúmeros fatores sociais, demográficos
e de comportamento são descritos como de risco para a infecção pelo HPV e para o
câncer de colo uterino. Pode-se citar, como exemplo, início precoce da atividade
sexual, tabagismo, estado civil e baixo nível escolaridade.6 Nesta casuística, ao se
analisarem esses fatores e comparar o grupo de mulheres infectadas pelo HPV ao
grupo de mulheres não infectadas, não foram identificadas diferenças
estatisticamente significativas em nenhuma dessas variáveis, possivelmente em
virtude do perfil das pacientes selecionadas, das quais 68,75% possuíam nível de
escolaridade superior completo, e 90,1% declararam-se não fumantes. Em
contrapartida, outros autores encontram relações entre esses fatores e a infecção
pelo HPV.67-69 Em um estudo,67 os autores observaram uma relação inversa entre o
nível de escolaridade e a infecção pelo HPV; outros autores,68 em estudo que
avaliou mais de mil mulheres, demonstraram a associação entre o hábito de fumar e
a infecção cervicovaginal pelo HPV. Além disso, esses mesmos autores68
estabeleceram uma relação diretamente proporcional entre o número de cigarros
consumidos por dia e a taxa de infecção pelo HPV. Sabe-se que o tabaco possui
efeito de imunossupressão genital, o que potencializa o seu efeito carcinogênico em
razão de esse fator ser importante no processo de perpetuação da infecção pelo
HPV.69
Possuir uma relação sexual estável, com parceiro fixo, nos seis meses que
antecederam a coleta de dados, contrariando o que se imaginaria, não demonstrou
proteção contra a infecção pelo HPV na presente casuística. Observou-se que 15,
93,75% das mulheres infectadas pelo HPV declararam viver em um relacionamento
conjugal estável. Em estudo70 que envolveu apenas mulheres casadas, a
40
prevalência da infecção pelo HPV foi de 13,5%, muito próxima ao encontrado nesta
pesquisa. Por outro lado, Ebrahim et al.71 demonstraram que, mesmo em mulheres
com união conjugal estável, quando estas não residiam com os companheiros, a
probabilidade de elas se infectarem pelo HPV era estatisticamente superior à das
mulheres que residiam com os seus respectivos cônjuges. No presente estudo, 8
(53,33%) mulheres HPV positivas que possuíam relacionamento estável relataram
residir com o seu respectivo parceiro, ao passo que 7 (46,66%) não residiam com o
parceiro, o que não permite corroborar ou refutar os dados proposto por Ebrahim et
al.71
Em relação à renda familiar, apenas duas (1,8%) pacientes desta amostra, as
quais foram classificadas como não infectadas pelo HPV, relataram possuir renda
familiar mensal de até um salário mínimo. Por outro lado, 84 (75,7%) possuem renda
superior a quatro salários mínimos. Ressalta-se, mais uma vez, que o baixo nível
socioeconômico é reconhecido como fator de risco para a infecção pelo HPV.
Acredita-se que o fato de não se encontrarem diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos, no aspecto da renda familiar, deva-se novamente ao
perfil das pacientes selecionadas nesta amostra.
Considerando-se a idade da sexarca, em que o início sexual precoce poderia
propiciar maior vulnerabilidade ao HPV e a outras DSTs, também não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de pacientes
infectadas e os de pacientes não infectadas pelo HPV. Todas as pacientes
infectadas relataram início da atividade sexual antes do 21 anos; contudo,
possivelmente em virtude de ter sido utilizada uma idade de corte mais elevada para
a sexarca, com menos estratificações, e considerando o padrão sexual atual, não
foram encontrados os resultados observados em outros estudos.8,20 Destaca-se,
ainda, que nesse contexto, apesar de o HPV possuir transmissão eminentemente
sexual, outros autores72 encontraram uma prevalência importante em meninas que
ainda não haviam iniciado a atividade sexual, possivelmente em razão da
contaminação vertical durante o parto ou, ainda, por transmissão por contato durante
o banho a até mesmo pela manipulação das fraldas.
Niyazi et al73 observou a associação entre a presença de úlceras ou
inflamação vulvovaginal e a infecção pelo HPV. Outro estudo, realizado na
Colômbia,74 demonstrou associação entre a infecção por Chlamydia trachomatis e o
41
HPV. Na presente casuística, as pacientes com processos inflamatórios ou outras
DSTs não apresentaram maior prevalência em relação à coinfecção com o HPV.
A gravidez, que por determinar um maior tempo de exposição ao epitélio
metaplásico do colo uterino, assim como ocorre com as adolescentes, e pela
imunossupressão própria do ciclo gravídico puerperal, também funciona como fator
de risco para a infecção pelo HPV.28 O risco é proporcional ao período de tempo que
a paciente permaneceu grávida, ou seja, quanto maior for o número de filhos, maior
o risco.28 No presente estudo e considerando-se as mudanças da mulher moderna,
com maior inserção no mercado de trabalho e menor número de filhos, sendo este o
perfil de mulheres desta amostra, observou-se que somente 26,2% relataram
possuir mais de um filho e, com isso, não determinando diferença estatística entre
os grupos. Destaca-se que a redução do número de filhos por família é uma
constante em todo o Brasil, especialmente na região Sul, onde esse índice caiu
10,4% entre os anos 2003 e 2013.75
Em relação aos tipos de HPV, observou-se claramente que a genotipagem
realizada por meio do sequenciamento do fragmento de 451 pb do gene L1 e a
posterior classificação taxonômica baseada em similaridade e em inferências
filogenéticas (Figura 4) permitiram a classificação correta dos genótipos identificados
no presente estudo quando comparados aos genomas de referência.
Considerando esses genótipos, cinco (45,45%) corresponderam a vírus
considerados de baixo risco oncogênico, com destaque para o tipo 54. Por outro
lado, seis, ou 54,55% das amostras evidenciaram DNA de tipos com alto risco
oncogênico, em que se destacam o 53 e o 58. Esses resultados estão abaixo dos
observados em outros estudos realizados no mesmo Estado, Santa Catarina, em
que foi observada uma taxa de 69,56% de pacientes com HPV de alto risco
oncogênico na região norte62 e de 71% na região da Grande Florianópolis.20 Além
disso, o tipo 16, que representa o tipo mais prevalente na maioria dos estudos, foi
observado em apenas uma paciente neste trabalho. Não é possível determinar se a
menor taxa de tipos considerados de alto risco oncogênico observada no presente
estudo ocorreu exclusivamente em virtude de terem sido selecionadas apenas
pacientes atendidas na saúde privada ou se, além disso, outros fatores regionais
podem ter influenciado a favor de se ter um menor índice de tipos oncogênicos na
região Oeste de Santa Catarina. Vale mencionar que os tipos mais prevalentes
encontrados neste estudo – 53, 54 e 58 – não fazem parte das cepas cobertas pelas
42
vacinas contra o HPV atualmente comercializadas no Brasil. A infecção pelo HPV
58, tipo com alto risco oncogênico, será coberta na vacina nonavalente contra o
HPV, a qual estará disponível no Brasil em 2017.
Assim como o trabalho de Oliveira et al.,8 no qual também se utilizou o
sequenciamento para o processo de genotipagem, não foram observadas pacientes
com coinfecção por mais de um tipo de HPV neste estudo.
A presente casuística mostrou associação estatisticamente significativa entre
apresentar, na história pregressa ou atual, alterações no exame citológico (ASCUS
ou LIE) e a infecção pelo HPV, assim como observado por Oliveira et al.8 e Pariz-
Silva et al.62 Apesar disso, 12 (75%) mulheres infectadas pelo HPV apresentaram
citologia negativa, distinto do observado por Saraiya et al.,76 nos Estados Unidos, em
que a discordância entre a citologia e os testes de biologia molecular foi de apenas
4,9%. Pode ter contribuído para esse fato a baixa prevalência da infecção pelo HPV
encontrada no trabalho americano, bastante inferior a esta, com índice de 7,2% das
mulheres infectadas pelo HPV.
Vários autores77,78 concordam que a utilização de testes de biologia molecular
para pesquisa do HPV podem melhorar o rastreamento do câncer de colo uterino.
Sabe-se, também, que em indivíduos imunologicamente competentes a evolução
natural da infecção pelo HPV cursa com a depuração do vírus, o que caracteriza um
processo transitório.79 Apesar dessa evolução benigna, o alto percentual de
mulheres infectadas com HPV e com citologia cervicovaginal normal, com
possibilidade de persistência e evolução para lesões pré-neoplásicas, encontrado
neste estudo, remete a pensar no custo-efetividade e na necessidade de se
associarem os testes de biologia molecular ao rastreamento convencional do câncer
de colo uterino. Além disso, conforme já preconizado por Katki et al.,80 a associação
entre esse método e o citológico mostra-se uma eficiente medida para a
identificação de mulheres com alto risco de desenvolvimento desse tipo de câncer.
Acreditamos que os estudos sobre a prevalência da infecção cervicovaginal
pelo HPV são de extrema importância e, portanto, devem ser constantemente
aprimorados e aprofundados. Houve dificuldades na realização do presente estudo,
sobretudo na manipulação das primeiras amostras coletadas, o que obrigou-nos a
descartar uma parcela importante de pacientes. Lembramos que, por se tratar de um
programa interdisciplinar, envolvendo biologia molecular e ginecologia, com prazo
determinado para realização de cada etapa, não tivemos tempo hábil para realizar
43
um estudo piloto, bem como para um treinamento adequado da equipe na realização
dos procedimentos laboratoriais, obrigando-nos com isso, a descartar amostras
duvidosas. Esse problema foi solucionado e, com isso, esperamos futuramente
ampliar o número de amostras para podermos determinar a prevalência da infecção
pelo HPV não só em uma clínica específica de ginecologia, mas em toda a
população do município de Joaçaba.
44
7 CONCLUSÕES
O presente estudo demonstrou que a prevalência da infecção cervicovaginal
entre as pacientes atendidas em clínica privada de ginecologia no Município de
Joaçaba, região Meio-Oeste de Santa Catarina, Brasil, é de 14,41%, resultado
inferior ao observado na maioria dos trabalhos cuja origem das pacientes é o
sistema público de saúde. Além disso, os tipos virais mais prevalentes (53, 54 e 58)
diferem daqueles observados em outros trabalhos realizados no Brasil, em especial
aqueles que focam em pacientes do sistema público de saúde. Apesar de não ter
sido constatada a associação entre a infecção pelo HPV e os principais fatores de
risco para o câncer de colo uterino, foi observada associação estatisticamente
significativa entre a presença do vírus HPV e a história pregressa ou atual de
alterações no exame de citologia oncótica, ressaltando a necessidade da aplicação
dos testes moleculares associados ao citológico como uma estratégia para detecção
precoce do câncer de colo de útero.
45
8 CONSIDERAÇÕES A RESPEITO DA INTERDISCIPLINARIDADE
O conceito de interdisciplinaridade parece ainda estar em construção.81 Para
Japiassu,82 a interdisciplinaridade caracteriza-se pela intensidade das trocas entre
os especialistas e pelo grau de integração real das disciplinas no interior de um
mesmo projeto. Nesse sentido, o presente estudo atendeu às premissas da
interdisciplinaridade, uma vez que associou conhecimentos oriundos dos ciclos
básicos e, não menos importantes, os praticados em laboratórios, sobretudo por
meio das técnicas de biologia molecular, ao conhecimento exercido na prática clínica
diária, desempenhada no atendimento à mulher em clínica privada de ginecologia.
A determinação da prevalência da infecção cervicovaginal pelo HPV, bem
como a sua genotipagem, desenvolvidas dentro de um laboratório, tendo como
amostra a população deste estudo, retornarão a essa mesma população como
medida efetiva na prevenção dessa infecção e da mais temida de suas
complicações, o carcinoma de colo uterino.
46
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Cervical cancer risk for women undergoing concurrent testing for human
papillomavirus and cervical cytology: a population-based study in routine clinical
practice. Lancet Oncol. 2011; 12:663-72.
81. Thiesen JS. A interdisciplinaridade como um movimento articulador no processo
ensino-aprendizagem. Rev Bras Educ. 2008; 13(39).
82. Japiassu H. Interdisciplinaridade e patologia do saber. Rio de Janeiro: Imago;
1976.
57
APÊNDICE A – Instrumento de pesquisa
Questionário Socioeconômico
1. Número da Paciente:_____
2. Idade:_____
3. Etnia: ( ) Caucasiana ( ) Negra
4. Estado Civil: ( ) União Estável ( ) Sem união estável
5. Escolaridade: ( ) Ensino Fundamental ( )Ensino médio ( ) Ensino Superior
6. Renda Familiar: ( ) Até 1 salário mínimo ( ) 1-3 salários mínimos
( ) 3-5 salários mínimo ( ) + 5 salários mínimos
7. Local de atendimento:
( ) Clínica Privada ( ) PSF Vargem Bonita
( ) Consórcio Saúde Herval d‟Oeste ( ) Ambulatório Universitário – AMU
8. Cidade onde reside: _______________
9. Números de filhos: _____
parto normal : _____ cesariana: _____
10. Idade de início da atividade sexual: _____
11. Tabagismo: ( ) Fumante ( ) Não Fumante
12. Uso de anticoncepcional hormonal: ( ) Sim ( ) Não
13. Já teve alterações no exame preventivo do colo uterino
( ) Lesão pré-cancerígina (NIC/ASCUS) ( ) Câncer colo uterino
( ) Inflamação ( ) Nunca teve alterações
14. Já teve alguma doença sexualmente transmissível: ( ) Sim ( ) Não
15. Já teve verrugas genitais: ( ) Sim ( ) Não
16. Já cauterizou „‟ferida‟‟ no colo uterino: ( ) Sim ( ) Não
17. Resultado de preventivo atual (não responder): .
58
APÊNDICE B – Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado(a) como voluntário(a) a participar da pesquisa: PREVALÊNCIA E GENOTIPAGEM DO PAPILOMA
VÍRUS HUMANO (HPV) EM MULHERES DO MEIO-OESTE DE SANTA CATARINA
A JUSTIFICATIVA, OS OBJETIVOS E OS PROCEDIMENTOS: O Papiloma Vírus Humano (HPV) é um micro-organismo (vírus) que causa verrugas genitais. Sabemos que o HPV apresenta íntima associação com o câncer genital, principalmente o câncer de colo de útero...Assim esta pesquisa quer saber os tipos mais prevalentes do HPV nas mulheres do meio-oeste de Santa Catarina para poderemos adotar a melhor forma de tratamento bem como medidas preventivas para o câncer genital. Para isto, alguns procedimentos simples serão realizados, como a coleta do material cervicovaginal (exame de Papanicolau ou preventivo do câncer de colo de útero) realizado pelo pesquisador responsável (que possui habilitação para tal procedimento). O material coletado será encaminhado para laboratórios para o diagnóstico e determinação do tipo do HPV através da análise do DNA do vírus. Além disso, você responderá a um questionário pré-estabelecido composto por 16 perguntas diretas. A sua participação na pesquisa ocorrerá em uma única vez e a resposta do questionário levará aproximadamente 5 (cinco) minutos. DESCONFORTOS, RISCOS E BENEFÍCIOS: A sua participação neste estudo não gerará nenhum tipo de desconforto ou risco
além do habitual da coleta do material cervicovaginal que, como preconizado, deve ser realizado regularmente. Por outro lado,
o benefício que se obterá, com a determinação do tipo de HPV mais prevalente na nossa região, auxiliará na instituição de
medidas preventivas e terapêuticas com relação ao câncer de colo uterino, um dos tipos de câncer mais comum entre as
mulheres brasileiras
FORMA DE ACOMPANHAMENTO E ASSISTÊNCIA: Uma vez diagnosticado a presença do HPV em seu exame
cervicovaginal, você será prontamente informada pelo pesquisador e, havendo necessidade de tratamento ou apenas de
seguimento, ele será instituído pelo seu médico assistente, com o devido encaminhamento, quando necessário, e seguindo as
premissas de tratamento para cada caso.
GARANTIA DE ESCLARECIMENTO, LIBERDADE DE RECUSA E GARANTIA DE SIGILO: Você poderá solicitar
esclarecimento sobre a pesquisa em qualquer etapa do estudo. Você é livre para recusar-se a participar, retirar seu
consentimento ou interromper a participação na pesquisa a qualquer momento, seja por motivo de constrangimento e ou outros
motivos. A sua participação é voluntária e a recusa em participar não irá acarretar qualquer penalidade ou perda de benefícios.
Os pesquisadores irão tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo. Os resultados da pesquisa do DNA do HPV
serão enviados para você e permanecerão confidenciais. Seu nome ou o material que indique a sua participação não será
liberado sem a sua permissão. Você não será identificada em nenhuma publicação que possa resultar deste estudo. Este
consentimento está impresso e assinado em duas vias, uma cópia será fornecida a você e a outra ficará com o pesquisador
responsável.
CUSTOS DA PARTICIPAÇÃO, RESSARCIMENTO E INDENIZAÇÃO: A participação no estudo, não acarretará custos para
você e não será disponibilizada nenhuma compensação financeira
DECLARAÇÃO DO SUJEITO PARTICIPANTE OU DO RESPONSÁVEL PELO SUJEITO PARTICIPANTE: Eu, .......................................................................................................... fui informada dos objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dúvidas. Sei que em qualquer momento poderei solicitar novas informações e ou retirar meu consentimento. Os responsáveis pela pesquisa acima, certificaram-me de que todos os meus dados serão confidenciais. Em caso de dúvidas poderei chamar os pesquisadores responsáveis Luiz Fernando Goncalves, Av. Santa Terezinha, 243 tel. 3521-0091 ou Prof. Dr. Glauber Wagner, Rua José Firmo Bernardi, 1591, Unoesc, Campus II, Bloco B, Sala 306, Tel. 3551 – 2128 ou ainda entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Unoesc e Hust, Rua Getúlio Vargas, nº 2125, Bairro Flôr da Serra, 89600-000- Joaçaba – SC, Fone: 49-3551-2012. Declaro que concordo em participar desse estudo. Recebi uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido e me foi dada a oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas. Assinatura do sujeito pesquisado ou impressão dactiloscópica.
Nome legível:
Endereço: RG. Fone: _______________________________________ Assinatura do(a) pesquisador(a) responsável Data _____/______/_____
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ANEXO A – Parecer Consubstanciado CEP
60
ANEXO B – Comprovante de submissão do artigo científico à
Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia
61
MEMORIAL DE CORREÇÕES
Mestrando: Luiz Fernando Gonçalves
Dissertação: PREVALÊNCIA E GENOTIPAGEM DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA
REGIÃO CERVICOVAGINAL DAS MULHERES ATENDIDAS EM CLÍNICA PRIVADA DE
GINECOLOGIA NO MUNICÍPIO DE JOAÇABA, SC.
Informamos que foram realizadas as correções na versão final do trabalho conforme
solicitado pela banca examinadora, a saber:
1) Alteração no título;
2) Correções gramaticais;
3) Substituição do termo “subtipo” pelo termo “Tipo” em todo o trabalho;
4) Alteração na Referência 29, página 21 do texto;
5) Mudança da Tabela 4 da seção “resultados” para a seção “discussão”;
6) Confecção de um parágrafo elencando as dificuldades e perspectivas futuras sobre o
tema abordado;
7) Correções da formatação nas referências bibliográficas
Atenciosamente,
_________________________________
Luiz Fernando Gonçalves
Joaçaba, 23/11/16