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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
O POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO SULFORAFANO – ENFOQUE NA
VIA NRF2/KEAP1
Tatiana Bertoni Bacovsky
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade
de São Paulo.
Orientadora:
Prof.a. Dra. Silvia Maria Franciscato
Cozzolino
São Paulo
2018
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................ 2
RESUMO..................................................................................................................... 4
1.INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 5
1.1. Oxidação e o papel de antioxidantes ................................................................ 6 1.2. A via Nrf2/Keap1 no estresse oxidativo e inflamação ....................................... 8 1.2.1. Nrf2 ................................................................................................................... 8 1.2.2. Keap1 ............................................................................................................... 9 1.2.3. Ativação do Nrf2 ............................................................................................. 10 1.2.4. A relação Nrf2- NFκB ...................................................................................... 10 1.3. Sulforafano ..................................................................................................... 11 1.3.1. Efeitos do processamento do vegetal ............................................................. 12 1.3.2. Biodisponibilidade ........................................................................................... 12 1.3.3. Ativação do Nfr2 ............................................................................................. 14
2.OBJETIVO .............................................................................................................. 16
3.MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 17
4.RESULTADOS ....................................................................................................... 18
5.DISCUSSÃO .......................................................................................................... 28
6.CONCLUSÃO ......................................................................................................... 33
7.BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 34
8.ANEXOS ................................................................................................................ 42
2
LISTA DE ABREVIATURAS
8-OHdG
ABC
ALT
ARE
AST
ATP
BTB
bZIP
CAT
CBP
CGI-I
CNC
DCNT
DGR
DNA
DPOC
EpRE
EROs
ESP
γ-GCS
γ-GTP
GCL
GCLc
GCLm
GRN
GSH
GSH-Px
GST
GSTM1
GSTP1
GSTT1
8-hidroxideoxiguanosina
Aberrant Behavior Checklist
Alanina aminotransferase
Antioxidant Response Elements
Aspartato aminotransferase
Adenosine triphosphate
bric-a-brac, tramtrac, broad complex
Basic leucine zíper
Catalase
cAMP-response-element-binding protein-binding protein
Clinical Global Impression Improvement Scale
Cap ‘n’ Collar
Doenças crônicas não transmissíveis
Double glycine repeat/6 Kelch repeat
Deoxyribonucleic acid
Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
Electrophilic Response Element
Espécies Reativas de Oxigênio
Epithiospecifier
γ -Glutamilcisteína sintetase
γ-Glutamil transpeptidase
Glutamato-cisteína ligase
Subunidade catalítica da glutamato cisteína ligase
Subunidade modificadora da glutamato cisteína ligase
Glicorafanina
Glutationa
Glutationa peroxidase
Glutationa S-transferase
Glutationa S-transferase M1
Glutationa S-transferase P1
Glutationa S-trasferase T1
3
HBG1
HO-1
H2O2
HpSA
IgE
IκBα
IL-6
IVR
Keap1
Maf
mRNA
NADPH oxidase
Neh
NFκB
NQO1
Nrf2
•O2-
•OH
PG
SFN
SOD
SRS
UGT
UV
Subunidade da hemoglobina fetal
Heme oxigenase-1
Peróxido de hidrogênio
H. pylori stool antigen
Imunoglobulina E
NFκB inhibitor-alpha
Interleucina 6
intervening linker region
Kelch-like ECH-associated protein 1
Musculoaponeurotic fibrosarcoma
Messenger ribonucleic acid
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase
Nuclear factor E2-related factor 2-ECH homology
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NAD(P)H:quinona oxiredutase 1
Nuclear factor E2-related factor 2
Ânion superóxido
Radical hidroxil
Pepsinogênio
Sulforafano
Superóxido dismutase
Social Responsiveness Scale
UDP-glicuronosiltransferase
Ultravioleta
4
RESUMO
BACOVSKY, T.B. O Potencial Antioxidante do Sulforafano – Enfoque na via Nrf2/Keap1. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018. Palavras-chave: Sulforafano, Nrf2, Antioxidante, Keap1. INTRODUÇÃO: O consumo de frutas, legumes e verduras é conhecido como parte fundamental de uma dieta saudável. O aumento do consumo de vegetais crucíferos, importante fonte do fitoquímico sulforafano (SFN), tem sido associado à diminuição do risco de doenças crônicas. A patogênese dessas doenças está relacionada ao estresse oxidativo, caracterizado pelo desequilíbrio entre a produção e a remoção de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que leva ao dano de DNA (deoxyribonucleic acid), proteínas e lipídios, afetando a função celular. O SFN vem sendo abordado como um potencial antioxidante devido à sua habilidade de modular a via do fator de transcrição Nrf2 (Nuclear factor E2-related factor 2) e seu repressor Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), induzindo a expressão do elemento de resposta antioxidante (Antioxidant response elements - ARE), região promotora de genes codificantes de enzimas antioxidantes e detoxificantes. OBJETIVO: O objetivo do presente trabalho foi revisar as evidências já publicadas de estudos clínicos de intervenção acerca do potencial efeito indutor do SFN sobre a via Keap1/Nrf2/ARE que demonstrem a sua eficácia clínica como alternativa terapêutica para manutenção do equilíbrio oxidativo do organismo humano. MATERIAIS E MÉTODOS: Uma vasta pesquisa bibliográfica foi conduzida nas bases de dados PubMed, MedLine e Science Direct. Foram incluídas publicações de ensaios clínicos relevantes, em inglês ou português, a partir do ano 2007, sobre os possíveis efeitos antioxidantes do consumo de SFN, glicorafanina (GRN) ou brócolis. Os descritores consultados no título e/ou resumo dos trabalhos foram: sulforaphane (sulforafano), glucoraphanin (glicorafanina), cruciferous vegetables (vegetais crucíferos), Nrf2, Keap1, oxidative stress (estresse oxidativo) e antioxidant (antioxidante), utilizando os termos AND e OR. Os desfechos de interesse considerados foram primordialmente parâmetros moleculares envolvidos na via do Nrf2, mas também se estendeu aos relacionados com o estresse oxidativo e a inflamação, quando passíveis de vínculo à via de sinalização desse fator de transcrição. RESULTADOS: Foram incluídos 15 estudos com amostras, intervenções, tempo de seguimento e desfechos muito heterogêneos. Os principais achados referem-se ao trato respiratório, infecção gástrica por Helicobacter pylori, doença falciforme e efeito protetor contra o risco de câncer de pele induzido por luz ultravioleta (UV) e de câncer oral. Foram encontrados desfechos favoráveis em relação a indicadores de estresse oxidativo em indivíduos com esteatose hepática e com diabetes tipo 2, assim como acerca da detoxificação de poluente atmosféricos, sugerindo um efeito protetor contra o câncer de pulmão. Ainda, um estudo verificou melhora comportamental em autistas. CONCLUSÃO: Há evidências de potenciais benefícios do consumo de SFN e/ou de seu precursor GRN sobre parâmetros moleculares antioxidantes e envolvidos na via Keap1/Nrf2/ARE em humanos, embora ainda sejam limitadas e um número maior de estudos é necessário para uma conclusão mais consistente.
5
1. INTRODUÇÃO
O estresse oxidativo, caracterizado pelo desequilíbrio entre a produção e a
remoção de espécies reativas de oxigênio (EROs), pode danificar o DNA, as proteínas
e os lipídios de membrana, afetando a função celular e, consequentemente,
desencadear diversas doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), como câncer,
diabetes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. A via do fator de
transcrição Nrf2 e seu repressor Keap1 possui importante ação citoprotetora ao
regular o ARE, também conhecido como EpRE (Electrophilic Response Element), que
corresponde à região promotora de genes que codificam enzimas antioxidantes
(AHMED et al., 2017; BAIRD & DINKOVA-KOSTOVA, 2011; QIN & HOU, 2016;
STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
Uma vez que o desenvolvimento de DCNT envolve tanto componentes
genéticos (predisponentes) quanto fatores ambientais (desencadeantes), a
alimentação possui papel importante. A composição e a qualidade dos alimentos são
de extrema relevância em virtude do valor nutricional e da capacidade de seus
nutrientes e compostos bioativos de impactarem na expressão gênica, caracterizando
a vertente de estudo conhecida como Nutrigenômica. A Nutrigenética, por sua vez,
representa o campo de pesquisa complementar, sendo definida como a atividade que
a carga genética exerce em resposta à alimentação, necessidades alimentares e risco
para DCNT (HOUGHTON, FASSETT, & COOMBES, 2016).
O consumo de frutas e vegetais é reconhecido como parte importante de uma
dieta saudável por contribuir com uma série de compostos benéficos à saúde, dentre
os quais estão os fitoquímicos, geralmente considerados nutrientes não-essenciais,
mas capazes de afetar a saúde humana em virtude de suas propriedades químicas
(RODRIGUEZ-CASADO, 2016). O consumo de vegetais crucíferos tem sido
associado à diminuição do risco de desenvolver doenças degenerativas e crônicas,
incluindo doenças cardiovasculares (BUIL-COSIALES et al., 2017; ZHANG et al.,
2011) e certos tipos de câncer (HU et al., 2015; TSE & ESLICK, 2014; WU et al., 2013).
Os vegetais crucíferos, como brócolis, couve, couve-de-bruxelas, couve-flor e repolho,
contêm concentrações significativas de fitoquímicos glicosinolatos, os quais são
metabolizados in vivo a isotiocianatos, que são biologicamente ativos. O isotiocianato
sulforafano derivado da glicorafanina contida nesses vegetais, vem ganhando
destaque como um antioxidante indireto, devido à sua habilidade de induzir a
6
expressão de diversas enzimas antioxidantes e detoxificantes de Fase II através da
via Keap1/Nrf2/ARE (BODDUPALLI et al., 2012). Esses achados indicam o potencial
do SFN como alternativa terapêutica para o tratamento e redução do risco de doenças
crônicas, cujos processos patológicos estão diretamente relacionados com essa via
de sinalização.
1.1. Oxidação e o papel de antioxidantes
Em termos químicos, oxidação é a adição de oxigênio ou a remoção de
hidrogênio ou de elétron de uma molécula. EROs são parcialmente reduzidas ou são
formas de oxigênio “energizadas”, o que as tornam capazes de oxidar moléculas
(BENZIE & CHOI, 2014). O oxigênio é um radical livre e aceptor final de elétrons da
respiração. O seu par de elétrons desemparelhados gira na mesma direção e, por
isso, é considerado um birradical (PACKER & CADENAS, 2007). Algumas EROs
contêm um ou mais elétrons desemparelhados em um orbital, que são os chamados
radicais livres, como o ânion superóxido (•O2-), o radical hidroxil (•OH) e radicais
lipídicos. Normalmente, possuem meia vida extremamente curta, são altamente
reativas, produzidas em todos os sistemas biológicos e reagem facilmente com
moléculas que se localizam em torno do seu sítio de formação. Outras, são espécies
oxidantes não radicalares, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual possui meia
vida longa e atravessa as membranas celulares facilmente, o que o torna
potencialmente tóxico para as células, além de participar na reação de formação do
radical hidroxil, o mais reativo dos radicais livres, devido à sua capacidade de alterar
qualquer estrutura celular (BENZIE, 2003; PACKER & CADENAS, 2007).
A produção de radicais livres constitui um processo contínuo e fisiológico. São
gerados durante o metabolismo e a produção de energia no organismo. A cadeia
respiratória nas mitocôndrias é a sua principal fonte, uma vez que possui vários
centros redox, mas também são formados a partir de enzimas de membrana, como o
complexo enzimático NADPH oxidases (nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate-oxidase), metabolismo de ácidos graxos nos peroxissomos, citocromo
P450 e células fagocitárias (GREEN, BRAND & MURPHY, 2004). Os radicais livres
exercem funções biológicas relevantes como mediadores para a transferência de
elétrons nas várias reações bioquímicas. Estão envolvidos com a geração de ATP
(adenosine triphosphate – energia), a regulação da transdução de sinal e a expressão
7
gênica, a ativação de receptores, a transcrição de fatores nucleares, a função
endotelial, a ação antimicrobiana e a ação citotóxica inerente ao sistema imune das
células, bem como com o envelhecimento e suas doenças degenerativas
relacionadas, em função do dano oxidativo aos componentes celulares (PACKER &
CADENAS, 2007). O óxido nítrico, por exemplo, é um vasodilatador, o peróxido de
hidrogênio é uma molécula importante da sinalização intracelular e o superóxido tem
papel importante na imunidade inata (BENZIE & CHOI, 2014).
A produção contínua de radicais livres durante os processos metabólicos
culminou no desenvolvimento de mecanismos de defesa antioxidante para limitar os
níveis intracelulares de tais espécies reativas, permitindo que essas efetuem suas
atividades biológicas benéficas sem que ocorram efeitos deletérios excessivos. Esses
mecanismos envolvem enzimas de Fase I, que englobam as hemoproteínas
monoooxigenases da classe do Citocromo P450, e enzimas de Fase II, as quais
convertem os metabólitos intermediários produzidos pelas enzimas de Fase I em
compostos excretáveis. Toxinas que ativam ambas as fases são conhecidas como
bifuncionais e as que ativam apenas as enzimas de Fase II, monofuncionais. Para
uma detoxificação ótima e eficiente, um oxidante deve ser submetido a uma reação
de Fase I lenta, seguida por uma de Fase II mais rápida, o que previne o acúmulo de
metabólitos da primeira fase, os quais são mais tóxicos que seus precursores.
Enzimas de Fase II, interessantemente, apresentam meia-vida relativamente longa,
permanecendo no organismo por vários dias (HOUGHTON, FASSETT & COOMBES,
2016). Além disso, a defesa antioxidante pode ser dividida em enzimática, que inclui
a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GSH-Px);
e em não-enzimática, constituída por grande variedade de substâncias antioxidantes,
de origem endógena, como a glutationa (GSH), e as de origem dietética. O sistema
de defesa antioxidante intrínseco, embora seja altamente efetivo, não é totalmente
suficiente, sendo necessário o acréscimo de antioxidantes da dieta, como vitaminas
lipossolúveis (vitamina A, vitamina E e betacaroteno), vitaminas hidrossolúveis
(vitamina C e vitaminas do complexo B) e oligoelementos (zinco, cobre, selênio e
magnésio) (PACKER & CADENAS, 2007).
Um excesso de EROs pode levar à oxidação descontrolada e indiscriminada
de importantes biomoléculas, afetando suas funções biológicas e/ou levando a um
desequilíbrio homeostático, o que é conhecido como estresse oxidativo. O dano
oxidativo potencial contra células e tecidos manifesta-se através de inativação de
8
enzimas, mutações, ruptura de membranas, aumento da aterogenicidade de
lipoproteínas de baixa densidade, disfunção mitocondrial e morte celular. Duas razões
principais explicam esse desequilíbrio: 1) produção excessiva de EROs, que pode ser
desencadeada pelo metabolismo oxidativo, pela detoxificação de níveis elevados de
compostos xenobióticos (como poluição, pesticidas, álcool, fumo e gorduras
insaturadas consumidas em excesso) ou por uma ativação descontrolada de sistemas
produtores de EROs, como os fagócitos; e 2) deficiência da defesa antioxidante, como
consequência de carências nutricionais ou doenças genéticas (BENZIE & CHOI, 2014;
BENZIE, 2003; KEHRER & KLOTZ, 2015).
A cronicidade desse descompasso tem implicações relevantes sobre o processo
etiológico de diversas doenças, incluindo as cardiovasculares, obesidade, câncer,
diabetes e transtornos neurodegenerativos. Essas patologias apresentam como
características em comum a inflamação crônica, que em conjunto com o estresse
oxidativo, compõem um binômio importante no desenvolvimento das mesmas
(FERRARI, 2004; GREEN, BRAND & MURPHY, 2004).
1.2. A via Nrf2/Keap1 no estresse oxidativo e inflamação
A recomendação de uma dieta variada e balanceada está baseada nos
componentes dos alimentos que promovem benefícios à saúde. Diversos estudos
epidemiológicos mostraram que dietas ricas em frutas, verduras e legumes reduzem
o risco de desenvolver doenças crônicas (KAULMANN & BOHN, 2014). Os compostos
antioxidantes dos alimentos de origem vegetal, por exemplo, atuam tanto diretamente
na eliminação dos radicais livres, quanto indiretamente, ao estimular o sistema
antioxidante endógeno através da ativação do Nrf2, um fator de transcrição nuclear
que coordena a expressão de genes antioxidantes em resposta ao estresse oxidativo
fisiológico e fisiopatológico, apresentando função importante na proteção celular.
Dentre os indutores de Nrf2, pode-se citar substâncias endógenas, como o óxido
nítrico, o ácido nitro-oleico, o peróxido de hidrogênio, as lipoproteínas de baixa
densidade, as prostaglandinas, bem como compostos de origem exógena (AHMED et
al., 2017; STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
1.2.1. Nrf2
9
O Nrf2 pertence à família de genes conhecida como basic leucine zíper (bZIP)
que possui uma estrutura Cap ‘n’ Collar (CNC). É constituído por seis domínios
funcionais, designados Nrf2-ECH homology (Neh), de Neh1 ao Neh6, conforme
representado na Figura 1 (Anexos). Neh1 corresponde ao domínio CNC-bZIP, que
permite a formação de heterodímeros com as proteínas musculoaponeurotic
fibrosarcoma (Maf), necessárias para a ligação ao DNA. Neh2 consiste na porção
amino-terminal da proteína e é a região de ligação ao Keap1, repressor da atividade
do Nrf2. Esse domínio possui uma região de alta afinidade ao Keap1 – motivo ETGE
– e uma de baixa – motivo DLG. Neh3 corresponde à região carboxil-terminal da
proteína e está envolvido na ativação transcricional de genes dependentes do ARE,
que corresponde à uma sequência de nucleotídeos específicos localizada na região
promotora desses genes. Neh4 e Neh5 estão envolvidas com a ativação transcricional
e são regiões onde se ligam outros co-ativadores de transcrição, conhecidos como
CBP (cAMP-response-element-binding protein-binding protein) (AHMED et al., 2017;
STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
Em condições de homeostasia do sistema redox, o Nfr2 se encontra inativo no
citoplasma, uma vez que é sequestrado pelo seu repressor Keap1. Este fica localizado
próximo à membrana plasmática e atua como uma proteína adaptadora para o
complexo ubiquitina ligase Cul3-Rbx E3, o qual é responsável pela ubiquitinação do
Nfr2, com consequente degradação proteassomal. Dessa forma, o Nrf2 apresenta
meia-vida curta e está em constante renovação, caracterizando um sistema de
feedback negativo, que previne um acúmulo de antioxidantes (AHMED et al., 2017;
STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
1.2.2. Keap1
O Keap1 é composto por três domínios, conforme representado na Figura 1
(Anexos). BTB (bric-a-brac, tramtrac, broad complex) corresponde às regiões de
dimerização de duas subunidades de Keap1 e de ligação com o complexo Cul3-Rbx
E3. IVR (intervening linker region) é o domínio redox sensível, uma vez que é a região
onde estão localizados a maioria dos grupos tiol sensíveis dos resíduos de cisteína
(Cis-SH) (STEFANSON & BAKOVIC, 2014). A proteína Keap1 humana possui 27
resíduos de cisteína e cada um parece responder de modo particular a tipos diferentes
de eletrófilos (KEUM, 2011). O domínio DGR (double glycine repeat/6 Kelch repeat) é
10
a região de ligação com a actina e com o Nrf2. Cada subunidade do dímero de Keap1
possui, portanto, uma região de ligação ao Nrf2 (STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
1.2.3. Ativação do Nrf2
O complexo Nrf2-Keap1 atua como sensor intracelular de alterações no
equilíbrio redox. Em resposta a eletrófilos e ao estresse oxidativo, podem ocorrer
modificações nos grupos tiol sensíveis, o que promove a ruptura da sua ligação com
o Nrf2, caracterizando o mecanismo Keap1 dissociation. Além disso, as modificações
nos resíduos de cisteína do Keap1 podem resultar em alterações conformacionais que
levam ao rompimento apenas da ligação fraca entre Keap1 e Nrf2, o que já impede a
ubiquitinação, caracterizando a teoria Keap1 hinge-and-latch, atribuída aos motivos
ETGE e DLG do domínio Neh2 do Nfr2. Um outro importante mecanismo de ativação
do Nrf2 pode ocorrer através da inativação do Keap1 por um complexo Cul3-
dependente, o qual o ubiquitiniza, consistindo no modelo Keap1 ubiquitination.
Também há evidências de que a inibição da formação do complexo Nrf2-Keap1 pode
ocorrer via mecanismos Keap1-independentes, através da fosforilação do Nrf2 por
certas proteínas quinases em resposta ao aumento de oxidantes, o que leva à sua
dissociação do Keap1 (QIN & HOU, 2016; BAIRD & DINKOVA-KOSTOVA, 2011).
Consequentemente, todas essas vias geram um acúmulo de Nfr2 no interior das
células, com posterior translocação nuclear. Uma vez no núcleo, o Nrf2 forma
heterodímeros com proteínas Maf e liga-se ao ARE localizado na região promotora de
genes-alvo, ativando a transcrição de genes que codificam enzimas antioxidantes e
detoxificantes de Fase II, dentre as quais pode-se citar a NAD(P)H:quinona
oxiredutase 1 (NQO1), glutationa S-transferase (GST), heme oxigenase-1 (HO-1),
GSH-Px, glutamato-cisteína ligase (GCL), CAT, SOD, UDP-glicuronil transferase
(UGT) e o sistema tioredoxina-peroxirredoxina (AHMED et al., 2017; BAIRD &
DINKOVA-KOSTOVA, 2011; STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
1.2.4. A relação Nrf2- NFκB
O Nrf2 também está envolvido na citoproteção contra a inflamação devido à
sua capacidade de antagonizar o fator de transcrição NFκB (nuclear factor kappa-
light-chain-enhancer of activated B cells). Este regula a reposta imune celular em
11
infecções e em níveis elevados de estresse oxidativo, promovendo a expressão de
genes inflamatórios codificantes de citocinas pró-inflamatórias. Essas citocinas, por
sua vez, podem estimular a produção de EROs, agravando ainda mais o desequilíbrio
do status redox (AHMED et al., 2017). A ativação do Nrf2 eleva o nível de Keap1 livre
para capturar IKKβ, proteína citosólica responsável pela fosforilação do IκBα (NFκB
inhibitor-alpha), inibidor do NFκB. Dessa forma, a formação do complexo Keap1-IKKβ
reduz a degradação do IκBα, a qual permanece ligada ao NFκB, inibindo sua ativação.
Em situações de estresse oxidativo elevado, as alterações que ocorrem nos grupos
tiol do Keap1 se tornam irreversíveis, interrompendo o sequestro de IKKβ, com
consequente ativação do NFκB. Este, por sua vez, é capaz de inibir o Nrf2,
caracterizando o ponto de transição entre estresse oxidativo e inflamação
(STEFANSON & BAKOVIC, 2014).
1.3. Sulforafano
O SFN [1-isotiocianato-(4R)-(metilsulfinil)butano: CH3S(O)(CH2)4-N=C=S]
pertence ao grupo dos compostos organosulfurados dos fitoquímicos e é um
isotilcianato, caracterizado pela presença do grupo funcional –N=C=S. A sua principal
fonte são os vegetais crucíferos, constituintes do gênero Brassica e da família
Brassicaceae (KEUM, 2011). Seu precursor é a GRN, a qual não possui bioatividade
inerente e pertence ao grupo dos glicosinolatos, os quais são classificados como
tioglicosídeos por conter um grupamento ciano (N=C) e um grupamento sulfato (SO4).
Quando a planta é processada pelo corte, cozimento ou pela mastigação, a GRN é
exposta à ação da enzima vegetal mirosinase (β-tioglicosidase) e então é hidrolisada
a SFN, conforme representado na Figura 2 (Anexos) (BODDUPALLI et al., 2012;
KEUM, 2011). Tal conversão também pode ocorrer através da ação de uma isoforma
dessa enzima produzida por bactérias da flora intestinal humana (KEUM, 2011), como
Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides e Enterococcus (TIAN et al., 2018),
apresentando ampla variabilidade de conversão interindividual (de cerca de 1% a 40%
da dose) (FAHEY et al., 2012).
Em decorrência da sua lipofilicidade e tamanho molecular, o SFN é absorvido
facilmente nos enterócitos por meio de difusão passiva, conjugado com a forma
reduzida da GSH pela GST e metabolizado pela via do ácido mercaptúrico até a forma
N-acetil-sulforafano (KEUM, 2011). O brócolis é a principal fonte de SFN, com cerca
12
de 75% dos seus glicosinolatos correspondendo à GRN (HOUGHTON, FASSETT &
COOMBES, 2016). Uma análise transversal de um estudo prospectivo de coorte
conduzido na Espanha observou um consumo diário médio de vegetais crucíferos de
11,3 g, o que representa cerca de 5% da ingestão total de vegetais e contribui com
6,5 mg de glicosinolatos por dia (AGUDO et al., 2008). Um outro estudo verificou que
menos de 1 em cada 5 americanos consumiram vegetais crucíferos no período
analisado, representando apenas 3% da população investigada, com ingestão média
de 0,2 porções por dia (JOHNSTON, TAYLOR & HAMPL, 2000).
1.3.1. Efeitos do processamento do vegetal
A maneira como o vegetal é cozido parece ser o principal determinante da
conversão de GRN em SFN. O consumo de brócolis levemente cozidos (2 minutos no
micro-ondas a 750 W) resultou em 3 vezes mais SFN em relação à versão cozida por
completo (5 minutos no micro-ondas a 750 W) (RUNGAPAMESTRY et al., 2007). Tal
fato pode ser explicado pela inativação térmica da mirosinase, que ocorre em
temperaturas superiores a 60ºC (TIAN et al., 2018). Nesse mesmo sentido, a
biodisponibilidade do isotiocianato foi 10 vezes maior para o consumo de sopa
preparada à base de brócolis frescos versus congelados, em função da perda de
atividade da mirosinase durante o processo de congelamento (SAHA et al., 2012). O
cozimento leve é capaz de maximizar a formação de SFN uma vez que desnatura
proteínas Epithiospecifier (ESP), inibidores não catalíticos da mirosinase
responsáveis pela conversão dos glicosinolatos em derivados nitrila, sem levar à
perda de atividade da mirosinase (SAHA et al., 2012). Dessa forma, o consumo de
vegetais crucíferos crus não é uma forma eficiente de obtenção dos benefícios
propiciados pelo SFN. A condição ideal de processamento para maximização da
concentração de SFN foi determinada como sendo de 38ºC durante 3 horas na
presença de 0,22 mg de ácido ascórbico por grama de brócolis fresco. O teor de SFN
atingido foi de 8,0 µmol/g de massa seca, representando um aumento de 585% em
comparação ao vegetal fresco, equivalente a 94% da conversão de GRN (MAHN &
PÉREZ, 2016).
1.3.2. Biodisponibilidade
13
Um estudo de revisão identificou que a concentração plasmática máxima de
SFN pode variar drasticamente entre cerca de 0,03 a 7 mol/L, atingindo o pico entre
1,5 e 3 horas após a ingestão de GRN ou preparações de brócolis (PATEL, MANN &
CHAPPLE, 2018). Tal variação pode ser atribuída em grande parte às diferenças no
processamento térmico do vegetal, bem como à variabilidade na composição da
microbiota, conforme supracitado. Os metabólitos do SFN são rapidamente
eliminados na urina dentro de 12 a 24 horas, tanto em animais quanto em humanos
(TAROZZI et al., 2013).
Em ratos o SFN atingiu os tecidos dos tratos gastrointestinal e geniturinário,
principalmente o estômago e a bexiga, bem como de outros órgãos, como fígado,
pâncreas, pulmão e coração. A distribuição pelos tecidos foi heterogênea tanto em
relação à concentração quanto à capacidade de induzir a expressão de enzimas
citoprotetoras de Fase II (VEERANKI et al., 2013). Um estudo com mulheres detectou
metabólitos nas concentrações de 0,05 a 3,95 μmol/mg de tecido das mamas uma
hora após a ingestão de 200 μmol de SFN (CORNBLATT et al., 2007).
Um estudo cross-over comparou a biodisponibilidade de 2 formulações
preparadas à base de brotos de brócolis: uma rica em GRN e outra rica em SFN. A
excreção urinária do SFN e seus metabólitos foi substancialmente superior para a
formulação contendo SFN (70%) em comparação à formulação rica em GRN (5%), a
qual por sua vez apresentou uma taxa de eliminação mais lenta, propiciando atingir
um steady-state em oposição ao efeito de ataque obtido com a formulação rica em
SFN. Esse resultado sugere que uma formulação ideal deve conter tanto GRN quanto
SFN, de modo que resulte em concentrações máximas e mais prolongadas,
amplificando a atividade deste fitoquímico (EGNER et al., 2011). Um resultado
semelhante foi observado por Fahey et al., ao comparar a excreção urinária de
ditiocarbamatos após a dose única de extrato de brotos de brócolis contendo GRN ou
SFN em duas populações diferentes, uma da zona rural chinesa de Han, e outra
miscigenada de Baltimore. A eliminação de metabólitos do SFN variou drasticamente
em ambas as populações após o consumo do extrato rico em GRN (cerca de 1% a
40% da dose), enquanto que a administração de SFN resultou em uma conversão
maior e mais uniforme (70 a 90%) (FAHEY et al., 2012).
Um estudo comparou a suplementação de 121 µmol de GRN com a ingestão
de 40 g de brotos de brócolis frescos contendo 150 µmol de GRN. A biodisponibilidade
do SFN foi significativamente inferior (7 vezes menor) para a suplementação,
14
evidenciando que esta alternativa, desprovida da atividade da mirosinase, não
propicia quantidades equivalentes do composto bioativo em comparação ao consumo
de brotos de brócolis. Embora a mirosinase intestinal seja capaz de converter
glicosinolatos em seus metabólitos bioativos, a presença adicional da enzima vegetal
é importante para que se atinja uma máxima biodisponibilidade de isotilcianatos
(CLARKE et al., 2011).
Além disso, a composição da refeição não parece interferir significativamente
na biodisponibilidade do sulforafano (RUNGAPAMESTRY et al., 2007).
1.3.3. Ativação do Nfr2
O SFN tem sido reportado como potente indutor da sinalização do Nrf2. A
incubação de enterócitos de camundongos com SFN resultou na indução do Nrf2 em
um período inferior a 30 minutos, com um concomitante aumento da ativação
transcricional de seus genes alvos, que resultou em maiores níveis de HO-1, NQO1,
GST, γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GCS) e UGT (THIMMULAPPA et al., 2002). Tal
efeito também foi observado em ratos diabéticos, através da indução da expressão de
HO-1 e NQO1, além de ter sido verificado o efeito anti-inflamatório do SFN devido à
redução da expressão de NFκB (NEGI, KUMAR & SHARMA, 2011). Em ratos
submetidos a traumatismo craniano, a exposição ao SFN aumentou a expressão de
HO-1 e NQO1 e reduziu o dano oxidativo causado pelas lesões corticais, diminuindo
a morte neuronal, o volume da contusão e a disfunção neurológica. Já camundongos
knockout para Nrf2 não se beneficiaram dos mesmos efeitos do SFN, evidenciando o
papel fundamental deste fator de transcrição para a defesa celular contra o estresse
oxidativo (HONG et al., 2010). Em contrapartida, observou-se que ratos tratados com
SFN não apresentaram elevação nos níveis de mRNA (messenger ribonucleic acid)
do Nrf2, sugerindo que o aumento nos níveis dessa proteína após exposição ao SFN
é regulado pós-transcricionalmente, estando apenas relacionado à redução da sua
taxa de degradação (MCMAHON et al., 2003).
O carbono central do grupo funcional do SFN (–N=C*=S) é eletrofílico e reage
rapidamente com enxofre, nitrogênio e oxigênio nucleofílicos, como os que estão
presentes na estrutura de aminoácidos. Sugere-se, dessa forma, que o SFN pode
reagir com os grupos tiol sensíveis da proteína Keap1, conforme representado na
Figura 3 (Anexos), contribuindo para a estabilização do Nrf2. Hong, Freeman e Liebler
15
investigaram essa interação com uma proteína Keap1 recombinante. Observaram que
o aduto Keap1-SFN é lábil e que os resíduos de cisteína responsáveis pela interação
com o fitoquímico são variáveis, dependendo das condições do experimento, como a
concentração de SFN utilizada (HONG, FREEMAN & LIEBLER, 2005). Além disso,
análises mutagênicas revelaram que um grande número de resíduos de cisteína na
posição 151 resulta em alterações na conformação estérica, diminuindo a capacidade
de interação Keap1-Cul3 e, consequentemente, a taxa de ubiquitinação do Nrf2
(EGGLER et al., 2009). Baird e Dinkova-Kostova também concluíram que a
estabilização do Nrf2 pela exposição ao SFN é resultante de alterações
conformacionais no Keap1, as quais dificultam a ubiquitinação pelo complexo Cul3
(BAIRD & DINKOVA-KOSTOVA, 2013). Contudo, ainda não se sabe se o SFN pode
formar um aduto estável com a proteína Keap1 endógena nas células humanas e,
tampouco em quais resíduos a conjugação ocorreria.
16
2. OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho foi revisar as evidências já publicadas de
estudos de intervenção acerca do potencial indutor do sulforafano sobre a via
Keap1/Nrf2/ARE que demonstrem a sua eficácia clínica como alternativa terapêutica
para o equilíbrio do status oxidante do organismo humano.
17
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Uma vasta pesquisa na literatura científica foi conduzida para a corrente
revisão, utilizando as bases de dados PubMed, MedLine e Science Direct. Foram
incluídas publicações de ensaios clínicos relevantes, em inglês ou português, a partir
do ano 2007, sobre os possíveis efeitos antioxidantes do consumo de sulforafano,
glicorafanina ou brócolis em humanos. Os descritores consultados no título e/ou
resumo dos trabalhos foram: sulforaphane (sulforafano), glucoraphanin
(glicorafanina), cruciferous vegetables (vegetais crucíferos), Nrf2, Keap1, oxidative
stress (estresse oxidativo) e antioxidant (antioxidante), utilizando os termos AND e
OR. Os desfechos de interesse considerados foram primordialmente parâmetros
moleculares envolvidos na via do Nrf2, mas também se estendeu aos relacionados
com o estresse oxidativo e a inflamação, quando passíveis de vínculo à via de
sinalização desse fator de transcrição. Ademais, embora um trabalho não tenha
avaliado tais parâmetros, foi incluído na revisão de forma independente por ter sido
considerado relevante, uma vez que os desfechos analisados foram relacionados ao
estado oxidativo. Não foram incluídos estudos realizados e não publicados,
dissertações e teses, tampouco trabalhos não disponibilizados na íntegra.
18
4. RESULTADOS
Diversos estudos clínicos vêm sendo desenvolvidos recentemente para avaliar
o potencial antioxidante do SFN. Quinze artigos foram selecionados de acordo com a
combinação dos descritores e filtros supracitados. O ano de publicação variou de 2007
a 2016, sendo a maioria de 2014 e 2016. A média amostral foi de 57,4 sujeitos de
pesquisa (variou de 10 a 267) e o tempo médio de intervenção de 30,1 dias (variou de
1 a 126 dias). O tipo de intervenção predominante foram os brotos de brócolis,
utilizados em homogeneizados (26,7%); bebidas (20%, um dos estudos também
empregou na formulação de enxaguante bucal), cápsulas de SFN (20%), cápsulas de
GRN (6,7%), formulação tópica (6,7%), pó (6,7%) e consumidos inteiros (13,2%).
Cinco estudos utilizaram BroccoSprouts®, que são brotos de brócolis com níveis
significativos de SFN, desenvolvidos por cientistas da Johns Hopkins University
School of Medicine e comercializados nos mercados dos Estados Unidos. Quatro
estudos não determinaram a quantidade de GRN ou SFN presente em cada dose. O
espaço amostral constituiu de indivíduos saudáveis, fumantes ou não, com doenças
respiratórias, doença falciforme, esteatose hepática, infecção gástrica por H. pylori,
diabetes tipo 2, autismo ou sujeitos a um maior risco de desenvolvimento de câncer.
Sete trabalhos estabeleceram restrições em relação ao consumo de alimentos ricos
em isotiocianatos, um estudo excluiu aqueles que utilizavam suplementos
antioxidantes, enquanto que 2 pesquisas não determinaram nenhum tipo de limitação
e 5 não informaram. Dos 15 estudos, apenas 2 empregaram brotos de brócolis in
natura e 6 não informaram a forma de processamento. Três trabalhos adicionaram
mirosinase na preparação da amostra em estudo, enquanto que 5 não o fizeram, e 7
não informaram. Os resultados encontrados estão sintetizados na Tabela 1 (Anexos).
Um estudo clínico de Fase I, aberto, de escalonamento de dose de
homogeneizado de brotos de brócolis contendo 50 g de BroccoSprouts® foi realizado
em indivíduos com doença falciforme, cuja patologia inclui a redução da capacidade
oxidativa, a qual pode estar relacionada com a desregulação do Nrf2. Sugeriu-se que
esse composto possa prover benefícios terapêuticos para esses pacientes ao
restaurar o estado oxidativo e reativar a expressão de hemoglobina fetal, a qual é
predominante no período fetal e, em adultos normais, representa menos de 1% das
hemoglobinas totais, com porcentagem média de 0,4% e é capaz de inibir a
deformação dos eritrócitos, contribuindo para a redução da gravidade da doença (DE
19
CASSIA MOUSINHO-RIBEIRO et al., 2008). O primeiro desfecho do estudo foi
determinar a segurança e a tolerabilidade; o segundo, analisar a alteração de
marcadores de resposta fisiológica indicativos da ativação do Nrf2.
Dez participantes foram tratados em 3 níveis de dose, de modo que 5 foram
randomizados para cada uma (50 g, 100 g e 150 g), todas administradas 1 vez ao dia,
durante 21 dias. Cinco participantes foram alocados para mais de um braço. A
intervenção foi bem tolerada e, os poucos eventos adversos ocorridos, não foram
relacionados ao seu consumo. Houve aumento no nível plasmático do mRNA de HO-
1 (p=0,02), bem como uma tendência de elevação do mRNA de HBG1 (subunidade
da hemoglobina fetal) (p=0,10), contudo sem alterações significativas da hemoglobina
fetal e de NQO1. O estudo concluiu que o homogeneizado de brotos de brócolis, em
doses adequadas, é seguro para pacientes com doença falciforme e pode induzir
alterações ao nível da expressão gênica (DOSS et al., 2016).
Em um estudo clínico randomizado, controlado por placebo, duplo cego, 52
homens japoneses portadores de esteatose hepática receberam uma vez ao dia
cápsulas de extrato de brotos de brócolis de 1 dia de germinação contendo 30 mg de
GRN (aproximadamente 69 µmol) (n=24) ou placebo (n=28), durante 2 meses.
Marcadores da função hepática, como os níveis séricos de aspartato e alanina
aminotransferase (AST e ALT, respectivamente) e γ-glutamil transpeptidase (γ-GTP),
bem como a concentração urinária de 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), um
marcador de estresse oxidativo, foram comparados antes e depois da intervenção. A
suplementação com GRN diminuiu significativamente os níveis de ALT (-10,7%) e de
γ-GTP (-8,9%), bem como de 8-OHdG (-20%), enquanto que não houveram
diferenças significativas no grupo que recebeu placebo (-4,3% no valor de ALT e -
1,1% para γ-GTP). Além disso, a redução da 8-OHdG urinária foi correlacionada
significativamente com a diminuição dos níveis de ALT e γ-GTP no grupo que recebeu
a GRN. O estudo concluiu que a suplementação com extrato de brotos de brócolis
contendo GRN parece ter alta efetividade para melhorar a função hepática através da
redução do estresse oxidativo (KIKUCHI et al., 2015).
Uma vez que o estresse oxidativo é um fator importante na fisiopatologia da
asma e parece ser o mecanismo principal pelo qual poluentes oxidantes medeiam
processos inflamatórios, um estudo clínico de escalonamento de dose, simples-cego,
controlado por placebo foi conduzido para investigar os efeitos da intervenção com
SFN uma vez ao dia durante 3 dias na expressão das enzimas de Fase II glutationa-
20
s-transferase M1 (GSTM1), glutationa-s-transferase P1 (GSTP1), NQO1 e HO-1 nas
vias aéreas superiores de 57 participantes. Empregou-se um escalonamento de dose
de homogeneizado de brotos de brócolis BroccoSprouts® contendo 0,283 µmol de
SFN por mL (25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 e 200 g) para monitorar a tolerabilidade e
a toxicidade, de modo que 5 participantes completaram cada nível de dose antes que
fossem recrutados novos indivíduos para o próximo nível. Cada sujeito de pesquisa
recebeu apenas um regime de dose para evitar potenciais interferências de doses
anteriores. Uma vez estabelecido a segurança e a tolerabilidade, novos participantes
foram recrutados para a avaliação dose-resposta (125, 150, 175 e 200 g). Cinco
participantes receberam 200 g de homogeneizado de brotos de alfafa como placebo,
visto que são similares em aparência e textura a brotos de brócolis, mas não
apresentam quantidades significativas de SFN, tampouco de outros glicosinolatos ou
isotiocianatos. Todos os participantes toleraram as doses de SFN sem apresentar
eventos adversos significativos (5 sujeitos apresentaram eventos leves, dos quais 4
foram gastrointestinais). Os valores séricos de SFN (0,0115-0,0121 nmol) revelaram
que este composto é biodisponível. O aumento na expressão das enzimas de Fase II
nas células de lavagem nasal foi significativo em doses maiores que 100 g (51 µmol
de SFN) e ocorreu de forma dose-dependente, sendo que a indução máxima foi
observada na dose mais elevada, de 200 g (102 µmol de SFN) (p ≤ 0,004). Houve
aumento significativo para todas as enzimas de Fase II analisadas, conferindo
consistência à ação indutora do SFN sobre o Nrf2, e uma forte correlação positiva foi
evidenciada para as enzimas GSTP1 (101%) e NQO1 (199%). O estudo concluiu que
a suplementação com SFN é segura e eficaz na indução da expressão de enzimas de
Fase II na mucosa das vias aéreas superiores, demonstrando seu potencial
antioxidante como estratégia para reduzir os efeitos inflamatórios do estresse
oxidativo (RIEDL, SAXON & DIAZ-SANCHEZ, 2009).
Um outro estudo clínico, pré-pós experimental foi realizado para determinar se
a administração de extrato de brotos de brócolis, contendo SFN, pode contribuir para
o controle de alergias do sistema respiratório e asma após exposição a uma
suspensão aquosa contendo 300 µg de partículas de escape de diesel (equivalente a
40 horas de exposição a poluentes do ar nas rodovias de Los Angeles). A fase de
screening selecionou 29 indivíduos saudáveis, não-fumantes, positivos para
alérgenos de gatos e responsivos à suspensão de diesel (>10.000 leucócitos/mL em
5 mL de fluido de lavagem nasal coletado após 24 horas da exposição). Os indivíduos
21
foram expostos novamente às partículas de diesel na fase controle e, após um período
de whasout de quatro semanas, iniciaram a fase intervencionista com 100 µmol de
SFN durante 4 dias e verificação da resposta inflamatória nasal (níveis de leucócitos).
Além disso, os participantes foram submetidos à genotipagem para identificar a
presença de mutação nula da glutationa S-transferase M1 (GSTM1), a qual pode
predispor os indivíduos a processos alérgicos, em função da maior indução de
Imunoglobulina E (IgE), bem como do genótipo GSTP1 Ile/Ile105, que contribui para
maiores níveis de liberação de histamina mediante exposição a poluentes. A média
de leucócitos aumentou 66% na fase de screening e 85% na fase controle após 24
horas de exposição à suspensão de partículas de diesel, enquanto que diminuiu 54%
após a intervenção (p<0,01 em 6 horas e p<0,001 em 24 horas). Não houve diferença
significativa entre a resposta à administração do extrato de brócolis e a presença de
polimorfismos em GSTM1 e GSTP1 Ile/Ile105 (HEBER et al., 2014).
Ainda abordando os benefícios do SFN nas vias aéreas, um terceiro estudo
clínico, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo avaliou o efeito de uma dose
diária de 200 g de homogeneizado de brotos de brócolis contendo 111 g de
BroccoSprouts® durante 4 dias na resposta nasal ao vírus atenuado da Influenza em
16 indivíduos fumantes, os quais são mais suscetíveis a essa infecção, e em 35 não-
fumantes. Amostras seriadas de fluido de lavagem nasal e de biópsia de epitélio nasal
foram coletadas para avaliar as citocinas nasais, a replicação viral e a expressão de
enzimas dependentes de Nrf2, após a aplicação da vacina intranasal do vírus
atenuado da influenza. Verificou-se uma redução significativa das respostas da
interleucina 6 (IL-6) (p=0,03) e da quantidade viral (p=0,01), bem como um aumento
significativo da NQO1 (p=0,04) nos fumantes tratados com o homogeneizado de
brotos de brócolis em comparação ao grupo que recebeu placebo. Uma tendência
similar de redução da quantidade de vírus e de elevação de NQO1 foram observadas
em não-fumantes tratados, embora não tenham atingido significância estatística
(NOAH et al., 2014).
Em contrapartida, outros 3 trabalhos não encontraram resultados favoráveis à
intervenção com SFN nas vias aéreas.
Um dos estudos, randomizado, controlado por placebo e duplo-cego foi
conduzido com 40 indivíduos asmáticos para determinar se a ingestão de brotos de
brócolis inteiros por 3 dias é capaz de melhorar a inflamação e os parâmetros
fisiológicos das vias aéreas, bem como o estresse oxidativo em portadores dessa
22
doença. Cem gramas de brotos de brócolis com 11 dias da germinação ou de alfafa
(placebo) foram consumidos em sanduiches uma vez ao dia. Não se observou
redução dos níveis de óxido nítrico exalado, estresse oxidativo e marcadores
inflamatórios, tampouco houve indução de genes antioxidantes alvos do Nrf2 (HO-1,
NQO1, subunidade catalítica da glutamato cisteína ligase – GCLc – e subunidade
modificadora da glutamato cisteína ligase – GCLm) nas células epiteliais nasais e
células mononucleares do sangue periférico, embora a concentração sérica de SFN
tenha aumentado acentuadamente (SUDINI et al., 2016).
A capacidade antioxidante do SFN também não se mostrou favorável em um
estudo clínico de fase II, randomizado, controlado por placebo, paralelo, duplo-cego
conduzido em indivíduos com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). Oitenta
e nove participantes foram randomizados 1:1:1 para receber doses diárias de
cápsulas de placebo ou de 4,4 mg (25 µmols) ou 26,6 mg (150 µmols) de SFN extraído
de extrato de brotos de brócolis, durante 4 semanas. Avaliou-se as alterações na
expressão de genes alvos do Nrf2 (NQO1, HO-1, AKR1C1 e AKR1C3) em macrófagos
alveolares e células epiteliais brônquicas, bem como mensurou-se o estresse
oxidativo, a inflamação das vias aéreas e a função pulmonar. Ocorreram alterações
de 0,79 a 1,45 na expressão de genes alvos do Nrf2, porém não houve um padrão
consistente entre os 3 grupos, tampouco variações significativas. Além disso, não
houveram diferenças entre os grupos com relação à inflamação das vias aéreas e à
função pulmonar. Contudo, a absorção do SFN de forma dose-dependente foi
confirmada através da detecção de seus metabólitos (ditiocarbamatos) no plasma
(WISE et al., 2016).
Desfechos promissores para as vias aéreas também não foram obtidos em um
estudo clínico randomizado, controlado por placebo, crossover, conduzido com 15
voluntários saudáveis não-fumantes e não-atópicos para verificar se a suplementação
com homogeneizado de brotos de brócolis contendo SFN é uma intervenção efetiva
contra a inflamação neutrofílica das vias aéreas induzida pela inalação de ozônio (O3).
Os participantes receberam ou 200 g de homogeneizado de brotos de brócolis
(equivalentes a 111 g de BroccoSprouts®) ou 200 g de brotos de alfafa como placebo
uma vez ao dia, durante 3 dias, e, após um período mínimo de washout de 14 dias, o
tratamento oposto durante a fase de crossover. No terceiro dia de cada intervenção,
os participantes foram expostos ao ozônio (0,4 ppm) por 2 horas enquanto realizavam
4 sessões de 15 minutos de exercício moderado intermitente em uma esteira,
23
intercalados por 15 minutos de descanso. Mediu-se as citocinas e a contagem de
células no escarro antes da intervenção e 4 horas após a exposição ao O3, bem como
os níveis de SFN e seus conjugados no sangue. Além disso, também se verificou a
expressão de genes regulados pelo Nrf2 (HO-1, NQO1, GSTM-1) no sangue e nas
células epiteliais nasais. O tratamento com homogeneizado de brotos de brócolis
aumentou significativamente os níveis de SFN (p=0,001) e de seus metabólitos N-
acetil-L-cisteína-SFN (p=0,002) e glutationa-SFN (p<0,001) em comparação ao
placebo. A exposição ao O₃ aumentou significativamente a quantidade de neutrófilos
no escarro de ambos os grupos, embora não se tenha observado diferença
significativa entre eles, tampouco na expressão do Nrf2 e dos genes de defesa
antioxidante de fase II (DURAN et al., 2016).
A magnitude e a duração da farmacodinâmica da dose diária de 600 µmol de
GRN e 40 µmol de SFN presentes em uma bebida preparada à base de brotos de
brócolis BroccoSprouts® de 3 dias de germinação foi avaliada durante 12 semanas
de intervenção em um estudo clínico randomizado controlado por placebo com 291
participantes recrutados em uma área rural da localidade chinesa de He-He Township,
em Qidong, caracterizada pela exposição a níveis excessivos de poluentes
atmosféricos, os quais tem sido associados a um maior risco de câncer de pulmão e
doenças cardiopulmonares. A excreção urinária de ácidos mercaptúricos de três
poluentes tóxicos do ar foi mensurada antes e durante a intervenção, verificando-se
que a ingestão da bebida com brotos de brócolis aumentou significativamente (p≤0,01)
a detoxificação do benzeno (61%) e da acroleína (23%), mas não do crotonaldeído
em comparação ao consumo do placebo. Sugere-se assim, que brotos de brócolis
podem prover uma resposta protetora sustentável, sendo uma forma econômica de
atenuar os riscos de alguns poluentes do ar para a saúde a longo prazo. Além disso,
a excreção de conjugados do benzeno foi maior nos indivíduos positivos para o alelo
GSTT1 (glutationa S-transferase T1 – um importante modificador do metabolismo do
benzeno) em ambos os braços, iniciando de uma linha de base superior no grupo
tratado, refletindo o efeito da intervenção (EGNER et al., 2014).
O potencial do SFN como alterativa terapêutica contra carcinógenos indutores
do câncer oral foi investigado em um estudo clínico piloto de braço único, crossover
com 10 voluntários saudáveis que avaliou a biodisponibilidade e a farmacodinâmica
de 3 diferentes tratamentos derivados de extrato de brotos de brócolis, de acordo com
os níveis urinários de SFN e de seu metabólito N-acetilcisteína-SFN, bem como com
24
a expressão de NQO1 no epitélio oral. Os participantes foram submetidos a 5 dias de
tratamento para cada intervenção (Regime 1: bebida contendo 600 μmol de GRN;
Regime 2: bebida contendo 150 μmol de SFN; Regime 3: enxaguante bucal contendo
150 μmol de SFN), com um mínimo de 3 dias de washout entre cada uma. A ingestão
de bebida rica em SFN apresentou a melhor biodisponibilidade (p=0,0013), enquanto
que foi insignificante para o enxaguante bucal. Uma maior variabilidade entre os níveis
urinários de SFN e seus metabólitos foi observada no consumo da bebida rica em
GRN. A expressão do NQO1 aumentou em 2 vezes ou mais em 6 dos 9 participantes
que ingeriram bebida contendo GRN; 3 dos 6 que consumiram bebida contendo SFN;
e 3 dos 9 indivíduos expostos ao enxaguante bucal, rico em SFN. Além disso, o nível
de mRNA de NQO1 mudou significativamente em função do tipo de tratamento
(p=0014) e dia da intervenção (p=0,0029), com um aumento significativo no dia 5 do
Regime 1 (p<0,0001) (BAUMAN et al., 2016).
Visando o desenvolvimento de estratégias para a proteção contra o câncer de
pele desencadeado pela luz UV, o potencial do SFN de induzir enzimas de Fase II
também foi investigado em um estudo de escalonamento de dose, controlado por
placebo, matched pair que analisou a segurança e a eficácia da aplicação tópica de
extrato de brotos de brócolis em doses simples ou múltiplas em 17 voluntários. A
segurança foi analisada mediante aplicação de no máximo 2 doses de SFN por
participante (no centro de um círculo de 1 cm de diâmetro desenhado em regiões
diferentes do antebraço): 0,534 e 5,34 nmol (n=4); 10,7 e 21,4 nmol (n=2); 42,7 e 85,4
nmol (n=2); 170 e 340 nmol (n=2); e 681 nmol (n=2). Nenhum efeito adverso
significativo foi verificado, exceto em um participante que recebeu a dose mais
elevada (681 nmol), o qual desenvolveu eritema plano transitório de 3 mm. A eficácia
foi mensurada mediante a aplicação de doses únicas de 5, 40, 170 e 340 nmol; e de
doses tríplices de 150, 300, 450 e 600 nmol. Uma correlação fortemente significativa
entre a dose e a atividade enzimática de NQO1 foi observada em biópsias de punção
cutânea de 3 mm de espessura (p<0,0009). O tratamento desencadeou elevação
máxima de 1,5 vezes naqueles que receberam única aplicação de 170 nmol e 340
nmol, bem como de 4,5 vezes após aplicação de três doses de 450 nmol em intervalos
de 24 horas. As aplicações de doses únicas de 5 ou 40 nmol não resultaram em
alterações significativas e a magnitude da indução reduziu na dose cumulativa mais
elevada (600 nmol), sugerindo uma dose ótima, acima ou abaixo da qual pode-se
25
comprometer a eficácia. Tais resultados evidenciam a ação indutora do SFN na
resposta de enzimas de Fase II (DINKOVA-KOSTOVA et al., 2007).
A atividade antioxidante do SFN também tem sido investigada na infecção
gástrica por H. pylori. Um estudo clínico randomizado, duplo-cego, controlado por
placebo avaliou o efeito da intervenção com cápsulas de 250 mg de extrato de brotos
de brócolis contendo 1 mg de SFN durante 4 semanas na densidade da infecção e na
lesão da mucosa gástrica. Mediu-se a densidade da infecção através de teste de ureia
respiratória e de exame gastroscópico, que avalia a concentração de amônia no suco
gástrico (indivíduos infectados por H. pylori apresentam menores níveis de ureia e
concentrações maiores de amônia, a qual está relacionada diretamente com a
gravidade da gastrite). Além disso, também se investigou a quantidade na mucosa
gástrica de malondialdeído, um produto da peroxidação lipídica e, portanto, um
biomarcador de dano oxidativo, e da GSH reduzida, um biomarcador antioxidante. Os
participantes foram randomizados de forma duplo-cega em três grupos: 33 positivos
para H. pylori foram tratados com extrato de brotos de brócolis (Grupo A); 28 positivos
para H. pylori receberam placebo (Grupo B); e 28 negativos para H. pylori foram
submetidos à intervenção com extrato de brotos de brócolis (Grupo C). O tratamento
com extrato de brotos de brócolis não afetou significativamente os valores do teste de
ureia (p=0,634), tampouco as concentrações de amônia (p=0,505) em aspirados do
suco gástrico no Grupo A. A concentração de malondialdeído reduziu
significativamente nos Grupos A (p=0,006) e C (p<0,001), enquanto que a
concentração de GSH aumentou ligeiramente nesses dois grupos,
independentemente do perfil de infecção por H. pylori (p=0,332). Além disso,
observou-se que as concentrações basais de GSH nos 61 participantes H. pylori (+)
foram inferiores às dos 28 indivíduos H. pylori (-), embora essa diferença não tenha
sido significativa (p=0,526). O estudo concluiu que o extrato de brotos de brócolis não
diminui a densidade da infecção por H. pylori, mas que é capaz de reduzir a
peroxidação lipídica na mucosa gástrica e pode exercer ação citoprotetora na gastrite
induzida por essa bactéria (CHANG et al., 2015).
Um outro estudo clínico, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo foi
conduzido com 48 indivíduos infectados por H. pylori para avaliar o efeito gástrico do
consumo diário de 70 g de brotos de brócolis de 3 dias de germinação (contendo 420
µmol de GRN) durante 8 semanas, em comparação à mesma quantidade de brotos
de alfafa, utilizados como placebo. Para tanto, realizou-se um estudo preliminar com
26
alguns voluntários visando verificar se a dose planejada de 50 g de brotos de brócolis
seria capaz de aumentar a expressão de enzimas citoprotetoras de Fase II. A
expressão de HO-1 aumentou drasticamente (de 2 a 3 vezes) após 24 horas da
ingestão. Uma vez que o peso médio desses participantes era cerca de 40% inferior
ao dos indivíduos recrutados para o estudo duplo-cego, decidiu-se por aumentar a
dose para 70 g. A excreção urinária de ditiocarbamatos, metabólitos do SFN, foi
significativamente maior no grupo que ingeriu brotos de brócolis em comparação ao
grupo controle, nos quais os níveis permaneceram na linha de base. No grupo teste
também houve redução significativa nos valores de pepsinogênio (PG) I e II séricos
(p<0,05), indicadores de inflamação gástrica, bem como aumento significativo da
razão PGI/PGII (p<0,05), a qual é utilizada como indicativo robusto da diminuição da
inflamação (a secreção de ambos os tipos de pepsinogênio, sobretudo do PGII, é
estimulada quando há dano da mucosa gástrica, provocando uma redução da relação
PGI/PGII), com consequente retorno aos níveis basais após dois meses da
descontinuação. Além disso, as concentrações urinárias de ditiocarbamatos foram
altamente correlacionados com a magnitude de variação da razão PGI/PGII após 8
semanas de intervenção (p<0,01). Os níveis do antígeno de H. pylori nas fezes HpSA
(H. pylori stool antigen - indicador de infecção recente) e os valores do teste de ureia
respiratória (indicador de infecção instantânea e de gravidade da infecção) no braço
que recebeu brotos de brócolis reduziram significativamente durante a intervenção
(p<0,05) e retornaram para o valor basal 2 meses após a descontinuação (p<0,05).
Tais resultados estão em conformidade com os encontrados por Chang et al. e
sugerem que o tratamento com brotos de brócolis reduz a colonização de H. pylori,
mas não provê erradicação completa (YANAKA et al., 2009).
Uma vez que a diabetes tipo 2 está associada a um desequilíbrio oxidativo em
função do metabolismo anormal de glicose e lipídios, um estudo randomizado, duplo-
cego, controlado por placebo foi conduzido para investigar o efeito do consumo por 4
semanas de brócolis em pó (contendo aproximadamente 22,5 µmol de SFN/g) sobre
alguns parâmetros séricos de estresse oxidativo em pacientes com essa doença.
Analisou-se 63 participantes, os quais foram randomizados em três grupos: 21
ingeriram 10 g da amostra de brotos de brócolis, 22 consumiram 5 g e 22 receberam
placebo (pó de amido de milho corado com clorofila). Verificou-se uma diminuição de
9 e 5% nos níveis de malondialdeído (p=0,001) e lipoproteína de baixa densidade
oxidada (p=0,03), respectivamente, no grupo que consumiu 10 g/dia, bem como uma
27
redução de 14 e 9% no índice de estresse oxidativo (p=0,001) nos grupos que
ingeriram 10 g/dia e 5 g/dia, respectivamente. Além disso, a capacidade antioxidante
total aumentou em 16 e 10% nos braços tratados com 10 g/dia e 5 g/dia,
respectivamente (p=0,001). Nenhum efeito foi observado no status oxidante total
(BAHADORAN et al., 2011).
Por fim, identificou-se também um estudo que analisou a capacidade do SFN
em reverter anormalidades comportamentais do autismo que têm sido relacionadas
ao estresse oxidativo decorrente de capacidade oxidativa reduzida, síntese de
glutationa comprometida, peroxidação lipídica aumentada e neuroinflamação, embora
ainda não esteja claro se esses distúrbios são etiológicos ou manifestações
secundárias da doença. Para tanto, conduziu-se um estudo clínico randomizado,
controlado por placebo, duplo-cego com 40 homens jovens portadores de autismo
moderado a grave para avaliar o efeito de doses diárias de SFN no comportamento,
de acordo com 3 medidores comportamentais: Aberrant Behavior Checklist (ABC),
Social Responsiveness Scale (SRS) e Clinical Global Impression Improvement Scale
(CGI-I). Doses de 50 a 150 µmol (de acordo com o peso de cada participante) de SFN
proveniente de extrato de brotos de brócolis ou placebo foram administradas
diariamente durante 18 semanas. Mudanças comportamentais mínimas (<3,3%)
foram apresentadas pelo grupo que recebeu placebo, enquanto que aqueles que
consumiram SFN tiveram melhora substancial do comportamento: 34% para ABC
(p<0,001) e 17% para SRS (p=0,017). Para o avaliador CGI-I, um número significativo
de participantes que recebeu SFN mostrou melhora na interação social, no
comportamento anormal e na comunicação verbal (p=0,015-0,007). Após a
descontinuação do tratamento, os resultados totais de todas as escalas voltaram para
os valores basais (SINGH et al., 2014).
28
5. DISCUSSÃO
A revisão sistemática dos estudos encontrados permitiu analisar os dados
disponíveis a respeito do consumo de SFN, em diferentes formas e quantidades,
indicando resultados relevantes em relação aos parâmetros moleculares envolvidos
na via do fator de transcrição Nrf2 no trato respiratório (NOAH et al., 2014; RIEDL,
SAXON & DIAZ-SANCHEZ, 2009), em indivíduos portadores de doença falciforme
(DOSS et al., 2016) e com infecção gástrica por H. pylori (CHANG et al., 2015;
YANAKA et al., 2009), bem como seu potencial efeito protetor contra o risco de câncer
de pele induzido por luz UV (DINKOVA- KOSTOVA et al., 2007) e de câncer oral
(BAUMAN et al., 2016). Ademais, a ingestão de SFN revelou desfechos favoráveis
em relação a indicadores de estresse oxidativo em indivíduos com esteatose
hepática (KIKUCHI et al., 2015) e com diabetes tipo 2 (BAHADORAN et al., 2011),
assim como acerca de parâmetros inflamatórios no trato respiratório (HEBER et al.,
2014) e de detoxificação em sujeitos de pesquisa expostos a um maior risco de
desenvolvimento de câncer de pulmão (EGNER et al., 2014). Ainda, um estudo
verificou melhora comportamental em autistas (SINGH et al., 2014). Três estudos não
encontraram resultados significativos em seu protocolo de tratamento de indivíduos
asmáticos (SUDINI et al., 2016), portadores de DPOC (WISE et al., 2016) e contra a
inflamação neutrofílica das vias aéreas (DURAN et al., 2016).
O aumento da expressão de enzimas de Fase II no trato respiratório foi
verificado em 2 estudos (NOAH et al., 2014; RIEDL, SAXON & DIAZ-SANCHEZ,
2009), embora ainda seja incerto se essa elevação é suficiente para prevenir ou
reduzir o estresse oxidativo nas vias respiratórias, o qual está diretamente envolvido
na fisiopatologia de alergias, asma e infecções causadas pelo vírus Influenza.
Também permanece desconhecido se doses superiores levariam a aumentos
adicionais na expressão das enzimas de Fase II ou se a toxicidade seria limitante da
dose. O consumo de SFN, em uma dose semelhante às empregadas nos estudos
mencionados acima, também foi capaz de suprimir a resposta alérgica a partículas da
fuligem de diesel, ao reduzir a contagem de leucócitos nas células nasais (HEBER et
al., 2014). Um estudo in vivo evidenciou o importante papel do Nrf2 para manutenção
do equilíbrio oxidativo nas vias respiratórias ao utilizar camundongos knockout para
este fator de transcrição e observar uma maior susceptibilidade a respostas
respiratórias inflamatórias mediante exposição a partículas de diesel (LI et al., 2008).
29
Em contrapartida, 3 estudos clínicos, embora tenham constatado aumento nos níveis
circulantes de SFN, este não foi suficiente para resultar em efeito biológico e em
nenhuma mudança significativa nos parâmetros respiratórios analisados (DURAN et
al., 2016; SUDINI et al., 2016; WISE et al., 2016). Como o estresse oxidativo e a
inflamação são capazes de superexpressar a atividade do Nrf2, é possível que esta
via esteja comprometida em pacientes com DPOC e asma atópica, resultando em um
baseline de ativação mais elevado, o que explicaria a ausência de resposta à
intervenção com SFN nos estudos de Wise et al. e Sudini et al., respectivamente.
Dessa forma, pode-se supor que a dose e a duração da intervenção com SFN
precisem ser maiores na população portadora de doenças respiratórias para que os
níveis plasmáticos de SFN sejam biologicamente ativos e resultem em efeitos clínicos
semelhantes aos obtidos nos estudos conduzidos com indivíduos saudáveis (NOAH
et al., 2014; RIEDL, SAXON & DIAZ-SANCHEZ, 2009), bem como seria interessante
testar formulações inalatórias, as quais poderiam ser mais eficazes do que doses
orais.
Além da diferença de resposta biológica entre indivíduos doentes e saudáveis, outras
possíveis explicações para esses resultados contraditórios incluem a variedade de
dosagem, tanto em relação à forma quanto à dose, o tempo de tratamento e o método
de detecção dos parâmetros moleculares, dificultando a comparação entre os
estudos. Dessa forma, devido às diferenças metodológicas dos estudos e ao fato de
que o estresse oxidativo parece ser o mecanismo principal pelo qual poluentes
oxidantes medeiam processos inflamatórios respiratórios (BOWLER & CRAPO, 2002),
pode-se considerar relevantes os achados em relação ao trato respiratório e a
abordagem antioxidante nutracêutica como uma alternativa promissora de baixo custo
para reduzir o impacto de distúrbios respiratórios.
Evidências epidemiológicas consistentes associam o consumo de vegetais
crucíferos com o menor risco para o desenvolvimento de câncer (HU et al., 2015; TSE
& ESLICK, 2014; WU et al., 2013), embora hajam poucos estudos clínicos
intervencionistas relacionados à esta doença. Dois trabalhos mais expressivos
avaliaram o efeito do SFN na infecção gástrica por H. pylori (CHANG et al., 2015;
YANAKA et al., 2009), a qual afeta aproximadamente 50% da população adulta no
mundo todo e, além de estar associada a gastrites e úlceras pépticas, pode levar ao
câncer gástrico. Uma vez que seu tratamento convencional, o qual consiste em uma
terapia tripla de associação de 2 tipos de antibióticos com um inibidor de bomba de
30
prótons, tem se tornado menos efetivo em função da crescente resistência bacteriana
(SIDDIQUE et al., 2018), esses 2 estudos abordam o SFN como uma possível
alternativa terapêutica. Os resultados encontrados evidenciam a ação citoprotetora do
SFN e indicam que o seu consumo pode reduzir a colonização de H. pylori, sem, no
entanto, prover erradicação completa. Tal infecção gera uma variedade de espécies
reativas de oxigênio que danificam a mucosa e o consumo de SFN pode contribuir
para o reestabelecimento do equilíbrio oxidativo nessa região, através do aumento de
enzimas antioxidantes alvos do Nrf2 nas células da mucosa gástrica. Entretanto,
estudos com tamanho amostral maior, com tempos de intervenção mais longos, bem
como que utilizem o SFN como uma quarta terapia, são necessários para obtenção
de melhores resultados. Ademais, Yanaka et al. conduziu em paralelo testes com SFN
em camundongos infectados por H. pylori e constatou redução da colonização
bacteriana e diminuição da inflamação, o que por sua vez não ocorreu nos animais
cujos genes do Nrf2 foram removidos, evidenciando fortemente a importância de
proteínas antioxidantes dependentes do Nrf2 para o efeito terapêutico do SFN
(YANAKA et al., 2009).
Ainda com relação à avaliação do potencial efeito quimioprotetor do SFN, 3 estudos
clínicos foram conduzidos (EGNER et al., 2014; BAUMAN et al., 2016; DINKOVA-
KOSTOVA et al., 2007). Bauman et al. e Dinkova-Kostova et al. constataram
aumentos significativos na expressão de NQO1 no epitélio oral e na pele de
voluntários saudáveis, respectivamente, provendo evidências da ação indutora do
SFN sobre a resposta de enzimas de Fase II. Egner et al. observaram que a ingestão
de bebida a base de brotos de brócolis contribuiu significativamente para a
detoxificação de poluentes tóxicos do ar, permitindo considerar o SFN como um
potente protetor contra o risco de desenvolvimento de câncer pulmonar. Esse
resultado corrobora com os achados em camundongos knockout para Nrf2, nos quais
o efeito quimiopreventivo do SFN foi neutralizado (apresentaram exacerbação da
toxicidade aguda e carcinogenicidade de metais e moléculas orgânicas absorvidas em
partículas de poluição do ar), evidenciando que a via de sinalização citoprotetora do
Nrf2 é característica do modo de ação do SFN (TOYAMA et al., 2011). O efeito
observado por Egner et al. persistiu pelas 12 semanas de intervenção e também foi
acompanhado pela detecção do SFN e seus metabólitos na urina, indicando sua
rápida absorção e metabolização.
31
Bauman et al. verificaram que a biodisponibilidade do SFN foi superior para a
ingestão de SFN versus GRN (BAUMAN et al., 2016), o que está condizente com os
achados de estudos prévios (EGNER et al., 2011; FAHEY et al., 2012), refletindo a
variabilidade individual da flora intestinal responsável pela conversão de GRN em
SFN. Nesse mesmo sentido, Egner et al. observaram que a biodisponibilidade do SFN
parece aumentar após 84 dias de intervenção, o que talvez ocorra em função de uma
possível alteração da microbiota do intestino (EGNER et al., 2014).
A diabetes tipo 2 é uma doença gradativa e demanda um número crescente de
agentes hipoglicemiantes orais, sendo particularmente importante a investigação de
estratégias terapêuticas auxiliares para o seu controle (PETZNICK, 2013). A melhora
do estado oxidativo em diabéticos que consumiram brotos de brócolis (BAHADORAN
et al., 2011) sugere o SFN como um possível tratamento complementar para o controle
dessa doença e prevenção de suas complicações a longo prazo, as quais estão
associadas ao estresse oxidativo desencadeado pelo metabolismo anormal da glicose
e de lipídios. Todavia, estudos com períodos de intervenção mais longos e maior leque
de doses são necessários para confirmar os efeitos do SFN. Esse resultado corrobora
com os achados em modelos animais que demonstraram atenuação dos sintomas de
desordem metabólica característicos da diabetes após o tratamento de 2 semanas
com SFN. Tais resultados, no entanto, não foram verificados em camundongos Nrf2
(-/-), indicando que o SFN atua especificamente através da ativação da via do Nrf2
(ZHENG et al., 2011).
Em relação ao estudo que abordou a doença falciforme, embora a maioria dos
resultados da expressão de mRNA alvos do Nrf2 não tenham sido estatiscamente
significativos, juntos eles sugerem que a ingestão de homogeneizado de brotos de
brócolis contendo SFN apresenta uma notável tendência de indução de genes
dependentes do Nrf2 nas células sanguíneas (DOSS et al., 2016). Esses resultados
devem ser considerados preliminares e interpretados com cautela, em função do
pequeno tamanho amostral, bem como de outras limitações do estudo, como a
alocação de um mesmo sujeito de pesquisa para mais de um braço e a utilização por
alguns participantes de hidroxiuréia, a qual induz a síntese de hemoglobina fetal,
atenuando a gravidade da doença.
Comenta-se ainda a melhora de marcadores da função hepática e de estresse
oxidativo em indivíduos portadores de esteatose hepática, embora tenham sido
32
avaliados apenas em homens japoneses, deixando em aberto a efetividade em
mulheres (KIKUCHI et al., 2015).
Ademais, o SFN também revelou ser benéfico na melhora comportamental de
indivíduos autistas, embora ainda não esteja claro se os distúrbios oxidativos
característicos desses pacientes são etiológicos ou manifestações secundárias da
doença (SINGH et al., 2014). Assim, em função da heterogeneidade considerável da
etiologia, patogênese e sintomatologia do autismo, a generalização desses achados
necessita confirmação.
Tanto a intervenção com cápsulas de SFN ou GRN, extratos ou
homogeneizados de brotos de brócolis, quanto com o consumo in natura resultaram
em achados favoráveis em relação ao status antioxidante, muito embora tenha sido
discutido anteriormente que o consumo de vegetais crucíferos levemente cozidos seja
preferível em comparação à suplementação com GRN ou à forma crua, uma vez que
provê mirosinase intrínseca do vegetal com atividade preservada, bem como com o
inibidor ESP inativo.
Limitações importantes da consistência dos resultados encontrados incluem o
acervo insuficiente de estudos que abordem os mesmos temas ou que avaliem
parâmetros e desfechos semelhantes, bem como a variabilidade das intervenções,
tempos de seguimento e tamanho amostral. Além disso, nem todos os estudos
analisados determinaram a quantidade de GRN ou SFN, tampouco informaram quanto
à adição de mirosinase, à inativação de ESP e ao tipo de processamento empregado,
dificultando também uma conclusão sobre a dose recomendada. De qualquer forma,
os desfechos identificados são de potencial interesse e maiores investigações são
necessárias.
33
6. CONCLUSÃO
A capacidade do sulforafano de modular a expressão gênica da via
Keap1/Nrf2/ARE, aumentando a resposta citoprotetora endógena e contribuindo para
o equilíbrio oxidativo do organismo humano, constitui uma importante vertente da
nutrigenômica e pode ser considerada uma estratégia terapêutica alternativa de baixo
custo coadjuvante no tratamento e prevenção de doenças crônicas.
Há evidências de potenciais benefícios do consumo de SFN e/ou de seu
precursor GRN sobre parâmetros moleculares antioxidantes e envolvidos na via do
fator de transcrição Nrf2 em humanos, muito embora ainda sejam limitadas.
Um maior número de estudos clínicos intervencionistas que abordem temas e
desfechos mais homogêneos, bem como que empreguem intervenções e tempos de
seguimento mais semelhantes é necessário para uma avaliação mais consistente, de
modo que viabilizem conclusões mais robustas e com maior embasamento científico.
34
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42
8. ANEXOS
Tabela 1: Artigos incluídos na revisão e principais resultados.
Autores e ano
Doença Tipo de estudo e amostra
Objetivo Intervenção e Duração do tratamento
Resultados
Evitou-se ingerir outras fontes de SFN ou antioxidan-
tes
Processa-mento/
Presença de mirosi-
nase
DOSS et al., 2016
Doença Falcifor-
me
EC de Fase I, aberto, de escalona-mento de dose com indivíduos portadores de doença falciforme
(n=10)
Determinar a segurança e a
tolerabilidade de HBB contendo SFN.
Analisar a alteração de marcadores de resposta fisiológica
indicativos da ativação do Nrf2.
HBB (50 g de BroccoSprouts®) contendo SFN:
50 g (n=5); 100 g (n=5); 150 g (n=5);
consumido com fruta.
1 vez ao dia.
21 dias.
Aumento de HO-1 (p=0,02); tendência de elevação de HBG1 (p=0,10); sem
alterações significativas da hemoglobina fetal e de NQO1.
Vitaminas antioxidantes e
vegetais crucíferos
foram evitados 2 dias antes do
início da intervenção até
completar o período de whasout.
Armazena-mento do
HBB a -20 .
Consumiu-se após
descongela-mento,
evitando aqueci-mento.
Mirosinase não foi
adicionada.
KIKUCHI et al., 2015
Esteatose Hepática
ECR duplo cego,
controlado por placebo
com indivíduos portadores
de esteatose hepática (n=52)
Comparar os níveis séricos de AST, ALT e
γ-GTP e a concentração urinária de 8-OHdG antes e
após a suplementação de cápsulas contendo GRN ou placebo.
Cápsulas de GRN extraída de brotos de brócolis com 1 dia da
germinação: 30 mg
(aproximadamente 69 µmol de GRN) (n=24).
Placebo (n=28).
1 vez ao dia.
2 meses.
Diminuição significativa dos níveis séricos de ALT (-10,7%) e de γ-GTP
(-8,9%) e da concentração urinária de 8-OHdG (-20%) no grupo teste.
A redução de 8-OHdG foi correlacionada significativamente com
a diminuição dos níveis de ALT e γ-GTP no grupo que recebeu GRN.
Não informado.
95 por 30 minutos.
Mirosinase não foi
adicionada.
43
RIEDL, SAXON e DIAZ-SAN-
CHEZ, 2009
Asma/ Vias
aéreas superio-
res
EC de escalona-mento de
dose, simples-
cego, controlado por placebo
com voluntários saudáveis
não-fumantes
(n=57)
Investigar a segurança, a eficácia e a dose-resposta do SFN na expressão
das enzimas de Fase II GSTM1, GSTP1, NQO1 e HO-1 nas
vias aéreas superiores (coleta de amostras de lavagem nasal e de sangue).
HBB (preparado a partir de
BroccoSprouts®) contendo 0,283 µmol
de SFN por mL: 25 g (n=5); 50 g
(n=5); 75 g (n=4); 100 g (n=4); 125 g (n=8); 150 g (n=10); 175 g (n=7); 200 g (n=9).
Placebo (n=5).
1 vez ao dia.
3 dias.
Ausência de EA significativos. Aumento significativo na expressão
das enzimas de Fase II nas células de lavagem nasal em doses maiores que
100 g (51 µmol de SFN), de forma dose-dependente, com indução
máxima observada na dose mais elevada, de 200 g (102 µmol de SFN)
(p ≤ 0,004). Aparente correlação linear para todas as enzimas de Fase II analisadas e uma forte correlação positiva foi evidenciada para GSTP1
(101%) e NQO1 (199%).
Participantes foram
instruídos a evitar alimentos contendo SFN.
Proibiu-se o uso de
medicamentos moduladores imunológicos.
37 por 2 horas.
Adição de excesso de mirosinase
(para converter
ao máximo a GRN em
SFN). Armazena-mento do
HBB a -20 e
consumo a 4 .
HEBER et al., 2014
Asma/ Alergias respira-tórias
EC pré-pós experimental
com indivíduos saudáveis,
não-fumantes positivos
para alérgenos de
gatos e responsivos às partículas
de diesel (n=29)
Determinar se a administração de EBB
contendo SFN é capaz de suprimir a
resposta inflamatória nasal após exposição
a 300 µg de suspenção aquosa de partículas de diesel.
EBB: 1,25 g (100 µmol de SFN)
ingerido com suco.
1 vez ao dia.
4 dias.
A média de leucócitos aumentou 66% na fase de screening e 85% na fase controle após 24 horas de exposição à suspensão de partículas de diesel.
A contagem de leucócitos após o tratamento foi significativamente
inferior (54%) quando comparada com as fases de screening e controle (p<0,01 em 6 horas e p<0,001 em 24
horas). Não houve diferença significativa entre a resposta à
administração do extrato de brócolis e a presença de polimorfismos em
GSTM1 e GSTP1 Ile/Ile105.
Evitou-se alimentos contendo
isotiocianatos 3 dias antes do
início do tratamento e
durante o estudo.
Proibiu-se o uso de anti-alérgicos.
Extração do SFN em
água fervente.
44
NOAH et al., 2014
Vias aéreas supe-riores/
Infecção por
Influenza
ECR duplo-cego,
controlado por placebo
com indivíduos fumantes
(n=16) e não-
fumantes (n=35)
Avaliar o efeito de HBB nas citocinas
nasais, replicação do vírus da Influenza e
expressão de enzimas dependentes do Nrf2.
HBB: 200 g (111 g de
BroccoSprouts®: 6 fumantes e 15 não-
fumantes. Placebo (200 g de
HBA): 10 fumantes e 20 não-fumantes.
4 dias.
Redução significativa das respostas a IL-6 (p=0,03) e da carga viral
(p=0,01); aumento significativo de NQO1 nos fumantes tratados; uma
tendência similar de redução da quantidade de vírus não atingiu significância estatística em não-
fumantes do grupo teste.
Evitou-se a ingestão de
vegetais crucíferos e o uso de anti-
inflamatórios. Exclui-se
aqueles com histórico de
vacinas contra a influenza ou
de infecção por influenza nos
últimos 12 meses.
37 por 2 horas.
Adição de excesso de mirosinase
(para converter
ao máximo a GRN em
SFN). Armazena-mento do
HBB a -20 ).
SUDINI et al., 2016
Asma/ vias
aéreas
ECR duplo-cego,
controlado por placebo
com indivíduos asmáticos
(n=40)
Determinar se a ingestão de brotos de
brócolis inteiros melhora a inflamação
e parâmetros fisiológicos das vias aéreas, bem como o estresse oxidativo.
Brotos de brócolis inteiros com 11 dias
da germinação: 100 g (n=20).
Placebo (100g de brotos de alfafa)
(n=20). Consumidos em
sanduíches.
1 vez ao dia.
3 dias.
Níveis de óxido nítrico exalado, estresse oxidativo e marcadores inflamatórios não reduziram; não
houve indução de genes antioxidantes alvos do Nrf2 (HO-1, NQO1, GCLc e GCLm) nas células
epiteliais nasais e células mononucleares do sangue periférico;
aumento acentuado das concentrações séricas de SFN.
Não houve restrição
alimentar e medicamento-sa. Aplicou-se questionários para coleta de informações
quanto à ingestão de
vegetais crucíferos.
Não houve aquecimen-
to. Instrução
para mastigação
por completo
(para garantir a conversão
de GRN em SFN).
45
WISE et al., 2016
DPOC
EC de fase II,
randomiza-do, paralelo, duplo-cego, controlado por placebo
com indivíduos portadores de DPOC
(n=89)
Determinar se a administração de SFN é capaz de alterar a expressão gênica de alvos do Nrf2 (NQO1,
HO-1, AKR1C1 e AKR1C3) nos macrófagos
alveolares e células epiteliais brônquicas,
bem como mensurar o estresse oxidativo, a inflamação das vias aéreas e a função
pulmonar.
Cápsulas de SFN extraído de brotos de
brócolis: 4,4 mg (25 µmols de
SFN (n=28); 26,6 mg (150 µmols
de SNF (n=28). Placebo
(microcelulose) (n=29).
1 vez ao dia.
4 semanas.
Alterações na expressão de genes alvos do Nrf2 variaram de 0,79 a 1,45; ausência de padrão consistente entre
os três grupos. As alterações não foram estatisticamente significativas.
Não houve diferenças entre os grupos com relação à inflamação das vias
aéreas e à função pulmonar.
Participantes concordaram em ingerir não mais que uma
porção de vegetais
crucíferos por semana.
Não informado.
DURAN et al., 2016
Inflama-ção
neutrofí-lica das
vias aéreas
ECR controlado
por placebo, crossover
com voluntários saudáveis
não-fumantes e
não-atópicos (n=15)
Examinar se a suplementação com
HBB contendo SFN é uma intervenção efetiva contra a
infamação neutrofílica das vias aéreas
induzida pela inalação de ozônio.
HBB: 200 g (111 g de
BroccoSprouts®). Placebo (200 g de
HBA).
1 vez ao dia.
3 dias.
A intervenção aumentou significativamente os níveis de SFN (p=0,001) e de seus metabólitos N-acetil-L-cisteína-SFN (p=0,002) e
glutationa-SFN (p<0,001) em comparação com o placebo. A
exposição ao O₃ aumentou significativamente a quantidade de neutrófilos no escarro de ambos os grupos, sem diferença significativa
entre eles, tampouco na expressão do Nrf2 e dos genes de defesa
antioxidante de Fase II entre os 2 grupos.
Não informado.Não
informado.
46
EGNER et al., 2014
Câncer de pulmão e doenças cardio-
pul-monares
ECR controlado por placebo
com indivíduos expostos a elevados
níveis ambientais
de poluentes tóxicos (n=267)
Determinar a extensão em que bebida a base de
brotos de brócolis é capaz de aumentar a excreção urinária de poluentes tóxicos do ar, bem como se a
resposta protetora é sustentável ao longo
de 12 semanas.
Bebida preparada com brotos de
brócolis (BroccoSprouts®) de 3 dias de germinação
com água, suco de abacaxi e suco de
limão (47:47:6) contendo
600 µmol de GRN e 40 µmol de SFN.
1 vez ao dia
12 semanas
A intervenção aumentou significativamente a detoxificação de
ácidos mercaptúricos do benzeno (61%) e da acroleína (23%) (p≤0,01),
mas não do crotonaldeído, em comparação ao placebo.
Nenhuma restrição
alimentar foi estabelecida.
Fervura por 30 minutos
e armazena-
mento a -20 .
Mirosinase não foi
adicionada.
BAU-MAN et al., 2016
Câncer oral
(carcino-ma de células
escamo-sas de
cabeça e pescoço)
EC piloto, de braço único,
crossover com
voluntários saudáveis
(n=10)
Avaliar a biodisponibilidade e a farmacodinâmica de 3
diferentes regimes derivados de EBB, de acordo com os níveis
urinários de SFN e seu metabólito N-acetilcisteína-SFN,
bem como da expressão de NQO1
no epitélio oral.
3 Regimes derivados de EBB:
Regime 1: bebida contendo 600 μmol de GRN; Regime 2:
bebida contendo 150 μmol de SFN; Regime 3: enxaguante bucal contendo 150 μmol
de SFN.
1 vez ao dia
5 dias
O Regime 2 apresentou a melhor biodisponibilidade (p=0,0013),
enquanto que o Regime 1 resultou em uma maior variabilidade nos níveis
urinários de SFN e seus metabólitos.A expressão de NQO1 aumentou em
2 vezes ou mais em 6 dos 9 participantes do Regime 1; 3 dos 6 do
Regime 2; e 3 dos 9 do Regime 3. Além disso, o nível de NQO1 variou significativamente de acordo com o tipo de tratamento (p=0014) e dia
(p=0,0029), com um aumento significativo no dia 5 do Regime 1
(p<0,0001).
Vegetais crucíferos
foram evitados 48 horas antes
e durante o período de
intervenção.
Não informado.
47
DINKO-VA-
KOSTO-VA et al.,
2007
Câncer de pele
induzido por luz
ultraviole-ta
EC de escalona-mento de
dose, matched
pair, controlado por placebo
com voluntários saudáveis
(n=17)
Verificar a segurança da aplicação tópica de
EBB em doses simples ou múltiplas, bem como investigar a eficácia em elevar a atividade enzimática
de NQO1.
Formulação tópica de EBB contendo SFN
Segurança: 0,534 e 5,34 nmol (n=4); 10,7 e 21,4
nmol (n=2); 42,7 e 85,4 nmol
(n=2); 170 e 340 nmol (n=2); 681 nmol
(n=2). Eficácia:
Dose única: 5, 40,170, 340 nmol
(n=não informado); Dose tríplice: 150, 300, 450, 600 nmol
(n=17).
1 ou 3 dias.
Nenhum EA significativo foi verificado, exceto em um participante que
recebeu a dose mais elevada (681 nmol), o qual desenvolveu eritema
plano transitório de 3 mm. Houve correlação significativa entre a
dose e a atividade enzimática da NQO1 (p<0,0009). Elevação máxima da atividade de NQO1 de 1,5 vezes
naqueles que receberam única aplicação de 170 nmol e 340 nmol,
bem como de 4,5 vezes após aplicação de 3 doses de 450 nmol em intervalos de 24 horas. As aplicações de doses únicas de 5 ou 40 nmol não
resultaram em alterações significativas e a magnitude da
indução reduziu na dose cumulativa mais elevada (600 nmol).
O consumo de vegetais
crucíferos e condimentos foi
evitado e controlado pelo preenchimento
de um diário alimentar.
Participantes foram
orientados a não lavar as
regiões tratadas por
pelo menos 8 horas após a
aplicação.
Não foram informadas
as caracterís-
ticas de processa-
mento. Adição de mirosinase
para obtenção do SFN a partir do
EBB.
CHANG et al., 2015
Infecção gástrica por H. pylori
ECR duplo-cego,
controlado por placebo
com indivíduos infectados
por H. pylori (n= 89)
Investigar se EBB contendo SFN é capaz de inibir a
densidade da infecção por H. pylori e de
atuar como antioxidante na lesão da mucosa gástrica.
Cápsulas de EBB contendo SFN:
250 mg (1 mg de SFN) (n=33 H. pylori
(+) e 28 H. pylori (-)).
Placebo (n=28 H. pylori (+)).
2 vezes ao dia.
4 semanas.
Os valores do teste respiratório com ureia e das concentrações de amônia
em aspirados do suco gástrico não variaram significativamente no Grupo
A (p=0,634 e p=0,505, respectivamente). Redução
significativa de malondialdeído na mucosa do Grupo A (p<0,05) e Grupo C (p<0,001). A concentração de GSH da mucosa gástrica não variou antes e depois do tratamento em ambos os
grupos.
Não informado.Excluiu-se
aqueles com histórico de
distúrbio gástrico, uso de
anti-inflamatórios
não esteroidais, anticoagulan-tes e doenças
sistêmicas.
Não informado.
48
YANAKA et al., 2009
Infecção gástrica por H. pylori
ECR duplo-cego,
controlado por placebo
com indivíduos infectados
por H. pylori (n=48)
Verificar se a ingestão de brotos de brócolis
resulta em SFN biodisponível para
conferir ação antibiótica contra H.
pylori e induzir enzimas
citoprotetoras sistêmicas.
Brotos de brócolis (Broccoli Super
Sprout de 3 dias da germinação):
70 g (420 μmol de GRN) (n=25).
Placebo (70 g de brotos de alfafa)
(n=23).
8 semanas.
Redução significativa de PGI e PGII séricos no grupo teste e aumento da
razão PGI/PGII (p<0,05), com consequente retorno ao nível basal
após dois meses do término da intervenção.
Os níveis do antígeno de HpSA e os valores do teste de ureia no grupo teste reduziram significativamente
(p<0,05) e retornaram ao valor basal na semana 16 (p<0,05).
Não informado.Exclui-se
aqueles que faziam uso de antibióticos, inibidores de
bomba de próton e
antiulcerosos.
Armazena-mento dos
brotos entre 5 e 7 . Mirosinase
não foi adicionada.
BAHA-DORAN
et al., 2011
Diabetes tipo 2
ECR paralelo,
duplo-cego, controlado por placebo
com indivíduos portadores de diabetes
tipo 2 (n=63)
Investigar o efeito do consumo de brotos de brócolis em pó sobre
parâmetros de estresse oxidativo
(capacidade antioxidante sérica
total, status oxidante total, índice de
estresse oxidativo, malondialdeído e
lipoproteína de baixa densidade oxidada).
Brotos de brócolis em pó (adquirido de Cyvex Nutrition
Company; contendo aproximadamente
22,5 µmol de SFN/g): 10 g (225 µmol SFN) (n=21); 5 g (112 µmol
SFN) (n=22). Placebo: 5 g (n=20).
1 vez ao dia.
4 semanas.
Diminuição de 9 e 5% nos níveis de malondialdeído (p=0,001) e
lipoproteína de baixa densidade oxidada (p=0,03), respectivamente,
no grupo que consumiu 10 g/dia; redução de 14 e 9% no índice de estresse oxidativo (p=0,001) nos grupos que ingeriram 10g/dia e
5g/dia, respectivamente. A capacidade antioxidante total
aumentou em 16 e 10% nos braços tratados com 10g/dia e 5g/dia,
respectivamente (p=0,001). Nenhum efeito foi observado no status
oxidante total.
Não houve nenhuma restrição
alimentar e acompanhou-se as dietas
antes e durante a intervenção.
Foram excluídos
aqueles que utilizavam injeção de insulina ou
suplementos antioxidantes.
Não informado.
49
SINGH et al., 2014
Autismo
ECR controlado
por placebo, duplo-cego
com homens jovens
portadores de autismo moderado a
grave (n=40)
Avaliar o efeito de doses diárias de SFN no comportamento de
indivíduos autistas, quantificado por 3
medidores comportamentais
validados: ABC, SRS e CGI-I.
Cápsulas de SFN derivado de EBB: 50 a 150 µmol de
SFN (de acordo com o peso de cada
participante) (n=26). Placebo (cápsulas de
celulose microcristalina)
(n=14).
1 vez ao dia.
18 semanas.
Melhora substancial do comportamento no grupo teste: 34% para ABC (p<0,001) e 17% para SRS (p=0,017); mudança comportamental mínima (<3,3%) no grupo controle.
Um número significativo de participantes do grupo teste mostrou
melhora na interação social, no comportamento anormal e na
comunicação verbal do parâmetro CGI-I (p=0,015-0,007). Após a
descontinuação do tratamento, todos os medidores retornaram para os
valores basais.
Não informado.
As cápsulas foram
mantidas a -20 .
8-OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina; ABC: Aberrant Behavior Checklist; ALT: Alanina aminotransferase; AST: Aspartato aminotransferase; CGI-I: Clinical Global
Impression Improvement Scale; DPOC: Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica; EA: Eventos Adversos; EBB: extrato de brotos de brócolis; EC: Estudo Clínico;
ECR: Estudo clínico randomizado; γ-GTP: γ-Glutamil transpeptidase; GCLc: Subunidade catalítica da glutamato cisteína ligase; GCLm: Subunidade
modificadora da glutamato cisteína ligase; GRN: Glicorafanina; GSH: Glutationa; GSTM1: Glutationa S-transferase M1; GSTP1: Glutationa S-transferase P1;
HBA: homogeneizado de brotos de alfafa; HBB: homogeneizado de brotos de brócolis; HBG1: Subunidade da hemoglobina fetal; HO-1: Heme oxigenase-
1;HpSA: H. pylori stool antigen; IL-6: interleucina 6; NQO1: NAD(P)H:quinona oxiredutase 1; Nrf2: Nuclear factor E2-related factor 2; PG: pepsinogênio; SFN:
Sulforafano; SRS: Social Responsiveness Scale.
50
Figura 1: Estrutura das proteínas Keap1 e Nrf2. Fonte: STEFANSON & BAKOVIC,
2014.
S
S
NO
SO3-
O
Glicorafanina
Mirosinase/Flora IntestinalOH2
S
SH
NO
SO3-
O
Intermediário Instável
+
S
NOS
O N
S
ESPSO42-
Sulforafano Sulforafano nitrila
Glicose
Glicose
Glicose
Figura 2: Representação esquemática da hidrólise da glicorafanina mediada pela
enzima mirosinase. A glicorafanina é hidrolisada pela enzima mirosinase ou pela sua
isoforma da flora intestinal, provocando a liberação de glicose e de um intermediário
instável, o qual se reorganiza para formar o sulforafano. ESP atua como inibidor não
catalítico da mirosinase ao converter a glicorafanina em derivados nitrila. Adaptado
de KEUM, 2011.
51
Keapl-SH,s
ç
-> --N,
Data e assi o alu a)
Tatiana Bertoni Bacovsky
S
*A ,Keap1o o' SSulforafano
Figura 3: Representação esquemática da reação reversívelentre o sulforafano e o
grupo tiol da cisteína do Keap1. O asterisco indica o carbono eletrofílico. Adaptado
de HONG, FREEMAN & LIEBLER,2005.
"whylw,nlü^fu{ffioorientado(a)Silvia Maria Franciscato Cozzolino
rr-^,