universidade de sÃo paulo escola de engenharia de...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

FELIPE ALCÂNTARA LIMA

OTIMIZAÇÃO DO TEMPO DE ANÁLISES DE AÇÚCARES EM CEREAIS MATINAIS ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE UTILIZANDO O PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS

Lorena

2014

FELIPE ALCÂNTARA LIMA

Otimização do tempo de análises de açúcares em cereais matinais através de cromatografia liquida de alta performance utilizando o

planejamento de experimentos

Monografia apresentada à Escola de Engenharia de Lorena como exigência para obtenção do certificado de graduação em Engenharia Industrial Química pela Universidade de São Paulo.

Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva

Lorena

2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA AFONTE

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Lima, Felipe Alcântara OTIMIZAÇÃO DO TEMPO DE ANÁLISES DE AÇÚCARES EMCEREAIS MATINAIS ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DEALTA PERFORMANCE UTILIZANDO O PLANEJAMENTO DEEXPERIMENTOS / Felipe Alcântara Lima; orientadorMessias Borges Silva. - Lorena, 2014. 67 p.

Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaIndustrial Química - Escola de Engenharia de Lorenada Universidade de São Paulo. 2014Orientador: Messias Borges Silva

1. Cromatografia. 2. Planejamento deexperimentos. 3. Açúcares. I. Título. II. Silva,Messias Borges, orient.

À minha namorada Carolina Vaz, que com muito amor, admiração, presença e incondicional apoio ao longo do período acadêmico, me auxiliou na elaboração deste trabalho, assim como em todos os momentos que convivemos.

AGRADECIMENTOS

À minha mãe Maria Izabel, meu pai Adilson e minha irmã Mariana, que com muito amor, carinho, atenção, apoio e empenho proporcionaram a construção dos alicerces de meu caráter e assim nortearam o caminho dessa jornada chamada, minha vida.

Ao Prof. Dr. Messias Borges Silva pelo apoio na orientação deste trabalho. E por todo conhecimento que me proporcionou em suas aulas durante o período de graduação.

Agradeço de uma forma geral, mas não menos importante, à todos os docentes da instituição EEL-USP, pela concretização do início de minha formação e carreira profissional.

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original”.

Albert Einstein

RESUMO

LIMA, F.A. Otimização do tempo de análises de açúcares em cereais matinais

através de cromatografia liquida de alta performance utilizando o

planejamento de experimentos. Monografia (Trabalho de Graduação em

Engenharia Industrial Química) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de

São Paulo, Lorena, 2014.

A cromatografia liquida de alta eficiência como uma técnica de separação, ocupa

um lugar de grande destaque como técnica analítica qualitativa e quantitativa.

Apesar de ser uma técnica relativamente nova, contando com um grande número

de publicações em química, descrevendo diversas aplicações. Em vários casos,

essas aplicações consistem em determinações de substancias cuja analises por

outras técnicas são muito difíceis ou demoradas. A análise química dos açúcares,

bem como de outros alimentos, visa à sua caracterização e também ao controle de

sua qualidade, empregando este método primário que determina a quantidade de

frutose, glicose, sacarose, maltose e lactose em cereais por cromatografia líquida

de alta eficiência (CLAE). Neste contexto, no presente trabalho serão apresentados

os principais parâmetros que influenciam, no tempo de retenção em análises por

cromatografia liquida de alta eficiência. Ao final da revisão da literatura, propôs-se

uma metodologia, a fim de determinar a melhor configuração dos parâmetros que

influenciam nas análises de açúcares em cereais matinais utilizando-se (CLAE).

Esta metodologia baseada em um planejamento estatístico de experimentos,

possibilita o desenvolvimento do estudo de forma mais rápida e econômica,

resultando em benefícios importantes para o setor da empresa Cereal Partners

Worldwide (CPW).

Palavras-chave: Açúcares. Cromatografia. Planejamento de experimentos.

ABSTRACT

LIMA, F.A. Optimization time in analysis of sugars in breakfast cereals by high

performance liquid chromatography using the design of experiments

methodology.. Monografia (Trabalho de Graduação em Engenharia Industrial

Química) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena,

2014.

The high performance liquid chromatography as a separation technique, occupies

a place of great prominence as qualitative and quantitative analytical technique.

Although a relatively new technique, with a large number of publications in

Chemical, describing various applications. In many cases, these applications

consist of determinations of substances whose other analysis techniques are very

time consuming or difficult. Chemical analysis of sugars and other foods, aims to

characterize and to control their quality, employing a primary method that

determines the amount of fructose, glucose, sucrose, maltose and lactose cereals

by high performance liquid chromatography (HPLC). In this context, in this study the

main parameters that influence the retention time for analysis by liquid

chromatography high efficiency will be presented. At the end of the literature review,

we proposed a methodology to determine the best configuration of parameters that

influence the analysis of sugars in breakfast cereals using (HPLC). This

methodology based on a statistical design of experiments methodology, enables the

development of the study more quickly and cost effectively, resulting in significant

benefits to the business sector of Cereal Partners Worldwide (CPW).

Keywords: Sugars. Chromatography. Design of experiments methodology.

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 Desempenho dos detectores para CLAE.. .......................................... 14

Tabela 2. 2 Matriz do planejamento fatorial completo 23. ..................................... 27

Tabela 2. 3 Resultados da matriz experimental fatorial 23.. .................................. 28

Tabela 2. 4 Coeficientes de contraste para um fatorial 23. ................................... 30

Tabela 2.5 Efeitos calculados para o planejamento fatorial 23. ............................ 33

Tabela 2. 6 Tabela da ANOVA.. ........................................................................... 38

Tabela 4.1 Matriz experimental fatorial proposta .................................................. 43

Tabela 4.2 Resultados da matriz 23do experimento realizado. ............................. 44

Tabela 4. 3 Resolução no cormatograma dos ensaios . ....................................... 45

Tabela 4. 4 Efeitos calculados para o experimento realizado. .............................. 46

Tabela 4. 5 Melhor configuração para os fatores .................................................. 47

Tabela 4. 6 ANOVA dos fatores e interações do experimento. ............................ 50

Tabela 4. 7 ANOVA para a regressão do modelo estatístico. .............................. 51

LISTA DE QUADROS

Quadro 2.1 Tipos de Planejamentos. ................................................................... 22

Quadro 4. 1 Resultados dos experimentos expressos em minutos ...................... 48

Quadro 4. 2 Resumo da formulação utilizada ...................................................... 48

Quadro 4. 3 Soma dos resultados das réplicas do experimento .......................... 49

Quadro 4. 4 Soma dos resultados da combinação FP. ........................................ 49

Quadro 4. 5 Soma dos resultados da combinação FT. ........................................ 49

Quadro 4. 6 Soma dos resultados da combinação PT. ........................................ 49

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 2.1 Sistema de um equipamento de CLAE. .............................................. 10

Figura 2.2 Diagrama esquemático de um detector por índice de refração. .......... 15

Figura 2.3 Medidas relacionadas à determinação da resolução .......................... 17

Figura 2.4 Separação em função da resolução de dois componentes presentes em diferentes concentrações ................................................................................ 18

Figura 2.5 Representação de um sistema ligando as variáveis de entrada às variáveis de saída ................................................................................................. 21

Figura 3.1 Planejamento para três fatores. .......................................................... 42

LISTA DE GRAFICOS

Gráfico 4.1 Análise das médias dos fatores nos níveis baixo e alto.

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

ABIA Associação Brasileira das Indústrias de Alimentos

ANOVA Análise de variância

CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência

CLC Cromatografia Liquida Clássica

CPW Cereal Partners Worldwide

DCCR Delineamento Composto Central Rotacional

FE Fase Estacionaria

FM Fase Móvel

GL Graus de Liberdade

IR Índice de Refração

LD Limite de Detecção

LISTA DE SIMBOLOS

fg Femtograma (10-15 g)

pg Picograma (10-12 g)

ng Nanograma (10-9 g)

µg Micrograma (10-6 g)

°C Graus Celsius

% Porcentagem

min Minutos

ml Mililitros

v/v Concentração volume por volume

ml/min Mililitros por minutos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 8

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................................... 9

2.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ...................................................................................... 9

2.2 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE – CLAE .......................... 9

2.2.1 FASE MÓVEL .............................................................................................................. 10

2.2.2 DEGASEIFICADOR .................................................................................................... 11

2.2.3 BOMBA........................................................................................................... 11

2.2.4 INJETOR ......................................................................................................... 12

2.2.5 COMPARTIMENTO DE COLUNA ........................................................................... 12

2.2.6 DETECTOR POR INDICE DE REFRAÇÃO .................................................... 13

2.2.7 SISTEMA COMPUTACIONAL/ MONITOR ..................................................... 15

2.2.8 TEMPO DE RETENÇÃO E RESOLUÇÃO NA ANÁLISE QUANTITATIVA ..... 16

2.3 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS....................................................................... 18

2.4 TIPOS DE PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS ............................................. 21

2.5 PLANEJAMENTO FATORIAL COMPLETO 2K ..................................................... 27

2.5.1 CÁLCULOS DOS EFEITOS ............................................................................ 29

2.5.2 ESTIMATIVA DO ERRO ................................................................................. 33

2.5.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS E MODELO ESTATISTICO ............. 34

2.5.4 ANÁLISE DA VARIÂNCIA ........................................................................................ 36

2.5.5 TESTE DE SIGNIFICÂNCIA ESTATISTICA .......................................................... 39

2.6 METODO DE DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES EM CEREAIS MATINAIS......... 40

3 METODOLOGIA ........................................................................................................................ 41

4 RESULTADO E DISCUSSÃO ................................................................................................. 43

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 52

6 OPORTUNIDADES ................................................................................................................... 53

6.1 DELINEAMENTO CENTRAL COMPOSTO ROTACIONAL ....................................... 53

6.2 IMPACTOS DO PROJETO ............................................................................................... 54

ANEXOS ......................................................................................................................................... 57

ANEXO A – TABELA DISTRIBUIÇÃO F, α=0,1. ................................................................ 57

ANEXO B – TABELA DISTRIBUIÇÃO F, α=0,05. ............................................................. 58

ANEXO C – TABELA DISTRIBUIÇÃO F, α=0,01. ............................................................. 59

8

1 INTRODUÇÃO

É difícil hoje em dia imaginar como seria a vida sem o açúcar e, consequentemente,

a sua ausência no nosso dia-a-dia, sendo que desde o século 17, as pessoas

passaram a usufruir dessa substancia extraída da cana. Uma vez que, hoje, o

açúcar é um produto acessível e indispensável no paladar do ser humano, a

indústria alimentícia tem a necessidade de utiliza-lo na formulação de produtos para

consumo humano.

As implicações do teor de açúcares são determinantes no que se diz respeito a

qualidade do produto terminado na fábrica de cereais matinais CPW-Brasil. A partir

de análises realizadas por métodos primários, utilizando Cromatografia liquida de

alta performance (CLAE) em conjunto com um detector por Índice de refração (IR),

os açúcares são determinados a partir de amostras previamente preparadas em

Laboratório utilizando-se de técnicas de extração e separação. A separação

completa dos componentes sacarídeos por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE-IR), muitas vezes, pode ser complicada se ao realizarmos o ensaio não

adotarmos os corretos valores para os parâmetro que influenciam no processo de

separação dos mesmos. Parâmetros relacionados com a fase móvel, fase

estacionaria, condições de temperatura e pressão da coluna de separação podem

ser investigados, afim de melhorar a resolução cromatográfica (ABIA, Associação

Brasileira das Indústrias de Alimentos, 1990) e otimizar o tempo de análise.

Devido ao elevado número de análise de monitoramento dos açúcares no processo

produtivo de cereais matinais, torna-se necessária a utilização de um estudo, a fim

de otimizar o tempo na obtenção dos resultados de quantificação desses açúcares,

através de análises realizadas em CLAE-IR. Com a aplicação da abordagem de

pesquisa experimental visa-se otimizar o tempo de obtenção desses resultados, e

assim garantir um melhor suporte ao setor de fabricação no processo produtivo de

Cereais Matinais. Este trabalho propõe a aplicação de um Planejamento

experimental, para três variáveis independentes, sendo que as variáveis analisadas

serão temperatura de trabalho da coluna cromatográfica, proporção volumetrica da

fase móvel e fluxo de fase móvel no equipamento de CLAE.

9

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

A cromatografia líquida basicamente pode ser separadas em dois tipos,

cromatografia liquida clássica (CLC) e cromatografia liquida de alta performance

(CLAE). Ambos, são métodos físico-químicos de separação de componentes de

uma mistura. A CLC utiliza uma coluna de vidro aberta de diâmetro interno de 10

centímetros ou maior que é recheada com partículas de dimensão na faixa de

centenas de micrometros. A fase móvel, ou eluente, com a amostra é introduzida

na coluna manualmente e flui através da coluna devido a força gravitacional. As

frações da amostra são coletadas e quantificadas individualmente. Na CLAE

emprega-se uma coluna fechada, trabalhando em conjunto com uma bomba de alta

pressão, que tem a função de fazer a fase móvel migrar a uma determinada

velocidade através da coluna. A amostra pode ser injetada manualmente ou por

sistema de injeção automática, em equipamentos mais sofisticados e as frações de

componentes da amostra são detectados e quantificados de forma continua. (Sales

Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes Guimarães, 2006)

2.2 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE – CLAE

A cromatografia liquida de alta performance, ou simplesmente CLAE, é uma das

técnicas de separação mais importantes que detemos hoje, uma vez que é capaz

de separar misturas que contêm um grande número de compostos similares

presentes em uma mesma amostra. A CLAE utiliza instrumentos que podem ser

totalmente automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que emprega colunas

10

recheadas com materiais especialmente preparados e uma fase móvel, eluída sob

altas pressões, seu uso aliado com o desenvolvimento em instrumentação

controlada por microcomputadores proporciona grandes melhorias no desempenho

do equipamento.

Figura 2.1 Sistema de um equipamento de CLAE.

Fonte: Próprio autor.

2.2.1 FASE MÓVEL

Em cromatografia liquida de alta eficiência a fase móvel (FM) desempenha um

papel importante no processo de separação dos componentes presentes na

amostra. Sua composição quase sempre é fundamental no processo, exercendo

duas funções essenciais, arrastando os componentes da amostra através do

sistema cromatográfico além de participar do processo de separação. Dentre as

características importantes de uma fase móvel em CLAE, segundo (Sales Fontes

11

Jardim, H. Collins, & Lopes Guimarães, 2006), considera-se, alto grau de pureza

da mesma, dissolver amostra sem decompor seus componentes, não decompor ou

dissolver a fase estacionária, ter baixa viscosidade e ponto de ebulição e ser

compatível com o detector utilizado, tendo como outra característica relevante o

seu baixo preço e baixa toxidade. Busca-se utilizar a melhor configuração possível,

uma vez que, muitas vezes é difícil obter todos as características em seu máximo.

A fase móvel é uma das variáveis que mais influenciam numa separação

cromatográfica, e cumpre um papel fundamental, já que por si mesma pode

modificar completamente a seletividade das separações e é o verdadeiro propulsor

da separação.

2.2.2 DEGASEIFICADOR

Permite a remoção dos gases das fases móveis de maneira contínua. Em

cromatografia líquida, todos os solventes devem se degaseificados e filtrados. O ar

dissolvido na fase móvel pode formar bolhas na cabeça da bomba o que

consequentemente, faz com que a pressão caia e não exista fluxo. A presença de

bolhas no detector pode gerar ruídos de linha de base tão altos que torna

impraticável a utilização do sistema. Em ambos os casos, há oscilações na linha de

base e influência sobre tempos de retenção ou aparecimentos de picos adicionais.

Os métodos de degaseificação são, geralmente, por aquecimento (refluxo com

agitação), vácuo, aborbulhamento de gás inerte (hélio), ultrassom, etc (SKOOG,

HOLER, & NIEMAN , 2009).

2.2.3 BOMBA

A vazão da fase móvel (FM) líquida, essencial para qualquer separação em CLAE

é mantida por uma, ou mais bombas de alta pressão. A alta pressão é necessária

12

para que o fluxo possa sobrepor à resistência das micropartículas da fase

estacionária empacotadas na coluna, assim como impedir a formação de

microbolhas no sistema, oriundas da mistura de solventes (SKOOG, HOLER, &

NIEMAN , 2009). A sua função é enviar um fluxo constante e reprodutível de FM

para a coluna.

Dentre os aspectos importantes para um sistema de bombeamento podemos

destacar a importância da vazão continua sem pulsos, a fim de não gerar variações

que possa gerar ruído na análise, faixa de trabalho de pressão entre 0,01 a 35 MPa

e vazões entre 0,01 e 5 mL min-1 (Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes

Guimarães, 2006).

2.2.4 INJETOR

Como o nome sugere, o injetor é a parte do equipamento por onde se introduz a

amostra, sem alterar a vazão do sistema. As principais características de um injetor

referem-se ao fato de não provocar alargamentos da banda do cromatograma,

devido à diluição da solução injetada não ser atacado por solventes, apresentar

reprodutibilidade e precisão, quando a quantidade injetada é operada a altas

pressões (SKOOG, HOLER, & NIEMAN , 2009).

2.2.5 COMPARTIMENTO DE COLUNA

Local que se encontra a coluna estacionária. A coluna é o “coração” de um sistema

cromatográfico. O sucesso de uma análise cromatográfica depende

fundamentalmente da coluna, na qual é escolhida conforme a natureza das

substâncias que se deseja determinar. Também no sistema de compartimento de

coluna, é onde se controla a temperatura da coluna durante a análise, fator

importante para o desenvolvimento de um método, visto que altera a viscosidade

13

do produto pela variação da temperatura, influenciando no tempo de retenção da

amostra na coluna (SKOOG, HOLER, & NIEMAN , 2009).

Independente da técnica de enchimento utilizada, tanto as colunas adquiridas no

comércio como as recheadas em laboratório devem ser condicionadas antes do

uso, para que haja um equilíbrio perfeito entre FM e a fase estacionaria (FE), pois

após o recheio, a FE encontra-se solvatada com o solvente propulsor, que é

utilizado no enchimento da coluna. O condicionamento deve ser feito com a FM em

vazão baixa, 0,2 mL min-1, por 4 a 8 horas para colunas novas, 2 horas para colunas

armazenadas por alguns dias, e 15 minutos antes do uso diário (Sales Fontes

Jardim, H. Collins, & Lopes Guimarães, 2006).

No que diz respeito a temperatura da coluna, não é possível estabelecer uma regra

a respeito da influência da temperatura em separações por CLAE. O aumento da

temperatura frequentemente aumenta o desempenho da coluna, porque diminui a

viscosidade da FM, o que melhora a transferência de massas. Contudo, é também

possível que o desempenho diminua (Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes

Guimarães, 2006).

2.2.6 DETECTOR POR INDICE DE REFRAÇÃO

O detector cromatográfico é a parte do equipamento que recebe e fornece o sinal

que representa a quantidade do componente de interesse no eluente da coluna. É

o mais complexo e o mais caro dos módulos em CLAE. Medindo de forma continua

alguma propriedade física ou físico-química da amostra, ou da solução que a

contém, e envia um sinal para registro, geralmente, diretamente proporcional à

concentração do componente na amostra (Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes

Guimarães, 2006). Esse sinal é gerado assim que o efluente sai da coluna e chega

ao detector. Deve-se requerer para a CLAE uma atenção com relação a

propriedades físicas e físico-químicas da amostra e da fase móvel, que podem ser

14

semelhantes causando dificuldades na detecção dos componentes. A Tabela 2.1 a

seguir mostra o desempenho de detectores utilizados em CLAE.

Tabela 2.1 Desempenho dos detectores para CLAE.

Detector para CLAE LD* em massa (típico)

Absorbância 10 pg Fluorescência 10 fg Eletroquímico 100 pg Índice de Refração 1 ng Condutividade 100 pg - 1 ng Espectrômetro de massas < 1 pg

FTIR 1 µg Espalhamento de Luz 1 µg Atividade óptica 1 ng Seletivo a elementos 1 ng Fotoionização < 1 pg

*Limite de Detecção (LD) dependem do composto, do instrumento e das disposições de CLAE. (SKOOG, HOLER, & NIEMAN , 2009)

Os detectores por índice de refração têm a vantagem significativa de responderem

a quase todos os solutos, sendo considerados, detectores universais, possuindo

ótima confiabilidade além de não serem afetados pela vazão, entretanto são

extremamente sensíveis à temperatura devendo ser mantidos em uma temperatura

constante e com baixíssima variação em milésimos de graus centigrados. A

princípio de quantificação, no detector por índice de refração (IR), correspondente

detector que é utilizado na determinação de açúcares no presente estudo, o

solvente passa através de uma metade da célula no seu caminho após a coluna; o

eluato, então flui através da outra câmara (SKOOG, HOLER, & NIEMAN , 2009).

A Figura 2.2 ilustra um sistema de detecção por (IR), os dois compartimentos são

separados por uma placa de vidro montada a um ângulo tal para que ocorra a

curvatura do feixe incidente se as duas soluções tiverem índices de retenção

diferentes. O deslocamento resultante do feixe em relação à superfície

fotossensível de um detector causa uma variação no sinal de saída, o qual então é

15

amplificado e registrado, fornecendo o cromatograma (SKOOG, HOLER, &

NIEMAN , 2009).

Figura 2.2 Diagrama esquemático de um detector por índice de refração. . (Cortesia da Waters Associates, Inc. Milford, MA

Esquema extraído de (SKOOG, HOLER, & NIEMAN , 2009)

2.2.7 SISTEMA COMPUTACIONAL/ MONITOR

Os computadores convertem os dados através de softwares específicos de

gerenciamento de sistemas de CLAE. Determinam a concentração da amostra em

questão através de cálculos de área dos picos cromatográficos ou também

utilizando a altura dos picos como base para fazer os cálculos, além de fornecer os

tempos de retenção dos componentes presentes na amostra. Para manter ou

aumentar a versatilidade, exatidão e a precisão da CLAE, a utilização de um

microcomputador é fundamental para processar os dados obtidos pelo detector de

forma rápida e continua, além disso o uso de softwares empregados para este fim,

fornece controle sobre a composição da fase móvel, vazão da bomba, injeção da

amostra, temperatura da coluna, dentre outras ferramentas que contribuem para

unificação dos paramentos envolvidos e dados gerados pela CLAE (Sales Fontes


16

2.2.8 TEMPO DE RETENÇÃO E RESOLUÇÃO NA ANÁLISE QUANTITATIVA

Em uma análise quantitativa, deve-se tomar cuidado em todas as etapas, para

evitar erros. Deve-se manter um bom controle tanto na etapa de separação dos

componentes quanto na etapa analítica, utilizando amostras representativas, livre

de contaminantes durante seu preparo e rígido controle de parâmetros como vazão,

temperatura e quantidade de amostra injetada. Após a obtenção do cromatograma,

faz-se a integração dos sinais, que tem por finalidade transformar a intensidade do

sinal emitido pelo detector em uma medida relacionada com a quantidade da

substancia analisada na amostra (Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes

Guimarães, 2006). Essas medidas são representadas no cromatograma continuo

da análise, e a partir da altura ou área dos picos é possível quantificar cada

componente através de vários métodos relativos que empregam padrões que

contêm os componentes presentes na amostra. Assim, um determinado

componente irá responder da mesma forma, seja presente na amostra seja na

solução padrão, para as mesmas condições paramétricas empregadas, ou seja,

apresentaram mesmo tempo de retenção e mesma resolução. Tendo estas

características vindo à tona vale torna-las mais explicitas.

Assim, pode-se definir como tempo de retenção o tempo gasto desde o ato de

injeção até a saída do ponto máximo do pico que representa um dos solutos, este

pico é a variável impressa pelos dispositivos eletrônicos, frequentemente acoplados

a sistemas automatizados de cromatografia. O tempo de retenção engloba todo o

tempo que o componente em questão fica no sistema cromatográfico, quer na fase

móvel quer na fase estacionaria (Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes

Guimarães, 2006). Outra medida importante da separação de componentes

consecutivos é a resolução RS. A resolução em cromatografia em coluna, é

calculada a partir da distância que separa os pontos máximos dos picos e da média

17

das Larguras de suas respectivas bases, wb. Para a medida da largura de base,

toma-se sempre a distância entre as tangentes traçadas nas laterais do pico.

�� = � �(��)(� �� )� ......(1)

Figura 2.3 Medidas relacionadas à determinação da resolução.

(Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes Guimarães, 2006)

Observa-se que a resolução é um termo sem unidades, o que implica a

necessidade e utilizar sempre as mesmas unidades para as distâncias (tempos) de

retenção e para as larguras de base.

Quando RS = 1, os picos são razoavelmente separados, com somente 2% de

superposição se as quantidades dos componentes forem iguais. Maiores valores

de resolução indicam melhor separação: RS = 1,25 é suficiente para fins

quantitativos e RS > 1,5 indica separação completa. A Figura 2.4 mostra as

separações dos compostos, presentes em diferentes quantidades, em valores de

resolução de 0,8, 1,0 e 1,25. Quando as razões de concentrações são 1:1 e 4:1

18

ambos os picos são distinguíveis, mesmo com uma resolução de 0,8; mas, quando

a razão de alturas é 16:1, o segundo pico não pode ser identificado (Sales Fontes


Figura 2.4 Separação em função da resolução de dois componentes presentes em diferentes concentrações.

(Sales Fontes Jardim, H. Collins, & Lopes Guimarães, 2006)

2.3 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS

O Planejamento de Experimentos (em inglês Design of Experiments, DOE) é uma

técnica utilizada para planejar-se experimentos, ou seja, definir quais dados e em

quais quantidades e condições devem ser coletados em um determinado

experimento, buscando satisfazer dois grandes objetivos: a maior precisão possível

na resposta e o menor custo. É uma técnica considerada de extrema importância

na indústria já que seu emprego permite resultados mais confiáveis, economizando

dinheiro e tempo (MONTGOMERY, 1976).

19

Parece ser simples e óbvia a preferência na utilização do DOE em atividades

experimentas uma vez que, o mesmo proporciona economia de tempo e dinheiro,

fatores importantes a serem considerados em qualquer atividade que se deseje

executar nos tempos atuais, seja ela de qualquer natureza, entretanto, ainda hoje

o cenário da utilização do DOE não é predominante. O método mais comumente

utilizado até então para o desenvolvimento de produtos e processos era o chamado

“One Variable At a Time”, ou OVAT, traduzido como “Uma Variável por Vez”

Infelizmente, o método OVAT não garante que a resposta máxima será atingida.

Essa abordagem só seria válida se as variáveis fossem totalmente independentes

uma das outras, dizendo de outra forma, sem interações entre elas (Leardi, 2009).

Um exemplo deste método pode ser a situação em que se necessita de uma

otimização do rendimento de um processo, por exemplo, uma reação química,

trabalhando com temperatura e tempo de reação como variáveis, ao utilizar o

método OVAT, inicialmente fixa-se o tempo de reação em um determinado valor e

realizam-se os experimentos variando a temperatura dentro de um intervalo

determinado através de um estudo prévio teórico ou empírico. Concluída esta

etapa, fixa-se o valor da temperatura ao qual se alcançou o melhor rendimento, e

realiza-se o restante do experimento variando o tempo de reação. Assim, espera-

se obter valores de temperatura e tempo de reação que geram o rendimento

máximo. Entretanto, ao variar um fator por vez, encontra-se a “melhor” temperatura

para um tempo de reação fixo, enquanto, na verdade, cada tempo de reação tem

uma temperatura ótima diferente. Outra diferença entre o OVAT e o DOE é o fato

de que o primeiro método decide qual será o próximo experimento com base nos

experimentos anteriores, enquanto que no segundo já se tem planejado

anteriormente todo o conjunto de experimentos, cobrindo todo o domínio

experimental, o que promove um conhecimento global de toda a reação (Leardi,

2009).

Para efetuar um planejamento de experimentos, cinco passos devem ser

considerados: I) Definir o objetivo dos experimentos. Embora possa parecer

totalmente absurdo, muitas pessoas começam a fazer experiências sem ter claro

20

em suas mentes o motivo pelo qual as estão fazendo. Uma vez que você obtém

resultados, poderá extrair informações a partir deles, e quanto maior o número de

resultados (experimentos), melhor; II) Detectar todos os fatores que podem afetar

o resultado que se deseja, também chamado de “resposta”. No entanto, cuidado

com a diferença entre os fatores que “podem” afetar a resposta e aqueles que

realmente afetam. Os fatores selecionados devem ter embasamento em fatos

científicos; III) Planeje os experimentos. Levando em consideração os fatores

selecionados, a definição de seus intervalos e o modelo a ser aplicado; IV) Realize

os experimentos. Na forma clássica de se pensar, esta seria a parte mais

importante do processo, mas do ponto de vista do planejamento de experimentos

esta etapa é apenas algo que não pode ser evitada, a fim de se obter os resultados

que serão utilizados para construir o modelo; V) Analise os dados obtidos dos

experimentos. Este passo transforma números em informações e é a conclusão

lógica de todo o processo (Leardi, 2009).

Um dos problemas mais comuns de quem faz experimentos é determinar a

influência de uma ou mais variáveis sobre outra variável de interesse. No linguajar

estatístico, estamos interessados em descobrir como a resposta depende dos

fatores. Podemos abordar esse problema como um caso particular da situação

mostrada esquematicamente na Figura 2.5. Um certo número de fatores C1, C2, C3,

..., Cn atuando sobre o sistema em estudo, produz as respostas A1, A2. O sistema

atua como uma função que opera sobre as variáveis de entrada (os fatores) e

produz como saída as respostas observadas (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

21

Figura 2.5 Representação de um sistema ligando as variáveis de entrada às variáveis de saída.

Esquema modificado de (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

Dando início ao planejamento, antes de mais nada é necessário decidir quais são

os fatores e as respostas de interesse. De um modo geral os fatores são as

variáveis que o experimentador tem condições de controlar, podendo estes serem

qualitativas, como tipos de catalisadores em uma reação química, ou quantitativos,

como o controle de temperatura em uma reação. As variáveis de saída, ou seja, as

respostas, são as quais estamos interessados, e que serão – ou não – afetadas por

alterações provocadas nos fatores, que são manipulados pelo experimentador.

2.4 TIPOS DE PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS

Existem diversos tipos de planejamentos de experimentos, sendo cada um

adequado a uma situação especifica, ou seja, as configurações podem ser

aplicadas em estudos desenvolvidos dependendo das informações que se deseja

obter. O Quadro (1) a seguir apresenta os principais métodos de planejamento

utilizados e suas principais características (WERKEMA & AGUIAR, 1996).

22

Quadro 2.1 Tipos de Planejamentos. Esquema adaptado de (WERKEMA & AGUIAR, 1996)

Classificação do

Planejamento de

Experimentos

Aplicação Estrutura Informações obtidas

Completamente aleatorizado

com único fator

Apropriado quando somente um fator experimental está sendo estudado

O efeito do fator é estudado por meio da alocação ao acaso das unidades experimentais aos tratamentos (níveis do fator). Os ensaios são realizados em ordem aleatória.

Estimativa e comparações dos efeitos dos tratamentos. Estimativas da variância.

Fatorial

Apropriado quando vários fatores devem ser estudados em dois ou mais níveis e as interações entre os fatores podem ser importantes

Em cada repetição completa do experimento todas as combinações possíveis dos níveis dos fatores (tratamentos) são estudadas. A alocação das unidades experimentais aos tratamentos e a ordem de realização dos ensaios são feitas de modo aleatório.

Estimativas e comparações dos efeitos dos fatores. Estimativa dos possíveis efeitos de interações. Estimativa da variância.

23

Quadro 2.1 Tipos de Planejamentos. Esquema adaptado de (WERKEMA & AGUIAR, 1996) - Cont.

Classificação do

Planejamento de

Experimentos


Fatorial 2k em blocos

Apropriado quando o número de ensaios necessários para os planejamentos em k fatores em 2 níveis é muito grande para que sejam realizados sob condições homogêneas

O conjunto completo de tratamentos é divido em subconjuntos de modo que as interações de ordem mais alta são confundidas com os blocos. São tomadas observações em todos os blocos.Os blocos surgem geralmente como consequência de restrições de tempo homogeneidade de materiais, etc.

Fornece as mesmas estimativas do planejamento fatorial exceto algumas interações de ordem mais alta que não podem ser estimadas porque estão confundidas com os blocos.

Fatorial 2k fracionado

Apropriado quando existem muitos fatores (k muito grande) e não é possível coletar observações em todos os tratamentos

Vários fatores são estudados em dois níveis, mas somente um subconjunto do fatorial completo é executado. A formação dos blocos algumas vezes é possível.

Estimativas e comparações dos efeitos de vários fatores. Estimativa de certos efeitos de interação (alguns efeitos podem não ser estimáveis). Certos planejamentos fatoriais fracionários (quando k é pequeno) não fornecem informações suficientes para estimar a variância.

24


Classificação do

Planejamento de

Experimentos


Blocos aleatorizados

Apropriado quando o efeito de um fator está sendo estudado e é necessário controlar a variabilidade provocada por fatores perturbadores conhecidos. Estes fatores perturbadores (material, tempo, pessoas, etc.) são divididos em blocos ou grupos ou grupos homogêneos

São tomadas observações correspondentes a todos os tratamentos (níveis do fator) em cada bloco. Usualmente os blocos são considerados em relação a um único fator perturbador.

Estimativas e comparações dos efeitos dos tratamentos livres dos efeitos do bloco. Estimativas dos efeitos do bloco. Estimativa da variância.

Blocos incompletos balanceados

Apropriado quando todos os tratamentos não podem ser acomodados em um bloco

Os tratamentos testados em cada bloco são selecionados de forma balanceada: dois tratamentos quaisquer aparecem juntos em um mesmo bloco o mesmo número de vezes que qualquer outro par de tratamentos

Idêntico ao planejamento em blocos aleatorizados.

Blocos incompletos parcialmente balanceados

Apropriado quando um planejamento em blocos incompleto parcialmente balanceados necessita de um número de blocos excessivamente grandes.

Alguns pares de tratamentos aparecem juntos n1 vezes, outros pares aparecem juntos n2 vezes, ..., e os pares restantes aparecem juntos m vezes.

Idêntico ao planejamento em blocos aleatorizados, mas os efeitos dos tratamentos são estimados com diferentes precisões.

25


Classificação do

Planejamento de

Experimentos


Quadrados Latinos

Apropriado quando um fator de interesse está sendo estudado e os resultados podem ser afetados por duas outras variáveis experimentais ou por duas fontes de heterogeneidade. É suposta a ausência de interações

O quadrado latino é um arranjo para permitir dois grupos de restrições de bloco. Os tratamentos são distribuídos em correspondência as colunas e linhas de um quadrado. Cada tratamento aparece uma vez em cada linha e uma vez em cada coluna. O número de tratamentos deve ser igual ao número de linhas e colunas do quadrado. Os blocos são formados em relação a duas variáveis perturbadoras, as quais correspondem as colunas e linhas do quadrado.

Estimativas e comparações dos efeitos dos tratamentos livres dos efeitos das duas variáveis bloco. Estimativas e comparações dos efeitos das duas variáveis de bloco. Estimativa da variância.

Quadrados de Youden

Similares aos quadrados latinos, mas o número de linhas, colunas e tratamentos não precisam ser iguais

Cada tratamento ocorre uma vez em cada linha. O número de tratamentos deve ser igual ao número de colunas. Os blocos são formados em relação a duas variáveis perturbadoras

Idêntico ao planejamento em quadrados latinos

26


Classificação do

Planejamento de

Experimentos


Hierárquico

Experimentos com vários fatores em que os níveis de um fator (B) são similares, mas não idênticos para diferentes níveis de outro fator (A). Ou seja, o n-ésimo nível de B quando A está no nível 1 é diferente do n-ésimo nível de B quando A está no nível 2 e assim por diante

Os níveis do fator B estão aninhados abaixo dos níveis do fator A

Estimativas comparações dos efeitos dos fatores. Estimativa da variância.

Superfície de resposta

O objetivo consiste em fornecer mapas empíricos ou gráficos de contorno. Estes mapas ilustram a forma pela qual os fatores, que podem ser controlados pelo pesquisador, influenciam a variável resposta

Os níveis dos fatores são vistos como pontos no espaço de fatores (muitas vezes multidimensional) no qual a resposta será registrada

Mapas que ilustram a natureza e a forma da superfície de resposta.

27

2.5 PLANEJAMENTO FATORIAL COMPLETO 2K

Dos planejamentos ilustrados no quadro 1, pode-se destacar o modelo dos

experimentos fatoriais. Para fazer um planejamento fatorial completo devemos

realizar experimentos (também chamados de ensaios) em todas as possíveis

combinações dos níveis dos fatores. Podemos dividir os planejamentos fatoriais

entre 2k, 3k, 4k e assim por diante, onde k representa o número de fatores

(MONTGOMERY, 1976).

Por exemplo um planejamento de 2 níveis com três variáveis é chamado de

planejamento 2³. Para realizar o chamado planejamento fatorial completo 2³, são

necessários então oito experimentos (2³ = 8), englobando todas as possibilidades

de ensaios, conforme mostrado na Tabela 2.2. Considerando efetuar um estudo do

rendimento de uma determinada reação química, onde um estudo prévio forneceu

três fatores que afetam a resposta: temperatura, catalisador e concentração. Foram

então selecionados os níveis dos fatores a serem estudados: I) Temperatura, entre

40ºC e 60ºC; II) Catalisador A e B; e III) Concentração dos reagentes entre 1,0M e

1,5M (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

Tabela 2.2 Matriz do planejamento fatorial completo 23.

Fatores Ensaio 1 2 3

1 - - -

2 + - -

3 - + - 4 + + - 5 - - +

6 + - +

7 - + + 8 + + + Fonte: (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

28

Nos planejamentos de dois níveis, costuma-se identificar os níveis superior e

inferior com os sinais (+) e (–), respectivamente. A atribuição desses sinais também

pode ser feita para os níveis dos fatores qualitativos. Em nosso exemplo, vamos

admitir que o nível (+) corresponde ao catalisador B. A escolha é arbitrária e não

afeta as conclusões. Suponha-se também que os oito ensaios foram realizados de

duplicatas, e a média dos mesmos geraram as seguintes respostas, descritas na

Tabela 2.3. Os ensaios estão dispostos na chamada ordem-padrão. Todas as

colunas começam com o nível (–) e depois os sinais vão se alternando. Um a um

na primeira coluna, depois dois a dois, e finalmente quatro sinais negativos e quatro

positivos na terceira coluna. Se houvesse um quarto fator, a coluna correspondente

teria oito sinais negativos e, em seguida, oito sinais mais, já que o número total de

fatores seria 16 (24=16). Para um planejamento com k fatores, a última coluna tem

2k-1 sinais negativos e depois 2k-1 sinais positivos. Assim, podemos escrever

facilmente a matriz de planejamento de qualquer fatorial de dois níveis, (BOX,

HUNTER, & HUNTER, 1978).

Tabela 2.3 Resultados da matriz experimental fatorial 23.

Fatores (-) (+)

1: Temperatura (°C) 40 60 2: Catalisador (tipo) A B 3: Concentração (M) 1 1,5

Ensaio 1 2 3 Rendimento (%) Média

1 - - - 56 52 54,0 2 + - - 85 88 86,5 3 - + - 49 47 48,0

4 + + - 64 62 63,0 5 - - + 65 61 63,0 6 + - + 92 95 93,5 7 - + + 57 60 58,5

8 + + + 70 74 72,0 Fonte: (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

29

2.5.1 CÁLCULOS DOS EFEITOS

A partir da matriz de planejamento pode-se formar a tabela de coeficientes de

contraste, interações entre os fatores estudados. Mas como construí-la. No

exemplo utilizado, ao fixar-se a concentração e utilizar o catalisador A, aumentando

a temperatura de 40°C para 60°C o rendimento de reação aumenta 32,5%.

Entretanto, ao se utilizar o catalisador B, o rendimento também aumenta, mas 15%.

Isso mostra que o efeito da temperatura, depende do nível em que o catalisador

está. Quando isto ocorre dizemos que as duas variáveis interagem (Neto,

Scarminio, & Bruns, 2010).

O chamado efeito principal de um fator é, por definição, a média dos efeitos deste

fator nos dois níveis dos demais fatores. Definimos portanto, que o efeito da

temperatura pode ser calculado da seguinte forma:

� = �� − �� ∴ ......(2)

� = (��)� − (��)

� ∴ ......(3)

� = (��,!��"�#",!�$%)� − (!��"�!�,!)

� = 22,875% ......(4)

Este valor indica que o rendimento da reação sobe 22,875%, em média, quando a

temperatura passa de seu nível inferior (40ºC) para o nível superior (60ºC). Este

cálculo pode ser feito de forma análoga para os outros fatores

Como visto anteriormente ao fixarmos a concentração efetuando um aumento na

temperatura para cada tipo de catalisador, obtemos diferentes resultados para a

resposta do rendimento. Com os dados obtidos podemos calcular o efeito da

temperatura interagindo com o tipo de catalisador, como sendo:

�+,- = − (.!"%,!)% = −17,5% ........(5)

30

Isso significa que quando trocamos o catalisador A pelo o catalisador B, o

rendimento cai 17,5% em média. Porém, como os três fatores interagem, deve-se

considerar o efeito de cada fator ao interagir com os outros, para não se precipitar

na interpretação do resultado. Para calcular o efeito entre a temperatura e o

catalisador levando-se em consideração também a concentração, é necessário

fazer a diferença entre a interação entre a temperatura e o tipo de catalisador, para

cada nível de concentração.

A partir deste ponto já é fácil notar que que quanto maior o número de variáveis,

mais sucessível a erros se torna o cálculo das interações. Para um planejamento

fatorial 2³ temos o equivalente a quatro tipos de interações possíveis entre os três

fatores (BOX, HUNTER, & HUNTER, 1978), teremos um total de 7 efeitos, 3 efeitos

principais dos fatores, temperatura, catalisador e concentração; três efeitos

correspondentes as interações temperatura e catalisador (12), temperatura e

concentração (13) e catalisador concentração (23); e um último efeito que é a

interação dos três fatores temperatura, catalisador e concentração (123); a Tabela

2.4 de contrastes a seguir, apresenta o nível dos efeitos de cada fator, níveis estes

que são calculados simplesmente multiplicando as colunas dos fatores em

interação.

Tabela 2.4 Coeficientes de contraste para um fatorial 23.

Fatores Interações Ensaio Média 1 2 3 12 13 23 123 1 + - - - + + + - 2 + + - - - - + + 3 + - + - - + - + 4 + + + - + - - - 5 + - - + + - - + 6 + + - + - + - - 7 + - + + - - + - 8 + + + + + + + +

Fonte: (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

Todas as colunas de efeitos na Tabela 2.4 têm quatro sinais positivos e quatro

sinais negativos. Isso significa que podemos interpretar qualquer efeito como a

diferença entre duas médias, cada uma contendo metade das observações. Assim

31

para facilitar as contas, é utilizada a chamada matriz de coeficientes de contraste

(MONTGOMERY, 1976). Começamos reescrevendo a matriz de planejamento para

os três efeitos principais 1 (temperatura), 2 (catalisador) e 3 (concentração).

0 123 1 � 4

5666666740 : 1,060 : 1,540 < 1,060 < 1,540 : 1,060 : 1,540 < 1,060 < 1,5=>

>>>>>?

=

56666667−1 −1 −1+1 −1 −1−1 +1 −1+1 +1 −1−1 −1 +1+1 −1 +1−1 +1 +1+1 +1 +1=>

>>>>>?

.......(6)

Acrescentando agora as colunas de interações, juntamente com a coluna

correspondente matriz identidade representada pela média, temos:

A�4�4�4�4

56666667+1 −1 −1 −1 +1 +1 +1 −1+1 +1 −1 −1 −1 −1 +1 +1+1 −1 +1 −1 −1 +1 −1 +1+1 +1 +1 −1 +1 −1 −1 −1+1 −1 −1 +1 +1 −1 −1 +1+1 +1 −1 +1 −1 +1 −1 −1+1 −1 +1 +1 −1 −1 +1 −1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1=>

>>>>>?

........(7)

Para calcular os efeitos a partir da matriz, escolhemos a coluna apropriada,

aplicamos seus sinais às respostas correspondentes (os rendimentos obtidos),

fazemos a soma algébrica e finalmente dividimos o resultado pela metade da

quantidade de ensaios. No caso de um planejamento 2³ que contém oito ensaios,

divide-se a soma algébrica por quatro. Com exceção da coluna I (matriz identidade),

que representará a média das respostas e, portanto, deve ser dividido pelo número

exato de ensaios, no caso, oito (MONTGOMERY, 1976).

32

Por exemplo, para o efeito de interação entre o catalisador (2) e a concentração

(3), tomamos a sexta coluna da matriz, e aplicamos os sinais as correspondentes

ao vetor coluna de respostas do rendimento de cada ensaio:

23

56666667+1+1−1−1−1−1+1+1=>

>>>>>?

.......(8)

56666667�1�2�3�4�5�6�7�8=>

>>>>>?

=

5666666754,086,548,063,063,093,558,572,0=>

>>>>>?

.......(9)

Assim concluindo o cálculo efeito da interação temos:

�4 = ��.��%�"��!��$�� ∴ .......(10)

�4 = �!�,D��,!��,D�",D�",D#",D�!�,!�$%,D� = 0,9% ........(11)

De forma análoga pode-se calcular os efeitos para as demais interações. Os efeitos

estão expressos na Tabela 2.5.

33

Tabela 2.5 Efeitos calculados para o planejamento fatorial 23.

Média 67,3 Efeitos principais: 1 (Temperatura) 22,9 2 (Catalisador) -13,9 3 (Concentração) 8,9

Interações de dois fatores: 12 -8,6 13 -0,9 23 0,9

Interações de três fatores: 123 0,1

Fonte: (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

Todavia podemos tomar um outro caminho para determinar os efeitos do

experimento de forma diferente, transformando a tabela de coeficientes de

contraste em uma matriz X, podendo calcular todos os efeitos, exceto pelos

divisores fazendo o produto Xty, onde y é o vetor coluna contendo os rendimentos

médios dos ensaios como colocado anteriormente. Realizando este procedimento

ao obtermos a matriz Xty e a dividirmos por oito para a média e por 4 para os demais

fatores e interações, é possível obter o vetor dos efeitos em um vetor coluna, na

mesma ordem das colunas da matriz X (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

2.5.2 ESTIMATIVA DO ERRO

Com as observações individuais sendo realizadas em replicatas, pode-se usar os

resultados das observações para estimar o erro experimental, e com isso avaliar a

significância estatística dos efeitos. Para evitar a ocorrência de distorção estatística

no s resultados, causados por exemplo, por condições externas que podem

influenciar no experimento, devemos fazer aleatorização dos ensaios. Esta

aleatorização é um princípio experimental muito importante que ajuda a impedir que

fatores indesejáveis, dos quais não estamos cientes, contaminem os efeitos que

queremos investigar (Hines, Montgomery, Goldsman, & Borror, 2006). Podemos

34

simplesmente realizar um sorteio da sequência de realização dos ensaios. A seguir

estão representadas as equações pertinentes para o cálculo do erro padrão dos

efeitos e média a partir da estimativa da variância experimental (12), para um

experimento realizado com (N) ensaios duplicados, onde (di) é a diferencia entre

os resultados das observações para uma mesma configuração. Assim o erro (s) de

cada efeito pode ser calculado obtendo-se a raiz quadrada da variância

experimental.

E� = ∑ GH�%I .......(12)

E(JKJL3M) = NO�% ........(13)

E(Pé�L2) = �. NO�% ......(14)

2.5.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS E MODELO ESTATISTICO

Algumas conclusões que podemos retirar da Tabela 2.5 são: I) Elevando a

temperatura aumentamos o rendimento da reação; II) Esse efeito é muito mais

pronunciado com o catalisador A do que com o catalisador B; e III) Quando a

concentração é aumentada de 1,0M para 1,5M, ocorre um aumento médio de cerca

de 9% no rendimento e não há evidência que de que esse aumento dependa dos

níveis de outras variáveis, já que as interações 13, 23 e 123 são muito baixas.

Além de todas as informações possíveis que podemos retirar da análise dos efeitos

de interação, serão exatamente esses efeitos de interação que possibilitarão a

montagem do modelo estatístico. Este modelo é usado para descrever as respostas

de um planejamento fatorial, formulado em termos dos efeitos por unidade de x1,

x2 e x3. Para um planejamento 2³, a resposta observada no nível (x1, x2, x3) é

35

considerada como uma variável aleatória y(x1, x2, x3) (MONTGOMERY, 1976),

expressada da seguinte forma:

�(S., S%, S") = TD + T.S. + T%S% + T"S" + T.%S.S% + T."S.S" + T%"S%S" + T.%"S.S%S"

........(15)

Onde b0 é o termo independente e corresponde à média das respostas do

planejamento; b1, b2 e b3 são os valores populacionais dos três efeitos principais

por unidade de x1, x2 e x3, que é a metade dos efeitos principais; e b12, b13, b23 e

b123 são os valores populacionais dos efeitos de interação por unidade de x1, x2 e

x3, que também é a metade dos valores dos efeitos de interação (MONTGOMERY,

1976). Assim utilizando os dados já obtidos, Tabela 2.5 é gerado então o modelo

estatístico deste experimento:

�(S., S%, S") = 67,3 + 11,4S. − 6,9S% + 4,4S" − 4,3S.S% − 0,4S.S" + 0,4S%S" + 0,1S.S%S"

.......(16)

Vale ressaltar que para determinarmos os coeficientes exatos precisaríamos

realizar um número infinito de experimentos, algo que não faz parte da metodologia

do planejamento fatorial. O que foi calculado a partir dos resultados dos oito

experimentos em duplicata nada mais é do que uma estimativa desses valores, ou

seja, amostras (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

Com o modelo estatístico, podemos estimar a resposta com base na variação dos

fatores dentro de certo desvio padrão. É possível também estimar quais os níveis

dos fatores que geram a maior resposta, caso seja de interesse aperfeiçoar o

processo (Leardi, 2009).

36

2.5.4 ANÁLISE DA VARIÂNCIA

Após determinado o modelo para o comportamento das variáveis sobre a resposta,

cabe a examinar os resíduos do mesmo, e assim avaliar a qualidade do ajuste do

modelo estatístico. Em primeiro lugar, os resíduos devem ser pequenos, pois, se

um determinado modelo deixa resíduos consideráveis, é muito provável que o

mesmo não está adequado às observações. Em um modelo ideal, as predições

sempre irão coincidir exatamente com as respostas observadas, e não haveria

resíduo nenhum. O método mais utilizado para avaliar numericamente a qualidade

do ajuste de um modelo é a análise da variância.

Segundo (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010) a análise começa com a decomposição

algébrica dos desvios das respostas observadas em relação a resposta global, e o

desvio de uma resposta individual em relação à média de todas as respostas

observadas (�U − ��), pode ser decomposto em duas parcelas.

(�U − ��) = (�VW − ��) + (�U − �VW) ......(17)

A primeira parcela, representa o desvio da previsão feita pelo modelo para o ponto

em questão, �VW , em relação à média global, ��. A segunda parcela é a diferença entre

o valor observado e o valor previsto. Num modelo bem ajustado, essa segunda

diferença deve ser pequena. Isso equivale a dizer, que o desvio (�VW − ��) deve ser

aproximadamente igual ao desvio (�U − ��), em outras palavras equivale dizer que

as predições estão em boa concordância com as observações.

O segundo passo é expressar esta comparação de desvios em termos

quantitativos. Para isso elevamos a equação (17) ao quadrado e em seguida

fazemos o somatório sobre todos os pontos:

X(�U − ��)% = X[(�VW − ��)% + (�U − �VW)%]% ∴

37

= ∑[(�VW − ��)% + 2 ∑(�VW − ��)(�U − �[U) + ∑(�U − �[U)% ∴

A partir de arranjos é possível modificar a da equação, e representa-la como a

equação (18)

∑(�U − ��)% = ∑(�VW − ��)% + ∑(�U − �VW)%.....(18)

Estas somas de quadrados de desvios costumam ser chamadas de somas

quadráticas, ou, abreviadamente, SQ. Assim, podemos expressa-la da seguinte

forma:

[\]^_`abcade_édfe(\]g)] = [\]d^hfdeàb^jb^kkãa(\]m)] + [\]b^kfdneo(\]p)] É evidente, que quanto maior for a fração descrita pela regressão, melhor será o ajuste do

modelo, o que podemos quantificar por meio da razão:

q% = rstrsu

= ∑(�[H��)�∑(�H��)� .......(19)

R2 é chamado de coeficiente de determinação do modelo, sendo que seu valor

máximo é igual a 1, e terá este valor caso não haver resíduo nenhum, ou seja, toda

variação em torno da média é explicada pela regressão. Assim podemos dizer que

quanto mais próximo de 1 melhor terá sido o ajuste ao modelo. Se por exemplo,

com as respostas obtidas em um determinado experimento ao se aplicar a equação

(19) para os dados obtidos e obtermos, um valor de 0,9878, isto significa que

98,78% da variação total em torno da média das observações é explicada pela

38

regressão. A soma quadrática residual, \]p, representa a parte da variação das

respostas em torno da média que o modelo não consegue representar.

A cada soma quadrática está associado um certo número de graus de liberdade,

que indica quantos valores independentes envolvendo as n observações, são

necessárias para determina-la, isso significa que que para os n desvios, o número

de graus de liberdade é (n-1) (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

Em um caso geral de um modelo com p parâmetros, o número de graus de

liberdade da soma quadrática residual é dado pela diferença entre o número de

observações e o número de parâmetros estimados, isto é, (n-p). Uma vez que, os

graus de liberdade para a soma quadrática total é (n-1) (MONTGOMERY, 1976).

Para satisfazer a relação de graus de liberdade para a equação (18) o número de

graus de liberdade devida a regressão tem de ser igual ao número de parâmetros

menos 1, ou seja, (p-1).

Exemplificando o que foi apresentado nesta seção, para realizar-se a análise de

variância de um modelo com dois parâmetros pode-se construir a Tabela 2.6, tabela

de análise da variância para o ajuste de um modelo linear, também conhecida como

tabela da ANOVA. A última coluna da tabela representa as médias quadráticas, que

é calculada dividindo-se a soma quadrática pelo seu respectivo grau de liberdade.

Tabela 2. 6 Tabela da ANOVA.

Fonte de variação

Soma quadrática

Nº de g.l.* Média quadrática

Regressão

X(�[U − ��)% v − 1 w]m = \]mv − 1

Resíduos X(�U − �VW)% c − v w]p = \]pc − v = k%

Total X(�U − ��)% c − 1

*g.l. – Graus de liberdade. Esquema de (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

39

2.5.5 TESTE DE SIGNIFICÂNCIA ESTATISTICA

Em problemas de regressão linear múltipla, certos testes de hipóteses sobre os

parâmetros do modelo são úteis para verificar a adaptabilidade do modelo, assim

fazendo-se uso das médias quadráticas é possível testar se a equação de

regressão é estatisticamente significativa, através do teste-F. Que nada mais é do

que uma relação estre as médias quadráticas obtidas pela ANOVA.

Fy.,zy ≈ |}~|}� (20)

onde p-1 e n-p,são os números de graus de liberdade da média quadrática da

regressão e da média quadrática residual, respectivamente.

Primeiramente é necessário saber qual é o valor do nível de significância adotado,

valor este que indica a probabilidade de se rejeitar uma hipótese nula, em um teste

de hipótese, quando a mesma for verdadeira. Os níveis de significância mais

utilizados são 5%, 0.1%, 1% e 10%, supondo um nível de significância de 5% temos

um nível de confiança de 95%. Uma vez realizado o cálculo de (Fy.,zy), a partir

da equação (20), busca-se na tabela F (ANEXO B), o valor do ponto da distribuição

F tabelado, no nível de confiança adotado. Caso o valor calculado seja maior do

que o tabelado, significa que o modelo é altamente significativo, entretanto nem

sempre uma regressão dada como significativa é útil para realizar previsões. Pois,

pode acontecer que a faixa de variação coberta pelos fatores estudados seja

pequena, fazendo com que o efeito sobre a resposta fique mascarado pela

extensão do erro experimental. Dessa forma adota-se como uma regra pratica

considerar a regressão como útil para fins de previsão se o valor, for pelo menos,

cerca de dez vezes o valor tabelado (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

40

2.6 METODO DE DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES EM CEREAIS MATINAIS

Na descrição do método da (CPW), o açúcar é extraído a partir da amostra por

agitação com água. O material sólido é removido por filtração por gravidade. A

solução aquosa, que contém os açúcares dissolvidos, é diluída com acetonitrila. A

acetonitrila precipita amidos e proteínas, e fornece compatibilidade com a fase

móvel. A solução diluída é então injetada numa coluna de CLAE. Os grupos

funcionais polares dos açúcares criam vínculos com os sites NH2 no enchimento

da coluna, conforme eles viajam através da coluna. Em geral, os açúcares menores

(monossacarídeos) fluem mais rápido do que os açúcares de maior dimensão

(dissacarídeos e trissacarídeos), devido ao número de sítios polares sobre as

diferentes moléculas. A mudança no índice de refracção (IR) da fase móvel com

açúcares é monitorado pelo detector de IR e é apresentada como picos no sistema

de aquisição de dados. As alturas de pico da solução de amostra são comparadas

com as alturas de pico de uma solução padrão de açúcar para calcular a

concentração de açúcar no extrato diluído. Esta solução padrão contém os cinco

açúcares que podem estar presentes em uma amostra de cereal matinal. Dentre

eles frutose, glicose, sacarose, maltose e lactose.

41

3 METODOLOGIA

A desenvolvimento do experimento será realizado em duas etapas. Na primeira

etapa foram realizados ensaios, com replicadas, variando os parâmetros do

equipamento de CLAE de acordo com a matriz experimental adotada, parâmetros

estes que são fundamentais e determinantes na separação dos açúcares presentes

nas amostras de cereais. Estes ensaios serão realizados, a fim de fornecer dados

da variável resposta mais eficientes para a análise. Neste estudo, a abordagem do

processo mais eficiente entende-se como o processo mais rápido na obtenção de

resultados, ou seja, o ensaio que apresentar um menor tempo de retenção na

coluna cromatográfica durante a análise dos cinco açúcares utilizados no ensaio.

No equipamento de CLAE, foram testadas a variáveis, fluxo de fase móvel,

temperatura da coluna de separação e proporção volumétrica da fase móvel. Para

isto será aplicado um planejamento fatorial 23 em dois níveis para cada fator. Assim,

foi analisado o tempo de separação e resolução no cromatograma gerado no

software do equipamento de CLAE a partir dos ensaios realizados com a solução

padrão de açúcar, para o estudo que foi realizado com enfoque na redução de

tempo de análise.

Na segunda etapa os dados coletados foram analisados, através de ferramentas

estatísticas, e assim foram definidas as melhores condições de análise para

alcançar o fim maior deste projeto, que é otimizar o tempo de análise, de açúcar

em cereais matinais, por cromatografia liquida de alta performance. Utilizando-se o

software excel para obtenção de gráficos e modelos matemáticos a partir dos dados

coletados na primeira etapa do projeto. Analisando-se a influência das variáveis de

entrada sobre a resposta, assim como a influência da interação das entradas na

resposta. Os resultados obtidos ao final da nova configuração paramétrica foram

comparados com os resultados obtidos na configuração anterior ao projeto. Sendo

analisado o tempo de separação e resolução a partir do cromatograma gerado no

software do equipamento de CLAE.

42

Uma vez que antes do planejamento, já se tem condições dos parâmetros

estabelecidas que estão sendo utilizadas com os valores fixos e que as respostas

em seus valores médios são conhecidas. Neste momento, como saber se seria

possível melhorar o tempo de analise, escolhendo outros níveis para os fatores,

fluxo de fase móvel (x1), proporção volumétrica da fase móvel (x2) e temperatura

da coluna (x3)?

Conhecendo as condições habituais de funcionamento do processo e usando o

planejamento fatorial completo 23, tem-se como ponto inicial escolher as condições

que margeiam estas condições habituais.

Figura 3.1 Planejamento para três fatores. As bolas cinzas são a parte cúbica – os ensaios de um fatorial 23.

Esquema modificado de (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010).

A partir deste momento, realizando uma análise sobre as respostas obtidas a partir

dos ensaios, cada fator e suas interações serão estudados, e utilizando-se do

ferramental estatístico, será possível estabelecer um modelo estatístico adequado

que represente a influência dos fatores sobre a resposta (tempo de análise em CLA-

IR).

43

4 RESULTADO E DISCUSSÃO

Como descrito na metodologia de preparo das soluções empregadas na análise

CLAE. A solução padrão de açúcar foi devidamente preparada com uma

concentração conhecida e suficientemente adequada aos níveis detecção prevista

em CLAE, como elucidado na Tabela 2.1. Segundo (SKOOG, HOLER, & NIEMAN

, 2009), o tempo de retenção de componentes analisados em CLAE está

relacionado, com diversos fatores entre eles a preparação de fase móvel, bem

como os outros fatores, entretanto como o foco está na execução da análise no

equipamento, as duas fases móvel foram preparadas seguindo o mesmo

procedimento a fim de não produzirem efeitos na variável resposta devido ao

preparo.

Uma vez aplicado o delineamento fatorial completo com três fatores em dois níveis

diferentes conforme tabela a seguir, torna-se possível estudar os efeitos dos fatores

e analisar se entre eles há interações. Os valores para cada variável em um

determinado nível estão expressos na Tabela 4.1.

A fim de simplificar na ilustração dos níveis das variáveis, os dois níveis, alto e baixo de cada variável foram codificados em com sinais (+) e (-) respectivamente.

Tabela 4.1 Matriz experimental fatorial proposta. Fonte: (Próprio autor, 2014)

Fatores (-) (+) F Fluxo Fase Móvel (ml/min) 1 2

P Proporção Fase Móvel

(v/v) 70/30 80/20 T Temperatura Coluna(°C) 25 35 Ensaio F P T Tempo (min) 1 - - - 2 + - - 3 - + - 4 + + - 5 - - + 6 + - + 7 - + + 8 + + +

44

Realizados os ensaios de forma aleatorizada, a partir do sorteio na ordem de

execução das condições estabelecidas, a fim de prevenir tendências na variável

resposta, e realizando cada ensaio em duplicata, chegou-se nos seguintes

resultados.

Os ensaios após sorteio foram realizados duplicata e a ordem de realização do

ensaio está entre parênteses representado na tabela a seguir.

Tabela 4.2 Resultados da matriz 23do experimento realizado.

Fatores (-) (+)

F Fluxo Fase Móvel

(ml/min) 1 2

P Proporção Fase Móvel

(v/v) 70/30 80/20

T Temperatura Coluna (°C) 25 35

Ensaio F P T Tempo (min) Média 1 - - - 10,444(4) 10,498(9) 10,471 2 + - - 5,552(10) 5,591(3) 5,572 3 - + - 28,134(1) 28,099(2) 28,117 4 + + - 14,129(13) 14,121(14) 14,125 5 - - + 9,132(11) 9,107(5) 9,120 6 + - + 4,638(6) 4,616(12) 4,627 7 - + + 21,912(8) 21,923(15) 21,918 8 + + + 11,941(16) 11,933(7) 11,937 Fonte: (Próprio autor, 2014)

Antes de iniciar a análise dos efeitos e influência dos fatores, foi realizada uma

verificação dos cromatogramas gerados em cada ensaio, afim de garantir que todos

ou pelo menos a maior parte dos ensaios sejam admissíveis do ponto de vista

quantitativo.

A resolução em cromatografia em coluna, é calculada a partir da distância que

separa os pontos máximos dos picos e da média das larguras de suas respectivas

bases. Assim a partir dos ensaios realizados foi possível verificar a resolução dos

picos gerados nos cromatogramas gerados pelo sistema de detecção do

45

equipamento de CLAE. A Tabela 4.3 foi construído com os níveis de resolução

entre os picos gerados durante a análise.

Foi evidenciado que todos os ensaios, com exceção do 2 e 5, apresentam níveis

aceitáveis para quantificação dos açúcares presentes na amostra de acordo com a

literatura, sendo que a maior parte dos mesmos apresentam resolução acima de

1,25.

Tabela 4. 3 Resolução no cormatograma dos ensaios .

Resolução

Ensaio Frutose-Glicose

Glicose-Sacarose

Sacarose-Maltose

Maltose-Lactose

1 1,03 1,42 2,11 1,08 2 0,53 1,29 1,22 0,96 3 1,12 3,24 2,55 1,97 4 1,31 3,55 2,59 1,95 5 0,89 1,98 1,34 1,00 6 1,10 1,82 1,54 1,06 7 1,51 4,55 3,41 2,27 8 1,70 5,53 2,01 1,89

Fonte: (Próprio autor, 2014)

A partir da Tabela 2.4 Coeficientes de contraste para um fatorial 23, é possível

construir a Tabela 4.4. Utilizando os conceitos descritos anteriormente para

determinação dos efeitos principais. Sendo os cálculos de um fator, nada mais do

que a diferença entre as médias em cada nível.

Uma vez que o efeito de uma variável de entrada depende do nível de outra

variável, pode-se dizer que as duas variáveis interagem, e podemos também

calcular o valor do efeito de interação entre elas. (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

Além do mais, a partir dos resultados obtidos em duplicatas podemos neste

momento definir a estimativa da variância experimental e subsequentemente o erro

padrão que serão aplicados aos efeitos que irão compor o modelo estatístico. Para

isso foram utilizadas as equações (12), (13) e (14).

46

Tabela 4. 4 Efeitos calculados para o experimento realizado.

Média 13,236 ± 0,007

Efeitos principais: F Fluxo Fase Móvel (ml/min) -8,341 ± 0,015 P Proporção Fase Móvel (v/v) 11,577 ± 0,015 T Temperatura Coluna (°C) -2,671 ± 0,015

Interações de 2ª ordem: FP -3,645 ± 0,015 FT 1,105 ± 0,015 PT -1,523 ± 0,015

Interações de 3ª ordem:

FPT 0,901 ± 0,015 Fonte: (Próprio autor, 2014)

É possível observar a partir dos efeitos principais que os fatores que mais

influenciam na variável resposta, são proporção da fase móvel seguido do fluxo da

fase móvel. Temperatura da coluna e a interação de segunda ordem (FP), formam

uma parcela que ainda pode ser considerável na variável resposta, entretanto, as

respectivas interações de segunda ordem (FT) e (PT), bem como a interação de

terceira ordem (FPT) aparentemente não contribuem na resposta devido aos seus

baixos efeitos. Isso nos permite evidenciar que a temperatura pode ser interpretada

isoladamente, pois não há interação desse fator com os demais, ou seja, existe

uma alteração pouco significativa no resultado devido a ação da temperatura sobre

os fatores relacionados à fase móvel (Fluxo e proporção da fase móvel). Porém,

podemos avaliar os efeitos e assim determinar a melhor configuração para cada

efeito, uma vez que, os efeitos produzidos pelas variáveis (F) e (P) apresentam

uma grande diferença na variável resposta para determinados níveis de trabalho.

47

Gráfico 4.1 Análise das médias dos fatores nos níveis baixo e alto. Fonte: (Próprio autor, 2014)

Como o objetivo é reproduzir uma análise com baixo tempo possível, a partir do

Gráfico 4.1, podemos observas que a melhor condição dos fatores (F) e (T) estão

no nível alto e o fator (P) no nível baixo.

Tabela 4. 5 Melhor configuração para os fatores

Fatores Melhor Configuração F Fluxo Fase Móvel (ml/min) Nível Alto

P Proporção Fase Móvel (v/v) Nível Baixo T Temperatura Coluna (°C) Nível Alto Fonte: (Próprio autor, 2014)

Contudo, todas as resposta e predições expostas até o momento serão avaliadas

ao realizar o teste da ANOVA para confirmação dos prognósticos e verificação da

veracidade do modelo estatístico construído, em variáveis codificadas, a partir dos

resultados obtidos até este ponto.

Tendo a interação de 3ª ordem produzido um efeito baixo, sua utilização como parte

do erro experimental contribuirá na avaliação do modelo proposto e das

contribuições dos fatores e interações de 2ª ordem no modelo.

�(S� , S�, Sg) = 13,236 − 8,341S� + 11,557S� − 2,671Sg − 3,645S�S� + 1,105S�Sg − 1,523S�Sg + 0,901S�S�Sg

F; 17,41

F; 9,07P; 7,45

P; 19,02

T; 14,57

T; 11,90

7,00

9,00

11,00

13,00

15,00

17,00

19,00

-1 1

Tem

po

da

anál

ise

(min

)

48

Para a análise da ANOVA e verificação da regressão do modelo proposto

montamos a partir da Tabela 4.2 o Quadro 4.1, que mostra os resultados obtidos

para os 3 fatores tratados nos 8 experimentos em duplicata. A partir deste quadro

é possível extrair alguns dados necessários para os cálculos da ANOVA para os

fatores e suas interações.

F= + F= -

T= + T= - T= + T= -

P= + 11,941 14,129 21,912 28,134

11,933 14,121 21,923 28,099

P= - 4,638 5,552 9,132 10,444

4,616 5,591 9,107 10,498 Quadro 4. 1 Resultados dos experimentos expressos em minutos. Fonte: (Próprio autor, 2014)

Os quadros a seguir, serão utilizados para construção da ANOVA dos fatores e

suas interações do experimento a partir das equações apresentadas no Quadro 4.2

Resumo da formulação utilizada, onde f,p,t são os números de níveis dos fatores

respectivos fatores F,P,T e n são o número de réplicas aplicada ao experimento.

Neste experimento todos igual a 2.

Soma de todos os resultados ao Quadrado

] = X X X X ��g�%

Soma dos quadrados Total \]�a` = ] − �a`%

�. v. `. c

Soma dos quadrados do fator (F) \]� = ��.% + ��%% + ⋯ + ��%

v. `. c − �a`%�. v. `. c

Soma dos quadrados do fator (P) \]� = ��.% + ��%% + ⋯ + ��%

�. `. c − �a`%�. v. `. c

Soma dos quadrados do fator (T) \]� = �g�.% + �g�%% + ⋯ + �g�-%

�. v. c − �a`%�. v. `. c

Soma dos quadrados da interação (FP) \](��) = ��.% + ��%% + ⋯ + ��%

`. c − �a`%�. v. `. c − \]� − \]�

Soma dos quadrados da interação (FT) \](��) = ��g�.% + ��g�%% + ⋯ + ��g��-%

v. c − �a`%�. v. `. c − \]� − \]�

Soma dos quadrados da interação (PT) \]�(��) = ��g�.% + ��g�%% + ⋯ + ��g��-%

�. c − �a`%�. v. `. c − \]� − \]�

Soma dos quadrados da interação (FPT) \](��) = ��g�.% + ��g�%% + ⋯ + ��g��-%

c − �a`%�. v. `. c − \]� − \]�

− \]� − \](��) − \](��) − \](��) Quadro 4. 2 Resumo da formulação utilizada. (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010)

49

Os quadros a seguir mostram as médias das duplicatas dos ensaios, ilustrados a cada nível codificado, das variáveis entrada e suas possíveis interações.

F= + F= -

T= + T= - T= + T= -

P= + 23,874 28,25 43,835 56,233 P= - 9,254 11,143 18,239 20,942

Quadro 4. 3 Soma dos resultados das réplicas do experimento. Fonte: (Próprio autor, 2014)

F= + F= - TP

P= + 52,124 100,068 152,192

P= - 20,397 39,181 59,578

TF 72,521 139,249 211,77 Quadro 4. 4 Soma dos resultados da combinação FP. Fonte: (Próprio autor, 2014)

T= + T= - TF F= + 33,128 39,393 72,521 F= - 62,074 77,175 139,249 TT 95,202 116,568 211,77

Quadro 4. 5 Soma dos resultados da combinação FT. Fonte: (Próprio autor, 2014).

T= + T= - TP

P= + 67,709 84,483 152,192

P= - 27,493 32,085 59,578

TT 95,202 116,568 211,77 Quadro 4. 6 Soma dos resultados da combinação PT. Fonte: (Próprio autor, 2014)

Uma vez que um modelo matemático de 1ª ordem apresenta um erro muito

pequeno, considerou-se para fins de cálculos que o efeito de menor magnitude

como parte do erro produzido pelo modelo. Dessa forma é possível analisar o

modelo com um pouco mais de fidelidade ao que acontece na realidade.

Estabelecido o nível e significância (α), igual a 0,05 (5%), determina-se o Fcritico ,

no ANEXO B, que relaciona os resultados da distribuição esperada para o

experimento. Para encontrar o valor de Fcritico para cada fonte de variação tomou-

se no número de graus de liberdade da fonte de variação como coluna da tabela,

50

(ANEXO B), e o número de graus de liberdade do erro como linha. A partir dos

quadros de resultados apresentados anteriormente foi possível calcular, com a

utilização do formulário apresentado anteriormente, o valor de Fcalc para cada fator

ou interação do experimento.

Assim foi possível avaliar e confirmar a inferência em relação às variáveis que

tomam parte importante para compor a resposta que compõem o modelo estatístico

proposto. Sendo realmente as interações (FT), (PT) e (FPT) desnecessárias na

composição do modelo, uma vez que o mesmo esta desprovido de ajustes para

torna-lo mais real.

Tabela 4. 6 ANOVA dos fatores e interações do experimento.

ANOVA

FONTE DE VARIAÇÃO

SOMA DOS QUADRADOS

GRAUS DE LIBERDADE

MÉDIA QUADRATICA

Fcalc.

F 278,289 1 278,289 77,1

P 536,085 1 536,085 148,6

T 28,532 1 28,532 7,9

FP 53,144 1 53,144 14,7

FT 4,880 1 4,880 1,4

PT 9,275 1 9,275 2,6

FPT 3,247 1 1 1 3,247 1

ERRO 0,004 3,251 8 9 0,36119 3,608

TOTAL 913,455 15 Fcritico (0,05;1;9)= 5,12 Fonte: (Próprio autor, 2014)

É possível concluir que a variável que mais contribui no tempo na análise por CLAE

é proporção de fase móvel seguida do fluxo da fase móvel. Com o objetivo de

chegar a uma configuração que possibilite uma análise em menor tempo, sem

produzir erros quanto a detecção dos analitos, no caso sobreposição de picos,

toma-se como condição propicia para o resultado esperado uma configuração em

que fase móvel seja injetada no sistema com fluxo de 2,0 ml/min e uma composição

de 70/30 de acetonitrila e água. A temperatura também pode ser mantida a 35° C,

melhor configuração para esta variável, mesmo não produzindo tanto efeito no

tempo de análise.

51

Realizada em duplicata os ensaios na condição acima obteve-se resultados de

4,255 e 4,320 min, muito parecidos com o predito pelo modelo e obtido nos ensaios

com diferenças de poucas dezenas de segundos em relação entre um e outro. Esta

condição se torna mais favorável do que a condição inicial, uma vez que, os tempos

médios das análises eram de 13,2 min, com uma configuração em que o sistema

operava com fluxo de 1,5 ml/min e uma composição de 75/25 de acetonitrila e água

e temperatura mantida a 30° C.

�(S� , S� , Sg) = 13,236 − 8,341S� + 11,557S� − 2,671Sg − 3,645S�S�

Para confirmar que o modelo estatístico está adequado ao experimento, ou seja,

se é possível fazer inferências a partir do mesmo, a ANOVA a seguir elucida uma

análise do modelo considerando somente as fontes de variação que foram julgadas

como componentes do modelo. Dessa forma foi possível notar que o coeficiente

regressão é igual a 0,98095 isto significa que 98,095% da variação total em torno

da média das observações é explicada pela regressão, o que torna o modelo

aceitável ao experimento.

Tabela 4. 7 ANOVA para a regressão do modelo estatístico.

FONTE DE VARIAÇÃO

SOMA DOS QUADRADOS

GRAUS DE LIBERDADE

MÉDIA QUADRATICA Fcalc.

F critico (0,05;5;10)

REGRESSÃO 896,049 3 298,683 205,9 F crit. = 3,33 Resíduo 17,405 12 1,450 TOTAL 913,455 15 R2 = 0,98095

Fonte: (Próprio autor, 2014)

Uma vez que para fins quantitativos a condição proposta é viável torna-se vantajoso

estabelecer esta condição como um ponto de melhoria na análise de

monitoramento de açúcares por cromatografia liquida de alta performance em

cereais matinais no laboratório no equipamento estudado.

52

5 CONCLUSÃO

A metodologia fatorial completo empregada na determinação das influencias dos

fatores estudados se mostrou aplicável frente as limitações de tempo e custo,

fatores que muitas vezes são limitantes na rotina de uma fábrica. Uma vez que para

sua execução não foram ocupadas mais do que 7 horas entre o início e finalização

dos ensaios do experimento. Conclui-se que, um experimento bem planejado e bem

interpretado após sua execução, o trabalho experimental passa a ser apenas uma

etapa que se bem realizada, pode proporcionar economia de tempo e dinheiro no

estudo de um processo a ser avaliado. Assim pode-se conhecer melhor a análise

de açúcares por CLAE e determinar sua condição de trabalho que ofereça uma

redução no tempo de análise e consequentemente tempo e custo de operação da

mesma.

53

6 OPORTUNIDADES

6.1 DELINEAMENTO CENTRAL COMPOSTO ROTACIONAL

Seguindo a metodologia de planejamento de experimentos. Uma oportunidade para

dar continuidade ao trabalho, seria a realização de um delineamento central

composto rotacional (DCCR). Uma vez que, o objetivo principal deste trabalho a

determinação, a partir das observações, da variável resposta (tempo de análise)

em função das modificações nas variáveis de entrada escolhidas (fluxo de fase

móvel, proporção da fase móvel e temperatura da coluna de separação) realizadas

durante a série de ensaios, poderíamos adicionar a estes ensaios mais alguns

ensaios a fim de fornecer uma análise mais encorpada sobre a relação entre as

variáveis de entrada e saída. Segundo (Neto, Scarminio, & Bruns, 2010), o DCCR

é um delineamento simétrico e de segunda ordem, e é constituído de duas partes:

um experimento preliminar fatorial 2k, com um número arbitrário de pontos centrais,

e a composição axial. Indicado a planejamentos com número pequeno de fatores

(geralmente 4). Aplicando-se DCCR, é possível analisar os efeitos dos fatores nas

respostas desejadas e determinação das condições ótimas, através da obtenção

dos modelos matemáticos de segunda ordem que representam o processo, e são

mais fiéis à variável respostas, em relação aos de primeira ordem, pois apresento

um ajuste melhor e com isso um menor desvio da realidade. Com isso é possível

construir superfícies de resposta e curvas de contorno que determinam regiões de

condições ótimas e não pontos específicos, ou seja, o analista tem regiões de

trabalho ótimas para cada fator, da mesma forma que o experimento preliminar,

mas com um melhor ajuste à realidade e com apenas alguns experimentos a mais.

54

6.2 IMPACTOS DO PROJETO

Apesar de não contemplado no escopo do projeto, não pode-se deixar de elucidar

os impactos positivos e/ou negativos oriundos do projeto. De uma forma

subentendida o processo de otimização de um processo gera por si só, uma

melhoria ou uma economia, seja ela financeira ou de recursos humanos, ou muitas

vezes ambas. Desta forma com a nova condição de operação do sistema de CLAE

obteve-se uma redução de 66% no tempo de análise a partir do momento que a

mesma é injetada no sistema isto representa uma economia de cerca de 38% no

tempo de obtenção do resultado, se considerar o equipamento fora da condição de

equilíbrio. Também representa uma redução no consumo de reagentes da fase

móvel e consequentemente uma redução na frequência de preparo da mesma,

disponibilizando um tempo útil ao analista.

É possível identificar diversos pontos prós que o projeto proporcionou com um baixo

investimento de recursos humanos e financeiro. Dessa forma fica a oportunidade

de realizar um levantamento dos custos envolvidos no projeto e o impacto gerado

pelo mesmo.

55

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WERKEMA, M., & AGUIAR, S. (1996). Planejamento e análise de experimentos: como identificar as principais variáveis influentes em um processo. Belo Horizonte: Ufmg.

57

ANEXOS

ANEXO A – TABELA DISTRIBUIÇÃO F, α=0,1. gl Graus de liberdade no numerador

denom. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 39,86 49,50 53,59 55,83 57,24 58,20 58,91 59,44 59,86 60,19

2 8,53 9,00 9,16 9,24 9,29 9,33 9,35 9,37 9,38 9,39

3 5,54 5,46 5,39 5,34 5,31 5,28 5,27 5,25 5,24 5,23

4 4,54 4,32 4,19 4,11 4,05 4,01 3,98 3,95 3,94 3,92

5 4,06 3,78 3,62 3,52 3,45 3,40 3,37 3,34 3,32 3,30

6 3,78 3,46 3,29 3,18 3,11 3,05 3,01 2,98 2,96 2,94

7 3,59 3,26 3,07 2,96 2,88 2,83 2,78 2,75 2,72 2,70

8 3,46 3,11 2,92 2,81 2,73 2,67 2,62 2,59 2,56 2,54

9 3,36 3,01 2,81 2,69 2,61 2,55 2,51 2,47 2,44 2,42

10 3,29 2,92 2,73 2,61 2,52 2,46 2,41 2,38 2,35 2,32

11 3,23 2,86 2,66 2,54 2,45 2,39 2,34 2,30 2,27 2,25

12 3,18 2,81 2,61 2,48 2,39 2,33 2,28 2,24 2,21 2,19

13 3,14 2,76 2,56 2,43 2,35 2,28 2,23 2,20 2,16 2,14

14 3,10 2,73 2,52 2,39 2,31 2,24 2,19 2,15 2,12 2,10

15 3,07 2,70 2,49 2,36 2,27 2,21 2,16 2,12 2,09 2,06

16 3,05 2,67 2,46 2,33 2,24 2,18 2,13 2,09 2,06 2,03

17 3,03 2,64 2,44 2,31 2,22 2,15 2,10 2,06 2,03 2,00

18 3,01 2,62 2,42 2,29 2,20 2,13 2,08 2,04 2,00 1,98

19 2,99 2,61 2,40 2,27 2,18 2,11 2,06 2,02 1,98 1,96

20 2,97 2,59 2,38 2,25 2,16 2,09 2,04 2,00 1,96 1,94

21 2,96 2,57 2,36 2,23 2,14 2,08 2,02 1,98 1,95 1,92

22 2,95 2,56 2,35 2,22 2,13 2,06 2,01 1,97 1,93 1,90

23 2,94 2,55 2,34 2,21 2,11 2,05 1,99 1,95 1,92 1,89

24 2,93 2,54 2,33 2,19 2,10 2,04 1,98 1,94 1,91 1,88

25 2,92 2,53 2,32 2,18 2,09 2,02 1,97 1,93 1,89 1,87

26 2,91 2,52 2,31 2,17 2,08 2,01 1,96 1,92 1,88 1,86

27 2,90 2,51 2,30 2,17 2,07 2,00 1,95 1,91 1,87 1,85

28 2,89 2,50 2,29 2,16 2,06 2,00 1,94 1,90 1,87 1,84

29 2,89 2,50 2,28 2,15 2,06 1,99 1,93 1,89 1,86 1,83

30 2,88 2,49 2,28 2,14 2,05 1,98 1,93 1,88 1,85 1,82

35 2,85 2,46 2,25 2,11 2,02 1,95 1,90 1,85 1,82 1,79

40 2,84 2,44 2,23 2,09 2,00 1,93 1,87 1,83 1,79 1,76

45 2,82 2,42 2,21 2,07 1,98 1,91 1,85 1,81 1,77 1,74

50 2,81 2,41 2,20 2,06 1,97 1,90 1,84 1,80 1,76 1,73

100 2,76 2,36 2,14 2,00 1,91 1,83 1,78 1,73 1,69 1,66

Fonte: (BOX, HUNTER, & HUNTER, 1978).

58

ANEXO B – TABELA DISTRIBUIÇÃO F, α=0,05. gl graus de liberdade no numerador

denom. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 161,45 199,50 215,71 224,58 230,16 233,99 236,77 238,88 240,54 241,88

2 18,51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40

3 10,13 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79

4 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,96

5 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74

6 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06

7 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64

8 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35

9 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14

10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98

11 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85

12 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,75

13 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67

14 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60

15 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54

16 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,49

17 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45

18 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41

19 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38

20 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35

21 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,32

22 4,30 3,44 3,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,30

23 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,27

24 4,26 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25

25 4,24 3,39 2,99 2,76 2,60 2,49 2,40 2,34 2,28 2,24

26 4,23 3,37 2,98 2,74 2,59 2,47 2,39 2,32 2,27 2,22

27 4,21 3,35 2,96 2,73 2,57 2,46 2,37 2,31 2,25 2,20

28 4,20 3,34 2,95 2,71 2,56 2,45 2,36 2,29 2,24 2,19

29 4,18 3,33 2,93 2,70 2,55 2,43 2,35 2,28 2,22 2,18

30 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,16

35 4,12 3,27 2,87 2,64 2,49 2,37 2,29 2,22 2,16 2,11

40 4,08 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,25 2,18 2,12 2,08

45 4,06 3,20 2,81 2,58 2,42 2,31 2,22 2,15 2,10 2,05

50 4,03 3,18 2,79 2,56 2,40 2,29 2,20 2,13 2,07 2,03

100 3,94 3,09 2,70 2,46 2,31 2,19 2,10 2,03 1,97 1,93


59

ANEXO C – TABELA DISTRIBUIÇÃO F, α=0,01. gl graus de liberdade no numerador

denom. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 4052,2 4999,3 5403,5 5624,3 5764,0 5859,0 5928,3 5981,0 6022,4 6055,9

2 98,50 99,00 99,16 99,25 99,30 99,33 99,36 99,38 99,39 99,40

3 34,12 30,82 29,46 28,71 28,24 27,91 27,67 27,49 27,34 27,23

4 21,20 18,00 16,69 15,98 15,52 15,21 14,98 14,80 14,66 14,55

5 16,26 13,27 12,06 11,39 10,97 10,67 10,46 10,29 10,16 10,05

6 13,75 10,92 9,78 9,15 8,75 8,47 8,26 8,10 7,98 7,87

7 12,25 9,55 8,45 7,85 7,46 7,19 6,99 6,84 6,72 6,62

8 11,26 8,65 7,59 7,01 6,63 6,37 6,18 6,03 5,91 5,81

9 10,56 8,02 6,99 6,42 6,06 5,80 5,61 5,47 5,35 5,26

10 10,04 7,56 6,55 5,99 5,64 5,39 5,20 5,06 4,94 4,85

11 9,65 7,21 6,22 5,67 5,32 5,07 4,89 4,74 4,63 4,54

12 9,33 6,93 5,95 5,41 5,06 4,82 4,64 4,50 4,39 4,30

13 9,07 6,70 5,74 5,21 4,86 4,62 4,44 4,30 4,19 4,10

14 8,86 6,51 5,56 5,04 4,69 4,46 4,28 4,14 4,03 3,94

15 8,68 6,36 5,42 4,89 4,56 4,32 4,14 4,00 3,89 3,80

16 8,53 6,23 5,29 4,77 4,44 4,20 4,03 3,89 3,78 3,69

17 8,40 6,11 5,19 4,67 4,34 4,10 3,93 3,79 3,68 3,59

18 8,29 6,01 5,09 4,58 4,25 4,01 3,84 3,71 3,60 3,51

19 8,18 5,93 5,01 4,50 4,17 3,94 3,77 3,63 3,52 3,43

20 8,10 5,85 4,94 4,43 4,10 3,87 3,70 3,56 3,46 3,37

21 8,02 5,78 4,87 4,37 4,04 3,81 3,64 3,51 3,40 3,31

22 7,95 5,72 4,82 4,31 3,99 3,76 3,59 3,45 3,35 3,26

23 7,88 5,66 4,76 4,26 3,94 3,71 3,54 3,41 3,30 3,21

24 7,82 5,61 4,72 4,22 3,90 3,67 3,50 3,36 3,26 3,17

25 7,77 5,57 4,68 4,18 3,85 3,63 3,46 3,32 3,22 3,13

26 7,72 5,53 4,64 4,14 3,82 3,59 3,42 3,29 3,18 3,09

27 7,68 5,49 4,60 4,11 3,78 3,56 3,39 3,26 3,15 3,06

28 7,64 5,45 4,57 4,07 3,75 3,53 3,36 3,23 3,12 3,03

29 7,60 5,42 4,54 4,04 3,73 3,50 3,33 3,20 3,09 3,00

30 7,56 5,39 4,51 4,02 3,70 3,47 3,30 3,17 3,07 2,98

35 7,42 5,27 4,40 3,91 3,59 3,37 3,20 3,07 2,96 2,88

40 7,31 5,18 4,31 3,83 3,51 3,29 3,12 2,99 2,89 2,80

45 7,23 5,11 4,25 3,77 3,45 3,23 3,07 2,94 2,83 2,74

50 7,17 5,06 4,20 3,72 3,41 3,19 3,02 2,89 2,78 2,70

100 6,90 4,82 3,98 3,51 3,21 2,99 2,82 2,69 2,59 2,50


universidade de sÃo paulo escola de engenharia de...

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