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UNIVERSIDAD DE GUADALAJARACENTRO UNIVERSITARIO DE LA CIÉNEGA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA VIDA

Manual de Prácticas para

Bioquímica II

(FB 209)

Fecha de Actualización 27.11.2008

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Índice

I. Reglamento General del Laboratorio............................................................................3II. Seguridad .....................................................................................................................4III. Comportamiento en el Laboratorio en General ............................................................5IV. Manejar Sustancias Peligrosas ....................................................................................6V. Reglamento Interno ......................................................................................................7VI. Evaluación de las Prácticas..........................................................................................7VII. Protocolo ......................................................................................................................8VIII. Examen ........................................................................................................................8Práctica No. 1: Grupos funcionales de aminoácidos.............................................................9Práctica No. 2: Separación de aminoácidos por cromatografía ..........................................15Práctica No. 3: Extracción y cualificación de DNA..............................................................21Práctica No. 4: Cuantificación de DNA ...............................................................................25Práctica No. 5: División celular ...........................................................................................28Práctica No. 6: Acción hormonal.........................................................................................33Práctica No. 7: Hemoglobina ..............................................................................................36

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I. Reglamento General del LaboratorioEl profesor de la práctica deberá:

- Estar presente durante todo el desarrollo de la práctica- Mantener la disciplina de sus estudiantes durante la práctica

Todo el personal que ingrese al laboratorio deberá portar el material de protecciónpersonal como:

- Bata (blanca, limpia, de algodón y manga larga)- Pantalones (largos)- Zapatos cerrados y de piso; preferiblemente de cuero- Guantes adecuados dependiendo de los reactivos y de las actividades. Con guantes

nunca se toca algo fuera del experimento. Véase a las "IdS Guantes"- Cubre-bocas, cofias, mascarillas y/o gafas de seguridad en casos necesarios

Además deberá:- Familiarizarse con la ubicación de los elementos de seguridad como extintor, puertas

de emergencia, duchas de emergencia, lava-ojos, botiquín de primeros auxilios etc.,así como los números telefónicos de emergencia

- Sujetar el cabello y no usar gorra- Traer uñas cortas y sin esmalte- No maquillarse durante el desarrollo de la práctica ni manipular lentes de contacto- No comer, beber, masticar chicle- No fumar- No llevarse objetos a la boca como lápices o dedos- Lavarse las manos antes de entrar y de salir del laboratorio

Está prohibido portar la indumentaria de protección personal fuera del laboratorioNo almacenar alimentos o bebidas para el consumo humano en el laboratorioEstá prohibido el ingreso al laboratorio a personas no autorizadas, p.ej. niños o visitasCualquier incidente en el laboratorio reportarlo inmediatamente al responsableLos estudiantes no podrán salir del laboratorio durante la práctica a menos que sea muy

necesarioEstá prohibido bloquear las rutas de evacuaciónToda sustancia química será etiquetada, clasificada y almacenada de acuerdo a la

normatividad existente (véase "Registro de Sustancias Peligrosas")Toda sustancia química no deberá ser eliminada directamente al desagüe sin antes

consultar las Fichas de Datos de Seguridad (véase "Registro Residuos Peligrosos")El responsable del laboratorio levantará un reporte cuando no se cumple con lo indicado

en este reglamento

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II. SeguridadPara entrar a las prácticas de bioquímica, cada estudiante tiene que conocer y cumplir lasreglas de seguridad en el laboratorio. Información sobre el comportamiento en general sepuede encontrar muy detallado en la página webhttp://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html y breve en los puntos"III: Comportamiento en el Laboratorio en General" y "IV: Manejar Sustancias Peligrosas"de este manual.También es obligatorio para el estudiante de informarse sobre los riesgos potenciales queprovienen de los reactivos y procedimientos que se aplicarán *antes* de que se lleven acabo las prácticas. Información y documentos de pdf para bajar e imprimir se encuentratambién en dicha página de internet como el "Registro de Sustancias Peligrosas","Instrucciones de Seguridad (IdS)" y "Fichas de Datos de Seguridad" (FDS) para lassustancias que se utilizarán.

En el caso de no cumplir las reglas de seguridad, el estudiante tiene que salir de la prácticainmediatamente y se evaluará este práctica con cero puntos. En casos graves (p.ej.causando accidentes con heridos) y de intención el estudiante puede ser exculído de lasprácticas para todo el semestre.

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III. Comportamiento en el Laboratorio en GeneralUsar una bata de algodón, manga larga, abotonada y limpia para

protegernos contra contaminaciones" para no contaminar el exterior, nunca se utiliza la bata fuera del

laboratorio" batas sucias traen el peligro de contaminarse uno mismo

Usar zapatos cerrados (no sandalias) y seguros para caminar (sin tacón)" en verano se puede traer un par de zapatos adicionales adecuados

para el laboratorio

Usar material de seguridad personal (gafas, guantes, etc.), cuando esindicado

NO fumarNO comer, beber, maquillarseNO alcohol u otras drogasNO móvil/celular

No desarrollar experimentos peligrosos solos en el laboratorioNo correr ni jugar en el laboratorioNo recibir visitas personales en el laboratorioNo dejar bolsas o ropa en el laboratorioSiempre dejar el laboratorio limpio y ordenado- su material (quitar escrituras y adhesivos)- los equipos (p.ej. centrífuga)- su lugar de trabajo y lugares comunes (p.ej. campana, lavabo)Avisar:- situaciones peligrosas- mal funcionamiento de equipos y/o- terminación de reactivosal Responsable del Laboratorio

Lavarse las manos después del trabajo y ponerse crema para la piel

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IV. Manejar Sustancias PeligrosasEs obligatorio informarse sobre los riesgos específicos de sustancias

peligrosas" Ver las Fichas de Datos de Seguridad (FDS)http://www.apacheweb.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/SDB.html" Ver al Registro de Sustancias Peligrosashttp://www.apacheweb.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/Anweisungen.html

Mujeres embarazadas y madres amamantandoNO pueden trabajar en el laboratorio con sustancias peligrosas

Almacenar:En recipientes adecuados y en una manera adecuadaMarcado conforme a su contenido- contenido (sustancia, mezcla, concentración)- fecha- propietario- símbolo de peligroNo en cantidades grandesSustancias que producen polvos, gases, vapores, aerosoles etc tóxicos,

nocivos, cancerígenos, corrosivos o inflamables almacenar en un lugarventilado

Nunca almacenar alimentos en el laboratorioNunca almacenar reactivos en contenedores de alimentos

Manejar:No tocar químicosTrasvasar mediante un medio aplicable (e.je. embudo)Nunca poner las tapas boca abajo sobre la mesa- dejar químicos sobre la mesa- traer contaminación al recipienteNo dañar las etiquetas mientras se trasvasa (p.ej. por goteo)Nunca devolver reactivos en su envase original- traer contaminación al recipienteNo llenar recipientes más del 90% de su capacidad máximaCerrar bien los recipientes no usadosSustancias que producen polvos, gases, vapores o aerosoles tóxicos,

nocivos, cancerígenos, corrosivos o inflamables se maneja en unacampana de extracción

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V. Reglamento InternoEl estudiante tiene que entrar preparado a las prácticas, es decir con:- Ropa adecuada cumpliendo las reglas de seguridad- Material necesario para llevar a cabo la práctica según el manual o el anuncio del profesor- Plan de trabajo/esquema para llevar a cabo la práctica- Conocer la base teórica para entender el objetivo de la práctica.En el caso de no cumplir algún punto de los anteriores, el estudiante puede ser excluido deesta práctica y se evalurará con cero puntos.

VI. Evaluación de las PrácticasEn cada práctica se evaluará al estudiante según el siguiente esquema:40 % Comportamiento en el laboratorio (actitud, preparación, desempeño, limpieza)30 % Protocolo (siempre individual)30 % Examen de prácticas

La calificación final de las prácticas se calculará del promedio de todas las prácticasofrecidas, donde cada práctica tiene el mismo peso. Según la voluntad del profesor elestudiante puede repetir prácticas ofrecidas, que él no ha llevado cabo; por lo demás seevaluará una falta de asistencia con cero puntos.

La evaluación de la materia será:Exámenes 65 %Prácticas 20 %Tareas 15 %Se tiene que aprobar la teoría (= exámenes + tareas) y las prácticas independientementepara aprobar la materia.

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VII. ProtocoloEl estudiante tiene que entregar el protocolo de la práctica a más tardar hasta el inicio de lasiguiente práctica al profesor responsable. El protocolo debe cumplir con los siguientespuntos:- Nombre, fecha, curso, tema- Introducción pequeña en la teoría en que se basa la práctica- Material: - Material (especial) utilizado (sin material estándar como tubo de ensayo, ...)

- Soluciones, reactivos utilizados (pureza, conc., marca si es relevante etc):no se refiere a soluciones/reactivos que deberían utilizar!

- Procedimiento: - Pasos que realizaron para llevar a cabo la prácticano se refiere a que deberían hacer (que sería el método!)

- Resultados: - Tabla, gráfica de los resultados primarios (de lectura),- Cálculos y resultados elaborados

- Discusión: - Resultados cumplen con la expectativa (en base de la teoría)?- Qué significan los resultados - para que se puede utilizar este método?- En el caso de no: discusión de errores

- Bibliografia: Autor1, N1, N2 Autor2 & N3 Autor3 (año): Título. Revista, Volumen: páginashttp://www.domain-name.de/link/al/documento.pdf

VIII. ExamenEl examen de las prácticas deberá ser antes de la siguiente práctica, la fecha concretadeberá ser establecida entre el profesor responsable y los estudiantes.El tema de los exámenes de las prácticas incluye el conocimiento teórico-básico de cadapráctica como se establece en este manual, los principios teóricos en que se basan lasreacciones y mecanismos de los experimentos y los cálculos necesarios. Los exámenes nodeberán tardar más de 30 min.

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Práctica No. 1 Grupos funcionales de aminoácidos

Tipo de práctica: Individual Tiempo de duración: 2 h

ObjetivoConocer diferentes métodos colorimétricos para identificar y diferenciar químicamente losdistintos grupos funcionales de los aminoácidos.

IntroducciónLas proteínas son las biomoléculas más abundantes de la materia viva. Sus propiedadesfísico-químicas pueden diferir drásticamente, y así una queratina del pelo se parece poco auna proteína plasmática o a la insulina. Sin embargo, todas tienen en común sucomposición, basada en α-aminoácidos unidos por enlaces peptídicos dando lugar acadenas lineales. Para identificar y diferenciar los grupos funcionales de los aminoácidosse utilizan diferentes técnicas como la xantoproteíca para detectar aminoácidosaromáticos, la reacción de plomo de azufre para detectar aminoácidos azufrados y lareacción de Biuret para detectar enlaces peptídicos de oligo- y polipéptidos.

Material1) Reacción Xantoproteíca

Material Cantidad Reactivos CantidadHuevo 1 Ácido nítrico (70 %) # $ 1 m%Tubo de ensayo de 15 m% 1 Soln. NaOH al 40 % # 2 m%Pinzas 1 EquiposPipetas de 1 y 2 m% 1 Baño María (100 ºC) 1

Vortex 1

2) Reacción de plomo de azufreMaterial Cantidad Reactivos Cantidad

Huevo 1 Soln. NaOH al 20 % # 2 m%Tubo de ensayo de 15 m% 1 Acetato de plomo al 5% & 1 m%Pinzas 1 EquiposPipetas de 1 y 2 m% 1 Baño María (100 ºC) 1

Vortex 1

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3) Reacción de BiuretMaterial Cantidad Reactivos Cantidad

Huevo 1 Soln. NaOH al 20 % # 2 m%Tubo de ensayo de 15 m% 1 Sulfato de cobre (CuSO4 al 1 %) 1 m%Pinzas 1 EquiposPipetas de 2 m% 1 Vortex 1

Método1) Reacción Xantoproteíca1.1. Pipetar 2 m% de clara del huevo (= albúmina) en un tubo de ensayo1.2. Añadir 1 m% de HNO3

1.3. Agitar breve (aproximadamente 5 s) con un Vortex1.4. Calentar cautelosamente en un Baño María a 100 °C (1 a 2 min)

- en la campana de extracción- agitar cada 20 s breve para prevenir borbotones y salpicaduras- agitar con la boca del tubo hacia la pared de la campana

1.5. Enfriar en agua fría1.6. Observar la coloración: amarilla1.7. Añadir para neutralizar goteando solución de NaOH al 40 % hasta que se observe otro

cambio de color: anaranjado oscuro

2) Reacción de Plomo de Azufre2.1. Pipetar 2 m% de clara del huevo (= albúmina) en un tubo de ensayo2.2. Añadir 2 m% de solución de NaOH al 20 %2.3. Añadir 1 m% de acetato de plomo2.4. Agitar breve con un vortex2.5. Calentar cautelosamente en un Baño María a 100 °C (hasta la ebullición)

- en la campana de extracción- agitar cada 20 s breve para prevenir borbotones y salpicaduras- agitar con la boca del tubo hacia la pared de la campana- cuidado, puede escarparse sulfuro de hidrógeno (H2S) &

2.6. Observar un precipitado de color marrón-negro

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3) Reacción de Biuret3.1. Pipetar 2 m% de clara del huevo (= albúmina) en un tubo de ensayo3.2. Añadir 2 m% de solución de NaOH al 20 %3.3. Agitar breve con un Vortex3.4. Añadir goteando (unas 4 a 5 gotas) de solución de sulfato de cobre (CuSO4) al 1 %

hasta que se observe un cambio de color: rosa-violeta

ResultadosReacción Xantoproteíca

Reacción de Plomo de Azufre

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Reacción de Biuret

Observaciones

Conclusiones

Bibliografía1. Conn, E.E., P.K. Stumpf, B. George & R.H. Doi (2002): Bioquímica Fundamental. 4. ed.,

Wiley2. Murray, R.K., D.K Granner & V.W. Rodwell (2007): Bioquímica ilustrada. 17. ed., Manual

Moderno3. Voet, D. & J.G. Voet (2004): Biochemistry. 3. ed., Wiley

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Cuestionario1. Elabore un diagrama de flujo en el que describa el o los procedimientos utilizados en

esta práctica.2. Indique los cálculos necesarios para la elaboración de las soluciones utilizadas y

especifique el peso molecular, temperatura de ebullición, temperatura de fusión, estadofísico a 25 ºC y solubilidad de los reactivos utilizados.

3. Clasifique a los aminoácidos según sus propiedades físico-químicas indicando susgrupos funcionales.

4. ¿Cuáles son las funciones de los grupos funcionales de los aminoácidos en lasenzimas?

5. ¿Cuál es el fundamento de la técnica xantoproteíca, de la reacción de plomo de azufre yde la reacción de Biuret? Indique también las reacciones que intervienen.

6. ¿Qué diferencia existe entre la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria delas proteínas?

Mecanismo de EvaluaciónLa presente se calificará en una escala del 0 al 100 y el valor obtenido estará enproporción con el porcentaje de la evaluación final (20 % para prácticas), los puntos aevaluar se listan a continuación:

Aspecto a evaluar %Comportamiento 40Protocolo 30Examen 30

Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalDurante el calentamiento de líquidos en el tubo de ensayo dentro del Baño María se tieneque traer gafas de seguridad y guantes para protegerse contra borbotones y salpicaduras.Durante el calentamiento de los tubos con los reactivos mantener la abertura del tubohacia la campana de extracción y nunca hacia una persona.El ácido nítrico concentrado (HNO3) se tiene que manejar en la campana de extracción porlos vapores que libera. Además, como es corrosivo se tiene que usar guantes de neoprenoy gafas de seguridad. Recuerde que los ácidos se adicionan a las soluciones, si se hacede manera contraria suelen proyectarse. En caso de contacto directo puede causarirritación en ojos, membranas mucosas y piel, cuando se está expuesto por un largoperiodo puede desarrollar edema pulmonar, neumonitis y bronquitis. En caso dequemadura se debe lavar con abundante agua la zona y llevar al servicio médico deemergencias lo antes posible al paciente, en caso de que no sea posible su transporte por

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el estado de salud del paciente solicite una ambulancia (marque el 065 Cruz RojaMexicana ó 114 Bomberos municipal).El acetato de plomo es tóxico y se tiene que usar guantes en caucho butílico o PVC. Lareacción se tiene que llevar a cabo en la campana de extracción por la posible liberaciónde H2S tóxico durante la reacción. El acetato de plomo es astringente y sedante cuandoestá en solución, además de ser carcinógeno, en caso de contacto con la piel y ojos lavarcon abundante agua, si se ingiere se debe provocar el vómito y en inhalación tomar airefresco, pero en este último caso puede llevar a paro cardiorrespiratorio y es necesarioaplicar reanimación cardiopulmonar. En todos los casos debes llamara al servicio médicode emergencias para la valoración del intoxicado.Sosa (20 % y 40 %) son corrosivas y se tiene que usar guantes caucho butílico. En casode derrame neutralice con carbonato hidrogenado, para situaciones en las que entre encontacto con piel y ojos enjuagar con abundante agua y llamar al servicio médico deemergencias.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosTodas las soluciones que contenga ácido nítrico se tiene que neutralizar con NaOH al40 % y ya neutralizado se puede tirar al desagüe. Mientras que las soluciones con acetatode plomo, se tiene que neutralizar y colectar en el contenedor para soluciones de sales demetales pesados. El resto de las sustancias se pueden tirar al desagüe.

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Práctica No. 2Separación de aminoácidos por cromatografía

Tipo de práctica: Equipo de 3 personas Tiempo de duración: 2 h

ObjetivoSeparar los aminoácidos por cromatografía en capa fina con el fin de identificar estosaminoácidos en una mezcla y además conocer el principio de la técnica y sus aplicaciones.

IntroducciónLa cromatografía en capa fina, o más comúnmente TLC (Thin Layer Chromatography), esuna técnica cromatográfica utilizada para separar los componentes puros que forman partede una mezcla. La separación de aminoácidos puede llevarse a cabo mediante estatécnica en donde la separación se consigue por la diferencia entre las fuerzas de adhesiónde las moléculas de los componentes a una fase móvil (normalmente, un disolvente) y auna fase estacionaria (que puede ser papel, gel de sílice, etc.). Esta diferencia se traduceen un mayor o menor desplazamiento o movilidad de cada componente individual, lo cualpermite su separación e identificación. El parámetro experimental asociado a la técnica esel Rf (factor de retención), definido como la relación entre la distancia que recorre dichasustancia y la que recorre la fase móvil (Figura 3). Las más insolubles tendrán, en eldisolvente empleado, un Rf próximo a cero, mientras las más solubles se acercarán a uno.En esta práctica la determinación de aminoácidos se basa en la reacción específica deéstos con la ninhidrina, formando un compuesto de intenso color purpúreo (Figura 1). Sólola prolina da una coloración amarilla.

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Figura 1: Reacción de la ninhidrina con α-aminoácidos

MaterialEquipos CantidadCámara para cromatografía en papel (5 x 9 x 4 cm) 1Horno (25 -300 °C) 1Fase estacionaria CantidadPlaca de silica-gel* 1Soluciones Volumen finalNinhidrina al 1% en etanol (70 %) ' 20 m%Fase móvil: butanol (() - ácido acético glacial (#) - Aqua destillata(A. dest.) [4:1:5]

3 m%

Estándar de aminoácido 1 al 0,5 % 1 m%Estándar de aminoácido 2 al 0,5 % 1 m%Control negativo: D-glucosa al 0,5% 1 m%Solución problema o mezcla de estándares de aminoácidos 1 m%* En caso de no conseguir silicagel utilizar papel filtro Whatman No. 3 (4 cm ancho por 7 cm de largo)

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Material Cantidad Material CantidadAtomizador 1 Lápiz No. 2 1Pinza para crisol 1 Regla (30 cm) 1Tubos capilares 5 µ% 4

Método1. Vaciar a la cámara cromatográfica unos 0,5 cm de fase móvil y taparla por 20 min para

que se sature dentro de la campana de extracción2. Tomar una placa de silicagel o papel y señalar suavemente con el lápiz de grafito No. 2

una línea recta a 1,0 cm de distancia del borde en el eje de las ordenadas. No hay quetocar la parte de la silica gel de la placa o papel con las manos, ya que lacontaminaríamos con aminoácidos procedentes de nuestras manos (Figura 2-A). Noutilizar nunca bolígrafo ni rotulador

3. Ubicar cuatro puntos de descarga sobre la línea recién trazada, el primero a 0,5 cm delborde de las abscisas y el resto a 0,5 cm de distancia entre ellos

4. Identificar los puntos de descarga con un símbolo con el que se pueda asociar lamuestra que se va a aplicar (p.ej.: a) L-arginina, b) L-glutamina, c) glucosa y d) muestra)

5. Con un tubo capilar adicionar gotas en cada punto correspondiente de los estándares yla muestra y dejar secar (Figura 2-B)

6. Colocar la placa de silicagel o papel en la cámara y cerrarla (Figura 2-C)7. Dejar que corra hasta que la fase móvil llegue aproximadamente 1 cm antes del fin de la

placa (aproximadamente 20 min)8. Sacar la placa de silicagel de la cámara cromatográfica y marcar inmediatamente con el

lápiz hasta donde llegó la fase móvil en la placa. Posteriormente dejar secar dentro de lacampana de extracción

9. Rociar la placa de silicagel o papel con ninhidrina al 1 % en la campana de extracción,tomando las precauciones correspondientes como cubrebocas, gafas de seguridad yguantes

10. Permita que se seque y una vez terminada esta operación llevarla al horno a untemperatura de 95 °C por 5 min para revelarla

11. Retirar del horno con unas pinzas para crisol y permitir que se enfrié

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A B CFigura 2: Método de aplicación de muestra en cromatografía en capa fina en sílica gel o

papel. A) Distribución y aplicación de muestra. B) Una vez aplicada la muestra se dejasecar. C) Colocación de la placa en la cámara cromotográfica

(B) solvente del frente al aplicación de punto el desde Distancia(A) mancha la de centro al aplicación de punto el desde DistanciaRf =

Figura 3: Toma de distancias para el cálculo de Rf

Resultados1. Identificar los aminoácidos que están presentes en la muestra (dibujar o colocar

fotografía de la placa teñida con ninhidrina).2. Medir los valores de Rf de cada uno de los aminoácidos (Figura 3).

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Observaciones

Conclusiones

Bibliografía1. Skoog, D.A., D.M. West, F.J. Holler & S.R. Crouch (2005): Fundamentos de química

analítica. 8. ed. Editorial Thomson2. Voet, D. & J.G. Voet (2004): Biochemistry. 3. ed., Wiley3. Mathews, C.K., K.E. van Holde & K.G. Ahern (2002): Bioquímica. 3. ed. Pearson

Addison Wesley




3. ¿Cuál es la diferencia entre los principios de separación: adsorción, intercambio iónico,exclusión y afinidad?

4. Esquematice los tipos de cromatografía de forma detallada.5. Indique la diferencia entre: tiempo de retención, factor de retención, eluyente, efluente y

series eluotrópicas.

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Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLa solución de ninhidrina al 1 % en 70 % etanol es inflamable, evitar rociar cerca demecheros, en caso de causar un incendio apagar con agua o con extintor tipo CO2.También causa irritación en piel y vías aéreas, el tratamiento en el primer caso es lavarcon abundante agua tibia la superficie de la piel y secar; para el segundo caso retirar a lapersona de la fuente de contaminación y que tome aire fresco. En caso de derramecolóquese guantes de caucho nitrilo y limpie el área afectada con papel absorbente,colóquelo en un recipiente, el cual deberá ser entregado debidamente etiquetado y tapadoal profesor de la clase para que lo confine a un contenedor para residuos sólidos quecontengan componentes orgánicos.El butanol es inflamable, así que debe evitarse trabajar cerca de fuego. Es nocivo alcontacto con ojos y piel, en caso de contacto enjuagar con abundante agua. Si se ingierese producen síntomas similares a la intoxicación por etanol (dolor de cabeza, nauseas,vómito, etc.), debe llevarse a la persona lo antes posible al servicio médico deemergencias o bien llamarlos para que vayan al lugar del incidente.El ácido acético glacial es corrosivo, en caso de derrame vaciar sobre carbonatohidrogenado, una vez neutralizado disolver con abundante agua. Es un fuerte irritante depiel y ojos, si alguien llega a entrar en contacto con esta sustancia enjuagar con agua. Sedebe usar guantes de neopreno. En caso de ingestión provoca dolor de garganta y dolorabdominal, evitar el vómito y llamar al servicio médico de emergencia.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos desechos líquidos se deben neutralizar con base a pH 5 - 10 y después se puedencolectar en un contenedor para solventes orgánicos. Del papel de cromatografía se tieneque dejar evaporar los solventes dentro de la campana de extracción y se puede utilizarpegándola en el protocolo.

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Práctica No. 3Extracción y cualificación de DNA


ObjetivoExtraer e identificar el DNA genómico de un tejido animal.

IntroducciónEl ácido desoxirribonucleico o DNA es la molécula que guarda el código genético de todaslas células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota oprocariota, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético. El DNA a menudoes comparado a un manual de instrucciones, ya que éste contiene las instrucciones paraconstruir otros componentes de las células, como moléculas de RNA y proteínas.La extracción de DNA requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen queromperse las membranas para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación deberomperse también la membrana nuclear para dejar libre el DNA. Por último hay queproteger el DNA de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer queprecipite en alcohol.

MaterialMaterial Cantidad Reactivos Cantidad

Hígado de pollo o de otro tipode tamaño equivalente

1 96 % EtOH (desnaturalizado)' (

50 m%

Algodón o tela para filtrar 1 20 % SDS ( 1 m%Mortero 1 2 M NaCl 50 m%Vasos de precipitados 2 Arena (fina)Pipetas de 1 m% 2 Aqua destillata (A. dest.) 60 m%Probeta de 100 m% 1 0,1 % Azul de metileno 5 m%Porta y cubreobjetos 1 Aceite de inmersión ( 2 gotasPipeta Pasteur 1Probeta de 50 m% 1Varilla de vidrio 1

MétodoExtracción del DNA1. Triturar medio hígado de pollo en un mortero frío (4 ºC)2. Añadir arena para que se puedan romper las células mejor al triturar

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3. Añadir al triturado 50 m% de A. dest. (4 ºC). Remover hasta hacer una papilla o puré4. Filtrar varias veces sobre una tela o algodón para separar los restos de tejidos que

hayan quedado por romper5. Medir el volumen del filtrado con una probeta6. Añadir al filtrado un volumen igual de 2 M NaCl (4 ºC)7. Añadir 1 m% de SDS, mezclar según aviso del profesor8. Añadir mediante una pipeta 50 m% de etanol frío (4 ºC). Hay que hacerlo de forma que el

alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas9. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla se

van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de laagrupación de muchas fibras de DNA

10. Resuspenderlas en 1 m% de A. dest. y almacenar la solución a - 20 ºC para la siguientepráctica

Tinción con Azul de metilenoAprovechando que se obtienen las fibras de DNA en el paso número 9, se puede tomaruna muestra del DNA recogido, depositarla sobre un portaobjetos y teñir con azul demetileno durante 1 a 3 min. Tras escurrir bien el portaobjetos, se observa al microscopiocon 40x y 100x (aceite de inmersión).

Resultados1. Explique detalladamente el por qué de cada paso del experimento

2. DNA teñido y observado al microscopio

40x 100 x

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Observaciones

Conclusiones

Bibliografía1. Champe, P.C., R.A. Harvey & D.R. Ferrier (2005): Bioquímica. 3. ed. McGraw Hill2. Conn, E.E., P.K. Stumpf, B. George & R.H. Doi (2002): Bioquímica Fundamental. 4. ed.,

Wiley3. Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott, S.L. Zipkursky &

J. Darnell (2005): Biología celular y molecular. 5. ed. Médica Panamericana4. Voet, D. & J.G. Voet (2004) Biochemistry. 3. ed., Wiley5. Skoog, D.A., D.M. West, F.J. Holler & S.R. Crouch (2005): Fundamentos de química

analítica. 8. ed. Editorial Thomson




3. Defina las características físico-químicas de las purinas y pirimidinas. Además denucleósido, nucleótido, formas tautómeras y encuentre otras moléculas que contenganácidos nucleicos.

4. ¿Cuál es la diferencia entre la estructura del DNA: A-, B-, Z-DNA?

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5. Defina cromosomas (supercoiled, nucleosoma, nucleofilamento, cromatina, función dehistonas).

6. ¿Existen otros métodos de tinción del DNA? ¿Cuáles son?



Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalEl hígado es un tejido no es tóxico, es un alimento y por eso no se requiere medidas deseguridad especiales.El etanol es una sustancia inflamable. Conservar alejado de toda llama o fuente dechispas. Como está clasificado como solvente, se recomienda utilizarlo en la campana deextracción con guantes en caucho nitrilo, PVC o Viton y lentes protectores. Puede causar,náuseas, vómito y mareo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente conagua. Si se inhala, trasladar a la persona al aire libre. En contacto con los ojos lavar conmucha agua manteniendo los párpados abiertos. Si se ingiere, beber agua abundante.Provocar vómito.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos desechos se pueden tirar al desagüe. Se debe lavar con mucha agua para evitarolores desagradables. Los portaobjetos se pueden lavar con abundante agua y loscubreobjetos colocarlos en el contenedor de objetos punzocortantes. El azul de metilenopuede tirarse al desagüe. Si existen residuos de hígado, se depositan en una bolsa deplástico, se cierra bien y se tira en la basura.

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Práctica No. 4 Cuantificación de DNA


ObjetivoDeterminar la pureza y concentración de DNA.

IntroducciónLos ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia debases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de UV deDNA es una característica de la molécula, que es usada eficientemente para determinar suconcentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y porlo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de unamolécula de DNA. Se realizan mediciones a 260 y 280 nm. Las proteínas tienen unmáximo de absorción a A280 (principalmente por residuos de triptófano) las lecturas a estalongitud pueden mostrar si existe algún contaminante proteico. El cálculo de la relaciónA260 /A280 es una manera común para expresar la pureza del DNA. Dependiendo de lacomposición nucleica, un valor de 1,65 a 1,9 indican una muestra pura.


1,5 m% Eppendorf 3 Aqua destillata 20 m%Celda de cuarzo 1 Equipo

Espectrofotómetro (240-800 nm) 1

Método1. Descongelar la solución de DNA extraída como se indica en la práctica No. 32. Diluir el DNA 1:10, 1:50 y 1:100 con A. dest. (cada 5 m%)3. El blanco será el A. dest.4. Determinar la absorbancia a 260 y 280 nm

RESULTADOS1. Calcule la concentración del DNA en solución (miniprep) y la cantidad del DNA en total2. Calcule la pureza del DNA aislado3. Discuta errores probables por contaminaciones (¿cuáles?).

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Miniprep Dilución A260 A280260/280 c (DNA) DNA total

1:10 µg/m% µg1:50 µg/m% µg1:100 µg/m% µg

Observaciones

Conclusiones

Bibliografía1. Champe, P.C., R.A. Harvey & D.R. Ferrier (2005): Bioquímica. 3. ed. McGraw Hill2. Conn, E.E., P.K. Stumpf, B. George & R.H. Doi (2002): Bioquímica Fundamental. 4. ed.,

Wiley3. Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott, S.L. Zipkursky &

J. Darnell (2005): Biología celular y molecular. 5. ed. Médica Panamericana


esta práctica.2. Indique los cálculos necesarios para la elaboración de las diluciones utilizadas.3. ¿Para qué extraer DNA? Usos y aplicaciones.4. ¿Qué función tiene el PCR y las enzimas de restricción?5. Explique palíndromo.6. ¿Qué provoca la desnaturalización del DNA?

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7. ¿Por qué la relación 260/280 no puede ser mayor a 2?



Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLas soluciones en esta práctica no son tóxicas.

Disposicion de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos desechos líquidos se pueden tirar al desagüe.Los desechos sólidos se pueden tirar a la basura normal.

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Práctica No. 5 División celular


ObjetivoObservar las distintas fases de la mitosis en las células vegetales.

IntroducciónLa mitosis es el mecanismo responsable del crecimiento, de la regeneración y delreemplazo celular en un organismo multicelular individual. Los tejidos del ápice de la raízde cebolla son muy convenientes para estudiar la mitosis. Si se tiñen con un coloranteapropiado, tales tejidos pueden mostrar los cromosomas en las células en proceso dedivisión. Una célula de la raíz de cebolla, que acaba de formarse en el meristemo, contiene16 cromosomas; de estos, ocho provienen del padre de la planta de cebolla; es decir, de laplanta que proporcionó los gametos masculinos. Estos cromosomas se denominan, amenudo, cromosomas paternos. Los otros ocho restantes provienen de la madre de laplanta de cebolla; es decir, la cebolla que produjo el óvulo (gameto femenino). Estos sonlos cromosomas maternos. Por cada cromosoma materno existe un cromosoma paternoque tiene la misma apariencia de aquél y funciona de modo semejante. Estos doscromosomas semejantes constituyen un par homólogo.Cuando la célula no se halla en proceso de división, los cromosomas no pueden serobservados con el microscopio óptico. En ese momento son demasiado delgados y nopueden absorber suficiente cantidad de colorante que permita revelar su naturalezaverdadera. Cuando los cromosomas se hallan bajo estas condiciones, reciben el nombrecolectivo de cromatina del núcleo. En muchas células, incluyendo las de la cebolla, uno ovarios de los cromosomas van acompañados de un nucléolo. Este puede ser observadofácilmente con el microscopio óptico. Aunque los cromosomas, durante el períodocomprendido entre dos divisiones celulares, son tenues e invisibles al microscopio óptico,ello no significa de ningún modo que durante ese periodo sean inactivos. Ocurre todo locontrario: durante ese periodo sintetizan activamente RNA y, un poco antes de la próximadivisión celular, también sintetizan DNA. El análisis químico demuestra que el contenido deDNA se duplica exactamente.Los distintos fenómenos que ocurren durante la mitosis se han agrupado en cuatro fasesconsecutivas: profase, metafase, anafase y telofase. El periodo que trascurre entre dosdivisiones celulares consecutivas se denomina interfase. Resulta importante señalar queestas fases son simplemente maneras convenientes de describir la mitosis.

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Cebolla (Allium cepa) 1 Orceína al 2 % en ácido acético(50 %) # 5 m%

Bisturí 1 HCl (1 M) # 0,5 m%Pinza para crisol 1 Aceite de inmersión 2 gotasPortaobjetos 2Cubreobjetos 2 EquiposPipetas Pasteur 2 Microscopio óptico 1Vidrio de reloj 1Mechero Bunsen 1Papel filtro 1

MétodoUnos cinco días antes de realizar la práctica,se colocará un bulbo de cebolla tapando laboca de un frasco, que se llena hasta que elagua toque la base de la cebolla. Se lograráasí el desarrollo de numerosas raicillasjóvenes, cuando éstas tengan una longitudde 3 centímetros es el momento adecuadopara hacer la preparación (Figura 1).

Figura 1. Bulbo de cebolla en agua para elcrecimiento de raíces

1. Cortar con unas tijeras o bisturí de un solo filo, los últimos 5 mm de las raicillas,depositándolas en un vidrio de reloj

2. Adicionar aproximadamente 2 m% de orceína acética y 0,5 m% de HCl de tal manera quese cubra la raíz

3. Dejar que actúe el colorante durante 10 min4. Tomar el vidrio de reloj por los bordes, ayudándose de una pinza para crisol y calentarlo

suavemente a la llama del mechero, evitando la ebullición y esperar hasta que seemitan vapores tenues. Cuidar que nunca se seque la raíz

5. Dejar enfriar 5 min a temperatura ambiente y repetir la operación6. Dejar enfriar 10 min a temperatura ambiente

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7. Con las pinzas de disección tomar con cuidado una raíz y colocarla sobre unportaobjeto, cortar los últimos 2 ó 3 mm y desechar el resto. Añadir una gota de orceínafresca

8. Colocar el cubreobjetos y encima una almohadilla hecha con papel filtro sobre la que seejerce presión con el dedo pulgar, primero suave, después más intensa, para aplastar lamuestra, técnica conocida como squash

9. Aspirar con el papel filtro el exceso de colorante10. Observar al microscopio primero en 10x y luego con 40x y por último con 100x (aceite

de inmersión), recorriendo diversos campos para descubrir en las células observadaslas distintas fases de la mitosis

Observación al microscopioLa preparación presenta el aspecto de una dispersión de células por todo el campo queabarca el microscopio. Se observarán células en distintas fases o estados de divisióncelular. Con esta técnica de tinción se ven los cromosomas impregnados por la orceína encolor morado. El aspecto reticulado, así como el mayor tamaño de algunos núcleos,corresponden a las células que se encontraban en los procesos iniciales de la divisiónmitótica.

Resultados

10 x 40 x 100 x

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Observaciones

Conclusiones

Bibliografía1. Ganong, W.F. (2006): Fisiología Médica. 20. ed. Manual Moderno2. Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott, S.L. Zipkursky &

J. Darnell (2005): Biología celular y molecular. 5. ed. Médica Panamericana3. Mathews, C.K., K.E. van Holde & K.G. Ahern (2002): Bioquímica. 3. ed. Pearson

Addison Wesley


esta práctica.2. Defina: Fases del ciclo celular y su regulación mediante ciclinas y CDKs.3. ¿Cuál es la diferencia entre mitosis y meiosis?4. ¿Qué importancia tiene el proceso mitótico para la vida celular?5. Investiga algún beneficio que pueda traer el proceso mitótico para el hombre.



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Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLa orceína contiene ácido acético glacial (50 %), por lo tanto se debe utilizar guantes deneopreno para evitar el contacto con ellos pues puede causar irritación y quemaduras.Lavar con mucho agua en caso de exposición. Si se llega a inhalar, sacar al aire frescorápidamente Si se llega a ingerir, dar a beber abundante agua.El HCl provoca quemaduras e irrita las vías respiratorias puesto que es una sustancia muycorrosiva y se tiene que usar guantes de caucho nitrilo. En caso de perdida delconocimiento nunca dar a beber ni provocar el vomito. Si se inhala, trasladar a la personaal aire libre. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica. Si se tienecontacto con la piel lavar abundantemente con agua. Quitarse las ropas contaminadas. Encaso de contacto con los ojos, lavar abundantemente con agua manteniendo los parpadosabiertos. Pedir atención médica. Si se llega a ingerir, beber abundante agua. Evitar elvómito. Pedir atención médica. En contacto con metales puede formarse hidrógenogaseoso.

Disposicion de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosSe deben neutralizar todos los desechos con carbonato hidrogenado. Ya neutralizadospueden ir al desagüe. Los portaobjetos se pueden lavar y los cubreobjetos se depositaránen el contenedor de objetos punzocortantes.

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Práctica No. 6 Acción hormonal


Esta práctica será propuesta por los alumnos.

Objetivo

Introducción

MaterialMaterial biológico Cantidad Reactivos Canidad

Equipos

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Método1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Resultados

Observaciones

Conclusiones

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Bibliografía

Cuestionario1. 2. 3. 4. 5.


Aspecto a evaluar %Comportamiento 40Protocolo 30Examen 30Ésta práctica deberá ser propuesta al profesor y registrada por él ocho días antes de surealización. Se debe realizar todo el protocolo y proponer mínimo 5 preguntas quepermitan ampliar los conocimientos en el tema y conectarlos con la unidad de hormonas.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

Disposicion de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

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Práctica No. 7 Hemoglobina


ObjetivoEl objetivo de esta práctica es relacionar rutas metabólicas de la bioquímica con procesosfisiológicos a nivel corporal. En ese caso se determina la cantidad de hemoglobina oxidadaa metahemoglobina por el oxígeno.

IntroducciónLa hemoglobina es una proteína pigmentada de color rojo transportadora de oxígeno quese encuentra solo en los eritrocitos de los vertebrados. Es un tetrámero con dos pares decadenas polipeptídicas diferentes. Cada una de ellas posee un derivado de la porfirinallamado grupo hemo, que a su vez contiene hierro. Las dos principales funciones de lahemoglobina son el transporte de oxígeno y amortiguador del pH. Las concentraciones dehemoglobina están influidas por variaciones fisiológicas como la edad, sexo,deshidratación, postura y altitud y por procesos patológicos. La determinación de laconcentración de hemoglobina se ha convertido en una de las pruebas más importantes enel diagnóstico y tratamiento de la anemia.


Tubos de ensayo 3 Anticoagulante: 1 % EDTA 12 m%Pipetas 4 Solución de Drabkin & 5 m%

KCN (0,5%) & 20 µ%Equipo K3[Fe(CN)6] (0,5 %) 10 µ%Espectrofotómetro 1

Sangre del estudiante )

Método1) Determinación de Hb cuantitativo1.1. Extraer sangre (capilar) y recibirla en un tubo con 20 µ% de EDTA1.2. Añadir a 20 µ% sangre 5 m% soln de Drabkin y mezclarlo1.3. Incubar por 25 min a temperatura ambiente en la oscuridad1.4. Determinar extinción a λ = 540 nm

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∆E *F * d

Hb540

ε = mM∆E540: extinción @ λ = 540 nmF (factor de dilución): 5,02 ÷ 0,02 = 251e (coeficiente de extinción): 11 cm2/µmold (celda): 1 cm

2) Determinar Meta-hemoglobina2.1. Extraer 100 µ% sangre (capilar) y recibirla en un tubo con 5 m% A. dest.2.2. Mezclar e incubar por 10 min a temperatura ambiente

Prodecimiento Ext.630

1) 2 m% muestra + 10 µ% A. dest. E1:+ 10 µ% KCN, después de 5 min E2:

2) 2 m% muestra + 10 µ% K3[Fe(CN)6], después de 5 min E3:+ 10 µ% KCN, después de 5 min E4:

- determinar extinción @ λ = 630 nm

CálculoE - EE - E

Met - Hb1 2

3 4* [%]100 =

Resultados

Observaciones

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Conclusiones

Bibliografía1. Ganong, W.F. (2006): Fisiología Médica. 20. ed. Manual Moderno2. Guyton, A.C. & J.E. Hall (2006): Tratado de Fisiología Médica. 11. ed. Elsevier3. Murray, R.K., D.K Granner & V.W. Rodwell (2007): Bioquímica ilustrada. 17. ed., Manual

Moderno4. Voet, D. & J.G. Voet (2004) Biochemistry. 3. ed., Wiley


esta práctica.2. Realice los cálculos necesarios para la elaboración de las diluciones utilizadas.3. Explique el metabolismo del hierro.4. Explique el transporte de O2 y la regulación del pH.5. Explique el fundamento de la técnica utilizada en esta práctica.6. Compare los espectros de Hb, oxi-Hb, CO-Hb, meta-Hb y Ciano-met-Hb. ¿Cuáles

concentraciones de estas formas son normales?



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Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLa sangre es un material biológico potencialmente infeccioso y por eso se tiene que traerguantes de látex. Durante la extracción de la sangre se debe tener cuidado de no picarsecon la aguja y evitar salpicaduras. La contaminación con sangre puede provocar latransmisión de infecciones como VIH, hepatitis vírica B y C, sífilis, la infección porcitomegalovirus, la malaria. infecciones por el virus herpético, mononucleosis infecciosa (elvirus de Epstein-Barr), toxoplasmosis, tripanosomiasis [enfermedad del sueño africana yenfermedad de Chagas], leishmaniosis, brucelosis [fiebre de Malta], tifus, filariasis,sarampión, salmonelosis, entre otras, las cuales pueden ocurrir de diversas formas: la másfrecuente es la inoculación accidental por pinchazos con agujas o bisturíes contaminadoscon sangre de pacientes infectados, pero ésta no es la única forma de transmisión, ya quetambién puede efectuarse mediante salpicaduras de sangre a los ojos, en partes de la pieldonde existan pequeños cortes o abrasiones y por contacto con las prendas o equiposcontaminados con sangre fresca.

El cianuro de potasio es muy tóxico y por eso se tiene que traer guantes neopreno o PVCpara su protección. Nunca se añade ácido en soluciones de KCN para no liberar HCN.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos tubos que contienen sangre y cianuro se tienen que alcalinizar (pH 12 con sosa) ycolectar en un contenedor de cianuros y además clasificarlo como residuo biológicoinfeccioso. ¡Nunca se añaden ácidos a este contenedor!

Con relación a la sangre restante deberán disponerse los desechos en un contenedor rojoque tenga la leyenda: "Peligro residuo biológico infeccioso nivel II". Los residuos del grupoII se recogerán en bolsas y recipientes cuyas características técnicas se adaptarán a loscriterios siguientes: estanqueidad total, opacidad a la vista, resistentes a la rotura, asepsiatotal en su exterior, ausencia total en su exterior de elementos sólidos, punzantes ycortantes, cierre especial hermético de fácil apertura y que no pueda abrirse de formaaccidental. Los residuos se podrán eliminar siempre que hayan sido previamente tratadosmediante esterilización por vapor caliente a presión por técnica de autoclave, es decirmediante acción desinfectante por proceso fraccionado de vapor al vacío.

Residuos sanitarios cortantes y punzantes:Los residuos cortantes y punzantes han de ser recogidos en recipientes impermeables,rígidos y a prueba de pinchazos. Pueden ser tratados mediante esterilización yposteriormente tendrán que eliminarse como residuos sanitarios específicos.

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