Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Agroalimentarias

Escuela de Agronomía

Determinación del comportamiento germinativo de semillas de cas (Psidium friedrichsthalianum L.), provenientes de la localidad de Coris de Cartago, sometidas a

diferentes temperaturas, métodos de extracción de semillas y periodos de almacenamiento.

Tesis presentada para optar por el grado de licenciada en Ingeniería Agronómica

Viviana Madrigal Ortiz

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio

2011

Determinación del comportamiento germinativo de semillas de cas (Psidiumriedrichsthalianum L.), provenientes de la localidad de Coris de Cartago, sometidas

a diferentes temperaturas, métodos de extracción de semillas y periodos dealmacenamiento

iii

Dedicatoria

A Dios, ya que sin él no hubiese podido lograr esta meta que me propuse alcanzar

al darme sabiduría y perseverancia. A mi familia por su inmenso apoyo y cariño a lo largo

de la realización de este trabajo, principalmente a mis padres a quienes debo todo lo que

soy hasta el día de hoy y quienes a través de su esfuerzo y sacrificio han hecho que este

sueño sea posible.

iv

Agradecimientos

A Dios que me ha guiado y a mi familia por su apoyo y amor.

A los Drs. Víctor Jiménez, Eric Guevara y Adriana Murillo por su constancia, interés y

valiosos aportes a mi trabajo derivados de su amplio conocimiento y experiencia.

Al M.Sc. Jorge Herrera por las observaciones y aportes a mi investigación.

Al señor Esteban Loría propietario de la finca “El Aguacate” quien proporcionó los frutos

de cas para la realización de este trabajo.

Al personal del Centro para Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS), quienes

pusieron su grano de arena para que esto fuera posible.

Muchas gracias.

v

Resumen

El cas, Psidium friedrichsthalianum, es un frutal perteneciente a la familia Myrtaceae. Dicho frutal ha sido poco estudiado, especialmente en lo referente al comportamiento de sus semillas. Es importante fomentar la investigación al respecto debido a que podría incrementarse su producción e incursión en nuevos mercados. Además, el cas es resistente a Meloidogyne sp. una plaga importante para el cultivo de guayaba, por lo que podría emplearse como portainjerto de éste y así reducir pérdidas económicas.

Con el fin de estudiar el comportamiento germinativo de las semillas de cas se efectuaron tres ensayos. En el primer ensayo se estudió la germinación utilizando diferentes temperaturas (20ºC, 25ºC y 30ºC), métodos de extracción de semillas (manual y enzimático) y madurez de frutos (maduros y sobremaduros). Este ensayo consistió en 9 repeticiones por tratamiento de 25 semillas cada una. En un segundo ensayo se evaluó el efecto de cambios de temperatura. Los tratamientos fueron los siguientes: 25°C constante, tres días a 25°C y el resto del período de evaluación a 30°C, 30°C constante, y tres días a 30°C y el resto del período de evaluación a 25°C. Se utilizó el método de extracción enzimática y no se tomó en cuenta la madurez del fruto. Este ensayo constó de 3 repeticiones por tratamiento de 25 semillas cada una.

Por otra parte, se estudió en un tercer ensayo el comportamiento germinativo de las semillas posterior a su almacenamiento a 5°C utilizando diferentes períodos (0, 2, 4, 8 y 12 semanas). Para ello se empleó el método de extracción enzimática. Se utilizaron tres repeticiones de 25 semillas cada una. Las variables evaluadas para los tres ensayos fueron: porcentaje de germinación, porcentaje de presencia de microorganismos, porcentaje de plántulas normales y altura.

Los resultados del ensayo uno y dos mostraron que la temperatura más adecuada para la germinación de las semillas de cas es la de 25ºC y la de 30ºC reduce la germinación. Además, la utilización de enzima pectinasa para la remoción de la pulpa reduce la presencia de microorganismos sobre la semilla. También, la combinación de temperatura de 25ºC y uso de pectinasa incrementa la velocidad de germinación de las semillas. Los resultados del ensayo 3 reflejaron que el almacenamiento de semillas a 5ºC en envases herméticos de vidrio mantiene la longevidad de las semillas de cas. Este almacenamiento tuvo efecto en la velocidad de inicio del proceso germinativo aunque; sin afectar su germinación final y humedad interna hasta por tres meses.

Palabras clave: pectinasa, germinación, sobremaduro, ortodoxas, recalcitrantes, latencia.

vi

ÍNDICE GENERAL

Página

Dedicatoria iii

Agradecimientos iv

Resumen v

Índice general vi

Índice de figuras viii

Índice de cuadros ix

Introducción 1

Objetivos de investigación 3

Revisión bibliográfica 4

1) La semilla y su germinación 4

2) Factores que afectan el proceso germinativo 5

i) Factores externos 5

ii) Reposo de semillas 8

3) Tipos de semillas y almacenamiento 10

Metodología 14

- Localización 14

- Clasificación de madurez de frutos 14

- Prueba de viabilidad 15

- Métodos de extracción de pulpa

a) Método manual

b) Método enzimático

15

15

15

- Ensayo 1 16

- Ensayo 2 18

- Ensayo 3 20

vii

Resultados 22

Discusión 34

Conclusiones 43

Bibliografía citada 45

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

1 Superficie de semillas extraídas de los frutos de cas con dos métodos: a) enzimático b) manual.

22

2 Presencia de microorganismos en la superficie de semillas de cas sometidas a diferentes temperaturas y métodos de extracción de semillas.

23

3 Presencia de microorganismos en la superficie de semillas de cas extraídas manualmente.

24

4 Germinación de semillas de cas sometidas a diferentes temperaturas y métodos de extracción de semillas.

25

5 Embriones de semillas de cas: a) normal al efectuar el corte y b) viables al someterlos a la prueba de tetrazolio.

26

6 Embriones de semillas no viables al efectuar el corte. 26

7 Altura de parte aérea de plántulas de cas a los 30 dds sometidas a diferentes temperaturas y métodos de extracción de semillas.

27

8 Presencia de microorganismos en la superficie de semillas de cas sometidas a cambio de temperatura.

28

9 Germinación de semillas de cas sometidas a cambio de temperatura.

29

10 Altura de parte aérea de plántulas de cas a los 30 dds sometidas a cambio de temperatura.

31

11 Germinación de semillas de cas sometidas a diferentes periodos de almacenamiento.

32

12 Altura de parte aérea de plántulas de cas a los 30 dds sometidas a diferentes periodos de almacenamiento.

33

ix

ÍNDICE DE CUADROS

Página

l Porcentaje de humedad de semillas de cas sometidas a diferentes periodos de almacenamiento.

32

1

Introducción

El cas (Psidium friedrichsthalianum L.) es un frutal de la familia Myrtaceae,

originario de América Central (Baraona 2000). Este frutal es explotado por pequeños

productores, generalmente en asocio con otros cultivos. No obstante, su producción a

nivel internacional es baja y, en el caso de Costa Rica, comparada con la de otros

frutales, es poco significativa (Baraona 2000).

Este fruto se comercializa a nivel local, ya sea para consumo fresco o como

materia prima para la producción de helados, bebidas y postres (Baraona y Rivera 1995).

También, la creciente preocupación por una alimentación más sana ha hecho de los

concentrados de fruta una alternativa para el aprovechamiento a mayor escala de la pulpa

de frutos tropicales como el cas (Baraona y Rivera 1995). La utilización de pulpas para la

elaboración de bebidas naturales por parte de las empresas productoras de refrescos ha

ido en aumento. Al elevarse la demanda se requiere de una producción continua y

eficiente para lograr altos rendimientos y brindar una mayor oferta al consumidor. Esto no

solo favorece el consumo del producto, sino que abre puertas a nuevos mercados

(Gutiérrez 2009; Gutiérrez s.f.). En los últimos años se ha incrementado el interés por su

cultivo y por aumentar su producción; sin embargo, sigue siendo un cultivo poco estudiado

(Baraona y Rivera 1995).

En nuestro país se encuentran principalmente árboles aislados, y las plantaciones

existentes se han generado por medio de semillas, lo que lleva a una gran variabilidad en

las características de los árboles (Baraona 2000). Esta misma autora menciona que en

Costa Rica el cas criollo es el más cultivado en el Valle Central, en las zonas productoras

de café.

2

El cas es un árbol cuyo crecimiento se ve favorecido por climas húmedos, no

tolera las sequías prolongadas ni bajas temperaturas; además, requiere de altitudes

medias (CATIE 2003). La reproducción se da por semilla, estacas y acodos, aunque cabe

mencionar que los métodos asexuales han sido poco exitosos (CATIE 2003). Se estima,

según lo reportado por CATIE (2003), que las semillas de este frutal no requieren de

tratamientos pre-germinativos para una germinación exitosa. Un estudio efectuado por

Rodríguez et al. (2008) mostró que el fruto de cas contiene un gran número de semillas.

Esta característica puede emplearse para maximizar su propagación y obtener mayor

producción de plántulas.

Por otra parte, es importante resaltar que la planta de cas posee una alta

resistencia al nematodo Meloidogyne sp. (El-Borai y Duncan 2005; Matehus et al. 1999).

Khan et al. (2007) y Rivero et al. (1999) indican que los nematodos son de las principales

limitantes para un cultivo rentable de guayaba (Psidium guajava), otra Myrtaceae del

mismo género. Meloidogyne sp. debilita las raíces y las hace más susceptibles al ataque

de varios agentes patógenos, lo cual genera grandes pérdidas económicas, ya que

disminuye la producción. Carneiro et al. (2007) manifiestan que el uso de patrones de

plantas con resistencia a nematodos es una práctica promisoria para el aumento de los

rendimientos del cultivo de guayaba. Utilizar cas como portainjerto de guayaba favorece la

disminución en el uso de compuestos químicos para el control de esta plaga, reduciendo

su impacto a nivel ambiental (Marin et al. 2000). Para una eficiente producción de

patrones de injertación es importante contar con semilla de calidad, lo cual es

fundamental para el establecimiento de una plantación de guayaba resistente a la plaga

(Baraona 2000).

Para lo anterior se debe tener un amplio conocimiento de la anatomía y fisiología

de las semillas y de las condiciones adecuadas para que estas puedan germinar. En

3

ocasiones las semillas no se pueden utilizar en un momento dado o deben ser

transportadas a otro sitio, por lo que es necesario almacenarlas. Es por esto que conocer

los aspectos fisiológicos de las semillas durante el almacenamiento es vital para

determinar si sufren algún cambio como respuesta a factores exógenos o endógenos que

afecten su germinación (Chong et al. 2002).

Objetivo general

• Estudiar la respuesta en la germinación de semillas de cas (Psidium

friedrichsthalianum L.) a diferentes temperaturas, métodos de extracción de

semillas y periodos de almacenamiento.

Objetivos específicos

• Determinar un método adecuado para la extracción de semillas de frutos de cas y

su efecto en la germinación.

• Comparar el comportamiento germinativo de las semillas de frutos maduros y en

estado avanzado de madurez (sobremaduros).

• Determinar el efecto de tres temperaturas sobre la germinación de semillas de cas.

• Evaluar la germinación de semillas de cas a lo largo del almacenamiento.

4

Revisión Bibliográfica

1) La semilla y su germinación

La forma de propagación de la mayoría de las plantas se da por medio de semillas.

Se dice que una semilla está lista para generar una nueva planta cuando el embrión ha

alcanzado su madurez. Cuando los factores ambientales o externos son favorables ocurre

entonces el proceso de germinación (Guevara et al. 2006).

La germinación es el proceso fisiológico que inicia cuando la semilla absorbe agua,

con lo cual se incrementa la actividad metabólica, se produce la emergencia de la radícula

y la elongación del eje embrionario (Rajjou et al. 2004). Para que esto ocurra la semilla

debe pasar por tres etapas: imbibición, activación metabólica (germinación sensu stricto) y

crecimiento de la radícula (Guevara et al. 2006).

Las semillas de las angiospermas tienen dos capas que recubren el embrión, el

endospermo y la cubierta seminal o testa (Rajjou et al. 2004). Para que la germinación se

lleve a cabo es fundamental la elongación de las células que componen al embrión para la

consiguiente salida de la radícula, lo cual es catalogado como el modo visible del proceso

de germinación (Finch-Savage y Leubner-Metzger 2006). Por otra parte, algunos autores

definen en un sentido más amplio la germinación como la capacidad de la semilla para

generar nuevas plantas con todas sus estructuras normales y con posibilidades de

sobrevivencia en el campo (ISTA 2008; Santos 2008).

5

2) Factores que afectan el proceso germinativo

La germinación de las semillas puede estar limitada por factores externos o

internos. Es importante mencionar que cada especie, así como las diferentes variedades,

pueden tener diversos requisitos para la germinación de sus semillas, los cuales están

influenciados por aspectos genéticos y por las condiciones en que se forma la semilla

misma (Koornneef et al. 2002; Santos et al. 2009).

i) Factores externos

Dentro de los factores externos que afectan la germinación se encuentran:

humedad o disponibilidad de agua para la semilla, temperatura, oxígeno y luz (Santos

2008).

La absorción de agua (imbibición) o exposición de las semillas a ésta es vital para

que ocurra la germinación (Meza y Bautista 2007). Esto se debe a que la imbibición

favorece la rehidratación celular y por consiguiente la activación enzimática. En esta fase

se incrementa la actividad metabólica con la rehidratación de la membrana antes rígida,

síntesis de mitocondrias, reparación de ADN, disminución de pérdida de solutos, glucólisis

y movilización de las reservas. Es importante mencionar que a partir de la imbibición de

las semillas se desencadena una importante secuencia de reacciones químicas (Guevara

et al. 2006).

El sustrato utilizado para la germinación afecta la cantidad de agua disponible.

Pereira y Andrade (1994) mostraron que la utilización de papel y vermiculita como

sustratos permite mantener la humedad para que la semilla de maracuyá (Passiflora

edulis) pueda germinar eficientemente. Por otra parte, Rivero et al. (1999) encontraron

que el tipo sustrato no tiene efecto sobre la germinación de semillas de cas.

6

La temperatura es un factor externo esencial para que la semilla germine y los

requerimientos de la misma varían entre especies. El someter a la semilla a una

temperatura adecuada incrementa la actividad y reacciones metabólicas dentro de ésta,

como el inicio del proceso germinativo (Bhanuprakash et al. 2008). Otro factor que juega

un papel importante es el oxígeno; el cual, aunque se requiere en bajas cantidades, debe

estar disponible para el embrión a través del agua de imbibición. Las cantidades

excesivas de humedad conducen a una condición de anoxia, la cual es perjudicial debido

a la falta de oxígeno para el embrión (Black 2009; Singh y Soni 1974). Esto implica que

las semillas no deben sumergirse, sino colocarse sobre una pequeña película de agua

para evitar esta condición de anoxia. Según Caraballo (2008), la absorción de oxígeno se

incrementa con el aumento de la actividad metabólica y avance del proceso de

germinación, lo cual puede ser usado como un indicativo del vigor de la semilla.

Según Chong et al. (2002), la luz también incide sobre la actividad de los

fitocromos, los cuales reaccionan y estimulan el proceso de germinación, lo cual varía

entre especies. La luz es un factor esencial para algunas plantas, por lo que establece

hábitats específicos dependiendo de los requerimientos que demande la semilla para

poder germinar, lo cual es evidente cuando se encuentran ciertas especies en lugares de

mucha o poca luz. En ocasiones la luz regula el proceso germinativo de algunas plantas

de la familia Myrtaceae. En condiciones naturales esto está determinado por la

profundidad a la que se encuentre la semilla en el suelo (Caraballo 2008). Por ejemplo,

De Paula et al. (2001) encontraron que una mayor presencia de luz favorece la

germinación de semillas de Eugenia uniflora. También, Ferraz y Ferreira (1992) evaluaron

el efecto de la luz sobre la germinación de Myrciaria cauliflora y encontraron que en estas

semillas la luz no influye en la capacidad germinativa.

7

Es importante mencionar que la utilización de temperaturas adecuadas favorece la

germinación de las semillas al aumentar su actividad metabólica. Este tipo de tratamientos

se ha empleado para estimular la germinación de semillas de guayaba, en donde su

exposición a temperatura de 25ºC incrementó el porcentaje germinativo, al igual que la

exposición a la luz por periodos entre las 10 y 24 horas (Sugahara y Takaki, 2004). Otro

estudio realizado por Otegui et al. (2007) mostró que la utilización de temperatura de 27ºC

incrementa la germinación de semillas de Psidium cuneatum.

Una temperatura constante de 25ºC y la presencia de luz con un fotoperiodo de 24

horas favoreció la germinación de semillas de Metrosideros polymorpha, también

perteneciente a la familia Myrtaceae (Burton 1982). Por otra parte, Drake (1993) encontró

que semillas de M. polymorpha tuvieron buenos porcentajes de germinación

sometiéndolas a temperaturas constantes, en un rango de 10ºC - 34ºC. De acuerdo con

los resultados obtenidos, concluyó que dichas semillas pueden germinar en diferentes

condiciones ambientales, aunque cabe mencionar que los mejores resultados en cuanto a

la velocidad germinativa fueron los obtenidos a 22ºC y los menores a 34ºC.

También, Ferraz y Ferreira (1992) agregan que semillas de Myrciaria cauliflora

(Myrtaceae) son capaces de germinar eficientemente a temperatura de 30ºC. Otro estudio

efectuado en semillas de diferentes especies de Eugenia (E. uniflora, E. involucrata, E.

brasiliensis), todas pertenecientes a la familia Myrtaceae, mostró que las semillas

germinan adecuadamente a temperatura de 30ºC, además de no requerir de tratamientos

para facilitar la germinación, en este caso de cortes en la superficie de la semilla

(Vendrame et al. 2005). La investigación realizada por Santos (2008) reflejó que la

temperatura de 25ºC es adecuada para la germinación de semillas de Blepharocalix

salicifolius y Myrceugenia gertii, ambas de la familia Myrtaceae.

8

Por otra parte, Maeda et al. (1999) evaluaron la germinación de semillas de

guayaba extraídas de frutos con diferente madurez. Los autores recomiendan no utilizar

los frutos cuando estos han caído del árbol, debido a que esta condición puede afectar la

calidad fisiológica de las semillas, ya sea por golpes que dañen el embrión y afecten la

posterior normalidad de las plántulas, o por presencia de microorganismos que sean

patógenos a la semilla y que afecten su germinación. La pulpa de frutos de cas es rica en

pectina, además de poseer alrededor de 0,88 % de proteínas y 7,9 % de fibra, lo cual

puede favorecer el crecimiento y proliferación de microorganismos sobre la superficie de

las semillas y de esta manera afectar la germinación del material (Rodríguez et al. 2008).

Es importante mencionar que la presencia de microorganismos sobre las semillas

puede también verse favorecida por la temperatura a la que estén expuestas. Según

Deacon (1997), los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo con su capacidad

de crecimiento y tolerancia a diferentes temperaturas. Los hongos mesófilos son los que

crecen favorablemente a temperaturas entre 20ºC y 35ºC y termófilos los que crecen a

temperaturas por encima de los 35ºC (Deacon 1997).

ii) Reposo de semillas

Un factor interno que afecta la germinación de las semillas es el reposo (Ortiz y

Castillo 2007). Según Finch-Savage y Leubner-Metzger (2006), el reposo no debe

relacionarse solamente con la ausencia de germinación, sino que debe ser visto como

una característica propia de la semilla que facilita la determinación de las condiciones más

favorables para el inicio del proceso germinativo de las mismas.

Es importante mencionar que existen dos tipos de reposo: el primario y el

secundario. El reposo primario se origina desde la planta madre durante la maduración

(Bewley 1943). En este caso, aunque una semilla viable cuente con las condiciones

9

adecuadas para su germinación, en cuanto a temperatura, humedad y oxígeno, ésta no

ocurre debido a condiciones intrínsecas (Frank y Dennis 2002). El reposo primario puede

ser causado por inmadurez del embrión, restricciones mecánicas dadas por la cubierta

seminal o los tejidos de reserva, impermeabilidad de la cubierta seminal al agua y al

oxígeno o la presencia de sustancias inhibidoras (Herrera y Arias 1982).

Según Bewley (1943), el reposo secundario se da una vez que se ha superado el

reposo primario. La semilla ya dispersada y madura responde a una condición de

germinación desfavorable. Este reposo puede producirse por condiciones ambientales

adversas o alteraciones en los niveles de ácido abscísico (ABA) y giberelinas endógenos.

Aún si éstas condiciones alcanzan niveles adecuados para la semilla, ésta no germina

(Gupta 2003; Holdsworth et al. 2007).

Con el fin de disminuir el reposo de semillas de diferentes cultivos se han utilizado

diversas estrategias para favorecer el proceso germinativo. Según Bewley (1997), los

tratamientos para la ruptura del reposo de las semillas facilitan la imbibición, el

intercambio gaseoso, incrementan la sensibilidad a la luz y a la temperatura y alteran el

balance de reguladores de crecimiento. Dentro de los métodos empleados para tal fin se

encuentran la escarificación, ya sea por abrasión mecánica o por la utilización de

sustancias químicas, como ácidos (Chong et al. 2002). La escarificación mecánica se

caracteriza por el empleo de utensilios recubiertos con lijas y con arena, en donde se

agitan las semillas y en consecuencia se remueve parte de la cubierta de éstas,

favoreciendo el intercambio gaseoso y absorción de agua (Tavares et al. 1995). Dentro de

los métodos de escarificación química se encuentran la utilización de ácidos, como el

clorhídrico y el sulfúrico (Chong et al. 2002). También existen métodos de escarificación

física como inmersión de las semillas en agua caliente (Bhanuprakash et al. 2008; Essien

2004; Singh y Soni 1974; Somarriba 1986). Además, existen tratamientos hormonales

10

para promover la germinación de semillas, donde ha predominado el uso de giberelinas y

etileno.

Con la finalidad de promover la utilización del cultivo de cas como portainjerto de

guayaba, Rivero et al. (1999) probaron los siguientes tratamientos para favorecer la

germinación de semillas de cas: inmersiones en agua caliente por un minuto (50ºC, 75ºC

y 100ºC), utilización de ácido sulfúrico concentrado (15, 30, 45, 60, 75, y 90 min) y

abrasión mecánica con el uso de un cilindro revestido en el interior con papel lija por 15

min. Sin embargo, los resultados obtenidos no mostraron grandes diferencias entre los

tratamientos utilizados. Debido a lo anterior los autores manifiestan que podría deberse a

la ausencia de reposo, ya que hubo germinación tanto de las semillas del testigo como de

las pertenecientes al resto de los tratamientos.

3) Tipos de semilla y almacenamiento

Un aspecto a tomar en cuenta para la reproducción exitosa de muchos cultivos es

la viabilidad de las semillas, la cual depende del tipo de semilla y puede estar relacionada

con las condiciones de su almacenamiento, ya que en ocasiones pierden su capacidad

germinativa a consecuencia de esto (Bewley 1997).

Según Bonner (2008) y Ferraz y Ferreira (1992), la longevidad de las semillas

puede estar sujeta al contenido de humedad y la temperatura. Dicha longevidad puede

incrementarse o disminuir si estos factores no son manejados adecuadamente. Justo et

al. (2007) agregan que la viabilidad de algunas semillas puede verse afectada por una

disminución en los contenidos de humedad interna.

De acuerdo con los requerimientos de humedad interna, las semillas se clasifican

en: recalcitrantes, ortodoxas y de condición intermedia. Las semillas recalcitrantes

11

requieren de altos contenidos de humedad (30 % - 50 %) para ser viables. La pérdida de

humedad por debajo de 10 % - 12 % propicia su muerte (Hong y Ellis 1996). Sin embargo,

las semillas recalcitrantes pueden almacenarse a 0ºC sin afectar su viabilidad. Este

aspecto es de gran importancia al diseñar las estrategias para su almacenamiento (Nunes

y Cunha 2000).

Lo contrario ocurre con las semillas clasificadas como ortodoxas, las cuales

pueden tolerar desecación hasta contenidos de humedad de 5 %. Además, pueden ser

almacenadas a temperaturas bajo cero de forma exitosa (Bonner 2008). Hong y Ellis

(1996) agregan que las semillas ortodoxas almacenadas herméticamente a -20ºC por tres

meses podrían mantener una viabilidad de 100 %. Al estar seca la semilla, sus procesos

metabólicos se detienen, por lo que se encuentra en un estado que permite su

almacenamiento hasta que sea utilizada (Bonner 2008; Hong et al. 1996; Mitra 2010;

Polenz et al. 2006; Sena et al. 2009). Bonner (2008) agrega que tanto semillas ortodoxas

como recalcitrantes pueden ser almacenadas a temperaturas entre 0ºC - 5ºC, sin afectar

su germinación.

También existe un grupo de semillas cuyas características en cuanto a tolerancia a

la desecación son intermedias, por lo que no pueden ser clasificadas como recalcitrantes

ni como ortodoxas. Las semillas de condición intermedia pueden tolerar pérdidas de agua

hasta alcanzar un contenido de humedad ligeramente superior al de las ortodoxas (12 % -

15 %). Si se desecan hasta alcanzar un contenido de humedad de 5 % pierden una alto

porcentaje de viabilidad (Hong y Ellis 1996). La temperatura de almacenamiento también

es diferente al de semillas ortodoxas, ya que las semillas intermedias son sensibles a las

bajas temperaturas, las cuales, de mantenerse por mucho tiempo, podrían afectar su

viabilidad (Bonner 2008).

12

Para el almacenamiento de semillas es fundamental considerar algunos factores

que son claves para el mantenimiento de su viabilidad, tales como: tipo, morfología,

composición química y madurez (Hong y Ellis 1996). De acuerdo a lo anterior es

importante tener conocimiento del tipo de semilla que va a almacenarse, ya sea ortodoxa

o recalcitrante, lo cual está vinculado con la capacidad de tolerar la pérdida de humedad

(Bonner 2008). La morfología es un factor que está asociado con las características

estructurales de la cubierta seminal y la regulación del intercambio gaseoso y retención de

la humedad interna.

La composición química es otro factor que condiciona la longevidad de los

embriones a lo largo del almacenamiento (Hong et al. 1996). Las semillas con un mayor

contenido de lípidos pueden almacenarse de mejor manera que aquellas con menor

contenido de aceites (Hong et al. 1996). De igual forma, un alto contenido de hidratos de

carbono minimiza la desecación (Bonner 2008). Es importante mencionar que lo anterior

difiere entre especies, y requiere de mayor investigación (Bonner 2008).

Otro factor importante es la madurez. Una semilla inmadura no posee los

compuestos (enzimas, reservas y reguladores de crecimiento), estructura ni organización

de las células necesarios para poder germinar exitosamente. Lo anterior es de gran

importancia para que ocurran las reacciones metabólicas que el proceso germinativo

demanda (Bonner 2008).

No existe información sobre la respuesta de semillas de cas al almacenamiento;

sin embargo, Rivero et al. (1999) observaron que la germinación de semillas de cas recién

extraídas de los frutos (frescos) fue alta sin necesidad de aplicar ningún tratamiento pre-

germinativo.

Estudios con otros géneros de la familia Myrtaceae incluyen el de Ferreira y

Barbedo (2007), quienes sometieron semillas de varias especies de Eugenia (E.

13

brasiliensis, E. cerasiflora, E. involucrata, E. pyriformis, E. umbelliflora y E. uniflora), a dos

métodos de secamiento, uno intermitente en horno a temperatura de 40ºC con circulación

de aire (8 horas secamiento y 16 en reposo) y otro continuo en recipientes cerrados

herméticamente con sílica-gel a 25ºC y 10 % de agua. Encontraron que al disminuir el

contenido de humedad se reducía la germinación. A contenidos de humedad menores a

45 % las semillas perdieron su capacidad germinativa independientemente del método de

secamiento. Por otra parte, Scalon et al. (2004) encontraron que las semillas de Eugenia

uvalha germinaron adecuadamente luego de ser sometidas a bajas temperaturas de

almacenamiento sin requerir de tratamientos pregerminativos que favorecieran el proceso

de germinación.

De acuerdo a los resultados obtenidos por Cisneiros et al. (2003), las semillas de

Psidium guineensis se conservan a temperaturas por debajo de 0ºC, por lo que se

consideran ortodoxas. En esa investigación, el almacenamiento en bolsas de papel a

temperatura ambiente dio resultados satisfactorios para la conservación, al preservar la

calidad y mantener la viabilidad. Otegui et al. (2007) conservaron eficientemente semillas

de Psidium cuneatum a bajas temperaturas y almacenadas en envases herméticos hasta

por 270 días. El envase permeable fue eficaz cuando el almacenamiento fue a

temperatura ambiente.

14

Metodología

Localización

Esta investigación se efectuó en el Centro para Investigaciones en Granos y

Semillas (CIGRAS) de la Facultad de Ciencias Agroalimentarias de la Universidad de

Costa Rica, localizada en San Pedro de Montes de Oca. Los frutos fueron tomados de

árboles de cas (Psidium friedrichsthalianum L.) localizados en Coris de Cartago en la finca

“El Aguacate”, la cual se ubica a 09°54'49" latitud norte y 83°59'51" longitud oeste. La

recolección de los frutos para la realización del primer ensayo se efectuó en el mes de

julio, y en el mes de setiembre para los ensayos posteriores.

Los frutos fueron recolectados de árboles de tipo criollo, de aproximadamente 30-

35 años. El pico de producción de estos árboles se da en diciembre-enero y junio–julio;

aunque cabe resaltar que se pueden encontrar frutos en toda época del año.

Clasificación de madurez de los frutos (medición de firmeza)

Se definieron como maduros los frutos firmes, de color verde-amarillento y con

superficie brillante al momento de extraer la semilla (Baraona 2000). Se tomaron como

frutos en estado avanzado de madurez o sobremaduros, los que presentaron coloración

amarilla en su totalidad y poca firmeza. No se utilizaron frutos que reflejaran presencia de

microorganismos.

Para medir la firmeza se evaluó la resistencia a la penetración de los frutos

recolectados con un penetrómetro modelo Ft 011 con cabeza convexa de 7 mm (QA

Supplies, Norfolk, Virginia, EUA).

15

Prueba de viabilidad

El lote de semillas se dejó en imbibición sobre una pequeña película de agua

destilada por un periodo de 48 horas. Transcurrida esta etapa, se cortaron con la ayuda

de una cuchilla, una pinza y un lente de aumento. El corte se realizó de forma longitudinal

y superficial para evitar daños en el embrión. Las semillas se colocaron en una solución

de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio al 1 %, se cubrieron con papel aluminio y se dejaron

en esas condiciones por 24 horas a 25ºC (Vadillo et al. 2004). Se consideró como una

semilla viable aquella cuyo embrión adquirió una coloración rojiza (Russi et al. 2007).

Métodos de extracción de las semillas

Se practicaron dos métodos de extracción:

a) Método manual

Este método consistió en el lavado de la pulpa con agua y un colador para separar

las semillas, a las cuales se les realizó adicionalmente un rápido enjuague con agua

destilada.

b) Método enzimático

En este caso se utilizó la enzima pectinasa (Pectinase 62L-P062L

BIOCATALYSTS, Gales, RU) a una concentración de 2% (v/v) en agua destilada

(Schweiggert et al. 2009). Estas semillas se colocaron en Erlenmeyers con la solución

enzimática y cubiertos con papel aluminio sobre agitadores JENWAY 1000 (Hotplate &

16

Stirrer) y VEIA (Cole Parmer) por 24 horas a 120 rpm. Transcurrido ese tiempo se sacaron

y se enjuagaron con agua destilada para eliminar los restos de la solución enzimática.

Ensayo 1: Efecto de temperatura, grado de madurez del fruto y método de

extracción sobre la germinación

Para este ensayo se utilizaron alrededor de 30 árboles de cas. Los frutos fueron

clasificados en dos categorías: maduros y en estado avanzado de madurez

(sobremaduros) empleando la prueba de clasificación descrita anteriormente. Se tomaron

alrededor de 3200 semillas de los frutos con una espátula y de este lote se separó un

grupo de 75 semillas para efectuar la prueba de viabilidad, tal y como se describió

anteriormente. Los beakers fueron rotulados según la madurez del fruto (maduros-

sobremaduros) y el método de extracción empleado para la eliminación de la pulpa

(manual-enzimático). Se tomaron 700 semillas de frutos maduros y sobremaduros, tanto

para efectuar la extracción manual de la pulpa, como para llevar a cabo la extracción

enzimática descritas anteriormente.

Una vez extraídas (manualmente o con enzima) se colocaron con una pinza en

una cámara de flujo laminar, 25 semillas (9 repeticiones por tratamiento para introducir la

variación dada por la cámara de crecimiento utilizada) sobre dos capas de papel de filtro

(Whatman # 2, Maidstone, RU) colocadas en placas de Petri de 15 cm de diámetro

previamente autoclavadas. A cada placa sembrada se le colocó con una pipeta, 7 ml de

agua destilada estéril.

Finalizada la siembra de las semillas en las placas de Petri, se procedió a la

aplicación de los tratamientos, los cuales consistieron en tres temperaturas de

germinación. Para ello se utilizaron cámaras de crecimiento a 20ºC, 25ºC y 30ºC con 12

17

horas de luz. Estas condiciones fueron aplicadas tanto a semillas de frutos maduros como

a las semillas de frutos sobremaduros y a semillas extraídas manualmente y con

pectinasa, para un total de 36 placas por cámara. Las variables evaluadas fueron las

siguientes:

Porcentaje de germinación: se consideró como germinada la semilla con una

radícula de al menos 2 mm de longitud. La germinación se calculó de la siguiente forma:

(Nº de semillas germinadas/Nº de semillas sembradas) * 100. Dicha medición se realizó

una vez por semana durante un mes.

Porcentaje de semillas con presencia de microorganismos: (Nº de semillas

con hongo/Nº de semillas sembradas)*100. Estas evaluaciones se realizaron una vez por

semana durante un mes.

Porcentaje de plántulas normales: se consideró como una plántula normal la

que presentara al menos uno de los cotiledones en buen estado, además de radícula y

plúmula (ISTA 2008; Pereira y Andrade 1994). Se calculó de la siguiente manera: (Nº de

plántulas normales/ Nº de semillas germinadas)*100. Esta medición se llevó a cabo al

finalizar el ensayo a los 30 días después de la siembra (30 dds).

Altura de parte aérea (cm): se efectuó la medición a partir del punto de unión

entre la raíz y el tallo. Estas evaluaciones se efectuaron al final del ensayo (30 dds).

Dos veces por semana a lo largo de un mes se aplicó 1,5 ml de agua destilada

estéril a las placas de Petri para mantener la humedad. Al finalizar el ensayo se evaluó la

viabilidad con la solución de tetrazolio a las semillas que no germinaron.

Las placas de Petri fueron colocadas de forma aleatoria dentro de las cámaras y el

diseño experimental utilizado fue el de parcelas divididas, en donde la temperatura fue el

factor principal y el método de extracción (manual-enzimático) y la madurez del fruto

18

(maduro-sobremaduro) los subfactores. Los datos se evaluaron con un análisis de

varianza con medidas repetidas en el tiempo para las variables de porcentaje de

presencia de microorganismos y de germinación, utilizando el programa Statistica (versión

6, StatSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma, EUA). Para las variables de altura y porcentaje de

plántulas normales se utilizó el análisis de varianza para una sola medición en el tiempo.

Para la determinación de diferencias entre tratamientos se realizó la comparación de

medias de Bonferroni. Además para los datos de firmeza de los frutos se efectuó una

prueba de T.

Ensayo 2: Efecto del cambio de temperatura sobre la germinación

Este ensayo se efectuó para tratar de explicar el efecto negativo de la temperatura

de 30ºC sobre la germinación de acuerdo con los resultados obtenidos en el Ensayo 1.

Además, este ensayo tuvo como finalidad observar el efecto del cambio de temperatura

sobre la germinación y determinar el posible efecto inhibitorio de la temperatura de 30ºC.

Se utilizaron alrededor de 15 árboles para la obtención de los frutos para este

ensayo y el siguiente, provenientes de la misma finca citada anteriormente. Se extrajeron

1100 semillas de frutos de cas sin tomar en cuenta el grado de madurez de los mismos

(con base en los resultados del Ensayo 1). Además, se tomó una muestra de 70 semillas

del lote recolectado para la realización de la prueba de viabilidad con tetrazolio descrita

anteriormente. De acuerdo con los resultados obtenidos en el Ensayo 1, se extrajeron las

semillas con el método enzimático descrito previamente.

Seguidamente se sembraron las semillas en placas de Petri estériles de la misma

forma en que se describió en el Ensayo 1. Los tratamientos consistieron en cuatro

19

arreglos de temperaturas (25ºC, 30ºC, 25ºC-30ºC y 30ºC-25ºC) cada uno con tres

repeticiones de 25 semillas, como se describe a continuación:

Inicialmente, seis placas de Petri fueron colocadas en la cámara de 25ºC y las

otras seis en la de 30ºC. Transcurridos tres días desde la siembra del material, se

tomaron tres placas colocadas a 25ºC y se cambiaron a la cámara de 30ºC. También se

tomaron tres de las placas colocadas a 30ºC y se cambiaron a la cámara de 25ºC para

efectuar un cambio de temperatura. Para mantener la humedad se aplicaron, con una

pipeta, 1,5 ml de agua destilada estéril a las placas cuando fuera requerido.

Las variables a evaluar con este ensayo fueron el porcentaje de germinación,

porcentaje de presencia de microorganismos, porcentaje de plántulas normales y altura

(cm). En el caso del porcentaje de germinación y de presencia de microorganismos, las

evaluaciones fueron realizadas dos veces a la semana por un mes. Para las variables

porcentaje de plántulas normales y altura la evaluación se efectuó al finalizar el ensayo

que fue a los 32 días después de la siembra (32 dds).

Las semillas que no germinaron al final del experimento se sometieron a la prueba

de viabilidad con la solución de tetrazolio.

En este ensayo se utilizó un diseño irrestricto al azar con un solo factor

(temperatura). Para el análisis estadístico se empleó el programa Statistica con un

análisis de varianza de medidas repetidas para las variables de germinación y presencia

de microorganismos. Por otra parte, para las variables plántulas normales y altura se

efectuó un análisis de varianza para una medida en el tiempo.

20

Ensayo 3: Almacenamiento de las semillas de cas por diferentes periodos de

tiempo

Para este ensayo se utilizaron 750 semillas. La extracción de las mismas se

efectuó empleando el método enzimático descrito en el Ensayo 1. Posterior a esto fueron

colocadas sobre papel toalla y se dejaron secar por 2 horas en condiciones de laboratorio

(aire acondicionado). Seguidamente se colocaron en placas de Petri estériles selladas con

plástico y cubiertas con papel aluminio en un refrigerador a 5ºC (oscuridad), y se

sometieron a diferentes tratamientos, los cuales fueron: 0, 2, 4, 8 y 12 semanas de

almacenamiento.

Se determinó la humedad de las semillas antes del almacenamiento y al final de

cada período. Para esto se midió el peso inicial de una muestra de 75 semillas con una

balanza analítica, seguidamente se colocó dentro de un horno a 100ºC por 24 horas.

Transcurrido el tiempo se realizó nuevamente la toma del peso de la muestra para la

determinación del porcentaje de humedad gravimétrica (ISTA 2008).

Una vez finalizado el periodo de almacenamiento correspondiente a cada

tratamiento las semillas fueron sembradas en placas de Petri como se describió en los

ensayos anteriores y colocadas en una cámara a 25ºC, la cual se mantuvo a 12 horas de

luz. Para el testigo y los tratamientos de almacenamiento se determinó porcentaje de

germinación, porcentaje de plántulas normales, porcentaje de presencia de

microorganismos y altura de parte aérea (cm). A las semillas que no germinaron se les

realizó la prueba de viabilidad como se describió anteriormente.

Se realizaron tres repeticiones de 25 semillas por tratamiento. Para este ensayo se

empleó un diseño irrestricto al azar y el factor fue el período de almacenamiento. Se

aleatorizó la distribución de las placas de Petri en la cámara de crecimiento. El análisis

estadístico de los datos se realizó con el programa Statistica. Se utilizó un análisis de

21

varianza de medidas repetidas en el tiempo para las variables porcentaje de germinación

y presencia de microorganismos. En el caso de las variables altura y el porcentaje de

plántulas normales se usó un análisis de varianza para una medición en el tiempo. Para la

determinación de diferencias entre los tratamientos empleados se utilizó la separación de

medias de Bonferroni.

22

Resultados

Ensayo 1: Efecto de temperatura, grado de madurez del fruto y método de

extracción sobre la germinación

Al realizar la medición de firmeza de los frutos de cas con ayuda del penetrómetro

se pudo observar que los frutos definidos como maduros de acuerdo con su apariencia

externa presentaron una firmeza significativamente mayor (6,8 Newton [N]) que la de los

frutos en estado avanzado de madurez, en donde la resistencia fue de 0 N.

Con respecto a los métodos de extracción de semillas, se pudo observar al

estereoscopio (modelo 420-1105-10, National Optical Scientific Instruments Inc., Texas,

EUA) que las semillas extraídas enzimáticamente presentaron una superficie libre de

pulpa (Figura 1a), mientras que las extraídas con el método manual mantuvieron una

cantidad apreciable de pulpa en su superficie (Figura 1b).

Figura 1. Semillas extraídas de los frutos de cas con los métodos enzimático (a) y manual (b). Barra equivale a 1 mm.

a) b)

23

Las semillas con extracción enzimática presentaron menor presencia de

microorganismos (hongos) que las semillas extraídas con el método manual a lo largo de

todo el periodo evaluado (Figura 2). Las primeras alcanzaron un máximo de 10 % a los 30

días después de la siembra (30 dds), mientras que las extraídas manualmente alcanzaron

porcentajes superiores al 20 %, llegando incluso a más de 50 % en algunos tratamientos

(Figura 2). Para la misma fecha de evaluación la superficie de las semillas de los

tratamientos a 25ºC y 30ºC con extracción manual se encontraba altamente colonizada

por los microorganismos (Figura 3).

0

1 0

20

30

40

50

60

0 8 1 5 22 30

Días después de la siembra (dds)

Pre

senc

ia M

icro

orga

nism

os (%

)

Enzima 20ºC

Manual 20ºC

Enzima 25ºC

Manual 25ºC

Enzima 30ºC

Manual 30ºC

cdede

def

bcde

bcdbc

a

a

b

def

effff ff

Figura 2. Presencia de microorganismos en la superficie de semillas de cas sometidas a

diferentes temperaturas y métodos de extracción. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

En el caso de las semillas en donde la eliminación de pulpa de su superficie se

realizó por método enzimático se pudo observar claramente que no hubo diferencias

significativas para la variable presencia de microorganismos entre temperaturas ni a lo

largo del tiempo (Figura 2). Por otra parte, las semillas extraídas manualmente no

24

presentaron diferencias significativas entre temperaturas hasta los 22 dds. En la última

fecha de evaluación (30 dds), los mayores porcentajes de presencia de microorganismos

fueron alcanzados con las temperaturas de 25ºC y 30ºC, las cuales no mostraron

diferencias entre sí (Figura 2).

Figura 3. Presencia de microorganismos en la superficie de semillas de cas extraídas manualmente, a los 30 dds. Barra equivale a 1 mm.

En cuanto a la germinación, se pudo observar que el tratamiento a 25ºC con

extracción enzimática mostró una mayor germinación a los 15 dds, en comparación con el

resto de tratamientos, los cuales no mostraron diferencias significativas entre sí (Figura 4).

También, se pudo observar que las temperaturas de 20ºC y 25ºC con extracción

enzimática alcanzaron su máximo porcentaje de germinación a los 22 dds. En ese

momento, los valores de germinación de los tratamientos con extracción manual y

germinados a 20ºC y 25ºC fueron menores que los mostrados por los de extracción

enzimática a las mismas temperaturas, siendo el de 25ºC ligeramente mayor que el

primero.

25

Por otra parte, los tratamientos a 20ºC y 25ºC con extracción enzimática no

mostraron diferencias significativas entre sí ni con extracción manual a 25ºC para la última

evaluación. Este último tampoco fue diferente del tratamiento con extracción manual

germinado a 20ºC (Figura 4).

0

1 0

20

30

40

50

60

70

80

90

1 00

8 1 5 22 30

Días después de la siembra (dds)

Ger

min

ació

n (%

)

Enzima 20ºC

Manual 20ºCEnzima 25ºC

Manual 25ºCEnzima 30ºC

Manual 30ºC

f fff

e

b

d

aab

c

ab

Figura 4. Germinación de semillas de cas sometidas a diferentes temperaturas y métodos de extracción. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

Las semillas sometidas a temperatura de 30ºC, tanto las extraídas con enzima

como las extraídas manualmente, no germinaron (Figura4).

En general, los máximos porcentajes de germinación alcanzados fueron

ligeramente superiores a 80 %. La viabilidad promedio del lote de semillas inicial luego de

efectuar la prueba de tetrazolio fue de 78 %, lo cual se observó con semillas que

presentaron embriones de color rojizo (Figura 5). Esto indicaría que prácticamente

germinó la totalidad de las semillas capaces de germinar en esos tratamientos.

En cuanto a la prueba de viabilidad efectuada a las semillas que no germinaron,

las semillas de los tratamientos a 20ºC y 25ºC resultaron en su mayoría no viables. Las

26

semillas no viables mostraron ausencia de embrión al efectuar el corte o el mismo estaba

en descomposición (Figura 6). En el caso de las semillas no germinadas que se

encontraban a 30ºC, éstas mostraron valores de 90 % de viabilidad; o sea que no

germinaron a pesar de que tenían la capacidad de hacerlo.

Figura 5. Embriones de semillas de cas: a) al efectuar el corte y b) viables al someterlos a

la prueba de tetrazolio. Barra equivale a 1 mm.

Figura 6. Embriones de semillas no viables de los tratamientos a 20 y 25ºC al efectuar el corte: a) embrión en descomposición y b) ausencia de embrión. Barra equivale a 1 mm.

a) b)

a) b)

27

Con relación a la altura de las plántulas al final del ensayo, se pudo observar una

interacción entre los factores temperatura y método de extracción. Los resultados

obtenidos mostraron una altura mayor de las plántula del tratamiento a 25ºC, aumentado

aún más, por el uso de la enzima, al compararlas con 20ºC, tanto de aquellas extraídas

enzimáticamente como manualmente (Figura 7).

0,0

0,5

1 ,0

1 ,5

2,0

2,5

Enzima Manual Enzima Manual

20ºC 20ºC 25ºC 25ºC

Altu

ra (c

m)

Tratamientos

c c

b

a

Figura 7. Altura de parte aérea de plántulas de cas a los 30 dds sometidas a diferentes temperaturas y métodos de extracción de semillas. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

No se contempló la madurez de fruto en las figuras anteriores debido a que al

efectuar el análisis de varianza el factor madurez de fruto no mostró un resultado

significativo (p≤ 0,05) sobre las variables medidas para este ensayo al igual que sobre el

porcentaje de plántulas normales.

28

Ensayo 2: Efecto del cambio de temperatura sobre la germinación

Se pudo observar que hasta los 22 dds no hubo efecto de los tratamientos sobre la

presencia de microorganismos. Por otra parte, no hubo diferencias entre los tratamientos

de 25ºC y 30ºC - 25ºC a lo largo de todas las fechas evaluadas (Figura 8). Al comparar las

semillas que se mantuvieron a 30ºC durante todo el experimento con las que se

sometieron a cambio de temperatura de 25ºC-30ºC no se encontraron diferencias entre

estos tratamientos sino hasta la última evaluación a los 32 dds, cuando el tratamiento

25ºC-30ºC fue mayor que el resto de tratamientos (Figura 8).

0

1 0

20

30

40

50

60

8 1 1 1 5 1 8 22 25 29 32

Pres

enci

a de

mic

roor

gani

smos

(%)

Días después de la siembra (dds)

25ºC

30ºC

30ºC-25ºC

25ºC-30ºC

a

ab

bcd

de

cdecde

de

e eeee eee

cde

bcdbc

decde

Figura 8. Presencia de microorganismos en la superficie de semillas de cas sometidas a temperatura constante y a cambio de temperatura. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

Tal y como ocurrió en el ensayo anterior, las semillas a 30ºC no germinaron,

mientras que las que se mantuvieron a 25ºC durante todo el experimento germinaron muy

29

rápido y alcanzaron su valor máximo a los 15 dds. En ese momento los porcentajes

alcanzados fueron cercanos a 90 % (Figura 9). El lote de semillas que se utilizó para este

ensayo obtuvo un porcentaje de viabilidad de 96 % luego de efectuar la prueba de

tetrazolio.

Las semillas con tratamiento 30ºC-25ºC comenzaron a germinar hasta después de

los 11 dds. Posteriormente, se pudo observar un aumento en los porcentajes de

germinación hasta alcanzar su máximo a los 22 dds, sin mostrar diferencias significativas

con el tratamiento a 25ºC para las fechas de evaluación posteriores (Figura 9). El

tratamiento 25ºC-30ºC comenzó a germinar rápidamente, aunque al transcurrir el tiempo

se observó una reducción en la tasa germinativa. A los 15 dds dejaron de germinar

nuevas semillas. El porcentaje máximo de germinación para este último tratamiento fue

ligeramente superior a 70 % y fue significativamente menor que el tratamiento 25ºC y

30ºC-25ºC (Figura 9).

0

1 0

20

30

40

50

60

70

80

90

1 00

8 1 1 1 5 1 8 22 25 29 32

Ger

min

ació

n (%

)

Días después de la siembra (dds)

25ºC

30ºC

30ºC-25ºC

25ºC-30ºC

h hhhhh

g

cde bcd

hh

g

cde bcd abc ab ab

ab ab abab ab

de

f

dededefefdede

Figura 9. Germinación de semillas de cas sometidas a cambio de temperatura. Medias con

una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

30

Una vez efectuada la prueba de viabilidad a las semillas que no germinaron a lo

largo del ensayo, se encontró que las que fueron sometidas a 30ºC (constante) mostraban

una viabilidad del 95 %, lo cual indica que el tratamiento al que fueron sometidas las

semillas (temperatura) fue el causante de la no germinación de las mismas. En el caso de

las semillas no germinadas sometidas al tratamiento 25ºC-30ºC, éstas obtuvieron un

porcentaje de viabilidad de 93 %.

Los tratamientos 25ºC y 30ºC-25ºC mostraron pocas semillas sin germinar al final

del ensayo y menor cantidad de semillas viables (10 % y 20 % respectivamente) posterior

a la realización de la prueba de tetrazolio. Las semillas no viables mostraron la presencia

de embriones en descomposición o ausencia de los mismos. Lo anterior muestra que las

semillas que no germinaron y que resultaron viables no desarrollaron esta condición como

producto de los tratamientos.

En cuanto a la altura de las plántulas, los tratamientos de 25ºC y 25ºC-30ºC no

mostraron diferencias significativas entre sí. El tratamiento de 30ºC-25ºC obtuvo valores

menores en comparación con los anteriores (Figura 10). Si bien hubo un retardo en el

inicio de la germinación con el tratamiento 30ºC-25ºC que no fue evidente al final del

ensayo al compararlo con el tratamiento a temperatura constante de 25ºC (Figura 9), hubo

un efecto en la altura de las plántulas, siendo más pequeñas. Por otra parte, el porcentaje

de plántulas normales promedio fue de 90 %, sin diferencias significativas con los demás

tratamientos.

31

0,0

0,5

1 ,0

1 ,5

2,0

2,5

3,0

25ºC 25ºC-30ºC 30ºC-25ºC

Altu

ra (c

m)

Temperatura

aa

b

Figura 10. Altura de parte aérea de plántulas de cas sometidas a cambio de temperatura a los 30 dds. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

Ensayo 3: Almacenamiento de semillas de cas por diferentes periodos de tiempo

Con respecto a la humedad presente en las semillas de cas almacenadas, se pudo

observar que no hubo gran pérdida del contenido de agua a lo largo del almacenamiento

(Cuadro I). El porcentaje de humedad de las semillas frescas (27 %), el cual pertenecía al

tratamiento testigo se tomó como referencia para determinar la pérdida de la misma

posterior al almacenamiento en los diferentes periodos. La máxima pérdida de humedad

registrada fue de 5 % para el tratamiento de 12 semanas de almacenamiento.

Las semillas del tratamiento testigo sin almacenar mostraron un comportamiento

germinativo similar al observado en el ensayo anterior (Figuras 9 y 11). Dos semanas de

almacenamiento a 5ºC fueron suficientes para retardar el inicio de la germinación, sin que

hubiera diferencias entre ninguno de los periodos de almacenamiento utilizados (Figura

11). Las semillas que fueron almacenadas alcanzaron su máxima germinación a los 22

32

dds, lo que reflejó una clara reducción en la velocidad del proceso germinativo de estas

semillas en comparación con el testigo, cuya máxima germinación se alcanzó a los 11

dds. No obstante, no se observaron diferencias en la germinación final obtenida para

ninguno de los tratamientos.

Cuadro I. Porcentaje de humedad de semillas de cas sometidas a diferentes periodos de almacenamiento

Tratamiento % Humedad 0 semanas 272 semanas 264 semanas 268 semanas 26

1 2 semanas 22

0

1 0

20

30

40

50

60

70

80

90

1 00

8 1 1 1 5 1 8 22 25 29 32

Ger

min

ació

n (%

)

Días después de la siembra (dds)

0 semanas

2 semanas

4 semanas

8 semanas

12 semanas

a aaaaa

ab aa

aababc

abcdbcdecde

def

ef

fg

gg g

Figura 11. Germinación de semillas de cas sometidas a diferentes periodos de almacenamiento. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

33

Los resultados obtenidos de las mediciones de altura de las plántulas no

mostraron un patrón claro en el crecimiento de las éstas con relación a los tratamientos

utilizados, al mostrar un comportamiento errático. Los valores obtenidos al almacenar las

semillas por 2 y 12 semanas no mostraron diferencias significativas entre ellos al efectuar

la comparación de medias. El tratamiento de almacenamiento de las semillas por 2

semanas no mostró diferencias significativas con el tratamiento de 4 semanas de

almacenamiento, el cual no fue diferente del testigo. Por otra parte, el testigo no mostró

diferencias significativas con el tratamiento de almacenamiento por 8 semanas.

El porcentaje promedio de plántulas normales fue de 95 % y el de presencia de

microorganismos fue de 10 %, sin diferencias significativas entre tratamientos.

0,0

0,5

1 ,0

1 ,5

2,0

2,5

3,0

0 2 4 8 1 2

Altu

ra (c

m)

Semanas de almacenamiento

cd

abbc

d

a

Figura 12. Altura de parte aérea de plántulas de cas sometidas a diferentes periodos de

almacenamiento, a los 30 dds. Medias con una letra común no son significativamente diferentes entre sí (p≤ 0,05).

34

Discusión

Ensayo 1: Efecto de temperatura, grado de madurez del fruto y método de

extracción sobre la germinación

La menor firmeza que presentaron los frutos de cas sobremaduros es

característica de todos los frutos en estados avanzados de madurez, y probablemente en

consecuencia de la degradación que sufren las paredes celulares como respuesta al

proceso de maduración (Álvarez et al. 2009). En este proceso, las enzimas hidrolíticas,

como las poligalacturonasas, celulasas y ß-galactosidasas, juegan un papel importante en

la degradación de la estructura de las células y de sus componentes (Muy et al. 2009;

Pérez y Carpita 2006). El principal compuesto que se degrada con la maduración es la

pectina, que compone tanto la lámina media como la pared celular; también se degradan

las celulosas y hemicelulosas. Lo anterior ocurre por medio de una despolimerización y

ruptura de enlaces (Pérez 2003).

Los frutos maduros mostraron mayor firmeza, lo que pudo deberse a que el

proceso de madurez de estos no se encontraba tan avanzado y la actividad de las

enzimas hidrolíticas mencionadas probablemente fue baja en comparación con la de los

frutos clasificados como sobremaduros (Pérez 2003; Sañudo et al. 2008; Zanotti et al.

2009).

La presencia de restos de pulpa en las semillas extraídas con el método manual

probablemente favoreció el crecimiento y esporulación de hongos en la superficie (Figuras

1 y 2), como respuesta a la presencia de un sustrato rico en nutrientes (Chaves et al.

2010; Deacon 1997). Sáez et al. (2004) agregan que el crecimiento de los

microorganismos es mayor cuando el medio en el que crecen posee un alto contenido de

35

azúcares, brindando una fuente de alimento adecuada para el crecimiento de los mismos.

Además, Deacon (1997) menciona que el bajo pH de la pulpa de frutos, como el cas,

puede favorecer el crecimiento de hongos (Figura 3). La presencia de pulpa fue menor en

las semillas extraídas con el método enzimático (Figura 1), ya que las pectinasas

favorecieron su degradación y separación de las semillas. La actividad de las pectinasas

sobre la pulpa de las semillas de cas limitó la disponibilidad de alimento para los

microorganismos, así como su desarrollo y establecimiento sobre la superficie de las

mismas (Schweiggert et al. 2009; Sineiro et al. 1998).

Con respecto al efecto de la temperatura sobre la presencia de microorganismos,

es probable que los hongos Penicillium sp. y Fusarium sp., que crecieron en la superficie

de las semillas de cas, se vieran favorecidos por la temperatura de 30ºC, clasificándose

como mesófilos, lo cual se evidenció especialmente a los 30 dds (Figura 2). Deacon

(1997) y Ojeda y Subero (2006) indican que la mayoría de microorganismos, en este caso

hongos, crecen favorablemente a temperaturas entre 25ºC y 30ºC. A 20ºC hubo un menor

crecimiento de microorganismos, posiblemente porque es una temperatura que está por

debajo de las condiciones que, a modo general, son adecuadas para el desarrollo y

supervivencia de estos microorganismos sobre las semillas (Alonso et al. 1996; Rousso y

Perraud-Gaime 1996).

Las semillas a 25ºC germinaron más rápido que con los otros tratamientos (Figura

4). Maeda et al. (1999) obtuvieron resultados similares en dicha temperatura con semillas

de guayaba, otra Myrtaceae del género Psidium. También, los resultados del presente

trabajo concuerdan con lo encontrado por Santos (2008), quien obtuvo una mayor

velocidad de germinación en semillas de dos Myrtaceae (Blepharocalix salicifolius y

Myrceugenia gertii) a 25ºC en comparación con temperaturas de 20ºC y 30ºC, donde la

velocidad fue menor.

36

Las semillas a 25ºC extraídas enzimáticamente germinaron más rápido, en

comparación con las del método manual a la misma temperatura (Figura 4). Lo anterior

pudo deberse a la acción de la enzima pectinasa sobre la cubierta de las semillas, lo que

probablemente permitió el ablandamiento de la cubierta seminal por la degradación de la

lámina media y posterior salida de la radícula (Pagán s.f). Esto, sumado al uso de una

temperatura favorable, como 25ºC, permite una germinación acelerada (Grasso et al.

2006; Sineiro et al. 1998). El efecto de la temperatura de 25ºC sobre la velocidad de la

germinación también se reflejó con los valores de altura alcanzados por las plántulas al

final del ensayo (Figura 7). Dicha temperatura posiblemente incrementó la actividad

metabólica en el proceso germinativo de las semillas y por consiguiente; las plántulas

alcanzaron una mayor altura (Maeda et al. 1999; Otegui et al. 2007).

El retardo en la germinación de las semillas extraídas enzimáticamente y

germinadas a temperatura de 20ºC indica que esta no es la temperatura más adecuada

para el cas. Según CATIE (2003), el cas requiere de una temperatura media anual de

24,6ºC para su crecimiento y producción, lo que podría ser también adecuado para la

germinación de sus semillas. Lo anterior es similar a lo reportado por Sugahara y Takaki

(2004) en semillas de guayaba, en donde se encontró que a 20ºC las semillas

germinaron; sin embargo, la velocidad fue mayor a 25ºC.

El retraso en la germinación de las semillas de cas sometidas a 20ºC y la menor

altura alcanzada al final del ensayo, tanto para la extracción manual como para la

enzimática (Figura 7), podría relacionarse a una condición de actividad metabólica baja ya

que si se compara con las de extracción manual a 25ºC, estas últimas alcanzaron mayor

altura a pesar de la presencia de pulpa. Esto reafirma que la temperatura de 25ºC

posiblemente favoreció la actividad metabólica y crecimiento de las plántulas como

consecuencia de una velocidad de germinación mayor (Sugahara y Takaki 2004). Lo

37

ocurrido con las semillas de cas sometidas a 20ºC podría deberse a una reacción de la

semilla a una condición desfavorable, la cual produjo un cese en las reacciones propias

del metabolismo con el posterior retraso de la germinación. Este atraso no fue tan fuerte

como para denominarlo reposo ya que las semillas germinaron (Sugahara y Takaki 2004).

Las semillas de cas no germinaron a 30ºC, lo que pudo deberse a que dicha

temperatura produjo una inhibición en su germinación. Con la prueba de tetrazolio

realizada a las semillas no germinadas se confirmó la existencia de una inhibición

producto de la temperatura, ya que el 90 % de las semillas era viable (Figura 5). Este

comportamiento probablemente se debió a que altas temperaturas limitan la disponibilidad

de oxígeno en el agua de imbibición para el embrión (Holdsworth et al. 2007). El oxígeno

es un factor indispensable para la germinación de las semillas, lo cual se discutirá con

mayor detalle en el Ensayo 2.

Ensayo 2: Efecto del cambio de temperatura sobre la germinación

Este ensayo se llevó a cabo con el objetivo de tratar de establecer la causa del

efecto de la temperatura de 30ºC sobre la germinación de las semillas de cas observado

en el Ensayo 1, además de observar su sensibilidad a un cambio de temperatura.

La mayor presencia de microorganismos en el tratamiento 25ºC-30ºC (Figura 8) se

puede explicar por la variación de la temperatura que permitió mayor proliferación de

hongos, en este caso Penicillium sp., el cual se identificó mediante pruebas de

crecimiento en laboratorio. Este hongo es favorecido por temperaturas entre 23ºC y 30ºC.

Además, este hongo es capaz de crecer en diversas condiciones de humedad, pH,

disponibilidad de CO2, entre otros, lo que le da ventaja frente a otros microorganismos en

cuanto a crecimiento (Deacon 1997; Dupont 2010). El testigo a temperatura constante de

38

25ºC y el tratamiento 30ºC-25ºC no mostraron diferencias significativas entre ellos. Esto

pudo ocurrir debido a que la temperatura óptima para el crecimiento y establecimiento de

la mayoría de los hongos se encuentra cercana a los 30ºC y el hecho de permanecer tan

solo tres días a dicha temperatura no tuvo un efecto mayor (Deacon 1997; Rousso y

Perraud-Gaime 1996). Además, cabe resaltar que la acción de las pectinasas sobre la

pulpa de las semillas, como se discutió en el ensayo anterior, disminuyó la presencia de

hongos al obtenerse resultados menores al 40 % (Sáez et al. 2004).

En el caso del tratamiento 30ºC-25ºC, los tres días a 30ºC fueron suficientes para

atrasar la germinación de las semillas, aunque logró alcanzar porcentajes altos sin

diferencias significativas con el tratamiento a 25ºC a los 22 dds. La exposición de las

semillas de cas inicialmente a 30ºC posiblemente generó una inhibición, ya que las altas

temperaturas por lo general limitan la disponibilidad del oxígeno en el agua de imbibición y

para que la germinación ocurra es necesaria la presencia de oxígeno, ya que es requerido

para las reacciones metabólicas (Chong et al. 2002). Aunque se requiere en pequeñas

cantidades, este factor es imprescindible para que el proceso germinativo se lleve a cabo

exitosamente (Guevara et al. 2006). Esto mostró que las semillas de cas posiblemente

poseen una alta sensibilidad al cambio de temperatura (Chong et al. 2002; Frank y Dennis

2002). El incremento en la germinación a partir de los 11 dds probablemente fue

consecuencia de la mayor disponibilidad del oxígeno que generó la exposición de las

semillas a 25ºC (Bhanuprakash et al. 2008; Guevara et al. 2006; Holdsworth et al. 2007;

Pereira y Andrade 1994).

Caso contrario ocurrió con el tratamiento 25ºC-30ºC, en donde las semillas

comenzaron a germinar rápidamente al estar sometidas a 25ºC, pero al efectuar el cambio

de temperatura tres días después (cambio a 30ºC) probablemente creó una condición

inhibitoria en las semillas que todavía no habían germinado como producto de la

39

exposición a un ambiente con oxígeno limitado (Guevara et al. 2006). Lo anterior se

confirmó al efectuar la prueba de viabilidad, en donde 93 % de las semillas se

encontraban viables, lo que indica que aunque eran capaces de germinar, no lo hacían.

Estas semillas posiblemente no contaron con las condiciones necesarias para iniciar las

reacciones metabólicas propias del proceso (Frank y Dennis 2002; Guevara et al. 2006).

La altura de las plántulas fue menor para el tratamiento 30ºC-25ºC debido,

probablemente, al retraso en el proceso germinativo como producto de su exposición a la

temperatura inicial de 30ºC, a pesar de someterse posteriormente a la temperatura de

25ºC. Los tratamientos a 25ºC y 25ºC-30º reflejaron una mayor altura debido

probablemente a que la temperatura de 25ºC incrementa la velocidad de germinación

(Maeda et al. 1999). Estos resultados indican que la temperatura de 30ºC posiblemente

no afectó la elongación de las plántulas; ya que, si bien las semillas pasaron la mayor

parte del tiempo a 30ºC en el tratamiento 25ºC-30ºC, las germinadas alcanzaron una

altura equivalente a las de 25ºC (Figura 10). Esto fue similar a lo encontrado por Tavares

et al. (1995) para semillas de guayaba, las cuales, al igual que las de cas, germinaron

rápidamente a 25ºC. Es posible que el incremento de la velocidad de germinación de los

tratamientos 25ºC y 25ºC-30ºC a los 11 dds permitió que las plántulas pudiesen

desarrollarse más que las del tratamiento 30ºC-25ºC en donde inicialmente las semillas

estuvieron a 30ºC (Sugahara y Takaki 2004). De acuerdo con lo anterior, probablemente

colocar las semillas inicialmente a 25ºC es suficiente para favorecer la velocidad de

germinación, el crecimiento de las plántulas es independiente de la temperatura a la que

se encuentren.

40

Ensayo 3: Almacenamiento de semillas de cas por diferentes periodos de tiempo

La humedad es un factor fundamental en cuanto al éxito del almacenamiento.

Como se mencionó anteriormente, esto depende del tipo de semilla que se almacena, ya

sea ortodoxa, de condición intermedia o recalcitrante. Las semillas de cas mostraron poca

pérdida de la humedad durante el almacenamiento, al tomar 27 % de humedad como

referencia (Cuadro I), lo cual probablemente contribuyó a mantener su viabilidad (Bonner

2008).

La pérdida reducida de humedad también pudo evitar alteraciones en los

embriones como respuesta a una ruptura celular que se manifiesta como producto de la

deshidratación, la cual genera deterioros en las membranas y posterior desintegración

nuclear, por lo tanto pudieron germinar eficientemente una vez que fueron colocados en la

cámara de germinación a 25ºC (Chin 1975). Es importante mencionar que esta alteración

depende de la sensibilidad a la desecación, lo que varía dependiendo del tipo de semilla.

Por otra parte, la poca pérdida de humedad que sufrieron las semillas debido al tipo de

almacenamiento empleado, se debió posiblemente a que tenían un contenido de

humedad similar al del medio en que se encontraban, en este caso la placa de Petri

(Cuadro 1). Debido a lo anterior la semilla probablemente perdió poca humedad para

establecer el equilibrio con la placa de Petri, lo que sugiere que el almacenamiento

hermético es eficiente para evitar mayor pérdida de humedad (Herrera 2011,

comunicación personal1). El tipo de envase y el cierre utilizados parecen jugar un papel

importante al respecto. En este caso, recipientes de vidrio sellados con plástico 1 HERRERA, J. (2011). Almacenamiento de semillas (entrevista). San José, Centro de Investigaciones para

Granos y Semillas. (jorge.herrera@ucr.ac.cr).

41

probablemente no permitieron la pérdida de agua interna de las semillas de cas y así se

logró evitar su deterioro, lo que fue similar a lo reportado por Cisneiros et al. (2003) para

semillas de Psidium guineensis. Lo anterior se debe a que el envase de vidrio sellado

funciona como una barrera entre el medio externo y las semillas, reduciendo

probablemente el intercambio de vapor de agua entre las semillas y el aire de la

atmósfera (Cisneiros et al. 2003; Justo et al. 2007). Al controlarse la entrada de oxígeno

también se redujo el metabolismo y aumentó la longevidad de las semillas de cas

almacenadas (Bonner 2008; Otegui et al. 2007).

El retardo en la germinación de las semillas almacenadas, independientemente del

tiempo de almacenamiento (Figura 11), se pudo deber a que la temperatura de

almacenamiento utilizada (5ºC) fue suficiente para retardar la actividad metabólica interna

pero sin reducir la viabilidad de las semillas (Bonner 2008; Scalon et al. 2004). Lo anterior

se corroboró al efectuar la prueba de viabilidad de las pocas semillas no germinadas al

final del periodo de evaluación, las cuales mostraron la presencia de embriones en

descomposición o anormales (Figura 6). Al respecto, Bonner (2008) menciona que bajas

temperaturas de almacenamiento reducen el metabolismo, así como la velocidad de las

reacciones que esto conlleva. Además, este autor agrega que la temperatura es un factor

importante de considerar para un buen almacenamiento de semillas, tanto ortodoxas

como recalcitrantes. Para semillas recalcitrantes la temperatura de almacenamiento debe

encontrarse por encima de 0ºC con buen control de humedad y ortodoxas pueden ser

almacenadas a cualquier temperatura, hasta -20ºC (Bonner 2008; Hong y Ellis 1996;

Nunes y Cunha 2000).

Con relación a lo anterior, el atraso en la germinación de las semillas almacenadas

en comparación con el testigo también pudo ocurrir como posible respuesta a una

condición de inhibición inducida por la exposición a baja temperatura (Frank y Dennis

42

2002; Guevara et al. 2006; Holdsworth et al. 2007). Además, dicho atraso en las

reacciones del proceso germinativo mencionado se pudo deber a que estas semillas

requirieron de tiempo para aclimatarse a las condiciones en la cámara de germinación a

25ºC. Una vez que esto ocurrió posiblemente hubo un incremento de la actividad

metabólica dentro de la semilla dando inicio a la germinación (Figura 11). También, este

resultado pudo deberse al tipo de envase utilizado para almacenar las semillas. El envase

hermético probablemente no permitió que las semillas pudiesen alcanzar un equilibrio

gradual entre la humedad interna y la del medio así como la temperatura, lo cual

retardaría el metabolismo de las semillas y por consiguiente su germinación (Farias et al.

1991; Otegui et al. 2007). En este caso, posiblemente la humedad del medio externo

(fuera del refrigerador) fue mayor que la del medio en donde se encontraban las semillas,

al igual que la temperatura. Por lo tanto, al estar expuestas las semillas del tratamiento

testigo a una cantidad de humedad y temperatura mayor el metabolismo no fue

interrumpido por la baja temperatura, lo que permitió una exposición constante a las

condiciones “ideales” de germinación (Chong et al. 2002).

Según Cisneiros et al. (2003), el ambiente de conservación de las semillas influye

en el vigor y capacidad de emergencia de éstas, ya que si este es inadecuado el embrión

puede sufrir deterioros que se verán reflejados en la germinación y en el desarrollo normal

de las plántulas, lo que se concretó al obtener un porcentaje promedio de plántulas

normales de 95 %. También Alfaro (2010) agrega que el almacenamiento en frío puede

mantener la longevidad de las semillas al máximo, lo que pudo corroborarse con los

resultados obtenidos tanto en la germinación como en la altura de las plántulas de cas

(Figuras 11 y 12), al obtenerse una germinación cercana al 90 % y altura promedio de

plántulas de 2,1 cm.

43

El comportamiento errático observado al evaluar el efecto del tiempo de

almacenamiento sobre la altura de las plántulas (Figura 12) es difícil de explicar. La

ausencia de un patrón de comportamiento definido para la variable no permite brindar una

respuesta concreta de lo ocurrido.

Conclusiones La temperatura de 25ºC parece ser adecuada para lograr una mayor tasa de

germinación de las semillas de cas evaluadas. La eliminación de la pulpa de semillas de

cas con la utilización de enzimas pectinasas incrementó la velocidad de germinación y

disminuyó la presencia de microorganismos. Así, utilizando una temperatura de 25ºC y

extracción enzimática se puede alcanzar el porcentaje máximo de germinación sin

presencia de microorganismos a los 22 dds, además de una altura promedio de 2,1 cm.

Lo anterior es ventajoso y muy práctico para el productor ya que puede obtener plántulas

rápidamente.

La temperatura de 30ºC no fue adecuada para la germinación de semillas de cas,

dicha temperatura inhibió el proceso germinativo. Esta temperatura permitió el mayor

desarrollo de microorganismos sobre la superficie de las semillas, lo cual no es deseable.

La semilla de cas parece ser sensible a los cambios de temperatura. El cambio de

temperatura 30ºC-25ºC retarda la germinación de las semillas y el crecimiento de las

plántulas. La germinación de nuevas semillas cesa en el momento de aumentar la

temperatura en el tratamiento 25ºC-30ºC.

La utilización de una temperatura de 5ºC para el almacenamiento de semillas de

cas permitió mantener su viabilidad hasta por tres meses sin afectar la germinación. Se

recomienda evaluar el almacenamiento de semillas de cas por un periodo más prolongado

44

para poder determinar si esta semilla es ortodoxa o recalcitrante y así promover la

viabilidad del material. Además se recomienda efectuar el almacenamiento a temperatura

ambiente para determinar si bajo esta condición de almacenamiento la semilla sufre algún

tipo de inhibición.

45

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