UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOLOGÍA

Evaluación de la capacidad fitorremediadora de Megathyrsus maximus en suelos de sabanas

contaminados con hidrocarburos de petróleo pesado

TRABAJO ESPECIAL DE GRADO Presentado ante la Ilustre Universidad Central de Venezuela, por el bachiller Guillermo A. Méndez Calderón como

requisito parcial para optar por el título de Licenciado en Biología

Tutor: Dr. Ismael Hernández-Valencia

CARACAS, VENEZUELA

Mayo - 2014

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DEDICATORIA

A mi querido hermano Gustavo, por creer en mí, por su apoyo incondicional y

ayuda en esos momentos críticos; gracias Gus sin ti no hubiera sido posible culminar

esta etapa de mi vida.

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AGRADECIMIENTOS

Al profesor Ismael Hernández, por brindarme la oportunidad de trabajar bajo su

guía, por su paciencia y pedagogía en aclarar todas las dudas durante el ensayo, por su

actitud diligente para conseguir los reactivos y ayuda para finalizar aquellos ensayos

que no dependían de mí. A Nancy, Joxmer y Lenny por su vital colaboración en la

culminación de ensayos de contenido de aceites y grasas, y fraccionamiento del

hidrocarburo. A Carmen Marrero, directora de la Biblioteca Alonso Gamero de la

Facultad de Ciencias por animarme, y por su apoyo constante en lo referente a los libros

de consulta.

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ÍNDICE

Introducción………………………………………………………………… ..7

Antecedentes………………………………………………………………….17

Hipótesis..……………………………………………………………………. .27

Objetivo general……………………………………………………………….27

Objetivos específicos…..…………………………………………………….. .27

Materiales y Métodos……………..…………………………………………..28

Diseño experimental:

Suelos y especies………………………………………………………………28

Descripción del material botánico……………………………………………28

Caracterización del suelo:

a) Análisis físico de las muestras de suelo:

a.1) Textura………………………………………………………………….…29

a.2) Capacidad de campo………………………………………………………29

b) Análisis químico de las muestras de suelo:

b.1) Capacidad de intercambio catiónico efectiva (C.I.C.E.), aluminio intercambia-

ble, porcentaje de saturación de bases (% S.B.) y bases intercambiables……...30

b.2) Fósforo disponible………………………………………………………....30

b.3) Nitrógeno total…………………………………………………………..…21

b.4) pH…………………………………………………………………………..31

b.5) Contenido de materia orgánica……………………………………………..31

Efecto de la gramínea sobre los niveles de contaminación del suelo:

Contenido de aceites y grasas…………………………………………………... 33

Fraccionamiento del hidrocarburo……………………………………………….34

Respiración basal……………………………………………………………….. 35

5

Carbono de la biomasa microbiana………………………………………………36

Coeficiente metabólico…………………………………………………………...37

Actividad de la enzima deshidrogenasa………………………………………….37

Análisis estadísticos……………………………………………………………...38

Resultados y Discusión

Caracterización del suelo

a) Análisis físico de las muestras de suelo:

a.1) Textura y capacidad de campo……………………………………………….39

b) Análisis químico de las muestras de suelo:

Capacidad de intercambio catiónico efectiva (C.I.C.E.), aluminio intercambia-

ble, porcentaje de saturación de bases (% S.B.) y bases intercambiables,

fósforo disponible, nitrógeno total, pH, contenido de materia orgánica.................41

Efecto de la gramínea sobre los niveles de contaminación del suelo:

Contenido de aceites y grasas…………………………………………………... …42

Fraccionamiento del hidrocarburo………………………………………………….47

Respiración basal……………………………………………………………….. …50

Carbono de la biomasa microbiana…………………………………………………53

Coeficiente metabólico…………………………………………………………......57

Actividad de la enzima deshidrogenasa…………………………………………….60

Consideraciones finales…………………………………………………………...65

Conclusiones……………………………………………………………………….67

Bibliográfía………………….……………………………………………………...69

6

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Variación del contenido de aceites y grasas de petróleo pesado en el suelo

con Megathyrsus Maximus, suelo mejorado sin plantas y control…………………….42

Figura 2: Variación de cada una de las fracciones de petróleo pesado (SARA) en el

suelo con Megathyrsus maximus, suelo mejorado sin plantas y control……………….46

Figura 3: Variación de la respiración basal en el suelo con Megathyrsus maximus, suelo

mejorado sin plantas y control………………………………………………………….50

Figura 4: Variación del carbono de la biomasa microbiana en el suelo con Megathyrsus

maximus, suelo mejorado sin plantas y control………………………………………..54

Figura 5: Variación del coeficiente metabólico en el suelo con Megathyrsus maximus,

suelo mejorado sin plantas y control…………………………………………………..56

Figura 6: Variación de la actividad de la enzima deshidrogenasa en el suelo con

Megathyrsus maximus, suelo mejorado sin plantas y control …………………………60

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1: Proporciones de arena, limo y arcilla de las muestras de suelo…………38

Cuadro 2: Capacidad de campo del suelo no contaminado y suelo contaminado….38

Cuadro 3: Resultados de los análisis químicos de las muestras de suelo…………..39

Cuadro 4: Correlación entre las variables microbiológicas estimadas para el tratamiento

TC……………………………………………………………………………………61

Cuadro 5: Correlación entre las variables microbiológicas estimadas para el tratamiento

TP……………………………………………………………………………………62

Cuadro 6: Correlación entre las variables microbiológicas estimadas para el tratamiento

SP……………………………………………………………………………………62

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INTRODUCCIÓN

La industrialización global de los últimos 200 años ha producido una

contaminación extendida del ambiente con compuestos químicos orgánicos e

inorgánicos, muchos de los cuales se caracterizan por su larga vida (Gaskin y Bentham,

2010).Ya sea por planificación o accidente, el suelo es recipiente primario de una

miríada de sustancias usadas en la sociedad moderna. Cada año, millones de toneladas

de productos industriales, domésticos y agrícolas tienen como destino final los suelos

del mundo, y una vez allí, estos productos se vuelven parte de los ciclos biológicos que

afectan a todas las formas de vida, incluyendo la de la especie humana (Meagher, 2000;

Brady y Weil, 2008).

La extensión y gravedad del daño debido a la contaminación de suelos, ha hecho

necesaria su limpieza; es decir, la remediación de esos suelos contaminados. La

diversidad química de los contaminantes vertidos ha impuesto el desarrollo de variadas

tecnologías de remediación; y entre ellos, el grupo de los contaminantes orgánicos ha

concentrado la atención de los investigadores, en virtud de los volúmenes vertidos y de

lo imprescindible de su uso en actividades domésticas e industriales. Con base a los

volúmenes de suelo a ser remediados, así como el gasto económico que generan, los

más importantes contaminantes orgánicos son: a) Petróleo y sus productos derivados, b)

Compuestos orgánicos clorados (PCBs, diclorobenzenos, etc.), c) Compuestos nitro

aromáticos (TNT, DNT, etc.), y d) Pesticidas y sus residuos (Cunningham y col., 1996).

La remediación de suelos contaminados con compuestos orgánicos es un

problema mundial que consume recursos económicos tanto de las actividades que los

generan, como de los gobiernos que deben velar por la buena calidad del ambiente. Los

suelos contaminados con compuestos orgánicos se pueden encontrar en todos los

continentes, y están asociados con frecuencia a centros poblados, áreas de manejo y

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almacenaje de petróleo y áreas donde se realizan actividades manufactureras

(Cunningham y col., 1996).

El petróleo es la fuente primaria de combustible para el transporte y para muchos

procesos industriales de producción. Como cualquier proceso industrial a gran escala, la

exploración, producción, transporte y refinación de petróleo, puede ocasionar la

contaminación del suelo y del agua. Entre las principales causas de contaminación del

suelo por petróleo están las fugas en tanques de almacenamiento y oleoductos, la

disposición en rellenos de lixiviados de lodos de perforación y derrames accidentales o

intencionales (Bossert y col., 1984). Debido a lo anteriormente mencionado, muchos

países en desarrollo enfrentan serios problemas con la contaminación del suelo por

compuestos orgánicos, pero las preocupaciones respecto al ambiente parecen ser un

lujo, dada la situación económica en estos.

Las tecnologías comunes de limpieza del suelo varían desde procesos físico

químicos hasta biológicas; sin embargo, el empleo de tecnologías basadas en procesos

físico químicos con frecuencia está fuera de las posibilidades financieras de los países

en desarrollo, especialmente si grandes áreas o volúmenes de suelos están

contaminados. Además, con el empleo de éstas técnicas, las características físicas,

químicas y biológicas del suelo pueden ser alteradas significativamente, degradando de

manera irreversible su uso para propósitos agrícolas (Merkl y col., 2006). Las

tecnologías biológicas o de biorremediación implican el uso de organismos (bacterias,

hongos y plantas), para estabilizar o degradar contaminantes a compuestos menos

tóxicos (Vivaldi, 2001). La biorremediación que emplea microorganismos únicamente

puede dividirse en (Malik, 2006):

1) Biorremediación intrínseca : En este proceso las condiciones y la microflora

naturales existentes, disminuyen la concentración del contaminante.

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2) Bioestimulación: Este proceso implica el añadir nutrientes in situ o ex situ

(agua o suelo) para estimular a los microorganismos endógenos. Los fertilizantes y

suplementos para el crecimiento son estimulantes comunes.

3) Bioventilación: Es similar a la bioestimulación, pero involucra el suminisitro de

oxígeno para estimular el crecimiento de microorganismos naturales o inoculados. Usa

un bajo flujo de aire para proveer oxígeno suficiente a fin de sostener la actividad

microbiana.

4) Bioaumentación: Consiste en la inoculación de microorganismos degradadores

de contaminantes (naturales/ exóticos/ adaptados/ modificados genéticamente) a fin de

aumentar la capacidad biodegradadora de las poblaciones microbianas naturales.

5) Biofiltros: Uso de columnas microbianas de remoción (con microorganismos

enriquecidos con suelo/compost) de compuestos orgánicos volátiles.

6) Composting: Es un proceso de tratamiento aeróbico y termofílico en el cual el

material contaminado es mezclado con un agente acondicionante (composta rico en

microorganismos biorremediadores). Es realizada ex situ.

7) Landfarming: Es un tratamiento que usa técnicas agrícolas de

acondicionamiento del suelo y arado a fin de estimular el crecimiento de

microorganismos degradadores en el suelo contaminado. Condiciones de humedad,

aireación, pH, acondicionamiento y fertilización son controladas. Puede realizarse in

situ o ex situ (Malik, 2006).

Existe una técnica de biorremediación que emplea microorganismos y plantas

denominada fitorremediación, y constituye una de las técnicas mas prometedoras, ya

que además de reducir la contaminación, incrementa el contenido de carbono, aumenta

la agregación de partículas, y por tanto mejora el drenaje (Cunningham et al., 1996) y

la actividad microbiana (Gaskin y Bentham, 2010). La palabra fitorremediación tiene su

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origen en el prefijo Griego phyto (planta) unido a la raíz latina remedium (corregir o

remover el mal). La técnica en sí, consiste en el uso de plantas y su microbiota asociada,

junto con técnicas agronómicas con el fin de remover, contener o, volver inocuos

contaminantes ambientales (Cunningham y col., 1996).

La fitorremediación se presenta como una solución alterna a las técnicas de

descontaminación basadas en procesos físicos y químicos, pues sus costos son menores.

Así, por ejemplo, los costos de remediación por técnicas basadas en procesos físicos y

químicos en Estados Unidos pueden llegar a 1.000.000 $ por hectárea para remediar

hasta una profundidad de medio metro. La fitorremediación por el contrario, debido a la

reducción de costos en manejo y manipulación, tiene unos costos estimados entre 2.500

y 15.000 $ por hectárea a una profundidad de 15 cm; adicionalmente, no es una técnica

degradadora y tiene un efecto rehabilitador en la estructura y ecología del suelo

(Cunningham y col., 1996). Otras ventajas que ofrece la fitorremediación son:

a) Por lo general se realiza in situ.

b) Las plantas son fácilmente monitoreadas.

c) Permite la utilización de técnicas agrícolas convencionales.

d) Puede tratar volúmenes mayores de suelo en comparación con las técnicas

basadas en procesos físicos y químicos.

e) Es una técnica relativamente fácil de aplicar y estéticamente agradable.

Sin embargo, a la fitorremediación también se le han reconocido limitaciones, y

estas son:

a) Sólo es aplicable si la concentración del contaminante en el suelo no es tóxica

para la planta.

b) Esta limitada a la profundidad del suelo a la cual pueden penetrar las raíces.

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c) Su aplicación requiere de períodos más largos que las técnicas basadas en

procesos físicos y químicos.

d) El potencial de contaminación de la cadena trófica debe ser considerado.

e) La volatilización de los contaminantes a la atmósfera puede generar problemas

de contaminación atmosférica.

f) Podrían necesitarse mecanismos de control de la erosión durante la fase de

establecimiento de las plantas.

La fitorremediación de suelos contaminados consta de dos procesos principales:

(1) fitodescontaminación y (2) fitoestabilización. La fitodescontaminación, es un

proceso en el cual la concentración del contaminante es reducida a través de la acción

de las plantas, su microflora asociada, y las técnicas agronómicas que se aplican al

suelo. Esto implica un conjunto de procesos inherentes descritos a continuación

(Cunningham y col., 1996):

a) Fitoextracción: Incorporación del contaminante al tejido de la planta, seguido por la

subsecuente cosecha para la destrucción.

b) Fitovolatilización: Las plantas y la actividad de su microbiota asociada incrementan

la tasa de volatilización del contaminante del suelo. La volatilización puede ocurrir

desde el tallo o las raíces, así como desde la superficie del suelo.

c) Fitodegradación: Las plantas absorben el contaminante y lo metabolizan,

transformándolo en un compuesto ambientalmente inofensivo.

d) Rizodegradación: Las raíces de las plantas y su microflora asociada y/o productos

excretados destruyen el contaminante en la rizosfera.

La fitoestabilización consiste de procesos que disminuyen la disponibilidad

biológica para receptores potenciales. Estos procesos son:

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a) Humificación: Transformación de los contaminantes e incorporación de los

catabolitos al humus del suelo, resultando en una bio-disponibilidad menor.

b) Lignificación: Los contaminantes orgánicos son atrapados de manera irreversible en

los constituyentes de la pared celular.

c) Enlace irreversible: Los compuestos se enlazan con el suelo y con ello disminuyen

su disponibilidad.

Las plantas promueven la actividad y el crecimiento microbiano en la rizósfera

(efecto rizosférico) regulando o alterando positivamente el ambiente del suelo (por

ejemplo pH, humedad, etc.) (Cunningham y col., 1996). Así como los microorganismos

se benefician de las plantas, también existe el efecto inverso, ciertas bacterias llamadas

rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (plant growth promoting

rhizobacteria o PGPR en inglés), tienen un efecto benéfico para las plantas, pues

incrementan la tolerancia de las plantas a la contaminación con petróleo. Ellas

promueven el crecimiento de las plantas, el cual resulta en una acumulación rápida de

biomasa. Esto lo logran evitando la síntesis de etileno y proveyendo auxinas a las raíces,

lo cual resulta en una mayor biomasa, especialmente de las raíces, y en consecuencia

una remediación más rápida (Huang y col., 2005).

Debido a la penetración de las raíces en el suelo, se facilita el ingreso del oxígeno

necesario para la oxidación de los contaminantes hacia zonas más profundas de éste. Por

otra parte, los exudados de la raíz liberados en el suelo, sirven como sustratos

fácilmente degradables por los microorganismos y pueden selectivamente aumentar el

crecimiento de éstos en la rizósfera (Burken y Schnoor, 1996; Cunningham y col.,

1996; Hedge y Fletcher, 1996; Chaîneau y col., 2000; White y col., 2006; Wenzel,

2009). Los sustratos liberados por las raíces en su mayoría consisten de carbohidratos,

vitaminas, amino ácidos, ácidos orgánicos y nucleótidos (White y col., 2006). Además

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de sustratos degradables, las raíces de las plantas también exudan enzimas y co-factores

de éstas, siendo de particular interés para la fitorremediación, la dehalogenasa

(transformación de compuestos clorados), peroxidasa (transformación de compuestos

fenólicos), nitroreductasa (transformación de explosivos y otros compuestos

nitrogenados), nitrilasa (transformación de compuestos aromáticos con cianuro) y

fosfatasa (transformación de pesticidas organofosfatados) (Susarla y col., 2002).

Por décadas, la industria del petróleo ha sido un puntal en la economía

venezolana; como consecuencia, la larga historia de producción de petróleo ha dejado

su marca en el ambiente, especialmente en las áreas de producción y refinación. En la

zona oriental, al sur de los estados Anzoátegui, Guárico y Monagas, se encuentra la Faja

Petrolífera del Orinoco (FPO), donde esta actividad se desarrolla con mayor empuje, y

por ende, donde se producirán los mayores problemas de contaminación de suelos con

petróleo (Infante y col., 2010a).

El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos que incluye una fracción

saturada, una fracción aromática, asfaltenos (fenoles, ácidos grasos, cetonas, ésteres y

porfirinas), y resinas (piridinas, quinolinas, carbazoles, sulfóxidos y amidas) (Atlas,

1981; Leahy y Colwell, 1990), y se clasifica según su gravedad API (American

Petroleum Institute), usando como referencia la gravedad específica del agua destilada

(valor expresado en grados API es 10°), en liviano (30 – 40° API), mediano (22 – 30°

API), pesado (10 – 22° API) y extrapesado (< 10° API). Esta complejidad hace que el

petróleo crudo no pueda ser completamente degradado por una sola cepa de

microorganismos, y que su descomposición sea lograda por un grupo de

microorganismos y su amplia capacidad enzimática combinada (Leahy y Colwell,

1990). La co-oxidación ocurre comúnmente en el petróleo; es decir los compuestos que

no pueden ser degradados por un microorganismo en particular, pueden ser atacados por

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las enzimas de otros microorganismos adaptados a crecer en compuestos diferentes

pertenecientes a esa mezcla de hidrocarburos que es el petróleo (Horvath, 1972). En la

FPO, la mayor reserva de crudos de Venezuela, predomina el petróleo pesado y extra-

pesado con un alto contenido de azufre (Merkl y col., 2006). Esta característica es

importante pues la biodegradabilidad del petróleo decrece a medida que el peso

molecular de los compuestos que lo forman se incrementa Ello se explica porque la

aromaticidad y el grado de condensación aumentan para las moléculas de mayor peso

molecular. Consecuentemente, a pesar de su origen, mientras más pesado sea el petróleo

crudo mayor será la fracción de compuestos recalcitrantes difíciles de degradar (Infante

y col., 2010a).

Son pocos los ensayos de fitorremediación de suelos contaminados con petróleo

realizados en Venezuela, debido a esto poco se sabe de las especies tropicales que

podrían servir como fitorremediadoras de suelos contaminados con petróleo. Es por esto

que mucha de la investigación se ha enfocado en determinar cuales especies de plantas,

autóctonas y exóticas ya establecidas, son más aptas para este proceso (Hernández-

Valencia y Mager, 2003; Merkl y col., 2005b; Brandt y col., 2006; Merkl y col., 2006).

Debido al tipo de petróleo de la FPO, se está haciendo énfasis en la fitorremediación de

suelos contaminados con petróleo pesado y extrapesado (Infante y col., 2010a). De esta

manera, cualquier investigación que ayude en el proceso de selección de las especies

más aptas para fitorremediar este tipo contaminación será un aporte al manejo de los

pasivos ambientales que se derivan de la actividad petrolera.

Las sabanas son uno de los ecosistemas más extensos de la geografía venezolana,

comprendiendo más de un tercio de su superficie, pudiendo éstas presentar suelos bien

drenados o con drenaje pobre. Las sabanas se caracterizan por el dominio de gramíneas

y ciperáceas, con muy poca cobertura de plantas leñosas. Las plantas de sabana se

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desarrollan bajo un clima estacional, en suelos ácidos, pobres en nutrientes y soportando

la quema, intencional o natural, de manera recurrente (Hernández-Valencia y López,

2002). Las sabanas son los ecosistemas dominantes en la FPO, y debido a que la

explotación de esta reserva es prioritaria para Venezuela, se consideran los ecosistemas

más vulnerables a la contaminación que la explotación y transporte de petróleo acarrea.

Por esta razón, se hace necesario investigar los procesos de rehabilitación en áreas de

sabanas degradadas por derrames de hidrocarburos pesados y extrapesados, haciendo

énfasis en aquellas especies de plantas más abundantes, más resistentes a los efectos del

petróleo en el suelo, y con mayor capacidad de descontaminar al el menor costo

económico posible.

Megathyrsus maximus Jacq. (gamelote) es una especie de gramínea perenne,

característica de zonas cálidas tropicales y subtropicales, oriunda de África. Crece en

haces o manojos, con alturas entre 0,5 y 3,0 m y posee rizomas cortos. Esta adaptada a

una gran variedad de suelos, principalmente aquellos con buen drenaje, aunque algunas

variedades son tolerantes a suelos con mal drenaje. Según la variedad, puede ser

plantada en zonas con precipitaciones anuales menores a los 800 mm ó superiores a los

1000 mm; sin embargo no toleran períodos de sequía superiores a los cuatro o cinco

meses. Crece bien a plena luz del sol, pero los mejores rendimientos se han producido

bajo una sombra del 30 % (Usberti y Jain, 1979; Cook y col., 2005). En Venezuela, a

esta especie se le observa creciendo en áreas intervenidas, como son las áreas urbanas,

bordes de carretera y predios abandonados, además de pastizales en donde se ha

establecido para cría de vacunos. Estas condiciones sugieren que la especie puede ser

tolerante a la contaminación por petróleo y el manejo del suelo que requieren las labores

de fitorremediación.

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Con base a lo anteriormente expuesto, el presente estudio evaluará la capacidad

remediadora de Megathyrsus maximus en suelos contaminados con petróleo pesado, en

lo que respecta a la capacidad que tiene la planta para estimular la actividad microbiana,

y con ello la disminución del contenido de petróleo del suelo. La selección de esta

gramínea que es utilizada como forraje, se debe a: a) rápido crecimiento, b) sus semillas

son accesibles en gran número y comercialmente, c) sus raíces son fasciculadas, lo que

permite un desarrollo más homogéneo en el suelo, d) los requerimientos agronómicos

son ampliamente conocidos y e) se desarrolla en ambientes perturbados donde tolera la

sequía y el fuego.

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ANTECEDENTES

Numerosos estudios sobre la fitorremediación de suelos contaminados con

petróleo han sido conducidos en las zonas templadas con especies adaptadas a estas

condiciones. En las zonas tropicales y subtropicales han sido escasos los ensayos de

fitorremediación realizados, pese a que en estas zonas las condiciones climáticas

favorecen el crecimiento de las plantas y la actividad de los microorganismos en la zona

de la rizósfera, siempre y cuando el agua y los nutrientes sean suministrados en

cantidades adecuadas (Infante y col., 2010b). Estudios en ambientes tropicales han

mostrado que las plantas favorecen la remoción de aceites y grasas en suelos

contaminados con petróleo, como en el caso del pasto Brachiaria birzantha (Hochst. Ex

A. Rich) Stapf (Hernández-Valencia y Mager, 2003; Merkl y col., 2005a, b; Merkl y

Schultze-Kraft, 2006; Mager y Hernández-Valencia, 2013). Como la fitorremediación

de suelos contaminados con petróleo se debe a un efecto compuesto de plantas y

microorganismos, esta técnica puede ser particularmente efectiva en los trópicos, dadas

las condiciones de alta radiación solar y temperaturas de esta zona (Merkl y col., 2004).

Rivera-Cruz y col., (2003), en el Edo. Tabasco en México, realizaron ensayos con

el fin de descontaminar suelos con petróleo crudo utilizando microorganismos

autóctonos y Echinocloa polystachya (pasto alemán). Estos investigadores querían

determinar si la rizosfera de E. polystachya, junto con hidrocarburos de petróleo,

modifican el tamaño de las poblaciones de bacterias y hongos. Por otra parte, también se

quería demostrar si la inoculación de bacterias y hongos en suelos con rizósfera del

pasto alemán reducía la concentración de hidrocarburos del petróleo, así como la

respuesta de producción de biomasa del pasto alemán al inóculo de bacterias en suelos.

Las bacterias y hongos utilizados fueron recolectados de la rizósfera de pasto alemán

que crecía en campos peroleros, y fueron seleccionados porque se aclimataron y

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crecieron in vitro en sustratos enriquecidos con 100000 mg de petróleo liviano por kg

de suelo.

A los 120 días, encontraron que el petróleo y el sistema rizosférico de E.

polystachya habían incrementado las poblaciones de bacterias, atribuyendo este

incremento a la mayor disponibilidad de carbono y nitrógeno; además por la adaptación

de las bacterias autóctonas que ellos habían previamente cultivado. Cuando estas

bacterias se asociaron con hongos, sus poblaciones disminuyeron y las de hongos

aumentaron, producto de las relaciones bacteria-hongo, en las que el hongo obtenía

beneficios por las relaciones de parasitismo o depredación. Este consorcio o asociación

bacteria-hongo ocasionó en el suelo rizosférico una significativa reducción de los

hidrocarburos de petróleo.

En Venezuela, Hernández-Valencia y Mager, (2003), evaluaron el uso de

Megathyrsus maximus y Brachiaria brizantha para fitorremediar suelos contaminados

con un crudo de petróleo liviano en ensayos de invernadero utilizando semillas

certificadas. También evaluaron la actividad microbiana durante el proceso de fito-

rremediación, mediante ensayos para determinar la actividad de la enzima

deshidrogenasa y el contenido de carbono microbiano. Para ello establecieron tres

tratamientos en suelos contaminados con un crudo liviano al 3 % (p/p), de los cuales en

uno se sembró M. maximus, en otro B. brizantha y un control sin plantas. Todos los

tratamientos fueron encalados y fertilizados para disminuir la acidez y favorecer el

desarrollo, tanto de plantas como de los microorganismos del suelo. Una vez

preparados los suelos sembraron semillas de cada especie en los envases

correspondientes, manteniéndose el suelo al 60 % de su capacidad de campo, mediante

riego. Se tomaron muestras al azar de cada contenedor al inicio, 30, 60, 120 y 240 días,

las cuales permanecieron refrigeradas hasta el inicio de los análisis.

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Al término del ensayo, 240 días, la concentración de aceites y grasas fue inferior

en los suelos tratados con las gramíneas, mostrando que estas especies poseían

capacidad para fitorremediar suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo. M.

maximus redujo el contenido inicial de aceites y grasas en un 63 %, B. brizantha en un

55 %, mientras la reducción del control fue de 40 %. Cuando compararon en valores

absolutos la concentración final de aceites y grasas fue de 1,0; 1,2 y 1,6 % para M.

maximus, B. brizantha y el control respectivamente, siendo estadísticamente diferentes

todos los tratamientos.

La actividad de la enzima deshidrogenasa mostró un máximo a los 30 días para

los tratamientos con plantas, y a los 60 días para el control. Se encontraron diferencias

significativas entre los tratamientos a los 120 y 240 días, siendo mayor la actividad

enzimática en B. brizantha que en M. maximus, y ambos superiores al control.

El carbono microbiano mostró la misma tendencia en todos los tratamientos, con

un incremento de biomasa hasta los 60 días del inicio del ensayo, y posteriormente una

reducción hasta los 240 días; no encontrándose diferencias significativas entre éstos.

Los investigadores explicaron la ausencia de diferencias entre los tratamientos debido a

la gran variabilidad de la data.

En el año 2004, Merkl y col., estudiaron el efecto del petróleo pesado sobre la

germinación y la producción de biomasa de dos especies de gramíneas (Brachiaria

brizantha y Megathyrsus maximus) y seis especies de leguminosas (Calopogonium

mucunoides, Centrosema brasilianum, Desmodium glabrum, Mimosa orthocarpa, M.

camporum y Stylosanthes capitata), seleccionadas por crecer de manera natural en áreas

contaminadas con el hidrocarburo en las sabanas orientales de Venezuela. Para ello

evaluaron la germinación y sobrevivencia de semillas sembradas, así como longitud del

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vástago, longitud de de la raíz y producción de biomasa en suelos de sabanas con

petróleo pesado en concentraciones de 3 y 5 % (p/p).

De las especies probadas, sólo D. glabrum mostró una disminución significativa

de germinación de 89 % y 88 % con respecto al control, tanto a 3 % como a 5 % de

contaminación respectivamente. También C. mucunoides exhibió una reducción en la

germinación en ambos niveles de contaminación, pero para el resto de las especies, la

contaminación no tuvo un efecto significativo. M. camporum y S. capitata tuvieron una

proporción de germinación excepcionalmente baja en los suelos contaminados y en los

controles.

La longitud del vástago para la mayoría de las especies fue reducida

significativamente; no obstante, el incremento en la concentración de 3 % a 5% no

causó una disminución adicional. D. glabrum mostró una correlación lineal negativa

entre largo del vástago y concentración de petróleo. También se halló una correlación

significativa para B. brizantha y M. maximus con respecto al nivel de contaminación.

Para M. orthocarpa sólo la concentración del 5 % causó una ligera reducción en el largo

del vástago.

En cuanto a longitud de la raíz, se halló una reducción significativa en suelo

contaminado para todas las leguminosas, excepto para D. glabrum y M. camporum. Una

diferencia significativa, por efecto de concentración de petróleo entre 3 % y 5 %, fue

encontrada para C. brasilianum. Solamente la concentración más alta afectó el

crecimiento de raíz de M. orthocarpa y S. capitata mostró una alta correlación entre

concentración de petróleo y longitud de raíz.

La producción de materia seca (biomasa de vástago y raíz) de vástago y raíz de

todas las especies fue significativamente más baja en suelo contaminado que en suelo

no contaminado, excepto para la biomasa de raíz para C. mucunoides. Las especies más

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afectadas, con sólo 15 % a 18 % de la biomasa del control, fueron M. maximus, S.

capitata y B. brizantha. La biomasa más alta se observó en C. mucunoides con una

reducción de 19 % y 27 %, en 3 % y 5 % de contaminación de petróleo crudo,

respectivamente. Finalmente estos investigadores concluyeron que las especies B.

brizantha, C. brasilianum y C. mucunoides, merecen ser mas estudiadas con respecto a

su uso en fitorremediación.

Merkl y col. (2005a) determinaron la influencia del petróleo crudo pesado sobre

las características morfológicas de las raíces de graminoideas en suelos contaminados.

Para el ensayo se utilizaron tres especies Brachiaria brizantha, Cyperus aggregatus y

Eleusine indica, las cuales fueron sembradas en suelo contaminado con petróleo pesado

al 5 % (p/p). Estos investigadores evaluaron la longitud de la raíz, el área superficial, el

volumen de raíz y el diámetro promedio de la raíz. Estas variables se relacionaron con el

peso seco de la raíz, con el fin de obtener la longitud específica, superficie de área

específica y volumen específico de raíz. Además de determinar el efecto de la

contaminación sobre la morfología radical, también evaluaron cual especie reducía más

el contenido de petróleo pesado en el suelo contaminado. Transcurridos 90 días,

encontraron que para B. brizantha, la longitud específica tendía a ser ligeramente

menor, mientras que área superficial, volumen específico y diámetro promedio eran

mayores en comparación con el control. Las diferencias fueron significativas con un

menor diámetro promedio con respecto al control para C. aggregatus. Para E. indica, no

se hallaron diferencias significativas. Tanto B. brizantha como C. aggregatus

alcanzaron una mayor degradación de petróleo que el control, mientras que E. indica no

mostró diferencia significativa alguna entre los suelos contaminados y sus controles.

Si bien la morfología radical de B. brizantha y C. aggregatus fué mas afectada

debido a la alteración de las características físicas y químicas del suelo contaminado, en

22

comparación con los controles, esto no las descartaría como candidatos para la

fitorremediación, pues bajo estos tratamientos se logró una mayor degradación del

petróleo comparada con los suelos no plantados. Por último, este estudio demostró que

los hidrocarburos de petróleo alteran la biomasa y la estructura de las raíces, y en

consecuencia el volumen de las raíces que pueden catalizar la descontaminación de los

suelos.

Luego de evaluar el efecto del petróleo en el crecimiento de plantas tropicales,

Merkl y col. (2005b) procedieron a realizar ensayos de fitorremediación con las

especies seleccionadas en su trabajo anterior (2005a) con el objetivo de determinar el

desempeño de las mismas en suelos contaminados con petróleo pesado y mejorar la

degradación de éste. Con este fin en mente, mezclaron suelos de las sabanas orientales

de Santa Bárbara, Edo. Monagas (Venezuela), con petróleo pesado al 5 % (p/p). Tres

especies de leguminosas (Calopogonium mucunoides, Centrosema brasilianum y

Stylosanthes capitata) y tres especies de gramíneas (Brachiaria brizantha, Cyperus

aggregatus y Eleusine indica) fueron establecidas tanto en suelos contaminados y no

contaminados, además de un control sin plantas. La toma de muestras de plantas y

suelos se realizó a los 90 y 180 días, para determinar producción de biomasa, contenido

total de aceites y grasas y, análisis de fracción (saturados, aromáticos, resinas y

asfaltenos). A diferencia de los resultados del trabajo anterior, todas las leguminosas

murieron entre las seis y ocho semanas del tratamiento, siendo esto atribuido a una

duración mayor del experimento, la forma de los contenedores y al exceso de

fertilizante.

La producción de biomasa fue significativamente reducida en suelo contaminado,

excepto para E. indica, después de 180 días. B. brizantha tuvo la producción de biomasa

más alta, para vástago y raíz, al final del experimento en suelo contaminado y no

23

contaminado; sin embargo, el crecimiento de las raíces fue sumamente afectado cuando

se le comparó con el control no contaminado. Después de 90 días el crecimiento del

vástago de C. aggregatus mostró la mayor inhibición debida a la contaminación; no

obstante, se recuperó hacia el final del experimento. E. indica tuvo la mayor biomasa de

vástago y raíz a los 90 días, pero transcurridos 180 días, ambos valores no mostraron un

incremento.

El contenido de aceites y grasas totales, mostró una influencia significativa de las

plantas en la degradación del petróleo en ambas fechas de muestreo. También hubo un

efecto significativo de la especie de planta en el contenido total de aceites y grasas. Así,

los suelos plantados con B. brizantha, exhibieron concentraciones mas bajas de aceites

y grasas que los controles a los 90 y 180 días.

Si bien B. brizantha fue la gramínea mas afectada, al final del experimento tenía

el mayor valor de biomasa en vástago y raíz. Basados en estos resultados, B. brizantha

fue considerada como una especie prometedora para fitorremediación de suelos

contaminados con petróleo, pues mostró la mayor producción de biomasa, además de

producir la más alta disipación de petróleo comparada con el suelo no plantado.

En el año 2006, Merkl y col. evaluaron el efecto de B. brizantha, en las

poblaciones microbianas y su actividad, en suelos contaminados con 5 % de petróleo

pesado, además de determinar si estas diferían de suelos no plantados. Esta especie fue

seleccionada en base al trabajo anterior, en el cual exhibió los valores más altos de

producción de biomasa y degradación de petróleo en suelos contaminados. El objetivo

de este ensayo era aclarar si la cantidad de microorganismos y su actividad, diferían

entre suelos contaminados con petróleo pesado, y plantados con B. brizantha, y suelos

contaminados y sin plantas. Además, también evaluó si las poblaciones microbianas se

24

correlacionaban con la declinación de hidrocarburos de petróleo encontrada en ensayos

anteriores.

Para el muestreo los investigadores distinguieron dos zonas: la rizósfera y la zona

alejada de la rizósfera. En cada una de estas zonas contaron bacterias y hongos

degradadores mediante técnicas de microbiología, y midieron la respiración del suelo

inducida por sustrato (SIR) y el pH. Transcurridas 30 semanas hallaron significativas

diferencias en el número de hongos y degradadores de petróleo crudo en el suelo de la

rizósfera respecto a suelos alejados de la rizósfera o suelos no plantados. En cuanto a la

respiración del suelo, la rizósfera siempre tuvo actividad microbiana menor que el suelo

no plantado o que el suelo alejado de la rizósfera. El pH fue menor en suelos plantados

con la gramínea respecto a suelos no plantados, y atribuyeron esta diferencia a la

acumulación de ácidos orgánicos debida a una mayor actividad metabólica de las

bacterias y hongos en los suelos plantados. Los investigadores hallaron una alta

correlación entre los valores de pH y la respiración microbiana, y esta disminución en el

pH afecta la actividad microbiana en el proceso de degradación de hidrocarburos y se

reflejó en una menor respiración en la rizósfera. Los autores también encontraron que la

regulación del pH dentro de las condiciones de neutralidad mejoraría el desempeño de

bacterias y hongos.

En el año 2012 Navas evaluó la capacidad fitorremediadora de Megathyrsus

maximus en suelos de sabanas contaminados con petróleo extrapesado. Para ello sembró

plantas de la especie en suelos contaminados al 5 % con petróleo extrapesado, y

mejorado con cáscara de arroz y fertilizado. Como controles se usó el mismo tipo de

suelo contaminado, pero sin plantas. Los parámetros evaluados fueron el contenido de

aceites y grasas, y el fraccionamiento del crudo. Adicionalmente, también se evaluó el

efecto que la planta tiene en la población microbiana mediante la determinación de la

25

respiración basal, carbono de la biomasa microbiana, coeficiente metabólico y actividad

de la enzima deshidrogenasa. Al finalizar el ensayo de 120 días, encontró que esta

especie mostró capacidad para fitorremediar, pero requiere de un período superior a la

duración del ensayo para alcanzar el límite de limpieza establecido por la legislación

venezolana. También halló que la planta tuvo una influencia beneficiosa sobre los

microorganismos, pues la respiración basal, el carbono de la biomasa microbiana, y la

actividad de la enzima deshidrogenasa mostraron valores superiores en presencia de la

planta. El coeficiente metabólico exhibió valores inferiores al control, pero se explica

porque en presencia de esta especie hay una mayor población de microorganismos, que

en los envases sin plantas.

En la búsqueda de procesos de limpieza del suelo más eficientes, se han creado

sistemas más complejos que involucran diferentes técnicas de biorremediación que se

implementan de manera secuencial, o en fases, conocidas como “sistemas

multiprocesos”. En el año 2005, Huang y col. realizaron una biorremediación por fases

implementando un sistema de fitorremediación por multiprocesos (multiprocess

phytoremediation system, MPPS) para descontaminar suelos con hidrocarburos de

petróleo (50 g/kg de lodos de refinería). El MPPS constó de varias fases; primera,

landfarming; mezclando el suelo dos veces por semana durante 15 días, la segunda

bioaumentación, consistente en la inoculación al suelo de un cultivo de bacteria

degradadora y por último la fitorremediación mediante la siembra de semillas de

Festuca arundinacea a los 20 días, previamente tratadas con dos cepas de bacterias

promotoras del crecimiento (plant growth promoting rhyzobacter, PGPR). Este MPPS

fue comparado con tratamientos consistentes únicamente de, landfarming,

biorremediación y fitorremediación. Se tomaron muestras del suelo y de las plantas al

inicio, 30, 60, 90, 120 y 240 días. A las cuales se les determinó el contenido de aceites y

26

grasas y así como su toxicidad con el uso del colémbolo (Onychiurus folsomi).

Transcurridos 120 días, todos los tratamientos, landfarming, bioaumentación, fito

remediación y MPPS, fueron realizados nuevamente en sucesión por otros 120 días.

Una vez finalizado el ensayo la reducción de la concentración de hidrocarburos fue

menor en los suelos que fueron tratados sólo con un proceso, siendo la reducción del

landfarming 20 %, segundo la biorremediación con 40 %, tercero la fitorremediación

con 55 % y MPPS con 90%. Por su parte, los ensayos de toxicidad demostraron que el

suelo de landfarming todavía era tóxico para O. folsomi, al igual que el suelo del

tratamiento fitorremediador también afectaba la germinación de las plantas, mientras

que los suelos de MPPS no eran tóxicos y no afectaron la germinación de F.

arundinacea.

27

HIPÓTESIS

La especie Megathyrsus maximus posee capacidad para fitorremediar suelos

contaminados con hidrocarburos de petróleo pesado.

OBJETIVO GENERAL

Determinar la capacidad fitorremediadora de Megathyrsus maximus en suelos de

sabana contaminados con petróleo pesado al 5%.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar la capacidad de Megathyrsus maximus para reducir el contenido de

aceites y grasas en un suelo contaminado con crudo un pesado al 5%.

2. Evaluar como cambian las diferentes fracciones del hidrocarburo por el

establecimiento de Megathyrsus maximus durante la fitorremediación de un suelo

contaminado con un crudo pesado al 5 %.

3. Evaluar los cambios en indicadores de la actividad microbiana, tales como el C

microbiano y la respiración basal por el uso de Megathyrsus maximus durante la

fitorremediación de un suelo contaminado con un crudo pesado al 5%.

28

MATERIALES Y MÉTODOS

Suelos y especies vegetal utilizados:

Los suelos utilizados para los ensayos pertenecen al horizonte A de un Typic

Haplustox proveniente de la localidad de El Sombrero, Edo. Guárico. Los ejemplares de

Megathyrsus maximus fueron colectados en los alrededores del Instituto de Zoología y

Ecología Tropical (I.Z.E.T.), seleccionando ejemplares que tenían una altura de entre 25

y 30 cm.

Descripción del material botánico:

Inicialmente el proyecto fue diseñado para evaluar la capacidad fitorremediadora

de la gramínea Hyparrhenis rufa; sin embargo, los ejemplares trasplantados en suelos

contaminados no sobrevivieron, y se descartó el uso de esta especie. Por esta razón se

decidió cambiar a la especie Megathyrsus maximus, la cual ha sido evaluada en ensayos

anteriores, demostrando su capacidad de tolerar y fitorremediar, suelos contaminados

con hidrocarburos extrapesados a concentraciones iguales a las del presente ensayo

(Navas, 2012).

Megathyrsus maximus Jacq. es una gramínea perenne perteneciente a la familia

Poaceae, que forma haces o manojos, pudiendo alcanzar hasta los tres metros de altura y

1,5 metros de diámetro; de tallos erectos y ascendentes, con vena central pronunciada;

cuyas raíces son largas y fibrosas, las cuales forman rizomas ocasionalmente, pudiendo

soportar niveles moderados de sequía (Cook y col., 2005).

Caracterización del suelo:

Las muestras de suelo se analizaron por triplicado con el fin de obtener

información a cerca de sus características físicas y químicas utilizando la metodología

descrita por Anderson e Ingram (1992). Los análisis realizados fueron del tipo físico y

químico.

29

a) Análisis físico de las muestras del suelo.

a.1) Textura.

Para estimar el contenido de arenas, limos y arcillas se aplicó el análisis mecánico

de Bouyoucos a las muestras de suelo. Se tomaron 50 g de suelo seco y tamizado

(partículas < 2 mm), se mezclaron con 125 ml de agua destilada y con 50 ml de

solución de pirofosfato de sodio 0,02 N. La mezcla se agitó por 10 minutos en una

batidora eléctrica, para luego trasvasarla a un cilindro graduado de 1000 ml y enrasado

con agua destilada. Posteriormente se tapó el cilindro, se invirtió su contenido cuidando

de no derramarlo para suspender todas las partículas y se dejó en reposo. Se realizaron

mediciones de temperatura y densidad a los 40 segundos y 5 horas en reposo, utilizando

para ello un termómetro y un hidrómetro previamente calibrado.

Las proporciones de arenas, limos y arcillas fueron determinadas por medio de

las siguientes ecuaciones:

% Arenas = 100 - ((lectura corregida a los 40 segundos) x 100) Peso seco de la muestra

% Arcillas = lectura corregida a las 5 horas x 100 Peso seco de la muestra

% Limo = 100 – (% arcilla + % arena)

a.2) Capacidad de campo:

Este parámetro se determinó tanto para suelo no contaminado como para suelo

contaminado. Para el suelo no contaminado se tomaron 20 g de suelo seco y tamizado

(partículas < 2 mm), se colocaron en un embudo con papel filtro Wattman # 2,

previamente humedecido con agua colocado sobre un matraz, y se pesó el conjunto.

Posteriormente, se añadió por goteo agua destilada utilizando una bureta hasta que la

primera gota cayó del suelo en el matraz. Se anotó el volumen utilizado, se tapó el

30

embudo junto con el matraz con plástico y se dejó reposar por tres días alejado de la luz

directa del sol. Transcurrido este período se pesó el conjunto. La cantidad de agua

retenida por el suelo constituye su capacidad de campo.

En cuanto al suelo contaminado, se preparó una mezcla de 85 % de suelo, 10 % de

cáscara de arroz y 5 % de crudo. De esta mezcla se tomaron 20 g y se realizó el mismo

procedimiento para determinar la capacidad de campo del suelo contaminado.

b) Análisis químico de las muestras de suelo.

b.1) Capacidad de intercambio catiónico efectiva (CICE), aluminio

intercambiable, porcentaje de saturación de bases (% SB) y bases intercambiables.

Se utilizó el método de extracción con acetato 1 M a un pH de 7,0 para determinar

los cationes intercambiables, y la concentración de éstos a través de espectrofotometría

de absorción atómica. El contenido de aluminio intercambiable se determinó por medio

de una titulación con hidróxido de sodio 0,1 M, previa lixiviación del aluminio de la

muestra con cloruro de potasio 1M. Con estos resultados se obtuvo la capacidad de

intercambio catiónico efectiva (C.I.C.E.) y el porcentaje de bases (SB) mediante las

ecuaciones:

CICE = Σ concentración de cationes intercambiables

SB = ((Σ cationes básicos)/C.I.C.E.)* 100

b.2) Fósforo disponible.

A través del método vanadato-molibdato, se extrajo el P disponible a 2g de suelo

seco y tamizado (partícula < 2 mm), mediante una solución extractora de bicarbonato de

sodio (NaHCO3), 0,5 M a un pH de 8,5; luego se mantuvo en agitación por 30 minutos.

Se transfirieron 6 ml del extracto a un balón aforado de 50 ml, se agregó una gota de p-

nitrofenol y se ajustó el pH con HCl y NaOH 5 N. Luego se agregaron 8 ml del reactivo

31

B y se enrasó con agua destilada. Al desarrollar el color se midió la absorbancia a 880

nm.

b.3) Nitrógeno total.

La determinación se realizó siguiendo la técnica de oxidación de Kjeldahl. Para

ello se tomó una muestra de 0,2 g de suelo seco y tamizado (partícula < 0,15 mm), la

cual fue sometida a digestión en una mezcla de H2SO4 concentrado y H2O2 a 360° C

durante dos horas. Posteriormente se destiló el extracto y tituló con HCL 0,01 N,

utilizando como indicador rojo de metilo y verde bromocresol. El porcentaje de N total

se calculó por medio de la fórmula:

% N = ((valoración del destilado – valoración del blanco) x Molaridad del HCl x M) Peso de la muestra

b.4) pH.

Una suspensión 1:2,5; suelo: agua fue preparada, utilizando 6 g de suelo seco y

tamizado (< 2 mm) y 15 ml de agua destilada, se agitándose por 30 minutos. Luego se

dejó reposar por 30 minutos más y se determinó el pH con un electrodo de vidrio.

b.5) Contenido de materia orgánica.

Se tomó una muestra de 0,5 g de suelo seco y tamizado (< 0,15 mm), se añadieron

2 ml de K2Cr2O7 al 8 % y 3 ml de H2SO4 concentrado, y se sometió a una digestión

húmeda a 150 °C por 30 minutos. Al enfriarse la muestra se añadieron 10 ml de agua

destilada y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos. Se trasvasaron las muestras a

celdas de cuarzo y se midió su absorbancia a 650 nm. Por medio del factor de Van

Bemmelen (1,724) se obtuvieron los valores de CO a materia orgánica, mediante la

ecuación:

% MOS = % CO x 1,724

32

Evaluación de la capacidad de Megathyrsus maximus para reducir el

contenido de aceites y grasas en suelos contaminados con crudo pesado:

Para este estudio se establecieron tres tratamientos:

TP: Este tratamiento permitiría establecer el efecto de Megathyrsus maximus

sobre la concentración de aceites y grasas en el suelo. Ello se evaluó mediante la

siembra de plantas de esta especie en 2000 g de una mezcla consistente de 85 % de

suelo, 10 % de cáscara de arroz, utilizada como acondicionador de suelo, fertilización y

petróleo pesado reformulado hasta alcanzar una concentración del 5 %. Este petróleo

reformulado se obtuvo de mezclar petróleo extrapesado y petróleo mediano en

proporciones establecidas por algoritmo determinado por PDVSA – INTEVEP

(Zamora, 2006).

SP: Un segundo tratamiento permitiría estimar los cambios en la concentración de

aceites y grasas en ausencia de M. maximus. Este tratamiento consistió de una mezcla

idéntica a la de los envases con M. maximus; 2000 g de mezcla con 85 % de suelo, 10 %

de cáscara de arroz, fertilización y petróleo pesado reformulado hasta alcanzar una

concentración del 5 %, pero sin plantas.

TC: por último se estableció un tratamiento control, en donde se evaluó el cambio

en la concentración de aceites y grasas en el suelo contaminado al 5 %, sin plantas,

cáscara de arroz ni fertilizantes. Este control constaba de 2000g de una mezcla de suelo

en un 95 %, y petróleo pesado reformulado en un 5 %.

Los tratamientos y el control fueron depositados en envases cilíndricos de PVC de

30 cm de alto y 10 cm de diámetro. Para cada tratamiento se establecieron 5 réplicas,

obteniendo un total de 15 unidades experimentales.

33

Los primeros ejemplares de M. maximus trasplantados no resistieron la

contaminación inicial y murieron, por lo que se decidió realizar un proceso de

bioestimulación en todos los tratamientos en los primeros 30 días. Esta bioestimulación

consistió en sacar el suelo de su envase y extenderlo en una capa uniforme no mayor a

dos cm, y cubrirlo con un plástico para conservar la humedad, regarlo y removerlo a los

15 días. Una vez finalizada esta fase, los suelos se retornaron a los envases y se

trasplantaron las plantas nuevamente en el tratamiento TP.

Como los suelos de sabanas, al igual que los suelos contaminados, suelen

presentar deficiencias en nitrógeno y fósforo, (Cawenberghe y Roote, 1998), sólo a los

suelos de los tratamientos con la mezcla de cáscara de arroz (TP y SP) recibieron

fertilización de C:N:P en una relación 100:2:0,2 (Hutchinson y col., 2001), utilizando

como fuentes de nutrimentos N:P:K (15:15:15) y urea. La fertilización se incorporó un

50% al comienzo del ensayo, un 25% a los 30 días, y otro porcentaje igual a los 60 días.

A las plantas se les suministró agua semanalmente, si se consideraba que necesitaban

agua, manteniendo el suelo al 50 % de su capacidad de campo.

Se colectaron muestras de suelo al inicio, 15, 30, 60, 90, 120 y 180 días de

iniciado el ensayo. A cada muestra se le practicaron los siguientes análisis:

Contenido de aceites y grasas.

Para la determinación del contenido de aceites y grasas se utilizó el protocolo de

EPA 3540 (EPA 1986). Como extractante se empleo di-clorometano. Para ello se

pesaron 20 g de suelo seco, y se colocaron en un dedal de celulosa, luego se colocó la

muestra en un extractor de solvente con 80 ml del extractante por 60 minutos. Una vez

obtenido el extracto, se permitió la evaporación del diclorometano, quedando como

residuo remanente, los aceites y grasas extraídos del suelo. El contenido de aceites y

grasas fue calculado mediante la fórmula:

34

% A y G = Pf – Po * 100 Pm

En la cual:

Pf: Peso final del envase colector

Po: Peso inicial del envase colector

Pm: Peso de la muestra del suelo contaminado

Este método no permite discriminar entre aceites y grasas de origen biológico de

aquellos provenientes del petróleo. Sin embargo, como el contenido de materia orgánica

de estos suelos es muy bajo, se puede considerar que la mayor contribución de aceites y

grasas en el suelo proviene de los aportes del petróleo utilizado.

Fraccionamiento del hidrocarburo.

La realización de este ensayo permite determinar el contenido de saturados,

aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA), que son las distintas fracciones que componen

el petróleo. Muestras del suelos, colectadas al inicio y al final del ensayo, fueron

procesadas según el método 5520 (APHA, 1992). Se tomaron 10 g de suelo y se

colocaron en un extractor de solventes con 80 ml de n-heptano por 30 minutos, con el

fin de separar los saturados, aromáticos y resinas (SAR), luego se permitió la

evaporación del n-heptano, se pesó el extracto obtenido y se sembró en una columna de

silica gel y hexano, separando con tolueno los aromáticos y con metanol las resinas.

Cada extracción se realizó por separado, en envases previamente pesados; calculando,

por diferencia de peso, los saturados (peso del SAR se determinó antes). Como último

paso se extrajeron los asfaltenos, con diclorometano en el extractor por 30 minutos,

dejando evaporar el extractante y pesando el envase.

35

Respiración basal.

Al consumir el carbono que forma parte del petróleo, los microorganismos lo

asimilan y metabolizan, luego parte de éste carbono se oxida durante la respiración,

utilizando oxígeno como aceptor final de electrones y formando CO2, el cual es liberado

a la superficie. Midiendo cuánto CO2 se libera se puede cuantificar la actividad

metabólica de los microorganismos del suelo.

El CO2 liberado por los microorganismos durante el proceso de degradación de

los hidrocarburos, fue determinado como respiración basal mediante el protocolo de

Alef y Nannipieri (1995), utilizando una alícuota de suelo de 25 g (peso seco)

proveniente de cada una de las réplicas de los tratamientos, que previamente se

mantenían refrigeradas (< 4 °C), y a 50 % de la capacidad de campo. Estas muestras se

colocaron en un envase de vidrio cerrado herméticamente junto con 10 ml de NaOH 0,5

M, el cual sirvió como solución trampa del CO2. El envase contentivo de vidrio se

incubó en la oscuridad a 25° C por 72 horas, permitiendo la captura de CO2 por la base

(ver ecuación 1). Una vez finalizado el período de incubación, se extrajeron los envases

y se añadió 3 ml de BaCl2 a los envases con NaOH, para obtener el carbonato

proporcional al CO2 fijado (ecuación 2), y el NaOH restante se tituló con HCl 0,5 M,

utilizando fenolftaleína (ecuación 3).

Ecuación 1 4NaOH + 2CO2 → 2Na2CO3 + 2H2O

Ecuación 2 2Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2NaCl

Ecuación 3 NaOH + HCl → H2O + NaCl

El cálculo del CO2 fijado se hizo a través de la siguiente fórmula:

mg CO2 / Kg suelo • h = (ml HCl blanco – ml HCl muestra) x Molaridad x 22 x (10/2)

x (100/25) x (Kg suelo seco/ Kg suelo húmedo)/horas

36

Carbono de la biomasa microbiana.

Mediante este ensayo se puede estimar como influyen los diferentes tratamientos

sobre la biomasa del carbono contenida en los microorganismos del suelo. Dado el

papel vital que juegan los microorganismos en la disminución de la concentración de

petróleo en el suelo, es importante estimar su biomasa, y monitorear como ésta varía

durante el proceso de descontaminación.

La determinación de la biomasa del carbono microbiano se realizó de acuerdo al

método de Anderson y Domsch (1978, 2010), el cual fue calibrado por estos

investigadores por el de fumigación-extracción de Vance y col. (1987).

Se tomaron 25 gramos de suelo fresco (a la humedad de campo o ajustados al 60-70

% de la capacidad de campo) por triplicado para cada serie de tiempo, se le añadieron 1

ml de solución de glucosa al 8 %, y se dejaron a temperatura ambiente por dos horas.

Una vez transcurrido este tiempo, se midió la emisión de CO2 durante 4 horas, con el

mismo método utilizado para estimar la respiración basal. La única diferencia fue que

tanto las soluciones de HCl como las de NaOH fueron mas diluidas (0,05 M).

La cantidad de CO2 emitida por el suelo fue calculada por medio de la siguiente

fórmula:

(BW – VP) x 1,1x 100 = mg de CO2 4 x EW 100 g PS x h

Para un coeficiente de respiración se cumple que:

1 mg de CO2 / 100 g PS x h = 20,6 mg C – biomasa / 100g PS

donde:

BW: promedio del consumo de HCl del blanco o control (ml)

VP: promedio del consumo de HCl de la muestra (ml)

1,1 Factor: 1 ml de HCl 0,05 M equivale a 1,1 mg de CO2

4: tiempo de incubación

37

EW: peso del suelo seco (g)

Coeficiente metabólico.

Una vez determinada la respiración basal y estimado el carbono microbiano, se

calculó la relación entre estas dos variables, conocida como coeficiente metabólico

(qCO2):

qCO2 = RB / Cmic

Este indicador es una medida del uso eficiente del carbono del suelo y de las

condiciones de stress al cual pueden estar sometidos los microorganismos (Anderson y

Domsch, 1993).

Actividad de la enzima deshidrogenasa.

La oxidación de sustancias orgánicas en condiciones aeróbicas se debe a

actividades enzimáticas, y ocurre, por lo general, mediante un proceso de

deshidrogenación catalizado por la deshidrogenasa (Alef y Nannipeieri, 1995). La

actividad de esta enzima es intracelular, por lo tanto la medición de su actividad es un

indicador directo de la actividad microbiana (García y Hernández, 1997).

Se utilizó el método de Casida et al. (1964, modificado en 1977), para determinar

la actividad de esta enzima, el mencionado método se basa en la tasa de reducción del

cloruro de trifeniltetrazolium (TTC) a trifenil formazán (TPF), éste forma un

precipitado de color rojo, insoluble en agua, pero soluble en solventes orgánicos.

Se tomaron 1,5 g de suelo (peso seco), y se colocaron en tubos de ensayo junto

con 0,25 ml de TTC al 3 %, 0,05 g de CaCO3 y 2,5 ml de agua destilada. Se incubó la

muestra por 24 horas a 37° C, se añadieron 2,5 ml de CH3OH, se agitó durante un

minuto; se filtró la muestra, se añadieron 25 ml de CH3OH y se midió la absorbancia a

485 nm. Luego se determinó la concentración de TPF por medio de una curva de

38

calibración, cuyos patrones fueron preparados a partir de una solución estándar de TPF

(1 mg/L). La actividad de la enzima se determinó empleando la siguiente fórmula:

AD = μg TPF/ml * 25

1,5 g suelo

Análisis estadísticos.

Los resultados de los tratamientos evaluados fueron comparados mediante un

análisis de varianza de dos factores y comparaciones a posteriori Fisher LSD (Least

Significant Difference), con un nivel de significancia de 0,05. Además se realizó un

análisis de correlación lineal entre tratamientos, todos ello empleando el software

PAST.

39

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización del suelo:

a) Análisis físico de las muestras de suelo:

Textura y Capacidad de campo:

El conocimiento de las proporciones de partículas de diferente tamaño del suelo,

su textura, es crítico para entender el comportamiento del mismo y su manejo, pues la

textura es una propiedad básica del suelo, no sujeta a cambio fácilmente. El término

textura se refiere propiamente a aquella fracción de partículas menores o iguales a 2

mm. Así, el término textura indica en que proporción se encuentran la arena, limo y

arcilla; expresada ésta en porcentajes de peso (Brady y Weil, 2008).

Cuando un suelo es denominado como franco, indica una mezcla de arena, limo y

arcilla poseedora de propiedades de los tres componentes en iguales proporciones; no

obstante no debe entenderse que los tres componentes están en cantidades iguales. Ello

se explica porque una pequeña proporción de arcilla basta para conferir propiedades

arcillosas a un suelo, mientras que pequeñas cantidades de arena y limo tienen una

influencia menor en el comportamiento de éste (Brady y Weil, 2008).

A los suelos francos con un porcentaje importante de arena, se les añade el

término arenoso; debiendo poseer al menos una proporción de arena del 45 %. Por la

alta proporción de arena, estos suelos poseen poros relativamente grandes, y no pueden

retener agua u otros líquidos contra la gravedad, por esta causa se drenan y promueven

la entrada de aire rápidamente, siendo el movimiento de los líquidos más rápido hacia

abajo que lateral (Brady y Weil, 2008). Es debido a estas características físicas, que los

hidrocarburos en suelos arenosos percolan a una mayor profundidad en menor tiempo

(Deuel y Holliday, 1997; Brady y Weil, 2008). Es éste movimiento vertical el que puede

disminuir la disponibilidad del hidrocarburo para los microorganismos degradadores,

40

los cuales se encuentran en mayor abundancia cerca de la superficie (Cauwenberghe y

Roote, 1998; Frick y col., 1999). No obstante, a pesar de que este suelo posee casi 2/3

de arena, las porciones de limo y arcilla de los suelos franco arenosos limitan la

propagación del hidrocarburo, y aumentan la capacidad de retención de agua. El suelo

utilizado para este ensayo se clasifica como franco arenoso (Cuadro 1), y posee una

capacidad de campo de 41,6 %, considerada como alta, permitiendo una disponibilidad

de agua en cantidades suficientes para el establecimiento de plantas y la supervivencia

de microorganismos.

Cuadro 1. Proporciones de arena, limo y arcilla del suelo

Partículas de suelo %

Arena 71,6

Arcilla 16

Limo 12,4

Al añadir la cáscara de arroz (10 % del total) y el petróleo pesado (5 % del total),

la capacidad de campo no mostró diferencias significativas respecto al suelo limpio.

Cuadro 2. Capacidad de campo de suelo no contaminado y contaminado

Capacidad de campo (%)

Suelo no contaminado 41,6

Suelo contaminado 40

41

b) Análisis químico de las muestras de suelo:

Capacidad de intercambio catiónico efectiva (C.I.C.E), aluminio

intercambiable, porcentaje de saturación de bases (% S.B), bases intercambiables,

pH, contenido de materia orgánica, fósforo disponible y nitrógeno total.

El suelo utilizado en este ensayo provino del estado Guarico, el cual forma parte

de las regiones de Venezuela caracterizadas por tener suelos ácidos; junto con los llanos

orientales y el sur del país (Casanova, 2005).

El Cuadro 3 muestra los valores obtenidos del análisis químico del suelo, y en él

se puede apreciar la poca fertilidad de éste, causada por las bajas concentraciones de N

y P disponibles, bases intercambiables, capacidad de intercambio catiónico y el escaso

contenido de materia orgánica.

Adicionalmente, el bajo pH (4,9) indica la acidez característica de los suelos de

sabana, escasos de nutrientes; afectando el crecimiento de las plantas y la actividad

biológica de los microorganismos (Cauwenberghe y Roote, 1998).

Cuadro 3. Resultados de los análisis químicos de las muestras de suelo.

C.I.C.E (cmoles/kg) 1,53

% S.B 67,97

Σ Bases intercambiables (cmoles/kg) 1,04

Acidez intercambiable (cmoles/kg) 0,59

Ca (cmoles/kg) 0,19

Mg (cmoles/kg) 0,16

K (cmoles/kg) 0,1

P disponible (mg/kg) 15

N total (mg/kg) 590

% M.O 1,65

pH 4,9

42

A causa de las bajas concentraciones de fósforo y nitrógeno, y por la

contaminación con petróleo pesado, se adicionaron fertilizantes (N:P:K y urea) de

manera dosificada, según las proporciones determinadas por Hutchinson y col. (2001);

esto permitió tanto a plantas como a microorganismos contar con los nutrientes

necesarios para tener un mejor crecimiento. En lo referente a la acidez, se decidió no

aumentar el pH mediante encalado pues la degradación de hidrocarburos es posible en

suelos ácidos (Stapleton y col., 1998).

Evaluación de la capacidad de Megathyrsus maximus para reducir el contenido de

aceites y grasas en suelos contaminados con crudo pesado:

Contenido de aceites y grasas:

Las técnicas actualmente empleadas sólo permiten una recuperación parcial del

crudo. De la mezcla al 5 % originalmente preparada, la evaluación inicial del contenido

de aceites y grasas estimó un valor de 3,5 %, hecho que indica una recuperación del 70

%. Esto se explica porque el solvente utilizado no logró una extracción completa del

crudo, además se producen pérdidas durante la preparación de la mezcla suelo-desecho,

así como en la extracción por la volatilización de la porción mas ligera. En todo caso los

valores de recuperación obtenidos en este estudio están dentro de lo previsible según la

literatura consultada (Mc Gill y Rowell, 1980; Infante y col., 2010b).

La variación de la concentración de aceites y grasas con respecto al tiempo, es uno

de los parámetros más importantes a evaluar en este ensayo, por ser una medida del

cambio en el tiempo de la concentración de crudo en el suelo, y de la efectividad del

proceso biorremediador en cuestión (Infante y col., 2010b). Cabe aclarar que la

determinación de aceites y grasas no permite discriminar los aceites y grasas de origen

mineral de aquellos de origen vegetal; no obstante dadas las características del suelo

43

utilizado (muy bajo contenido de materia orgánica) se estima que esta contribución debe

ser muy baja.

La legislación nacional establece en el Decreto 2635 (República de Venezuela),

en cuanto a los requerimientos mínimos para realizar biotratamiento, lo siguiente: 1) El

contenido hidrocarburos biodegradables en el desecho debe estar entre 1 y 10 %

(Artículo 53, numerales 1 y, 2) el suelo contaminado con esparcimiento de

hidrocarburos se considerará limpio cuando el contenido de aceites y grasas sea menor

al 1 % (Artículo 50, numeral 4).

En la Figura 1 se observa la variación del contenido de aceites y grasas, con

respecto al tiempo, para el suelo con tratamiento TP, los suelos con SP y TC, durante el

período del ensayo. El contenido de aceites y grasas al inicio del estudio fue para los

tres tratamientos 3,5 %, el cual disminuyó a 1,89 % en el suelo con Megathyrsus

maximus; 2,19 % para el tratamiento sin plantas; y 2,53 % para el suelo control al

término del ensayo (180 días), siendo los tratamientos estadísticamente diferentes entre

sí (p = 0,0063), y con respecto al inicio del ensayo (p = 0)(ANOVA de dos vías),

confirmando la disminución de los niveles de contaminación del suelo en todos los

tratamientos considerados; así, TP redujo en un 46 % la concentración de aceites y

grasas, SP en un 37 % y TC en un 28%.

44

Contenido de Aceites y Grasas

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 50 100 150 200

días

Ace

ites

y gr

asas

(%)

TP

SP

TC

aA bA bA

bAcA

cAcA

dA

bCbC bC bC

bA bBbB

cB

Figura 1: Variación del contenido de aceites y grasas de petróleo pesado (15 ° API) en los diferentes tratamientos evaluados. Tratamiento con suelo mejorado y M. maximus (TP), suelo mejorado sin plantas (SP), y en suelo contaminado con petróleo sin ninguna mejora (TC). Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias dentro de cada tratamiento para cada tiempo. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para cada tiempo. La línea vertical indica el inicio del proceso de fitorremediación.

En referencia específica al tratamiento con M. maximus, éste también mostró

diferencias significativas con respecto al día 180 y el resto de los días. Los valores

críticos calculados; 14,48 para los tratamientos y; 41,41 para los tiempos, fueron muy

superiores a los valores críticos obtenidos; 3,89 y 3, para tratamientos y tiempos,

respectivamente. A pesar de que el efecto del factor tiempo es mucho mayor que el

efecto del factor tratamiento, la presencia de las plantas produjo una mayor

disminución, estadísticamente significativa, de las concentraciones de crudo con

respecto a los tratamientos SP y TC durante el período del ensayo (p = 0,003 y p =

0,008 respectivamente).

45

La gravedad API del crudo utilizado en este ensayo, 15 ° y considerada como

baja, obviamente influyó en los resultados obtenidos (McMillen y col.; 2004, Infante y

col., 2010a; Infante y col., 2010b; Navas, 2012). Los crudos cuya gravedad API se

encuentre entre 10 y 22 °, son clasificados como pesados, y contienen una mayor

proporción de resinas y asfaltenos que los crudos livianos y medianos; haciéndolos más

resistentes a la biodegradación.

El tratamiento de bioestimulación, aplicado durante los primeros 30 días del

ensayo, posiblemente aumentó en gran medida la volatilización de los compuestos

saturados y aromáticos de bajo peso molecular (Mc Gill y Rowell, 1980; Bossert y col.,

1984; Infante y col., 2010b), disminuyendo la concentración de éstos y el efecto tóxico

que tienen en plantas y microorganismos. Ello a su vez facilitó tanto la acción

remediadora de los microorganismos, como el establecimiento de las plantas luego de

30 días.

La disminución más rápida de la concentración de crudo se obtuvo en el proceso

de biestimulación inicial para el suelo mejorado (con petróleo, cáscara de arroz y

fertilizante) tanto para TP y SP; los primeros 30 días, siendo ésta de 11 %, esto se debió

a la adición de cáscara de arroz y fertilizantes. La tasa de disminución para el control

(suelo con petróleo, sin cáscara de arroz ni fertilizantes) fue menor, un 8 %. Si bien la

disminución del contenido de aceites y grasas en la fase de fitorremediación (TP) fue

menor a la fase previa de bioestimulación, se obtuvo una disminución del 46 % en un

período de150 días. Esto se logró con el suelo en envases, con sólo una pequeña

superficie del mismo expuesta directamente a la atmósfera dada la forma de los envases

y sin remoción del suelo. Los exudados radicales parecen haber estimulado la actividad

microbiana, favoreciendo esto a su vez la degradación del crudo, dado que este es

usado como fuente alternativa de carbono (Mager y Hernández-Valencia, 2013). La

46

disminución de las concentraciones de crudo para los dos tratamientos restantes fueron

significativamente menores en el mismo período; 37 % para SP y 28 % para TC.

Los resultados obtenidos en ensayos anteriores con M. maximus (Hernández –

Valencia y Mager, 2003; Mager y Hernández-Valencia, 2013), confirman la capacidad

fitorremediadora de esta especie. En estos trabajos el porcentaje de reducción fue muy

superior; un 63 %; sin embargo, los ensayos tuvieron una duración de 240 días, se

utilizó un crudo liviano con una mayor proporción de aromáticos y saturados, y el nivel

de contaminación fue del 3 %. Un factor adicional a considerar en los resultados

obtenidos del ensayo del 2013 es que Mager y Hernández-Valencia (2003), trataron el

suelo con cal para disminuir la acidez (aumentar el pH de 4,9 a 6,5) y mejorar el

desarrollo de las plantas; algo que eventualmente pudo favorecer la actividad

microbiana, así como su densidad poblacional, ya que los hongos no son afectados por

la acidez (Brady y Weil, 2008), pero un pH superior favorece a las poblaciones de

bacterias y su actividad. La presencia de bacterias y hongos formando los denominados

“consorcios” aumenta la densidad de poblaciones de hongos y acelera la degradación

del petróleo (Rivera-Cruz y col., 2003). Navas (2012) obtuvo una menor disminución,

bajando de 3,745 % a 3,11 % de aceites y grasas; posiblemente porque no hubo una fase

de bioestimulación, el ensayo tuvo una menor duración y utilizó petróleo extrapesado,

más difícil de degradar. Por otra parte, Infante y col. (2010a), aplicando únicamente

bioestimulación durante 180 días, lograron una disminución del 80 % de la

concentración de aceites y grasas de lodos petrolizados extraídos de fosas en el

occidente de Venezuela; hay que aclarar que los hidrocarburos de estos lodos constaban

de saturados y aromáticos.

Si bien la disminución del contenido de aceites y grasas al final del ensayo, 1,89

% para el tratamiento con M. maximus, no cumplió con el límite establecido por el

47

Decreto 2635, pues excede el 1 %; la cercanía de los valores obtenidos sugiere que en

un período más largo, esta concentración podría ser menor al porcentaje máximo

exigido por la ley. Incluso una mayor frecuencia de aireación en la fase de

bioestimulación, dos o tres veces por semana, y el aporque en los tratamientos TP y SP

hubieran podido reducir más significativamente la concentración de aceites y grasas

(Infante y col., 2010a). Además el encalado de los suelos para disminuir las acidez,

hubiera favorecido a las bacterias y su metabolismo, acelerando la degradación del

crudo (Mager y Hernández-Valencia, 2013).

Fraccionamiento del hidrocarburo:

La evaluación de los cambios al inicio y al final del ensayo de las distintas

fracciones constituyentes del petróleo, permiten conocer cuáles de estas fracciones han

disminuido con mayor intensidad por la acción del tratamiento aplicado. Esta

determinación es extensamente utilizada para evaluar resultados de la degradación de

crudos mediante biorremediación (Infante y col., 2010b), pues se ha determinado que

los hidrocarburos saturados y aromáticos son las fracciones más fácilmente

biodegradables del petróleo, mientras que resinas y asfaltenos son los más recalcitrantes

(Atlas, 1981; Bossert y col., 1984; Atlas y Bartha, 1998).

La Figura 2 presenta la variación de cada una de las fracciones del hidrocarburo

en los diferentes tratamientos evaluados. Al inicio del ensayo se obtuvo una

concentración de 33,20 % de saturados; 15,29 % de aromáticos; 30,07 % de resinas y

21,44 % de asfaltenos. Como puede observarse la proporción de compuestos polares

(resinas y asfaltenos) es ligeramente superior a la suma de saturados y los aromáticos de

menor peso molecular y biodegradables (Infante y col., 2010b).

48

Variacióndel contenido de las fracciones

12,706,60 7,37 8,26

5,85

1,76 1,99 2,11

11,50

10,98 11,16 11,30

8,20

7,54 7,79 7,97

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

0 TP180 SP180 TC180

días

Cont

enid

o de

frac

ción

(mg/

g su

elo)

asfaltenoresinaaromáticosaturado

a a aa

a a aa

b b b

ab b b

a

Figura 2: Variación de las fracciones de saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA) en los diferentes tratamientos evaluados, al inicio (día 0), y fin del ensayo, (180 días). Las letras iguales indican que no hay diferencia dentro de cada fracción en el tiempo.

El tratamiento con TP mostró para los saturados una disminución del 48 %, en

tanto que el tratamiento SP un 42 %, y el control TC un 34,8 %. Para los aromáticos la

pérdida fue de un 70 % para el suelo TP, un 66 % para el suelo SP sin planta, y un 64 %

para el suelo TC. Al realizar el anova de dos vías no se obtuvieron diferencias

significativas entre los tratamientos; pero si se hallaron diferencias significativas para el

tiempo (p = 0,00069), por lo que es el tiempo el factor decisivo en la disminución de

esta fracción para los tres ensayos. Ensayos realizados en campo han obtenido

disminuciones del 60 %, en lodos contaminados con saturados y aromáticos, a los 60

días, aplicando bioestimulación, consistente de aireación (tres veces por semana) y

fertilización (Infante y col., 2010a). Podría entonces ser posible que una porción

importante de esta disminución haya sucedido en la fase de bioestimulación.

49

Los resultados obtenidos parecen indicar que los diferentes tratamientos no

producen cambios significativos en la tasa de degradación de las diferentes fracciones

de hidrocarburos durante el tiempo que se llevó a cabo el ensayo. Es posible que un

período más largo hubiera permitido detectar mejor las diferencias entre los distintos

tratamientos. El ensayo duró 150 días, y en el caso de la fitorremediación se ha

reconocido que se requieren plazos más largos para una descontaminación más efectiva

(Cunningham y col., 1996; Huang y col., 2005) Además al aumentar la biomasa de las

raíces, incrementa el efecto rizosférico, hecho que pudiera favorecer una

descontaminación más efectiva.

Las resinas no mostraron una disminución significativa, ni entre tratamientos ni

entre tiempos. Para los asfáltenos tampoco se hallaron diferencias significativas para

tratamientos o para tiempos.

Ensayos anteriores realizados con crudos pesados por Merkl y col. (2005b),

encontraron que luego de 180 días, las fracciones de resinas y asfaltenos no fueron

degradadas, mientras que los saturados y aromáticos disminuyeron su concentración,

tanto en suelos con plantas como los suelos sin plantas. Para los suelos plantados con B.

brizantha y C. aggregatus, obtuvieron una disminución de 50 y 30 % respectivamente,

para los saturados; mientras los aromáticos mostraron una disminución del 15 %, en

comparación con el control, en los suelos con B. brizantha. La disminución en

aromáticos es mucho menor en comparación con la de este ensayo (70 %), porque

Merkl y col. no realizaron un biotratamiento previo como en nuestro caso.

Para lograr una disminución efectiva de las fracciones polares se requiere una

biorremediación por fases con un período más largo (240 días), que incluya además la

fitorremediación. Se ha logrado una reducción de 90 % de todas las fracciones con el

sistema de fitorremediación multiprocesos (Huang y col., 2005). Este sistema de

50

biorremediación por fases ha logrado degradar las fracciones de resinas y asfaltenos de

manera significativa. No obstante este ensayo requirió de largos períodos (al menos 240

días) para logar tan altos niveles de reducción y sembrar dos veces (a los 100 días se

sembró nuevamente).

Respiración basal:

El monitoreo del proceso de biodegradación de suelos contaminados con petróleo,

puede realizarse a través de la evaluación de diversas actividades biológicas de los

microorganismos que habitan en éste. Entre estas actividades se encuentra la respiración

basal, pues la actividad microbiana dependerá de la cantidad de compuestos carbonados

biodisponibles, y consecuentemente a mayor disponibilidad de sustratos carbonados

para degradar, también será mayor la actividad enzimática de los microorganismos y el

carbono de la biomasa microbiana (Margesin y col., 2000).

La intensidad de la biodegradación es influenciada por varios factores, tales como

el contenido de nutrientes, la disponibilidad de oxígeno, valores de pH, composición,

concentración y biodisponibilidad de los contaminantes (Margesin y Schinner, 2001;

García Izquierdo y col., 2003). Específicamente en este ensayo, el petróleo pesado es un

sustrato de carbono utilizable por los microorganismos como fuente de energía, y la

oxidación de éste genera CO2; así, mientras más hidrocarburos degraden los

microorganismos, mayor será la emisión del gas.

La variación de la respiración edáfica, determinada a través del CO2 emitido por

los microorganismos en cada uno de los tiempos de muestreo, se puede apreciar en la

Figura 3. En general, para todos los tratamientos se obtuvo un pico en la respiración

basal para el día 15 del ensayo y luego decae progresivamente hasta el día 150. Esta

conducta se relaciona con la biodisponibilidad de sustratos carbonados. Al inicio, la

contaminación genera un impacto sobre la comunidad microbiana del suelo, y solo

51

favorece a aquellos grupos que pueden tolerar la contaminación y aprovechar la fuente

de carbono que representa el hidrocarburo. Posteriormente, los microorganismos aptos

para aprovechar esta fuente de carbono, aumentan su actividad y comienzan a crecer.

Cuando los sustratos carbonados biodisponibles comienzan a escasear, la actividad

microbiana disminuye (Margesin y col., 2000).

Los valores más altos de respiración basal se obtuvieron tanto para TP como SP,

durante el proceso de bioestimulación; a los 15 y los 30 días. Esta respuesta es

consistente, si se considera que las mejoras a la mezcla suelo: desecho hechas a estos

tratamientos (cáscara de arroz y fertilizante), permitió a los microorganismos de estas

mezclas contar con mejores condiciones para el aprovechamiento del carbono

disponible y para su actividad en general. La respiración basal mostró diferencias

significativas, con respecto al inicio del ensayo, a los 15 y 30 días (p= 0,00012 y p=

0,003 respectivamente) para TP y SP. Igualmente se encontraron diferencias

significativas de los tratamientos TP y SP con respecto a TC a los 15 y 30 días (p =

0,0001 y p = 0,0002 respectivamente). Los tres tratamientos alcanzaron sus valores más

altos; 58,06; 59,23 y 37,9 mg CO2/kg suelo día para TP, SP y TC respectivamente, a los

15 días.

52

Respiración basal

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

0 30 60 90 120 150 180

días

Res

pira

ción

bas

al (m

g C

O 2 /

kg s

uelo

día

)

TP

SP

TC

aC

bC

cCbC

bBaB aB

aA

bAbA

cB

bB

bA

aB

bA

cA

bA aA

Figura 3: Variación de la respiración edáfica en los diferentes tratamientos evaluados. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias dentro de cada tratamiento para cada tiempo, con respecto al comienzo, y con respecto al día inmediato anterior. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para cada tiempo. La línea vertical indica el inicio del proceso de fitorremediación.

Una vez iniciado el proceso de fitorremediación (día 30) se observa una

diferenciación significativa, para el tratamiento TP, primero con respecto al inicio del

ensayo para los días 60 (p= 0,04), 120 (p= 0,0065) y 180 (p= 0,00002), y segundo con

respecto a la emisión de CO2, entre el tratamiento con Megathyrsus maximus (TP) y el

tratamiento sin la planta (SP) a los 60 (p= 0,013), 90 (p= 0,005) y 180 días (p =

0,0072). La diferencia significativa entre TP y SP a los 60, 90 y 180 días, se debe al

efecto de las plantas. La presencia de exudados en la rizósfera parecen haber estimulado

la actividad microbiana, lo cual se refleja en valores superiores de respiración basal de

TP con respecto a SP y TC (Mager y Hernández-Valencia, 2013). Igualmente cuando se

53

compararon los valores de TP con los de TC, se encontraron diferencias significativas a

los 15 (p= 0,00001), 30 (p= 0,0002), 60 (p= 0,00002), 90 (p= 0,00002), 120 días (p=

0,001) y 180 días (p =0,004).

Otros factores a tomar en cuenta de los valores superiores de TP con respecto a SP

y a TC, es que el tratamiento con M. maximus (TP), cuenta con mejor aireación y mejor

distribución del agua por las raíces, factores que también favorecen una mayor actividad

microbiana (fig. 4) que el tratamiento sin plantas (SP) y el control (TC).

Para los 120 días no se hallaron diferencias significativas entre los tratamientos

TP y SP; manteniendo el tratamiento con Megathyrsus maximus (TP) los valores más

altos en cada muestra.

Al comparar el tratamiento SP con TC a partir de los 30 días, se hallaron

diferencias significativas a los 60 (p= 0,0002), 90 (p= 0, 002) y 120 días (p = 0,008)

debidas a las mejoras del acondicionamiento y fertilización, con respecto al suelo

contaminado de TC. Esto permitió una mejor aireación y disminuyó la hidrofobia del

suelo contaminado, proporcionando una mejor distribución del agua y aire. Además al

ser fertilizado, el suelo con tratamiento SP contó con mayor cantidad de nutrientes, esto

permitió a los microorganismos aumentar su biomasa microbiana, lo cual se reflejó en

la respiración basal (Infante y col., 2010a).

Carbono de la biomasa microbiana:

La biomasa microbiana del suelo comprende aquella porción viviente de la

materia orgánica menor a 5 x 10-3 μm3, excluyendo las raíces y organismos de mayor

tamaño (Jenkinson y Ladd, 1981), y generalmente constituye un 2 % del total de la

materia orgánica del mismo. La biomasa microbiana del suelo actúa como un agente de

transformación de la materia orgánica, siendo a la vez fuente y sumidero del C, N, P y S

contenidos en ésta, y es el centro de la mayoría de la actividad biológica del suelo. Es

54

necesario entonces, para entender apropiadamente la actividad biológica en el suelo,

tener conocimiento de la biomasa microbiana de éste (Jenkinson y Ladd, 1981;

Frankenberger y Dick, 1983). Asimismo, dada la sensibilidad de los microorganismos a

los contaminantes, puede usarse también como un indicador del nivel de contaminación

del suelo (Alef y Nannipieri, 1995).

El método de respiración inducida por sustrato (SIR, substrate induced

respiration), fue escogido como medio para estimar este parámetro debido a las

dificultades de disponer de ácido sulfúrico en las cantidades requeridas por el método de

estimación directa de Vance y col. (1987), que es el más frecuentemente usado.

En la Figura 4 se observa la variación del carbono de la biomasa microbiana

determinada para cada uno de los tres tratamientos. El suelo con el tratamiento TP

mostró un incremento desde el inicio hasta los 60 días, con diferencias significativas

hasta el período mencionado, estabilizándose luego hasta el final del ensayo; no

encontrándose diferencias significativas al compararse los días 90, 120 y 180 con el día

60. El suelo mejorado sin plantas (tratamiento SP), también experimentó un incremento

significativo y constante de la biomasa microbiana hasta el día 30; observándose un

descenso al finalizar la bioestimulación y manteniéndose constante hasta el término del

ensayo. La justificación a esta conducta es similar a la dada para la respiración basal,

con un incremento inicial debido a la mayor disponibilidad de sustratos carbonados y

luego decrece en la medida que la disponibilidad de estos se reduce, especialmente en la

zona de la rizósfera (Mager y Hernández-Valencia, 2013). En el caso del tratamiento

con fitorremediación, este descenso no se observa, posiblemente por la fuente

alternativa de carbono que representan los exudados y otras mejoras (p.e. oxigenación)

que procuran las raíces. Además, otra característica a resaltar en este ensayo es la

utilización de plantas adultas con un sistema radical desarrollado, a diferencia de

55

ensayos en los cuales se sembraron semillas (Merkl y col., 2005a;Merkl y col., 2005b;

Huang y col., 2005; Mager y Hernández-Valencia, 2013). Esta mayor biomasa radical

produjo una mayor cantidad de exudados que llegaron a mayor profundidad, y esto

probablemente haya influido en el mantenimiento de valores superiores de biomasa

microbiana en TP con respecto a los otros tratamientos. Los valores superiores de SP

con respecto a TC pueden explicarse por la presencia de la cáscara de arroz, el cual

podría ser una fuente extra de nutrientes y microorganismos (Infante y col., 2010a),

dado que inclusive los microorganismos degradadores de petróleo no pueden sobrevivir

exclusivamente del contaminante (Huang y col., 2005).

El proceso de bioestimulación también permitió un incremento de la biomasa de

carbono microbiano en el control, aunque el mismo fue mucho menor comparado con

los otros dos tratamientos. Dado que el suelo control no se acondicionó con cáscara de

arroz, ni se fertilizó con P y N, es muy probable que estas condiciones menos

favorables influyeron en menor aprovechamiento del carbono proveniente del petróleo y

la biomasa microbiana fue menor (Infante y col., 2012).

56

Carbono de biomasa microbiana

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 50 100 150 200

días

Car

bono

mic

robi

ano

(mg

de C

/ K

g de

sue

lo)

TP

SP

TC

aA

bB

bA

bA

bB

cA cA cA

cA

cB cB cBcB

bC bC bC bC

Figura 4: Variación del carbono de la biomasa microbiana en los diferentes tratamientos evaluados. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias dentro de cada tratamiento para cada tiempo. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para cada tiempo. La línea vertical indica el inicio de la fitorremediación.

Navas (2012), obtuvo resultados similares con M. maximus, lo cual sugiere que al

inicio de la contaminación sólo aquellos microorganismos capaces de tolerar el

hidrocarburo y alimentarse de las fracciones del crudo, sobreviven y se multiplican.

Posteriormente, gracias a las mejoras por la cáscara de arroz y macronutrientes (N, P y

K) se observa una recuperación más rápida de la población, y una disminución de la

contaminación después de la bioestimulación. La presencia de las plantas aumentó este

efecto al permitir mayor aireación y penetración del agua, a través de las raíces, y por la

presencia de los exudados. Esto tuvo un efecto de mejoramiento al compararlo con el

suelo mejorado sin plantas y con el control. Esta mayor cantidad de biomasa microbiana

57

explica los valores superiores de respiración basal obtenidos en TP, con respecto a SP y

TC.

El Anova de dos factores mostró diferencias significativas entre los tres

tratamientos (p = 0,00081), y entre los 30, y los 60, 90, 120 y 180 días para el

tratamiento TP (p = 0,003; p = 0,0065; p = 0,005; p = 0,0063). También se hallaron

diferencias significativas entre el inicio y los 15 y 30 días por la bioestimulación (p =

0,02 y p = 0,04), siendo estas iguales para TP y el suelo con tratamiento SP. Para el

control las diferencias significativas se hallaron entre el inicio y los 15, y 30 días (p =

0,0073 y p = 0,006), debidas a la bioestimulación. No se detectaron diferencias entre los

días a partir del día 30.

Al valorar ambos factores a la vez se hallaron diferencias significativas entre los

60, 90, 120 y 180 días (p = 0,006; p = 0,007; p = 0,028 y p = 0,002) para los tratamiento

TP y SP. Tanto el tratamiento TP como el SP, mostraron diferencias significativas con

respecto al control (TC) a partir del día 15 hasta el fin del ensayo (p = 0,006 y p =

0,0007 respectivamente)

Coeficiente metabólico:

El coeficiente metabólico (qCO2) es la tasa de respiración de los

microorganismos por unidad de biomasa de C microbiano, e indica la eficiencia con la

cual estos asimilan el carbono orgánico y lo mineralizan (Anderson y Domsch, 1993;

Insam y col., 1996). Un cambio en éste parámetro puede indicar: (1) cambios en los

sustratos que una comunidad microbiana no alterada usa, (2) cambios en la composición

de la comunidad, (3) cambios en los dos puntos mencionados anteriormente y (4) no

hay cambios en los sustratos o la comunidad, pero si en el status fisiológico de la

comunidad debido a una alteración en los requerimientos de ésta para su mantenimiento

(Insam y col., 1996).

58

Al inicio del ensayo el valor obtenido para los tratamientos TP y SP, fue en

promedio 764,22 mg de CO2/ g CBM día, y de 160,39 mg de CO2/ g CBM día para el

control (Fig. 5). El coeficiente metabólico del tratamiento TP al inicio fue

significativamente diferente con respecto a los 15 y 30 días (p = 0,003 y p = 0,007)

durante la bioestimulación; luego con M. maximus a los 60, 90, 120 y 180 días (p =

0,006; p = 0,005; p = 0,005 y p = 0,004 respectivamente) mostrando un descenso en sus

valores hasta el día 120; se encontraron diferencias significativas entre 15 y 30 (p =

0,02), 30 y 60 (p = 0,007), y 90 (p = 0,04) respectivamente. No se hallaron diferencias

significativas entre los 90, 120 y 180 días para el mismo tratamiento.

Coeficiente metabólico (qCO2)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 50 100 150 200

días

qCO

2 (m

g CO

2 / g

de

C m

icro

bian

o dí

a)

TPSPTC

aA

aB

bA

cA

bA

dA

dB

eA

cB

eAeA

cB

Figura 5: Variación del coeficiente metabólico en los diferentes tratamientos evaluados. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias entre los días para cada tratamiento. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para cada tiempo. La línea vertical indica el inicio del proceso de fitorremediación.

Para SP los resultados fueron muy similares a los de TP en cuanto a diferencias

entre tiempos, siendo significativamente diferentes al inicio, todos los días restantes del

59

ensayo (p15 = 0,002; p30 = 0,004; p60 = 0,0063; p90 = 0,0055; p120 = 0,036; p180 =

0,007). Al comparar 15 y 30 (p = 0,02), 30 y 60 (p = 0,0053), 60 y 90 (p = 0,006), se

encontraron diferencias significativas; estos resultados contrastan con los obtenidos

entre 90, 120 y 180, que no presentan diferencias significativas entre ellos.

Los valores de qCO2 de TC mostraron un aumento desde el inicio a los 15 días

(Fig. 5) (p = 0,008) y fueron significativamente diferentes a los15 (p = 0,008), 30 (p =

0,03), 60 (p = 0,005) y 90 días (p = 0,009). Los valores entre 60 y 90 días también

fueron significativamente diferentes (p = 0,004); mientras que los valores de 90, 120 y

180 (p = 0,3; p = 0,2; p = 0,5) no fueron significativamente distintos entre sí.

Entre tratamientos, los resultados no fueron significativamente diferentes para TP

y SP. Una posible explicación a este hecho es que si bien el tratamiento con M.

maximus tenía una respiración basal superior al suelo mejorado sin plantas, éste también

poseía una mayor biomasa microbiana; resultando esto en una relación o proporción

muy similar a la del tratamiento SP (Mager y Hernández-Valencia, 2013). Los valores

del control (TC), fueron estadísticamente diferentes con respecto a los otros dos

tratamientos al inicio (p = 0,007), 60 (p = 0,004), 90 (p = 0,003), 120 (p = 0,008) y 180

días (p = 0,002); siendo a partir del día 60 superiores a TP y SP. Este mayor qCO2

podría interpretarse como un ambiente mas hostil para los microorganismos con

respecto al los tratamientos TP y SP, de coeficientes metabólicos menores (Anderson y

Domsch, 1993; Anderson y Domsch, 2010). Así, los valores superiores de qCO2 del TC

con respecto a TP y SP, reflejan primero una mayor demanda de carbono para mantener

el metabolismo de una menor biomasa microbiana, y segundo una menor eficiencia

energética. Esto también indica que una mayor proporción del carbono se desvía para el

mantenimiento metabólico en TC y no para sintetizar nueva biomasa microbiana, lo

contrario de lo que sucede con TP y SP. Dado que este carbono, representado por

60

saturados y aromáticos, ha disminuido y el suelo no puede reponer el carbono perdido a

través de la respiración, pues no hay exudados o cáscara de arroz como fuente

alternativa de carbono (Infante y col., 2010a; Mager y Hernández-Valencia, 2013), la

biomasa microbiana descenderá (Anderson y Domsch, 1993; Anderson, 2003; Anderson

y Domsch, 2010).

Actividad de la enzima deshidrogenasa:

Las propiedades biológicas y bioquímicas del suelo son altamente sensibles a las

perturbaciones ambientales, pudiendo ser usadas para determinar la calidad del mismo.

Así, la inclusión de variables biológicas y bioquímicas reflejan los procesos que afectan

la calidad del suelo (Trasar-Cepeda y col., 1997). Entre las variables bioquímicas a

medir, la cuantificación de las actividades enzimáticas es un indicador de la actividad y

del crecimiento microbiano en los suelos (Frankenberger y Dick, 1983).

La enzima deshidrogenasa es frecuentemente usada en la estimación de los

procesos oxidativos de sustancias orgánicas bajo condiciones aeróbicas. Esta oxidación

de sustancias orgánicas, esta ligada a una cadena de transferencia de electrones ubicada

en la membrana celular de los microorganismos, con el oxígeno como aceptor final de

esos electrones (Alef y Nannipieri, 1995). Esta actividad enzimática ocurre en el interior

de la célula, por lo cual su determinación es una medida directa de la actividad

microbiana (García y Hernández, 1997).

En la Figura 6 se pueden observar los cambios en la actividad de la enzima

deshidrogenasa obtenidos en los tres tratamientos. El análisis de varianza de dos

factores, mostró que durante el proceso de bioestimulación se observaron incrementos

en la actividad enzimática desde el inicio hasta los 30 días, posteriormente cuando se

colocó el suelo en envases, la actividad disminuyó hasta los 180 días, para todos los

tratamientos. El descenso observado en la actividad de la enzima para todos los

61

tratamientos, puede explicarse por la disminución de las fuentes de carbono

degradables; las fracciones de saturados y aromáticos, a medida que estas son

consumidas por los microorganismos y las fracciones restantes más complejas no

pudieron ser utilizadas por su condición recalcitrante (Margesin y Schinner, 1997;

Merkl y col., 2005b). Los valores más altos, tanto para los suelos TP como para SP, se

obtuvieron durante el proceso de bioestimulación. Recordando que durante la

bioestimulación TP no tenía plantas de M. maximus, ello puede explicar porque los

valores de TP y SP son muy similares los primeros 30 días debido a que ambos

tratamientos consistían de petróleo, cáscara de arroz y fertilizante.

Durante el proceso de bioestimulación se obtuvieron diferencias significativas de

TP con respecto al inicio en los días 15 (p= 0,001) y 30 (p= 0,0006), igualmente SP

mostró diferencias significativas entre el inicio y los 15 y 30 días. Además también se

observaron diferencias significativas de ambos tratamientos con respecto al ensayo TC,

desde el inicio (p= 0,0005); así como para los días 15 (p= 0, 001) y 30 (p= 0,0001).

A los 60 días el efecto de la planta puede notarse en las diferencias significativas

obtenidas de el ensayo TP con respecto a SP (p= 0, 0009) y TC (p= 0,0005). Esta

mayor actividad de la enzima en el tratamiento TP puede explicarse por una mejor

aireación y penetración más profunda del agua en el suelo por las raíces, y por presencia

de exudados; factores que estimulan el metabolismo microbiano (Cunningham y col.,

1996; Merkl y col., 2005a).

62

Actividad de la deshidrogenasa (ADH)

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

0 30 60 90 120 150 180

días

ADH

( μgT

PF /

g su

elo

día)

TPSPTC

aAbB

cB

dC

eCfC fC

aA

bA

cA

dA

eAeA

fA

dB

eBeA

fA

Figura 6: Variación de la actividad de la enzima deshidrogenasa en los diferentes tratamientos evaluados. Letras minúsculas iguales indican que no hay diferencias dentro de cada tratamiento para cada tratamiento con respecto al inicio del ensayo y al día anterior inmediato. Letras mayúsculas iguales indican que no hay diferencias entre tratamientos para cada día. La línea vertical indica el inicio del proceso de fitorremediación.

Para los días 90 y 120 no se encontraron diferencias significativas entre TP y SP,

pero si entre TP y TC (p= 0,003 y p= 0,0009 respectivamente), y entre SP y TC (p=

0,004 y 0,002). Al término del ensayo (180 días) no se obtuvieron diferencias

significativas entre ninguno de los tres tratamientos.

Relaciones entre las variables de actividad microbiológica evaluadas.

Al realizar un análisis de correlación entre la biomasa microbiana, la respiración

basal y la actividad de la enzima deshidrogenasa, se obtuvo una relación lineal

significativa entre C microbiano y respiración basal solamente para el tratamiento

control (TC) (Cuadro 4). La ausencia de relaciones lineales en la mayoría de los casos

63

parece estar asociado a la alta variabilidad de las estimaciones microbiológicas, tal

como lo han reportado Mager y Hernández-Valencia (2013).

Cuadro 4. Correlación entre las variables microbiológicas estimadas para el tratamiento TC. Los valores de correlación están dados en el triángulo inferior de la matriz. Las probabilidades de dos colas de que las columnas no están correlacionadas están dadas en el triángulo superior.

Variable Respiración

basal

Actividad

deshidrogenasa

C biomasa

microbiana

Respiración basal 1 0,11725 0,0011661

Actividad deshidrogenasa 0,64567 1 0,28963

C biomasa microbiana 0,94773 0,46795 1

De la misma forma, al realizar un análisis de correlación se encontró una relación

lineal entre la actividad de la enzima deshidrogenasa y la respiración basal para el

tratamiento TP y el tratamiento SP (Cuadros 5 y 6); pudiendo explicarse esta relación

porque la conducta de ambos indicadores es muy similar, con una mayor actividad al

inicio cuando hay sustratos carbonados biodegradables y posteriormente decaen en la

medida que estos van disminuyendo su disponibilidad. Para que los microorganismos

asimilen el carbono y luego él esté disponible, la enzima deshidrogenasa debe haber

desprovisto a las cadenas carbonadas de los átomos de hidrógeno, rompiendo el enlace

simple que los une. Es decir a mayor emisión de CO2, mayor necesidad de átomos de

carbono desprovistos de hidrógenos y en consecuencia mayor actividad de la enzima.

Esta correlación lineal entre la actividad de la deshidrogenasa y la respiración basal

concuerdan con los resultados de la literatura consultada (Casida y Santoro, 1963;

Casida, 1977), en la cual un aumento en la actividad de esta enzima reflejaba un

64

aumento en la respiración asociada con la actividad metabólica y no necesariamente con

el número de microorganismos.

Cuadro 5. Correlación entre las variables microbiológicas estimadas para el suelo con Megathyrsus maximus. Los valores de correlación están dados en el triángulo inferior de la matriz. Las probabilidades de dos colas de que las columnas no están correlacionadas están dadas en el triángulo superior.

Variable Respiración

basal

Actividad

deshidrogenasa

C biomasa

microbiana

Respiración basal 1 0,0020215 0,72398

Actividad deshidrogenasa 0,93468 1 0,89371

C biomasa microbiana - 0,16482 - 0,062736 1

Cuadro 6. Correlación entre las variables microbiológicas estimadas para el suelo con mejoras sin plantas. Los valores de correlación están dados en el triángulo inferior de la matriz. Las probabilidades de dos colas de que las columnas no están correlacionadas están dadas en el triángulo superior.

Variable Respiración

basal

Actividad

deshidrogenasa

C biomasa

microbiana

Respiración basal 1 0,00034141 0,71896

Actividad deshidrogenasa 0,96816 1 0,54763

C biomasa microbiana 0,1679 0,27697 1

65

CONSIDERACIONES FINALES

En vista de que Venezuela posee la mayoría de sus reservas en crudos pesados y

extrapesados, las investigaciones sobre biorremediación de suelos contaminados con

este tipo de crudos adquieren gran relevancia. Como parte de estos estudios, la selección

de especies con potencial fitorremediador es esencial no solo por la capacidad de estas

para descontaminar los suelos, sino también para protegerlos de la erosión y mejorar su

actividad microbiológica, aspecto esencial que incide en otras funciones del suelo, como

son la producción de materia orgánica y la degradación de contaminantes.

La especie Megathyrsus maximus ha demostrado en ensayos anteriores tener

capacidad fitorremediadora, tanto en suelos contaminados con hidrocarburos livianos y

extrapesados (Hernández-Valencia y Mager, 2003; Navas, 2012); no obstante, en este

estudio las plantas no toleraron la concentración de 5% (p/p) de crudo pesado y se hizo

necesario un proceso de bioestimulación previo, para disminuir la concentración de

petróleo y evitar la muerte de los ejemplares trasplantados.

Una vez establecida la planta, la disminución en el contenido de aceites y grasas

fue significativa respecto a los tratamientos sin planta y con adecuación del suelo (SP) y

el control sin planta y sin adecuación del suelo (TC), aunque en el tiempo en la cual

transcurrió el ensayo, no se pudo alcanzar el límite de limpieza establecido en la

legislación venezolana (Decreto 2635). Ello confirma lo encontrado en estudios previos,

sobre el hecho que la fitorremediación es un proceso de limpieza de suelos

contaminados con petróleo mucho más lento que la biorremediación (Cunningham

1996).

El efecto de la planta sobre la actividad microbiana del suelo se hizo patente al

evaluar la actividad de estos con indicadores tales como la respiración basal, el carbono

de la biomasa microbiana y actividad de la enzima deshidrogenasa. Si bien los valores

66

más altos de estos parámetros se obtuvieron durante la fase inicial de bioestimulación

para todos los tratamientos, en la fase de post bioestimulación, el tratamiento con

plantas mostró la mayor actividad microbiológica, hecho que se correlaciona con la

mayor disminución del contenido de aceites y grasas en el suelo (Navas, 2012; Mager y

Hernández-Valencia, 2013). Evidentemente, estos son indicios de la importancia de los

procesos microbiológicos en la degradación de los hidrocarburos del petróleo y

especialmente del papel de la rizósfera para estimular esta actividad.

A la luz de los resultados obtenidos en este estudio, varias recomendaciones o

ensayos pueden diseñarse para mejorar el protocolo aquí probado. La cercanía

alcanzada en cuanto a la disminución del contenido de aceites y grasas, sugiere en

primera instancia que es necesario la prolongación del período de estudio de los

ensayos, de manera que permita al tratamiento de fitorremediación una concentración de

aceites y grasas inferior al 1 % establecido por la ley. Adicionalmente, se pueden

realizar aporques en los alrededores de las plantas y adicionar cal para disminuir la

acidez del suelo, factores que incentivarían la actividad microbiana y la volatilización

de componentes de compuestos carbonados lábiles. Por último, se recomienda la

realización de ensayos de toxicidad en los suelos biotratados, pues existe la posibilidad

que aunque se cumpla la meta de limpieza, el suelo tratado sea tóxico para plantas y

animales (Infante y Morales García, 2012).

67

CONCLUSIONES

• La especie Megathyrsus maximus no toleró concentraciones de 5 % (p/p) de

crudo pesado, en suelos de sabanas acondicionados con cáscara de arroz y con

adición de N.P.K y urea. Es necesario biotratar previamente la mezcla

suelo:desecho y disminuir la concentración de aceites y grasas a 2,87 % para

poder incorporar la planta. Una vez incorporada la planta, el tratamiento con

Megathyrsus maximus es más eficiente en la remoción de aceites y grasas con un

46 % de reducción en 150 días, seguido de un 37 % para el tratamiento SP y

28% para el tratamiento TC.

• Los análisis de fracciones mostraron que tanto el contenido de saturados y

aromáticos disminuyeron al término del ensayo, pero no se encontraron

diferencias entre tratamientos. Los porcentajes de reducción en el contenido de

saturados fueron de 48, 42, y 34,8 % para TP, SP y TC respectivamente. Para

los aromáticos la pérdida fue de un 70 % para TP, un 66 % para SP, y un 64 %

para TC. La disminución en la concentración de resinas y asfaltenos en 150 días

no fue significativa.

• La respiración basal, el carbono de la biomasa microbiana y la actividad de la

enzima deshidrogenasa fue mayor siempre en el tratamiento TP, seguido de SP y

TC. Esta mayor actividad microbiana en TP se asocia también con la mayor

disminución del contenido de aceites y grasas. En general, la respiración basal,

la biomasa de carbono microbiano y la actividad de la enzima deshidrogenasa

mostraron un incremento en la fase inicial del biotratamiento, el cual se asocia a

la mayor disponibilidad de sustratos carbonados. Posteriormente decae hasta el

término del ensayo por la reducción en la disponibilidad de los mismos. Pese a

eso, solo se encontró una correlación significativa entre la respiración basal y el

68

carbono microbiano para el tratamiento control y entre la actividad de la enzima

deshidrogenasa y la respiración basal para el tratamiento TP y el tratamiento SP.

69

BIBLIOGRAFÍA

- Alef, K. y Nannipieri, P. 1995. Methods in applied soil microbiology and

biochemistry. Academic Press. Harcourt Brace & Company, Publishers.

Londres, Inglaterra.

- Anderson, J. P. E. y Domsch, K.H. 1978. A physiological method for the

quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil. Biol. Biochem. 10:

215 – 221.

- Anderson, T. H. y Domsch, K. H. 1993. The metabolic quotient for CO2 (q

CO2) as a specific activity parameter to asses the effects of environmental

conditions, such as pH, on the microbial biomass of forest soils. Soil. Biol.

Biochem. 25 (3): 393 – 395.

- Anderson, T. H. 2003. Microbial eco-physiological indicators to asses soil

quality. Agr. Ecosyst. Environ. 98: 285 – 293.

- Anderson, T. H. y Domsch, K. H. 2010. Soil microbial biomass: The eco-

physiological approach. Soil. Biol. Biochem. 42: 2039 – 2043.

- Atlas, R. 1981. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an

environmental perspective. Microbiol. Rev. 45 (1): 180 – 209.

- Atlas, R. y Bartha, R. 1998. Microbial ecology: Fundamentals and applications.

Benjamin Cummings Publishers Company. San Francisco, Estados Unidos. Pp

393 – 399.

- Bossert, I., Kachel, W. M. y Bartha, R. 1984. Fate of hydrocarbons during oily

sludge disposal in soil. Appl. Environ. Microb. 47 (4): 763 - 767.

- Brady, N. y Weil, R. 2008. The nature and properties of soils. Pearson Prentice

Hall. Décimo-cuarta Edición. Upper Saddle River, Nueva Jersey.

70

- Brandt, R., Merkl, N., Schultze-Kraft, R, Infante, C. y Broll, G. 2006. Potential

of Vetiver (Vetiveria zizanoides (L.) Nash) for phytoremediation of petroleum

hydrocarbon-contaminated soils in Venezuela. Int. J. Phytoremediat. 8: 273 –

284.

- Burken, I. G. y Schnoor, J. L. 1996. Phytoremediation: plant uptake of atrazine

and role of root exudates. J. Environ. Eng. 122: 958 – 963.

- Casanova, E. O. 2005. Introducción a la ciencia del suelo. Consejo de Desarrollo

Científico y Humanístico. Universidad Central de Venezuela.

- Casida, L. E. Jr., Klein, D. A. y Santoro, T. 1964. Soil dehydrogenase activity.

Soil Sci. 98: 371 – 376.

- Casida, L. E. Jr. 1977. Microbial metabolic activity in soil measured by

dehydrogenase determinations. Appl. Environ. Microb. 34 (6): 630 – 636.

- Cauwenberghe, L. y Roote, D.S. 1998. In situ bioremediation. Technology

overview report. TO-98-01.

- Chaîneau, C. H., Morel, J.L. y Oudot, J. 2000. Bioremediation and

biodegradation: biodegradation of fuel oil hydrocarbons in the rhizosphere of

maize. J. Environ. Qual. 29: 568 – 578.

- Cook, B., Pengelly, B., Brown, S., Donelly, J., eagles, D., Franco, A., Hanson, J.

y colaboradores. 2005. Tropical forages. An Interactive selection tool. [en

línea].http://www.tropicalforages.info/key/Forages/Media/Html/Panicum_maxi

mum.htm [Consulta: 23 septiembre 2013].

- Cunningham, S., Anderson, T., Schwab, P. y Hsu, F. 1996. Phytoremediation of

soils contaminated with organic pollutants. Adv. Agron. 56: 55 – 114.

- Daniel, W. 2005. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud.

Limusa Wiley. Cuarta Edición. México.

71

- Deuel, L.E. y Holliday, G.H. 1994. Soil remediation for the petroleum

extraction industry. Penn Well Books. Segunda Edición. Tulsa, OK.

- Frankenberger, W.T. y Dick, W.A. 1983. Relationships between enzyme

activities and microbial growth and activity indices in soil. Soil Sci. Soc. Am. J.

47(5): 945 – 951.

- Frick, C.M., Farrell, R.E. y Germida, J.J. 1999. Assessment of phytoremediation

as an in situ technique for cleaning oil-contaminated sites. Petroleum

Technology Alliance Canada. Calgary. Canadá.

- García, C. y Hernández, T. 1997. Biological and biochemical inidicators in

derelict soils subject to erosion. Soil Bio. Biochem. 29(2): 171 – 177.

- García Izquierdo, C., Gil Sotres, F., Hernández Fernández, T., y Trasar Cepeda,

C. (eds.). 2003. Técnicas de análisis de parámetros bioquímicos en suelos:

medida de actividades enzimáticas y biomasa microbiana. Ediciones Mundi-

Prensa. Madrid, España.

- Gaskin, S. y Bentham, R. 2010. Rhizoremediation of hydrocarbon contaminated

soil using Australian native grasses. Sci. Total Environ. 408: 3683 – 3688.

- Hedge, R.S. y Fletcher, J. S. 1996. Influence of plant root stage and season on

the release of root phenolics by mulberry as related to development of

phytoremediation technology. Chemosphere 32: 2471 – 2479.

- Hernández-Valencia, I. y López-Hernández, D. 2002. Pérdida de nutrimentos

por la quema de la vegetación de una sabana de Trachypogon. Rev. Biol. Trop.

50 (3/4) 1013 – 1019.

- Hernández-Valencia, I. y Mager, D. 2003. Uso de Panicum maximum y

Brachiaria brizantha para fitoremediar suelos contaminados con un crudo de

petróleo liviano. Bioagro. 15(3): 149 – 153.

72

- Horvath, R.S. 1972. Microbial co-metabolism and the degradation of organic

compounds in nature. Bacteriol. Rev. 36: 146 – 155.

- Huang, X., El-Alawi, Y., Gurska, J., Glick, B. y Greenberg, B.M. 2005. A multi-

process phytoremediation system for decontamination of persistent total

petroleum hydrocarbons (TPHs) from soils. Microchem. J. 81: 139 – 147.

- Hutchinson, S. L., Banks, M. K. y Schwab, A. P. 2001a. Bioremediation and

Biodegradation. Phytoremediation of aged sludge: effect of inorganic fertilizer.

J. Environ. Qual. 30: 395 – 403.

- Hutchinson, S. L., Banks, M. K. y Schwab, A. P. 2001b. Bioremediation and

Biodegradation. Phytoremediation of aged sludge: effect of irrigation techniques

and scheduling. J. Environ. Qual. 30: 1516 – 1522.

- Infante, C., Morales, F., Ehrmann, E.U., Hernández-Valencia, I. y Leon, N.

2010a. Hydrocarbon bioremediation and phytoremediation in tropical soils:

Venezuelan study case. Trends in Bioremediation and Phytoremediation.

Grazyna Plaza. Primera Edición. Kerala, India.

- Infante, C., Ortega, C., Morales, F., Ehrmann, U., Hernández-Valencia, I. y

Pérez, R. 2010b. Efecto del potasio en la biorremediación de un suelo

contaminado con crudo liviano. Bioagro. 22(2): 145 – 152.

- Infante, C., Morales, Hernández-Valencia, I., López, L. y Toro, M. 2012a.

Phytoremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soils in Venezuela.

Pp. 99 – 109 en: Anjum, N. A., Pereira, M. E., Ahmad, I., Duarte, A. C., Umar,

S. y Khan, N. A. (eds.), Phytotechnologies: Rmediation of environmental

contaminants. CRC Press. Taylor & Francis Group. Primera Edición. Boca

Ratón, Florida, E.U.A.

73

- Infante, C. y Morales García, F.A. 2012b. Evaluación de la toxicidad en

desechos y suelos petrolizados empleando semillas de Lactuca sativa L.

Interciencia. 37(10): 782 – 788.

- Insam, H., Hutchinson, T.C. y Reber, H.H. 1996. Effects of heavy metal stress

on the metabolic quotient of the soil microflora. Soil Bio. Biochem. 28 (4 – 5):

691 – 694.

- Jenkinson, D. S. y Ladd, J. N. 1981. Microbial biomass in soil: measurement

and turnover. pp. 415 – 471 En E.A. Paul y J.N. Ladd (eds). Soil Biochemistry,

Voume 5. Marcel Dekker, New York.

- Leahy, J.G., Colwell, R.R. 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the

environment. Microbiol. Rev. 54: 305 – 315.

- Mager, D. y Hernández-Valencia, I. 2013. Actividad microbiana durante la

biorremediación de un suelo contaminado con un crudo liviano. Rev. Fac.

Agron. (LUZ). 30: 53 – 72.

- Malik, A. 2006. Bioremediation. Environmental. Microbiology. [en línea]

http://hdl.handle.net/123456789/659 [ Consulta: 29 de abril 2013].

- Margesin, R. y Schinner, F. 1997.Efficiency of indigenous and inoculated of

cold-adapted soil microorganisms for biodegradation of diesel oil in alpine soils.

Appl. Environ. Microbiol. 63(7): 2660 - 2664.

- Margesin, R. y Schinner, F. 2001. Biodegradation and Bioremediation of

hydrocarbons in extreme environments. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 650 –

663.

- Mc Gill, W.B. y Rowell, M.J. 1980. Determination of oil content of oil

contaminated soil. Sci. Total Environ. 14(3): 245 – 253.

74

- Meagher, R. 2000. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants.

Plant Biol. 3: 153 – 162.

- Merkl, N., Schultze-Kraft, R. y Infante, C. 2004. Phytoremediation in the

tropics- The effect of crude oil on the growth of tropical plants. Bioremediation

Journal. 8 (3 – 4): 177 – 184.

- Merkl, N., Schultze-Kraft, R. y Infante, C. 2005a. Phytoremediation in the

tropics – influence on root morphological characteristics of graminoids. Environ.

Pollut. 138: 86 -91.

- Merkl, N., Schultze-Kraft, R. y Infante, C. 2005b. Assesment of tropical grasses

and legumes for phytoremediation of petroleum-contaminated soils. Water Air

Soil Poll. 165: 195 – 209.

- Merkl, N. y Schultze-Kraft, R. 2006a. Influence of the tropical grass Brachiaria

brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf on bacterial community structure in

petroleum contaminated soils. Intl. J. Soil Sci. 1 (2): 108 – 117.

- Merkl, N., Schultze-Kraft, R. y Arias, M. 2006b. Effect of the tropical grass

Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf on microbial population and

activity in petroleum-contaminated soil. Microbiol. Res. 161: 80 – 91.

- Navas, G. 2012. Evaluación de la capacidad fitorremediadora de Panicum

maximum en un suelo de sabana contaminado con un hidrocarburo de petróleo

extrapesado. Tesis de Licenciatura. Universidad Central de Venezuela. Caracas,

Venezuela.

- Rivera-Cruz, M., Ferrera-Cerrato, R., Sánchez-García, P., Volke-Haller, V.,

Fernández-Linares, L. y Rodríguez-Vázquez, R. 2004. Descontaminación de

suelos con petróleo crudo mediante microorganismos autóctonos y pasto alemán

[Echinochloa polystachya (H.B.K.) Hitchc.]. Agrociencia. 38: 1 – 12.

75

- Sokal, R. y Rohlf, J. 1995. Biometry. The principles and practice of statistics in

biological research. W. H. Freeman and Company. Tercera Edición. Nueva

York, E.U.A.

- Stapleton, R. D., Savage, D. C., Sayler, G. S. y Stacey, G. 1998. Biodegradation

of aromatic hydrocarbons in a extremely acidic environment. Appl. Environ.

Microbiol. 64: (11). 4180 – 4184.

- Susarla, S., Medina, V. F. y McCutcheon, S.C. 2002. Phytoremediation: an

ecological solution to organic chemical contamination. Ecol. Eng. 18: 647 – 658.

- Trasar-Cepeda, C., Leirós, C., Gil-Sotres, F. y Seoane, S. 1997. Towards a

biochemical quality index for soils: an expression relating several biological and

biochemical properties. Biol. Fert. Soils. 26(2):100 – 106.

- Usberti, J. A y Jain, S. 1979. Ecotypic differentiation in guineagrass (Panicum

maximum Jacq.). Agro-Ecosystems. 5: 147 – 158.

- Vivaldi, M. 2001. Bioremediation. An overview. Pure Appl. Chem. 73(7): 1163

– 1172.

- Wenzel, W. 2009. Rhizosphere processes and Management in plant-assisted

bioremediation (phytoremediation) of soils. Plant Soil. 321: 385 – 408.

- White, P. M., Wolf, D. C., Thoma, G. J. y Reynolds, C. M. 2006.

Phytoremediation of alkylated polycyclic aromatic hydrocarbons in a crude oil-

contaminated soil. Water Air Soil Poll. 169: 207 – 220.