Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ …ph 10.5’da gösterirken, 0.5-3.4m...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

Ashabil AYGAN

HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ, SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2008



HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ, SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE

BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ

Ashabil AYGAN

DOKTORA TEZİ


Bu tez 04/01/2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir.

İmza ………………… Prof. Dr. Burhan ARIKAN DANIŞMAN

İmza …………………. Prof. Dr. Ömer ÇOLAK ÜYE

İmza ………………………. Doç.Dr.Gökhan CORAL ÜYE

İmza .............................. Doç.Dr. Hatice Kormaz Güvenmez ÜYE

İmza ………………… Doç.Dr.Mutlu Nisa Ünaldı Coral ÜYE

Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza-Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE 2003-D-18 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

I

ÖZ

DOKTORA TEZİ

HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ,

KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ

Ashabil AYGAN




Danışman: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl: 2008, Sayfa:186

Jüri:Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ

Doç.Dr. Gökhan CORAL Doç.Dr. Mutlu Nisa ÜNALDI CORAL

Bu çalışmada, Van Gölü topraklarından izole edilen haloalkaloflik Bacillus sp. suşlarından amilaz, selülaz ve ksilanaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin besiyerlerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri ve aktivite gösterdiği optimum sıcaklık, pH ve NaCl konsantrasyonu saptanmıştır.

Bacillus sp. AB-17 suşundan üretilen amilazın SDS-PAGE analizinde iki band elde edilmiş ve moleküler ağırlıkları 66.25 ve 58 kDa olarak belirlenmiştir. Enzim, optimum aktivitesini 150ºC ve pH 10.5’da gösterirken, 0.5-3.4M NaCl’de ortalama %67’lik aktivite ile halofil özellikte olduğu saptanmıştır.

Bacillus sp.C-14 suşundan izole edilen endoglukanaz enzimin molekül ağırlığı 61 kDa olarak belirlenmiş, optimum aktivite ise 50°C’de pH 11.0’de görülmüştür. Maksimum enzim aktivitesi %20 (3.4M) NaCl konsantrasyonunda (%133) elde edilmiştir.

Bacillus sp X13 suşundan elde edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesi 40ºC de pH 6.0’da gerçekleşmiştir. Enzim pH 5.0-6.0 aralığında 15 dk süreyle aktivitesini %100 koruyabilmiş, SDS-PAGE analizinde ise moleküler ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört band tespit edilmiştir.

Bu sonuçlara göre AB-17 amilaz enziminin Nişastanın sıvılaştırılması ve tekstil endüstrisinde nişastanın uzaklaştırılmasında kullanılabilecek bir enzim olduğu belirlenmiştir. C14 endoglukanaz enziminin tuzlu ortamlarda yüksek düzeyde aktivite göstermesi, halo-stabilitesinin yüksek olması ve deterjanlara dirençli olması bu enzimin tekstil uygulamaları, kağıt endüstrisi ve hayvan yemi üretimi gibi uygulamalarda kullanılabileceğini göstermektedir. X13 Ksilanaz enzimi ise besin endüstrisinde prebiyotik üretiminde ve selülaz ve pektinaz enzimine gerek kalmadan meyve suyu üretiminde kullanılabileceği önerilebilir. Anahtar Kelimeler: Bacillus, amilaz, selülaz, ksilanaz,, haloalkalofil

II

ABSTRACT

Ph.D. THESIS

ISOLATION OF HALOALKALOPILIC BACILLUS SP., PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND DETERMINATION OF

BIOTECHNOLOGICAL APPLICATION OF THEIR AMYLASE, CELLULASE AND XYLANASE

Ashabil AYGAN

DEPARTMENT OF BIOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF CUKUROVA

Supervisor:Prof. Dr. Burhan ARIKAN Year: 2008, Page: 186

Jury: Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ

Doç.Dr. Gökhan CORAL Doç.Dr. Mutlu Nisa ÜNALDI CORAL

In this study, the amylase, cellulase, xylanase enzymes from Bacillus sp. strains isolated from

Van lake soil were produced and characterized. The strains were tested for determination of temperature, pH range and NaCl concentration for growth and enzyme production on plate. Molecular weight of the amylase from Bacillus sp.AB-17 was estimated as 66.25 and 58 kDa on SDS-PAGE. The optimum activity was obtained at 150oC, pH 10.5. the enzyme also presented halophilic properties with an activity around 67% between 0.5-3.4M NaCl concentration.

Molecular weight of the Endoglucanase from Bacillus sp.C14 was detected as 61kDa on SDS-PAGE, and the optimum enzyme activity was obtained at 50oC, pH 11.0. Maximum endoglucanase activity (%133) was recorded at 20% (3.4M) NaCl. On the other hand the xylanase from Bacillus sp.X13 presented and optimum activity at 40oC and pH 6.0. The enzyme was 100% stable between pH 5.0-6.0 for 15 min. The enzyme was consist of 4 unit as 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa on SDS-PAGE. The results showed that the amylase AB-17 is a relevant enzyme for desizing processes in textile industries. The increased activity of C14 endoglucanase in high saline conditions, high halo-stability, resistance to detergents makes the enzyme C14 endoglucanase appropriate for textile, paper, animal feed preparation processes. X13 Xylanase enzyme could also be used for prebiotic preparation in food industries and fruit juice production without needing pectinase and cellulase usage.

Key Words: Bacillus, amylase, cellulase, xylanase, haloalkalophile

III

TEŞEKKÜR

Çalışmamın her aşamasında bana yardımcı olan, bilgi ve deneyimleriyle yol

gösteren danışman hocam sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN’a, Moleküler Biyoloji

Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof.Dr.Ömer ÇOLAK’a, sayın Prof.Dr.Sadık

DİNÇER’e ve Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ’e çok teşekkür ederim.

Bazı suşların dizi analizlerinde yardımlarını esirgemeyen Dr.A.Akın

DENİZCİ’ye, bölüm teknisyeni sayın Mustafa TOMAK’a ve bölüm sekreteri sayın

Mediha KURTOĞLU’na teşekkür ederim.

Ayrıca bütün çalışmalarım süresince manevi desteğini esirgemeyen annem

Meliha, eşim Arife ve kızım Irmak Zehra AYGAN’a sonsuz teşekkür ederim.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA NO

ÖZ........................................................................................................I

ABSTRACT.........................................................................................II

TEŞEKKÜR.........................................................................................III

İÇİNDEKİLER.....................................................................................IV

ÇİZELGELER DİZİNİ .........................................................................XII

ŞEKİLLER DİZİNİ ..............................................................................XIV

SİMGELER VE KISALTMALAR .......................................................XVI

1.GİRİŞ ................................................................................................1

1.1.Enzimler ve Bazı Özellikleri ........................................................3

1.2. Enzimlerin Sınıflandırılması .......................................................5

1.2.1. Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması........5

1.3.Amilazlar (Amylase)....................................................................6

1.3.1.Amilazların Bazı Uygulama Alanları ................................7

1.4. Selülazlar (Endoglukanaz) ..........................................................9

1.4.1.Kompleks Olmayan Selülaz Sistemleri .............................10

1.4.2. Kompleks Selülaz sistemleri (Selülozom) ........................11

1.4.3. Selülazların Bazı Uygulama Alanları ...............................13

1.4.3.1. Gıda endüstrisinde Selülazlar ...............................13

1.4.3.2. İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar .............14

1.4.3.3. Hayvan Yemi Endüstrisinde Selülazlar ................14

1.4.3.4. Tekstil Endüstrisinde ...........................................14

1.5. Ksilanazlar (Xylanase) ................................................................15

1.5.1. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları ....................17

1.6. Ekstremofilik Enzimler (Ekstremozimler) ...................................19

1.7. Bacillus Cinsi..............................................................................21

1.8. Elektroforez Uygulamaları ..........................................................22

1.8.1. Jel Elektroforezleri ..........................................................24

V

1.8.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi

(SDS-PAGE).................................................................26

1.8.3. Doğal (Native) Jel Elektroforezi ......................................28

1.9. Protein İzolasyonu ......................................................................28

1.9.1. Çöktürme ile Proteinlerin İzolasyonu...............................31

1.9.1.1. TCA ile Çöktürme ...............................................31

1.9.1.2. Nötral tuzlar ile Proteinlerin Çöktürülmesi ...........31

1.9.1.3. Organik Çözücülerle Proteinlerin Çöktürülmesi ...33

1.9.1.4. Non-İyonik Organik Polimerlerle Çöktürme ........33

1.10. Kromatografi ............................................................................34

1.10.1. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) ........................................35

1.11. Araştırmanın Amacı ..................................................................37

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.................................................................39

3. MATERYAL VE METOD...............................................................49

3.1. Materyal .....................................................................................49

3.1.1.Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan

Besiyerleri........................................................................49

3.1.1.1. LB Agar...............................................................49

3.1.1.2. M9-Nişasta Agarı.................................................49

3.1.1.3. CMC-Agar Besiyeri .............................................50

3.1.1.4. CEPM (Selüloz Enzim Üretimi Besiyeri) .............50

3.1.1.5. Ksilanlı Besiyeri ..................................................51

3.1.1.6. Nutrient Broth......................................................51

3.1.2. Kullanılan Çözeltiler........................................................51

3.1.2.1. NaOH Çözeltisi....................................................51

3.1.2.2. Etanol ..................................................................52

3.1.2.3. Na2CO3 Çözeltisi..................................................52

3.1.2.4. Lügol ...................................................................52

3.1.2.5. Kongo Kırmızısı ..................................................52

3.1.2.6. NaCl Çözeltisi......................................................53

3.1.2.7. Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M) ........................53

VI

3.1.2.8. Sitrat Tamponu ....................................................53

3.1.2.9. Sodyum-Fosfat Tamponu.....................................53

3.1.2.10. Glisin-NaOH Tamponu ......................................54

3.1.2.11. Borax-NaOH Tamponu ......................................55

3.1.2.12. Dinitro Salisilik Asit (DNS) ...............................55

3.1.3. Elektroforezde Kullanılan Solüsyonlar.............................55

3.1.3.1. Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu)......................55

3.1.3.2. Solüsyon B (4X) ..................................................55

3.1.3.3. Solüsyon C (4X) ..................................................56

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS) ...............................56

3.1.3.5. Elektroforez Tamponu ........................................56

3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu ....................................56

3.1.3.7. SDS Jel boyama (Staining) Solüsyonu .................56

3.1.3.8.SDS Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining)

Solüsyonu .............................................................57

3.1.3.9.SDS-PAGE’nde Zymogram Analizleri İçin

Renatürasyon Solüsyonları....................................57

3.1.3.10.Nişastalı Glisin-NaOH Tamponu Çözeltisi..........57

3.1.4. İnce Tabaka Kromatografisi Solüsyonları ........................57

3.1.4.1. Bütanol-Asetik Asit-Distile Su.............................57

3.1.4.2. %20’lik Sülfirik Asit (H2SO4) Çözeltisi ...............58

3.1.4.3. Kloroform-Asetik Asit-Distile Su Çözeltisi ..........58

3.1.4.4. Anilin-Difenilamin-Ortofosforik Asit Çözeltisi ....58

3.1.4.5. D-Glikoz Çözeltisi ...............................................58

3.1.4.6. Maltoz Çözeltisi...................................................58

3.1.4.7. Ksiloz Çözeltisi....................................................58

3.1.5.16S rRNA Dizisinin Belirlenmesi İçin Kullanılan

Solüsyonlar....................................................................59

3.1.5.1 DNazolDirect.....................................................59

3.1.5.2.TAE (Tris-Asetik Asit-Edta)Tamponu ..................59

VII

3.1.5.3.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için

Kullanılan Primerler..............................................59

3.2. Metod .........................................................................................59

3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi ..........................................59

3.2.1.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu .......59

3.2.1.2. Bakteri Teşhisi.....................................................60

3.2.1.3. Bakteri Teşhisi İçin Genomik DNA Hazırlanması 60

3.2.1.4. Agaroz Jel Hazırlanması .....................................60

3.2.1.5.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için

Reaksiyon Koşulları..............................................61

3.2.1.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Koşulları .....61

3.2.1.7. 16S rDNA Dizisinin Belirlenmesi ........................61

3.2.2. Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi..................................62

3.2.2.1.Katı Besiyerlerinde Amilaz Aktivitelerinin

Belirlenmesi..........................................................62

3.2.2.2.Katı Besiyerlerinde Selülaz Aktivitelerinin

Belirlenmesi..........................................................62

3.2.2.3.Katı Besiyerlerinde Ksilanaz Aktivitelerinin

Belirlenmesi..........................................................62

3.2.2.4. Bakterilerin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim

Sentezlerinin Gerçekleştiği pH Aralığının

Saptanması............................................................63

3.2.2.5.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyon

Sıcaklığının Saptanması ........................................63

3.2.2.6.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyonu İçin

Gerekli Tuz Konsantrasyonlarının Saptanması ......63

3.2.3.1.Sıvı Kültürde Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi

Saflaştırma............................................................64

3.2.3.2.Sıvı Besiyerinde Selülaz ve Ksilanaz Enzim

Üretimi ve Kısmi Saflaştırma................................64

VIII

3.2.3.3.Enzimin Optimum Aktivite Göstediği pH

Değerinin Saptanması ...........................................65

3.2.3.4.Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Değerinin Saptanması ...........................................65

3.2.3.5.Enzimin Termal (Sıcaklık) Stabilitesinin

Saptanması............................................................65

3.2.3.6. Enzimin pH Stabilitelerinin Belirlenmesi .............66

3.2.3.7.NaCl’ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin

Belirlenmesi..........................................................67

3.2.3.8.İnhibitörlerin Enzim Aktivitesine Etkisi ................67

3.2.4.Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler

Ağırlık ve Zimogram Analizi............................................68

3.2.4.1.Moleküler Ağırlık Analizi İçin SDS-PAGE

Sisteminin Hazırlanması. ......................................68

3.2.4.2.Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin

Hazırlanması.........................................................69

3.2.4.3.Amilaz Enzimi Zimogram Analizi Için Doğal

(Nativ) Jelin Hazırlanması ....................................69

3.2.4.4.Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve

Yürütülmesi ..........................................................69

3.2.4.5.SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram

Analizleri..............................................................70

3.2.5.Enzim Substrat Reaksiyonu Sonunda Açığa Çıkan Son

Ürünlerin Saptanması .......................................................71

3.2.5.1.İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Plakalarının

Hazırlanması.........................................................71

3.2.5.2. Amilaz Enzimine Ait Son ürünlerin Saptanması...72

3.2.5.3.Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerine Ait Son

Ürünlerin Saptanması............................................72

4. BULGULAR VE TARTIŞMA..........................................................73

4.1.Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ...............................73

IX

4.2.Bakterilerin Teşhisi......................................................................73

4.2.1.1Bakterilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri ......73

4.2.2.AB-17 Suşunun 16S rDNA Dizi Analizi sonuçları............74

4.3.AB-17 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme

Sonuçları......................................................................................74

4.3.1.AB-17 Suşunun Farklı pH Değerleri ve 37oC’de Üreme

ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular......................74

4.3.2.AB-17 Suşunun Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’deki

Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular ..........75

4.3.3.M9 Nişastalı Agar Besiyerinde Farklı NaCl

Konsantrasyonlarında Bakteri Üreme Davranışı ve Enzim

Sentezine Ait Bulgular......................................................76

4.4.C-14 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme

Sonuçları......................................................................................77

4.4.1.C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı pH Değerleri ve

37ºC’de Üreme ve Selülaz Enzim Aktivitesine Ait

Bulgular ...........................................................................77

4.4.2.C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklık Değerleri

ve pH 9.5’teki Üreme ve Enzim Aktivitesine Ait Bulgular77

4.4.3.C-14 Suşunun Farklı NaCl (%3-20) İçeren CMC’li

Agarda Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular ..............78

4.5.X-13 Suşunun Katı Besiyerinde 37ºC ve Farklı pH eğerlerinde

Enzim Sentezleme ve Ürem Davranışına Ait Bulgular .................79

4.5.1.X-13 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklıklar ve pH

7.0’deki Ürem ve Enzim Sentezlemesine Ait Bulgular......80

4.6. AB-17 Amilaz’ın Enzimatik Özellikleri ......................................81

4.6.1. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum pH Aralığı ...............81

4.6.2. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Aktivitesi...83

4.6.3. AB-17 Amilaz Stabilitesi Üzerine pH’nın Etkisi..............86

4.6.4.AB-17 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait

Bulgular ...........................................................................88

X

4.6.5.AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl’ün Etkisi..89

4.6.6. AB-17 Amilaz Enzimi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi.........90

4.6.7. AB-17’nin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi..................94

4.6.8.AB-17 Amilaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi

Bulguları ..........................................................................95

4.7. Kısmi Saflaştırılmış C-14 Selülaz Enziminin Katı Besiyerindeki

Aktivite Görüntüsü....................................................................96

4.7.1.C-14 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği

pH Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar ................................97

4.7.2.C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite

Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Sonuçlar .......................99

4.7.3.C-14 Endoglukanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait

Sonuçlar ...........................................................................100

4.7.4.C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite

Analizlerine Ait Sonuçlar .................................................102

4.7.5.C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi

Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar ............................105

4.7.6.C-14 Endoglukaaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör,

Deterjan ve Metal İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar.........108

4.7.7.C-14 Selülaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram

Analizi .............................................................................110

4.7.8. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait İnce Tabaka

Kromatografi Bulguları ....................................................111

4.8.Kısmi Saflaştırılmış X-13 Ksilanaz Enziminin Katı

Besiyerindeki Aktivite Sonucu.....................................................113

4.8.1.X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği

pH Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar ................................113

4.8.2.X-13 Ksilanaz’ın Sıcaklık Optimumu ...............................115

4.8.3.X-13 Ksilanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar ...117

4.8.4.X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait

Sonuçlar ...........................................................................120

XI

4.8.5.X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine

NaCl’ün Etkisine Ait Sonuçlar .........................................122

4.8.6.X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör,

Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi ..................................125

4.8.7.X-13 Ksilanaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram

Analizi Bulguları ..............................................................128

4.8.8.X-13 Ksilanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi

Bulguları ..........................................................................129

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ..........................................................133

KAYNAKLAR.....................................................................................157

ÖZGEÇMİŞ .........................................................................................176

EK 1 Nişasta.........................................................................................177

EK 2 Selüloz (Cellulose) ......................................................................180

EK 3 Ksilan (Xylan) .............................................................................184

EK 4 İnce Tabaka Kromatografisi Plakalarının Hazırlanması................186

XII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO Çizelge 1.1. İnce Tabaka Kromatografileri İçin Kaplama Malzemeleri...... 37

Çizelge 1.2. İnce Tabaka Kromatografisi için Bazı Geliştirme

Çözeltileri.............................................................................. 38

Çizelge 3.1. Sitrik asit Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması...................... 53

Çizelge 3.2. Sodyum Fosfat Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması ............. 54

Çizelge 3.3. Glisin-NaOH Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması ................ 54

Çizelge 3.4. Ayırıcı Jelin Bileşimi............................................................. 68

Çizelge 3.5. Dengeleyici Jelin Bileşimi ..................................................... 69

Çizelge 4.1. AB-17 suşunun farklı pH değerleri ve 37oC’de ki üreme

ve Enzim Üretme sonuçları. ................................................... 75

Çizelge 4.2. AB-17 suşunun farklı Sıcaklık değerleri ve pH 9.5’de ki

Üreme ve Enzim Üretme sonuçları. ....................................... 75

Çizelge 4.3. AB-17 Suşunun Farklı Tuz Konsantrasyonunda Üreme ve

Enzim Üretme Sonuçları........................................................ 76

Çizelge 4.4. C-14 Suşunun Katı Besiyerinde ve Farklı pH

Değerlerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları ......... 77

Çizelge 4.5. C-14 Bakterisinin Farklı Sıcaklık ve pH 9.5’teki CMC

Agar Besiyerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme

Sonuçları ............................................................................... 78

Çizelge 4.6.C-14 Suşunun Katı Besiyeri ve Farklı Tuz

Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Sentezlemesiyle

İlgili Sonuçlar ....................................................................... 78

Çizelge 4.7. X-13 Suşunun 37ºC ve Farklı pH değerlerinde Üreme ve

Enzim Üretimine Ait Sonuçlar .............................................. 79

Çizelge 4.8. X-13 Suşunun Farklı Sıcaklık ve pH 7.0 de Gösterdiği

Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular................................ 80

Çizelge 4.9. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör,

Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi. ...................................... 91

XIII

Çizelge.4.10. C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör,

Şelatör, Metal İyon ve Deterjanların Etkisine Ait

Sonuçlar ................................................................................ 109

Çizelge 4.11. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör,

Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi ....................................... 126

Çizelge Ek 1.1.Amiloz ve Amilopektinin Bazı Özellikleri ............................ 178

XIV

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO

Şekil 1.1. Ksilanın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler ve Etki

Bölgeleri ..................................................................................... 17

Şekil 4.1. AB-17 Suşundan Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle İzole

Edilmiş Enzim Çözeltisinin Nişastalı Agar Ortamında

Oluşturduğu Aktivite Reaksiyonu................................................ 81

Şekil 4.2.AB-17 Suşundan Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum

pH’sı ........................................................................................... 82

Şekil 4.3. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği

Sıcaklık Verileri .......................................................................... 84

Şekil 4.4. AB-17 Amilaz Enziminin pH Stabilitesi ...................................... 86

Şekil 4.5. AB-17 Amilaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesi. ............................. 88

Şekil 4.6. NaCl’ün AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi............. 89

Şekil 4.7. AB-17 Amilaz Enziminin SDS-PAGE ve Doğal PAGE

Zymogram Sonuçları ................................................................... 94

Şekil 4.8. AB-17 Amilaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile

Son Ürünlerinin Saptanması. ....................................................... 96

Şekil 4.9. Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Endoglukanaz

Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu............................ 97

Şekil 4.10. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği

pH Değerine Ait Sonuçlar. .......................................................... 98

Şekil 4.11. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Sıcaklığına

Ait Sonuçlar. ............................................................................... 100

Şekil 4.12. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait pH Stabilite Sonuçları ............ 102

Şekil 4.13. C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları........... 104

Şekil 4.14. Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim

Aktivitesine Etkisi ....................................................................... 106

Şekil.4.15. Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim

Stabilitesine Etkisi....................................................................... 107

XV

Şekil 4.16. C-14 Selülaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zymogram

Analizi ........................................................................................ 112

Şekil 4.17. C-14 Endoglukanaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi

ile Son Ürünlerinin Belirlenmesi. ................................................ 113

Şekil 4.18. Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Ksilanaz

Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu............................ 114

Şekil 4.19. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH

Değerine Ait Sonuçlar. ................................................................ 115

Şekil 4.20. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği

Sıcaklık Değerine ait Sonuçlar..................................................... 117

Şekil 4.21. X-13 Ksilanaz Enziminin 15 dakika, 60 dakika ve 24 Saat Ön

İnkübasyon İşleminden Sonraki pH Stabilitesine Ait

Sonuçlar. ..................................................................................... 119

Şekil 4.22. X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları. .................. 121

Şekil.4.23. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün

Etkisine Ait Sonuçlar................................................................... 124

Şekil 4.24. X-13 Ksilanaz Enzimi Zymogram Analizi Sonuçları. .................. 129

Şekil 4.25. X-13 Ksilanaz Enziminin Hidroliz Ürünlerine ait Bulgular. ......... 131

Şekil Ek 1.1.Amiloz........ ............................................................................. 179

Şekil Ek 1.2.Amilopektin.............................................................................. 180

Şekil Ek 2.1.Selüloz, β-D-glukoz polimeri .................................................... 182

Şekil Ek 3.1.Ksilanaz Yapısı......................................................................... 186

Şekil Ek 4.1.Cam Plakaların Yerleştirilmesi.................................................. 187

Şekil Ek 4.2.Silika Jel karışımının Hazırlanması ........................................... 187

Şekil Ek 4.3.Silika Jel Karışımının Yayma Aparatına Dökülmesi.................. 187

Şekil Ek 4.4.Silika Jelin Cam Plakalar Üzerine Yayılması ............................ 187

Şekil Ek 4.5.Kuruyan Plakaların Magazine Yerleştirilmesi ........................... 187

Şekil.Ek.4.6.Plakaların Dikey Pozisyonda Aktivasyon için Fırına

Yerleştirilmesi............................................................................. 187

Şekil Ek 4.7.İnce Tabaka Kromatografisinin Uygulanması ........................... 187

XVI

SİMGELER VE KISALTMALAR AMPS : Amonyum persülfat CMC : Karboksimetilselüloz DNS : Dinitrosalisilikasit CMCaz: Karboksimetilselülaz EDTA : Etilendiaminotetraasetik asit L : Litre LB : Luria Bertani M : Molar mL : Mililitre mM : Milimolar mg : Miligram µg : Mikrogram µL : Mikrolitre SDS : Sodyum dodesil Sülfat SDS-PAGE: Sodyum dodesil süüfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi α : Alfa β : Beta rpm : dakikada devir sayısı Tris : 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol TEMED : N,N,N,N-Tetrametil etilendiamin TAE : Tris-Asetik Asit-Edta

1.GİRİŞ Ashabil AYGAN

1

1. GİRİŞ

Canlı yaşamı sürekli bir değişim temeline dayanmaktadır. İnorganik maddeler

dünyadaki yaşamı oluşturup karmaşık yapıları meydana getirdikten sonra tekrar

cansız yapılara dönüşürler. Bu süreçte güneş ışığı temel bir rol oynamakta olup,

bitkilerin yaşam için gerekli maddelerin sentezini geçekleştirmesini sağlar.

Sentezlenen bu bileşikler, hayvansal organizmaların yaşamları için gerekli temel

besin kaynağını oluştururlar. Bu bileşiklerin sentezi veya yıkımı mucize moleküller

olarak adlandırılan enzimler tarafından gerçekleştirilirler.

Enzimler, doğal olarak canlılar tarafından sentezlenen protein yapısında ya da

bir kısmı protein olan biyo-moleküllerdir. Enzimler, binlerce yıldır içecek, ekmek ve

peynir yapımı gibi işlemlerde varlığı ve görevi bilinmeden kullanılmıştır. İlk bulgular

eski Mısıra kadar dayanmaktadır. Yakın tarihte ise Doğu ülkelerinde birçok gıda

fermentasyonu için ipliksi mantarlar enzim kaynağı olarak kullanılmaktadır. Batıda

1896’da gerçek modern mikrobiyal enzim teknolojisi ‘takadiastase’ın ticareti ile

başlamıştır. Bu Doğudan Batı toplumuna önemli bir teknolojik transferdir (Smith,

1996).

Dericilikte, derinin yumuşatılması köpek ya da güvercin dışkıları ile muamele

edilerek yapılırken, bu yüzyıl başlarında Alman kimyacı ‘Otto Röhm’ köpek

dışkılarındaki aktif bileşenlerin proteinleri parçalayan proteaz enzimi olduğunu,

hayvansal organlardan bu enzimin elde edilebileceğini ve bu işlemlerde köpek dışkısı

yerine kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Böylece 1905 den itibaren domuz ve

sığır pankreasları sosyal açıdan ve güvenilir bir enzim kaynağı olarak ön plana

çıkmıştır (Smith, 1996). Bitkisel kaynaklı enzimlerden bira üretiminde kullanılan

malt amilazı içecek endüstrisinde önemli bir yer tutmaktadır (John, 1987).

Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde

edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı

karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark, 2003). Bugüne kadar

yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda

kullanım için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu %10 içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile

deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün


2

enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal

enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir

şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar,

biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden

dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark,

1998). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı

mikroorganizmaların fermentasyonu ile üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996).

Bacillus cinsi bakteriler, toprakta, hayvan dışkılarında ve bitkisel ürünler

üzerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu

ve teşhisi kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısa, genel olarak

güvenli olması, sentezledikleri proteinlerin dış ortama salgılama kapasiteleri gibi

birçok sebepten dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Çünkü gram negatif

bakteriler, ürettikleri proteinleri protoplazmalarında ya da periplazmik boşluklarında

biriktirirler. Bu da üretilen ürünün izolasyonunu güçleştirerek suştan birden fazla kez

yararlanılmasını engeller. Ayrıca sentezlenen ürünlerin organizmaya karşı toksik etki

oluşturması da söz konusudur.

İntrasellüler ortamda sentez ürünlerinin biriktirilmesi çözünmez protein

oluşumu, yanlış protein katlanmaları ve etkin olmayan disülfit bağ formasyonu gibi

problemleri beraberinde getirmektedir. Ayrıca gram negatif bakteriler, insanlara

toksik olan endotoksin üretimi ve intrasellüler protein üretimi ile izolasyon ve

saflaştırma için ekstra maliyet oluşturmaktadırlar (Schallmey ve ark, 2004).

Mantarlardaki aflatoksin gibi toksik ya da alerjen (Sander ve ark, 2000) bileşik

üretimi de göz önünde bulundurulduğunda, gram pozitif bakterilerin, özellikle

Bacillus türlerinin endüstriyel enzim üretiminde öncelikli olarak tercih edilmesine

neden olmaktadır.

Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının

yaklaşık 1,6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir (Schallmey ve ark, 2004). Bu

enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında, %29’unun gıda

endüstrisinde, %15’inin hayvan yemi sektöründe ve %56’sının ise genel amaçlı

teknik alanlarda yer aldığı görülmektedir (Outtrup ve Jorgensen, 2002).


3

Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75’ini hidrolitik enzimler

oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken,

karbohidratları parçalayan enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992;

Bhat, 2000). Karbonhidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında

yaklaşık %25’lik bir paya sahiptir (Sidhu ve ark, 1997; Rao ve ark, 1998). Son

zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt hamurunun beyazlatılması için

ksilanazların endüstride kullanılması Viikari ve arkadaşlarının (1986) buluşu ile

artışa geçmiştir.

Hidrolazlardan selülozlar ise selülozik materyallerin şekerlere dönüştürülerek

biyo-etanol gibi biyolojik temelli ürünlere dönüştürülmesi söz konusu olduğunda

enzim piyasasındaki payı ciddi bir şekilde artması beklenmektedir (Cherry and

Fidantsef, 2003).

Sellülazların bitkisel atıkların hidrolizinde kullanılması durumunda Amerika

Birleşik Devletleri’nde yıllık 400 milyon dolarlık bir ticaret hacmine sahip

olabileceği tahmin edilmektedir. Bu durum, endüstriyel enzim pazarının %33 lük bir

orana yükselebileceğini göstermektedir (Percival Zhang ve ark, 2006).

1.1.Enzimler ve Bazı Özellikleri

Biyolojik katalizör olan enzimler hücre içerisinde üretilmelerine rağmen

birçoğu hücre dışına salınarak aktivitelerine devam ederler. Enzimlerin bu özellikleri

endüstriyel uygulamalarda kullanılmalarının yolunu açmıştır. Enzimin aktivasyonu,

sahip olduğu katalitik yapısından kaynaklanmakta olup aktivasyonunu reaksiyon

esnasında enzim tüketilmeksizin gerçekleşir.

Enzimin etki gösterdiği maddeye ‘substrat’ adı verilir ve enzimin

adlandırılmaları etkilediği maddenin isminin sonuna –az (-ase) eki getirilerek yapılır.

Bütün enzimlerin şifresi genler üzerindedir. Dolayısıyla amino asit dizilimi kendine

özgüldür.

Doğada her metabolik reaksiyon enzimler tarafından kontrol edilir. Enzim

reaksiyon sırasında değişikliğe uğramadan yapısını korur ve başka bir substrat ile

tekrar reaksiyona girer. Kimyasal katalizör maddelerin büyük çoğunluğu birçok


4

reaksiyonu katalizleyebilir. Fakat bunlar genellikle hem özgül hem de seçici

değildirler. Buna rağmen enzimler oldukça selektif olup spesifik reaksiyonlara

katalizör etkisi yaparlar. Bu özellik, enzim molekülünün şeklinden kaynaklanır.

Enzim substrat ilişkisi ‘kilit-anahtar’ uyumu ile açıklanmaktadır.

Enzimlerin bazıları iki farklı kısımdan oluşur. Bunlar Apoenzim (protein

kısım) ve Koenzim (Organik ya da İnorganik kısım) yapılarıdır. Ne Koenzim

(vitaminler olabilir) ne de apoenzim tek başına işlevsel değildir. Bazı enzimler ise

etkinlikeri için belirli iyonlara ihtiyaç duyarlar.

Örneğin tükrükteki amilaz nişastayı yalnız klor (Cl-1) iyonlarının bulunduğu

ortamda parçalayabilir. Canlı bünyesinde bulunan eser elementler, mangan (Mn+2),

bakır (Cu+2), çinko (Zn+2), demir (Fe+2) ve diğer elementler bu enzimatik işlevlerde

aktivatör olarak kullanılır. Ayrıca bazı enzimlerin etkinliği yapılarındaki metal

iyonlarına bağlıdır. Yani koenzim kısmı kalsiyum (Ca+2), potasyum (K+),

magnezyum (Mg+2), çinko (Zn+2) ise kofaktör adını alır. Koenzim kısmının organik

olduğu durumlarda, bu kısmın apoenzime kovalent bağlarla bağlanması söz konusu

ise prostetik grup olarak adlandırılır. Koenzim (Prostetik grup) ve apoenzim

birlikteliğine holoenzim denir.

Bir enzim molekülü genel anlamda globüler yapıda bulunur ve molekül içi

veya arası bağlar ile sekonder ya da tersiyer yapıda tutulur. Proteinlerin bu yapıları

sıcaklık ve pH daki değişmeler ile bozulabilir. Bu yüzden, bir enzimin katalitik

aktivitesi pH ve sıcaklığa duyarlıdır. Sıcaklığın yükselmesi, reaksiyona girecek

moleküllerin kinetik enerji ile yüklenmesini sağlar. Böylece etkileşime girecek

moleküllerin reaksiyon için karşılaşma şansını artırır.

Her enzimin katalitik aktivitesinin en yüksek seviyede olduğu bir sıcaklık

değeri vardır. Buna ‘optimal sıcaklık’ denir. Bu değerden yüksek sıcaklıklarda

enzim yapısı molekül içi veya arası bağların kopması sonucu bozulmaya başlar. Aynı

zamanda her enzimin en iyi çalıştığı bir pH aralığı (optimum pH) mevcuttur. Bu,

enzimin molekül yapısının pH daki değişime bağlı olarak etkilenmesinden

kaynaklanmaktadır. Bazı maddeler ise enzimlerin aktif bölgelerinin tutulması sonucu

enzimin deformasyonunu sağlayarak, katalitik aktivitesini düşürebilir. Hatta

tamamen durdurabilir. Bu tür maddelere ‘inhibitör’ adı verilir (Aehle,2004).


5

1.2.Enzimlerin Sınıflandırılması

Bilinen enzimlerin sayısı 1950’lerin sonuna kadar çok hızlı bir şekilde artmış

ve birçok kişinin aynı enzime farklı isimler vermelerinden dolayı adlandırmada

karmaşa ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda adlandırılması yapılan birçok enzimin

katalizlediği reaksiyonun tabiatı hakkında herhangi bir bilgi içermemesi de bu

karmaşayı artırmaktaydı. Bu karışıklığın düzenlenmesi amacı ile 1956 yılında bir

Uluslararası Enzim Komisyonu (International Comission on Enzyme) kurulmuştur.

Enzimlerin sınıflandırılması ve isimlendirilmesi için kabul edilen sistem 3 genel

prensibi içermektedir.

Birincisi, -az (-ase) eki ile sonlanan enzim isimleri, tek enzimler için

kullanılmalıdır. Bu durum birden fazla sistem içeren enzimler için kullanılmamalıdır.

İkincisi, enzimler katalizledikleri reaksiyonlara göre sınıflandırılır ve adlandırılırlar.

Son prensip ise katalizlenen reaksiyonların tipine göre adlandırılır ve sınıflandırılır.

Bu sistem enzim komisyonu (E.C.) tarafından belirlenen kod numaraları kullanılarak

enzimlerin açık bir şekilde tanımlanmalarını sağlar.

Bir enzimin genellikle iki ismi mevcuttur. Biri sistematik yada tavsiye edilen,

diğeri ise yaygın olarak kullanılan, daha kısa ve kolayca uygulanan genel ismidir. Bir

enzim, sistematik ismi ve E.C. kod numarası ile tanımlandıktan sonra önerilen isim

herhangi bir karışıklık olmaksızın sorunsuzca kullanılabilir. Bu tür yaklaşımlar

literatürlerde yaygın olarak uygulanmaktadır (Aehle, 2004).

1.2.1.Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması

Enzim komisyonu raporuna göre enzimler katalizledikleri reaksiyona göre 6

ana sınıfa ayrılır ve kod numaraları ile tanımlanırlar. E.C. ön eki ile başlayan

numaralar noktalarla birbirinden ayrılmış 4 temel öğeyi ifade ederler.

1. İlk rakam, enzimin altı sınıftan hangisine ait olduğunu belirtir.

2. İkincisi, enzimin alt sınıfını (Subclass) ifade eder.

3. Üçüncü rakam, ikinci alt grubu (Sub-Subclass),


6

4. Dördüncü rakam ise enzimin sub-subclass içindeki seri

numarasını ifade eder.

Örneğin E.C. 3.2.1.1 fungal alfa-amilaz enziminin kod numarası ile ifade

edilmesidir.

Bu sisteme göre ilk rakamın ifade ettiği sınıflar kısaca aşağıdaki gibidir.

1. Oksidoredüktazlar,

2. Transferazlar,

3. Hidrolazlar,

4. Liyazlar,

5. İzomerazlar,

6. Ligazlar. (Aehle, 2004)

1.3.Amilazlar (Amylase)

Amilazlar, glikoz birimlerinden oluşan nişasta ve benzer polimer moleküllerini

parçalayan “glikozid hidrolaz” olarak da bilinen enzimlerdir. Doğada bitkiler,

hayvanlar ve mikroorganizmalarda bulunur ve amiloz, amilopektin ve glikojeni

oluşturan glikoz birimleri arasındaki glikozidik bağları parçalayabilme yeteneğine

sahiptir. Amilaz enzimleri, “endoamilaz” ve “ekzoamilaz” olmak üzere iki

kategoriye ayrılabilirler.

Endoamilazlar nişasta molekülünü, farklı uzunluklarda düz ya da dallanmış

oligosakkarit oluşturacak şekilde rastgele parçalarlar. Ekzoamilazlar ise indirgen

olmayan uç kısmından itibaren kısa son ürün bırakacak şekilde parçalar (Gubta ve

ark, 2003). Son yıllarda, nişasta ve benzeri polisakkaritleri parçalayan birçok yeni

enzimler tespit edilmiştir. Polisakkarit yapıları oluşturan α-1,4 ya da α-1,4 ve/veya α-

1,6 bağlarını parçalayabilen, ticari öneme sahip mikrobiyal veya başka kaynaklı

enzimler 6 sınıfa ayrılabilirler (Fogarty ve Kelly, 1979).

Bunlar:

a) α-1,4 bağlarını hidrolize edebilen ve α-1,6 dallanma noktalarını atlayabilen

zincir üzerinde rastgele aktivasyon gösterebilen (Endoakting) α-amilaz enzimleri

(E.C:3.2.1.1)


7

b) α-1,4 bağlarını hidrolize edebilen fakat α-1,6 dallanma noktalarını

geçemeyen β-amilaz gibi nişasta zincirinin indirgen olmayan ucundan itibaren

parçalayan (Ekzoakting) ve maltozu son ürün olarak açığa çıkaran enzimler

(E:C:3.2.1.2).

c) Glukoamilaz (amiloglikozidaz) gibi α-1,4 ve α-1,6 bağlarını

parçalayabilen ekzoakting amilazlar (γ-amilaz) (E.C:3.2.1.3).

d) Sadece α-1,6 bağlanmalarını parçalayabilen Pullulanaz ve diğer

dallanmaları parçalayan enzimler (örn, E.C:3.2.1.41).

e) α-Glukozidaz gibi özellikle amiloz ve amilopektin üzerine etki eden diğer

enzimler sayesinde meydana gelmiş kısa zincirli oligosakkaritler üzerindeki α-1,4

bağlanmalarını hidrolize eden enzimler (E.C:3.2.1.20).

f) Nişastayı, Siklodekstrin (Cyclodextrin) adı verilen, indirgenmeyen siklik

D-glukozil (non-reducing D-Glucosyl) polimerlerine parçalayan enzimler

(E.C:3.2.1.19) (Cyclodextrin Producing Enzyme) (Reddy ve ark, 2003;Aiyer, 2005).

Günümüzde amilazlar, bitki, hayvan ve mikroorganizmalar olmak üzere birçok

farklı kaynaktan elde edilmelerine rağmen, mikrobiyal kaynaklı olanlar endüstriyel

alanda kullanılmaktadır. Nişasta endüstrisinde enzim kullanımı nedeniyle nişastanın

kimyasal uygulamalarla parçalanması işlemine son verilmiştir (Gupta ve ark, 2003).

Özellikle α-amilazlar endüstride kullanılan enzimlerin en popüler ve önemli

formlarından biridir.

1.3.1.Amilazların Bazı Uygulama Alanları

Yaklaşık on yıldır unlu mamüllerde amilazlar yaygın bir şekilde yer

bulmuştur. Özellikle ekmek ve unlu mamüllerde daha iyi kabarma, renk ve daha

yumuşak ürün eldesi amacıyla kullanılmaktadır. Amilaz ilavesi ile fermentasyon

oranı artmakta, hamur viskozitesi azaltmakta, ürün hacmi ve hamurda şeker miktarı

yükseltilerek ekmek kalitesi artırılmaktadır.

Ayrıca son zamanlarda ürünlerde raf ömrünü uzatıcı olarak da

değerlendirilmektedir. Alfa amilazların en büyük pazarı, glukoz ve fruktoz gibi

nişastanın parçalanmasından açığa çıkan ürünlerin üretimin alanıdır. Tatlandırıcı


8

özelliklerinden dolayı alkolsüz içecek endüstrisinde çok büyük oranlarda

kullanılırlar. Aynı zamanda içecek endüstrisinde, alkol fermentasyonu için nişastanın

sıvılaştırılması ve şekerleştirilmesi için kullanılmaktadır.

Tekstil endüstrisinde nişasta, haşıllama işleminde kullanılır. İpliğin

kırılmasını önlemek amacı ile sonradan giderimi kolay koruyucu bir tabaka

uygulaması yapılır. Bu amaçla nişasta ile muamele edilmesine ‘sizing’, nişastanın

uzaklaştırılmasına ise ‘desizing’ (Haşıllama) denir. Haşıllama dokuma esnasında

tekstile direnç kazandırır.

Dokuma işleminden sonra nişastanın uzaklaştırılmasını takiben yumuşatma ve

boyama işlemi başlar. Nişastanın giderilmesi ise genellikle α-amilaz uygulaması ile

gerçekleştirilir (Gupta ve ark, 2003; Aiyer, 2005). Alfa-amilazların kağıt ve kağıt

hamuru endüstrisinde kullanımı, kağıt kaplamasında nişastanın modifikasyonu

iledir. Tekstilde olduğu gibi, kağıdın nişasta ile kaplanması kağıdı mekanik hasarlara

karşı korumaktadır. Aynı zamanda son ürün halindeki kağıdın sertliğini, direncini ve

kalitesini de artırmaktadır.

Doğal nişastanın viskozitesi kağıt işlemleri için çok yüksektir. Nişastanın

istenilen yoğunluğa ulaşması, amilaz enzimi kullanılarak nişastanın belirli düzeyde

hidrolizasyonu sonucu elde edilir.

Deterjan endüstrisinde ise, nişasta temelli kirliliklerin temizlenmesi amacı ile

alfa amilaz enzimi detejanlarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Özellikle sıvı

deterjanların %90’dan fazlasında amilaz enzimi vardır.

Son yıllarda bulaşık makinelerinde kullanılan deterjanlara her geçen gün daha

fazla amilaz enzimi katılmaya başlanmıştır. Deterjanlardaki enzim ilavelerinin en

büyük avantajı enzimsiz deterjanlara nazaran daha iyi temizleme sağlaması ve ortam

koşullarını yumuşatmasıdır. İlk üretilen enzimsiz deterjanlar, solunduğunda sağlığa

zararlı olduğu ve çin porselenleri ile ahşap malzemelere zarar verdiği görülmüştür.

Medikal ve klinik kimya analizleri ile biyoteknoloji uygulamalarında da amilaz

enzimi kullanılmaktadır. Amilaz uzun moleküllü oligosakkaritlerin saptanmasında

gümüş nitrat testinden daha başarılı olarak kullanılmaktadır (Giri ve ark,1990). Aynı

zamanda elektrolit, izolatör ve yarı-iletken kapasitörlü biyosensörlerde de amilaz

enzimi kullanılmaktadır (Menzel ve ark, 1998).


9

1.4. Selülazlar (Endoglukanaz)

Selülazlar, selülozu glikoza parçalayabilme kapasitesindeki hidrolitik enzim

grubudurlar. Mikroorganizmalar, bitkiler ve hayvanlar (memeliler hariç) tarafından

üretilirler ve genellikle bir selülaz sistemi olarak birden fazla farklı enzimden

oluşurlar. Selülaz sistemi bileşenleri, başlangıçta katalitik etki şekillerine göre

sınıflandırılırken, günümüzde sınıflandırma yapısal özellikler temeli dikkate alınarak

yapılmaktadır. Üç ana enzimatik aktivite tipi söz konusdur. Bunlar:

a) Endoglukanazlar (endo-1,4-β-glucanases, yada 1,4-β-D-glucan-4-

glucanohydrolases, EC 3.2.1.4).

b) Ekzoglukanazlar (Sellodextrinazlar, 1,4- β-D-glucan glucanohydrolases)

(EC 3.2.1.74) ve Sellobiyohidrolazlar (exo-1,4-β-glucanases, ya da 1,4-β-D-

glucan cellobiohydrolases, EC 3.2.1.91).

c) Sellobiyazlar (β-glucosidases, yada β-D-glucoside glucohydrolases, EC

3.2.1.21).

Endoglukanazlar, selülozu meydana getiren polisakkarit zincirinin iç

bölgelerinde rastgele hidroliz yaparlar ve değişik uzunlukta oligosakkaritler meydana

getirirler. Ekzoglukanazlar ise selüloz zincirinin indirgenen ve indirgenmeyen

ucundan itibaren sırasal olarak hidroliz yaparlar ve son ürün olarak glukoz

(glukanohidrolaz) ya da sellobioz (Sellobiohidrolaz) açığa çıkarırlar.

Ekzoglukanazlar aynı zamanda mikrokristal selülozu da hidrolize etmektedirler. β-

Glikozidazlar sellodekstrin ve sellobiozu glikoza parçalayan enzimlerdir.

Selülazların çoğunluğunun genel özelliği, hem katalitik hemde karbonhidrat

bağlayan yapıları içeren modüler bir şekilde olmalarıdır. Selüloz bağlayan modül

(CBM: Cellulose Binding Module) çözünmeyen selülozda muhtemelen katalitik

bölgeyi substrata yaklaştırıp selülozun hidrolizini kolaylaştırmaktadır. CBM özellikle

ekzoglukanazların hidroliz işlevinin başlangıcında önemlidir. Selüloz sistemleri, her

bir enzimin kendi bireysel aktivitelerinin toplamından daha yüksek bir sinerjik

aktiviteye sahiptir. Sinerjik aktivitenin 4 formu bildirilmiştir. Bunlar:


10

a) Endoglukanazlar ve ekzoglukanazların arasındaki endo-ekzo

sinerji.

b) Selüloz zincirinin indirgenen ve indirgenemeyen uçlarından

ekzoglukanaz uygulamaları arasındaki ekzo-ekzo sineji.

c) İlk iki enzimin son ürünü olarak sellobiozu (ve Sellodekxtrin)

alan β-glukozidaz ve ekzoglukanazların arasındaki sinerji.

d) Katalitik domain ve CBM arasındaki intra-moleküler sinerji.

Selüloz sistemleri sadece üç enzimi de temsil eden bir birliktelik değil, daha

çok selülozun etkin hidrolizi için koordinasyon sunan bir etkiye sahiptirler.

Mikroorganizmalar selülozun tam hidrolizi için, doğal olarak lignin ve hemiselüloz

polimeri içine gömülmüş substratlar için farklı adaptasyonlar geliştirmişlerdir.

Selülolitik filamentöz mantarlar ve aktinomisetlerin, lif uzantıları boyunca

selülozik substratlara nüfuz etme kabiliyetleri vardır. Serbest selülazların (CBM’li ya

da CBM’siz) üretimi bu şartlarda selülozun etkin hidrolizi için yeterli olmaktadır. Bu

sistemlerdeki enzimler molekül ağırlık bakımından büyük stabil kompleksler

oluşturmazlar. Bu yüzden kompleks olmayan (Non-Complex) sistem olarak

adlandırılır.

Buna rağmen, anaerobik bakterilerin selülozik materyal içine etkin olarak nüfuz

olma kabiliyetleri yoktur. Bu yüzden selülozun parçalanabilmesi için diğer

mikroorganizmalar selülaz sentezi yapabilmek için ATP’nin sınırlı olması nedeniyle

alternatif mekanizma bulmak zorundadırlar. Bu durum mikroorganizmaların

Selülozom (Cellulosomes) denen kompleks selülaz sistemlerini geliştirmelerini

zorunlu hale getirmiştir. Clostridium’lar ve ruminant bakterilerde hidrolizin

gerçekleştiği bölgelerde selülaz üreten hücrelerin yerleştiği gözlenmiştir (Doi ve ark,

2003).

1.4.1.Kompleks Olmayan Selülaz Sistemleri

Son 50 yılın en fazla incelenen konusu Tricoderma reesei’ nin selülaz sistemi

olmuştur. T.reesei en az 2 ekzoglukanaz (CBH-I ve II), 5 endoglukanaz (EGI, II,III,

IV, ve V), ve 2 β-glukozidaz (BGL-I ve II) üretir.


11

İki ekzoglukanazın (sellobiohidrolaz) varlığı, mikrokristal selüloz zincirinin

indirgenen (CBH-I) ve indirgenmeyen (CBH-II) uçları için T.reseei’ nin gösterdiği

özel tercihe bağlanmıştır. Bu düşünce iki enzim arasında gözlenen ekzo-ekzo sinerji

ile de desteklenmiştir.

Sellobiohidrolaz aktivitesi mikrokristal selülozun hidrolizi için gereklidir.

Sellobiohidrolazların her ikisi de selüloz polimerizasyonunu (zincir uzunluğu)

düşürmede çok yavaştırlar. Endoglukanazların amorfoz bölgelerden selüloz zincirini

keserek zincirin kısaltılmasından birincil olarak sorumlu olduğu düşünülmektedir.

Böylece CBH ların etkisine açık yeni selüloz zinciri oluşturulmaktadır.

Henüz T.reesei de 5 endoglukanaz varlığının nedeni tam olarak

açıklanamamıştır. Aynı zamanda endoglukanazlar arasındaki sinerji de

gösterilememiştir. Buna rağmen bazı endoglukanazların (EG-I) ksilanaz aktiviteleri

gibi geniş substrat özgüllüğü de vardır.

CBM nin varlığı bir endoglukanaz aktivitesi ya da endo-ekzo sinerjisi için

gerekli değildir. CBH-I ve CBH-II’ nin temel ürünü olan sellobiozlar

sellobiohidrolazların ve endoglukanazların aktivitesini de inhibe ederler.

T.reesei nin en az iki β-glukozidaz enzimi üretmesi sellobioz ve kısa

oligosakkaritlerin hidrolizini kolaylaştırır. Hem BGL-I ve hem de BGL-II’nin büyük

çoğunluğu hücre duvarına bağlı olarak kalsalar da, süpernatantlardan da izole

edilmişlerdir. β-glukozidazın mantar hücre duvarlarına yakın bulunması, selüloz

hidrolizinden açığa çıkan glukozun, çevreye dağılarak kaybını azaltmaktadır.

Termofilik mantar H.insolens’ in selülaz sistemi T.reesei sistemine homolog

iken Phanerochaete chrysoporium’ un ürettiği selülaz sistemi CBH-II ve 6 CBH-I

yapılarına homoloji oluşturur (Doi ve ark, 2003).

1.4.2. Kompleks Selülaz sistemleri (Selülozom)

Selülozomlar, selüloz, hemiselüloz ve pektini parçalayabilen ekstrasellüler

enzim komplekleridir. Selülozom sistemlerine sahip mikroorganizmalar anerobik

ortamlarda ürerler. Selülozomların kompozisyonları türden türe değişkenlik


12

göstermesine rağmen, Clostridium ve ruminant bakterilerden Ruminococcus

türlerinde benzerlik gösterirler.

Selülozomların yapısı incelendiği zaman enzimatik özelliği olmayan, scaffoldin

adı verilen temel bir protein ile buna bağlanmış enzimatik alt ünitelerden oluştuğu

görülür. Skafoldin (Scaffoldin) proteini CbpA, CipA ya da CipC denen proteinlerden

oluşur ve bunlarla kompleks oluşturan bir çok selülozomal enzimler vardır. Non-

enzimatik protein (scaffoldin) bir çok kohezin (cohesin) denen bölgeyi ve selüloz

bağlayan bölgeleri (CBM yada CBD, Cellulose Binding Domain) içerir. Bunlardan

başka, hidrofilik bölge, dockerin II bölgesi, enzim kodlayan bölge ve görevi

bilinmeyen tanımlanmamış bölgeler mevcuttur.

Kohezin bölgeleri, skafoldin proteinlerde her zaman mevcut olup, selülozomal

enzimlerin dockerin bölgeleri için bağlanma noktalarına sahiptir. Kohezin-dockerin

birlikteliği selülozomun bir araya gelmesinde anahtar rol oynar. CBM selülozomu,

selülazı substrata sıkıca bağlamakla görevlidir. Kristal selüloza amorfoz selülozdan

daha etkin bağlanma özelliği göstermektedir. Ayrıca CBM selülozomu, omurgası

selülozunkine benzeyen kitine de bağlanır.

CBM selülozomları farklılık gösterebilirler ve aminoasit dizilerine göre birçok

familyaya ayrılabilirler. Aynı zamanda, CBM selülozomlar sadece skafoldin

proteinlerle bulunmaz daha önce de bahsedildiği gibi selülozomal ya da selülozomal

olmayan selülazlarla da bulunabilirler.

Selülozomal Enzimler: Minimal olarak bir katalitik ve dockerin bölgesi içerir.

Bir enzimde dockerin varlığı genellikle enzimin selülozomal enzim olduğunu

gösterir. Çünkü dockerin, skafoldinin kohenzin ile etkileşimi sonucu enzim

kompleksini oluşturur. Selülozomal enzimlerin esas kısmını oluşturan selülazlar 5. ve

9. familyanın endoglukanazları ve 48. familyanın ekzoglukanazlarını içeren glikozit

hidrolazların 3 familyasına aittirler. Dokuzuncu familyanın üyeleri özellikle selüloz

liflerini internal olarak parçalayabildikleri gibi kesme noktasından başlayarak selüloz

polimerini kesintisiz olarak da parçalayabilir.

Selülozomal hemiselülozlar enzimleri ksilanazları ve mannanazlardan meydana

gelirler. Ksilanazlar enzimleri, glikozit hidrolazların 11. familyası içerisinde yer

alırlar. Mannanazlar ise 5. familyanın üyeleridirler. Dokuzuncu familyaya ait olan


13

pektat liyazlar enzimleri da selülozomlar içerisinde tespit edilmişlerdir. Bu bulgu,

selülozomların selüloz, hemiselüloz ve pektini yani tüm hücre duvarı bileşenlerini

parçalayabileceğini göstermektedir.

Selülozomal kitinazlar da C.thermocellum’ dan izole edilmiş enzimler olup,

lignoselülozu parçalayamamalarına karşın, mantar ve böceklerin ekzo-iskeletini

oluşturan kitini parçaladığı gösterilmiştir. Selülolitik mikroorganizmaların çoğunun

karbon ve azot kaynağı olarak mantar ve ölü böceklerdeki kitini kullandığı

saptanmıştır (Doi ve ark, 2003).

1.4.3. Selülazların Bazı Uygulama Alanları

Selülazların ana uygulama alanları gıda, hayvan yemi üretimi, tekstil, biyo

yakıt, kimya, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, atıkların giderimi, tıbbi ve farmasötik

endüstrisi, protoplast üretimi, genetik mühendisliği ve kirlilik giderimidir (Bhat ve

Bhat, 1997). Bazı uygulamalar ayrıntılı olarak incelendiğinde çok farklı kullanım

alanlarının olduğu görülür.

1.4.3.1. Gıda endüstrisinde Selülazlar

a) Tohumlardan yağ ve meyve suyu ekstraksiyonunda,

b) Meyve sularının berraklaştırılmasında,

c) Tahılların homojen olarak su çekmesini sağlamak ve yeterince

ıslanmasının artırılmasında,

d) Soya sosu gibi fermente soya gıdaların üretiminde soyanın dış

zarının uzaklaştırılmasında,

e) Kokonat ve soya fasulyesinden protein izolasyonunda,

f) Mısır ve tatlı patatesten nişasta üretiminde,

g) Sindirimini artırmak amacı ileyosunlarının jelatinizasyonunda,

h) Su yosunlarından agar ekstraksiyonunda

i) Gıda katkısı maddesi olarak kullanılan öğütülmüş

lignoselülozik materyalin parçalanmasında,


14

j) Selülozik atıklardan çözünür şeker, glikoz ve sello-

oligosakkarit üretiminde.

k) Bioetanol üretimi için substrat eldesinde.

l) Kurutulmuş sebze ve çorba karışımlarının geri sulandırımının

artırılmasında.

m) Polisakkarit, protein, enzim ve tat verici maddelerin açığa

çıkışını kolaylaştırmak amacıyla bitki hücre duvarlarının

uzaklaştırılmalarında kullanılmaktadır(Bhat ve Bhat, 1997).

1.4.3.2. İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar

Rekombinant mayalardan elde edilen β-1,3 ve β-1,4 glukanazlar şaplarda

aroma artışının sağlanması, biranın filtrasyonunun kolaylaştırılması ve düşük kalite

arpada bulunan β-1,3 ve β-1,4 glukan hidrolizinde kullanılmaktadırlar.

1.4.3.3. Hayvan Yemi Endüstrisinde Selülazlar

a) Ruminant ve monogastrik hayvanlar yemlerinde

sindirilebilirliği artırmak amacı ile,

b) Lignoselülozik materyallerin ön işlemden geçirilmesinde,

hububatların kabuklarından arındırılmasında, ruminant ve monogastrik

hayvanların selülozda yararlanmalarını artırmak için silaj yapımında

kullanılırlar.

1.4.3.4. Tekstil Endüstrisinde

a) Kumaşlarda boyanın fazlasını almada (biostoning),

b) Bir çok yıkama sonunda pamuk kumaşlardan çıkan

mikrofibrillerin giderilmesinde,


15

c) Pamuk yada pamuklu kumaşların yıkanması, renk parlaklığının

artırılması ve yumuşaklığının geri kazandırılmasında kullanılır. (Bhat ve

Bhat, 1997)

1.5. Ksilanazlar (Xylanase)

Ksilanın kompleks yapısı nedeniyle molekülün tamamen hidrolizi için farklı

enzimlere gereksinim duyulmaktadır. Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına

ksilanolitik enzim sistemi adı verilir. Bu gurupta β-1,4-Endoksilanaz, β-Ksilozidaz,

α-L-araninofuranozidaz, α-Glukuronidaz, Asetil Ksilan Esteraz ve Fenolik asit

(Ferulik ve p-Kumarik asit) esteraz yer almaktadır.

Endo-1,4,-β-Ksilanaz (1,4-β-D-xylanxylanohydrolase, EC. 3.2.1.8)

Endoksilanaz enzimi, ksilan omurgasını rastgele hidrolize ederek depolimerizasyonu

sağlar.

β-Ksilozidaz (β-Xylosidase; 1,4-β-D-Xylosidase; 1,4-β-D-Xylan

Xylohydrolase EC.3.2.1.37) kısa oligosakkaritleri parçalar.

Ksilanda bulunan yan gruplar, α-L-Arabinofuranozidaz, α-D-glukuronidaz,

galaktozidaz ve asetil ksilan esterazlar tarafından molekülden kopartılarak serbest

kalırlar (Şekil 1.1).

Endoksilanazların genel olarak bakteri ve mantarlardan meydana gelen

mikroorganizmalar tarafından üretildikleri bulunmuştur. Bununla birlikte, bitkisel

kökenli endoksilanazların da bulunduğu ve bazı meyvelerin aşırı olgunlaşma dönemi

sonunda üretildikleri saptanmıştır. Su yumuşakçaları dahil bazı gelişmiş hayvanlarda

da ksilan üretiminin gerçekleştiği bildirilmiştir.

Exo-1,4-β-D-Ksilozidaz enzimi (EC.3.2.1.37) indirgen olmayan uçtan D-ksiloz

birimlerini başarılı bir şekilde kopartarak 1,4-β-D-ksilo-oligosakkarit hidrolizini

katalizler. Ksilanın hidrolizi sırasında ksilozun koparılmasını sağlayan

endoksilanazların, β-ksilozidaz tarafından kolayca hidrolize edilebilen ksilobioza

(Xylobiose) karşı aktiviteleri yoktur. α-Arabinofuranozidazlar (EC:3.2.1.55),


16

arabinanların, arabinoksilanların ve arabinogalaktanların indirgenmeyen α-L-

arabinofuranosil ucunu hidrolize ederler.

α-D-Glukuronidazlar (EC.3.2.1.1) ksiloz ve D-glukuronik asit veya 4-0-

metileter arasındaki α-1,2-glikozidik bağlarının hidrolizinde görev yapan

enzimlerdir. Ksilanın enzimatik hidrolizinde α-1,2 bağları, hidrolizi yavaşlatan

bölgelerdir ve α-glukuronidazlar ise farklı substrat ile çalışırlar. Lignin karbohidrat

bağlarına benzer şekilde 4-0-metil glukuronik asit bağları ile odunun

degredasyonunda engeller.

Doğal glukuronidazların hidrolizasyon işleminde tam etki gösterebilmeleri için

esterazlara gereksinim vardır. Bu enzimler, ksilan molekülündeki asetik asit ve

fenolik asit birimlerinin koparılmasını sağlarlar. Asetil, feruloyl ve p-kumoryl

gruplarının ksilandan koparılması, ligninin uzaklaştırılmasında önemli bir

basamaktır. Aynı zamanda hemiselüloz ve lignin arasında ester bağlarının

koparılmasıyla ligninin çözülmesine katkıda bulunurlar (Subramaniyan ve Prema,

2000).

Şekil 1.1: Ksilanın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler ve Etki Bölgeleri

(Beg ve ark,2001)


17

Ksilan hidrolizinde görevli enzimler arasında da sinerjik etkiden söz etmek

mümkündür. Hidroliz sırasında 1,4-β-D-Ksilan omurgasında etkin olan (β-1,4-

Endoksilanaz) ve yan zincirleri koparan enzimlerin aktif olduğu gözlemlenir. Asetil

ksilan esteraz ve endoksilanaz arasındaki sinerjik etki asetil ksilanların

degredasyonunda etkindir.

Asetik asitin asetil ksilan esterazla ayrılması, ksilan omurgasını endoksilanaz

etkisi için uygun duruma getirecektir. Böylece daha hızlı bir hidroliz meydana gelir.

β-ksilozidazlar endoksilanazların inhibisyonuna neden olacak son ürünleri

parçalayarak ksilanın hidrolizasyon düzeyini artıracaktır. Benzer şekilde, α-arabino-

furanozidazların endoksilanazlara eklenmesi arabinoksilanların şekerleştirilmesini

artırmaktadır.

1.5.1. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları

Özellikle mikroorganizmalardan elde edilen ksilanolitik enzimler, birçok

endüstriyel işemlerde biyoteknolojik potansiyellerinden dolayı büyük bir ilgi odağı

olmuştur. Bilhassa kağıt ve kağıt hamuru başta olmak üzere gıda ve hayvan yemi

endüstrisi gibi alanlarda temel endüstriyel enzim olma yolunda çok büyük öneme

sahiptir.

Ksilanazların ekonomik önemi yüksek birçok faydalı ürünün istenilen düzeyde

üretimi için önemli bir potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Tek hücre proteini,

enzimler, sıvı ya da gaz yakıtların üretimi, çözücüler ve şeker şuruplarının üretimi

genel uygulamalar arasındadır (Beg ve ark, 2001).

Ksilanazların kullanımı sadece kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi ile sınırlı

olmayıp aynı zamanda ligno-sellülozik materyallerin dönüşümü, tarımsal atıkların

fermentatif ürünlere parçalanması, meyve sularının berraklaştırılması, biranın

kıvamının gelişimi, hayvan gıdalarının sindiriminin artırılması alanlarında özel bir

öneme sahiptir. Ksilanaz enziminin kullanım alanları arasında;

a) Ksilanazların en ümit verici uygulamalarından birisi, kağıt hamuru

hazırlamada beyazlaştırma ajanı olarak klor kullanımınının azaltılması ve kağıt


18

hamurundan lignini ayırma özelliğidir. Enzim uygulaması kağıt hamurunun

fibrilasyonunu ve su tutuşunu artırır, işlenmemiş kağıt hamurunda çırpma yada

dövme sayısını düşürür, hurda kağıt hamurunda bağları onarır, çözünen hamurdan

ksilanın selektif giderimi sağlar.

Ksilanazlardan ayrıca odun hamurunda biobeyazlatma, sentetik ipek üretiminde

ise hamurdan selüloz eldesinde faydalanılır (Viikari ve ark, 1986; Beg ve ark, 2001).

b) Çavdardan elde edilen yemler ile beslenen et tavuklarında yemden geri

dönüşüm oranı ve kilo kaybı intestinal viskozite ile ilişkilendirilmiştir. Et

tavukçuluğunda çavdar temelli yemlere ksilanaz uygulamaları intestinal viskoziteyi

düşürmüş ve böylece yemden etkin yararlanma, dolayısıyla kilo artışı sağlanmıştır.

Ksilanazların etkinliği ekmek kalitesi artışında da ekmek hacmini artırarak

gözlenmiştir. Bu durum ksilanazlarla birlikte amilazların kullanılmasıyla daha da

artmıştır (Maat ve ark, 1992).

c) Ksilan tarım ve gıda endüstrisi atıklarında bol miktarda bulunmaktadır.

Ksilanaz uygulamaları ile bunlar ksiloza dönüştürülür (Rani ve Nand,1996). Bitki

hücrelerinde ise ksilanaz uygulamaları firosterollerin yağ açilasyonu (fatty acylation)

ve glikozilasyonunu indüklerler.

Tütün süspansiyon hücrelerinin endoksilanazlarla muamele edilmesi,

açillenmiş sterol glikozidlerinin seviyesinin 13 kat artmasına ve fitoaleksinlerin

sentezini sağlamaktadır (Moreau ve ark, 1994).

d) Meyve ve sebzelerin sıvılaştırılması (eritilmesi) ve meyve sularının

berraklaştırılması amacıyla pektinaz ve selülaz ile birlikte aynı anda kullanılır.

Ayrıca kompostlamayı ve ruminantların beslenmesinde sindirimi artırmak amacıyla

yem bitkilerinin ön işleminde kullanılmaktadır (Gilbert ve Hazlewood,1993).

e) Alkil glikozitler yeni surfaktanlar için geleceği en parlak adaylardan biridir.

D-glikoz ve yağ alkolü gibi monomerik şekerlerden üretilirler. Fakat polisakkarit

kullanımı ile doğrudan glikozilasyonu endüstriyel üretim için daha uygundur. Çünkü

polisakkaritlerin hidrolizine ve daha sonraki aşamalara gerek kalmaz. Bu yüzden bu

işlemlerde ksilanaz kullanımı kolaylık arzeden bir fırsat sağlar.


19

f) α-L-Arabinofuranozidaz ve β-D-Glukopiranozidazlar meyve suyu, şarap ve

aroma özütleri için gıda işlemede kullanılırlar. Bazı ksilanazlar bitki hücrelerinden

protoplast üretimi için hücre duvarının yumuşatılmasında da kullanılır.

g) Mannanaz, ligninaz, ksilozidaz, glukanaz, glukozidaz gibi diğer enzimlerle

birlikte ksilanazlar, lignoselülozik materyallerden etanol ve ksilitol gibi biyolojik

yakıt üretimi için kullanılabilir. Etanol üretiminde kullanılacak serbest şekerlerin

üretimi amacıyla, karbohidrat polimerlerinin depolimerizasyonunu takiben lignin,

hemiselüloz ve selülozun ayrıştırılması ile delignifikasyon gerçekleştirilir.

Sonuçta etanol üretimi için pentoz ve heksoz şekerlerinden oluşan karışım

fermentasyon için kullanılır.

h) Ksilanolitik enzim sistemlerinin pektinolitik enzim sistemleri ile birlikte

önemli uygulamalarından biri de, jüt ve kenevir gibi lif bikilerinin reçine benzeri

maddelerden arındırılmasıdır. Ksilanaz-pektinaz kombinasyonu odun işlemede ilk

basamak olan kabuktan arındırma işlemlerinde de kullanılabilmektedir (Beg ve ark,

2001).

1.6. Ekstremofilik Enzimler (Ekstremozimler) Ekstremofilik enzimler sıcaklık, basınç, pH ve tuzluluk gibi ekstrem şartlarda

çalışabilen ve endüstriyel uygulamalar için büyük öneme sahip enzimlerdir.

Mezofilik enzimler enzim stabilitelerindeki eksikliklerden dolayı endüstriyel

enzimlerden istenen zorlu reaksiyon şartları için, pek uygun değillerdir.

Ekstremofilik organizmalar ise ekstrem ortamlarda bulunabilen organizmalar

olup termofil, asidofil, halofil, alkalofil, psikrofil gibi bir çok farklı sınıflar altında

grublandırılabilirler. Dolayısı ile bu organzimalar, mezofillerin yaşamlarını

sürdüremeyecekleri koşullarda aktivite gösteren enzimleri üretebilirler.

Mikroorganizmalar optimum büyüme sıcaklıkları dikkate alındığında

psikrofiller (20oC altında), mezofiller (20-55oC) ve termofiller (55oC üzeri) olmak

üzere üç ana gruba ayrılırlar. Bunlara ilaveten Kristjansson ve Stetter (1992)’

termofil grubu daha da genişletilerek 60-80oC arasında üreyenleri ekstremofil,

80oC’nin üzerinde üreyenler için hipertermofil tanımını kullanılmaktadırlar.


20

Gerek termofilik gerekse hipertermofilik enzimler karakteristik olarak 40oC’nin

altında etkin bir aktivite göstermezler (Gomes ve Steiner, 2004). Sıcaklığa dirençli

proteinlerin amino asit kompozisyonu mezofilik organizmaların amino asit

kompozisyonu ile karşılaştırıldığında glisin yerine alanin, lizin yerine arjinin amino

asitinin sıcaklığa dirençli proteinlerde daha fazla yer aldığı görülmüştür. Aynı

zamanda arjinin termofilik proteinlerin yapısında bol bulunurken sıcaklığa en hassas

amino asit olan sistein bu proteinlerin yapısında daha sınırlı düzeyde bulunmaktadır.

Deneysel çalışmalar hidrofobik interaksiyonların termofilik proteinlerin

stabilizasyonunda önemli bir rol aldığını göstermiştir. Sıcaklığa dirençli proteinler

hidrofobik interaksiyonlarla dimer oluşturarak termal hidrolize karşı daha dirençli

hale geçmektedir. Bunlardan başka sıcaklığa dirençli proteinler disülfit bağları,

molekül içi aromatik yapılar, zengin hidrojen bağları içermekte ve elektrostatik

mekanizmalarla yüksek sıcaklığı tolere edebilmektedirler (Kumar ve Nussinov,

2001).

Deterjan, gıda, yem, nişasta, tekstil, deri, kağıt hamuru, farmasötik endüstrisi,

termofilik enzimlerin en geniş kullanıldığı alanlardır (Gomez ve Steiner, 2004).

Örneğin nişasta endüstrisi, termostabil amilazın en yaygın kullanıldığı alandır.

Halofilik mikroorganizmalar üremeleri için yüksek tuz konsantrasyonuna

ihtiyaç duyarlar. Bunlar dış ortamdaki tuz konsantrasyonu ile izotonik dengenin

kurulabilmesi için NaCl ya da KCl akümülasyonu yaparlar. Halofil ortama uyum

sağlanması halofilik organizmalarda yüksek tuz konsantrasyonunda aktivite gösteren

proteinlerin sentezlenmesiyle mümkün olur. Uyum olayının gerçekleşmesine,

termofiliklerde olduğu gibi, halofilik proteinlerin amino asit kompozisyonlarındaki

farklılık neden olmaktadır.

Halofilik proteinlerin yüzeyinde özellikle glutamik asit ve aspartik asit gibi

asidik amino asitler fazlaca bulunur (Ventosa ve ark, 1998). Halofilik proteinlerin

yüzeylerinde bulunan negatif yüklü yapılar sudaki pozitif yüklü iyonlara sıkıca

bağlanarak, yüzey hidrofobitesini düşürür ve proteinlerin yüksek tuz konsantrasyonu

nedeniyle agregasyonu engellemiş olurlar (Gomez ve Stainer, 2004). Halofilik

proteinler aynı özelliğe sahip olmayan diğer protein yapılarından düşük tuz

konsantrasyonlarındaki stabilitelerinin eksik olması buna karşılık yüksek tuz


21

konsantrasyonlarında çözünürlüklerinin yüksek oluşu ve aktif konformasyonları ile

ayrılırlar.

Alkalifilik mikroorganizmalar alkalifiller ve haloalkalofiller olmak üzere iki

ana fizyolojik gruptan toplanırlar. Alkalifil organizmalar, genellikle üreyebilmek için

8’in üzerinde bir pH’ya ihtiyaç duymaktadırlar. Optimum üreme pH değeri ise 9-10

aralığıdır.

Haloalkalofil organizmalar ise üreyebilmek için hem 8 ve daha yüksek pH

ortamına hem de yüksek tuz konsantrasyonuna ihtiyaç duyarlar. Alkalifilik

enzimlerin başlıca uygulama alanı deterjan endüstrisidir. Ayrıca deri

işletmeciliğinde, tabaklama uygulamaları ile derideki kılların uzaklaştırılması

amacıyla kullanılmaktadırlar (Horikoshi,1999).

1.7. Bacillus Cinsi

Gram pozitif, çomak şekilli, sıcağa dirençli endosporlara sahip ve aerobik

şartlarda üreyebilen mikroorganizmalar Bacillus cinsi içerisinde sınıflandırılırlar.

Endospor oluşturan bakterilerden obligat anaerobik olanlar ise Clostridium cinsi

mikroorganizmalardır. Bacillus cinsi bakterilerin bu özellikleri nedeniyle, cins

düzeyinde tanımlanması ve izolasyonları oldukça kolaydır.

Tek ya da çok sayıda hücreden oluşan uzun zincirler meydana getirebilirler.

Hücrede bulunan sporun şekli ve yeri, türler arasında farklılık gösterir. Sporlar

genellikle silindirik, elipsoidal, oval ya da yuvarlaktır. Sporun hücre üzerindeki

konumu ise merkezde, merkeze yakın veya uçta bulunabilir (Lennete ve ark,1985).

Bacillus’ların tanımlanması ve türler arasındaki farklılıkların belirlenmesinde spor ve

konumları temel alınabilmektedir.

Bazı türler fakültatif anaerob özellikte olsalar ve oksidaz testleri değişkenlik

gösterse de, daima katalaz pozitiftirler. Bilinen birkaç tür hareketsizdir. Tür

düzeyinde tanımlamada önemli bir yer tutan spor şekilleri ve konumları, faz-kontrast

veya spor boyama ile kolayca saptanabilir.


22

Bu cinse ait bakterilerin çoğunun tanımlanması, hala klasik biyokimyasal

testlerle yapılabilse de, bu işlemin hem çeşitli olumsuzlukları vardır hemde oldukça

iş yüküne neden olmaktadır.

Koloni özellikleri genellikle çevresel faktörlere göre değişebilmektedir.

Kültürün ürediği besiyerinin bileşimi ve inkübasyon sıcaklığı gibi etmenler, koloni

büyüklüğü ve mofolojisini değiştirebilir. Katı besiyerlerinde genellikle daha geniş ve

şekilli koloniler oluşturmaları, ön tanımlama için büyük yarar sağlamakadır. Koloni

morfolojilerine göre seçilen örnekler biyokimyasal testler kullanılarak tanımlanırlar.

Günümüzde, API ve VITEK teknikleri kullanılarak tanımlama

yapılabilmektedir. Bu sistemlerin temeli, sistemde kayıtlı referans organizmalar ile

doğal organizmanın biyokimyasal özellikleri bakımından karşılaştırılması esasına

dayanmaktadır.

Bacillus’ların teşhisinde kullanılabilen bir diğer uygulama ise yağ asiti

kompozisyonu temeline dayalı tanımlama sistemleridir. Bu yöntem, hücresel yağ

asitleri metil-esterlerinin (FAME) Gaz-Chromatografisi (GC) ile analizi ve referans

değerler ile karşılaştırılması esasına dayanmaktadır.

Belirtilen yöntemlerin yanısıra günümüzde, moleküler tanılama şeklinde de

adlandırılan ve 16S rRNA/DNA sekans analizi esas alınarak gerçekleştirilen ileri

tanımlama yöntemleri de kullanılmaktadır. Bu teknik ağırlıklı olarak filogenik

çalışmalarda tercih edilmektedir (Barrow ve Feltham,1993).

1.8. Elektroforez Uygulamaları

İyonlaşabilir gruplara sahip amino asitler, peptidler, proteinler, nükleotidler ve

nükleik asitler gibi biyolojik moleküller, ayırıcı bir ortamın bulunduğu elektriksel

alanda, sahip oldukları elektrik yüküne bağlı olarak, anod veya katoda bölgesine göç

ederler. Moleküller aynı yüke sahip olsalar dahi, molekül ağırlık farklılığı nedeniyle

sahip olunan yükün molekül ağırlığına oranı (yük/kütle) farklı olacaktır. Bu

farklılıklar sayesinde solüsyon içindeki iyonlar bir elektriksel alana tabii

tutulduklarında moleküllerin göçüne yönelik farklılıklar ortaya çıkar.


23

Elektroforez için gereken gereçler güç kaynağı ve elektroforez tankından

oluşur. Güç kaynağı elektrodlar arasında doğru akımın dengeli ve düzgün şekilde

akışını sağlayarak elektriksel alanın istenilen özellikte oluşmasını neden olur.

Elektriksel alanda sürekli olarak, pozitif yüklü moleküller negatif kutba, negatif

yüklü moleküller pozitif kutba doğru göç ederler.

Örnekler elektroforezin düzgün gerçekleşmesi için tampon içinde çözülürerek

hazırlanmalıdır. Ayrıca elektroforzde istenilen başarının elde edilmesi için ayırıcı

ortamın mutlaka elektroforez tamponu ile hazırlanması şarttır. pH değişikliği

elektroforezi yapılan molekülün iyonik yükünü değiştirebileceğinden, tampon

pH’sının stabil tutulması önemlidir.

Ayırıcı ortam olarak filtre kağıdı, selüloz asetat, agaroz, nişasta, agar veya

poliakrilamid gibi sitemler kullanılabilir. Her sistemin ayırma gücü bir birinden

farklılık gösterir. Elektroforez işlemi ayırıcı ortamın konsantrasyonu, ortam sıcaklığı,

uygulanan akımın türü ve şiddeti, kullanılan tamponun iyonik gücü, elektroforez

süresi, molekül şekli ve ağırlığı gibi parametrelerden etkilenmektedir.

Elektrodlar arasındaki akımı genel olarak tampon iyonları az bir kısmı örnek

iyonları iletilir. Voltajdaki iletilen toplam yükün artışına neden olur. Sıcaklık artışı

elektroforez sırasında direncin düşmesine neden olur. Isı artışı tomponun

buharlaşmasına neden olduğunda iyonik gücün değişmesine yol açar.

Elektroforez düzeyi örneğin net elektriksel yükü arttıkça artacaktır. Diğer

taraftan molekül büyüklüğü arttıkça göç oranı düşecektir. Örnekler aynı molekül

büyüklüğüne sahip olsalar bile moleküllerin globüler ya da fibröz oluşu moleküllerin

göçünde farklılığa neden olacaktır. Elektroforez işlemi, kullanılan tamponun bileşimi

ve iyonik yükünden farklı şekilde etkilenir. Yaygın olarak kullanılan tamponlar

agaroz için tris-asetat, tris-fosfat ve tris-borat, poliakrilamid için tris-glisin

karışımlarıdır.

Örnekle bağlanma davranışı göstermeyen tamponlar molekülün göç oranını

değiştirirken, karbonhidratların analizinde kullanılan borik asit tamponu moleküle

bağlandığı için elektroforezde olumsuzluğa yol açar. Aynı şekilde tamponun iyonik

gücü artarsa, tampondan geçen elektrik akımıda artacaktır. (Wilson ve Goulding,

1986).


24

1.8.1. Jel Elektroforezleri

Ayırıcı ortam olarak jellerin kullanılmaya başlanması, nükleik asit ve protein

gibi büyük moleküllü maddelerin seperasyonunda “düşük voltajlı ince tabaka

elektroforez” sistemlerinin devre dışı kalmasına sebep olmuştur. Suda çözünmez,

hidrofilik ve yarı-katı kolloid yapıda olmaları gibi fiziksel özellikleri tercih

edilmelerinde önemli faktörleri oluşmuştur. Nişasta, agar ve poliakrilamid jel

elektroforez uygulamalarında kullanılan malzemeler olup, kullanmadan hemen önce

hazırlanırlar.

Nişasta jeller, uygun tampon içerisinde kısmen hidrolize olmuş nişasta karışımı

ısıtılıp soğutularak hazırlanır. Nişastanın amilopektin bileşeni dallanmış zincirlerinin

sarılmaları ile yarı katı jelin oluşumu sağlar. Nişastanın moleküler elek özelliğinde

olması, fizyolojik aktif proteinler ve kompleks yapısal molekül karışımlarının

analizinde tercih edilmelerine neden olmuştur.

Agar ucuz, toksik olmayan, zararsız bir malzeme olup agaroz ve

agaropektinden oluşmuştur. Agar tampon içerisinde kaynatılarak çözülürken ortam

sıcaklığı 40oC ye düşürüldüğünde katılaşarak jelleşir. Geniş por çapına sahip

olmaları nedeniyle elektroforez esnasında iyonların hareketi çok hızlı

gerçekleşmektedir.

Bu özellik makromoleküllerin separasyonunu için bir avantajdır. Agar,

separasyondan sonra boyama için çok uygun bir materyal olup, özelleklikle difüzyon

direncinin düşük olması nedeniyle, immünelektroforez uygulamalarında fazlaca

tercih edilmektedir. Saflaştırılmış agaroz jel saf halde izole edilmiş nükleik asit

yapılarının analizi için yaygın bir kullanım alanına sahiptir.

Poliakrilamid jeller oldukça toksik kimyasal bileşiklerle hazırlanır. Akrilamid

monomerleri (CH2=CHCONH2) taze hazırlanmış amonyumpersülfat ve TEMED

(Kimyasal katalizör sistemi) varlığında genellikle N,N-metilenbisakrilamidin

(CH2(NHCOCH=CH2)2) çapraz bağlanmaları ile polimerize olurlar. Moleküler

oksijenin polimerizasyonu inhibe etmesi nedeniyle monomer, tampon ve su

sistemine AMPS ve TEMED in ilavesinden önce degaz işlemi gerçekleştirilir. Bu


25

amaçla karışım vakum pompası ya da vakumlu desikatörde veya ultrasonik su

banyosunda 5 dakika bekletilir.

Jelin dökümünden hemen sonra üst yüzeydeki yüzey gerilimi nedeniyle

meydana gelen eğimli yüzey oluşumunun separasyonu olumsuz etkilemesi ve

atmosferik oksijen difüzyonunun engellenmesi için jelin üst tabakası distile su veya

suya doyurulmuş bütanol ile kapatılır. Jelin polimerizasyonunda riboflavin ve

TEMED sisteminden yararlanılacaksa (foto-polimerizasyon) reaksiyon ışık altında

gerçekleştirilir (Wilson ve Goulding, 1986).

Akrilamid jel uygulamaları Kesiksiz (Continuous) ve Kesikli (discontinuous)

olmak üzere iki farklı şekilde gerçekleştirilebilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel

vardır ve tanklarla jelde aynı tampon kullanılır. Kesikli sistemde ise jel, farklı

tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur. Büyük porlu stacking (dengeleme jeli)

ve küçük porlu separating (ayırıcı) jel şeklindedir.

Jelin porlarının büyüklüğü/küçüklüğü akrilamid monomerinin konsantrasyonu

ile değişir. Jeller mevcut akrilamidin toplam yüzdesi ile %3 ila %30 arasında bir

konsantrasyonda hazırlanabilir. Düşük konsantrasyonlarda geniş por yapıları oluşur

ve büyük moleküllerin separasyonu için tecih edilir.

Proteinlerin seperasyonu çoğunlukla %5 ile %15 lik jellerde

gerçekleştirilmektedir. Benzer yüklere sahip olsalar bile farklı şekil ve büyüklükteki

moleküllerin analizinde çok uygun bir elektroforez tekniğidir.

Elektroforetik separasyon sonunda proteinler ya doğrudan jel içerisinde ya da

sabit bir yüzeye (örn: nitroselüloz veya naylon membran) aktarıldıktan sonra saptanır

ve analiz edilir. Protein bandlarının görünür hale getirilmesinde en uygun yöntem

boyamadır. Jeldeki proteinler genellikle Coomassie Brillant Blue veya Gümüş Nitrat

ile filtreye emdirilmiş proteinler ise amido black ve ponceau S gibi boyalarla

boyanır.

Boyama sonunda bir birinden ayrılmış proteinler jel ya da membran üzerinde

bantlar şeklinde görünürler. Herhangi bir yöntemle boyanmış protein bantlarının

bulunduğu jel çeşitli çözeltiler içinde birkaç ay veya jel kurutma aletinde

kurutulduktan sonra yıllarca saklanabilir. Ancak görüntünün kalıcı olması açısından

en pratik yol fotoğrafının çekilmesidir. Ayrıca görüntünün bir bilgisayar ortamına


26

aktarılması veya spektrofotometrik ölçüm temeline dayanan bir densitometre ile

analiz edilmeside mümkündür. Bu temele göre çalışan ve renkli bölgelerin jeldeki

konumunu ve alanını standartlar ile karşılaştıran jel görüntüleme sistemleri ile

günümüzde geniş bir kullanım alanı bularak nitel analiz yanı sıra nicel analiz yapmak

da mümkün olmaktadır (Temizkan ve Arda, 2004).

Proteinlerin elektroforez uygulamaları farklı amaçlara göre denatüre veya

native (Doğal) jel elektroforezi olmak üzere iki şekilde gerçekleştirilir. Denatüre

jeller SDS veya üre gibi denatüre edici ajanların jel içerisine karıştırılması ile

hazırlanırlar. Bu tür uygulama başta molekül ağırlık belirlenmesi olmak üzere,

proteinlerin saflıklarının araştırılması, konsantrasyonlarının tanımlanması ve enzim

aktivitelerinin saptanmasına olanak verir (Hames ve Rickwood,1996).

1.8.2. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)

Proteinlerin molekül ağırlıklarını belirlemede en yaygın kullanılan yöntem

poliakrilamid jel elektroforez tipidir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) bir anyonik

deterjan olup, proteinlere sıkıca bağlanarak proteinlerin denatürasyonunu sağlar.

Yaklaşık 1 g proteine 1.4g SDS bağlanır. Proteinler, birim kütle başına sabit negatif

elektriksel yük kazanırlar. Yani SDS, protein molekülünde her üç aminoasitlik

birime bağlanarak proteinlere homojen negatif bir yük kazandırır. Böylece proteinler

yük bakımından eşitlendiği için moleküler ağırlıklarına göre separasyonları

geçekleşecektir.

Oluşan SDS-protein kompleksi elektroforez sırasında anoda doğru göç ederler.

Jelin moleküler elek özelliğinden dolayı belirli bir sürede katettikleri mesafe

moleküler ağırlığa göre proteinden proteine farklılık gösterecektir. Moleküler ağırlığı

bilinen standart bir protein ile analizi yapılacak örnek aynı ortamda yürütülecek

olursa, örnek proteinlerin moleküler ağırlıkları bulunabilir. Standart SDS-PAGE

uygulamaları dikey elektroforez şeklinde gerçekleştirilir.

Protein örnekleri genellikle pH’sı 6,8 olan örnek hazırlama tamponu içinde

çözülür. Bu tampon denatüran olarak SDS, disülfit bağlarını indirgeyen β-


27

merkaptoetanol, yoğunluk oluşturan sükroz veya gliserol ve bromfenol mavisi

içermektedir.

Elektroforez uygulamasında kullanılan jel, genellikle stacking (Dengeleme) ve

separating (ayırma) jeli olarak iki kısımdan oluşur. Her iki jel de içerdikleri akrilamid

konsantrasyonları bakımından birbirlerinden farklılık gösterir. Bu iki jeldeki pH ve

konsantrasyon farklılığı sayesinde, protein karışımlarının birbirlerinden ayrılması ve

belirgin bandlar oluşması sağlanır.

SDS-PAGE uygulamalarının diğer bir şekli gradient jellerdir. %5 ila %25

arasında dikey pozisyonda hazırlanan jel içerisinde, aşağıdan yukarı doğru jel

konsatrasyonunun farklılaşması söz konusudur. En altta en yoğun jel tabakası

oluşurken en üstte yoğunluğu en düşük tabaka meydana gelir. Bunun sonucunda elde

edilen jelin en üst tabakasındaki por çapı en geniş, en alt tabakasındaki por çapı ise

en dar olmuş olur.

Gradient SDS-PAGE uygulaması ile homojen jelde tek bir band şeklinde

görülen, moleküler ağırlığı bir birine çok yakın protein yapıları birbirinden ayrılarak

ayrı ayrı bandlaşma meydana gelir.

İki boyutlu (two-dimesional) jeller kompleks protein karışımlarınının yüksek

bir resolüsyon oranı ile ayrılmalarını sağlar. Örnekler birinci boyutta izoelektrik

fokuslama ile izoelektrik nokta farklılıklarına göre kısmen separe edilirler. İkinci

boyutta örnekler, SDS-PAGE ortamında separating jel ortamına doğru yürütülerek

moleküler büyüklüklerine göre ayrıştırılırlar.

İzo Elektrik Fokuslama (IEF) tekniğinde aminoasitler ve peptidler gibi

amfoterik yapıların hem voltaj hem de pH gradientinin olduğu bir alanda

elektroforetik analizleri gerçekleştirilir. Bu yöntemde jelin her noktasında pH

gradienti oluşturmak için izo elektrik noktaları belli olan düşük moleküler ağırlıklı

amfolitler kullanılır.

Bellirli pH aralıklarının oluşmasını sağlayan bu bileşikler sentetik alifatik

poliamino polikarboksilik asit yapısındadırlar. Düşük pH gradienti anod bölgesinde

oluşur. Başlangıçta izo elektrik noktalarının altında bir pH da bulunan maddeler,

pozitif olarak yüklenecekler ve katoda doğru ilerleyeceklerdir. İzo elektrik nokta

değerine bağlı olarak çevresel pH’sı kademeli olarak yükselecektir.


28

Net yükün yok olduğu, yani zwitterion formunda, proteinler daha fazla hareket

yapmayacaklardır. Diğer taraftan zıt reaksiyon izo elektrik noktasının üzerinde bir

pH’da bulunan maddeler de negatif yük kazanarak net yüklerinin dengede olduğu

ana kadar anoda doğru hareket edeceklerdir. Bu teknik izo enzim separasyonunda

oldukça kullanışlıdır. İzo elektrik noktalarındaki 0.01 ünitelik pH farklılığı

separasyon için yeterlidir.

1.8.3. Doğal (Native) Jel Elektroforezi

Doğal jel elektroforezinde kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer denatüre

edici ajanları içermediğinden, işlemler doğal şartlarda gerçekleştirilir. Fazla sayıda

protein içeren karışımların bir birinden ayrılmasında, bir protein ya da protein

kompleksinin aktivite veya yapısı ile ilgili elektroforetik çalışmalarda, protein saflık

kontrolü ve proteinin denatüre olup olmadığının saptanmasında kullanılır.

Doğal jel elektroforez uygulamasında, örneklerin molekül ağırlıkları hakkında

kesin bir bilgi edinmek mümkün değildir. Bunun nedeni, molekül büyüklüğünün

yanında molekül şekli ve yükünün de ayrımı etkilemesidir (Wilson ve Goulding,

1986; Hames ve Rickwood, 1996;Temizkan ve Arda, 2004).

1.9. Protein İzolasyonu

Proteinler doğada diğer moleküllerle beraber karışık olarak bir molekül

havuzunda ya yapısal veya işlevsel bir birliktelik içinde bulunurlar. Böyle bir

ortamda bir proteinin fizikokimyasal yapısını ve işlevini doğru bir şekilde

tanımlayabilmek hemen hemen imkansızdır. Yapı, fonksiyon ve bazı aktivitelerin

belirlenmesi çalışmalarında saf proteinlere ihitiyaç duyulur. Ayrıca bazı endüstriyel

üretim süreçleri de tamamen saflaştırılmış proteinlerle yürütülmektedir.

İzolasyon protokollerinin çoğu, istenen seviyede bir saflığın elde edilebilmesi

için birden fazla basamak gerektirmektedir. Örnekler kolay elde edilebildiklerinde az

miktarda kimyasal bileşik ekleyerek veya birkaç kez tekrarlanmak suretiyle

saflaştırma yapılabilir. Her bir basamak bir miktar ürün kaybına neden olur. Proteini


29

denatürasyon ve inaktivasyondan korunmak için çalışmanın her aşamasında pH ve

sıcaklık kontrol altında tutulmalıdır.

Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin genellikle +4oC’de yapılması ile önlenir.

pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış

tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerde tutulur.

Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle ve ne kadar saflaştırma

yapılacağına karar vermeden önce materyal, çalışılacak protein tipi ve miktarı gibi

kriterler göz önünde bulundurulmalıdır. İzolasyonu yapılacak protein kaynağı

hayvansal, bitkisel veya mikrobiyal olabilir. Her üç kaynak için farklı izolasyon

protokolünün izlenmesi gerekir.

Örneğin bitkisel proteinlerle çalışmak zordur. Çünkü açık arazide

gerçekleştirilen üretimde, mevsimsel değişikliklerin protein içeriklerini etkilemesi

farklılıklara yol açacağı için, sera veya bitki büyüme odalarında yetiştirilen bitkilerle

çalışmak daha avantajlıdır. Yaprak ve tohumlar protein izolasyonunun nisbeten kolay

olduğu bitki yapılarını oluştururken, birçok enzimin bulunduğu sitoplazma toplam

hücre hacminin ancak %1-2 sini kapsar. Bu nedenle, bitkisel özütler çok az miktarda

tamponlarla hazırlansalar bile, elde edilen protein miktarı oldukça düşüktür.

Mikroorganizmalarla yapılan çalışmalarda, kullanılacak organizmaların belli ve

sabit koşullarda üretilmesi gerekir. Algler, küf mantarları, mayalar ve bakteriler için

özel üretme ve izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. En önemli sorun, üremenin

çeşitli fazlarında protein kompozisyonlarının farklı olmasıdır.

Bu nedenle, bakteriler ve diğer tek hücreli organizmalarla çalışılırken, protein

izolasyonu genellikle logaritmik üreme fazındaki organizmalardan yapılır.

Protein izolasyonunun ilk aşamasındaki işlemler, söz konusu proteinin hücrenin

içindemi yoksa dışında mı olduğuna, içindeyse bulunduğu yere göre farklılık

gösterir.

Çalışılacak molekül ekstraselüler yani sentezlendikten sonra hücre dışına

salınan ve aktivitesini orada gösteren bir enzim ise, kullanılacak yöntem oldukça

basittir. Bu işlemlerde bitki, hayvan veya hücre içi protein izolasyonlarında

yapılması zorunlu olan dokuların parçalanması, hücrelerin lizi edilmesi ve gereksiz


30

maddelerden kurtulmak amacı ile gerçekleştirilen sentrifügasyon işlemlerine gerek

kalmadan, hedef protein, hücrelerin ürediği substrat ortamından izole edilebilir.

Bacillus cinsi bakterilerde, organizma substratın bulunduğu ortama aşılandığı

andan itibaren enzim sentezi başlar ve sentezlenen enzimler hücre dışına salınır.

İstenilen üreme fazına ulaştıktan sonra, santrifüjleme veya filtrasyon tekniği

kullanılarak bakteri ve oluşan ürün birbirinden ayrılır. Salgılanan enzim

organizmanın uzaklaştırılması sonucu elde edilen üst sıvıda (Süpernatant) bulunur.

Enzim üretimi sonunda hücrelerin ortamdan uzaklaştırılması amacı ile katyonik

bir polielektrolit olan chitosandan da yararlanılmaktadır. Bu bileşik ortamdaki

mikroorganizmalara yapışarak yumak oluşumna neden olur. Oluşan yumak çökerek

ürünün bulunduğu sıvı fazdan ayrılır (flokulasyon).

Hedef proteinlerin süpernatant içerisinden izolasyonu ürünün su ve diğer küçük

moleküllü yapılardan kurtarılmasıyla olur. Sonuçta proteinler daha konsantre hale

gelir ve çözelti hacmi daha azalmış olur. Dolayısı ile birim hacimdeki protein miktarı

artar. Daha iler saflaştırma işlemleri ve daha küçük hacimde örnekle çalışmak,

kimyasal madde kullanımını azaltacak işlemleri kolaylaştıracaktır.

Yoğunlaştırma işlemi, ultrafiltrasyon veya diyaliz yöntemi kullanılarak küçük

moleküllü yapıların uzaklaştırılması, liyofilizasyonla ile suyun uçurulması ve çeşitli

kimyasallarla proteinlerin çöktürülmesi/presipitasyonu teknikleri kullanılarak

gerçekleştirilir.

Ultrafiltrasyon tekniğinde, su ve diğer küçük moleküller santrifüjleme veya

yüksek basınç altında yarı geçirgen bir zardan geçirilerek proteinler konsantre hale

getirilir.

Diyaliz yönteminde ise seyreltik protein çözeltilerinin dializ torbalarına

doldurulması ve konsantre edilmeleri söz konusudur. Konsantrasyonu sağlanacak

protein çözeltisi diyaliz tüpüne konduğunda örneğin üst kısmı toz halde polietilen

glikol (PEG), sephadex G-25 veya karboksimetil selüloz ile tamamen kapatılarak

suyun örnekten uzaklaşması sağlanır. Dializ işlemi, aynı zamanda saflaştırma işlemi

sırasında ortamdaki tuzların uzaklaştırılması içinde kullanılmaktadır.

Dondurarak vakumda kurutma tekniği şeklinde de tanımlanan Liyofilizasyon

yönteminde, dondurulmuş protein çözeltisi yüksek vakum altında bırakılarak,


31

donmuş haldeki suyun sıvı hale geçmeden buharlaşması ve örneğin toz formunda

geri kazanımı gerçekleştirilir. Bu işlemden önce çözeltide bulunan tuzların diyaliz ile

uzaklaştırılması gerekmektedir.

1.9.1. Çöktürme ile Proteinlerin İzolasyonu

Çöktürme yöntemi, proteinlerin çözeltiden ayrılması ve yoğunlaştırılması için

kullanılan en yaygın metoddur. Presipite edilmiş proteinlerin, az miktarda ve uygun

bir tampon içerisinde çözülmesi sonucu daha konsantre protein örneği elde edilmiş

olur. Çöktürme uygulamalarında, trikloroasetik asit (TCA), aseton, etil alkol, metil

alkol veya amonyum sülfat gibi tuzlarla polietilen glikol (PEG) gibi organik

polimerler kullanılır.

1.9.1.1. TCA ile Çöktürme

Kuvvetli bir asit olan TCA, proteindeki amino asitlerin yan zincirlerindeki

iyonik grupların yüklerini değiştirerek iç elektrostatik dengeyi bozar ve proteinin

denatürasyonuna yol açar. Denatüre olan proteinler, çözünürlükleri değişeceğinden

çökerler. Eğer çalışmada denatürasyonun önemi yoksa TCA çöktürülmesi uygulanır.

1.9.1.2. Nötral tuzlar ile Proteinlerin Çöktürülmesi

Nötral tuzlar kansantrasyona bağlı olarak proteinler arasında elektrostatik ve

nonpolar (hidrofobik) etkileşimle etkilerini gösterirler. Birçok protein, seyreltik tuz

çözeltilerinde yüksek düzeyde çözünme özelliğine sahiptirler. Bununla birlikte, sulu

otamda konformasyonu etkilemeyen yüzeylerindeki elektrostatik yüklerden dolayı

(agregasyonu önlemeyecek düzeyde) çok az çözünürler.

Proteinlerin çözünürlüğü yüzeydeki elektrostatik kuvvetleri nötralize edecek

miktarda (0.1M) tuz ilavesi ile artırılabilir. Diğer taraftan, 0.2 M’dan daha yüksek tuz

konsantrasyonları, sadece proteinin yüzeyindeki elektrostatik güçleri nötralize etmez,

aynı zamanda su moleküllerinin proteinden uzaklaşmasına neden olur. Böylece iyon

konsantrasyonu yeterince yüksek olduğu zaman, proteinler diğer protein molekülleri


32

ile ilişkiye girerek, yüzey yüklerini nötralize etmeye yönelirler. Su molekülleri ile

olan bu rekabet çeşitli tuzlar, organik çözücüler ve PEG gibi nötral polimerlerle

gözlenen presipitasyonu açıklamaktadır (Scopes, 1982;Temizkan ve Arda, 2004).

Suda yüksek düzeyde çözünebilirliği, düşük çözelti sıcaklığı, ucuz ve saf halde

bulunma gibi nedenlerden dolayı, proteinlein presipitasyonda en fazla kullanılan tuz,

amonyum sülfattır. Ayrıca amonyum sülfatın birçok protein üzerine koruyucu etkisi

vardır. Genellikle işlemlerin düşük sıcaklıklarda yürütülmesine gerek yoktur.

Presipite olmuş proteinin eldesi santrifüjle gerçekleştirilir.

Amonyum sülfat gibi tuzlarla proteinlerin konsantrasyonu, ya bulk

presipitasyon ya da fraksiyonlu presipitasyon şeklinde gerçekleştirilebilir.

Proteinlerin bazıları çözeltideki amonyum sülfat konsantrasyonu %25 olduğunda

presipite olurken, bazı proteinler ise, amonyumsülfat konsantrasyonu ancak %75

düzeyine ulaştığında presipite olmaktadırlar.

Hedef proteinin hangi konsantrasyonda presipite olduğunun saptanması,

sonraki izolasyon çalışmalarında uygulamanın standart duruma getirilmesini

sağlayacaktır. Gerekli amonyum sülfat miktarı hesaplanarak süpernatanta kademeli

olarak eklenip, hedef protein bulk presipitasyon şeklinde çöktürülür.

Fraksiyonlu presipitasyon metodunda ise değişik konsatrasyonda amonyum

sülfat tartılarak çözeltiye eklenerek, kullanılan her farklı konsantrasyon

uygulamasında çöken proteinlerin ayrı ayrı izolasyonu sağlanır.

Santrifüjleme ile çöken proteinler ortamdan izole edilerek geri kazanılır. Bu

işlem sonunda %20-%80 lik konsantrasyonlardaki presipitatlar ayrı ayrı toplanarak

hedef proteinin hangi fraksiyonda olduğu belirlenir. Böylece örneğin izole edildiği

tuz konsantrasyonundaki fraksiyonlar daha saf elde edileceklerdir. Örneğin %50 lik

amonyumsülfat ile çöktürülen protein, daha düşük veya daha yüksek

konsantrasyonda çöken diğer proteinlerden de ayrılmış olurlar.

Tuz çöktürme yöntemiyle izole edilen proteinler, pratikte kullanılmadan önce

dializ tekniği kullanılarak tuzdan kurtarılmak zorundadırlar.


33

1.9.1.3. Organik Çözücülerle Proteinlerin Çöktürülmesi

Etanol, metanol ve aseton gibi organik çözücülerin hedef proteinlerin

bulunduğu çözeltiye eklenmesi, protein presipitasyonuna sebeb olur. Ana etki su

aktivitesini düşürme şeklindedir. Elektrik yüküne sahip hidrofil enzim molekülü için

suyun çözücü gücü, organik çözücünün ortamdaki konsantrasyonu arttıkça

azalacaktır. Bu durum, çözücünün dielektrik sabitesinin indirgenmesi veya basitçe

suyun kütlesel yer değişimi ile açıklanabilir.

Proteinin yüzeyindeki hidrofobik bölgelerin kısmen daha fazla çözünürlüğünü

ortaya çıkarır. Agregasyon olayı ise muhtemelen proteindeki elektrostatik ve dipolar

van der Waals kuvvetlerinden kaynaklanmaktadır. Genel olarak düşük molekül

ağırlıklı proteinler için daha yüksek konsantrasyonda çözücü gerekir. Ayrıca sıcaklık

artışıyla birlikte denatürasyon artacağından (10oC’nin üzerinde denatürasyon hızı

artar), çalışmalar 0-4oC de gerçekleştirilmelidir.

1.9.1.4. Non-İyonik Organik Polimerlerle Çöktürme

Polietilen glikol (PEG), dekstran ve polivinilpirolidon gibi non-iyonik lineer

polimerler, oda sıcaklığında kullanılabilmeleri ve proteinleri stabilize etmelerinden

dolayı, proteinlerin çöktürülmesinde tercih edilmekedirler. Bunların arasında PEG

çözeltideki proteinin denatürasyonuna izin vermemesi ve daha az viskoz olması

nedeniyle en uygun olanıdır.

Protein presipitasyonunda en fazla kullanılan PEG tipi, PEG-6000 ve PEG-

20000 türevleridir. Proteinlerin davranışı organik çözücülerle gerçekleştirilen

presipitasyondakine benzer şekildedir. Fakat protein fraksiyonundan PEG’ün

uzaklaştırılması, organik çözücü veya tuzların uzaklaştırılması kadar kolay değildir.

PEG polimer olduğu için molekülün diyalizle ortamdan uzaklaştırılması

oldukça zordur. Örneğin bu amaçla sephadex G25 kolonu kullanılsa da, istenilen

sonucu elde etmek oldukça zordur. Bununla birlikte az miktardaki PEG kalıntısının

çeşitli uygulamalarda zarar vermediği belirtilmektedir. Genellikle presipitasyon


34

%20’ nin altındaki konsantrasyonlarda gerçekleşir. PEG’in uzaklaştırılması tuz

destekli faz separasyonu ile gerçekleştirilebilir

Bu aşamaya kadar kısmen saflaştırılan proteinler için, kullanım alanının

özelliğine göre istenirse, tam saflaştırma işlemi yapılır. İleri saflaştırma uygulaması,

proteinin toplam elektrik yükü, büyüklük ve şekli, sahip olduğu hidrofilik grupları ve

kullanılan sabit faz ile bağlanma kapasitesi gibi farklı özelliklerinden biri temel

alınarak, kromatografik yöntemlerle gerçekleştirilir. Bu yöntemlerden en çok

kullanılanı kolon kromatografisidir.

Kolon Kromatografisi, dolgu maddesi ile doldurulmuş musluklu veya benzer

bir mekanizmaya sahip basit bir cam boruda gerçekleştirilir. Protein çözeltisi uygun

bir elüsyon (Proteinin separasyonuna imkan verecek hareketli tampon) çözeltisi

yardımıyla kolondan geçirilir. Kolondaki dolgu maddesinin porları ile bir etkileşim

gösteren proteinler, hareketli faz ile etkileşimi olanlara göre daha yavaş hareket

ederler ve belli zaman aralıklarında veya hacimlerde fraksiyonlar halinde toplanarak

tam saflaştırmalar gerçekleştirilir. (Scopes, 1982; Temizkan ve Arda, 2004)

1.10. Kromatografi

Bir karışımın bileşenlerini, iki ya da daha çok fazdan oluşan sistemler

arasındaki göç farklılıklarına bakarak tanımlamak ve niceliklerini belirlemek

amacıyla yapılan bir analitik ayırma işlemidir. İlk olarak bir Rus bilim adamı Mikhail

Semyonovich Tsvet tarafından bitki pigmentlerini ayırma metodu olarak geliştirilmiş

ve ismini oradan almıştır. Günümüzde son derece duyarlı ve etkin bir yöntem olarak

geçerliliğini sürdürmektedir.

Genel olarak kromatografi molekül büyüklüğü, şekil, elektrik yükü, uçuculuk,

çözünürlük veya yüzeye tutunabilme (adsorptiviti) gibi fiziksel özelliklerdeki

farklılıklar temelinde bir karışımın bileşenlerine ayrılmasında kullanılır.

Ktomatografik sistemin temel bileşenleri, sabit faz, kromatografik yatak, hareketli

faz, dağıtım sistemi ve bazı durumlarda tespit sisteminden meydana gelir. Sabit faz,

destek matriksle tutulmuş katı, jel veya immobilize sıvıdır. Hareketli faz ise

kromatografik yatakta, sabit faz boyunca bir sıvı veya bir çözücü olarak etki eden


35

gazdan oluşur. Test materyalini izlemek ve tespit etmek için mevcut otomatik veya

yarı otomatik olabilen bir sistemdir (Temizkan ve Arda, 2004).

Saflaştırılacak malzeme, sabit faz üzerinde hareket ederken, karışım içindeki

moleküllerin sabit fazla etkileşimleri farklı olur. Sabit faz ile sıkı ilişki gösteren

moleküllerin hareketi, daha zayıf ilişki gösteren moleküllerinkine göre sabit faz

boyunca daha yavaş bir ilerleme gösterir. Böylece farklı tipteki moleküller destek

materyali boyunca hareket ederken birbirlerinden ayrılırlar.

Kromatografik ayırma işlemleri, cam yada benzer malzemeler üzerine

sabitlenmiş silika (Thin Layer Chromatography/İnce Tabaka Kromatografisi , TLC),

uçucu gazlar (Gaz Kromatografisi), Kağıt (Kağıt Kromatografisi) ve hidrofilik

çözünmez molekülleri içerebilen sıvı (Likit Kromatografisi)’lar dahil, bir çok destek

malzemesi ile gerçekleştirilebilir (Erich,1975).

1.10.1. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC)

Kimyasal bileşikleri ayrımak için yaygın olarak kullanılan kromatografi

yöntemidir. Genellikle bir yüzey üzerine tutturulmuş silika jel, alüminyum oksit ya

da selüloz gibi ince bir adsorbent tabakadan oluşan sabit faz kullanılır. Sıvı faz ise,

saflaştırılması istenen karışımın, içinde çözündüğü kapiller etki ile çekilebilen uygun

bir çözücüdür.

İnce tabaka kromatografi tabakaları, silika jel, (adsorbent malzeme), kalsiyum

sülfat (bağlayıcı) ve su ile hazırlanır. Hazırlanan karışım genellikle reaksiyon

vermeyen cam, kalın alüminyum folyo ya da plastik malzemeler üzerine yayılır.

Hazırlanan plakalar havada kurutulduktan sonra, 110oC’lik fırnda 30 dakika dikey

pozisyonda tutularak, aktive edilirler. Adsorban tabakanın kalınlığı genellikle,

analitik amaçlı işlemlerde 0.1-0.25 mm, preperatif çalışmalarda 1-2 mm aralığında

kullanılmaktadır.

İşlemler kağıt kromatografisine benzese de daha hızlı ve ayırımın daha başarılı

olması ve sabit fazın farklı kalınlıklarda kullanılmasıyla bu teknikten ayrılır. İnce

tabaka kromatografisi, karışımdaki bileşenlerin miktarını belirlemede, maddenin


36

tanımlanmasında, kolon kromatografisi için uygun şartları belirlemede, kolondan

elde edilen fraksiyonların analizinde kullanılırlar.

Tabakalar ya laboratuarda hazırlanır ya da kullanıma hazır olarak satın alınır.

Laboratuar hazırlamasında cam plakalar tercih edilir. Alüminyum plakalar çok

kullanılan malzemeler olmasa da, endüstriyel uygulamalarda, kalın alüminyum

folyolar sıkça kullanılmaktadır. Plakaların sabit faz malzemeleriyle kaplanması farklı

tiplerdeki yayma aparatları ile gerçekleştirilir. Temelde iki tipi vardır.

Birinci tipte, yan yana dizilmiş plakaların sabit jel dökme ekipmanı hareketli,

ikincisinde ise jel dökme ekipmanı sabit malzemenin döküleceği tabakalar

hareketlidir (Poole, 2003).

İnce tabaka kromatografisinde molekülün jeldeki hareketi genellikle aşağıdan

yukarıya doğru yükselen yöntem ile gerçekleştirilir. Bunun için cam

plakanın/plakaların yerleştirileceği ekipman değişik boyutlar ve şekilde olabilir.

Sistemin çoklu uygulamalara uygun olması ve solvent sistemi ile atmosfer

doygunluğunun sağlanabilmesi için kapağının olması gerekir. Yürütme işlemi

tamamlanmış tabakalar, genellikle havada, infrared ışık altında veya fırınlarında

kurutulur.

Seperasyonu gerçekleştirilmiş malzemelerin görünür hale gelmesi için

kullanılan çözeltiler zehirli veya korozif olabilecekleri için, çeker ocak ya da özel

kabinlerde püskürtme yapılarak gerçekleştirilir.

Birçok madde ince tabaka üzerinde herhangi bir özel tespit metoduna gerek

kalmadan görülebilir. Kâğıt kromatografisinde kullanılan indikatörlerin çoğu ince

tabakaya da uygulanabilir. Bu teknikte örneğin saptanması için kullanılan teknikler

kağıt kromatografisine göre 10-100 kat daha hassastır. Kullanılan korozif spreyler

uçucu olmayan organik maddelerin fırında kömürleştirilmesi için kullanılır (Poole,

2003).

İnce tabaka kromatografilerinde, örneğin görünmesini sağlayan çözeltiler

kullanılacak kromatogafi tipine göre tercih edilir. Kromatografi tipleri ve

kullanılabilecek geliştirme solüsyonları Çizelge 1.1ve 1.2’de gösterilmiştir.


37

Çizelge 1.1: İnce Tabaka Kromatografileri İçin Kaplama Malzemeleri (Erich, 1975)

Adsorpsiyon İnce Tabaka Kromatografisi

Silisik Asit (Silika Jel) Alüminyum Oksit

Kieselguhr (Diatom toprağı) Hidroksilapatit

İyon-Değişimi İTK Polietilenimin selüloz

Selüloz fosfat DEAE Selüloz

Partisyon İTK

Selüloz Kieselguhr

Hidroksilapatit Silika jel

Dekstran Jel İTK Sephadex G-25,G50,G-75,G-100

Poliamid İTK Poliakrilonit Asetil ε-Polikaprolaktam

Çizelge 1.2:İnce Tabaka Kromatografisi için Bazı Geliştirme Çözeltileri (Erich,1975)

Adsorpsiyon İnce Tabaka

Kromatografisi

n-Hekzan-Dietil eter-asetik asit (90:10:1) Klororoform-Metanol (19:1)

Benzen-Aseton (1:1)

İyon-Değişimi İTK Hidroklorik asit, 0.001-1N

Sodyum Hidroksil, 0.001-1N Sodyum Klorür, 0.001-1N

Partisyon İTK Bütanol-Aseton-Dietilamin-Su (10:10:2:5)

Bütanol-Astik asit-Su (4:1:5) Propanol-Formik asit-Su (2:1:5)

Dekstran Jel İTK Asetik asit (0.01-0,1N) Amonyak (0.01-0,1)

Poliamid İTK

Su-Etanol (1:1) Su-Aseton (1:1)

Su-Etanol-AsetikAsit-Dimetilformamid (6:4:2:1)

1.11. Araştırmanın Amacı

Bu çalışmada, endüstriyel uygulamalarda kullanılacak halofil alkalin amilaz,

glukanaz (selülaz) ve xylanase enzim üreticisi Bacillus sp. bakterilerinin doğal

ortamdan izolasyonu, identifikasyonu, enzim izolasyonu ve kısmi saflaştırılması,


38

enzim karekterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanaklarının araştırılması

amaçlanmıştır.

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ashabil AYGAN

39

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

İlk enzimatik yıkım reaksiyonu 1783 yılında, İtalyan rahip Spallanzani

tarafından gözlemlenmiştir. Kirchhoff 1814 yılında, arpanın nişasta lapalarını şekere

dönüştürdüğünü görmüştür.

Pasteur 1877 yılında fermentasyonla canlı mayalar arasında ilişki olduğunu

ileri sürmüş, hücresel ve soluble mayalanmaların bir birinden farklı gerçkleştiğini

saptamıştır. Künhe 1878 yılında, canlı hücre kullanılmadan gerçekleşen

mayalanmayı, enzim olarak tanımlamıştır (Uhlig, 1998).

Endüstriyel öneme sahip mikrobiyal enzimlerinin gelişimi Japon Jokichi

Takamine ile başlamıştır. Takamine küflerden enzim üretimi üzerine çalışmış ve

1894’de mantarlardan elde ettiği diastatik enzime patent almıştır. 1913 yılında

Röhm, deterjanlarda enzim kullanılabileceğini belirtmiştir.

Biodin ve Effront (1917), B. subtilis kültürlerinden enzim hazırlanmasıyla ilgili

çalışmalar yapmıştır.

Kneen ve Sandstedt (1946), bakteriyel amilazların diğer alfa amilazlardan daha

büyük sıcaklık stabilitesine sahip olduklarını ortaya koymuştur.

Conn ve ark (1950), alfa amilazlar içerisinde yer alan bir grubun inaktivasyon

sıcaklığını bulmak için 60 ile 85oC’de çeşitli testler yapmışlardr.

Stark ve Tetrault (1951), Nişastayı şekere dönüştüren enzimi üreten Bacillus

stearothermophilus bakterisini 70oC’de izole etmiştir. Enzimin 90oC de inaktive

olduğunu saptamışlardır.

Campbell (1952), 35oC’de ve 55oC’deki üreyen hem Bacillus

stearothermophilus hemde Bacillus coagulans’dan elde eilen amilazların

karşılaştırmasını yapmıştır. 55oC’de üretilen amilazların 35 oC’de üretilenlerden bir

şekilde daha yüksek optimum aktiviteye sahip olduklarını ortaya koymuştur. 35oC’de

elde edilen amilazların 90oC’ye maruz bırakıldıklarında 2 saat sonra aktivitelerini

kaybettikleri fakat 55 oC’de elde edilen amilazların ise 24 saat sonuda aktivitelerini

%50 oranında koruduklarını belirtmiştir.

Hartman ve ark (1954), B.stearothermophilus’dan ürettikleri amilaz enziminin

hem pH hemde termal stabilitelerini belirlemişlerdir. Elde ettikleri termofilik


40

bakteriyel amilazın, mezofilik olanlara göre daha yüksek pH stabilitesine sahip

olduklarını belirtmişlerdir.

Miller (1951), Karbonidrataz etkisi gösteren enzimlerin aktivite analizlerinde

indirgen şeker miktarının saptanması için Dinitrosalisilik asit (DNS) yöntemini

kullanmıştır. Bu metod ile 3,5-dinitrosalisalisilik asitin, 3-amino-5-nitrosalisilik asite

indirgendiğini ve aldehit grupların karboksilik gruplara okside olarak gelişen renk

reaksiyonunu oluşturduklarını bildirmiştir.

Friedmann ve Epstein (1967), inaktive olmuş taka-amilaz enziminin yeniden

aktif duruma gelmesinde kalsiyumun etkisini araştırmıştır.

Saito (1973), B.licheniformis bakterisinden amilaz enzimi üretimi için hangi

karbon kaynaklarının daha etkili olduğunu araştırmştır.

Onishi ve Sonoda (1979), orta düzeyde halofilik Micrococcus halobius’ tan

elde ettikleri amilazlarda optimum aktivite için gerekli olan NaCl ve KCl

konsantrasyonlarını saptamışlardır.

Morgan ve Priest (1981), 40oC’nin üzerinde aktivitelerini kaybeden Bacillus

suşlarında termostabilite yeteneklerini araştırmışlardır.

Zhang ve ark (1983), Bacillus amiloliquefacien suşunda, ortamda glisin

bulunduğu zaman alfa-amilaz üretiminde artış gerçekleştiğini saptamışlardır. Glisin

etkisinin murein tabakasının sentezinde rekabetçi inhibisyona neden olarak amilaz

üretimini artırdığını belirtmişlerdir.

Bajpai ve Bajpai (1987), termostabil alfa-amilaz üreten Bacillus licheniformis

suşunun izolasyon, tanımlama, kültür ve enzim özelliklerini araştırmışlardır.

Bacillus licheniformis TCRDC-B13 suşunun üremesinin pH 3.0-11.0 arasında olup,

besiyeri pH’sının arttırılması ile üremenin azaldığını, enzim üretiminin pH 5.0-10.0

aralığında gerçekleştiği ve maksimum enzim aktivitenin pH 6.0-9.0 arasında

olduğunu bulmuşlardır.

Bu suş için enzim üretim sıcaklık aralığının 25-50oC maksimum enzim üretim

sıcaklığının ise 35oC olduğunu saptamışlardır. Ayrıca bu enzimin, nişastanın

sıvılaştırılması amacıyla geniş pH aralıklarında kullanılabileceğini belirtmişlerdir.

Srivastava (1987), topraktan izole ettiği B.stearothermophilus suşunda iki farklı

amilaz enzimi izole etmiş ve karakterizasyonunu gerçekleştirmiştir. Bakteriyel alfa-


41

amilazların endüstride kullanımının giderek arttığını ve bu nedenle amilaz üreten

yeni suşların izole edilmelerinin gerekli olduğunu belirtmiştir.

Igarashi ve ark (1988), alkalifilik Bacillus türlerinden alkali izoamilaz, alkali

dirençli neopullulanaz ve yüksek alkali pullulanaz gibi bazı enzimleri karakterize

etmişler ve bunların alkali koşullarda alfa-amilazlar ile birlikte çamaşır ve bulaşık

deterjan sanayinde etkili olarak kullanılabilirliğini göstermişlerdir. Ayrıca

izolasyonunu yaptıkları amilazın maksimum aktivitesinin pH 8.0-8.5 civarında

olduğunu gözlemlemişlerdir.

Vihinen ve Mantsala (1990), B.stearothermophilus’dan elde edilen alfa-amilazı

enziminin aktivite gösterdiği optimum sıcaklığın 50-70oC olduğunu belirtmişler ve

alfa-amilaz aktivitesinin en yüksek 70-80oC sıcaklıkta gerçekleştirdiğini

göstermişlerdir.

Shaw ve ark (1995), ekstrem termofilik Thermus sp. suşundan ekstrasellüler

amilaz izolasyonu ve karakterizasyonunu yapmış, bu enzimin pH 5.5-6.5 arasında ve

70oC’de optimum aktivite gösterdiğini saptamışlardır.

Kim ve ark (1995), alkalifilik Bacillus sp. izolatından pH 11.0 ve 12.0 da en iyi

aktivite gösteren maltotrioz üreten alkali alfa-amilaz üretimini gerçekleştirmiştir.

Sidhu ve ark (1997), termostabil amilaz üretimi amacı ile suş geliştirme

deneyleri yapmışlar ve etilmetan sülfonat ile mutasyon çalışmaları sonucunda, enzim

üretiminde 40 kat daha yüksek miktarda ürün almayı başarmışlardır.

Lin ve ark (1998), Bacillus sp. TS-23 suşundan izole ettikleri enzimde

moleküler ağırlıkları 42 ve 150 kDa olan iki amilaz bandı bulmuşlardır. Enzimin

optimum aktivite gösterdiği pH ve sıcaklığının 9.0 ve 70oC olduğu ve enzimin ham

nişastayı kısmen parçalayabildiği belirlenmiştir.

Egas ve ark (1998), Thermus filiformis suşundan ürettikleri alfa-amilazın

optimum pH 5.5-6.0 ve 95oC’de çalıştığını belirlemişlerdir. Enzimin 80oC’nin

üzerinde ve Ca+2 varlığında yarılanma ömrünün, 85oC’de 8 saat, 90oC’de 80 dakika

ve 95 oC’de 19 dakika olduğunu belirlemişlerdir.

Mamo ve ark (1999), Etiopyada sıcak su kaynaklarından izolasyonunu

yaptıkları termofilik Bacillus sp.’ den izole edilen amilaz enziminin optimum 75-


42

80oC’de ve pH 5.0 –8.0 arasında çalıştığını saptamışlar ve 105oC’de termal stabilite

üzerine Ca+2 etkisinin olmadığını belirtmişlerdir.

Malhotra ve ark (2000), ekstrem termofil özellikte olan Bacillus

thermooleovarans suşundan termostabilite için Ca+2’a ihtiyaç duymayan amilaz

izolasyonunu ve karakterizasyonunu gerçekleştirmiştir.

Duedahl-Olesen ve ark (2000), Bacillus clausii’den optimum pH 9.5 ve 55oC

de aktivite gösteren, moleküler ağırlığı 101 kDa olan, nişastadan maltoheksoz

oluşturabilen amilaz izolasyonu ve karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir.

Hagihara ve ark (2001), Optimum pH 8.0-9.5 ve 55-60oC’de aktivite gösteren,

şelatörlere ve kimyasal oksidantlara karşı oldukça dirençli olduğunu bildirdikleri

alfa-amilazın molekül ağırlığını 55 kDa olarak bulmuşlardır.

Deutch (2002), tuza karşı toleransı bulunan Bacillus dipsosauri’den ürettikleri

amilazın optimum pH 6.5 ve 60oC aktivite gösterdiğini ve yüksek tuz

konsantrasyonlarında da büyük bir aktivite toleransına sahip olduğunu

belirtmişlerdir.

Burhan ve ark (2003), Bacillus sp. Ant-6 dan izolasyonunu yaptıkları amilaz

enziminin optimum aktivitesinin pH 10.5 ve 80oC’ de gerçekleştiğini bulmuşlardır.

Aynı zamanda alkali, termostabil ve şelatör dirençli bu enzimin nişasta, tekstil ve

deterjan endüstrisi için uygun bir potansiyel olduğunu belirtmişlerdir.

Amoozegar ve ark (2003), yüksek tuz gibi stres altında üretilen ekstrasellüler

amilazın enziminin optimum aktivite sıcaklığının 50oC ve optimum pH aktivitesinin

ise pH 7.5-9.0 arasında olduğunu rapor etmişlerdir.

Pomares ve ark (2003), halofilik arkeon Haloferax mediterranei’ den 58 kDa

büyüklüğünde ve maksimum aktivitesini 3M NaCl’de gösterebilen halofilik alfa-

amilaz izolasyonu yapmışlardır. İzole edilen enzimin maksimal aktivitesini pH 7.0-

8.0 arasında ve 60oC’de gerçekleştirdiğini saptamışlardır.

Das ve ark (2004), Bacillus subtilis suşundan, moleküler ağırlığı 42.8 kDa

optimum aktivite sıcaklığı 52-55oC ve pH 9.0 olan, alkali alfa-amilaz izolasyonu

yapmışlardır.

Konsula ve ark (2004), mezofilik Bacillus subtilis suşundan izolasyonunu

yaptıkları ekstrasellüler termostabil alfa-amilaz enziminde en yüksek aktivitenin


43

135oC ve pH 6.5’da gerçekleştiğini bulmuşlardır. Artan termostabilitenin varlığı bu

enzim için de rapor edilmiştir.

Bernhardsdotter ve ark (2005), alkali şelatör dirençli fakat Ca+2 varlığında

termostabilitesi yükselmeyen ve EDTA varlığında aktivitesi yükselen amilazın

izolasyonunu ve özelliklerini rapor etmişlerdir.

Hutcheon ve ark (2005), halofilik arkeon Haloarcula hispanica’dan elde edilen

alfa-amilazın yüksek tuz konsantrasyonlarında stabil olduklarını hatta üre varlığında

dahi stabilitesinin devam ettiğini bulmuşlardır. Normalde tuz bulunmayan ortamlarda

ürenin enzim inhibisyonunu gerçekleştirdiği belirtilmiştir.

Saxena ve ark (2007), izole ettikleri amilaz enziminin, maksimum aktivitesini

pH 10.0 ve 90oC’ gerçekleştirdiği ve enzimin 80-100oC arasında %100 stabil

davranış gösterdiğini saptamışlardır.

Asgher ve ark (2007), Bacillus subtilis’den izolasyonunu yaptıkları termostabil

alfa-amilazın optimum aktivitesinin pH 8.0 ve 70oC olduğunu bulmuşlar ve 60oC’de

1 saat süreyle stabilitesini koruduğunu saptamışlardır.

Robson ve Chambliss (1984), Bacillus sp.’den üretilen selülaz enziminde

aktivite analizi yapmışlar ve maksimum selülaz aktivitesin pH 4.8 ve 58oC’de

gerçekleştiğini bulmuşlardır.

Soutschek-Bauer ve Staudenbauer (1987), Clostridium thermocellum’dan elde

edilen genini B.subtilis’e ve B.stearothermophilus’a transfer ederek CMC-az üretimi

gerçekleştirmişlerdir.

Hreggvidsson ve ark (1996), Rhodothermus marinus’ tan izole edilen

termostabil selülaz enziminin optimum aktivitesini pH 7.0 de gösterdiği ve enzim

100oC’de 3,5 saat bekletildikten sonra, orijinal aktivitesini %50 koruduğu

sapamışlardır.

Hakamada ve ark (1997), alkalifilik Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilmiş

termostabil alkali selülazın optimum aktivitesini pH 8.6-9.0 ve 45oC’de gösterdiği

bildirmişlerdir.

Yernool ve Eveleigh (1998), iki termostabil endoselülaz izolasyonu yapmış ve

moleküler ağırlıkları 29 ve 30kDa olan enzimlerin optimum pH 6.0-6.6 ve 95oC’de

aktif olduklarını bulmuştur.


44

Krishna (1999), katı faz fermentasyon ile B.subtilis’ten selülaz enzimi üretimini

gerçekleştirmişler ve substrat, nem, parça büyüklüğü, ortam pH’sı, inkübasyon

sıcaklığı azot ve karbonun, enzim üretimine etkilerini araştırmışlardır.

Mawadza ve ark (2000), iki Bacillus suşundan üretilen selülazın

karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Her iki enzimin molekül ağırlığı 40 kDa

olup, enzimlerin otimum aktivitelerini pH 5.0-6.5’de ve 65 ve 70oC’de

gösterdiklerini belirlemişlerdir.

Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans’dan izole ettikleri alkalin

endoglukanazın pH 8.5’da 55oC’de optimal çalıştığını ve 43 kDa moleküler ağırlığa

sahip olduğunu saptamışlardır.

Singh ve ark (2001), termostabil alkali CMC-az enzimini Bacillus sp. VG1

suşundan izole etmişler ve enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 9.0-

10.0, yarılanma ömrünün ise 100oC’de 12 dakika olduğunu bulmuşlardır.

Endo ve ark (2001), Bacillus sp. KSM-N252 suşundan izole edilen

endoglukanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH’nın 10.0 sıcaklığın 55oC ve

molaküler ağırlığının 50 kDa olduğunu saptamışlardır.

Coral ve ark (2002), Aspergillus niger’den moleküler ağırlıkları 83 ve 50kDa

olan, optimum aktivitesini pH 3.0-9.0 aralığında gösteren CMC-az enzimi izole

etmişlerdir. Enzimin optimum aktivite sıcaklığını 40oC bulmuşlardır.

Kang ve ark (2004), Aspergillus niger KK2 suşundan solid state fermentasyon

tekniği ile pirinç ve buğday kabukları kullanılarak selülaz enzimi üretimi


Saha (2004), Mucor circinelloides’ten izole ettikleri endoglukanazın optimum

aktivitesini pH 4.0-6.0 ve 55oC’de gösterdiğini, enzimin moleküler ağırlığının 27

kDa olduğunu belirtmiştir.

Huang ve Monk (2004), Caldibacillus cellulovorans’dan izolasyonunu

yaptıkları CMC-az enziminin 85.1 kDa molekül ağırlığa sahip olduğunu ve

maksimum aktivitenin ise 80oC’de gerçekleştiğini belirtilmiştir.

Singh ve ark (2004), Bacillus sphaericus JS1suşundan alkali selülaz enzimi

izole ederek enzimin üretimi ve karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Enzimin

SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlığının 42 kDa olduğu saptamış ve enzimin


45

termostabilite, pH stabilitesi ve hidrolitik kapasitesi açısından, deterjen sanayi için

uygun olduğunu belirtmişlerdir.

Kim ve ark (2005), alkalifilik Bacillus sp. suşundan HSH-810’dan alkali

selülaz izolasyonu yapmışlar ve enzimin pH 10.0’da ve 50oC’de optimum aktivite

gösterdiğini belirtmişlerdir.

Zverava ve ark (2006), haloalkalifilik anaerobik bakteriden izole ettikleri

selülaz enziminin moleküler ağırlığının 75 ve 84 kDa olduğunu bildirmişlerdir.

Hirasawa ve ark (2006), Bacillus agaradhaerens suşundan endoglukanaz

enzimi izolasyonu gerçekleştirmişler, farklı sıcaklık ve pH’larda enzim aktivitesine

bakarak, NaCl ile enzim aktivitesinde artış olduğunu belirlemişlerdir. NaCl’ün enzim

aktivitesini artırıcı yöndeki etkisinin pH 6.5-7.0 arasında ve 60oC’de, altı kat daha

yüksek olduğunu ortaya koymuşlardır.

Kang ve ark (2007), Pyrococcus horikoshii’den, kristalin selüloza karşı oldukça

etkin hipertermofilik selülaz izolasyonu gerçekleştirmişler ve enzimin disülfit bağına

sahip olduğunu belirtmişlerdir.

Blanco ve ark (1995), alkali-tolerant Bacillus sp. BP23’den ürettikleri ksilanaz

enziminin özelliklerini belirlemişlerdi. Enzimin 32 kDa molekül ağırlığa sahip

olduğu, optimum aktivitesini 50oC ve pH 5.5’de gösterdiğini saptamışlardır.

Yang ve ark (1995), Kağıt hamurundan izole ettikleri alkalifilik Bacillus sp.den

alkali ksilanaz üretmişlerdir. Enzimin maksimum aktivitesini pH 8.5 ve 55oC’de

gösterdiğini saptamışlardır.

Archana ve Satyanarayana (1997), solid state fermentasyon tekniği kullanılarak

termofilik B.licheniformis A99 suşundan ksilanaz enzim üretimi gerçekleştirmişler.

Enzimlerin optimum aktivite gösterdikleri pH değerinin 6.0-7.0 sıcaklık değerinin ise

45oC ve 50oC olduğunu bildirmişler.

Lopez ve ark (1998), alkali tolerant Bacillus’tan izole edilen ksilanaz enziminin

45oC’de 5 saat’lik inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini %72 koruduğunu

saptamışlardır. Son üründe ksiloz yerine ana ürün olarak ksilotrioz ve ksilotetroz

oluştuğunu belirtmişlerdir.

Breccia ve ark (1998), Bacillus amyloliquefaciens’den termostabil ksilanaz

izolasyonu ve karakterizasyonu yapmışlardır. Saflaştırma sonunda SDS-PAGE


46

analizi sonucuna göre, enzimin, 18.4 ve 19.6 kDa ağırlığa sahip iki alt birimden

meydana geldiğini belirtmişlerdir.

Enzimin optimum ativitesini pH 6.8-7.0’de gösterirken pH stabilitesinin 9.0

olduğu saptanmıştır. Enzim otimum aktivitesini 80oC’de göstermiş ve termal

stailitesinin ise 50oC olduğu gözlenmiştir.

Gessesse ve Mamo (1999), solid state fermentasyon tekniği kullanarak

alkalifilik Bacillus sp. den bol miktarda ksilanaz üretimi gerçekleştirmişlerdir.

Çalışmalarında ksiloz, laktoz, glikoz ve sükroz gibi şekerlerin enzim üretimine

etkilerini araştırmışlardır.

Duarte ve ark (1999), İzolasyonunu gerçekleştirdikleri 500 mikroorganizma

içerisinden ksilanaz üreten 22 suş seçmişler ve pH 10.0’da enzim üreten

organizmadan alkali ksilanaz enzimi üreterek saflaştırmışlardır. Saflaştırılan enzim

aktivitesi üzerine NaCl’ün etkisini araştırmışlardır.

Dhillon ve ark (2000), Bacillus circulans AB16 suşundan selülaz aktivitesi

zayıf olan termostabil ve alkalitolerant ksilanaz üretimi ve karakterizasyonunu

gerçekleştirmişlerdir. Moleküler ağırlıkları farklı olan enzimleri, ksilanaz A ve B

şeklinde adlandırmışlardır. Enzimlerin optimum aktivite göstedikleri pH ve sıcaklık

değerleri birbirinden farklı olup, ksilanaz A’nın moleküler ağırlığı 30 kDa, optimum

aktivite gösterdiği pH 6.0, sıcaklık değeri 75-80oC’dir. Ksilanaz B’nin moleküler

ağırlığı 22 kDa, optimum aktivite gösterdiği pH 6.0, sıcaklık değeri 65-70oC’dir.

Sa-Pereira ve ark (2002), Sıcak su kaynaklarından izole ettikleri B. Subtilis

organizmasından, selülaz aktivitesi bulunmayan (selülaz free) termostabil ksilanaz

enzimi üretmişlerdir. Enzim üretimini pH 6.0 da 50oC’de 18 saat ve 55oC’de 11

saat’lik fermentasyon işlemleri uygulayarak, enzim verimini karşılaştırmışlardır.

Tseng ve ark (2002), Alkalifilik Bacillus firmus suşundan selülaz aktivitesi

olmayan iki farklı ksilanazı izole etmişlerdir. Moleküler ağırlıkları 45 ve 23 kDa

olan enzimlerin optimum aktivitelerini 37oC’de ve pH 5.0-11.0’da gösterdiklerini

saptamışlardır. Enzim aktivitesi sonucu oluşan son ürünün ksiloz, ksilotrioz ve

ksiloheksoz olduğu saptanmıştır.


47

Saha (2002), Fusarium proliferatum suşundan ksilanaz enzimi üretip

özelliklerini belirlemiştir. Enzimin moleküler ağırlığının 22.4 kDa optimum aktivite

pH’sının 5.0-5.5, sıcaklığının ise 55oC olduğunu saptamıştır.

Wejse ve ark (2003), Halofilik bakteriden iki ekstrem halotolerant ksilan

enzimi üreterek karakterizasyonunu yapmışlardır. Moleküler ağırlığı 43 ve 62 kDa

olan iki alt birimden meydana gelmiş ksilanaz-1 optimum aktivitesini pH 6.0 ve

60oC’de göstermektedir. Ksilanaz-2 ise optimum 65oC ve 4 M NaCl’de etki

göstermektedir. Enzimlerin yarılanma ömürleri 60oC’de 97 ve 192 dakikada olarak

bulunmuştur.

Cardoso ve Filho (2003), Acrophialophora nainiana’dan selülaz aktivitesi

göstermeyen ksilanaz izolasonu ve karakterizasyonu gerçekleştirmişlerdir. β-

Ksilanaz 55oC’de ve pH 6.5 de optimum aktivite gösterirken moleküler ağırlığı 54

kDa olarak belirtilmiştir.

Anthony ve ark (2003), alkali tolerant Aspergillus fumigatus’dan selülaz

aktivitesi göstermeyen büyük moleküler ağırlığı sahip ksilanaz üretimi

gerçekleştirmişlerdir. Ksilanazın optimum pH’sının 6.0-6.5, sıcaklığın ise 60oC


Ryan ve ark (2003), Penicillium capsulatum’dan düşük molekül ağırlığına

sahip endoksilanaz üretmişlerdir. Enzimin aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH

optimumu 48oC ve 3.8 olurken, yarılanma ömrü 50oC’de 25 saat olarak bulunmuştur.

WainØ ve Ingvorsen (2003), ekstrem halofilik arkeon Halorhabdus

utahensis’den β-Ksilanaz ve β-ksilozidaz üretimi gerçekleştirmişlerdir. Her iki enzim

de %0-%30 arasında NaCl konsantrasyonu gibi geniş bir aktivite spektrumuna sahip

olup kısmen de olsa termofilik özelliktedirler. Enzimlerden β-ksilanaz 55oC ve 70oC

olarak iki optimum aktivite sıcaklığına sahiptir. β-Ksilozidaz ise 65oC optimum

sıcaklığa sahiptir.

Lama ve ark (2004), termofilik Bacillus thermantarcticus’dan termostabil

ksilanaz ve β-Ksilozidaz izole etmişlerdir. Ksilanaz için optimum aktivite sıcaklığı

80oC ve pH 5.6 iken, β-Ksilozidaz için 70oC ve pH 6.0 olarak bulunmuştur.

Kumar ve ark (2004), alkalifilik Bacillus sp.NCL’den ürettikleri alkali ksilanazı

ticari ksilanazlar ile kıyaslamışlardır. Değerlendirdikleri 4 ksilanaz arasında


48

alkalifilik Bacillus sp.den elde edilen enzimin, ticari deterjanlar için en uyumlusu

olduğunu belirtmişlerdir.

Gallordo ve ark (2004), Bacillus sp.BP7’den ksilanaz kodlayan gen izolasyonu

yaparak E.coli’ye klonlamışlardır. Genin ekspresyonu sonunda elde edilen enzimin

maksimum pH 6.0 ve 60oC’de aktivite gösterdiğini, moleküler ağırlığının ise 24 kDa


Avcıoğlu ve ark (2005), topraktan izole ettikleri Bacillus sp. suşlarından

ksilanaz üretimi ve karakterizasyonu yapmışlardır. Ksilanaz üretimini tarımsal atık

ürünler üzerinde Bacillus sp. izolatlarının üretilmesi ile gerçekleştirmişlerdir.

Moleküler ağırlıkları 22, 23 ve 40 kDa olan üç endoksilanazın optimum 70oC’ ve pH

6.5’de aktivite gösterdiğini saptamışlardır.

3.MATERYAL ve METOD Ashabil AYGAN

49

3. MATERYAL VE METOD

3.1. MATERYAL

3.1.1. Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri

3.1.1.1. LB Agar

Alkalifilik ve halofilik bakterilerin izolasyonu ve eğik katı agarda stok

kültürlerin saklanması için kullanılmıştır (Sambrook ve Russell, 2001).

Bileşimi g/L Tripton 10 Maya Ekstraktı 5 NaCl 10 Agar 15

İstenen özellikteki bakteri izolasyonu için NaCl miktarı %10, ve pH:10.0 olarak

modifiye edilmiştir.

3.1.1.2. M9-Nişasta Agarı

Amilaz aktivitesinin saptanması ve enzim üretimi amacıyla kullanılmıştır

(Shibuya ve ark, 1986). Test edilmek istenen özelliklere göre NaCl ve pH değerleri

değiştirilmiştir.

Bileşimi g/L Na2HPO4.7H2O 6 KH2PO4 3 NaCl 0.5 NH4Cl 1 MgSO4.7H2O 0.24 CaCl2.2 H2O 0.24 Pepton 3 Nişasta 10 Agar 15


50

NaCl miktarı istenen tuz konsantrasyonuna göre modifiye edilir ve agar hariç

diğer besiyeri bileşenleri distile suda çözülüp pH’sı istenen değere ayarlanır. Agar

eklenip manyetik karıştırıcıda eritilir ve otoklavda 15 dakika steril edilir.

3.1.1.3. CMC-Agar Besiyeri

Selülaz aktivitesinin saptanması amacıyla kullanılmıştır (Kim ve ark, 2005).

Bileşimi g/L CMC 10 Pepton 5 Maya özütü 5 KH2PO4 1 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 10

Agar-agar 15

3.1.1.4. CEPM (Selüloz Enzim Üretimi Besiyeri)

Bileşimi g/L

Na2HPO4 .7H2O 1.18 KH2PO4 0.9 NaNO3 1 KCl 0.5 MgSO4.7H2O 0.5 Maya Özütü 0.5 Pepton 0.5 CMC 10

Besiyerinin pH’sı otoklavdan sonra %10 luk Na2CO3 ile ayarlanır (Krishna,

1999).


51

3.1.1.5. Ksilanlı Besiyeri

Ksilanaz aktivitesinin saptanması ve enzim üretimi amacıyla kullanılmıştır

(Gessesse, 1998). Amaca göre NaCl ve pH değerleri değiştirilmiştir.

Bileşimi g/L

Pepton 5 Maya Özütü 1 MgSO4.7H2O 0.2 CaCl2.2H2O 0.1 K2HPO4 1 NaCl 5 Ksilan ( Oat Spelt) 5 Agar-agar 15

3.1.1.6. Nutrient Broth

İzolasyonu yapılan Bacillus sp. suşlarından genomik DNA izolasyonu için

bakteri üretimi amacı ile kullanılmıştır.

Bileşim g/L

Et Özütü 10

Pepton 10

NaCl 5

(Barrow ve Feltham, 1993).

3.1.2. Kullanılan Çözeltiler

3.1.2.1. NaOH Çözeltisi

Besiyerlerinin pH’sını ayarlamak ve tampon çözeltilerin hazırlanması amacı ile

0.2N ve 2N NaOH çözeltisi kullanılmıştır.


52

3.1.2.2. Etanol

Sıvı besiyerlerinde üretilen enzimlerin süpernatanttan kurtarılması için

proteinlerin presipitasyonu amacı ile daha önceden soğutulmuş %96’lık soğuk etanol

kullanılmıştır.

3.1.2.3. Na2CO3 Çözeltisi

Besiyerlerinin pH’sını otoklavdan sonra ayarlamak için %10 luk Na2CO3 ten

faydalanılmıştır (Gessesse, 1998).

3.1.2.4. Lügol

Katı besiyerinde ve Poliakrilamid Jel Elektroforez (PAGE) uygulamalarında

amilaz aktivitesinin saptanması için kullanılmıştır.

Bileşimi g/100mL İyot 7 g Potasyum iyodür 3 g Distile Su 100 mL

20 kat sulandırılarak kullanılmıştır (Çetin, 1968).

3.1.2.5. Kongo Kırmızısı (%0.1)

Katı besiyeri ve SDS-PAGE jelinde selülaz ve ksilanaz aktivitesinin

gösterilmesi için %0.1’lik kongo kırmızısı 100 mL distile suda çözülerek

hazırlanmıştır (Voget ve ark, 2006).


53

3.1.2.6. NaCl Çözeltisi (1M) Petri kutusunda selülaz ve ksilanaz aktivitesini saptamak ve zimogram

analizinde jelde bulunan aktivite bandını görünür hale getirmek amacıyla

kullanılmıştır (Voget ve ark, 2006).

3.1.2.7. Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M)

Çöktürme sonucu elde edilen enzimin çözülerek resüspanse edilmesi için

kullanılmıştır.

3.1.2.8. Sitrat Tamponu

Enzimin pH 4.0-5.5 aralığındaki aktivitesini saptamak için kullanılır.

Tamponun hazırlanmasında 0.2 M Sitrik asit ve 0.2M Na2HPO4.7H2O çözeltileri ve

distile su’dan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine sahip yeni bir

karışım elde edilir. Hangi pH değerine sahip tampon hazırlanacaksa, Çizelge 3.1 de

verilen oranlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).

Çizelge 3.1: Sitrik asit Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması

PH 0.2M Sitrik Asit

(19.21g/L) mL

0.2M Na2HPO4 (53.65g/L)

mL

Distile Su mL

4.0 30.7 19.3 50 4.6 26.7 23.3 50 5.0 24.3 25.7 50 5.6 21.0

+

29.0

+

50

3.1.2.9. Sodyum-Fosfat Tamponu

Enzimlerin pH 6.0-8.0 arasındaki aktivite düzeylerinin saptanmasında

kullanılmıştır. Tamponun hazırlanmasında 0.2M NaH2PO4 ile 0.2M Na2HPO4.7H2O

çözeltileri ve distile sudan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine


54

sahip yeni bir karışım elde edilir. Hangi pH değerine sahip tampon hazırlanacaksa,

Çizelge 3.2 de verilen oranlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).

Çizelge 3.2: Sodyum Fosfat Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması

PH

0.2M NaH2PO4

(27.8g/L) mL

0.2M Na2HPO4 (53.65g/L)

mL

Distile Su mL

6.0 87.7 12.3 100 6.5 68.5 31.5 100 7.0 39.0 61.0 100 7.5 16.0 84.0 100 8.0 5.3

+

94.7

+

100

3.1.2.10. Glisin-NaOH Tamponu

Enzimlerin pH 8.5-10.5 aralığındaki aktivitelerini saptamak için kullanılır.

Tamponun hazırlanmasında 0.2M Glisin ile 0.2M NaOH çözeltileri ve distile su’dan

uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine sahip yeni bir karışım elde

edilir. Hangi pH değerine sahip tampon hazırlanacaksa, Çizelge 3.3 de verilen

oranlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).

Çizelge 3.3: Glisin-NaOH Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması

PH 0.2M Glisin (15.01g/L)

mL

0.2M NaOH (8g/L)

mL

Distile Su mL

8.6 4.0 50 146 9.0 8.8 50 141.2 9.6 22.4 50 127.6 10.0 32.0 50 118 10.6 45.5

+

50

+

104.5


55

3.1.2.11. Borax-NaOH Tamponu

Enzimlerin pH 11.0-12.5 arasındaki aktivitelerini saptamak amacı ile kullanılır.

Tamponu hazırlamak için 0.05M Boraks (19.05g/L) çözeltisinden 50 mL alınarak

üzerine istenilen pH değeri elde edilinceye kadar (0.2M NaOH ve yüksek pH

değerleri için de 2N NaOH) uygun NaOH çözeltisinden eklenerek son hacim 200mL

olacak şekilde distile su ilave edilir (Temizkan ve Arda, 2004).

3.1.2.12. Dinitro Salisilik Asit (DNS)

Enzim aktivitesi sonucu açığa çıkan indirgen şeker miktarını belirlemek amacı

ile kullanılır. 1g DNS 50 mL distile su içerisinde çözülür. Üzerine 30g K-Na-Tartarat

ve 20 mL 2N NaOH ilave edilerek son hacim 100mL ye tamamlanır (Miller, 1951).

3.1.3. Elektroforezde Kullanılan Solüsyonlar

3.1.3.1. Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu)

29.2 g Akrilamid, 0.8g Bisakrilamid bir miktar distile suda çözülür ve son

hacim 100 mL olacak şekilde distile su ile ayarlama yapılır. Monomer çözeltisi koyu

renkli şişede ve buzdolabında saklanır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.2. Solüsyon B (4X)

75 mL 2M Tris-HCl (pH 8.8), 4 mL %10’luk SDS, ve 21 mL distile su

karışımından oluşur. Nativ jel uygulamalarında SDS kullanılmadığı için son hacim

100 mL oluncaya kadar distile su eklenir (Bollag ve ark, 1996).


56

3.1.3.3. Solüsyon C (4X)

50 mL 1M Tris-HCl (pH 6.8), 4 mL %10’luk SDS, 46 mL distile su

karışımından meydana gelir. Nativ jel uygulamalarında SDS kullanılmadığı için son

hacim 100 mL oluncaya kadar distile su eklenir (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS) %10

0.5g AMPS 5mL distile su içerisinde çözülerek hazırlanır (Bollag ve ark,

1996).

3.1.3.5. Elektroforez Tamponu

3g Tris, 14.4g Glisin, 1g SDS bileşikleri bir miktar distile suda çözülür ve son

hacim 1 L olacak şekilde distile su eklenerek hazırlanır. Nativ Jel uygulamasında

SDS karışımdan çıkartılarak yürütme tamponu hazırlanır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X)

0.6 mL 1M Tris-HCl (pH 6.8), 5 mL Gliserol (%50), 2 mL %10’luk SDS, 0.5

mL β-Merkaptoetanol, 1 mL %1’lik Bromfenol mavisi ve 0.9 mL distile su

karışımından meydana gelir (Bollag ve ark, 1996). Nativ jel uygulmasında SDS

içermeyen bir örnek yükleme tamponu hazırlanır.

3.1.3.7. SDS Jel boyama (Staining) Solüsyonu

1g Coomassie Brillant Blue R-250, 450 mL metanol içerisinde çözülüp filtre

kağıdından süzüldükten sonra, karışımın üzerine 100 mL asetik asit ve 450 mL

distile su eklenerek hazırlanır (Bollag ve ark, 1996).


57

3.1.3.8. SDS Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu

100 mL metanol, 100 mL asetik asit ve 800 mL distile su karışımından oluşur

(Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.9. SDS-PAGE’nde Zimogram Analizleri İçin Renatürasyon Solüsyonları

Renatürasyon Solüsyonu-1 ( pH 7.5): 10mM Tris, 5mM β-Merkaptoetanol

ve %20 izoproplanol karıştırılarak istenilen miktarda hazırlanır.

Renatürasyon Solüsyonu-2 (pH 7.5): 50mM Tris, 5mM β-Merkaptoetanol

ve 1mM EDTA karıştırılarak istenilen miktarda hazırlanır.

Renatürasyon Solüsyonu-3 (pH 6.8): 50mM sodyum fosfat tamponu şekilde

hazırlanır (Saul ve ark, 1990)

3.1.3.10. Nişastalı Glisin-NaOH Tamponu (pH 10.0) Çözeltisi

Nativ PAGE elektroforezde gerçekleştirilen analiz sonucunda, jeldeki amilaz

aktivitesinin saptanması amacıyla kullanılır. Bu amaçla 50mM Glisin-NaOH

tamponuna (pH 10.0) son konsantrasyon %1 (w/v) olacak şekilde çözünür nişasta

eklenerek hazırlanır (Hashim ve ark, 2005).

3.1.4. İnce Tabaka Kromatografisi Solüsyonları

3.1.4.1. Bütanol-Asetik Asit-Distile Su

Amilaz enzimine ait reaksiyon ürünlerinin saptanması amacıyla yapılan ince

tabaka kromatografi çalışmalarında geliştirme solüsyonu olarak kullanılmıştır.

Bütanol-asetik asit-distile su, 3:1:1 (v/v/v) şeklinde hazırlanır (Kim ve ark, 1995).


58

3.1.4.2. %20’lik Sülfirik Asit (H2SO4) Çözeltisi

80 mL Etil alkol (%96) içerisine 20 mL H2SO4 çözeltisi (v/v) eklenerek

hazırlanır (Kim ve ark, 1995).

3.1.4.3. Kloroform-Asetik Asit-Distile Su Çözeltisi

Selülaz ve ksilanaz enzimlerine ait hidroliz ürünlerinin belirlenmesinde

hareketli faz olarak kullanılmıştır. Kloroform-asetik asit-distile su (6:7:1 v/v/v)

karıştırılarak hazırlanır (Singh ve ark, 2004).

3.1.4.4. Anilin-Difenilamin-Ortofosforik Asit Çözeltisi

Anilin (%1) ve v/v-difenilamin (%1) w/v-aseton içerisinde çözüldükten sonra

karışıma, çözeltideki konsantrasyonu %10 olacak şekilde ortofosforik asit (v/v) ilave

edilir (Singh ve ark, 2004).

3.1.4.5. D-Glikoz Çözeltisi (%1 w/v)

İnce tabaka kromatografisinde son ürünlerin tanımlanması amacı ile standart

olarak kullanılmıştır.

3.1.4.6. Maltoz Çözeltisi (%1 w/v)

İnce tabaka kromatografisinde son ürünlerin tanımlanması amacı ile standart


3.1.4.7. Ksiloz Çözeltisi (%1 w/v)

İnce tabaka kromatografisinde son ürünlerin tanımlanması amacı standart



59

3.1.5. 16S rDNA Dizisinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Solüsyonlar

3.1.5.1 DNazolDirect

Molecular Research Center Inc.’ den temin edilmiştir ve bakterilerden DNA

izolasyonu için kullanılmıştır.

3.1.5.2.TAE (Tris-Asetik Asit-Edta)Tamponu (1X)

Agaroz jelinin hazırlanmasında ve agaroz jel elektroforezinde yürütme

tamponu olarak kullanılmıştır.

3.1.5.3.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Kullanılan Primerler

Primer1F 5’GAGTTTGATCCTGGCTCA 3’ (27F)

Primer2R 5’CGGTGTGT[A/G]CAAGGCCC 3’(1385R)

3.2. Metod 3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi

3.2.1.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Van gölü çevresinden 20 farklı bölegeden alınan toprak örnekleri, halo-

alkalofilik Bacillus sp. suşlarının izolasyonu için 1 g tartılarak 4.5 mL steril distile su

içerisine ilave edilip homojen şekilde karıştırıldıktan sonra, 80 oC de 10 dakika

sıcaklık uygulaması gerçekleştirilmiştir (Lennette ve ark, 1985).

Tek koloni elde edilmesi amacıyla steril su bulunan tüplerde seri sulandırma

yapılarak %10 NaCl içeren ve pH’sı 10.0 olan LB agar besiyerine yayma ekim

şeklinde ekim yapılarak 37 oC de inkübasyona bırakılmıştır.

Inkübasyondan sonra besiyerinde tek düşmüş koloniler morfolojilerine göre

değerlendirilmiş, karakteristik Bacillus görünümüne sahip koloniler LB agar

besiyerine çizgi şeklinde ekilerek 37 oC bir gece inkübasyona bırakılmıştır. LB agar

ortamında üreyen suşlar sonraki analizler için stok kültür şeklinde saklanmışlardır.


60

3.2.1.2. Bakteri Teşhisi

Seçilen bakteri örneklerinin teşhisi için Gram boyama, hareketlilik, spor

oluşumu gibi mikroskopi testlerinin yanısıra katalaz ve kültür morfolojisinin

incelenmesi ile glikoz, ksiloz ve mannitolden asit oluşumu gibi biyokimyasal testler

yapılmıştır (Ratanakhanokchai ve ark, 1999).

3.2.1.3. Bakteri Teşhisi İçin Genomik DNA Hazırlanması

5 mL Nutrient Broth 37 °C’de çalkalayıcıda 24 saat inkübe edilmiştir.

Eppendorfa 1.5 mL alınarak 7000 dev/dak 5 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı atılarak

hücre pelletine 0.1 mL DNazolDirect (Molecular Research Center Inc,) ilave

edildikten sonra 80°C 15 dakika bekletilerek genomik DNA elde edilmiştir. Agaroz

jelde kontrolu yapılmıştır.

3.2.1.4. Agaroz Jel Hazırlanması

%0.7’ lik jel hazırlamak amacı ile 0.48 g agaroz 40 mL 1X TAE agaroz

elektroforez tamponuna eklenmiş ve mikrodalga fırında çözülmüştür. Karışımın

homojen olması sağlanmıştır. Yaklaşık 40-45 °C’ ye kadar soğutularak son

konsantrasyonu 0.3 µg/mL olacak şekilde 10mg/mL’ lik Etidyum Bromür’den 3 µL

eklenmiştir. Jel kasete dökülerek 30-60 dakika süre ile donması beklenmiştir.

Taraklar çıkarılarak ve jel içinde 1XTAE bulunan elektroforez tankına

yerleştirilmiştir.


61

3.2.1.5. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Reaksiyon Koşulları

Bileşenler Miktar 10x PCR buffer 2,5µL MgCl2 (25 mM) 2 µL Primer 1 F (25pmol/ µL) 1 µL Primer 2 R (25pmol/ µL) 1 µL DNA (genomik) 2 µL dNTP (25mM) 0,3 µL Taq polimeraz (5U/ µL) 0,5 µL Distile Su 25 µL

3.2.1.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Koşulları

Sıcaklık Süre 94 °C 5:00 dakika 94 °C 1:00 dakika 56°C 1:00 dakika 35 döngü 72°C 3:00 dakika 72°C 10:00 dakika

Döngüler tamamlandığında PCR ürünü daha sonraki kullanımlar için +4oC’

de bekletilmiştir. 3.2.1.7. 16S rDNA Dizisinin Belirlenmesi

İki farklı primer [Primer 1: 27 F ( 5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA-3’) ve

Primer 2: (1385R) (5’-CGGTGTGT[A/G]CAAGGCCC-3’) kullanılarak elde edilen

PCR ürünü EZ-10 Spin Column PCR saflaştırma kiti (Bio Basic Inc.) ile firma

tarafından verilen yönteme göre temizlendi. Dizi analizi ABI310 ile aynı primerler

kullanılarak gerçekleştirildi. Benzerlik araştırması (GenBank/EMBL/DDBJ) Basic

Local Alignment Search Tools (BLAST) programı (Altschul ve ark, 1990)

kullanılarak ve referans veritabanları kullanılarak yapılmıştır. 16S rDNA dizisi

Clustal Multiple Alignment Program (Clustal W 1.8) (Thompson ve ark, 1994)

kullanılarak dizinler oluşturulmuştur.


62

3.2.2. Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.2.2.1. Katı Besiyerinde Amilaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Nişastalı M9 (pH:10.0 ve % 10 NaCl içeren) besiyerine çizgi şeklinde ekilen

suşlar, 3 gün 37oC de inkübasyona bırakıldıktan sonra besiyeri petri kutusunun

kapağına dökülen iyod buharına tutularak boyama işlemi gerçekleştirilmiştir. Nişasta

içeren zemin koyu maviye boyanırken, amilaz enzimi üreten kolonilerin çevresinde

şeffaf zon oluşumunun gözlenmesiyle, bu suşlar amilaz pozitif olarak

değerlendirilmişlerdir (Hols ve ark, 1994).

3.2.2.2. Katı Besiyerinde Selülaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Topraktan izole edilen suşlar CMC agar besiyerine (pH:10.0 ve % 10 NaCl

içeren) çizgi şeklinde ekilerek 37oC’de bir gece inkübasyona bırakılmıştır.

İnkübasyon sonunda petri kutusuna %0.1’lik kongo kırmızısı çözeltisinden dökülerk

örnekler 15 dakika süreyle boyanmıştır.

Bu sürenin sonunda boya dökülerek boyanın geri alınması amacıyla besiyerine

1M NaCl çözeltisi ilave edilir ve 15 dakika inkübasyon yapılmıştır. Boyama işlemi

sonunda etrafında sarı hidroliz zonu gözlenen suşlar selülaz (glukanaz) pozitif olarak

değerlendirilmiştir.

3.2.2.3. Katı Besiyerinde Ksilanaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Oat spelt ksilan içeren besiyerine çizgi şeklinde ekilen örnekler 37oC’de bir

gece süreyle inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda besiyerine %0.1’lik kongo

kırmızısı çözeltisinden dökülerek ve 15 dakika boyama işlemi gerçekleştirilmiştir.

Boyama süresinin sonunda fazla boyanın ortamdan uzaklaştırılması için

besiyerine 1M NaCl çözeltisi ilave edilmiş ve 15 dakika inkübasyon yapılmıştır.

Etraflarında sarı hidroliz zonu bulunan suşlar ksilanaz pozitif olarak

değerlendirilmiştir(Voget ve ark, 2006).


63

3.2.2.4. Bakterilerin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezlerinin

Gerçekleştiği pH Aralığının Saptanması

Bu amaçla 5.0-12.5 arasında pH değerine sahip Nişastalı M9, CMC agar, ve

oalt spelt ksilan agar besiyerleri hazırlanarak, tanımlamaları yapılan amilaz, selülaz

ve ksilanaz pozitif suşlar, içerisinde substrat bulunan katı besiyerlerine çizgi şeklinde

ekilmişlerdir.

Örneklerden amilaz pozitif sular 72 saat, selülaz ve ksilanaz pozitif suşlar 24

saat süresince 37oC’de inkübe edilmişlerdir. İnkübasyon sonunda üreme ve enzim

sentezinin gerçekleştiği pH aralığı, koloni ve aktivite zon çapları ölçülerek

saptanmıştır (Hols ve ark, 1994; Voget ve ark, 2006).

3.2.2.5.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyon Sıcaklığının Saptanması

Bakteriler substratlarının bulunduğu ve optimum üreme gösterdikleri pH’da

besiyerlerine çizgi şeklinde ekilerek 25oC, 37 oC, 45 oC ve 50 oC’ de inkübe edilmiş

ve üremenin ve enzim sentezinin gerçekleştiği sıcaklık aralığı ve optimum sıcaklık

değerleri saptanmıştır (Voget ve ark, 2006).

3.2.2.6.Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyonu İçin Gerekli Tuz

Konsantrasyonlarının Saptanması

Enzim sentezleme yetenekleri pozitif suşlardan AB-17, C-14 ve X-13,

içerisinde her üç enzim için uygun substratların bulunduğu, faklı konsantrasyonlarda

tuz içeren (%3, %5, %7, %10, %13, %15, %20) besiyerlerine çizgi ekim yapılarak

bakteriler her üç enzim için uygun süreyle 37 oC de üretilmişler ve aktivite analizleri

yapılmıştır.


64

3.2.3.1. Sıvı Kültürde Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma

Katı besiyerinde farklı pH, NaCl konsantrasyonu ve sıcaklıklarda test edilen

bakteriler içerisinden seçilen AB-17 suşu pH’sı 9.5 olan %10 NaCl tuz içeren M9-

Nişastalı sıvı besiyerlerine ekilerek 37oC’de 3 gün süreyle 250 devir/dakika

çalkalayıcıda üretilmiştir. Bakteriler +4oC ve 8000 dev/dak de 30 dakika santrifüj

edilerek çöktürülmüş ve hücresiz süpernatant elde edilmiştir.

Yeni bir ortama aktarılan süpernatant’ın üzerine, orijinal hacmin %70’i

oranında %96’lık soğuk etanol eklenmiş ve –33oC de bir gece bekletilmiştir. Çökmüş

olan örnek, +4 oC de 15 dakika süreyle 10000 dev/dak santrifüj edilerek enzim sıvı

fazdan geri kazanılmıştır. Çökelti, pH’sı 7.0 olan 0.1M’lık sodyum fosfat

tamponunda çözülerek +4oC’de saklanmıştır (Srivastava, 1987).

3.2.3.2. Sıvı Besiyerinde Selülaz ve Ksilanaz Enzim Üretimi ve Kısmi

Saflaştırma

Bakteri örneklerinde C-14 ve X-13 olarak adlandırılan suşlar enzim üretimi

için pH’sı 9.5’a ayarlanmış (%10’luk Na2CO3 ile), %10 NaCl içeren CMC ve

Ksilanlı sıvı besiyerlerine ekilerek inkübasyona bırakılmışlardır. Bakteriler 37oC’de

250 dev/dak çalkalamak suretiyle bir gece inkübe edilmiştir. Kültür +4oC ve 8000

dev/dak’da çöktürülerek bakterilerin fermentasyon ortamından ayrılması

sağlanmıştır.

Elde edilen hücresiz sıvı faz amilaz eldesinde olduğu gibi soğuk etanol

presipitasyonu çöktürülmüştür. Uygun sıcaklık ve süreyle gerçekleştirilen çökeltme

işleminden sonra hazırlanan örnek, +4 oC de 15 dakika süreyle 10000 dev/dak

santrifüj edilerek enzim sıvı fazdan geri kazanılmıştır. Çökelti, pH’sı 7.0 olan

0.1M’lık sodyum fosfat tamponunda çözülerek +4oC’de saklanmıştır.


65

3.2.3.3. Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerinin Saptanması

Kısmi saflaştırma yöntemi ile elde edilen enzimlerin optimum aktivite

gösterdikleri pH değerlerinin saptanması için Na-fosfat (pH 6.0-8.0), Glisin-NaOH

(pH 8.5-10.5) ve Boraks-NaOH (pH 11.0-12.5) tamponları kullanılarak farklı pH

değerlerine sahip (pH 6.0-13.0) ve içerisinde %1 Nişasta, CMC ve Ksilan bulunan

substrat çözeltileri hazırlanmıştır.

Aktivite tayini için 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat tüpte karıştırılarak

37oC’de 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda enzim substrat karışımına

toplam hacim kadar DNS ayıracı eklenerek, 5 dakika kaynar suda kaynatılmış,

soğutma işleminden sonra 550nm dalga boyunda UV visible spektrofotometre

(Cecil-5500) kullanılarak, köre karşı absorbans değerleri kaydedilmiştir. Kör, eşit

hacimde substrat ve DNS karışımı kullanılarak hazırlanmıştır.

En yüksek absorbans değerinin elde edildiği pH değeri baz alınarakr % rölatif

enzim aktivitesi bulunmuştur. Her test üç seri tüpün ortalaması alınarak, üç kez

tekrarlanmıştır. Her üç enzim için aynı uygulama gerçekleştirilmiştir.

3.2.3.4.Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerlerinin

Saptanması

Enzimleri optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin belirlenmesi amacı ile

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC’lik sıcaklık değerlerinde inkübasyonlar

gerçekleştirilmiştir. Amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin

saptanmasında aktivitenin 20-100 aralığında stabil olması nedeniyle analizlere 110,

120, 130, 140, 150 ve 160oC’ye kadar devam edilmiştir. Analizler 20-90oC aralığında

su banyosunda, 100-160 oC aralığındar ise yağ banyosunda gerçekleştirilmiştir

(Tatar, 2007).

Enzim (0.5 mL) ve substrat (0.5 mL) karışımı (optimum aktivitenin

gerçekleştiği pH değerinde hazırlanmış) belirtilen sıcaklıklarda 30 dakika inkübe

edildikten sonra örnek karışımına eşit hacimde DNS eklenerek 5 dakika kaynatma

işlemi uygulanmıştır. Soğutulan örnekler 550nm dalga boyunda UV visible


66

spektrometrede değerlendirilmiştir. En yüksek absorbansın elde edildiği sıcaklık

değeri baz alınarak % rölatif aktivite saptanmıştır.

3.2.3.5. Enzimlerin Termal (Sıcaklık) Stabilitelerinin Saptanması

Termal (sıcaklık) stabilitelerinin saptanması için enzimler 20-100oC

aralığındaki sıcaklıklarda 30 dakika ön inkübasyona bırakılmışlardır. Ön inkübasyon

uygulamasından sonra 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat (optimum aktivitenin

gerçekleştiği pH değerinde hazırlanmış) karıştırılarak optimum aktivitenin görüldüğü

sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda karışıma

eşit hacimde DNS çözeltisi eklenmiş, 5 dakikalık soğutmanın ardından spektroskopik

ölçüm yapılmıştır.

Orijinal enzim aktivitesinin saptanması için inaktivasyon amacı ile ön işlem

yapılmamış enzim ve substrat uygun miktarlarda karıştırılarak, optimum sıcaklık

değerinde aktivite analizi yapılmıştır.

3.2.3.6. Enzimlerin pH Stabilitelerinin Belirlenmesi

Etanol presipitasyon tekniği kullanılarak izole edilen ve stok örnek şeklinde

tamponda resüspanse edilerek saklanan enzimden 2 mL alınarak eppendorf tüpüne

transfer edilmiş ve 10.000dev/dak 5 dakika çöktürülmüştür. Üst faz atıldıktan sonra

tüpe yeni hazırlamış tampon çözeltiden 2 mL (pH 8.0; 9.0; 10.0; 11.0 ve 12.0)

eklenerek, enzim yeniden resüspanse edilmiştir. Karışım 37 oC de 42 saat ön

inkübasona bırakılmıştır.

Aktivite analizi için ön inkübasyonu yapılmış enzim ve optimum pH daki

tamponda hazırlanmış substrat çözeltisinden 0.5’er mL alınarak optimum sıcaklığın

gerçekleştiği sıcaklık değerinde 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örneğin

üzerine eşit hacimda DNS ayıracı eklendikten sonra soğutma işlemi uygulanmış ve

spektrofotometrede okuma yapılarak sonuç değerlendirilmiştir.


67

3.2.3.7. NaCl’ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi

Sıvı enzim örneğinden 2 mL alınarak eppendorf tüpünde çöktürülmüş, sıvı faz

atılarak tüpe farklı konsantrasyonda NaCl (%3, %5, %7,5, %10, %15 ve %20)

çözeltilerinden 2 mL eklenmiş ve enzim tekrar resüspanse edilmiştir. Sıvılaşmış

enzim 37 oC de 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır.

Ön inkübasyon aşamasından sonra, 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat (optimum

aktivitenin görüldüğü pH değerinde hazırlanmış) karıştırlarak optimum aktivitenin

gerçekleştiği sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örneğin üzerine

eşit hacimde DNS ayıracı eklendikten sonra soğutma işlemi uygulanmış ve


3.2.3.8. İnhibitörlerin Enzim Aktivitesine Etkisi

Enzim inhibitörü olarak 5mM EDTA, %1’lik SDS, %1’lik TritonX-100, 5mM

CaCl2, 5mM ZnCl2, 5mM KCl, 5mM Na2SO3, 5mM PMSF, %1’lik β-

Merkaptoetanol ve 8M Üre kullanılmıştır. Her inhibitör madde için 2 mL enzim

örneği alınarak eppendorfa transfer edilmiş ve 10.000 dev/dak santrifüj edilerek

çöktürülmüştür. Sıvı faz atıldıktan sonra enzimin üzerine 2 mL inhibitör madde

eklenerek 37 oC de 15 dakika ön inkübasyon gerçekleştirilmiştir.

Ön inkübasyon aşamasından sonra, 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat (optimum

aktivitenin görüldüğü pH değerinde hazırlanmış) karıştırılarak optimum aktivitenin

görüldüğü sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örneğin üzerine eşit

hacimde DNS ayıracı eklendikten sonra soğutma işlemi uygulanmış ve



68

3.2.4. Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık ve

Zimogram Analizi

Enzimlerin moleküler ağırlıkları ve enzim fraksiyonuna ait aktivitenin

(zimogram) analizi için SDS-PAGE jel ve Nativ jel sistemlerinden yararlanılmıştır

(Laemmli, 1970).

3.2.4.1. SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması

Çizelge 3.4: Ayırıcı Jelin Bileşimi (%10’luk)

Solüsyonlar Miktar Sol A 6.5 mL Sol B 5.0 mL

Distile Su 8.4 mL AMPS (%10) 66 µL

TEMED 13 µL

Sol A, Sol B ve distile su Çizelge 3.4’de belirtilen miktarda alınarak şişe

içerisine konur, moleküler oksijenin uzaklaştırılması için 5 dakika vakum pompası

ile degaz işlemi gerçekleştirilir. Örneğin üzerine uygun miktarda yeni hazırlanmış

AMPS çözeltisi ve TEMED ilave edildikten sonra cam plakalara dökülür.

Jelin üst yüzeyi atmosferik oksijenin difüzyonunu önlemek ve düzgün bir

tabaka elde etmek amacı ile ince bir su tabakası ile kapatılarak oda sıcaklığında

polimerizasyona bırakılır.

Çizelge 3.5: Dengeleyici Jelin Bileşimi

Solüsyonlar Miktar Sol A 1.5 mL Sol C 2.25 mL Distile Su 5.25 mL AMPS (%10) 30 µL TEMED 7.5 µL


69

Ayırma jelinin polimerizasyonu tamamlandıktan sonra jelin üst yüzeyindeki

distile su atılarak, üzerine uygun hacimde dengeleme jeli dökülür. Jele örnek sayısına

uygun tarak yerleştirdikten sonra oda sıcaklığında polimerizasyona bırakılır. Jelin

hazırlanmasında izlenecek yol ayırma jeli ile aynıdır (Bollag ve ark, 1996).

3.2.4.2. Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması

Selülaz ve Ksilanaz enzimlerinin zimogram analizleri CMC ve ksilan içeren

SDS-PAGE’de gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla uygun konsantrasyonda hazırlanan jel

karışımına %3’lük CMC (w/v) ve ksilan (w/v) çözeltilerinden 1 mL eklenerek

polimerizasyon gerçekleştirilmiştir. Polimerizasyon işleminden sonraki uygulamalar

standart SDS-PAGE uygulamasına göre yapılmıştır.

3.2.4.3. Amilaz Enzimi Zimogram Analizi Için Doğal (Nativ) Jelin Hazırlanması

Doğal jel elektroforezi için kullanılacak jel bileşenleri (Sol B, Sol C,

Elektroforez tamponu, ve örnek yükleme tamponu) SDS’siz olarak hazırlanır. Jel

karışımlarının hazırlanması ve elektroforez uygulaması bir önceki aşamaya (3.2.4.1)

uygun şekilde gerçekleştirilir.

Elektroforez işlemi tamamladıktan sonra sonra, Jel pH’sı 10 olan Nişastalı 50

mM Glisin-NaOH tamponu içerisinde 50oC de çalkalamalı inkübatör kullanılarak (50

dev/dak) 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyon sonunda lügol çözeltisi kullanılarak 5-

10 dak. boyama yapılıp, aktivite zonu aranır.

3.2.4.4. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi

Polimerize olmuş jeldeki tarak, oluşan örnek yükleme gözleri yırtılmadan

çıkarılır ve örnek yükleme tamponu ile karıştırılmış protein örnekleri ceplere 15-30

µL arasında gözlere doldurulur. Jel uygulaması SDS-PAGE ise örnek yükleme

tamponu ile 1/3 oranında karıştırılan protein örnekleri yüklemeden önce 2 dakika


70

kaynatılarak tam bir denatürasyon sağlanır. Eğer uygulama doğal jel ise kaynatma

işlemi yapılmaz.

Elektroforez işlemi sonunda moleküler ağırlıkları doğru saptamak için

gözlerden birine içeriği ve moleküler ağırlığı bilinen protein standart’ı (marker)

konur.

Örnek yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez uygulaması başlatılır.

Örnekte bulunan izleme boyası ayırma jeli içine girinceye kadar yaklaşık 30 mA,

daha sonra 20 mA akım uygulanır. İzleme boyası jelin diğer ucuna 2 cm uzaklığa

ulaştığı zaman elektroforez işlemi sonlandırılır.

3.2.4.5. SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri

Elektroforezden sonra jel, cam plakalar arasından çıkarılarak Boyama

solüsyonuna (Staining) konulur. Yaklaşık 12 saat boyunca boyama solüsyonu içinde

bırakıldıktan sonra birkaç kez saf sudan geçirilir ve jele bağlanmış fazla boyanın

uzaklaştırılması için bir gece boyayı geri alma çözeltisinde inkübasyon

gerçekleştirilir. Protein örneklerine bağlanan boya jelden çıkmadığı halde jelin diğer

bölgelerindeki boya ortamdan uzaklaşır ve örnekler görünür hale gelirler.

SDS-PAGE uygulamasında zimogram analizi amaçlandığında elektroforez

işlemi sonlandırıldıktan sonra boyama işlemi yerine, renatürasyon uygulaması

yapılır. Bu işlem ya jelin tamamı kullanılarak ya da tek bir örnek analiz edilip jel

ikiye bölünerek yapılır İkinci uygulama gerçekleştirildiğinde, jelin bir parçası

boyama işlemi diğer parçası renatürasyon uygulaması için kullanılır.

Renatürasyon uygulaması üç farklı çözeltide farklı sıcaklık ve süreler

kullanılarak jedeki SDS’nin çıkarılması temeline dayanır. Bu amaçla, jel, solüsyon-

1’de 1 saat (50 dev/dak çalkalanarak), sol-2’de bir gece +4oC’de bekletilerek ve sol-

3’te inkübasyon yapılır.

Renatürasyon işleminden sonra, jel cam plaka üzerine alınarak plastik kapaklı

bir kutu içerisine konur ve enzimin izole edildiği sıcaklıkta (sıcaklığın jele zarar

vermediği durumlarda optimum aktivite sıcaklığında) 6 saat inkübasyon yapılır.

İnkübasyon sonunda selülaz ve ksilanaz enzimlerinin aktivasyon zonlarını belirlemek


71

için %0.1’lik Kongo Kırmızısı (w/v) içerisinde 15 dakika boyama yapılır. Ardından

1M NaCl çözeltisi kullanarak 15 dakika süre ile fazla boyanın geri alınma işlemi

gerçekleştirilir. Sarı zonlar, enzimin aktivite gösterdiği bölgelerdir.

3.2.5. Enzim Substrat Reaksiyonu Sonunda Açığa Çıkan Son Ürünlerin

Saptanması

Enzim substrat etkileşimine bağlı olarak substratların hidrolizi sonucu açığa

çıkan son ürün veya ürünlerin saptanması amacı ile İnce Tabaka Kromatografisi

analizleri gerçekleştirilmiştir.

3.2.5.1. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Plakalarının Hazırlanması

Daha önceden yıkanmış ve kurutulmuş standart ölçüdeki (20x20) cam plakalar,

plaka hazırlama sistemine (leveling device) yerleştirilerek, kenar raylar ve sabitleme

mandalı ile tutturulurlar. Kieselguhr “Silika Jel-GF254” materyalinden 25 g alınarak

50 mL (yaklaşık iki kat) distile su içerisinde, kabarcık oluşturmamasına dikkat

edilerek karıştırılır (ortalama 45 saniye).

Hazırlanan karışım, yayma aparatına doldurulur ve 0.25 mm kalınlıkta tabaka

oluşturacak şekilde cam plaka üzerine yayılır. Cam plakalar, örneğin kuruması için

30-45 dakika oda sıcaklığında tutulur. Beyaz renk oluşumu kurumanın göstergesidir.

Kuruyan plakalar tek tek ya da topluca (birbirine değmeden) dikey pozisyonda fırına

yerleştirilir ve 110-120oC sıcaklıkta 30-60 dakika aktive edilirler.

3.2.5.2. Amilaz Enzimine Ait Son Ürünlerin Saptanması

Fırında aktifleştirilmiş cam plakalara, optimum aktivite sıcaklığında bir saat

inkübe edilmiş enzim+substrat karışımının hidrolizi sonucu açığa çıkan son üründen,

mikropipet kullanılarak farklı miktarlarda (5µL ve 10µL) örnek konur. Damlatma

şeklinde gerçekleştirilen örnek uygulama işleminde, damla çapının 3 mm’den büyük


72

olamamasına özen gösterilmelidir. Aynı plaka üzerine son ürünün doğruluğunu

saptamak amacı ile markır olarak, %4’lük glikoz ve maltoz çözeltileri de ilave edilir.

Oluşan son ürünlerin bir birinden ayrılabilmesi için hazırlanan cam plaka,

örneklerin yüklendiği kenardan itibaren, solvent çözeltisine batırılarak (Butanol-

Asetik Asit-Distile Su karışımı, 3:1:1), moleküllerin silika jelde göç etmeleri

sağlanır. Bu işlem kapalı ortamda, 4-8 saat süreyle uygulanır.

Kromatografik analizi yapılan ürünlerin görünür hale gelebilmesi için plakanın

üzerine, etil alkolde hazırlanmış %20lik H2SO4 çözeltisi püskürtülür. Bu

uygulamanın hemen ardından, cam plakalar 120oC’lik fırına konulara, yaklaşık 30-45

dakika inkübe edilir.

3.2.5.3. Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerine Ait Son Ürünlerin Saptanması

Selülaz ve ksilanaz enzimleri uygun substrat çözeltileri ile enzimler için

optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklıkta reaksiyona sokulurlar. Oluşan reaksiyon

ürünleri 5 ve 10 µL miktarlarda silika jel üzerine yüklenirler. Selülaz ve ksilanaz

ürünlerinin doğrulanabilmesi için silika jel plağına %1’lik ksiloz, glikoz ve maltoz

örneklerinden 5’er µL hacimde marker ilave edilir.

Bu enzimlere ait son ürünlerin silika jel ortamında yürütülmesi için hareketli

faz olarak kloroform-asetik asit-distile su (6:7:1) karışımından yararlanılmıştır.

Yürütme işlemi, amilaz enzimi reaksiyon ürünlerinin analizindeki gibi

gerçekleştirilir. Reaksiyon ürünlerinin görünür hale getirilmesi için anilin-

difenilamin-ortofosforik asit karışımı jelin üzerine püskürtülür. Jel 120oC’lik fırında

30-45 dak. kurutulur.

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Ashabil AYGAN

73

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Van Gölünde suların çekildiği kıyı şeridinin 20 farklı bölgesinden toprak

örnekleri alınmıştır. Laboratuarda ısısal ön işlemden geçirilen topraklar (80 oC de 10

dakika) pH’sı 9.5 olan ve %10 NaCl içeren LB agar besiyerine tek koloni düşecek

şekilde yayılmışlardır. Örnekler 24 saat süreyle 37oC’ de inkübe edildikten sonra

koloni morfolojileri farklı toplam 242 bakteri suşu izole edilmiştir. İzole edilen

bakteriler LB agar ortamına çizgi şeklinde üretildikten sonra, enzim aktivitesi, üreme

pH değerleri, üreme sıcaklık değerleri ve enzim üretiminde kullanılmak üzere, stok

kültür şeklinde saklanmışlardır.

Toplam 242 bakteri suşu içerisinde 76 suşun (%31.66) amilaz enzimi ürettiği

saptanmış, yapılan analizlerde en iyi sonucu veren AB-17 suşu enzim üretimi ve

karakterizasyonu için seçilmiştir. Bu suş biyokimyasal testlerden yararlanılarak

Bacillus sp. şeklinde tanımlanmıştır.

İzolasyonu yapılan suşlar, selülaz ve ksilanaz enzimlerini üretme yetenekleri

için de analiz edilmişlerdir. Toplam 242 örnek içerisinde 35 (%14.6) selülaz, 32

(%13.2) suş, ksilanaz pozitif özelliktedir. Bunlar içerisinde en yüksek verimin elde

edildiği C-14 suşu selülaz, X-13 suşu ise ksilanaz enziminin üretimi ve

karakterizasyon için seçilmiştir. Bu suşlar, biyokimyasal analiz sonuçlarına göre

Bacillus sp. olarak tanımlanmıştır.

4.2. Bakterilerin Teşhisi

4.2.1.Bakterilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri

Enzim üretimi ve karakterizasyonu için kullanılmak üzere seçilen suşlar, geniş,

beyaz renkli ve dalgalı kenarlı koloni morfolojisine sahiptirler. Suşlar gram pozitif,

aerob, spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli bakterilerdir. Glikoz, ksiloz ve

mannitolü asit oluşturarak parçalamaka ve katalaz pozitif özellik göstermektedirler.


74

Koloni morfolojileri ve diğer özelliklerine göre seçilen suşlar Bacillus sp. şeklinde

tanımlanmıştır.

4.2.2. AB-17 Suşunun 16S rDNA Dizi Analizi Sonuçları GGGCGAGTGGGCTATCTGCAGTCGAGCGAACGAAGGGAGCTTGCTCCCGG ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGAC TGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCG CATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCC GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGC GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCT CTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGG TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC TCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTANACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC

16S rDNA dizisi Clustal Multiple Alignment Programı kullanılarak elde

edilen dizi sonuçlarına göre Bacillus sp.AB17 suşu %99 oranında Bacillus pumilus

olarak tanımlanmıştır.

4.3. AB-17 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları

4.3.1. AB-17 Suşunun Farklı pH Değerleri ve 37oC’de Üreme ve Amilaz Enzim

Aktivitesine Ait Bulgular

AB-17 suşunun 37oC’de ve farklı pH’da hazırlanmış M9 besiyerinde üreme ve

enzim sentezine ait bulgular Çizelge 4.1’de gösterilmiştir.


75

Çizelge 4.1. AB-17 suşunun 37oC’de farklı pH’larda üreme ve Enzim Üretme sonuçları.

pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5

KÇ 0 2 2 2 3 4 4 4 2 2 2 2 2 ZÇ 0 6 14 14 14 14 18 14 8 6 2 2 0

(KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Enzim Hidroliz Zon Çapı (mm)

AB-17 suşu pH:7.0-12.5 arasında üreme göstermekle birlikte pH 9.0-10.0

aralığında optimum değer elde edilmiştir. Analiz edilen pH değerlerinden 7.0-12.0

aralığında enzim sentezi gerçekleştiği bulunmuştur. Özellikle pH 7.5-10.0 aralığında

14 mm’lik aktivite zon çapına ulaşılırken, pH 11.5-12.0 değerlerinde 2 mm zon çapı

elde edilmiştir.

Enzim sentezi optimum (18 mm aktivite zon çapı) pH 9.5 de gözlenmiştir. En

iyi üreme ve en yüksek enzim sentezinin pH 9.5 de geçekleşmesi, bakterileri

izolasyonlarının gerçekleştirildiği pH değeri ile (pH 9.5) uygunluk göstermektedir.

Bu sonuçlar enzim üretimi için seçilen AB-17 suşunun orta düzeyde halofil ve alkali

olduğunu göstermektedir.

4.3.2. AB-17 Suşunun Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’deki Üreme ve Amilaz

Enzim Aktivitesine Ait Bulgular.

AB-17 suşu pH’sı 9.5’e ayarlanmış nişastalı M9 besiyerinde 25oC, 37oC, 45 oC

ve 50 oC’de inkübe edilmiş, üreme ve enzim üretme yetenekleri araştırılmıştır.

Çizelge 4.2. AB-17 suşunun pH 9.5’da farklı Sıcaklıklarda Üreme ve Enzim Üretme sonuçları. Sıcaklık 25oC 37 oC 45 oC 50 oC

KÇ 4 4 1 0

ZÇ 15 17 0 0

(KÇ:Koloni Çapı (mm); ZÇ: Hidroliz Zon Çapı (mm)

Elde edilen verilere göre en iyi üreme 4 mm’lik koloni çapı ile 25 ve

37oC‘lerde görülürken, 45oC de 1 mm koloni çapına ulaşılmıştır. Buna karşılık


76

50oC’de üreme gerçekleşmemiştir. Aynı scaklık değerlerindeki enzim sentezleme

özelliği araştırıldığında ise sadece 25 ve 37 oC’lerde aktivite zonu oluşmuştur.

Maksimum zon oluşumu 17 mm ile 37oC de gerçekleşmiştir. Sıcaklık değerlerinden

45 ve 50 oC’ler de ise enzim sentezi gözlenmemiştir. Bu sonuçlar enzim üretimi

amacı için seçilen suşun mezofil özellikte olduğunu göstermektedir.

4.3.3. M9 Nişastalı Agar Besiyerinde Farklı NaCl Konsantrasyonlarında Bakteri

Üreme Davranışı ve Enzim Sentezine Ait Bulgular

AB-17 suşu pH:9.5 ve %3-20 konsantrasyonda NaCl içeren M9 nişastalı agarda

37oC’de inkübe edilmiş, üreme ve enzim sentezleme yeteneği araştırılmıştır. Elde

edile bulgular Çizelge 4.3’ de gösterilmiştir.

Çizelge 4.3.AB-17 Suşunun Farklı Tuz Konsantrasyonunda Üreme ve Enzim

Üretimi Sonuçları Tuz Kons %3 %5 %7 %10 %13 %15 %20

KÇ 3 3 3 4 2 1 0

ZÇ 14 14 18 14 6 0 0


AB-17 suşu %3-%15 aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında üreme

gösterirken, %20 NaCl’lü ortamda üreme saptanmamıştır. Optimum üreme 4 mm

koloni çapı ile %10 NaCl’lü ortamda gerçekleşirken, %3-7 aralığında 3 mm koloni

çapı elde edilmiştir. Üreyen kolonilerdeki enzim üretimi ise %3-13 aralığındaki

NaCl’lü ortamlarda gerçekleşmiştir. Katı besiyerinde optimum enzim üretimi 18 mm

zon çapı ile %7’lik NaCl’lü ortamda görülürken, %3, %5 ve %7 NaCl bulunan

ortamlarda 14 mm, %13 NaCl’lü ortamda ise 6 mm zon çapı elde edilmiştir. Bu

sonuçlar enzim üretiminde kullanılan suşun orta düzeyde halofil olduğunu

göstermektedir (Ventosa ve ark, 1998).


77

4.4. C-14 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları

4.4.1. C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı pH Değerleri ve 37ºC’de Üreme ve

Selülaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular

CMC’li katı besiyerinde C-14 suşunun inkübasyonu sonucu elde edilen üreme

ve enzim sentezine ait bulgular, Çizelge 4.4 de gösterilmiştir.

Çizelge 4.4.C-14 Suşunun Katı Besiyerinde ve Farklı pH Değerlerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları

pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5

KÇ 1 6 8 12 16 12 13 6 6 6 6 2 0 ZÇ 1 16 22 22 24 23 24 11 9 6 7 0 0


C-14 suşunun 37oC’lik inkübasyon ortamında pH 6.6-12.0 aralığında ürediği

bulunmuştur. Enzim sentezine ilişkin çalışmalarda ise pH 7.0-11.5 aralığında 16-7

mm arasında aktivite zonu elde edildiği, optimum aktivite zonunun 24 mm ile pH 8.5

ve 9.5’te gerçekleştiği saptanmıştır. pH 7.5-9.5 aralığında ise ortalama 23 mm

aktivite zonu gözlenmiştir.

En yüksek aktivite zonunun pH 8.5-9.5 aralığında gözlenmesi, bakterinin

alkalifil özellikte olduğunu göstermektedir. Horikoshi (1999), pH 8.5’in üzerinde

bakteri üremesi ve enzim sentezinin gerçekleşmesinin alkali organizmaların en

büyük özellikleri olduğunu bildirmiştir.

4.4.2. C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklık Değerleri ve pH 9.5’teki

Üreme ve Enzim Aktivitesine Ait Bulgular

C-14 suşu pH’sı 9.5 olan CMC agar besiyerinde 25, 37, 45 ve 50ºC’de inkübe

edilerek üreme ve enzim üretme yeteneği araştırılmıştır. Elde edilen veriler, Çizelge

4.5’ de gösterilmiştir.


78

Çizelge 4.5. C-14 Bakterisinin Farklı Sıcaklık ve pH 9.5’teki CMC Agar Besiyerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları

Sıcaklık 25oC 37 oC 45 oC 50 oC

KÇ 9 10 8 6

ZÇ 11 22 9 9


C-14 suşu, test edilen sıcaklık aralıklarında 25-50ºC aralığında 9-6 mm koloni

çapı oluşturarak üremiştir. Bacillus sp. C-14 suşunun optimum üremesi 10 mm

koloni çapı ile 37ºC de gerçekleşirken, 25ºC de 9 mm, 45ºC de ise 8 mm’lik koloni

çapı elde edilmiştir. Aynı sıcaklık değerlerinin kullanıldığı enzim sentezleme

çalışmalarında optimum sentezin 22 mm aktivite zonu ile 37ºC de gerçekleştiği

saptanmıştır. Bacillus sp. C-14 suşu, optimum üreme ve enzim sentezleme yeteneği

dikkate alındığında mezofil ve alkalin özellik göstermektedir.

Bununla birlikte, suşun 25ºC de 9 mm çaplı koloni, 11 mm aktivite zonu, 55ºC

de ise 6 mm çaplı koloni 9 mm çapında aktivite zonu oluşturması, psikrotolerant-

termotolerant aralığında yüksek düzeyde üreme ve enzim sentezleme yeteneğinde


4.4.3. C-14 Suşunun Farklı NaCl (%3-20) İçeren CMC’li Agarda Üreme ve

Enzim Sentezine Ait Bulgular

C-14 suşunun pH 9.5 ve %3-20 NaCl içeren katı besiyerindeki üreme ve enzim

üretimine ait sonuçlar Çizelge 4.6’te gösterilmiştir

Çizelge 4.6. C-14 Suşunun Katı Besiyeri ve Farklı Tuz Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Sentezlemesiyle İlgili Sonuçlar

Tuz Kons %3 %5 %7 %10 %13 %15 %20

KÇ 9 7 6 5 1 0 0

ZÇ 11 12 12 10 0 0 0


C-14 suşu %3-%13 NaCl içeren katı besiyerinde 9-1 mm koloni oluşturacak

şekilde üremiştir. Konsantrasyon arttıkça koloni çapında da azalma meydana


79

gelmiştir. NaCl konsantrasyonu %15-20 düzeylerine çıkarıldığında ise her hangi bir

üreme gözlenmemiştir.

Maksimum koloni oluşumu 9 mm ile %3’lük konsantrasyonda gerçekleşirken

%10 NaCl içeren ortamda koloni çapı 5 mm olarak gerçekleşmiştir.

Optimum enzim sentezi 12 mm ile %5-7 konsantrasyonda gözlenirken, %3’de

11 mm %10’da ise 10 mm aktivite zonu meydana gelmiştir. Bu sonuçlar C-14

suşunun halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Literatür bilgilerinde %3-15 NaCl

içeren ortamlarda üreyen organizmaların orta düzeyde halofil özelliğe sahip

olduklarını belirtilmektedir (Ventosa ve ark, 1998).

4.5. X-13 Suşunun Katı Besiyerinde 37ºC ve Farklı pH Değerlerinde Enzim

Sentezleme ve Üreme Davranışına Ait Bulgular

X-13 suşunun 37ºC ve pH 6.0-12.0 aralığında katı besiyerinde enzim üretme ve

üreme ile ilgili sonuçlar, Çizelge 4.7 de gösterilmiştir.

Çizelge 4.7. X-13 Suşunun 37ºC ve Farklı pH Değerlerinde Üreme ve Enzim Üretimine Ait Sonuçlar

pH 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0

KÇ 10 10 8 8 6 4 0 ZÇ 25 25 22 21 17 16 0


X-13 suşu pH 6.0-11.0 arasında üreme gösterirken en büyük koloni oluşumu 10

mm ile pH 6.0-7.0 değerlerinde gerçekleşmiştir. X-13 suşu oldukça aktif bir enzim

üreticisi olup, elde edilen aktivite zon çapları, pH 6.0-7.0 değerlerinde 25 mm, pH

8.0-9.0 değerlerinde ortalama 22 mm ve pH 10.0-11.0 değerlerinde ortalama 17 mm

olarak saptanmıştır. pH 11.0 de elde edile aktivite zon çapı, koloni çapının dört

katına ulaşmıştır.

Bu sonuçlar suşun ve enzimin çok geniş pH aralığında üreme (asidikten-

alkaliye) ve enzim sentezleme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.


80

Buna karşılık özellikle pH 6.0-7.0 değerlerinde 25 mm gibi oldukça geniş

aktivite zonu elde edilmesi, enzimin daha çok asidik pH da aktif olduğunu

düşündürmektedir.

4.5.1. X-13 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklıklar ve pH 7.0’deki Ürem ve

Enzim Sentezlemesine Ait Bulgular

X-13 suşunun pH 7.0 ve 20-60ºC’lik sıcaklık değerlerinde inkübe edilmesi

sonucu katı besiyerinde elde edilen koloni ve aktivite zon çaplarına ait bulgular

Çizelge 4.8’de gösterilmiştir.

Çizelge 4.8. X-13 Suşunun Farklı Sıcaklık ve pH 7.0 de Gösterdiği Üreme ve Enzim Sentezine ait Bulgular.

Sıcaklık 20ºC 30ºC 40ºC 50ºC 60ºC

KÇ 4 10 10 4 2

ZÇ 24 18 25 20 16


X-13 suşu inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde oldukça iyi

üreme göstermiştir. Özellikle 30 ve 40ºC de gerçekleştirilen inkübasyonlarda 10 mm

koloni çapı oluşumu gerçekleşmiştir. İnkübasyon için seçilen 20ºC (4 mm) ve 60ºC

(2 mm) sıcaklık aralığında üreme geçekleşmiştir. Bu özellikler dikkate alındığında

suşun oldukça geniş bir sıcaklık toleransına sahip olduğu görülmektedir.

Diğer taraftan aynı sıcaklıklarda oldukça geniş aktivite zon çapları oluşturacak

şekilde enzim üretimi gerçekleşmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 20-40ºC seçildiği zaman

ortalama 22 mm aktivite zon çapına ulaşmıştır. Bütün sıcaklık değerleri ayrı ayrı

değerlendirildiği zaman ise en yüksek enzim üretiminin 25 mm ile 40ºC de

gerçekleştiği görülmektedir. Bununla birlikte 20ºC de 24 mm zon çapına ulaşılması,

enzimin psikrofil, 60ºC deki zon çapının koloni çapının 8 katı büyüklüğe (16 mm)

ulaşması ise aynı zamanda termofil özellikte olduğunu göstermektedir. Bir başka

ifade ile X-13 suşu 20-60ºC’ler arasında, oldukça iyi üreyebilen ve bu değerlerde

yüksek düzeyde enzim sentezleme yeteneğinde olan bir organizmadır.


81

Bu sonuçlar ışığında X-13 suşunun, inkübasyon sıcaklığına göre farklı aktivite

düzeyine sahip enzim sentezleyebilecek özel bir organizma olduğu söylenebilir.

4.6. AB-17 Amilaz’ın Enzimatik Özellikleri

AB-17 suşunun sıvı kültüründen alkol presipitasyonu ile elde edilen amilaz

enzimi %1’lik nişasta içeren agar besiyerine 20µL damlatılarak 1 saat 37oC’de

inkübe edilmiş, boyama işleminden sonra, enzimin yaklaşık 10 mm aktivite zonu

oluşturduğu saptanmıştır.

Şekil 4.1. AB-17 Suşundan Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle İzole Edilmiş

Enzim Çözeltisinin Nişastalı Agar Ortamında Oluşturduğu

Aktivite Reaksiyonu

4.6.1. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum pH Aralığı

AB-17 suşuna ait amilaz enzimi kullanılarak Na-fosfat (pH 6.5-8.0), Glisin-

NaOH (pH 8.5-10.0) ve Boraks-NaOH (pH 10.5-12.5) tampon sistemleri ile

aktivite analizleri yapılmıştır. Bacillus sp. AB-17 suşundan izole edilen amilaz

enziminin 6.5-12.5 aralığındaki bütün pH değerlerinde yüksek düzeyde aktiviteye


82

sahip olduğu saptanmıştır. Enzim pH 6.5 de %81, 7.5’de %82, 8.5’de %84, 9.5’de

%84 aktiviteye sahipken optimum aktivitesini pH 10.5’de göstermektedir.

Optimum aktivitenin gözlendiği pH değerinin üstündeki değerlerde ise aktivite

hızla düşüş göstermiştir (pH 11.5 de %64, 12.5 de %61). Analizler sonunda pH

6.5-9.5 aralığında ortalama %83 aktivite elde edilmiştir. Enzim aktivitesi pH 11.5-

12.5 aralığında hızla düşerek ortalama %62.5’e gerilemiştir. Analiz edilen bütün

pH değerleri ortalama %79.4 düzeyinde, oldukça stabil bir aktivitenin

gerçekleştiği görülmektedir (Şekil 4.2). Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi geniş

pH spektrumuna sahip, alkalin özellik göstermektedir.

0

20

40

60

80

100

120

6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 11,5 12,5

pH

Röl

atif

Akt

ivite

(%)

Şekil 4.2. AB-17 Suşundan Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum pH’sı

Farklı bir çalışmada alkalin özellik gösteren amilaz enzimi izole

etmişlerdir. Horikoshi, izole ettiği alkalin amilaz enziminin pH 10.0-10.5


83

aralığında çok aktif olduğunu, pH 9.0-11.5 aralığında ise yaklaşık %50 aktivite

gösterdiğini belirtmiştir (Horikoshi, 1999).

McTigue ve ark. Bacillus halodurans A-59 (ATCC 21591), Bacillus sp.

NCIB 11203 suşu ve Bacillus sp. IMD370 suşlarının üçünden de amilaz enzimi

izolasyonu gerçekleştirmişler. Optimum aktivite görülen pH değerinin 10.0

olduğunu belirtmişlerdir (McTigue ve ark, 1995). Bacillus sp. ANT-6 amilaz

enziminin optimum aktivitesini 10.5 de gösterdiğini pH 9.5-13.0 aralığında ise

yüksek düzeyde aktiviteye sahip olduğunu belirtmişlerdir (Burhan ve ark, 2003).

Termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole edilen amilaz enziminin

optimum aktivitesini pH 11.0 de gösterdiği, özellikle pH 10.0-11.5 aralığında

%95 aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır (Arıkan, 2007). Termofil ve halofil

Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen amilaz enziminin optimum aktivitesini

pH 12.5 de gösterdiği, pH 8.5-12.0 aralığında ise ortalama %86.25 aktiviteye

sahip olduğu bulunmuştur (Tatar, 2007).

Bacillus halodurans A-59 suşundan izole edien amilaz enzimi pH 10.0’da

optimum enzim aktivitesi göstermiştir (Horikoshi, 1999). Diğer yandan, Bacillus

sp. PN5 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise optimum pH 10.0 da aktivite

gösterdiği belirtilmektedir (Saxena ve ark, 2007). Doğal halofil Bacillus sp. AB-17

suşundan izole edilen amilaz enzimine ait pH optimum sonuçları, alkalin ve

termofil Bacillus sp. ANT-6 amilazı ile tam bir uyum içindedir. Bu sonuçlar AB-

17 amilaz enziminin alkalin özellikte olduğunu göstermektedir.

4.6.2. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Aktivitesi

AB-17 amilaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği sıcaklık değerinin

saptanması amacı ile 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150

ve160˚C aralığında aktivite analizleri yapılmıştır. Analizler için kullanılan substrat

optimum aktivitenin geçekleştiği pH 10.5 değerinde hazırlanmıştır. Aktivite

tayininde inkübasyon süresi 30 dakika olarak seçilmiştir. Analizler sonucu elde

edilen veriler Şekil 4.3’de gösterilmiştir.


84

0102030405060708090

100110

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

İnkübasyon sıcaklığı

Rel

atif

enzi

m a

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.3. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Verileri.

AB–17 amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 150ºC

olarak bulunmuştur. Enzim 30ºC de %16, 40ºC % 21 gibi nisbeten düşük bir

aktiviteye sahiptir. İnkübasyon sıcaklığı 50ºC’ye yükseltildiğinde aktivite değeri

%27’ye ulaşmıştır. İnkübasyon sıcaklığının 30–40ºC aralığında gerçekleşen

%18.5’lik aktivite değeri dikkate alındığı zaman, 50ºC de aktivitenin yaklaşık %50

oranında artış gösterdiği görülmektedir. Buna karşılık 50–130ºC aralığında

gerçekleştirilen inkübasyonlarda, enzim aktivitesinde tam bir stabilite görülmüş ve

ortalama %27.3’lük aktivite elde edilmiştir.

İnkübayon sıcaklığı 140ºC’ye yükseltildiği zaman, enzim aktivitesi %81

değerine ulaşarak çok hızlı bir artış gerçekleşmiştir. Aktivitedeki artış oranının

30–130ºC aralığındaki verilerle karşılaştırıldığı zaman (ortalama %26) yaklaşık

%311 düzeyine ulaştığı görülmektedir. Optimum aktivite 150ºC (%100) elde

edilirken, sıcaklık 160ºC’ye yükseltildiğinde enzim aktivitesinin %82’ye düştüğü

bulunmuştur.


85

En yüksek aktivitenin gerçekleştiği 140–160ºC aralığında elde edilen

ortalama aktivite değeri %87.6’dır. Bu aralıktaki aktivite artışının 30–130ºC

aralığı ile karşılaştırıldığı zaman yaklaşık %337 olduğu görülmektedir (Şekil. 4.3).

Bu sonuçlar dikkate alındığı zaman, enzimin özellikle 130ºC den sonra çok

yüksek bir aktiviteye sahip olduğu ve bu özelliği ile ultratermofil özellik

gösterdiği söylenebilir.

Konsoula ve Kyriakides, Bacillus sp. suşundan izole ettikleri amilaz

enziminin optimum aktivitesini 135˚C de gösterdiğini belirtmişler, 160˚C de ise

yaklaşık %70 aktivite saptamışlardır (Konsoula ve Kyriakides, 2004). Tatar,

termofil alkalin-halofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole ettiği amilaz enziminde

optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklığı 140˚C olarak bulmuştur. Tatar, amilaz

enziminin optimum aktivitesini 140˚C de göstermekle birlikte 130˚C de %91,

150˚C de %93 ve 10˚C de %86.5 aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur (Tatar,

2007).

Yukardaki bulguların dışında bir çok araştırıcı, yüksek sıcaklıkta aktivite

gösteren amilaz enzimi izolasyonu gerçekleştirdiklerini belirtmişlerdir. Literatürde

belirtildiğine göre, Goyal ve ark (2005), 70˚C, Saxena ve ark (2007), 90˚C,

Burhan ve ark (2003), 80˚C, Arıkan (2007), 70˚C ve Mamo ve Gessesse (1999),

80˚C’de optimum aktivite gösteren bakteri kökenli amilaz enzimi izolasyonu

gerçekleştirdiklerini belirtmişlerdir.

Goyal ve ark (2005), izolasyonunu gerçekleştirdikleri amilaz enziminin 50-

100ºC aralığında aktivite gösterdiğini, optimum aktivite sıcaklığının ise 70ºC

olduğunu belirtmişlerdir.

Literatür verileriyle karşılaştırıldğı zaman, Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi

bugüne kadar mezofil bakterilerden izolasyonu yapılan, optimum aktivite değeri

en yüksek olan (150˚C) enzimdir.

Bu özelliği ile amilaz enzimi, literatürler arasında en üst noktaya yerleşecek

ultra-termofil alkalin özellikte bir enzimdir.


86

4.6.3. AB-17 Amilaz Stabilitesi Üzerine pH’nın Etkisi

Bacillus sp. AB–17 amilaz enzimi pH 8.0; 9.0; 10.0; 11.0 ve 12.0 ve 37ºC’de

42 saat ön inkübasyon yapılarak enzimin farklı pH değerlerindeki stabilitesi

araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.4 de gösterilmiştir. Kalan aktivitenin

saptanması için enzim, optimum pH değerinde hazırlanmış substrat kullanılarak

optimum aktivite sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilerek analiz

gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar Şekil 4.4 de gösterilmiştir.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Kontrol 8 9 10 11 1242 saat Ön İnkübasyon yapılan pH değerleri

Kal

an R

ölat

if En

zim

Akt

ivite

si (%

)

Şekil 4.4. AB-17 Amilaz Enziminin pH Stabilitesi.

Analizler sonunda pH 8.0 de kalan enzim aktivitesi %62 olarak

gerçekleşirken, pH 9.0 da %50’ye düşmüştür. Enzim pH 10.0-12.0 aralığında

stabil bir aktivite göstermiş, kalan enzim aktivitesi ortalama %54.3 olarak

gerçekleşmiştir. pH 9.0-12.0 aralığında elde edilen stabilite değeri ise ortalama

%53.2 olarak bulunmuştur.


87

Analiz edilen bütün pH değerlerinde ortalama %55 enzim stabilitesi elde

edilmiştir. Özellikle pH 10.0-12.0 aralığında aktivite sonuçlarının birbirine yakın

çıkması ve pH 9.0 daki %50 değerinin aksine, ortalama %54.2 kalan aktivite

değeri elde edilmesi, enzimin alkali özelliği ile bütünlük göstermektedir.

Bütün pH değerlerinde 24 saatlik inkübasyon sonunda enzim stabilitesi

ortalama %55 düzeyinde gerçekleşmiştir. Bu sonuçlar enzimin pH stabil olduğunu

kanıtlamaktadır.

Bacillus sp. TS-23 suşundan üretilen amilaz enziminin, pH 9.0 da 10

dakikalık inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini %100 koruduğu bulunmuştur

(Lin ve ark, 1998). Alkalin termofil Bacillus sp. A3-15 suşuna ait amilaz

enzimiyle yapılan pH stabilitesi çalışmalarında enzim, 60˚C de ve pH 10.0-11.0

aralığnda 24 saat inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %70 koruduğu

bulunmuştur (Arikan, 2007). Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen amilaz

enziminin ise pH 10.0-12.0 aralığında 55˚C de 72 saat inkübe edildiği zaman

aktivitesini yaklaşık %54 koruduğu bulunmuştur (Tatar, 2007).

Bacillus subtilis’ten elde edilen alfa amilaz enziminin 24 saatlik inkübasyon

sonunda aktivitesini pH 7.0’de %80 korurken, pH 10.0’da aktivitenin %40’a

düştüğü bulunmuştur (Lin ve ark, 1998). Igarashi ve ark (1998), amilaz enziminin

30 dakika süreyle 40˚C ve pH 7.0-9.0 aralığında inkübe edildiği zaman aktivitenin

%100 korunduğunu, pH 10.0-12.0 aralığında ise %75 e düştüğünü saptamışlardır.

Thermus filiformis suşundan üretilen amilaz enzimine 70˚C ve pH 5.0-7.0

aralığında 30 dakika ön inkübasyon uygulandığı zaman, aktivitenin %90

korunduğunu belirtmişlerdir (Egas ve ark, 1998). Bacillus sp. PN5 suşundan izole

edilen termostabil alkalin amilazın enziminin 1 saat pH 10.0’da inkübasyonu

sonucu aktivitenin %80 koruduğu saptanmıştır (Saxena ve ark, 2007).

Bernhardsdotter ve ark (2005), izole ettikleri amilaz enzimini 1 saat 37˚C ve

pH 7.0-11.0 aralığında ön inkübasyona bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin

%80’e düştüğünü saptamışlardır. Lo ve ark (2001), TS-23 α-amylase enziminin

orijinal aktivitesini pH 9.0 da %100, pH 10.0 da %86 koruduğunu belirtmişlerdir.

Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi 60˚C ve pH 9.0-12.0 aralığında 24 süreyle

aktivitesini %53.2 koruması enzimin, pH stabil özellikte olduğunu göstermektedir.


88

Uygulanan inkübasyon süresi, inkübasyon sıcaklığı ve pH aralıkları dikkate

alındığında enzimin, literatür verilerinin bir çoğundan daha yüksek stabiliteye

sahip olduğu görülmektedir.

4.6.4. AB-17 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular

AB-17 amilaz enziminin termal stabilitesinin satanması için 30-160ºC

aralığında 30 dakika süreyle ön inkübasyon yapıldıktan sonra, optimum aktivite

sıcaklığı ve pH değerindeki substrat ile gerçekleştirilen analiz sonuçları şekil 4.5

de gösterilmiştir.

Şekil 4.5. AB-17 Amilaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesi.

Enzim ön inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde (30-

160˚C) 30 dakika süreyle yaklaşık %51 oranında orijinal aktivitesini korumuştur.

Goyal ve ark (2005), Bacillus sp. I-3 suşundan izole edilen termostabil

amilaz enziminin 70ºC de 3.5 saat’lik inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini

%100, 2.5 saatlik inkübasyon sonunda ve 80ºC’de ise %90 koruduğunu

bulmuşlardır. Araştırmacılar aynı enzimi 30 dakika süreyle 90 ve 100ºC de ön

0

20

40

60

80

100

120

Kont 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Sıcaklık

Kal

an A

ktiv

ite(%

)


89

inkübasyon bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin %59 ve %26’ya düştüğünü

saptamışlardır. Mamo ve Gessesse (1999), Termofilik Bacillus’lardan izole edilen

termostabil amilaz enzimini 80ºC de 4 saatlik inkübasyona bıraktıkları zaman

orijinal aktivitenin %50’ye düştüğünü belirtmişlerdir. Arikan (2007), termofil

Bacillus sp. A3-15 amilaz enziminin orijinal aktivitesini 100ºC de 30 dakika

süreyle %96 koruduğunu bulmuştur.

Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin 30-160ºC aralığında 30 dakika süreyle

orijinal aktivitesini yaklaşık %51 koruması, enzimin yüksek düzeyde termostabil

ve stabil bir enzim özelliğinde olduğunu göstermektedir.

4.6.5. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl’ün Etkisi

Amilaz enzim aktivitesi üzerine NaCl’ün etkisini saptamak için enzim %3,

%5, %7.5, %10, %15 ve %20’lik tuz konsantrasyonlarında 30 dakika süreyle

37ºC de ön inkübasyona tabi tutulmuştur. Optimum aktivite sıcaklığı ve pH

değerinde gerçekleştirilen analiz sonuçlarına ait veriler şekil 4.6. da gösterilmiştir.

0

20

40

60

80

100

120

Kontrol 3 5 7,5 10 15 20

NaCl Konsantrasyonu (%)

Kal

an R

ölat

if En

zim

Akt

ivite

si (%

)

Şekil 4.6. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl’ün Etkisi

Analizler sonunda kalan enzim aktivitesi %3, %5, %7.5, %10, %15 ve %20

NaCl konsantrasyonları için sırasıyla ortalama %68.4, %67.3, %67.5, %67, %67

ve %64 olarak bulunmuştur. En yüksek enzim aktivitesi %68.4 ile %3’lük NaCl


90

konsantrasyonunda sağlanmıştır. %5-15 aralığındaki konsantrasyonlarda kalan

enzim aktivitesi ortalama %67 düzeyinde gerçekleşmiştir.

En yüksek kalan aktivite değeri %68.4 ile %3 NaCl konsantrasyonunda

(0.5M) elde edilirken, diğer konsantrasyonların hepsinde yaklaşık %67 aktivite

bulunmuştur. Bir başka ifade ile enzim 0.5-3.4 M aralığındaki NaCl

konsantrasyonlarında, ortalama %67 ile aynı aktiviteyi ve stabiliteyi göstermiştir.

Tuz konsantrasyonu %20’ye yükseltildiği zaman, enzim aktivitesi %64’e

düşmüştür. Bütün konsantrasyonlar (%3-20) dikkate alındığı zaman kalan enzim

aktivitesinin, ortalama %67 olduğu görülmektedir. Bu sonuçlar enzimin halofil

özelliğe sahip olduğunu göstermektedir.

Haloferax mediterranei suşundan izole edilen amilaz enziminin 2-4M

aralığındaki NaCl konsantrasyonunda aktif ve stabil olduğunu, optimum

aktivitenin ise 3M konsantrasyonda elde edildiğini bulmuşlardır (Pomarez ve ark,

2003).

WainØ ve Ingvorsen (2003), β-xylanase enziminin %5-%15 NaCl

konsantrasyonlarında optimum aktivite gösterdiğini, 24 saat üreyle %20 NaCl

içerisinde bırakılan enzimin aktivitesini %55 oranında koruduğunu saptamışlardır.

Halofilik arkeal enzimlerin özellikleri arasında, yüksek tuz konsantrasyonlarında

aktivitenin giderek artmasının bulunduğunu belirtmişlerdir (Dym ve ark, 1995).

Literatür verileri ile karşılaştırıldığı zaman, AB-17 amilaz enziminin %3-20

arasındaki NaCl konsantrasyonlarında ortalama %67 aktivite ve stabilite

göstermesi, enzimin halofil olduğunu göstermektedir.

4.6.6. AB-17 Amilaz Enzimi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi

Enzim aktivitesine şelatör, metal iyonları, inhibitörler ve deterjanların etkisi

ile ilgili sonuçlar Çizelge 4.9 da verilmiştir. Çalışmada 5mM EDTA, 5mM CaCl2,

3mM PMSF, 5mM Na2SO3, 5mM NaCl, 5mM ZnCl2 , 5mM 1,10-phenantroline,

8M Üre, %1’lik SDS(v/v), %1’lik TritonX-100 (w/w) ve %1’lik β-Merkaptoetanol

(v/v) kullanılmıştır.


91

Çizelge 4.9: AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi

İnhibitörler İnhibitör kons. Kalan aktivite(%)

Kontrol Yok 100 EDTA 5 mM 69.21 CaCl2 5 mM 63.42 PMSF 3 mM 70.52

β-Merkaptoetanol %1 v/v 67.36 SDS %1 v/v 69.21

TritonX-100 %1 v/v 72.36 Na2SO3 5 mM 73.15 NaCl 5 mM 78.15 ZnCl2 5 mM 59.21

1,10-phenantroline 5 mM 67.10 Üre 8 M 2.22

Kalan aktivite analizleri sonuçlarına göre 8M üre aktiviteyi %97.8 oranında

inhibe etmiştir. Bu sonuç enzimin alkali ve termofil özellikte olduğunu

göstermektedir. İnhibisyon oranı metal iyonlarında ortalama CaCl2 de %37,

Na2SO3 te %27, NaCl de %22 ve ZnCl2 de %41 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Metal iyonları arasında en yüksek inhibisyon %41 ile ZnCl2 de saptanırken,

en düşük inhibisyon %22 ile NaCl de elde edilmiştir. Metal iyonlarına karşı elde

edilen ortalama dirençlilik %68.40 düzeyindedir. Enzimin özellikle ZnCl2 ile

önemli düzeyde inhibe olması, temostabilitesinin yüksek olmadığını fakat termofil

özellikte olduğunu göstermektedir.

Termostabilite çalışmalarından elde edilen sonuçlar dikkate alındığında

(bütün sıcaklık değerleri için otalama %53 kalan aktivite saptanmıştır) metal

iyonları ile yapılan analizlerden elde edilen sonuçların birbirini desteklediği

görülmektedir.

Deterjanlar arasında en yüksek inhibisyon oranı ortalama %32 ile β-

Merkaptoetanol de elde edilirken, SDS de %31 ve Triton X-100 de %28

inhibisyon saptanmıştır. Her üç deterjanda gözlenen inhibisyon ortalama %30.3

düzeyindedir. Bir başka ifade ile AB-17 amilaz enzimi deterjanlara ortalama %70

dirençlilik göstermişlerdir. Hashim ve ark (2005), Bacillus halodurans LBK

34’den izolasyonunu yaptıkları alfa amilazda orijinal aktivitenin 5 mM CaCl2 ile

%59, 1 mM EDTA ile %58 oranında korunduğunu bulmuşlardır. Berhardsdotter

ve ark (2005) ise, alkalin-şelatör dirençli amilaz enziminde orijinal aktivitenin 5


92

mM CaCl2 ile %34, ZnCl2 ile %30.6 korunduğunu, buna karşılık EDTA ile

aktivitenin indüklenerek %120.7’ye yükseldiğini bulmuşlardır.

Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi 5 mM EDTA’ya yaklaşık %69.2, PMSF’

ye ise %70.52 direnç göstermiştir. Bu sonuç enzimin metallo enzim yapısında

fakat düşük düzeyde serin amino asitleri içerdiğini göstermektedir. Szilagyi ve

Zavodszky (2000), Termofilik proteinlerde serin amino asitlerinin düşük düzeyde

bulunduğunu belirtmiştir.

Literatürde Bacillus sp. SPS-0 suşundan izole edilen orta düzeyde

termostabiliteye sahip ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini 1 mM CaCl2 ile %92, ,

5 mM Triton-X100 ile %43, ve 5 mM EDTA ile %93 oranında koruduğu

belirtilmektedir (Bataillon ve ark, 2000). Horikoshi (1999) ile Hutscheon ve ark

(2005) amilaz enziminin 8M üre ile tamamen inhibe olmasının alkalofil ve halofil

özelliğin göstergesi olduğunu belirtmektedir (Horikoshi, 1999; Hutscheon ve ark,

2005). Fukuchi ve ark (2003), halofilik enzimlerin üre ve guanidin hidroklorid gibi

kaotrapik tuzlarda genellikle stabil olmadıklarını ve inhibisyon gerçekleştiğini

belirtmektedirler.

Bacillus sp. AB-17 enzimi 8M üre ile tamamen (yaklaşık %97.8) EDTA ile

önemli düzeyde (%30.79) inhibe olmuştur. Bu sonuçlar enzimin alkalin, halofil ve

metalloenzim özellikte olduğununu göstermektedir.

Lo ve ark (2001), Bacillus sp. TS-23 amilaz enziminin %6’lık SDS bulunan

ortamda 30ºC de 1 saat inkübe edildiği zaman stabilitesini koruduğunu, 60ºC ise

inaktive olduğnu bulmuşlardır. Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin ZnCl2 ile

yapılan inaktivasyon çalışması sonucunda orijinal aktivitenin %63 oranında

korunduğunu belirtmişler ve bunun termostabilitenin göstergesi olduğunu

bildirmişlerdir (Burhan ve ark, 2003). Termofilik Bacillus sp. TS–23 suşuna ait

amilaz enzimi 5 mM ZnCl2 ile %40 oranında inhibe olmuştur (Lin ve ark, 1998).

AB-17 amilaz enziminin orijinal aktivitesi 5 M ZnCl2 ile yaklaşık %40.8 oranında

kaybolmuştur. Bu sonuç literatür verileri ile son derece uyumludur termofilliğin

göstergesidir.


93

Bacillus sp. suşundan izole edilen ağartıcılara dirençli alkalin proteaz

enziminin %1 SDS bulunan ortamda 40˚C de 30 dakikalık inkübasyon sonunda

%85, 60 dakikada ise %60 aktivitesini koruduğu belirtilmiştir (Gupta ve ark, 1999).

Haloalkalofilik Bacillus sp. bakterisinden izole edilen alkalin proteaz

enziminin 1 mM EDTA %10, 1 mM PMSF ile %94 inhibe olduğu, 5 mM CaCl2 ile

aktivitenin %71’e düştüğü belirtilmektedir (Gupta ve ark, 2005). Termofil Bacillus

sp. A3-15 suşundan izole edilen amilaz enziminin orijinal aktivesini 60˚C de 30

dakika süreyle inkübasyo gerçekleştirildiği zaman, %1 SDS ile %82, 8M üre ile

%20, 5 mM ZnCl2 ile %82, 3 mM PMSF ile %90 koruduğu belirtilmektedir (Arıkan,

2007).

Halofil alkalin termofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen ve optimum

aktivitesini 140˚C de gösteren amilaz enziminin 55˚C, 30 dakika süreyle aktivitesini

%1 SDS de %71, β-Merkaptoetanol de %81, triton X-100 de %82, 8 M ürede %11,

3 mM PMSF de %74, 5 mM CaCl2 de %70, ZnCl2 de %68 koruduğu

belirtilmektedir (Tatar, 2007).

Saxena ve ark (2006), Bacillus sp. PN5 suşundan üretilen termostabil alkalin

amilaz enziminin 5 M SDS ile 1 saat inkübe edildiği zaman atvitesini %70

koruduğunu bulmuşlardır.

AB-17 amilaz enziminin %1 SDS ile %69.21, β-Merkaptoetanol ile %67.36 ve

triton X-100 ile %72.36 oranında orijinal 30 dakika süreyle koruduğu bulunmuştur.

Bu sonuçlar, AB-17 amilaz eziminin çeşitli deterjan, sürfaktan ve ağartıcı bileşiklere

karşı dirençli olduğunu ve deterjan endüstrisi için uygun özellik taşıdığını

göstermektedir.

Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminden elde edilen sonuçlar, literatür

verileriyle önemli bezerlikler göstermektedir. Özellikle, Tatar (2007)’ın tanımladığı

ultratermofil ve termostabil alkalin halofil amilaz enzimiyle üre dışındaki değerler

çok büyük uyum göstermektedir.

Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin PMSF ye %70, EDTA’ya %69

dirençlilik göstermesi, üre ile tamamen inhibe olması, ZnCl2 ile inhibe olması,

enzimin serin amino asitlerince zengin olmadığı, metal atomları bulunduran,

termofilik halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Bacillus sp. AB-17 amilaz


94

enzimi bu özellikleri ile, nişasta, tekstil ve deterjan başta olmak üzere, nişastanın

kullanıldığı bütün biyoteknolojik alanlar için öncelikli kullanım olanağına sahiptir.

4.6.7. AB-17’nin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi

%10’luk homojen SDS-PAGE sistemi kullanılarak yapılan analiz sonuçları

Şekil 4.7. de gösterilmiştir.

Şekil 4.7.AB-17 Amilaz Enziminin SDS-PAGE ve Doğal PAGE Zimogram Sonuçları (N: Doğal PAGE jelde elde edilen aktivite görüntüsü). 1,2,3 ve 4 numaralı örnekler SDS-PAGE’de analiz edilmiş amilaz enzimine ait protein bandları M: Markır (Merck Standart Protein Mixture: 78, 66.25, 42.7, 30 kDa).

Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin SDS-PAGE analizinde moleküler

ağırlıkları 66.25 ve 58 kDa olan iki farklı protein bandı elde edilmiştir. Aynı

enzim örneği nişastalı doğal PAGE’i kullanılarak analiz edildiği zaman, SDS-

PAGE jelinde saptanan bandlarla aynı moleküler ağırlığa sahip (A ve B şeklinde

görülmektedir) iki aktivite bandının saptanması, SDS-PAGE’de elde edilen

bandların amilaz enzimine ait olduğunun kanıtıdır. Bu sonuç enzimin moleküler

ağırlıkları farklı iki alt birimden oluştuğunu göstermektedir.

Literatürde amilaz enzimleri ile yapılan SDS-PAGE çalışmalarında

moleküler ağırlıkların 51 ve 70 kDa arasında değiştiğine ait çok sayıda bulgu


95

vardır (Horikoshi, 1971; Igarashi ve ark, 1998; Hamilton ve ark, 1999; Ben ve ark,

2001; Bernhardsdotter ve ark, 2007).

Kim ve ark (1995) Bacillus sp. GM-8901 suşundan kültür süresine bağlı

olarak farklı moleküler ağırlıkta 5 farklı aktivite bandı elde ettiğini belirtmiştir.

Arıkan (2007) termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole ettiği alkalin amilaz

enziminin SDS-PAGE zimogram analizi sonucunda moleküler ağırlıkları 60500

ve 86 kDa olan iki alt birimden meydana geldiğini bulmuştur.

Mamo ve Gessesse (1999), termofilik Bacillus sp. WN11 suşuna ait amilaz

enziminin moleküler ağırlıkları 76 kDa ve 53 kDa olan, AmyI ve AmyII şeklinde

tanımladığı iki alt birimden medana geldiğini belirtmişlerdir. Literatürde Bacillus

sp.PS-7 suşundan izole edilen amilaz enziminin 55 ve 71 kDa’luk iki alt birimden

oluştuğu ve bunların izoenzim oldukları belirtilmiştir (Sodhi ve ark, 2005).

Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi zimogram sonuçları, literatür verileriyle oldukça

uyumludur.

4.6.8. AB-17 Amilaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin optimum aktivite sıcaklığı ve pH

değerinde nişastayı parçalaması sonucu ince tabaka kromatografisinde elde edilen

hidroliz ürünleri Şekil 4.8 de gösterilmiştir.

Şekil 4.8. AB-17 Amilaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Saptanması. (G: Glikoz; M: Maltoz; AB-17 Amilaz enzimi Hidroliz ürünleri; Ti: Ticari α-Amilaz hidroliz ürünleri; N: Enzim ilave edilmemiş Nişasta çözeltisi).


96

İnce tabaka kromatografi analizi sonucunda, Bacillus sp. AB-17 amilaz

enziminin nişastayı maltoz ve diğer oligosakkaritlere parçaladığı saptanmıştır.

Ticari alfa amilaz enziminin kullanıldığı çalışmaya ait hidroliz ürünleri ile AB-17

amilaz enzimine ait hidroliz ürünleri karşılaştırıldığında, oluşan oligosakkaritlerin

büyük benzerlik gösterdiği, dahası AB-17 enziminin aktivitesi sonucu elde edilen

sondan ikinci bandın farklı bir oligosakkarite ait olduğu açıkça görülmektedir. Bu

sonuçlar, izole edilen AB-17 amilaz enziminin alfa amilaz olduğunu ve ticari

alanda kullanılabilecek özellik taşıdığını göstermektedir.

Lee ve ark, (1994)’nın termofilik alkalifilik Bacillus sp. XAL601 suşundan

ürettikleri α-amilaz enziminin nişastayı hidrolizi sonucu maltoz ve uzun zincirli

oligosakkaritlerin oluştuğu, buna karşılık glikoz üretilmediğini belirtmişlerdir.

İzole ettiğimiz AB-17 amilaz enzimine ait hidroliz ürünlerinin, Lee ve

arkadaşlarının (1995) bulguları ile tam bir benzerlik gösterdiği görülmektedir.

Bacillus amyloliquefaciens geninin E.coli’de ekspresyonu sonucu elde edilen

amilazların nişastayı hidrolizinde son ürün olarak maltoz, maltotrioz ve

maltotetroz gibi oligosakkaritler ile çok az glikoz oluştuğunu bildirilmiştir

(Demirkan ve ark, 2005). Bununla birlikte, Morgan ve Pires (1981), Bacillus

subtilis bakterisinden üretilen amilaz enziminin nişastayı glikoz ve maltoza

dönüştürdüğü belirtilmektedir. Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimine ait hidroliz

bulguları literatür verileriyle karşılaştırıldığı zaman sonuçlar arasında tam bir

uyum olduğu görülmektedir.

4.7. Kısmi Saflaştırılmış C-14 Selülaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite

Görüntüsü

C-14 suşundan kısmi saflaştırma yöntemiyle elde edilen endoglukanaz

enziminin katı besiyerindeki aktivitesi Şekil 4.9 da görülmektedir. Enzimin aktivite

bölgesi sarı renkte görülürken, hidrolize edilmemiş CMC’li bölgeler, kırmızı renkte

görülmektedirler.


97

Şekil 4.9.Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Endoglukanaz Enziminin Katı

Besiyerindeki Aktivite Sonucu

4.7.1. C-14 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değeri ve

Aralığına Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzimi üç farklı tampon sistemi (Na-fosfat, pH 6.5-8.0

Glisin-NaOH, pH 8.5-10.0 ve Boraks-NaOH, pH 10.5-12.5) kullanılarak en iyi

aktivite gösterdiği pH değerinin ve aralığının saptanması için analiz edilmiştir. Elde

edilen sonuçlar Şekil 4.10 da gösterilmiştir.

0102030405060708090

100

6 7 8 9 10 11 12

pH

Röl

atif

Akt

ivite

(%)

Şekil 4.10. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH

Değerine Ait Sonuçlar.


98

İzole edilen enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değeri 11.0 olarak

saptanmıştır. Enzim, pH 8.0-11.0 aralığında ortalama 96.5 aktiviteye sahiptir. pH

aralığı 9.0-11.0 aralığında ise aktivite ortalama %98 değerine ulaşmaktadır. pH 12.0

ye yükseltildiğinde enzim aktivitesi %92 değerine düşmektedir.

Analiz edilen bütün pH değerleri dikkate alındığı zaman gerçekleşen aktivite

ortalama %92 düzeyindedir. Bu sonuçlar, enzimin özellikle pH 9.0-11.0 aralığında

çok yüksek bir aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Bütün pH değerlerinde

yüksek aktivite elde edilmesi (pH 6.0 da %81, pH 12.0 de %12) enzimin aktivite pH

aralığının son derece geniş olduğunu göstermektedir.

Bununla birlikte özellikle pH 9.0 dan itibaren (pH 9.0 da %96, pH 11.0 de

%100) aktivitenin yüksek değerlere ulaşması, enzimin yüksek düzeyde alkali özellik

taşıdığının kanıtıdır.

Birçok araştırmacı değişik organizmalarda alkalin özellik gösteren çok sayıda

selülaz enzimi izolasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Robson ve Chambliss (1984),

Hreggvidsson ve ark (1996), Tahara ve ark (1997), Mawadza ve ark (2000), George

ve ark (2001), Murashima ve ark (2002), Saha (2004), Huang ve ark (2004), Li ve

ark (2006), Voget ve ark (2006), izolasyonun gerçekleştirdikleri selülaz enzimlerinin

optimum pH 4.0 ve 7.0 aralığında aktivite gösterdiklerini belirtmişlerdir. Zvereva ve

ark (2006), haloalkaofil anaerob bakteriden optimum pH 6.0-9.0 arasında aktivite

gösteren selülaz enzimi izole etmişlerdir.

Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans suşundan optimum enzimatik

aktivitesini pH 8.5 de gösteren endoglukanaz enzimi izole etmişlerdir. Hakamada ve

ark (1997), alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan optimum aktivite pH’sı 8.6-

9.0, Bacillus sp.VG1 suşundan ise pH 9.0-10.0 olan endoglukanaz izolasyonu


Literatürlerde değişik Bacillus sp. izolatlarından optimum enzimatik

aktivitesini pH 10.0 da gösteren iki endoglukanaz enziminin izole edildiği

belirtilmektedir (Endo ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005).

Çalışmamızda izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilen C-14

endoglukanaz enzimi optimum aktivitesini pH 11.0 de göstermektedir. Bu özellik,

literatür verilerinde şu ana kadar Bacilus sp. suşlarından izole edilen endoglukanaz


99

enzimleri dikkate alındığında en yüksek pH değerine sahip olması açısından oldukça

önemlidir. C-14 enzimi oldukça güçlü alkali endoglukanaz özelliği göstermektedir.

4.7.2. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Değerine Ait Sonuçlar

C-14 Endoglukanaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği sıcaklık

değerinin saptanması için 20oC-100oC arasındaki sıcaklıklarda optimum pH

değerinde hazırlanmış substrat kullanılarak aktivite analizleri yapılmıştır. Sonuçlar

Şekil 4.11 de gösterilmiştir.

40

50

60

70

80

90

100

110

20 30 40 50 60 70 80 90 100

Sıcaklık (oC)

Röl

atif

Enz

im A

ktiv

ite (%

)

Şekil 4.11. C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Sıcaklığına Ait

Sonuçlar

Analiz sonuçlarında C-14 endoglukanaz enziminin optimum aktiviteyi 50°C de

gösterdiği saptanmıştır. Bununla birlikte enzimin 20-80°C aralığında yaklaşık %85

aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Bu sonuç enzimin psikrofilden termofile kadar

geniş bir sıcaklık aralığında kullanılabilir özellikte olduğunu göstermektedir.


100

Farklı sıcaklık aralıkları değerlendirildiği zaman en iyi aktivitenin sırasıyla 40-

60°C arasında ortalama %90, 40-70°C arasında %88.5 olduğu görülmektedir.

İnkübasyon sıcaklığı 80°C’ye yükseltildiği zaman enzim aktivitesi %71

düzeyine düşmüştür. Sıcaklığın 100°C ‘ye yükseltilmesi sonucunda aktivite değeri

%64 düzeyine düşmüştür. 80-100°C aralığındaki aktivite sonuçları incelendiği

zaman ortalama aktivitenin %67 düzeyinde gerçekleştiği görülmektedir.

Bu bulgular endoglukanaz enziminin optimum aktivite değeri açısından olmasa

bile, yüksek sıcaklık değerlerinde %67 düzeyinde aktiviteye sahip olduğunu ortaya

koymaktadır. Bu açıdan değerlendirildiği zaman enzim, oldukça geniş bir sıcaklık

aralığında kullanılabilme özelliği taşımaktadır.

Literatürler verilerinde optimum aktivite sıcaklığı farklı olan çok sayıda

endoglukanaz enzimi yer almaktadır. Bunlardan bir kısmı pH optimum açısında

asidofil özellikte olup, optimum aktivite sıcaklıkları 65-70oC (Mawadza ve ark,

2000), 70oC (Li ve ark, 2006), ve 80oC (Huang ve Monk, 2004) olarak bulunmuştur.

Alkali pH değerinde aktivite gösteren endoglukanaz enzimleri arasında

optimum aktivite sıcaklığı 65ºC olan enzim termofil olarak tanımlamıştır (Singh ve

ark, 2001). Alkali pH değerlerinde aktivite gösteren enzimler arasında optimum

aktivitenin 50-55ºC olduğu belirtilmektedir (Hakamada ve ark, 1997 ve 2002; Endo

ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005).

Çalışmamızda Halofil Bacillus sp. suşundan izole edilen C-14 endoglukanaz

enzimi alkali özellikte olup, optimum aktivitesini 50ºC de göstermektedir. Bu

özellikleri açısından literatür verileri ile büyük bir benzerlik göstermektedir.

4.7.3. C-14 Endoglukanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzimi pH stabilitesinin saptanması için pH 6.0-12.0

aralığında 24 saat 50ºC de ön inkübasyon gerçekleştirilmişti. İnkübasyon sonunda

optimum pH değerinde hazırlanmış subatrat kullanılarak optimum aktivite

sıcaklığında kalan aktivitenin saptanması için uygun süreyle inkübasyon

gerçekleştirilmiştir. Analizler sonunda elde edilen bulgular Şekil 4.12 de

gösterilmiştir.


101

0

20

40

60

80

100

120

K 7 8 9 10 11 12

Ön İnkübasyon Yapılan pH değerleri

Röl

atif

Kal

an E

nzim

Akt

ivite

si (%

)

Şekil 4.12. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait pH Stabilite Sonuçları

Aktivite analizleri sonunda C-14 endoglukanaz enzimin orijinal aktivitesini pH

9.0 da %68 düzeyinde koruduğu saptanmıştır. Enzimin analiz edildiği diğer pH

değerlerinde orijinal aktivitenin 24 saatlik ön inkübasyon sonunda, sırasıyla 7.0, 8.0,

10.0, 11.0 ve 12.0 için ortalama %63, %64, %66, %63 ve %63 oranında korunduğu

bulunmuştur.

Enzim pH 7.0-12.0 aralığında orijinal aktivitesini ortalama %64.5 oranında

korumuştur. Enzim bu özellikleri ile (özellikle pH 9.0 ve 10.0 aralığında) yüksek

düzeyde pH stabilitesi göstermektedir. Ezimin optimum aktivite gösterdiği pH değeri

ve en yüksek aktivitenin elde edildiği pH aralıkları dikkate alındığında, pH stabilitesi

sonucu kalan aktivite değerlerinin bu sonuçlarla paralellik gösterdiği görülmüştür.

Yani enzim, en yüksek aktivitenin gözlendiği pH değerlerinde en iyi stabiliteyi

göstermiştir.

İzole edilen endoglukanaz enzimin optimum aktivitesinin pH 6.0-8.0 aralığında

gerçekleştiği saptanmıştır. Enzim pH 5.0 de ve 50ºCde 1 saat inkübe edildiğinde

orijinal aktivitenin %100 korunduğu, pH 6.0 da ise aktivitenin %55’e düştüğü

gözlenmiştir (George ve ark, 2001).


102

Optimum aktivitesini pH 4.5-6.5 ve 70ºC gösteren Ba-EGA endoglukanaz

enziminin pH 7.5 de 2 saat 30ºC de inkübe edildikten sonra orijinal ativitesini büyük

ölçüde koruduğu saptanmıştır (Li ve ark, 2006) .

Alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan izole edilen alkalin selülaz

enziminin pH 5.0-11.0 aralığındaki taponlarda 30 dakika süreyle 30ºC de inkübe

edildiği zaman orijinal ativitesini ortalama %80 oranında koruduğu bulunmuştur

(Hakamada ve ark,1997).

Bacillus circulans suşundan izole edilen ve optimum aktivitesini pH 8.5 ve

55ºCde gösteren endoglukanaz enziminin, pH 5.0-11.0 aralığında ve 30ºC’de 1

saatlik inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini %100’e yakın koruduğu

bulunmuştur (Hakamada ve ark, 2002).

Bacillus sp.HSH-810 suşundan izole edilen alkalin selülaz enzimi optimum

aktivitesini pH 10.0 göstermektedir. Enzim pH 7.0-9.0 aralığında ve 50ºC 10 dakika

inkübe edildiğinde aktivitenin yaklaşık %10 kaybolduğu saptanmıştır (Kim ve ark,

2005).

Endo ve ark (2001) alkalin endoglukanaz enzimini pH 6.0-9.0 aralığında,

30ºC’de 30 dakika süreyle inkübe ettiklerinde, orijinal enzim aktivitesinin belirtilen

pH aralığında %100’e yakın düzeyde korunduğunu belirtmişlerdir.

C-14 alkalin endoglukanaz enzimin 24 saat sonunda orijinal aktivitesini %64.5

(pH 7.0-12.0 aralığında) koruduğu dikkate alınırsa, enzimin aktivitesini, literatür

verilerinden çok daha uzun süreyle ve geniş pH aralığında koruduğu görülmektedir.

4.7.4. C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enziminin termal stabilitesini saptamak amacıyla 20-90 ºC

aralığında 15, 30 ve 60 dakikalık ön inkübasyon uygulamaları gerçekleştirilmiştir.

Sonuçlar Şekil 4.13 de gösterilmiştir.


103

Şekil 4.13. C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları

C-14 selülaz enziminin 20-40ºC aralığında 15 dakikalık ön inkübasyondan

sonra orijinal aktivitesini ortalama %94, 30 dakikada %89, 60 dakikada ise %64

oranında koruduğu saptanmıştır. Ön inkübasyon süresine bağlı olarak termal

stabilitenin düştüğü gözlenmiştir.

Termal stabilite 20-40º aralığındaki 15 dakikalık inkübasyon sonunda %94 iken

60 dakika sonunda %64 olarak gerçekleşmiştir. Stabilitedeki düşüş oranı yaklaşık

%32 düzeyindedir.

Ön inkübasyon sıcaklığı 20-60ºC olarak seçildiğinde 15 dakika sonunda orijinal

aktivitenin ortalama %90, 30 dakika sonunda %77 ve 60 dakika sonunda %54’e

düştüğü saptanmıştır. Bu aralıkta da ön inkübasyon süresinin değişmesiyle birlikte

termal stabilite de önemli düşüşler gözlenmiştir.

Elde edilen sonuçlara termal stabilite 60 dakika sonunda 15 dakikaya göre

yaklaşık %40 oranında düşüş göstermiştir.

0

20

40

60

80

100

120

Kont 20 30 40 50 60 70 80 90

Ön İnkübasyon Sıcaklıkları (ºC)

Kal

an E

nzim

Akt

ivite

si (%

)15 30 60


104

Ön inkübasyon sıcaklık değeri 70ºC ye yüksetildiğinde termal stabilite 15

dakika sonunda %62, 30 dakika sonunda %51 olarak gerçekleşirken 60 dakika

sonunda bu değer %10 düzeyine düşmüştür. Sıcaklığın ve ön inkübason süresinin

yükseltilmesine paralel olarak stabilite giderek düşmüştür.

Örneğin ön inkübasyon sıcaklığı 90ºC’ye yükseltildiğinde kalan aktivitenin

15 dakika sonunda %28, 30 dakika sonunda ise %5’e düştüğü saptanırken 60

dakikada hiç aktivite gerçekleşmemiştir.

Kalan enzim aktivitesinin 15 ve 30 dakikalık ön inkübasyonlar sonunda 70ºC

de %50 değerine düşmesine karşılık 60 dakikalık inkübasyon dikkate alındığında

40ºC de %45’e düştüğü saptanmıştır.

Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz enzimi, 70ºC’ye kadar ısısal işlemlerin

kullanıldığı uygulamalarda 15 ve 30 dakika süreyle başarıyla kullanılabilme özelliği

göstermektedir. Elde edilen veriler değerlendirildiği zaman enzimin, 20-70ºC

aralığında termostabil olduğu görülmektedir.

Endo ve ark, (2001) optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan alkalin

endoglukanaz enzimininin, orijinal aktivitesini 40ºC 15 dakika inkübasyon sonunda

%100’e yakın koruduğunu, ortam sıcaklığı 60ºC’ye yükseltildiğinde ise aktivitenin

yaklaşık %50 düzeyine düştüğünü belirtmişlerdir.

Optimum sıcaklığı 50oC olan Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilen ve

optimum aktivite sıcaklığı 50ºC olan endoglukanaz enziminin 10 dakikalık

inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini 20ºC’de tamamen koruduğunu, 40ºC’de

aktivitenin %90’a, 50ºC’de %50’ye 100ºC’de ise %30’a düştüğü bulunmuştur

(Hakamada ve ark, 1997).

Bacillus circulans suşundan üretilen ve optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan

alkalin endoglukanaz enziminin, 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda, orijinal

aktivitesini 55ºC de %100 koruduğu 60ºC de ise aktivitenin %50’ye düştüğü,

sıcaklığın 65ºC‘ye yükseltilmesiyle aktivitenin tamamen kaybolduğu saptanmıştır


C-14 alkalin endoglukanaz enziminin ön inkübasyon sıcaklık aralığı 20-60º

olarak seçildiğinde orijinal aktivitesini 15 dakika sonunda ortalama %90, 30 dakika

sonunda %77 ve 60 dakika sonunda %54 koruduğu saptanmıştır. Bu sonuçlara göre


105

C-14 endoglukanaz enzimi literatür verilerinden daha yüksek termal stabiliteye

sahiptir.

4.7.5. C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün

Etkisine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzim aktivitesine NaCl’ün etkisini saptamak amacı ile

içerisinde %3.5-30 NaCl bulunan optimum pH değerine sahip substratlar kullanılarak

optimum aktivite sıcaklığında standart enzim aktivitesi analizleri yapılmıştır. Elde

edilen sonuçlar Şekil 4.14 de gösterilmiştir.

60

70

80

90

100

110

120

130

140

K 3,5 5 7,5 10 12,5 15 20 25 30

NaCl Konsantrasyonları (%)

Röl

atif

Enzi

m A

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.14: Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim

Aktivitesine Etkisi

Yapılan analizler sonunda NaCl’ün bütün konsantrasyonlarda enzim

aktivitesini artırdığı saptanmıştır. En yüksek aktivite %133 ile %20 tuz

konsantrasyonunda elde edilirken %12.5-25 aralığındaki aktivitelerin ortalama %128

olarak gerçekleştiği bulunmuştur. NaCl konsantrasyonu %30 düzeyine

çıkartıldığında ise aktivite %95 düzeyine düşmüştür.

Enzim aktivitesi %15-25 aralığında ortalama %128.3 olarak gerçekleşmiştir.

Optimum enzim aktivitesinin %20 (3.4M) tuz konsantrasyonunda elde edilmesi


106

enzim aktivitesinin yüksek NaCl düzeylerinde uyarıldığını ve enzimin halofil

karakterde olduğunun kanıtıdır.

C-14 endoglukanaz enziminin tuz stabilitesinin saptanması amacı ile %3-25

aralığında değişen konsantrasyonlarda NaCl çözeltileri hazırlanarak enzim optimum

inkübasyon sıcaklığında (50ºC) 1 ve 6 saat ön inkübasyona bırakılmıştır.

Ön inkübasyon işleminden sonra optimum pH değerinde hazırlanmış substrat

kullanılarak standart aktivite analizi yapılarak kalan enzim aktivitesi saptanmıştır.

Elde edilen bulgular Şekil 4.15 de gösterilmiştir.

0

20

40

60

80

100

120

K 3 5 7 10 15 20 25

NaCl Konsantrasyonu (%)

Kal

an E

nzim

Akt

ivte

si (%

)

1 saat6 saat

Şekil.4.15: Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim

Stabilitesine Etkisi

C-14 endoglukaaz enzimi 1 saatlik ön inkübasyon işleminden sonra %3-7 tuz

konsantrasyonu içeren aralıkta orijinal aktivitesini ortalama %70 oranında

korumuştur. Ön inkübasyon uygulaması 6 saat gerçekleştirildiği zaman, aynı

konsantrasyon aralığında yaklaşık %69 kalan aktivite gözlenmiştir. Her iki sürede

elde edilen kalan aktivite değerleri hemen hemen aynı düzeydedir.

Tuz konsantrasyonu %10-15 aralığına 1 saatlik inkübasyon sonunda kalan

aktivite %77 bulunurken, 6 saat sonunda %71.5 olarak gerçekleşmiştir.


107

NaCl konsantrasyonu %20’ye yükseltildiğinde kalan aktivite değerinde önemli

bir yükselme meydana gelmiştir. Buna göre 1 saat sonunda %88 aktivite elde

edilirken, 6 saat sonra %75’lik aktivite bulunmuştur. Özellikle 1saatlik uygulamada

%3-7 aralığındaki değere göre enzimin stabilitesi %20 tuz konsantrasyonunda

yaklaşık %25 oranında artmıştır.

Her iki inkübasyon süresi için %25 tuz konsantrasyonunda elde edilen kalan

aktivite değeri %50’nin üzerinde olup 1 saat sonunda %73, 6 saat sonunda %63

olarak saptanmıştır. Bu sonuçlara göre enzim yüksek düzeyde tuz stabil özellik

göstermektedir. Bu açıdan özellikle tuz uygulamalarının fazlaca gerçekleştiği

endüstriyel alanlar için oldukça kullanışlı özelliğe sahiptir.

Alkalifilik Bacillus agaradhaerens’ten izole edilen endoglukanaz enziminin

aktivitesi üzerine tuzların etkisini araştırmışlardır. 0.2M tuz konsantrasyonunun

enzim aktivitesini 4 kat (%400) artırdığını ve 0.2-1.5 M aralığında aktivitenin sabit

kaldığını, tuz konsantrasyonun artmasına paralel olarak aktivitede keskin bir düşüşün

gözlendiğini belirtmişlerdir (Hirasawa ve ark, 2006).

Egl-AG endoglukanaz enziminde ise konsantrasyondaki artışla birlikte

aktivitenin arttığı saptanmışlardır (Hirasawa ve ark, 2006).

C-14 enziminde, Hirasawa ve ark (2006)’nın bulgularına benzer sonuçlar

gözlenmiştir. Enzim aktivitesi %3.5 (0.6M) NaCl konsantasyonunda %119’a

yükselirken, %20 (3.45M) tuz konsantrasyonunda %133 ile en yüksek değerine

ulaşmıştır.

Konsantrasyon %30’a (5.17 M) yükseldiğinde ise aktivite hızla azalarak %95

değerine düşmüştür. Bununla birlikte, özellikle %15-25 (2.6-4.3M) aralığındaki tuz

konsantrasyonlarında enzim aktivitesinin ortalama %128.3’e yükselmesi enzimin

ekstrem halofil olduğunu göstermektedir.

Rekombinant endoglukanaz enziminin Cel5A ile yapılan çalışmalarda

enzimin 20 saatlik inkübasyon sonunda (3 M NaCl) orijinal aktivitesini %87

koruduğu bulunmuştur (Voget ve ark, 2006). C-14 Endolukanaz enziminin orijinal

aktivitesini 3.45 M NaCl de 1 saatlik inkübasyon sonunda %87, 6 saat sonunda ise

%74 oranında koruduğu saptanmıştır.


108

Bu sonuçlar C-14 endoglukanaz enziminin aktivite açısından Egl-AG’den çok

daha iyi olduğunu göstermektedir. Stabilite çalışmalarından elde edilen sonuçlar ise

Cel5A ile uygunluk (1 saat için) göstermektedir. Bu sonuçlara göre C-14

endoglukanaz enziminin ekstrem halofil ve halostabil özellikte olduğu söylenebilir.

4.7.6. C-14 Endoglukaaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal

İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar

C-14 endoglukanaz enzimi üzerine metod bölümünde belirtilen

konsantrasyondaki bileşikler kullanılarak uygun süreyle uygun sıcaklıkta ön

inkübasyon gerçekleştirilmiş ve standart enzim aktivite analizi yapılarak kalan enzim

aktivitesi saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar Çizelge.4.10 da verilmiştir.

Çizelge.4.10:C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyon ve Deterjanların Etkisine Ait Sonuçlar

İnhibitörler İnhibitör Konsantrasyonu Kalan Aktivite (%)

Kontrol none 100 EDTA 5mM 93.00 SDS 1% 81.00

CaCl2 5mM 132.00 Na2SO3 5mM 102.00 ZnCl2 5mM 77.00 PMSF 5mM 43.00 KCl 5mM 40.33

β-Merkaptoetanol 1% 69.00 Triton X-100 1% 52.00

Üre 8M 42.33

Enzim deterjanlardan SDS’ye %81 düzeyinde direnç gösterirken, bu oran triton

X-100 de %52, β-merkaptoetanol’de %69 olarak saptanmıştır. C-14 endoglukanaz

enziminin aktivitesi CaCl2 ve Na2SO3 ile artış göstermiştir. Aktivitedeki artış CaCl2

de %132, Na2SO3 ise %102 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Buna karşılık 5 mM ZnCl2 de %77, KCl de ise %40.33 düzeyinde kalan

aktivite değeri elde edilmiştir. Bir başka ifade ile ZnCl2 de yaklaşık %23 düzeyinde

inhibisyon gerçekleşmiştir.


109

Analiz edilen endoglukanaz enzimi EDTA ile %7 inhibe olurken, PMSF

kullanıldığı zaman %57 oranında inibisyon gerçekleşmiştir. Üre ile yapılan

analizlerde ezim aktivitesindeki inhibisyon düzeyi yaklaşık %58 olarak

gerçekleşmiştir.

Bütün bu özellikler enzimin, serin amino asitlerce zengin, deterjanlara oldukça

dirençli, yüksek düzeyde halofil ve kısmi termofil/termostabil özellik taşıdığını

göstermektedir. Buna örnek olarak PMSF ile yüksek düzeyde inhibe olurken EDTA

ile önemli bir inhibisyonun gerçekleşmemesi, KCl ile önemli düzeyde inhibisyon

görülmesi, SDS ve β-merkaptoetanol gibi deterjanlara yüksek düzeyde dirençlilik

görülmesi, ZnCl2’ dirençli olması buna karşılık üre ile yaklaşık %60 inhibisyon

gerçekleşmesini verebiliriz.

Literatür bilgilerinde kalsiyumun endoglukanaz aktivitesi üzerindeki etkisinin

çok farklı yönde olduğunu göstermektedir. Örneğin, 8.4 ve 5 mM CaCl2

endoglukanaz aktivitesini inhibe ettiği belirtilmektedir (Huang ve Monk, 2004; Li ve

ark, 2006).

Bazı araştırmacılar CaCl2 ün endoglkanaz aktivitesi üzerine herhangi bir

etkisinin olmadığını saptamışlardır (Hakamada ve ark, 2002; Singh ve ark, 2004).

Bazı araştırmalarda ise aktiviteyi artırdığı yönünde sonuçlar elde edilmiştir. Buna

göre aktivite artışı sırasıyla %109 (Murashima ve ark, 2002), %108 (Saha, 2004),

%140 (Han ve ark, 1995) ve %118 (Singh ve ark, 2001) olarak bulunmuştur.

C-14 Endoglukanaz enziminin orijinal aktivitesinde 5mM CaCl2 ile %131,

Na2SO3 ile %102 oranında artış meydana gelmiştir. Literatürde kalsiyumun aktiviteyi

artıran etkisi enzimin substrata bağlanma isteğini artırmak ve katalitik bölgenin daha

stabil hale gelmesini sağlama şeklinde açıklanmaktadır (Mansfield ve ark, 1998).

Literatürde Zn+ ve K+ gibi metal iyonlarının enzim aktivitesini değişik

oranlarda (sırasıyla %23 ve %60) inhibe ettiği belirtilmektedir. Murashima ve ark,

(2002) Zn+ ile %73 oranında Han ve ark, (1995) % 63 oranında bir inhibisyon

belirlerken Hakamada ve ark, (2002) herhangi bir inhibisyon gözlemlememişlerdir.

KCl ile yapılan çalışmalarda endoglukanaz enziminde orijinal aktivitenin

sırasıyla %125; %117 ve %102 düzeyinde arttığı bulunmuştur (Singh ve ark., 2001;

Murashima ve ark, 2002; Singh ve ark,2004). C-14 endoglukanaz enziminde yukarda


110

verilen literatür verilerinden farklı olarak yaklaşık %60 düzeyinde inhibisyon

gerçekleşmiştir.

Halofilik enzimlerin büyük çoğunluğunun 2M’dan daha düşük KCl

konsantrasyonlarında bile orijinal aktivitelerinin inhibe olduğu, aktivitedeki düşüş

oranının halofilik düzeyinin göstergesi olarak ifade edildiği belirtilmektedir (Madern

ve ark, 2000). C-14 endoglukanaz enziminin KCl sonuçları, enzimin halofil özellikte

olduğunu kanıtlamaktadır.

Literatür bulgularında EDTA ile gerçekleştirilen aktivite çalışmalarında kalan

enzim aktivitesinin %90-%95 aralığında gerçekleştiği belirtilmiştir (Singh ve ark,

2001; Huang ve Monk, 2004; Li ve ark, 2006). C-14 endoglukanaz enzimi 5mM

EDTA ile muamele edildiği zaman kalan enzim aktivitesi %93 bulunmuştur. Bu

sonuç literatür verileri ile tam bir uyum göstermektedir.

İzolasyonun geçekleştirdiğimiz C-14 endoglukanaz enzimi %1’lik SDS

bulunan ortamda orijinal aktivitesini %81 oranında korumuştur. Bu sonuç literatürde

verilen sonçlarla karşılaştırıldığı zaman (%34, %60 ve %0) oldukça yüksek bir

dirençliliği göstermektedir (Li ve ark, 2006; Singh ve ark, 2001; Mawadza ve ark,

2000).

Buna karşılık diğer araştırmacıların yaptıkları çalışmalarda endoglukanaz

enziminin SDS’ye %91.5, β-Merkaptoetanol’e ise %88.7 dirençi olduğu bulunmuştur

(Huang ve Monk, 2004). C-14 endoglukanaz enziminin SDS’ye %81, β-

Merkaptoetanol’e %69 dirençli olması, enzimin bir çok literatür değerinden daha

yüksek direçlilik gösterdiğini, bu nedenle detejanlara dirençli olduğunu

göstermektedir.

4.7.7. C-14 Selülaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi

C-14 endoglukanaz enzimi %10’luk SDS-PAGE’de (%1’lik CMC içeren)

yürütüldükten sonra jel iki parçaya ayrılarak, marker bölgesi Comassie Brillant Blue

R-250 ile boyanırken, diğer parça renatürasyon işlemlerinden sonra aktivitenin

saptanması için kongo kırmızısı ile boyanarak analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlar

Şekil 4.16 da gösterilmiştir.


111

Şekil 4.16. C-14 Selülaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zimogram Analizi (1: C-14 selülazın SDS-PAGE’de zimogramı, 2: Markır Albümin-66 kDa)

Elektroforetik analiz sonucunda enzime ait 61 kDa ağırlığa sahip tek bir protein

bandı elde edilmiştir.

Literatürde endoglukanaz enzimlerinin büyük çoğunluğunda moleküler

ağırlıkların 35 kDa 85 kDa arasında değiştiği belirtilmiştir (Han ve ark,1995;

Hakamada ve ark., 1997; Mawadza ve ark.,2000; Hakamada ve ark., 2002; Singh ve

ark., 2001; Endo ve ark.,2001; Kim ve ark., 2005;Voget ve ark., 2006; Zvereva ve

ark, 2006; Zhang ve ark, 2007). Bir başka kaynakta ise termo-asidofilik

endoglukanaz (Ba-EGA) enziminin 67 kDa moleküler ağırlıkta olduğu saptanmıştır

(Li ve ark, 2006). Çalışmamızda izole edilen C-14 halofil alkalin endoglukanaz

enziminin moleküler ağırlığı 61 kDa olarak bulunmuştur. C-14 endoglukanaz

enzimine ait moleküler ağırlık değeri literatür verileriyle uygunluk içindedir.

4.7.8. C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları

C-14 endoglukanaz enziminin ince tabaka kromatografisi analizlerine ait

sonuçlar Şekil 4.17’de gösterilmiştir.


112

Şekil 4.17. C-14 Endoglukanaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son

Ürünlerinin Belirlenmesi.(G1: Glikoz; G2: Maltoz; C14 selülaz enzimi Hidroliz ürünleri; CMC: enzim ile muamele edilmemiş karboksimetil selüloz)

Analiz sonunda C-14 selülaz enziminin CMC’yi maltoz ve diğer uzun zincirli

sellooligosakkaritlere (sellobioz, sellotrioz, sellotetroz gibi) parçaladığı fakat glikoza

dönüştürmediği saptanmıştır.

Bu konuda daha önce yapılan çalışmalarda termofilik Rhodothermus

marinus’dan izole edilen endoglukanaz enzimi ile CMC’nin hidrolizi sonucu ortaya

çıkan ürünlerin glikoz, sellobiyoz, sellotrioz, sellotetraoz ve sellopentaoz olduğu

bulunmuştur (Hreggvidsson ve ark, 1996).

Bacillus sphaericus JS1’den izole edilen endoglukanaz enziminin CMC’yi

hidrolizi sonucu ouşan son ürünlerin glikoz, sellobiyoz, sellotrioz ve daha uzun

zincirli sellooligosakkarit olduğu saptanmıştır (Singh ve ark, 2004). Başka bir

araştırmada ise halotolerant selülaz enziminin CMC’yi hidrolizi sonunda sellobioz,

sellotrioz, sellotetraoz ve diğer sellooligosakkaritlerin meydana geldiği saptanmıştır

(Voget ve ark, 2006).

C-14 endoglukanaz enzimin CMC’yi hidrolizasyonu sonunda maltoz,

sellobioz, sellotrioz, sellotetroz gibi uzun zincirli sellooligosakkaritler açığa

çıkmıştır. Bu sonuç literatür verileriyle tam bir uyum göstermektedir (Voget ve ark,

2006).


113

4.8. Kısmi Saflaştırılmış X-13 Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite

Sonucu

X-13 suşundan kısmi saflaştırma yöntemiyle elde edilen ksilanaz enziminin

oalt spealt ksilan içeren katı besiyerindeki aktivite sonucu Şekil 4.18’de

görülmektedir. Enzimin aktivite gösterdiği bölge sarı renkte görülürken

parçalanmamış ksilanlı bölgeler, kırmızı renkte görülmektedirler. Elde edilen

sonucun 50µl enzim kullanılarak 1 saatlik imkübasyon sonunda geçekleştiği göz

önüne alındığında, ksilanaz enziminin oldukça aktif olduğu görülmektedir.

Şekil 4.18.Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Ksilanaz Enziminin Katı

Besiyerindeki Aktivite Sonucu

4.8.1. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değeri ve

Aralığına Ait Sonuçlar

X-13 suşuna ait ksilanaz enziminin pH optimumunun saptanması için Sitrat-

fosfat (pH 4.0-5.5); Na-fosfat (pH 6.0-8.0); Glisin-NaOH (pH 8.5-10.0) ve Borax-

NaOH (pH 10.5-11.0) oluşan 4 farklı tampon sistemi kullanılmıştır. Ksilanaz

enziminin pH optimumuna ait veriler Şekil 4.19’da gösterilmiştir.


114

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH

Röl

atifA

ktiv

ite(%

)

Şekil 4.19.X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine

Ait Sonuçlar.

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi ile gerçekleştirilen ön çalışmalardan elde

edilen veriler ışığında, optimum pH analizlerinin alt sınırı diğer enzimlerden farklı

olarak 4.0 şeklinde belirlenmiş ve analizler pH 4.0-12.0 aralığında

gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle analizde kullanılan tampon sistemine Sitrat-fosfat

(pH: 4.0-5.5) tamponu eklenmiştir.

Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH aralığı ağırlıklı olarak 4.0-7.0 arasında

yer almıştır. Enzim optimum aktivitesini pH 6.0 da gösterirken, pH 5.0 te %97

aktivite gerçekleşmiştir. Bu sonuçlara göre pH 5.0-6.0 aralığında ortalama %98.5

düzeyinde aktivite varlığı söz konusudur. Asidik pH aralığı olan 4.0-7.0 değerleri

arasındaki ortalama aktivite oranı %90.25 düzeyindedir.

pH değerinin yükselmesiyle birlikte enzimin ativitesi hızla düşmeye başlamış

ve pH 9.0 da %51 aktivite elde edilmiştir. Alkali pH ortamlarında, enzim aktivitesini

önemli düzeyde kaybedip pH 10.0 da %26, pH 11.0 de %8 aktivite değerine

ulaşılırken, pH 12.0 de aktivite tamamen kaybolmuştur. Bu sonuçlar X-13 ksilanaz

enziminin asidik karakterde olduğunu göstermektedir.


115

Ksilanaz enzimi ile bu güne kadar yapılan değişik çalışmalarda farklı pH

optimumuna sahip sonuçlar elde edilmiştir. Örneğin, Sulfolobus solfataricus’tan

izole edilen ksilanazın optimum aktivitesini pH 7.0, Humicola insolens’ten izole

edilen ksilanaz pH 6.0-6.5 ve Halorhabdus utahensis’ten izole edilen ksilanazın pH

7.0’de gösterdiği saptanmıştır (Düsterhöft ve ark, 1997; WainØ ve Ingvorsen, 2003;

Cannio ve ark, 2004).

Optimum pH değerinin saptanmasıyla ilgili çok farklı organizmalara ait

çalışmalardan değişik sonuçlar elde edilmiştir. Yaplan analizlerde Penicilliun

capsulatum’dan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH

değerinin 3.8, Fusarium proliferatum ksilanazının 5.0-5.5 ve Aspergillus fumigatus

ksilanazının 6.0-6.5 olduğu bulunmuştur (Saha ve ark, 2002; Ryan ve ark, 2003;

Anthony ve ark, 2003).

Bacillus sp. suşlarından izole edilen ksilanaz enzimlerinin optimum aktivite

gösterdikleri pH değerleri literatürlerde değişik şekilde (5.5, 5.6, 6.0, 6.5 ve 7.0) yer

almıştır (Blanco ve ark, 1995; Pham ve ark, 1998; Dhillon ve ark, 2000; Lama ve

ark, 2004; Gallardo ve ark, 2004; Avcioglu ve ark, 2005). Bu verilerin yanı sıra

alkalifilik Bacillus sp. suşundan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesini

pH 8.0de gösterdiği belirtilmiştir (Kumar ve ark, 2004).

Optimum aktivitesini pH 6.0 da gösteren Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi

literatür verileriyle tam bir uygunluk içerisinde olup, ağırlıklı olarak asidik özellik

göstermektedir. Bu özelliği dikkate alındığı zaman, özellikle kanatlı hayvan

yemlerinin hazırlanması ve kağıt endüstrisinde kullanılabilecek uygun pH değerine

sahip, ideal bir enzimdir.

4.8.2. X-13 Ksilanaz’ın Sıcaklık Optimumu

X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin

bulunabilmesi için enzim 20-100ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde metod

bölümünde açıklanan standartlara uygun şekilde analiz gerçekleştirilmiştir. Elde

edilen sonuçlar Şekil.4.20’de gösterilmiştir.


116

0

20

40

60

80

100

120

20 30 40 50 60 70 80 90 100

İnkübasyon sıcaklığı (ºC)

Röl

atif

enzi

m a

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.20. X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Değerine ait Sonuçlar.

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi optimum aktivitesini 40ºC de göstermektedir.

Enzim 20ºC de %19 aktivite gösterirken, sıcaklık 30ºC’ye yükseldiğinde aktivite

%67 düzeyine çıkmıştır. İnkübasyon sıcaklığının 50-60ºC olarak uygulandığı

aşamada aktivite yaklaşık %78.5’e düşse de, bu iki sıcaklık değerinde stabil bir

aktivite saptanmıştır.

İnkübasyon sıcaklığının yükselmesine paralel olarak aktivitede de lineer bir

düşüş meydana gelmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 70, 80, 90 ve 100ºC olarak

uygulandığı zaman, aktivite değerleri sırasıyla %70, %58, %45 ve %42 şeklinde

saptanmıştır.

En yüksek aktivite 40ºC de gerçekleşmekle birlikte enzim, 30-70ºC aralığında

ortalama %78.8 aktiviteye sahiptir. Bu özellikler dikkate alındığı zaman, Bacillus sp.

X-13 enziminin özellikle mezofil olmak üzere, termofil sıcaklık aralığında

gerçekleştirilecek uygulamalar için ideal özellikler taşıdığı görülmektedir.

Halofilik bakterilerden elde edilen ksilanazlarda gözlenen optimum sıcaklık

değerlerinin 55-90ºC arasında değiştiği belirtilmiştir (Düsterhöft ve ark, 1997; Wejse

ve ark, 2003; Waino ve ark, 2003; Cannio ve ark, 2004). Mantar kasilanazlarında


117

elde edilen optimum aktivite değerlerinin ise 48-60ºC arasında dağılım gösterdiği

bildirilmiştir (Saha ve ark, 2002; Anthony ve ark, 2003; Ryan ve ark, 2003).

Değişik literatürlerde Bacillus sp. suşlarından izole edilen ksilanaz enzimlerinin

optimum aktivite gösterdikleri sıcaklık değerlerinin 60-80ºC arasında olduğu

bildirilmiştir (Breccia ve ark, 1998; Dhillon ve ark, 2000; Gallardo ve ark, 2004;

Avcioglu ve ark, 2005).

Diğer Bacillus sp. suşlarında ise daha düşük aktivite sıcaklıkları bulunmuş

olup, bir çok araştırmacının çalışmalarında optimum aktivitenin 50ºC de gözlendiği

saptanmıştır (Blanco ve ark, 1995; Pham ve ark, 1998; Lama ve ark, 2004; Poorna ve

Prema, 2006;).

Pham ve ark (1998), ise analizini geçekleştirdikleri ksilanaz enziminin en iyi

aktiviteyi 40ºC de gösterdiğini bulmuşlardır. Çalışmalarımızda doğal ortamdan izole

edilen Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivitesini 40ºC’de gösterdiği

saptanmıştır.

Bacillus sp. X-13 ksilaz enzimine ait sonuçlar, Pham ve ark, (1998)’nın

bulguları ile tam bir uyum göstermektedir. Bu özellik enzimin tavuk yemlerinin

hazırlanmasında ne kadar uygun olduğunu bir kez daha kanıtlamaktadır (Tavukların

vücut sıcaklığı 40ºC civarındadır).

4.8.3. X-13 Ksilanaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar

X-13 ksilanaz enziminin pH stabilite analizleri için enzim, pH 3.0-10.0

arasındaki tampon çözeltilerde 15 dakika, 60 dakika ve 24 saat süreyle, 40ºC de ön

inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil.4.21’ de gösterilmiştir.


118

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

K 3 4 5 6 7 8 9 10

Ön İnkübasyon Gerçekleştirilen pH Değerleri

Kal

an R

ölat

if En

zim

Akt

ivite

si (%

)

15 dk60 dk24 saat

Şekil 4.21:X-13 Ksilanaz Enziminin 15 dakika, 60 dakika ve 24 Saat Ön

İnkübasyon İşleminden Sonraki pH Stabilitesine Ait Sonuçlar.

Enzim 15 dakikalık ön inkübasyondan sonra özellikle pH 5.0-6.0 aralığında

aktivitesini %100 korumuştur. İnkübasyon pH’sının 3.0-4.0 aralığındaki değerlerde

ise kalan aktivite yaklaşık %94.5 düzeyinde korunmuştur. Ön inkübasyon pH’sının

yükselmesiyle birlikte kalan enzim aktivitesinde düşme gözlenmiştir.

pH 7.0’de kalan aktivite %91düzeyinde gerçekleşirken, 8.0-10.0 aralığında

ortalama %85’lik aktivite saptanmıştır. Bununla birlikte özellikle pH 9.0 da kalan

enzim aktivitesinin pH 8.0 e göre arttığı, pH 10.0 ise yeniden düştüğü saptanmıştır.

X-13 ksilanaz enzimi 15 dakikalık ön inkübasyon uygulaması sonucunda pH 3.0-

10.0 aralığında orijinal aktivitesini ortalama %92 düzeyinde korumuştur.

Ön inkübasyon süresinin 60 dakika olarak seçildiği deneyler sonucunda

enzimin pH 3.0 de %81 aktivite gösterdiği bulunurken pH 4.0-6.0 aralığında yaklaşık

%73.3 kalan aktivite saptanmıştır.

Ön inkübasyonun 60 dakika olarak seçildiği uygulamalarda da pH 9.0 da kalan

enzim aktivitesinin pH 8.0 e göre yükseldiği, pH 10.0 tekrar düştüğü görülmüştür.


119

Enzim 60 dakikalık inkübasyon sonunda bütün pH değerleri dikkate alındığında (pH

3.0-10.0) orijinal aktivitesini yaklaşık %71.5 korumuştur.

X-13 ksilanaz enziminde 24 saatlik ön inkübasyon uygulaması sonunda en

yüksek kalan enzim aktivitesi pH 6.0 da %55 olarak bulunmuştur. Ezim pH 3.0 de

%50 kalan aktivteye sahipken, pH 4.0-5.0 aralığında kalan aktivite değeri yaklaşık

%45.5 olarak ölçülmüştür. Bu inkübasyon süresinde de pH 9.0 da kalan enzim

aktivitesinde pH 8.0 e göre yükselme gerçekleşmiş, fakat pH 10.0 da aktivite tekrar

düşmüştür. Ksilanaz enzimi pH 3.0-10.0 aralığındaki tampon çözeltilerde 24 saat

inkübe edildiğinde başlangıç aktivitesini ortalama %44 düzeyinde korumaktadır.

Ksilanaz enzimi özellikle asidik pH değerlerinde yüksek düzeyde stabilitesini

korumuştur. Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 6.0 olduğu dikkate

alınırsa, elde edilen souçlar, optimum pH değeriyle tamamen uyum göstermetedir.

pH 9.0 da bütün inkübasyon sürelerinde kalan aktivitenin yükselmesi, pH 8.0

ve 10.0 azda olsa düşmesi, zimogram analizinde de görüldüğü enzime ait diğer alt

birimlerin sonucu olabilir (dört band gözlenmiştir). Bu sonuçlar ışığında X-13

ksilanaz enziminin, özellikle asidik pH değerlerinde 24 saat süreyle ön inkübasyon

gerçekleştirildiği zaman, %50’nin üzerinde stabil olduğunu söylemek mümkündür.

Bacillus circulans’dan izole edilen ksilanaz A ve Ksilanaz B enzimlerine

50ºC’de ve pH 8.0’de 10 dakika süreyle ön inkübasyon uygulandığı zaman orijinal

aktivitenin %60-70 devam ettiğini belirtmişlerdir (Dhillon ve ark, 2000).

B. amyloliquefaciens suşundan izole edilen ksilanaz enziminin orijinal

aktivitesini pH 9.0’da %71, pH 10,0’da ise %43 oranında koruduğunu bulmuşlardır

(Breccia ve ark, 1998). Gallardo ve ark, (2004) optimum ativitesini pH 6.0 ve 60ºC

gösteren ksilanaz enziminin 3 saat süreyle pH 7.0 ve 50ºC de inkübe edildiği zaman,

enzimin stabil kaldığını saptamışlardır. Fusarium suşundan izole edilen ksilanaz

enziminin pH 5.0-7.0 aralığında 55ºC sıcaklığa kadar tamamen stabil kaldığını

belirtmiştir (Saha, 2002).

Halofilik bakterileriden elde edilen iki ekstrem halotolerant ksilanaz

enziminlerinin pH 4-11 aralığında stabil oldukları saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003).

Bacillus sp. X-13 suşundan izole edilen ksilanaz enzimi, pH 3.0-10 aralığında

15 dakika süreyle optimum aktivite sıcaklığında inkübe edildiği zaman orijinal


120

aktivitesini %92, 60 dakika inkübe edildiği zaman %71.5 ve 24 saat inkübe edildiği

zaman %44 koruduğu saptanmıştır.

Elde edilen sonuçlar literatür verilerinden (10 dakikalık uygulama dikkate

alındığında) oldukça yüksek olup, enzimin geniş bir pH aralığında stabil olduğunu

göstermektedir.

4.8.4. X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Sonuçlar

X-13 ksilanaz enzimin termal stabilitesini saptamak için 20-90ºC sıcaklık

aralığında 15 ve 60 dakika süreyle ön inkübasyon gerçekleştirilmiş ve optimum pH

değerindeki substrat kullanılarak standart aktivite tayini yapılmıştır. Elde edilen

sonuçlar Şekil 4.22’ de verilmiştir.

0

20

40

60

80

100

120

K 20 30 40 50 60 70 80 90

Ön İnkübasyon Gerçekleştirilen Sıcaklık Değerleri (ºC )

Kal

an R

ölat

if En

zim

Akt

ivite

si (%

)

15 dk60 dk

Şekil 4.22:X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları.

Enzim 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda 20ºC de orijinal aktivitesini %94

oranında devam ettirmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 30-40ºC seçildiğinde orijinal

aktivitenin yaklaşık %70 düzeyine düştüğü saptanmıştır. İnkübasyon sıcaklığı 50ºC

ye yükseltildiği zaman kalan aktivitenin %50’nin altına düştüğü bulunmuştur.


121

Sıcaklık 90ºC ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi %20 düzeyine

düşmüştür. 20-40ºC’lik sıcaklık aralığında elde edilen ortalama aktivite değeri %78

olurken, 50-90ºC aralığındaki aktivite ortalama %32 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Ön inkübasyon süresi 60 dakika olarak uygulandığı zaman, 20ºC de %75

aktivite gözlenirken, 30-40ºC sıcaklık aralığında ortalama aktivite %67.5 düzeyinde

gerçekleşmiştir. Ön inkübasyon sıcaklığı 50ºC’ye yükseltildiğinde kalan enzim

aktivitesinin %40 düzeyine düştüğü saptanmıştır.

Sıcaklığın 90ºC ye yükseltilmesi sonucu kalan enzim aktivitesi %20’ye

düşmüştür. 20-40ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde ortalama %70 kalan aktivite

değeri saptanırken, 50-90ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde kalan enzim aktivitesi

ortalama %26 olarak bulunmuştur.

Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin 40ºC olduğu göz önüne

alınırsa, 20-40ºC aralığındaki stabilitenin optimum aktivite sıcaklığı ile uyum

gösterdiği görülmektedir. Bununla birlikte 50ºC nin üzerindeki sıcaklıklarda hem 15

hemde 60 dakikalık uygulamalarda, X-13 ksilanaz enziminin stabil olmadığı

bulunmuştur.

Yapılan çalışmalarda ksilanaz enzimlerinin çok farklı termal stabilite profilleri

gösterdikleri bulunmuştur. Bacillus amyloliquefaciens’den izole edilen ksilanaz

enzimi 60ºC de 15 dakika inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %100 korurken,

inkübasyon sıcaklığı 65-70ºC’ye yükseltildiğinde aktivitenin %50’nin altına düştüğü

saptanmıştır (Breccia ve ark,1998).

Aspergillus fumigatus ile yapılan çalışmalarda izole edilen ksilanaz enzimi ile

40ºC’lık sıcaklıkta 30 dakika ön inkübasyon uygulandığında orijinal aktivitenin

%100’e yakın korunduğu, inkübasyon sıcaklığı 60ºC ‘ye yükseltildiğinde ise 10

dakikalık uygulama sonunda aktivitenin %50’nin altına düştüğü saptanmıştır

(Anthony ve ark, 2003).

Sa-Pereira ve ark, (2002) Bacillus subtilis’ten izole edilen ksilanaz enziminin

20 dakikalık inkübasyon sonunda 60ºC sıcaklığa kadar orijnal aktivitesin %60’ın

üzerinde koruduğunu, sıcaklığın yüksetilmesiyle birlikte aktivitenin %40’ların altına

düştüğünü bulmuşlardır.


122

Bacillus sp.Bp-7 suşundan üretilen ksilanaz enziminin pH 7.0 ve 50ºC

sıcaklıkta 3 saat süreyle stabil kaldığını bulmuşlardır (Gallardo ve ark, 2004). Yang

ve ark (1995)’nın yaptığı çalışmada Bacillus sp. V1-4 suşundan izole edilen ksilanaz

enziminin 50ºC ve pH 9.0’da 30 dakikalık inkübasyon sonuda orijinal aktivitesini

%95 koruduğunu bildirmişlerdir. Bacillus pumilus’a ait ksilanaz enziminin 40ºC ‘ye

kadarki sıcaklıklarda aktivitesini 1 saat süreyle koruduğu, 60ºC de ise aktivitenin

%30 düzeyine düştüğü bulunmuştur (Poorna ve Prema, 2006).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 20-40ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde 60

dakika süreyle orijinal aktivtesini ortalama %70 oranında korurken, 50-90ºC

aralığındaki sıcaklıklarda aktivite ortalama %26 düzeyine düşmüştür.

Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite sıcaklığında

termostabil olduğunu göstermektedir.

4.8.5. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait

Sonuçlar

X-13 ksilanaz enzim aktivite ve stabilitesi üzerine NaCl’ün etkisini saptamak

amacıyla enzim değişik tuz konsantrasyonlarında (%3-25) 1 ve 6 saat süreyle ön

inkübasyona tabi tutulmuştur. Ön inkübasyon işleminden sonra optimum aktivite

sıcaklığı ve pH değerinde standart enzim aktivitesi saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar

Şekil.4.23’ de gösterilmiştir.


123

30

40

50

60

70

80

90

100

110

K 3 5 7 10 15 20 25

Ön İnkbasyon yapılan NaCl Konsantrasyonu (%)

Kal

an R

ölat

if En

zim

Akt

ivite

si (%

)

1 Saat6 saat

Şekil.4.23: X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün

Etkisine Ait Sonuçlar.

Ksilanaz enziminin 1 saatlik ön inkübasyon uygulaması sonunda %3-20

aralığındaki tuz konsantrasyonlarında kalan enzim aktivitesi ortalama %91 olarak

gerçekleşmiştir. En yüksek kalan enzim aktivitesi değeri %97 ile %3 tuz

konsantrasyonunda gerçekleşirken, %3-7 aralığında ortalama %93.3 kalan enzim

aktivitesi saptanmıştır. Enzim %3-25 aralığındaki tuz konsantrasyonuna 1 saatlik ön

inkübasyon sonunda ortalama %89 direnç göstermiştir.

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin ön inkübasyon süresi 6 saat olarak

uygulandığı zaman en yüksek kalan enzim aktivitesi %3 tuz konsantrasyonunda elde

edilmiştir. %3-20 aralığındaki tuz konsantrasyonlarında kalan enzim ativitesi

ortalama %74.3 düzeyinde gerçekleşmiştir. %25’lik tuz konsantrasyonu ve 6 saat ön

inkübasyon sonundaki kalan aktivite yaklaşık %64 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Bütün tuz konsantrasyonları dikkate alındığında (%3-25) elde edilen kalan

aktivite ortalama %73 olarak bulunmuştur. Her iki inkübasyon süresi sonunda da

ksilanaz enziminin %3-25 tuz konsantrasyonlarında %73’ün üzerinde aktivite

gösterdiği saptanmıştır.


124

Ekstrem halofilik Halorhabdus utahensis suşundan izole edilen β-ksilanaz

enziminin %5-15 NaCl konsantrasyonunda optimum aktivite gösterdiğini

saptamışlardır. β-ksilanaz enzimi orijinal aktivitesinin %20 NaCl bulunan ortamda

24 saatlik inkübasyon sonucunda yaklaşık %53’e düştüğü bulunmuştur (WainØ ve

Ingvorsen, 2003).

Bir başka çalışmada, halofilik bakteriden izole edilen ksilanaz-1 ve ksilanaz-2

enzimlerinin en yüksek aktiviteyi 1M NaCl konsantrasyonunda, 50ºC ve pH 6.0’da

gösterdiği saptanmıştır. Ksilanaz-1 enziminin aktivitesi 1-2M NaCl aralığında

%100’den %54’e hızlı bir düşüş göstermiştir. NaCl konsantrasyonu 2’den 5 M’a

yükseltildiğinde ksilanaz-2 enziminde aktivitenin %31’e düştüğü saptanmıştır.

Analiz edile enzimlerden ksilanaz-1’in 4M NaCl konsantrasyonunda optimum

aktiviteyi 60ºC de, ksilanaz-2 ‘nin ise 65ºC ‘de gösterdiği bulunmuştur (Wejse ve

ark, 2003).

Çalışmada analiz edilen X-13 ksilanaz enzimin 1 saatlik inübasyon sonunda

%3-20 NaCl konsantrasyonunda, orijinal aktivitesi yaklaşık %91, 6 saatlik

inkübasyon sonunda ise %74 oranında korunmuştur. Bu sonuçlar enzimin halofil


Halofilik özellik göstermeyen enzimler yüksek tuz konsantrasyonlarında

genellikle presipite olup inaktif hale gelirken, aynı durum halofillerde düşük tuz

konsatrasyonlarında ortaya çıkmaktadır (Ryu ve ark,1994; Madern ve ark, 2000;

Wright ve ark, 2002).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin pH optimumu ve pH stabilitesinin asidik

bölgede gerçekleşmesi, literatür bulgularıyla uyumluluk göstermektedir.

Enzimin halofilik özelliği hemiselüloz parçalanmasıyla ilgili çalışmalarda,

polisakkaridlerin hidrolizi ve karbonhidrat üretimi ile kanatlı hayvan yemlerinin

verimliliklerinin artırılması alanlarında öncelikli olarak kullanılabileceğini

göstermektedir.


125

4.8.6. X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve

Deterjanların Etkisi

X-13 ksilanaz enzimin aktivitesi üzerine deterjan, şelatör, metal iyonu ve

inhibitör maddelerin etkisini saptamak için enzim 15 dakika ve 60 dakika olmak

üzere iki farklı süre ile ön inkübasyona tabii tutulmuştur. Elde edilen sonuçlar

Çizelge 4.11’de gösterilmiştir.

Çizelge 4.11:X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve

Deterjanların Etkisi İnhibitörler İnhibitör

Konsantrasyonu Kalan aktivite (%) * Kalan aktivite (%)**

Kontrol Yok 100.00 100.00 EDTA 5mM 89.31 84.40 SDS 1% 69.00 62.00

Triton X-100 1% 86.00 80.24 CaCl2 5mM 99.00 86.00 ZnCl2 5mM 94.00 82.24 KCl 5mM 95.00 82.00

Na2SO3 5mM 92.34 83.14 PMSF 5mM 89.31 80.14

β-Merkaptoetanol 1% 94.00 82.34 Üre 8M 38.20 28.30

*: 15 dakika ön inkübasyon; **:60 dakika ön inkübasyon

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi EDTA ile kısmen inaktive olurken, orijinal

enzim aktivitesi 15 dakika da yaklaşık %89, 60 dakikada %84 korunmuştur. İzole

edilen ksilanaz enzimi 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda bütün metal iyonlarına

karşı oldukça yüksek direnç göstermiştir. Kalan enzim aktivitesi CaCl2 de %99,

ZnCl2 de %94, Na2SO3 de ise %92 düzeyinde geçekleşmiştir.

Aynı metaller kullanılarak ön inkübasyon süresi 60 dakikaya yükseltildiğinde

kalan enzim aktivitesi bütün metal iyonlarında yaklaşık %11 düzeyinde düşüş

göstermiştir. Elde edilen kalan aktivite değerleri CaCl2 de %86, ZnCl2 de %82,

Na2SO3 de ise %83 olarak saptanmıştır. Metal iyonlarında 15 dakikalık ön

inkübasyon sonunda ortalama %5 inhibisyon meydana gelirken, 60 dakika sonundaki

inhibisyon oranı yaklaşık %16 olarak gerçekleşmiştir.


126

KCl kullanılan analizlerde diğer metal iyonlarındakilere benzer sonuçlar

alınmıştır. İnkübasyon süresi 15 dakika olduğunda %5 inhibisyon gerçekleşirken, 60

dakikada %17 inhibisyon meydana gelmiştir. Bütün bu sonuçlar enzimin 15

dakikalık ön inkübasyon süresinde metal iyonlarına ve şelatörlere yüksek düzeyde

dirençli olduğunu göstermektedir.

Deterjanlar arasında en yüksek dirençlilik %94 ile β-merkaptoetanol’de

saptanırken bunu sırasıyla %86 ile triton X-100 ve %69 ile SDS izlemiştir.

İnkübasyon süresi 60 dakika’ya yükseltildiğinde dirençlilik %80 düzeyine düşse de

deterjanların sırasında değişme meydana gelmemiştir. En yüksek dirençlilik %82 ile

β-merkaptoetanol’de gözlenirken bunu %80 ile triton X-100 ve %62 ile SDS

izlemiştir. Sonuçlardan da görülebileceği gibi özellikle β-merkaptoetanol ve triton X-

100’e karşı önemli düzeyde direçlilik söz konusudur.

PMSF kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi 15 dakika %89, 60 dakika

%80 olarak bulunmuştur. Enzim PMSF ile her iki sürede de kısmen inhibe olmuştur.

Üre kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi diğer ajanlara göre daha

fazla düşmüştür. Buna göre orijinal enzim aktivitesi 15 dakikada %38, 60 dakikada

%28 düzeyine düşmüştür. Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin şelatör, metal

iyonları, deterjanlar ve inhibitörlere karşı (üre hariç) önemli düzeyde dirençli olduğu

söylenebilir.

Yapılan çalışmalarda ksilanaz enzimlerinin EDTA ile muamele edildiği zaman

aktivitenin etkilenmediği veya arttığı yönünde bulgular saptanmıştır (Düsterhöft ve

ark, 1997; Breccia ve ark, 1998; Wejse ve ark, 2003; Anthony ve ark, 2003; Lama ve

ark, 2004). Bazı araştırmacılar ise EDTA kullanıldığı zaman aktivitenin düştüğünü

saptamışlardır (Saha, 2002; Sa-Pereira, 2002).

Bazı araştırmacılar CaCl2 ile enzim aktivitesinde artış saptamalarına rağmen,

genellikle divalent katyonların ksilanaz aktivitesi için gerekli olmadığını

belirtmişlerdir (Wejse ve ark, 2003; Saha, 2002). Bununla birlikte yapılan bazı

çalışmalarda aktivitenin inhibe olduğu yönünde sonuçlar elde edilmiştir (Breccia ve

ark, 1998; Sa-Pereira ve ark, 1998; Heck ve ark, 2004).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi orijnal aktivitesini 5 mM EDTA ile 15

dakikada %89, 60 dakikada %84 devam ettirmiştir. X-13 enzimine ait bu sonuçlar


127

literatür değerleriyle uygunluk göstemektedir. Lama ve ark, (2004) karakterizasyon

çalışması gerçekleştirdikleri ksilanaz enziminde CaCl2 ile aktivitede artış veya

inhibisyon gerçekleşmediğini belirtmişlerdir. Diğer taraftan 1mM SDS kullanılan

çalışmalarda aktivitede %5’lik inhibisyon gerçekleştiği bulunmuştur (Lama ve ark,

2004). Bir diğer çalışmada, halofil bakteriden elde edilen halotolerant ksilanaz-1

enziminin orijinal aktivitesini 1 mM SDS ile %60 koruduğu belirtilmektedir (Wejse

ve ark, 2003).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminde %1 SDS kullanılan çalışmalarda 15

dakikada %69, 60 dakikada %62 kalan aktivite elde edilmiştir. Bu sonuç literatürde

belirtilen enzime göre, X-13 enziminin daha dirençli olduğunu göstermektedir.

ZnCl2 (1 mM) ile yapılan çalışmalarda ksilanaz-1 enziminde %57, ksilanaz-2

enziminde %39 oranında inhibisyon gerçekleştiğini saptamışlardır (Wejse ve ark,

2003).

Çalışmamızda analizini gerçekleştirdiğimiz Bacillus sp. X-13 ksilanaz

enziminde 5 mM ZnCl2 ile 15 dakikalık inkübasyon sonunda orijinal aktivitenin

yaklaşık %14, 60 dakika sonunda %18 inhibe olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlara

göre Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi, ZnCl2’e literatür verilerinden çok daha

yüksek düzeyde dirençlidir.

Halofil bakteriden elde edilen ksilanaz-1 enzimi 1 mM β-Merkaptoetanol ile

muamele edildiğinde enzim %95 direnç göstermiştir (Wejse ve ark, 2003). Bacillus

sp. X-13 ksilanaz enzimi 5 mM β-Merkaptoetanol ile 15 dakikalık inkübasyon

sonunda orijinal aktivitesini %94 korumuştur. Bu açıdan literatür verisi ile tam bir

uyum görülmektedir.

Halotolerant ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini 1 mM PMSF’de %99, 10

mM’ da ise %76 koruduğu saptanmıştır. Üre ile yapılan analizlerde ise orijinal

aktivitenin 1mM’da %81 korunduğu bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 5 mM PMSF ile 15 dakikalık inkübasyon

sonunda orijial aktivitesini %89, 60 dakikada %80 korumuştur. Bu sonuç literatürle

uygunluk göstermektedir. Diğer taraftan Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin 8M

üre kullanılan çaışmalarda 15 dakika sonunda orijinal aktivitesini %38, 60 dakika

sonunda %28 koruduğu saptanmıştır.


128

4.8.7. X-13 Ksilanaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi Bulguları

Bacillus sp.X-13 ksilanaz enziminin zimogram analizi %10’luk homojen

SDS-PAGE (%1’lik ksilan içeren) sisteminde gerçekleştirilmiştir. Elektroforez

uygulamasından sonra jel iki parçaya bölünerek, parçalardan birisi moleküler ağırlık

saptaması için Comassie Blue R250 ile boyanmıştır. Diğer parça enzim aktivitesinin

saptanması amacıyla renatürasyon işlemlerinde kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar

Şekil 4.24’ de gösterilmiştir.

Şekil 4.24. X-13 Ksilanaz Enzimi Zimogram Analizi Sonuçları (1: X-13 Ksilanazın SDS-PAGE’de Zimogramı 2: Markır Sığır Albümin-66 kDa)

Zimogram analizi sonucunda Bacillus sp.X-13 ksilanaz enzimin, moleküler

ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört alt birimden meydana geldiği

saptanmıştır.

Literatürde Penicillium capsulatum ve Fusarium proliferatum

organizmalarından izole edilen ksilanazlar enzimlerinin 22-22.4 kDa ağırlığa sahip

oldukları, buna karşılık Aspergillus fumigatus mantarından elde edilen enzimin

moleküler ağırlıkları 212-253 kDa arasında değişen 4 alt birimden meydana geldiği

bulunmuştur (Ryan ve ark, 2003; Saha, 2002).

Farklı Bacillus sp. izolatlarından moleküler ağırlıkları 24-45 kDa arasında

değişen ksilanaz enzimlerinin izole edildiği belirtilmiştir (Lama ve ark, 2004;

Gallardo ve ark, 2003; Blanco ve ark, 1995). Bacillus circulans suşundan üretilen


129

ksilanaz enziminin moleküler ağırlıkları 22 ve 30 kDa olan iki at birimden meydana

geldiğini bulunmuştur (Dhillon ve ark, 2000) .

Bacillus firmus suşundan izole edilen ksilanaz enziminin 18.4 ve 19.6 kDa,

Bacillus amyloliquefaciens ksilanaz enziminin ise 23 ve 45 kDa ağırlığa sahip iki alt

birimden meydana geldiği bulunmuştur (Tseng ve ark, 2002; Breccia ve ark, 1998;

Lopez ve ark, 1998).

Ekstrem halofilik archaeon Halorhabdus utahensis organizmasından izole

edilen β-ksilanaz enzimi 45 kDa, β-ksilosidaz enzimi ise 67 kDa moleküler ağırlığa

sahiptir (WainØ ve Ingvorsen, 2003). Halophilic bakteriden izole edilen ekstrem

halotolerant ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin moleküler ağırlıkları sırası ile 43

ve 62 kDa olarak bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003).

Bacillus sp. X-13 suşundan izole ettiğimiz halofil ksilanaz enziminin,

moleküler ağırlıkları 68.5-108.4 kDa arasında değişen 4 alt birimden meydana

geldiği bulunmuştur.

4.8.8. X-13 Ksilanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları

Enzim substrat karışımının optimum aktivite sıcaklığında 1 saatlik inkübasyonu

sonucu açığa çıkan hidroliz ürünlerinin ince tabaka kromatografisi sonuçları Şekil

4.25’de gösterilmiştir.

Şekil 4.25. X-13 Ksilanaz Enziminin Hidroliz Ürünlerne ait Bulgular


130

Gerçekleştirilen analiz sonucunda enzimin hidroliz ürünleri arasında ortaya

çıkan en önemli ürünün, bandın yoğunluğundan da görüldüğü gibi ksiloz olduğu

saptanmıştır. Ayrıca reaksiyon ürünleri arasında konsantrasyonları farklı olan ve

kromatografi ortamında bir birinden belirgin şekilde ayrılmış çok sayıda uzun zincirli

ksilo-oigosakkarit ürünlerinin açığa çıktığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar enzimin yüksek

düzeyde aktif olduğunu ve ksilanaz endüstrisinde önemli bir yer edinebileceğini

göstermektedir.

Alkali tolerant özellik gösteren Bacillus sp. suşuna ait ksilanaz enzimi, substrat

ile 1 saat inkübe edildiğinde ortaya çıkan hidroliz ürünlerinin ksilotrioz ve daha uzun

zincirli ksilo-oligosakkaritler olduğu bulunmuştur. Enzim 3 saat inkübe edildiğinde

ise ksilobiyoz ve uzun zincirli ksilooligosakkaritlerin meydana geldiği gözlenmiştir

(Lopez ve ark, 1998).

Bacillus halodurans organizmasından elde edilen ksilanaz enzimi huş agacı

ksilanı ile inkübasyona bırakıldığında, 6 saat sonunda ksilobiyoz, 24 saat sonunda ise

çok az ksiloz açığa çıktığı saptanmıştır (Mamo ve ark, 2006).

Halofilik bakteri suşundan elde edilen halotolerant ksilanaz enzimlerinin ksilanı

ksilobiyoz ve ksilotrioza parçaladıkları saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003).

Tanaka ve ark (2005), Penicillium citrinum ksilanazının huş ağacı ksilanını 1

saatlik inkübasyon sonunda çok az miktarda ksiloz ve diğer ksilo-oligosakkaritlere,

48 saatlik inkübasyon sonunda ise önemli miktarda ksilobiyoz, ksiloz ve diğer ksilo-

oligosakkaritlere hidroliz ettiğini bulmuşlardır. Alkalifilik Bacillus sp. suşundan

izole edilen ksilanaz enzimi 3 saatlik inkübasyon sonunda ortamdaki ksilanı

ksilobiyoz ve daha uzun zincirli ksilo-oligosakkaritlere dönüştürmüştür (Li ve ark,

2006).

Bacillus sp. X-13 suşundan izole edilen halofil ksilanaz enzimi oalt spealt

ksilanı pH 6.0 ve 40˚C’de 1 saatlik inkübasyon sonunda, önemli miktarda ksiloz,

farklı konsantrasyonda ve çok sayıda ksilotrioz ve ksilotetrozdan oluşan uzun zincirli

ksilooligosakkaritlere hidroliz etmiştir. Enzimin hidroliz ürünleri dikkate alındığında,

literatürde belirtilen farklı organizmalara ait ksilanaz enzimlerinden daha yüksek

aktiviteye sahip olduğu görülmektedir. Enzim, bu özellikleri ile özellikle besin


131

endüstrisi alanında, prebiyotiklerin üretiminde öncelikle kullanılabilecek özelliğe

sahiptir.

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ashabil AYGAN

133

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizma

kaynaklıdırlar. Bunun nedeni mikroorganizma kökenli enzimlerin, bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması,

istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, ekstrem

koşullarda aktivite gösterebilmeleri ve büyük boyutlarda üretilebilmeleridir. Yüksek

bitkilerin vakuollerde artık ürünler olarak, bir tür enzim inhibitörleri ve/veya toksik

karakterli maddeleri depoladıkları bilinmektedir. Bitkilerden enzim elde edilmesi

sırasında bu yapılar ürüne karıştıkları için, bitki enzimleri, endüstri ve klinikte enzim

kaynağı olarak tercih edilmemektedirler (Wiseman, 1987).

Her ne kadar mikrobiyal enzimlerin kullanımı için yukarıda belirtildiği gibi çok

geçerli nedenler varsa da, her mikrobiyal enzim endüstriyel alanda

kullanılmamaktadır. Endüstride kullanılan enzimlerin, bir ürünün üretilmesinde bazı

avantajlara sahip olması gerekmektedir.

Buna göre, bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet

bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en

önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir

olmasına bağlıdır (Wiseman, 1987).

Bugüne kadar 2000’den fazla enzim tanımlanmış ve bunlardan yaklaşık 100

tanesi ticari olarak kullanıma uygun bulunmuştur. Fakat günümüzde bunlardan sadece

18 tanesi endüstriyel amaçla üretilmektedir (Zeman ve McCrea, 1985).

Biyoteknoloji kaynaklı çalışmalar A.B.D. de odaklanmış olmakla birlikte,

günümüzde, Japonya ve Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle moleküler

biyoteknolojiyi) stratejik alan kategorisinde değerlendirerek, özel şirketlerin yanı

sıra, hükümetler düzeyinde destekleme ve geliştirme kararı almışlardır (Glick ve

Pasternak, 1994).

Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının

çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin

endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem


134

kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışındaki diğer ülkeler bu konuda tamamen

dışa bağımlı durumdadırlar.

Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara

sahip olması gerekmektedir. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında

kullanılabilmesi için, işlem maliyeti bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal

koşullara bağlı olmadan aktivitesini en yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan

en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması,

allerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olması gerekir (Sarıkaya,

1995).

Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve

mikroorganizma kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan

izole edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik

aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve

daha ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi

avantajlara sahip olmasıdır. Örneğin mikrobiyal enzimler ekstrem sıcaklık ve pH

değerlerinde çok yüksek düzeyde aktivite gösterirler (Wiseman, 1987; Horikoshi,

1999).

Endüstride yaygın şekilde kullanılan enzimler arasında Bacillus cinsine ait tür

ve alttürleri tarafından sentezlenen ondan fazla enzim vardır. Örneğin ticari olarak

üretilen ve kullanılan termostabil amilaz enzimlerinin üretilmelerinde B.

amyloliquefaciens ve B. licheniformis en çok kullanılan iki Bacillus türüdür (Lin ve

ark, 1998).

Bacillus sp. suşları, proteolitik enzimler ve karbohidratazların önemli bir

kaynağını oluşturmaktadırlar. Örneğin α-amilaz enzimi Bacillus sp. grubunda

oldukça yaygın şekilde bulunur ve başlıca, gıda endüstrisinde nişastanın maltoza

hidrolize edilmesi, maltoz şuruplarının hazırlanması ile ekmek ve bira üretiminde

kullanılmaktadır.

Ekstremofilik organizmalar yüksek sıcaklık, ekstrem pH, yüksek tuz

konsantrasyonu ve yüksek basınç gibi ekolojik koşullara uyum sağlamış

organizmalardır. Bu mikroorganizmalar, ekstrem koşullar altında fonksiyonel olan

biyokatalistik ürünler sentezlemektedirler. Sentezledikleri ürünler arasında amilaz,


135

pullulanaz, selülaz, ksilanaz, kitinaz, proteazlar, esterazlar, glikoizomerazlar,

alkoldehidrojenazlar ve DNA modifiye eden enzimler ilk sayılabileceklerdir.

Bu enzimler gıdadan tekstile, ekmekten deterjana, içecek üretiminden

saflaştırmasına, yenilenebilir enerji kaynaklarından alkol üretimine ve kimya

endüstrisinden farmasötik alanına kadar çok yaygın bir yelpazede, belki de en

önemlisi bir çok farklı uygulamalarla tedavide kullanım alanı bulmuşlardır (Niehaus

ve ark, 1999).

Alkalifilik özellikteki organizmalar, prokaryot, eukaryot ve archea grubu

içerisinde yer almaktadırlar. Alkalifiller arasında çok değişik taksonomik gruplar

olmakla birlikte, bunların bazıları taksonomiye yeni girmişlerdir. Alkalifiller, bahçe

toprağı gibi normal çevresel ortamlardan izole edilebileceği gibi, yüksek alkalik

özellik gösteren topraklardan da izole edilebilirler. Alkalofilik enzimler endüstriyel

uygulamalarda büyük öneme sahiptirler.

Alkalin selülaz, alkalin proteaz ve alkalin amilaz gibi alkalofilik

organizmalardan izole edilen enzimler, çeşitli deterjanların içerisine karıştırılmışlar

ve biyolojik deterjanlar şeklinde tanımlanmışlardır. Dünyada üretilen toplam

alkalifilik enzimlerin %30 dan büyük kısmı çamaşır deterjanları içerisine

karıştırılarak değerlendirilmektedir. (Horikoshi, 1996). Alkalifilik amilaz, selülaz ve

proteazlar aynı zamanda endüstrinin diğer birçok alanında da yoğun şekilde

değerlendirilmektedirler.

Bunlar arasında, dericilik, tekstil, gıda endüstrisi, içecek endüstrisi, ekmek ve

pasta ürünleri, çeşitli soya ürünlerinin üretimi, protein hidrolizatlarının

tatlandırılması, farmasötik endüstrisi ve tıbbi uygulamalar, kimya endüstrisi,

atıkların temizlenmesi, nişastadan etanol üretimi gibi kendi içlerinde birer endüstri

olan çok değişik alanlar vardır (Rao ve ark, 1998; Igarashi ve ark, 1998; Kumar ve

Takagi, 1999).

Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı

zaman, alkalin proteaz %25, diğer proteazlar %21, Amilaz %18, Renin %10, Trypsin

%3, Lipaz %3, diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz gibi)

%10, analitik ve farmasötik enzimler %10 şeklinde bir dağılımla karşılaşılmaktadır

(Rao ve ark, 1998).


136

Halofil organizmalar, halofil, moderately halofil ve ekstrem halofil olmak

üzere genel olarak üç grup içerisinde toplanmaktadırlar. Bu gruptaki

mikroorganizmalar archea adı verilen grup içerisinde değerlendirilirler ve yüksek tuz

içeren çevre koşullarında yaşamaya uyum sağlamışlardır. Orta düzeyde halofil

organizmaların optimum üreyebildikleri tuz konsantrasyonu %3 ile %15 aralığında

değişiklik gösterir (Ventosa ve ark, 1998). Halofil organizmalar özellikle soda

gölleri, çöller ve tuzlu yiyecekler gibi tuz içeren çok değişik habitatlarda

bulunmaktadırlar (Ventosa ve ark, 1998). Alkalin, halofil ve termofil özellik

gösteren extremophile mikroorganizmaların enzim üretim alanında mikrobiyal

fabrikalar şeklinde kullanılacakları ve bu şekilde adlandırılacakları belirtilmektedir

(Aguilar ve ark, 1998).

Halofilik mikroorganizmalar arasında özellikle gram negatifler ile

çalışılmıştır. Gram pozitifler ise bu alanda henüz yeni araştırılmaya başlanmış

organizmalardır. Ekstrem olarak adlandırılan birçok mikroorganizma adaptasyon

gösterdikleri ortam koşullarına bağlı olarak çeşitli özelliklere sahiptirler. Bu nedenle

bu organizmaların biyoteknolojik ve ticari önemleri oldukça yüksektir.

Halofil mikroorganizmalar arasında Halobacillus halophilus (Spring ve ark,

1996), Marinococcus halophilus (Marquez ve ark, 1992), ve Bacillus halophilus

(Ventosa ve ark, 1998) en fazla bilinen organizmalardır. Halofil organizmaların

sentezlediği ürünler arasında bakteriorodopsin, Ektoin, amilaz, lipaz, selülaz,

proteaz, biyosürfaktanlar, lektinler ve biyoplastikler en önemlileridir (Adams ve

Kelly, 1995; Banat ve ark, 2000).

Halotolerant veya halofilik mikroorganizmalar tuz içeren çevresel ortamlarda

üreyebildikleri için biyoteknolojinin değişik alanlarında ve güncel uygulamalar için

potansiyel oluşturmaktadırlar. Halofillerden elde edilen bakteriyel rodopsin uzaysal

ışık modülatörleri, optik hafızalar, optik bilgisayarlar ve optik holograf teknoloji

alanlarında kullanılmaktadır. Halotolerant mikroorganizmalar fermente gıda ve gıda

katkı maddelerinin üretimi için gıda biyoteknolojisinde temel bir rol oynamaktadır.

Değişik organik kirleticilerin transformasyonu veya parçalanmasında ve alternatif

enerji üretim alanlarında halofil mikroorganizmalar kilit bir öneme sahiptirler

(Margesin ve Schinner, 2005).


137

Endüstriyel öneminin ve kullanımının yaygın olması nedeniyle çalışmamızda

Van soda gölünden izole edilen ve mezofil ortamda üreyebilen Bacillus sp. suşları

izole edilerek analizleri gerçekleştirilmiştir.

Çalışmalarımızda Van soda gölünden izole edilen doğal Bacillus sp. AB-17,

Bacillus sp. C-14 ve Ardıçlı Köyü/Tarsus’tan izolasyonu gerçekleştirilerek Bacillus

sp. X-13 şeklinde adlandırılan amilaz, selülaz ve ksilanaz enzimi üretme yeteneğine

sahip üç bakteri suşu kullanılmıştır. Organizmalar, ilk izolasyon aşaması

gerçekleştirildikten sonra saf kültür ve biyokimyasal analizler yapılarak Bacillus sp.

şeklinde adlandırılmışlardır.

Seçilen suşlar, geniş, beyaz renkli ve dalgalı kenarlı koloni morfolojisine

sahiptirler. Suşlar gram pozitif, aerob, spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli

bakterilerdir. Glikoz, ksiloz ve mannitolü asit oluşturarak parçalamakta ve katalaz

pozitif özellik göstermektedirler. Koloni morfolojileri ve diğer özelliklerine göre

seçilen suşlar Bacillus sp. şeklinde tanımlanmışlardır.

Tanımlama çalışmalarından sonra her üç suş için birinci aşamada, içerisinde

uygun substrat bulunan katı besiyerleri kullanılarak farklı sıcaklık ve pH değerlerinde

üreme ve enzim sentezleme özelliklerinin saptanması için analizler yapılmıştır.

Bacillus sp. AB-17 suşu pH:7.0-12.5 arasında üreme göstermekle birlikte pH

9.0-10.0 aralığında optimum değer elde edilmiştir. Analiz edilen pH değerlerinden

7.0-12.0 aralığında enzim sentezi gerçekleştiği bulunmuştur. Özellikle pH 7.5-10.0

aralığında 14 mm’lik aktivite zon çapına ulaşılırken, optimum sentez (18 mm aktivite

zon çapı ile) pH 9.5 de gözlenmiştir. Horikoshi (1999), pH 8.5’in üzerinde bakteri

üremesi ve enzim sentezinin gerçekleşmesinin alkali organizmaların en büyük

özellikleri olduğunu bildirmiştir.

Bacillus sp.AB-17 suşu 4 mm’lik koloni çapı ile 25 ve 37 oC arasında optimum

üreme gösterirken, sadece 25 ve 37 oC’lerde aktivite zonu saptanmıştır. Optimum zon

oluşumu ise 17 mm ile 37 oC de gerçekleşmiştir.

Bacillus sp AB-17 suşu %3-%15 aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında üreme

gösterirken, %20 NaCl’lü ortamda üreme saptanmamıştır. Optimum üreme 4 mm

koloni çapı ile %10 NaCl’lü ortamda gerçekleşmiştir. Optimum enzim üretimi 18 mm


138

zon çapı ile %7’lik NaCl’lü ortamda görülürken, %3, %5 ve %7 NaCl içeren

ortamlarda 14 mm, %13 NaCl’lü ortamda ise 6 mm zon çapı elde edilmiştir.

Bacillus sp AB-17 suşu ie katı besiyeri çalışmalarından elde edilen bu

sonuçlar, bakteri suşunun mezofil, orta düzeyde halofil ve alkali özellik gösterdiğini

kanıtlamaktadır.

Bacillus sp. C-14 suşunun pH 6.5-12.0 aralığında ürediği, optimum üremenin

16 mm ile pH 8.5 de gerçekleştiği bulunmuştur. Enzim sentezi pH 7.0-11.5

aralığında gerçekleşirken 16-7 mm arasında zon çapı elde edilmiştir. Optimum

aktivite zonu ise 24 mm ile pH 8.5 ve 9.5’te gerçekleşirken, pH 7.5-9.5 aralığında ise

ortalama 23 mm aktivite zonu gözlenmiştir.

Bacillus sp. C-14 suşu, test edilen sıcaklık aralıklarında (25-50ºC aralığında)

9-6 mm koloni çapı oluşturarak üremiştir. Bacillus sp. C-14 suşunun optimum

üremesi 10 mm koloni çapı ile 37ºC de gerçekleşirken, 25ºC de 9 mm, 45ºC de ise 8

mm’lik koloni oluşumu saptanmıştır. Aynı sıcaklık değerlerinin kullanıldığı enzim

sentezleme çalışmalarında optimum sentezin 22 mm aktivite zonu ile 37ºC de

gerçekleştiği saptanmıştır. Bacillus sp. C-14 suşu, optimum üreme ve enzim

sentezleme yeteneği dikkate alındığında mezofil ve alkalin özellik göstermektedir.

Bununla birlikte, suşun 25ºC de 9 mm çapında koloni ve 11 mm aktivite zonu,

55ºC de ise 6 mm çapında koloni ve 9 mm aktivite zonu oluşturması, suşun

psikrotolerant-termotolerant aralığında yüksek düzeyde üreme ve enzim sentezleme

yeteneğinde olduğunu göstermektedir. Bacillus sp. C-14 suşu %3-%13 NaCl içeren

katı besiyerinde 9-1 mm çaplı koloni oluşturacak şekilde üremiştir. Konsantrasyon

arttıkça koloni çapında azalma meydana gelmiştir. NaCl konsantrasyonu %15-20

düzeylerine çıkarıldığında her hangi bir üreme gözlenmemiştir.

Maksimum koloni oluşumu 9 mm ile %3’lük konsantrasyonda gerçekleşirken

%10 NaCl içeren ortamda koloni çapı 5 mm olarak ölçülmüştür. Optimum enzim

sentezi 12 mm ile %5-7 konsantrasyonda gözlenirken, %3’de 11 mm %10’da ise 10

mm aktivite zonu elde edilmiştir. Bu sonuçlar C-14 suşunun halofil özellikte

olduğunu göstermektedir. Literatür bilgilerinde %3-15 NaCl içeren ortamlarda

üreyen organizmaların orta düzeyde halofil özelliğe sahip olduklarını belirtilmektedir

(Ventosa ve ark, 1998).


139

Bacillus sp. X-13 suşu pH 6.0-11.0 arasında üreme gösterirmiş pH 6.0-7.0

değerleri arasında 10 mm’lik koloni çapına ulaşılmıştır. Aynı koşullarda

gerçekleştirilen enzim sentezi analizlerinde, pH 6.0-7.0 aralığında 25 mm, pH 8.0-9.0

aralığında ortalama 22 mm ve pH 10.0-11.0 aralığında ortalama 17 mm aktivite zonu

elde edilmiştir.

Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 suşunun oldukça aktif bir enzim üreticisi olup,

pH 11.0 de elde edile aktivite zon çapının, koloni çapının dört katına ulaştığı

bulunmuştur. Üreme ve enzim sentezleme özelliği suşun çok geniş pH aralığında

aktif olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, pH 6.0-7.0 aralığında zon çapının

25 mm’ye ulaşması, suşun asidik aralıkta daha iyi çalıştığını göstermektedir.

Bacillus sp. X-13 suşu inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık

değerlerinde 20ºC (4 mm) ve 60ºC (2 mm) üreme göstermiştir. Bakteri suşu, 20-

40ºC’lik inkübasyon aralığında ortalama 22 mm aktivite zonu oluşturmuştur. Bütün

sıcaklık değerleri dikkate alındığında en yüksek enzim üretiminin 25 mm’lik zon

çapı ile 40ºC de gerçekleştiği görülmektedir. Diğer taraftan 20ºC de 24 mm, 40ºC de

25 ve 60ºC’de 16 mm (koloni çapının 8 katı) aktivite zon çapı elde edilmesi suşun

psikrofil-termofil aralığında çok yüksek aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir.

Çalışmanın ikinci aşamasında sıvı besiyerinde enzim üretimi, kısmi

saflaştırma ve karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Suşlar sıra ile

incelendiği zaman;

Bacillus sp. AB-17 suşunun optimum aktivitesini pH 10.5’ de gösterdiği

bulunmuştur. Enzim pH 6.5 de %81, 7.5’de %82, 8.5’de %84, 9.5’de %84 aktivite

göstermiştir. Analizler sonunda pH 6.5-9.5 aralığında ortalama %83 aktivite elde

edilmiştir. Enzim aktivitesi pH 11.5-12.5 aralığında hızla düşerek ortalama %62.5’e

gerilemiştir. Analiz edilen bütün pH değerlerinde ortalama %79.4 düzeyinde,

oldukça stabil bir aktivitenin gerçekleştiği görülmektedir (Şekil 4.2).

Horikoshi, izole ettiği alkalin amilaz enziminin pH 10.0-10.5 aralığında

çok aktif olduğunu, pH 9.0-11.5 aralığında ise yaklaşık %50 aktivite gösterdiğini

belirtmiştir (Horikoshi, 1999).

McTigue ve ark. Bacillus halodurans A-59 (ATCC 21591), Bacillus sp.

NCIB 11203 suşu ve Bacillus sp. IMD370 suşlarının üçünden de amilaz enzimi


140

izolasyonu gerçekleştirmişler ve optimum aktivite görülen pH değerinin 10.0

olduğunu belirtmişlerdir (McTigue ve ark, 1995). Bacillus sp. ANT-6 amilaz

enziminin optimum aktivitesini 10.5 de gösterdiğini pH 9.5-13 aralığında ise

yüksek düzeyde aktiviteye sahip olduğunu belirtmişlerdir (Burhan ve ark, 2003).

Termofil Bacillus sp. A3-15 suşundan izole edilen amilaz enziminin

optimum aktivitesini pH 11.0 de gösterdiği, özellikle pH 10.0-11.5 aralığında

%95 aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır (Arikan, 2007). Termofil ve halofil

Bacilus sp. SB-28 suşundan izole edlen amilaz enziminin optimum aktivitesini pH

12.5 de gösterdiği, pH 8.5-12.0 aralığında ise ortalama %86.25 aktiviteye sahip

olduğu bulunmuştur (Tatar, 2007).

Bacillus halodurans A-59 suşundan izole edien amilaz enzimi pH 10.0’da

optimum enzim aktivitesi göstermiştir (Horikoshi, 1999). Diğer yandan, Bacillus

sp. PN5 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise optimum pH 10.0 da aktivite

gösterdiği belirtilmektedir (Saxena ve ark, 2007). Bu sonuçlar AB-17 amilaz

enziminin alkalin özellikte olduğunu kanıtlamaktadır.

Enzim pH 10-12 aralığında stabil bir aktivite göstermiş, kalan enzim

aktivitesi ortalama %54.3 olarak gerçekleşmiştir. pH 9-12 aralığında elde edilen

stabilite değeri ise ortalama %53.2 olarak bulunmuştur. Bütün pH değerlerinde 24

saatlik inkübasyon sonunda enzim stabilitesi ortalama %55 düzeyinde

gerçekleşmiştir. Bu sonuçlar enzimin pH stabil olduğunu kanıtlamaktadır.

Alkalin termofil Bacillus sp. A3-15 suşuna ait amilaz enzimiyle yapılan pH

stabilitesi çalışmalarında enzim, 60˚C de ve pH 10.0-11.0 aralığında 24 saat

inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %70 koruduğu bulunmuştur (Arikan,

2007). Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen amilaz enziminin ise pH 10.0-

12.0 aralığında 55˚C de 72 saat inkübe edildiği zaman aktivitesini yaklaşık %54

koruduğu bulunmuştur (Tatar, 2007).

Bacillus subtilis’ten elde edilen alfa amilaz enziminin 24 saatlik inkübasyon

sonunda aktivitesini pH 7.0’de %80 korurken, pH 10.0’da aktivitenin %40’a

düştüğü bulunmuştur (Lin ve ark, 1998).

Bacillus sp AB–17 amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık

değeri 150ºC olarak bulunmuştur. AB-17 amilaz enzimi 50–130ºC aralığında


141

inkübe edildiğinde enzim aktivitesinde tam bir stabilite görülmüş ve ortalama

%27,3’lük aktivite elde edilmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 140ºC’ye yükseltildiği

zaman, enzim aktivitesi %81değerine ulaşarak çok hızlı bir artış gerçekleşmiştir.

Optimum aktivite 150ºC’de (%100) elde edilirken, sıcaklık 160ºC’ye yükseltildiği

zaman enzim aktivitesinin %82’ye düştüğü bulunmuştur.

En yüksek aktivitenin gerçekleştiği 140–160ºC aralığında elde edilen

ortalama aktivite değeri %87.6’dır. Bu aralıktaki aktivite artışının 30–130ºC

aralığı ile karşılaştırıldığı zaman yaklaşık %337 olduğu görülmektedir (Şekil. 4.3).

Konsoula ve Kyriakides, Bacillus sp. suşundan izole ettikleri amilaz

enziminin optimum aktivitesini 135˚C de gösterdiğini belirtmişler, 160˚C de ise

yaklaşık %70 aktivite saptamışlardır (Konsoula ve Kyriakides, 2004). Tatar,

Termofil alkalin-halofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole ettiği amilaz enziminde

optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklığı 140 ˚C olarak bulmuştur. Tatar, amilaz

enziminin optimum aktivitesini 140˚C de göstermekle birlikte 130˚C de %91,

150˚C de %93 ve 160˚C de %86.5 aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur (Tatar,

2007).

Literatürde bu güne kadar en yüksek optimum aktivite sıcaklığının 135˚C

olduğu ve 160˚C de yaklaşık %70 aktivite elde edildiği belirtilmektedir (Konsoula

ve Kyriakides, 2004). Bir başka literatürde ise gelecek on yılda 150˚C civarında

aktivite gösteren enzimin bulunamayacağı iddia edilmektedir (Daniel ve ark,

1996). Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminde, optimum aktivitenin 150˚C de

gerçekleşmesi, bu güne kadar elde edilen en yüksek aktivite sıcaklığı değeri olup,

literatür verilerini değiştirecek özelliktedir. Bu özelliği ile AB-17 amilaz enzimi,

mikrobiyal enzim literatürleri arasında en üst noktaya yerleşecek, ultra-termofil

alkalin özellikte bir enzimdir.

AB-17 amilaz enzimi 30-160ºC arasında orijinal aktivitesini yaklaşık %51

oranında korumuştur. Bununla birlikte 150ºC de diğer sıcaklıklara göre daha

yüksek bir stabilite gerçekleşmiştir (%53). Goyal ve ark (2005), Bacillus sp. I-3

suşundan izole edilen termostabil amilaz enziminin 70ºC de 3.5 saat

inkübasyondan sonra orijinal aktivitenin 2.5 saatlik inkübasyon sonunda ve

80ºC’de %90 korunduğunu bulmuşlardır. Araştırmacılar aynı enzimi 30 dakika


142

süreyle 90 ve 100ºC de ön inkübasyon bıraktıkları zaman orijinal aktivitenin %59

ve %26’ya düştüğünü saptamışlardır. Literatür verileri dikkate alındığı zaman AB-

17 amilaz enziminin yüksek düzeyde olmamakla birlikte 30-160ºC arasında

oldukça stabil (Şekil 4.5) aktivite gösterdiği bulunmuştur (150ºC de %53).

Bacillus sp. AB-17 amilaz enzimi en yüksek aktiviteyi %68.4 ile %3’lük

NaCl konsantrasyonunda göstermiştir. %5-15 aralığındaki konsantrasyonlarda

kalan enzim aktivitesi ortalama %67 düzeyinde gerçekleşmiştir. Enzim 0.5-3.4M

aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında ortalama %67 ile stabil bir aktivite

göstermiştir. Bu sonuçlar, enzimin halofil olduğunu göstermektedir.

Wainø ve Ingvorsen (2003), β-ksilanaz enziminin %5-%15 NaCl

konsantrasyonlarında optimum aktivite gösterdiğini, 24 saat üreyle %20 NaCl

içerisinde bırakılan enzimin aktivitesini %55 oranında koruduğunu saptamışlardır.

Haloferax mediterranei suşundan izole edilen amilaz enziminin 2-4M aralığındaki

NaCl konsantrasyonunda aktif ve stabil olduğunu, optimum aktivitenin ise 3M

konsantrasyonda elde edildiğini bulmuşlardır (Pomares ve ark, 2003).

Metal iyonları arasında en yüksek inhibisyon %41 ile ZnCl2 de saptanırken,

en düşük inhibisyon %22 ile NaCl de elde edilmiştir. Enzimin özellikle ZnCl2 ile

önemli düzeyde inhibe olması temostabilitesinin yüksek olmadığını fakat termofil

özellikte olduğunu göstermektedir.

Deterjanlar arasında en yüksek inhibisyon oranı ortalama %32 ile β-

Merkaptoetanol ile elde edilirken, SDS de %31 ve Triton X-100 de %28

inhibisyon saptanmıştır. Her üç deterjandaki inhibisyon ortalama %30.3

düzeyindedir. Bir başka ifade ile AB-17 amilaz enzimi deterjanlara ortalama %70

dirençlilik göstermişlerdir.

Bacillus halodurans LBK 34’den izolasyonunu yaptıkları alfa amilazda

orijinal aktivitenin 5mM CaCl2 ile %59 1 mM EDTA ile %58 oranında

korunduğunu bulmuşlardır (Hashim ve ark, 2005). Berhardsdotter ve ark (2005)

ise, alkalin-şelatör dirençli amilaz enziminde orijinal aktivitenin 5 mM CaCl2 ile

%34, ZnCl2 ile %30.6 koruduğunu bulmuşlardır.

AB-17 amilaz enzimi, PMSF’ye ise %70.52 direnç göstermiştir. Bu sonuç

enzimin düşük düzeyde serin amino asitleri içerdiğini göstermektedir. Szilagyi ve


143

Zavodszky (2000), Termofilik proteinlerde serin amino asitlerinin düşük düzeyde

bulunduğunu belirtmiştir.

Bacillus sp. AB-17 enzimi 8M üre ile tamamen (yaklaşık %97.8) EDTA ile

önemli düzeyde (%30.79) inhibe olmuştur. Bu sonuçlar enzimin alkalin, halofil ve

metalloenzim özellikte olduğununu göstermektedir.

Horikoshi (1999) ile Hutcheon ve ark (2005), amilaz enziminin 8M üre ile

tamamen inhibe olmasının alkalofil ve halofil özelliğin göstergesi olduğunu

belirtmektedirler.

AB-17 amilaz enziminin orijinal aktivitesi 5 M ZnCl2 ile yaklaşık %40.8

oranında kaybolmuştur. Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin ZnCl2 ile yapılan

inaktivasyon çalışması sonucunda orijinal aktivitenin %63 oranında korunduğunu

belirtmişler ve bunun termostabilitenin göstergesi olduğunu bildirmişlerdir

(Burhan ve ark, 2003). Termophilik Bacillus sp. TS–23 suşuna ait amilaz enzimi 5

mM ZnCl2 ile %40 oranında inhibe olmuştur (Lin ve ark, 1998).

Halofil alkalin termofil Bacillus sp. SB-28 suşundan izole edilen ve optimum

aktivitesini 140˚C de gösteren amilaz enziminin 55˚C, 30 dakika süreyle aktivitesini

%1 SDS de %71, β-Merkaptoetanol de %81, triton X-100 de %82, 8 M ürede %11,

3 mM PMSF de %74, 5 mM CaCl2 de %70, ZnCl2 de %68 koruduğu

belirtilmektedir (Tatar, 2007).

Saxena ve ark (2006), Bacillus sp. PN5 suşundan üretilen termostabil alkalin

amilaz enziminin 5 M SDS ile 1 saat inkübe edildiği zaman aktivitesini %70

koruduğunu bulmuşlardır. Bu sonuçlar Bacillus sp.AB-17 amilaz enziminin

ekstremtermofil, alkali, termostabil, deterjan stabil ve halofil olduğunun

göstergesidir.

AB-17 amilaz enziminin SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlıkları 66.25

ve 58 kDa olan iki farklı protein bandı elde edilmiştir. Bu sonuç enzimin

moleküler ağırlıkları farklı iki alt birimden oluştuğunu göstermektedir. Literatürde

amilaz enzimleri ile yapılan SDS-PAGE çalışmalarında moleküler ağırlıkların 51

kDa.ve 70 kDa arasında değiştiğine ait çok sayıda bulgu vardır (Horikoshi, 1971;

Igarashi ve ark, 1998; Hamilton ve ark, 1999; Ben ve ark, 2001;Bernhardsdotter

ve ark, 2007).


144

İnce tabaka kromatografi analizi sonucunda AB-17 amilaz enziminin

nişastayı parçalaması sonucu maltoz ve diğer oligosakkaritlerin meydana geldiği

bulunmuştur. Lee ve ark (1994)’nın termofilik alkalifilik Bacillus sp.XAL601

suşundan ürettikleri α-amilaz enziminin nişastayı hidrolizi sonucu maltoz ve uzun

zincirli oligosakkaritlerin oluştuğu, buna karşılık glikoz üretilmediğini

belirtmişlerdir. AB-17 amilaz enzimine ait ince tabaka kromatografisi sonuçları

enzimin, alfa amilaz olduğunu ve ticari alanda kullanılabilecek özellik taşıdığını

göstermektedir.

Bacillus sp. C-14 suşundan elde edilen endoglukanaz enzimi optimum

aktivitesini pH değeri 11.0 de göstermektedir. pH 9.0-11.0 aralığında yapılan

çalışmalarda, aktivitenin ortalama %98 değerine ulaştığı bulunmuştur. Elde edilen

sonuçlar enzimin, özellikle pH 9.0-11.0 aralığında çok yüksek bir aktiviteye sahip

olduğunu göstermektedir. Bütün pH değerlerinde yüksek aktivite elde edilmesi (pH

6.0 da %81, pH 12.0 de %12) enzimin aktivite pH aralığının son derece geniş

olduğunu göstermektedir (Şekil 4.10).

Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans suşundan optimum enzimatik

aktivitesini pH 8.5 de gösteren endoglukanaz enzimi izole etmişlerdir. Hakamada ve

ark (1997), alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan optimum aktivite pH’sı 8.6-

9.0, Bacillus sp.VG1 suşundan ise pH 9.0-10.0 olan endoglukanaz izolasyonu


Literatürlerde değişik Bacillus sp. izolatlarından optimum enzimatik

aktivitesini pH 10.0’da gösteren iki endoglukanaz enziminin izole edildiği

belirtilmektedir (Endo ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005).

Bacillus sp.C-14 endoglukanaz enziminin pH 9.0 da orijinal aktivitesinin %68

düzeyinde korunduğu saptanmıştır. Bütün pH değerleri incelendiği zaman (pH 7.0-

12.0 aralığında) orijinal aktivitenin ortalama %64.5 oranında devam ettiği

saptanmıştır.

İzole edilen endoglukanaz enzimin optimum aktivitesinin pH 6.0-8.0

aralığında gerçekleştiği saptanmıştır. Enzim pH 5.0 de ve 50ºC’de 1 saat inkübe

edildiğinde orijinal aktivitenin %100 korunduğu, pH 6.0 da ise aktivitenin %55’e

düştüğü gözlenmiştir (George ve ark, 2001).


145

Alkalifilik Bacillus sp.KSM-S237 suşundan izole edilen alkalin selülaz

enziminin pH 5.0-11.0 aralığındaki taponlarda 30 dakika süreyle 30ºC de inkübe

edildiği zaman orijinal aktivitesini ortalama %80 oranında koruduğu bulunmuştur


Bacillus sp.HSH-810 suşundan izole edilen alkalin selülaz enzimi optimum

aktivitesini pH 10.0 göstermektedir. Enzim pH 7.0-9.0 aralığında ve 50ºC 10 dakika

inkübe edildiğinde aktivitenin yaklaşık %10 kaybolduğu saptanmıştır (Kim ve ark,

2005). Enzim, bu özellikleri ile (özellikle pH 9.0 ve 10.0 aralığında) yüksek düzeyde

pH stabilitesi göstermektedir (Şekil 4.12)

Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin optimum 50°C de aktivite gösterdiği

saptanmıştır. Bununla birlikte enzim 20-80°C aralığında yaklaşık %85 aktiviteye

sahiptir (Şekil 4.11). C-14 endoglukanaz enzimin en yüksek aktivite gösterdiği

sıcaklık aralığı %90 ile 40-60°C’ler arasıdır. İnkübasyon sıcaklığı 80°C olduğunda

%71, 100°C’de ise %64 aktivite elde edilmiştir. Alkali pH değerinde aktivite

gösteren endoglukanaz enzimleri arasında optimum aktivite sıcaklığı 65ºC olan

enzim termofil olarak tanımlamıştır (Singh ve ark, 2001). Bir çok araştırmacı alkali

pH değerinde aktivite gösteren enzimlerin optimum aktivite gösterdikleri sıcaklık

aralığınn 50-55ºC olduğunu belirtmişlerdir (Hakamada ve ark, 1997 ve 2002; Endo

ve ark, 2001; Kim ve ark, 2005).

Literatür verileriyle karşılaştırıldığı zaman C-14 endoglukanaz enzimi

termotolerant özelliktedir (şekil 4.11).

Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzimi 20-60ºC’lik sıcaklık değerlerinde

orijinal aktivitesini 15 dakika sonunda ortalama %90, 30 dakika sonunda %77 ve 60

dakika sonunda %54 oranında koruduğu saptanmıştır. İnkübasyon sıcaklığı 70ºC ye

yükseltildiğinde kalan aktivite değeri 15 dakika %62, 30 dakika %51 olarak

gerçekleşirken, 60 dakika sonunda bu değer %10 düzeyine düşmüştür (Şekil 4.13).

Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz enzimi, 70ºC’ye kadar ısısal

uygulamaların gerçekleştirildiği çalışmalarda 15 ve 60 dakika süreyle başarıyla

kullanılabilme özelliği göstermektedir.

Optimum sıcaklığı 50oC olan Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilen ve

optimum aktivite sıcaklığı 50ºC olan endoglukanaz enziminin 10 dakikalık


146

inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini 20ºC’de tamamen koruduğunu, 40ºC’de

aktivitenin %90’a, 50ºC’de %50’ye 100ºC’de ise %30’a düştüğü bulunmuştur


Bacillus circulans suşundan üretilen ve optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan

alkalin endoglukanaz enziminin, 15 dakikalık ön inkübasyon sonunda, orijinal

aktivitesini 55ºC de %100 koruduğu 60ºC de ise aktivitenin %50’ye düştüğü,

sıcaklığın 65ºC ‘ye yükselilmesiyle aktivitenin tamamen kaybolduğu saptanmıştır


Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzimi, ön inkübasyon sıcaklığı 20-60ºC olarak

seçildiği zaman, orijinal aktivitesini 15 dakikada ortalama %90, 30 dakikada %77 ve

60 dakikada %54 koruduğu saptanmıştır. Bu sonuçlara göre C-14 endoglukanaz

enzimi literatür verilerinden daha yüksek termal stabiliteye sahiptir.

Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzim aktivitesi kullanılan bütün NaCl

konsantrasyonlarında aktiviteyi artırmıştır. En yüksek aktivite %133 ile %20 tuz

konsantrasyonunda elde edilirken, %12.5-25 aralığındaki aktivite artışı ortalama

%128 olarak gerçekleşmiştir. NaCl konsantrasyonu %30 düzeyine çıkartıldığında ise

aktivite %95 düzeyine düşmüştür. Optimum enzim aktivitesinin %20 (3.4M) tuz

konsantrasyonunda elde edilmesi, enzim aktivitesinin yüksek NaCl

konsantrasyonlarında uyarıldığını ve enzimin halofil karakterde olduğunun kanıtıdır

(Şekil 4.14).

Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enzimi ile %3-7 NaCl içeren ortamda 1 saat

sonunda %70, 6 saat sonunda %60 oranında aktivitesini korumuştur. NaCl

konsantrasyonu %10-15 kullanıldığında kalan enzim aktivitesi 1 saat sonunda %77, 6

saat sonunda %71.5 olarak gerçekleşmiştir. NaCl konsantrasyonu %20’ye

yükseltildiği zaman, kalan enzim aktivitesinde önemli düzeyde artış gerçekleştiği

saptanmıştır. Bu konsantrasyonda 1 saat sonunda %88, 6 saat sonunda %75 aktivite

değeri elde edilmiştir. NaCl konsantrasyonu %25’e yükseltildiğinde kalan aktivitenin

1 saat sonunda %73, 6 saat sonunda %63’e düştüğü bulunmuştur.

Rekombinant endoglukanaz enziminin Cel5A ile yapılan çalışmalarda enzimin

20 saatlik inkübasyon sonunda (3 M NaCl) orijinal aktivitesini %87 koruduğu

bulunmuştur (Voget ve ark, 2006). Egl-AG endoglukanaz enziminde ise


147

konsantrasyondaki artışla birlikte aktivitenin arttığı saptanmışlardır (Hirasawa ve ark,

2006). İzolasyonunu geçekleştirdiğimiz C-14 endoglukanaz enziminin NaCl ile

gösterdiği reaksiyon sonuçları literatür verileri ile tam bir uyum içindedir. Bu

sonuçlar ışığında, C-14 endoglukanaz enzimini ekstrem halofil ve halostabil şeklinde

tanımlamak mümkündür.

Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin SDS’ye %81 dirençli olduğu

bulunmuştur. Huang ve Monk (2004), yaptıkları çalışmada endoglukanaz enziminin

SDS’ye %91.5, β-Merkaptoetanol’e ise %88.7 dirençli olduğu bulunmuştur. CaCl2

ve Na2SO3 ile aktivitede önemli artışlar saptanmış, artış oranı CaCl2 de %132,

Na2SO3 ise %102 düzeyinde gerçekleşmiştir. Metal iyonları ile yapılan analizlerde

kalan enzim aktivitesi 5 mM ZnCl2 de %77, KCl de ise %40.33 olarak

gerçekleşmiştir.

C-14 endoglukanaz enziminde 5 mM EDTA ile %7, PMSF ile %57 oranında

inhibisyon gerçekleşmiştir. Üre ile yapılan analizlerde (8M) enzim aktivitesindeki

inhibisyon düzeyi yaklaşık %58 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.10).

Literatürde Zn+ ve K+ gibi metal iyonlarının enzim aktivitesini değişik

oranlarda (sırasıyla %23 ve %60) inhibe ettiği belirtilmektedir (Murashima ve ark,

2002). Halofilik enzimlerin büyük çoğunluğunun 2M’dan daha düşük KCl

konsantrasyonlarında bile orijinal aktivitelerinin inhibe olduğu, aktivitedeki düşüş

oranının halofilik düzeyinin göstergesi olarak ifade edildiği belirtilmektedir (Madern

ve ark, 2000). C-14 endoglukanaz enziminin KCl sonuçları, enzimin halofil özellikte

olduğunu kanıtlamaktadır.

Literatür bulgularında EDTA ile gerçekleştirilen aktivite çalışmalarında kalan

enzim aktivitesinin %90-%95 aralığında gerçekleştiği belirtilmiştir (Singh ve ark,

2001; Li ve ark, 2006; Huang ve Monk, 2004). C-14 endoglukanaz enzimi 5mM

EDTA ile muamele edildiği zaman kalan enzim aktivitesi %93 bulunmuştur. Bu

sonuç literatür verileri ile tam bir uyum göstermektedir Bacillus sp. C-14

endoglukanaz enziminde, SDS-PAGE elektroforez analizi sonunda 61 kDa ağırlığa

sahip tek bir protein bandı elde edilmiştir (Şekil 4.16).

Termoasidofilik endoglukanaz (Ba-EGA) enzimi ile yapılan çalışmalarda

enzimin 67 kDa moleküler ağırlıkta tek bir protein bandından meydana geldiği


148

belirtilmiştir (Li ve ark, 2006). Diğer taraftan bir çok araştırmada endoglukanaz

enzimlerinin 35-85 kDa arasında moleküler büyüklüğe sahip oldukları belirtilmiştir

(Voget ve ark, 2006; Zvereva ve ark, 2006; Kim ve ark, 2005; Zhang ve ark, 2007).

Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin 1 saat’lik inkübasyon sonunda

CMC’yi maltoz, sellobioz, sellotrioz ve sellotetroz gibi diğer uzun zincirli

oligosakkaritlere hidroliz ettiği, fakat glikoza dönüştürmediği saptanmıştır.

Termofilik Rhodothermus marinus’dan izole edilen endoglukanaz enzimi ile

CMC’nin hidrolizi sonucu ortaya çıkan ürünlerin glikoz, sellobiyoz, sellotrioz,

sellotetraoz ve sellopentaoz olduğu bulunmuştur (Hreggvidsson ve ark, 1996). Başka

bir araştırmada ise halotolerant selülaz enziminin CMC’yi hidrolizi sonunda

sellobioz, sellotrioz, sellotetraoz ve diğer sellooligosakkaritlere dönüştürdüğü

saptanmıştır (Voget ve ark, 2006).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin pH analizlerinin alt sınırı diğer

enzimlerden farklı olarak 4.0’ten başlatılmış ve analizler pH 4.0-12.0 aralığında

gerçekleştirilmiştir.

Enzim optimum aktivitesini pH 6.0 da gösterirken, pH 5.0 te %97 aktivite

gerçekleşmiştir. Asidik pH aralığında (4.0-7.0) ortalama enzim aktivitesi %90.25

olarak bulunmuştur. Alkali pH koşullarında enzim, aktivitesini tamamen kaybederek

pH 10.0 da %26, pH 11.0 de %8 aktivite saptanırken, pH 12.0 de aktivite tamamen

kaybolmuştur (Şekil 4.19). Bu sonuçlar X-13 ksilanaz enziminin asidik özellikte


Sulfolobus solfataricus’tan izole edilen ksilanazın optimum aktivitesini pH 7.0,

Humicola insolens’ten izole edilen ksilanaz pH 6.0-6.5 ve Halorhabdus

utahensis’ten izole edilen ksilanaz pH 7.0’de gösterdiği saptanmıştır (Düsterhöft ve

ark, 1997; WainØ ve Ingvorsen, 2003 ;Cannio ve ark, 2004).

Yapılan analizlerde Penicilliun capsulatum’dan izole edilen ksilanaz enziminin

optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 3.8, Fusarium proliferatum ksilanazının

5.0-5.5 ve Aspergillus fumigatus ksilanazının 6.0-6.5 olduğu bulunmuştur (Ryan ve

ark, 2003; Saha ve ark, 2002; Anthony ve ark, 2003). Bu verilerin yanı sıra alkalifilik

Bacillus sp. suşundan izole edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesini pH 8.0 de

gösterdiği belirtilmiştir (Kumar ve ark, 2004).


149

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi 15 dakikalık ön inkübasyon uygulaması

sonucunda pH 3.0-10.0 aralığında orijinal aktivitesini ortalama %92 düzeyinde

korumuştur. Bununla birlikte, özellikle pH 5.0-6.0 aralığında aktivite %100, 3.0-4.0

aralığında yaklaşık %94.5 düzeyinde korunmuştur. pH 9.0 (%86) da kalan enzim

aktivitesinin pH 8.0’e göre arttığı (%84), pH 10.0 ise yeniden düştüğü saptanmıştır

(%84).

Bacillus sp. X-13 enzimi 30 dakikalık inkübasyon sonunda bütün pH değerleri

dikkate alındığında (pH 3.0-10.0) orijinal aktivitesini yaklaşık %71.5 korumuştur.

Ksilanaz enzimi pH 3.0-10.0 aralığındaki 24 saat inkübe edildiğinde orijinal

aktivitenin ortalama %44 düzeyinde korunduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar enzimin

özellikle asidik pH bölgesinde oldukça dirençli olduğunu, fakat inkübasyon süresinin

artışıyla birlikte stabilitenin azaldığını göstermektedir. Özellikle asidik pH değerleri

incelendiğinde 24 saat süreyle 40ºC de inkübasyon gerçekleştirildiği zaman, %50’nin

üzerinde stabilite saptanmıştır (Şekil 4.21).

Bacillus circulans’dan izole edilen ksilanaz A ve Ksilanaz B enzimlerine

50ºC’de ve pH 8.0’de 10 dakika süreyle ön inkübasyon uygulandığı zaman orijinal

aktivitenin %60-70 devam ettiğini belirtmişlerdir (Dhillon ve ark, 2000). Halofilik

bakterilerden elde edilen iki ekstrem halotolerant ksilanaz enzimlerinin pH 4-11

aralığında stabil oldukları belirtilmiştir (Wejse ve ark, 2003).

B. amyloliquefaciens suşundan izole edilen ksilanaz enziminin orijinal

aktivitesini pH 9.0’da %71, pH 10.0’da ise %43 oranında devam ettirdiğini

bulmuşlardır (Breccia ve ark, 1998).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık

40ºC bulunmuştur. Enzim aktivitesi 20ºC de %19, 30ºC %67 iken 50-60ºC arasında

ortalama %8.5 düzeyinde gerçekleşmiştir. İnkübasyon sıcaklığının yükseltilmesiyle

birlikte aktivite düşmüş ve 100ºC de yaklaşık %42 düzeyine gerilemiştir. Aktivitede

bu denli yüksek farklılık olmakla birlikte 30-70ºC aralığında ortalama %79’luk

aktivite elde edilmesi, enzimin mezofil-termotolarant aralığında aktif olduğunu

göstermektedir.


150

Literatürde halofilik bakterilerden elde edilen ksilanazlarda gözlenen

optimum aktivite sıcaklığının 55-90ºC arasında değiştiği belirtilmektedir (Cannio ve

ark, 2004).

Bacillus sp suşlarında ise daha düşük aktivite sıcaklıkları bulunmuş olup, bir

çok araştırmacının çalışmalarında optimum aktivitenin 50ºC de gözlendiği

saptanmıştır (Lama ve ark, 2004; Poorna ve Prema, 2006). Pham ve ark (1998), ise

analizini geçekleştirdikleri ksilanaz enziminin en iyi aktiviteyi 40ºC de gösterdiğini

bulmuşlardır. Bu sonuçlar, X-13 ksilanaz enzimine ait sonuçlarla tam bir uyum

göstermektedir.

Termal stabilite çalışmalarında 20-40ºC’lik sıcaklık aralığında 15 dakika

sonunda elde edilen ortalama aktivite %78 iken, 50-90ºC aralığında ortalama %32

düzeyinde gerçekleşmiştir. İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak uygulandığı

çalışmalarda, 20-40ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde kalan aktivite ortalama %70,

50-90ºC aralığındaki %26 olarak bulunmuştur (Şekil 4.22).

Yapılan çalışmalarda ksilanaz enzimlerinin çok farklı termal stabilite profilleri

gösterdikleri bulunmuştur. Bacillus amyloliquefaciens’den izole edilen ksilanaz

enzmi 60ºC de 15 dakika inkübe edildiği zaman, orijinal aktivitesini %100 korurken,

inkübasyon sıcaklığı 65-70ºC’ye yükseltildiğinde aktivitenin %50’nin altına düştüğü

saptanmıştır (Breccia ve ark,1998).

Sa-Pereira ve ark (2002), Bacillus subtilis’ten izole edilen ksilanaz enziminin

20 dakikalık inkübasyon sonunda 60ºC sıcaklığa kadar orijnal aktivitesin %60’ın

üzerinde koruduğunu, sıcaklığın yüksetilmesiyle birlikte aktivitenin %40’ların altına

düştüğünü bulmuşlardır.

Bacillus pumilus’a ait ksilanaz enziminin 40ºC ‘ye kadarki sıcaklıklarda

aktivitesini 1 saat süreyle koruduğu, 60ºC de ise aktivitenin %30 düzeyine düştüğü

bulunmuştur (Podorna ve Prema, 2006). Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 ksilanaz

enziminin optimum aktivite sıcaklığında termostabil olduğunu göstermektedir.

En yüksek kalan enzim aktivitesi değeri %97 ile %3 tuz konsantrasyonunda

gerçekleşirken, %3-7 aralığında ortalama %93.3 olarak saptanmıştır. Enzim %3-25

aralığındaki tuz konsantrasyonuna ortalama %89 direnç göstermiştir.


151

Ksilanaz enzimi %3-20 aralığındaki tuz konsantrasyonlarında 6 saat inkübe

edildiği zaman orijinal aktivitenin ortalama %74.3, %25’lik tuz konsantrasyonu ise

%64 düzeyinde devam ettiği bulunmuştur (Şekil 4.23). Her iki inkübasyon süresi

sonunda da ksilanaz enziminin %3-25 tuz konsantrasyonlarında %73’ün üzerinde

aktivite gösterdiği saptanmıştır.

Literatürde, β-ksilanaz enzimine ait orijinal aktivitenin %20 NaCl bulunan

ortamda 24 saatlik inkübasyon sonucunda yaklaşık %53’e düştüğü bulunmuştur

(WainØ ve Ingvorsen, 2003). Bir başka çalışmada, halofilik bakteriden izole edilen

ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin en yüksek aktiviteyi 1M NaCl

konsantrasyonunda, 50ºC ve pH 6.0’da gösterdiği saptanmıştır. Ksilanaz-1 enziminin

aktivitesi 1-2M NaCl aralığında %100’den %54’e hızlı bir düşüş göstermiştir. NaCl

konsantrasyonu 2’den 5 M’a yükseltildiğinde ksilanaz-2 enziminde aktivitenin

%31’e düştüğü saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003).

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzimi EDTA ile kısmen inaktive olurken, orijinal

enzim aktivitesi 15 dakika da yaklaşık %89, 60 dakikada %84 korunmuştur. Kalan

enzim aktivitesi (15 dakikalık uygulama sonunda) CaCl2 de %99, ZnCl2 de %94,

Na2SO3 de ise %92 düzeyinde geçekleşirken, 60 dakika sonunda CaCl2 de %86,

ZnCl2 de %82, Na2SO3 de ise %83 olarak bulunmuştur. En yüksek dirençlilik (60

dakika sonunda) %82 ile β-Merkaptoetanol’de gözlenirken bunu %80 ile triton X-

100 ve %62 ile SDS izlemiştir.

PMSF kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi 15 dakika %89, 60 dakika

%80 olarak bulunmuştur. Üre kullanılan çalışmalarda kalan enzim aktivitesi diğer

ajanlara göre daha fazla düşmüştür. Buna göre orijinal enzim aktivitesi 15 dakikada

%38, 60 dakikada %28 düzeyine düşmüştür (Çizelge 4.11).

Bir diğer çalışmada, halofil bakteriden elde edilen halotolerant ksilanaz-1

enziminin orijinal aktivitesini 1 mM SDS ile %60 koruduğu belirtilmektedir (Wejse

ve ark, 2003). ZnCl2 (1 mM) ile yapılan çalışmalarda ksilanaz-1 enziminde %57,

ksilanaz-2 enziminde %39 oranında inhibisyon gerçekleştiğini saptamışlardır (Wejse

ve ark, 2003). Halofil bakteriden elde edilen ksilanaz-1 enzimi 1 mM β-

Merkaptoetanol ile muamele edildiğinde enzim %95 direnç göstermiştir (Wejse ve

ark, 2003). Halotolerant ksilanaz enziminin orijinal aktivitesini 1 mM PMSF’de


152

%99, 10 mM’ da ise %76 koruduğu saptanmıştır. Üre ile yapılan analizlerde ise

orijinal aktivitenin 1mM’da %81 korunduğu bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003).

Zimogram analizi sonucunda Bacillus sp.X-13 ksilanaz enzimin, moleküler

ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört alt birimden meydana geldiği

saptanmıştır (Şekil 4.24).

Literatürde Penicillium capsulatum ve Fusarium proliferatum

organizmalarından izole edilen ksilanazlar enzimlerinin 22-22.4 kDa ağırlığa sahip

oldukları, buna karşılık Aspergillus fumigatus mantarından elde edilen enzimin

moleküler ağırlıkları 212-253 kDa arasında değişen 4 alt birimden meydana geldiği

bulunmuştur (Ryan ve ark, 2003; Saha, 2002).

Farklı Bacillus sp. izolatlarından moleküler ağırlıkları 24-45 kDa arasında

değişen ksilanaz enzimlerinin izole edildiği belirtilmiştir (Lama ve ark,2004).

Ekstrem halofilik archaeon Halorhabdus utahensis organizmasından izole

edilen β-ksilanaz enzimi 45 kDa, β-ksilosidaz enzimi ise 67 kDa moleküler ağırlığa

sahiptir (Waino ve Ingvorsen, 2003). Halophilik bakteriden izole edilen ekstrem

halotolerant ksilanaz-1 ve ksilanaz-2 enzimlerinin moleküler ağırlıkları sırası ile 43

ve 62 kDa olarak bulunmuştur (Wejse ve ark, 2003).

Bacillus sp. X-13 suşunun 1 saatlik inkübasyon uygulaması sonunda oalt spelt

ksilanı ksiloz ve çok sayıda uzun zincirli ksilooligosakkaritlere dönüştürdüğü

bulunmuştur.

Bacillus halodurans organizmasından elde edilen ksilanaz enzimi huş agacı

ksilanı ile inkübasyona bırakıldığında, 6 saat sonunda ksilobiyoz, 24 saat sonunda ise

çok az ksiloz açığa çıktığı saptanmıştır (Mamo ve ark, 2006). Halofilik bakteri

suşundan elde edilen halotolerant ksilanaz enzimlerinin ksilanı ksilobiyoz ve

ksilotrioza parçaladıkları saptanmıştır (Wejse ve ark, 2003).

Tanaka ve ark (2005), Penicillium citrinum ksilanazının huş ağacı ksilanını 1

saatlik inkübasyon sonunda çok az miktarda ksiloz ve diğer ksilo-oligosakkaritlere,

48 saatlik inkübasyon sonunda ise önemli miktarda ksilobiyoz, ksiloz ve diğer ksilo-

oligosakkaritlere hidroliz ettiğini bulunmuşlardır.

Enzimin hidroliz ürünleri dikkate alındığında, literatürde belirtilen farklı

organizmalara ait ksilanaz enzimlerinden daha yüksek aktiviteye sahip olduğu ve


153

ancak 48 saatik inkübasyon sonunda elde edilen ürünlerin, 1 saatlik sürede ortaya

çıktığı görülmektedir. Enzim, bu özellikleri ile özellikle besin endüstrisi alanında,

prebiyotiklerin üretiminde öncelikle kullanılabilecek özelliğe sahiptir.

Sonuç olarak;

1.Nişasta işletmelerinde birinci aşama olan jelatinleştirmenin 140-150°C de 5

dakika süreyle gerçekleştirilip, 100-105°C’ye soğutulduktan sonra ikinci ve en

önemli aşama olan sıvılaştırmanın 2 saat süreyle yapılması düşünüldüğünde,

soğutma işlemleri için çok önemli bir enerji kullanılması söz konusudur.

Diğer taraftan, bu konuda en fazla arzulanan durum jelatinleştirme (100-

110°C) ve sıvılaştırma (80-90°C) çalışmalarında çok yüksek sıcaklıklarda aktivite

gösteren α-amilaz enziminin bulunması ve kullanılmasıdır.

Oysa, 140-150°C-160°C de uzun süre aktif bir enzim kullanılsa soğutmaya

gerek kalmayacaktır. Dolayısı ile, soğutma için ekstra enerji kullanılmaması ve

moleküller arası bağların kopması sonucu enzimden daha yüksek verim alınacaktır

Optimum aktivitesini 150°C de gösteren, 30 dakika süreyle 150°C inkübe edildiği

zaman yaklaşık %53 kalan aktivite özelliği gösteren AB-17 amilaz enzimi nişastanın

hidrolizi çalışmalarında maliyeti düşürerek, yüksek düzeyde verim alınmasını

sağlayacaktır.

2. Amilaz enzimlerinin uygulama alanı oldukça geniş olup klinik, medikal,

analitik kimya, nişastanın şekerleştirilmesiyle ilgili bütün alanlar, tekstil, gıda,

fermentasyon, kağıt, biracılık ve damıtma uygulamaları sayılabilir. Bacillus sp. AB-

17 amilaz enzimi sahip olduğu üstün yetenekleri (optimum aktivitesini 150°C, pH

10.5 ve halofil koşullarda göstermesi, deterjanlara dirençli olması, 20-160°C

aralığında stabil olması gibi) nedeniyle bütün alanlar için oldukça uygundur.

Nişastanın parçalanması aşamasındaki ilk adım molekülün oligomaltodekstrinlere

dönüştürülmesidir. Özellikle nişastanın şekerleştirme ve sıvılaştırma işlemlerinin

uygulandığı 1. ve 2. basamaklarda bugüne kadar istenilip de gerçekleştirilemeyen

bütün görevleri (110°C’nin zerinde akivite) fazlasıyla yerine getirecek yetenektedir.

3.Tekstil endüstrisinde haşıllama işlemlerinde yoğun nişasta kullanımı söz

konusudur. Tekstil endüstrisi pH’nın yaklaşık 12, sıcaklığın en az 80°C olduğu


154

işletmelerdir. Nişastanın ortamdan uzaklaştırılmasında son yıllarda enzim kullanımı

önemli bir yer tutmaktadır. Bacillus sp. AB-17 amilaz enziminin alkalin, termofil,

termostabil ve halofil özelliği dikkate alındığında bu işletmeler için ideal bir enzim

olduğu görülmektedir.

4. Amilaz enzimlerinin en fazla kullanıldığı alanlardan bir diğeri deterjan

endüstrisidir. Özellikle alkalin, termostabil, halofil, SDS, triton X-100 ve β-

merkaptoetanol gibi deterjan ve yüzey aktif ajanlara dirençli özellik gösteren

enzimler, deterjan formülasyonunda öncelikli bir yere sahiptir. Bu açıdan Bacillus

sp. AB-17 amilaz enzimi, ideal endüstriyel enzim özelliğindedir.

5. Halofil organizmaların sentezlediği ürünler arasında bakteriorodopsin,

ektoin, amilaz, lipaz, sellülaz, proteaz, biyosürfaktanlar, lektinler ve biyoplastikler en

önemlileridir. Halotolerant ve halofilik organizmalar ve bulardan elde edilen

enzimler, biyoteknolojik uygulamalarda her geçen gün daha ön plana çıkmaktadırlar.

Bunlar arasında optik bilgisayarlar, optik hafızalar, biyoçipler, uzay çalışmalarındaki

ışık modülatörlerinin yapımı, yağların geri kazanılmalarında kullanılan biyopolimer

özelliğindeki biyosürfaktan üretimi, fermente gıdaların üretimi, organik kirliliklerin

temizlenmesi ve alternatif enerji üretim alanları sayılabilir. İzolasyonunu

gerçekleştirdiğimiz her üç enzimde halofil özellikte olup, özellikle alternatif enerji

üretim alanı için ideal özelliktedirler.

6. Geçen son 20 yıl içerisinde selülaz kullanımı özellikle tekstil, temizlik,

kağıt, içecek ve şarap endüstrisinde önemli düzeyde artış göstermiştir. Ayrıca

hayvan yemlerinin üretimi, tekstil ve temizlik endüstrisi, kağıt hamuru hazırlama

işletmeleri ile tarımsal uygulamalar endoglukanazların kullanım alanları arasındadır.

Günümüzde selülaz (enduglukanaz) enziminin dünya enzim ticaretindeki yeri

yaklaşık %20 düzeyindedir.

İzolasyonunu gerçekleştirdiğimiz Bacillus sp. C-14 endoglukanaz enziminin

optimum aktivitesinin pH 11.0 gerçekleşmesi, optimum aktivite sıcaklığının 50°C de

olması, halofil koşullarda özellik yüksek düzeyde aktivite göstermesi, halofilik

stabilitesinin yüksek olması, deterjanlara dirençli olması, enzimin tekstil

uygulamaları, kağıt endüstrisi, hayvan yemi hazırlanması gibi uygulamalarda

kullanılacak özelliktedir.


155

Son yıllarda özellikle selülozdan biyoetanol üretimi, üzerinde en fazla çalışılan

konular arasında birinci sırada yer almaktadır. Selülozun tamamen oligosakkaritlere

dönüşümünün sağlanmasında endoglukanaz ve ksilanaz enzimleri birlikte

kullanılması başarı oranını üst düzeylere taşıyacaktır. Bu alanın giderek önem

kazanması, selülozu kısa sürede hidrolize edecek enzimlere olan ihtiyacı giderek

artırmaktadır. Çalışmamızda izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilen C-14

endoglukanaz ve X-13 ksilanaz enzimlerinin hidroliz ürünlerine arasında yoğun

miktarda maltoz, sellobioz, sellotrioz ve sellotetroz, ksiloz ve uzun zincirli

olgosakkaritlerin bulunması (1 saat gibi kısa bir inkübasyon sonunda), enzimin

endüstriyel uygulamalar için ideal özellik taşıdığını göstermektedir.

7. Günümüzde, özellikle çevre koruma önlemleri sayesinde, ksilanazların en

yaygın kullanım alanı kağıt endüstrisi olmuştur. Ksilanaz enziminin kullanımı

nedeniyle (dioxin gibi) toksik organik klorlu bileşiklerin kağıt endüstrisindeki

kullanımı azalmakta, selüloza zarar vermediği ve yan etkisi olmadığı için

uygulamada daha başarılı sonuçlar sağlandığı belirtilmektedir.Gıda (unlu mamuller)

ve içecek (meyve suyu, kahve), et tavukçuluğunda (Yem verimi artışı amacıyla,

besin katkı maddesi), yem sanayinde (Silaj etkiliğini artırmada) ve biyoteknoloji de

(Protoplast oluşumu, Tek hücre proteini üretimi, Düşük kalorili tatlandırıcılar ve sıvı

yakıt üretimi gibi) önemli bir yere sahiptir.

Halofilik ksilanaz’ların saflaştırılmasına fazla gerek duyulmaması ekstrem

koşullar gerektiren endüstriyel uygulamalarda, kullanılabilecek bu enzimlerin

önemini bir kat daha artırmaktadır.

Bacillus sp. X-13 ksilanaz enzmi, optimum aktivitesini pH 7.0 ve 40°C de

göstermesi, asidik pH koşullarında yüksek stabilite göstermesi, 70°C’ye kadar

termostabil olması nedeniyle, özellikle kanatlı hayvan yemlerinin üretimi için ideal

özellik göstermektedir.

Hemiselüloz selülozik materyalde en fazla bulunan ikinci yenilenebilir

polisakkarit molekülüdür. Her yıl yaklaşık 1010 ton düzeyinde üretilmektedir. Ksilan

hemiselülozu meydana getiren en önemli yapı olup, heteropolimer özelliği taşır. Bu

yapı ksilanaz enzimleri ile ksiloz başta olmak üzere diğer oligosakkaritlere

parçalanır. Kağıt endüstrisinde ligninin molekülden uzaklaştırılması için NaOH


156

çözeltisinde yaklaşık 170°C’lik koşullarda iki saat parçalama işlemleri

gerçekleştirilir. Buna rağmen molekülde kalan lignin kalıntıları nedeni ile elde edilen

kağıdın rengi kahverengi görünüme sahiptir. Bu yüzden birçok kimyasal işlem

uygulanarak rengi giderme işlemi gerçekleştirilir. Beyazlatma işlemlerinde klor

kullanılmakla birlikte ligninin tamamen uzaklaştırılmasının mümkün olmadığı

bilinmektedir. Klor uygulamasına alternatif olarak son yıllarda ksilanaz enzimi

kullanımı hızla yaygınlaşmış ve çok başarılı sonuçlar alınmıştır. İzolasyonunu

gerçekleştirdiğimiz enzim taşıdığı aktivite özellikleri nedeniyle bu alan için ideal bir

çözüm oluşturacaktır.

Enzimin hidroliz ürünleri arasında yoğun şekilde ksiloz açığa çıkması, çok

sayıda uzun zincirli ksilo-oigosakkarit ürünlerinin oluşması, enzimin besin

endüstrisinde prebiyotik üretimi için son derece uygun özelliktedir. X-13 ksilanaz

enzimi özellikleri nedeniyle meyve suyu üretiminde selülaz ve pektinaz enzimi

kullanılmadan tek başına berraklaştırma yapabilecek özellikte olup, etkin şekilde

kullanılabilir.

157

KAYNAKLAR

ADAMS,M.W.W., and KELLY,R.M., 1995. Enzymes in extreme environments.

Chem. Eng. News. 73:32-42.

AEHLE, W.,2004. Enzymes in Industry Production and Application. Wiley-VCH

Verlag,Weinheim, 484s.

AGUILAR, A., INGEMANSSON, T., and MAGNIEN, E., 1998. Extremophile

microorganisms as cell factories: supprt frm the Europian Union.

Extremophiles. 2:367-373.

AIYER, P.V., 2005. Amylases and their applications. African Journal of

Biotechnology. 4: 1525-1529.

ALTSCHUL, S.F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E.W. and LIPMAN, D.J.,

1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 215: 403-410.

AMOOZEGAR, M.A., MALEKZADEH, F. and MALIK, K.A., 2003. Production of

amylase by newly isolated moderate halophile, Halobacillus sp. strain

MA-2. Journal of Microbiological Methods, 52: 353-359.

ANTHONY, T., RAJ, K.C., RAJENDRAN,A., GUNASEKARAN,P., 2003. High

molecular weight cellulase-free xylanase from alkali-tolerant Aspergillus

fumigatus AR1. Enzyme.Microb.Technol., 32: 647-654.

ARCHANA, A. and SATYANARAYANA,T., 1997. Xylanase production by

thermophilic Bacillus licheniformis A99 in solid-state fermentation.

Enzyme.Microbial.Technol.,21: 12-17.

ARIKAN, B., 2007. Highly Thermostable, Thermophilic, Alkaline, SDS and

Chelator Resistant Amylase from a Thermophilic Bacillus sp. Isolate

A3-15. Bioresource Technology. (Basımda).

ASGHER, M., ASAD, M.J., RAHMAN, S.U., LEGGE, R.L., 2007. A thermostable

α-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for

starch processing. J. Food Engineering, 79:950-955.

ASI, T., 1996. Tablolarla Biyokimya. Nobel Tıp Kitabevi, İstanbul,282s.

ATALLA, R.H., VANDERHART, D.L., 1984. Native Cellulose: a composite of two

distinct crystalline forms. Science, 223: 283-285.

158

AVCIOGLU, B., EYUPOGLU,B.and BAKIR,U., 2005. Production and

characterization of xylanase of a Bacillus strain isolated from soil. World

Journal of Microbiology&Biotechnology,21:65-68.

BAJPAI, P. and BAJPAI, K.P., 1987. High temğerature alkaline α-amylase from

Bacillus licheniformis TCRDC-B13. Biotechnology and Bioengineering,

33:72-78.

BANAT, I.M., MAKKAR, R.S., and CAMEOTRA, S.S., 2000. Potential

commercial applications of microbial surfactans. Appl microbiol

Biotechnol. 53:495-508.

BARROW, G.I and FELTHAM, R.K.A., 1993. Cowan and Steel’s Manual for the

Identification of Medical Bacteria. Cambridge Uni.Pres.

BEG, Q.K., KAPOOR, M., MAHAJAN, L., and HOONDAL, G.S., 2001. Microbial

xylanases and their industrial applications: a review.

Appl.Microbiol.Biotechnol.,56: 326-338.

BERNHARDSDOTTER, E.C.M.J., NG, J.D., GARRIOTT, O.K., PUSEY,

M.L.,2005. Enzymic properties of an alkaline chelator-resistant α-

amylase from alkaliphilic Bacillus sp. isolate L1711.Process Biochem.,

40:2401-2408.

BHAT, M.K., 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnolgy

Advances, 18(5): 355-383.

BHAT, M.K., and BHAT, S., 1997. Cellulose degrading enzymes and their potential

industrial applications. Biotechnology Advances, 15: 583-620.

BIODIN, A. and EFFRONT,J.,1917. Process manufacturing diastases and toxins by

oxidizing ferments. U.S.Patent 1, 227,525.

BLANCO, A., VIDAL, T., COLOM, J. F .and PASTOR, F. I. J.,1995. Purification

and Properties of Xylanase A from Alkali-Tolerant Bacillus sp. Strain

BP-23. Appl. Environ.Microbiol.,61: 4468-4470.

BOLLAG,D.M., ROZYCKI, M.D., EDELSTEIN, S.J., 1996. Protein Methods (2nd

Edt). Viley-Liss Press, USA. 414s.

BRECCIA, J.D., SIFIERIZ, F,. BAIGORI, M. D., CASTRO, G. R. and HATTI-

KAUL, R.,1998. Purification and characterization of a thermostable

159

xylanase from Bacillus amyloliquefaciens. Enzyme.Microb.Tech.,22:42-

49.

BURHAN, A., NISA, U., GOKHAN, C., OMER, C., ASHABIL, A., OSMAN, G.,

2003. Enzymatic properties of a novel thermostable, thermophilic,

alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp.

isolate ANT-6. Process Biochem., 38: 1397-1403.

CAMPBELL, L.L.,Jr., 1952. Physiological studies on thermophilic bacteria.

Ph.D.Thesis, University of Texas, Austin, Teksas.

CARDOSO, O.A.V., FILHO, E.X.F., 2003. Purification and characterizaiton of a

novel cellulase-free xylanase from Acrophialophora nainiana. FEMS

Microbiol.Lett., 223:309-314.

CHERRY, J.R., and FIDANTSEF A.I., 2003. Directed evolution of industrial

enzymes: an update. Current Opinion in Biotechnology, 14: 438-443.

CHUNG, Y.C., KOBAYASHI, T., KANAI, H., AKIBA, T., KUDO, T., 1995.

Purification and properties of extracellular amylase from the

hyperthermophilic archeon Thermococcus profundus DT5432. Appl.

Environ. Microbiol., 1502-1506.

CONN, J.F., JOHNSON, J.A. and MILLER, B.S., 1950. An investigation of

commercial fungal and bacterial alpha-amylase preparations in baking.

Cereal Chem., 27: 191-205.

CORAL, G., ARIKAN, B., UNALDI, M.N., GUVENMEZ, H., 2002. Some

Properties of Crude Carboxymethyl Cellulase of Aspergillus niger Z10

wild type strain. Turk. J. Biol., 26:209-213.

DANIEL, R.M., DINES,M., and PETACH, HH., 1996. The denaturation and

degradation of stable enzymes at high temperatures. Biochem. J. 317:1-

11.

DAS, K., DOLEY,R. and MUKHERJEE,A.K., 2004. Purification and biochemical

characterization of a thermostable, alkaliphilic, extracellular α-amylase

from Bacillus subtilis DM-03, a strain isolated from the tradition

fermented food of India. Biotechnol.Appl.Biochem.,40:291-298.

160

DEMIRKAN, E.S., BUNZO, M., ADACHI, M., HIGASA, T., UTSUMI, S., 2005.

α-Amylase from B.amyloliqefaciens: purification, characterization, raw

starch degradation and expression in E.coli. Process. Bichemistry., 40:

2529-2636.

DEUTCH, C.E.,2002. Characterization of a salt-tolerant extracellular a-amylase from

Bacillus dipsosauri. Letters in Applied Microbiology, 35: 78–84.

DEY, D., HINGE, J., SHENDYE, A., RAO, M., 1991. Purification and properties of

extracellular endoxylanase from alkalophilic thermophilic Bacillus sp.

Can. J. Microbiol., 38: 436-442.

DHILLON, A., GUPTA,J.K., KAHNA, S., 2000. Enhanced production, purification

and characterization of a novel cellulase-poor thermostable, alkalitolerant

xylanase from Bacillus circulans AB16. Process Biochem.,35:849-856.

DOI, R.H., KOSUGI,A., MURASHIMA, K., TAMARU, Y., and HAN, S.O., 2003.

Cellulosomes from mesophilic Bacteria. Journal of Bacteriology,185:

5907-5914.

DONG, X.M., REVOL, J-F., GRAY, D.G., 1998. effect of microcrystallite

preparation conditions on the formation of colloid crystals of cellulose.

Cellulose, 5: 19-32.

DUARTE, M.C.T., PORTUGAL, E.P., PONEZI,A.N., BIM, M.A., TAGLIARI,

C.V., FRANCO, T.T., 1999. Production and purification of alkaline

xylanase. Bioresource Tech.,68:49-53.

DUEDAHL-OLESEN, L., KRAGH, K.M. and ZIMMERMANN, W., 2000.

Purification and characterisation of a malto-oligosaccharide-forming

amylase active at high pH from Bacillus clausii BT-21. Carbohydrate

Research 329: 97–107.

DYM, O., MEVARECH, M., SUSSMAN, J.L., 1995. Structural features that

stabilize halophilic malate dehydrogenase from archaebacterium.

Science., 267:1344-1346.

161

EGAS, M.C.V., daCOSTA, M.S., COWAN, D.A., PIRES, E.M.V., 1998.

Extracellular α-amylase from Thermus filiformis Ork A2: purification and

biochemical characterization. Extremophiles., 2:23-32.

ENDO, K., HAKAMADA, Y., TAKIZAWA, S., KUBOTA, H., 2001. A novel

alkaline endoglucanase from an alkaliphilic Bacillus isolate:

enzymatic properties, and nucleotide and deduced amino acid

sequences. Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 109-116.

ERICH,H., 1975. Chromatography, A laboratory Handbook of Chromatographic and

Electrophoretic Methods. Van Reinhold Comp., New York. 968s.

FLEMING, K., GRAY, D.G., MATTHEWS, S. Cellulose crystallites. Chemistry, 7:

1831-1835.

FOGARTY, W.M., and KELLY, C.T., 1979. Developments in microbial

extracellular enzymes. (A.Wisemann editör) Topics in Enzyme and

fermentation biotechnology, Wiley,New York, s.45-108.

FRIEDMANN, T. and EPSTEIN, C.J., 1967. The role of calcium in the reactivation

of reduced taka-amylase. The Journal of Biological Chemistry,

242:5131-5140.

FUKUCHI, S., YOSHIMUNE, K., WAKAYAMA, M, MORIGUCHI, M., and

NISHIKAWA, K., 2003. Unique amino acid composition of proteins in

halophilic bacteria. J. Mol. Biol. 327:347-357

GALLORDO, O., DIAZ, P., PASTOR,F.I.J., 2004. Cloninig and characterization of

xylanase A from the strain Bacillus sp.BP-7: Comparison with alkaline

pI-low molecular weight xylanase of family 11. Current Microbiology,

48:276-279.

GEORGE, S.P., AHMAD, A., RAO,M.B., 2001. Studies on carboxymethyl cellulase

produced by an alkalothermophilic actinomycete. Bioresource Tech., 77:

171-175.

GESSESSE, A. and MAMO,G.,1999. High level xylanase production by an

alkaliphilic Bacillus sp. by using solid state fermentation.

Enzyme.Microb.Technol.,25:68-72.

162

GESSESSE, A., 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline

Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp. Appl.Environ.Microbiol.,64:

3533-3535.

GILBERT, H.J., and HAZLEWOOD, G.P.,1993. Bacterial cellulases and Xylanases.

J.Gen.Microbiol.,139: 187-194.

GIRI, N.Y., MOHAN, A.R., RAO, L.V., RAO, C.P., 1990. Immobilization of α-

amylase complex in detection of higher oligosaccharides on paper.

Curr.Science., 59: 1339-1340.

GLICK,B.R., and PASTERNAK,S.S., 1994. Molecular biotechnology: Principles

and Applications of Recombinant DNA. Cold Spring Harbor Laboratory,

New York.

GODFREY, T. and WEST, S., 1996. Introduction to Industrial Enzymology.

(T.Godfrey and S. West editör) Industrial Enzymology,2nd Edition,

Stockton Pres, New York.

GOMES, J. and STEINER,W., 2004. The biocatalytic Potential of Extremophiles

and Extremozymes. Food Technology and Biotechnology, 42(4): 223-

235.

GOYAL, N., GUPTA, J.K., and SONI, S.K., 2005. A novel raw starch digesting

thermostable α-amylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the direct

hydrolysis of raw starch. Enzyme and Microbial Technology. 37:723-

734.

GUPTA, A., ROY, I., PATEL, R.K., SINGH, S.P., KHARE, S.K., and GUPTA ,

M.N., 2005.One-step purification and characterization of an alkaline

protease from haloalkalophilic Bacillus sp. Journal of

Chromathography A. 1075:103-108.

GUPTA, R., GIGRAS, P., MOHAPATRA, H., GOSWAMI, V.K., CHAUHAN,

B.,2003. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective. Process

Biochem., 1-18.

GUPTA, R., GUPTA, K., SAXENA, R.K., and KHAN, S., 1999. Bleach-stable

alkaline protease from Bacillus sp. Bioechnology Letters,21:135-138.

163

HAGIHARA, H., IGARASHI, K., HAYASHI, Y.,ENDO, K., IKAWA-ITAYAMA,

K., OZAKI, K., KAWAI, S. and ITO,S.,2001. Novel a-Amylase That Is

Highly Resistant to Chelating Reagents and Chemical Oxidants from the

Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM-K38. Appl. and Env.

Microbiol.,67:1744-1750.

HAKAMADA, Y., ENDO, K., TAKIZAWA, S., KOBAYASHI, T., SHIRAI, T.,

YAMANE, T., ITO, S., 2002. Enzymatic properties, crystallization and

deduced aminoacid sequence of an alkaline endoglucanase from

Bacillus circulans. Biochimica et Biophysica Acta,1570: 174-180.

HAKAMADA, Y., KOIKE, K., YOSHIMATSU, T., MORI, H., KOBAYASHI, T.,

ITO,S., 1997. Thermostable alkaline cellulase from an alkaliphilic isolate,

Bacillus sp. KSM-S237. Extremophiles, 1:151-156.

HAMES, B.D. and RICKWOOD, D., 1996. Gel Electrophoresis of Proteins A

Practical Approach. Oxford University Press, Oxford.383s.

HARTMANN ,P.A., WELLERSON,R.Jr., and TETRAULT, P.A., 1954. Bacillus

stearothermophilus I. Thermal and pH Stability of the Amylase. Journal

of Bacteriology, 7-10.

HARWOOD, C.R., 1992. Bacillus subtilis and its relatives: Molecular Biological and

Industrial Workhorses. Elsevier Science Publishers Ltd (U.K.), 10:247-

256.

HASHIM,S.O., DELGADO, O.D., MARTINEZ,M.A., KAUL, R-H., MULAA, F.J.,

MATTIASSON,B., 2005. Alkaline active maltohexaose-forming α-

amylase from Bacillus halodurans LBK 34. Enzyme.Microbial

Technol.,36:139-146.

HIRASAWA, K., UCHIMURA, K., KASHIWA, M., GRANT, W.D., ITO, S.,

KOBAYASHI, T., HORIKOSHI, K., 2006. Salt-activated

endoglucanase of a strain of alkaliphilic Bacillus agaradhaerens.

Antonie v Leeuwenhoek 89:211-219.

164

HORIKOSHI, K., 1971. Production of alkaline amylase by alkalophilic

microorganisms II Alkaline amylase produced by Bacillus no A-40-2.

Agric. Biol. Chem., 35: 1783-1791.

HORIKOSHI, K., 1996. Alkaliphiles-from an industrial point of view. FEMS

Microbiology Reviews, 18:259-270.

HORIKOSHI, K., 1999. Alkaliphiles: some Applications of Their Products for

Biotechnology. Microbiol. Mol.Biol.Rev.,63:735-750.

HREGGVIDSSON, G.O., KAISTE, E., HOLST, O., EGGERTSSON,

G.,PALSDOTTIR, A and KRISTJANSSON, J.K., 1996. An Extremely

Thermostable Cellulase from the Thermophilic Eubacterium

Rhodothermus marinus. Appl. Environ. Microbiol.,62: 3047-3049.

HUANG, X.P., MONK, C., 2004. Purification and characterization of a cellulase

(CMCase) from a newly isolated thermophilic aerobic bacterium

Caldibacillus cellulovarans gen.nov., sp. nov. World J. Microbiol.

Biotechnol., 20: 85-92.

HUTCHEON, G.W., VASIST, N., BOLHUIS, A.,2005. Characterization of a highly

stable α-amylase from the halophilic archeon haloarcula hispanica.

Extremophiles,9:487-495.

IGARASHI, K., HATADA, Y., HAGIHARA, H., SAEKI, K., TAKAIWA, M.,

EUMURA, T., ARA, K., OZAKI, K., KAWAI, S., KOBAYASHI, T.,

ITO, S., (1998). Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase

from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid

sequences. Appl. Environ. Microb., 64:3382-3389.

IGARASHI, K., HATADA, Y., HAGIHARA, H., SAEKI, K., TAKAIWA, M.,

UEMURA, T., ARA, K., OZAKI, K., KAWAI, S., KOBAYASHI, T. and

ITO, S., 1988. Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase

from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid

sequences. Appl.Env.Microbiol.,64:3282-3289.

165

JOHN, F.K., 1987. Enzyme Technology (H.J.Rehm ve G.Reed editör).

Biotechnology,Vol.7A. New York s 37-62.

KANG, S.W., PARK, Y.S., LEE, J.S., HONG, S.I., KIM, S.W., 2004. Production of

cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from

lignocellulosic biomass. Bioresource Tech.,91: 153-156.

KANG,H-J.,UEGAKI, K., FUKADA, H., ISHIKAWA,K.,2007. Improvement of the

enzymatic activity of the hyperthermophilic cellulase from Pyrococcus

horikoshii.Extremophiles,11, 251-256.

KIM, J-Y., HUR, S-H., HONG, J-H., 2005. Purification and characterization of an

alkaline cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp. HSH-

810. Biotechnol. Lett., 27:313-316.

KIM, T.U., GU, B.G., JEONG, J.Y., BYUN S.M. and SHIN, Y.C., 1995.

Purification and Characterization of a maltotetraose-forming alkaline α-

amylase from and alkalophilic strain, GM8901. Appl.Environ.

Microbiol., 61:3105-3112.

KNEEN, E. and SANDSTEDT, R.M., 1946. Application of the amylases in milling

and baking technology. (J.A.Anderson, Editör), Enzyme and Their Role

in Wheat Technology. Interscience Publishers,Inc.,New York. s,89-126.

KONSULA, Z. and LIAKOPOULOU-KYRAIDES, M., 2004. Hydrolysis of

starches by the action of an α-amylase from Bacillus subtilis.Process

Biochem.,39:1745-1749.

KRISHNA, C., 1999. Production of bacterial cellulases by solid state

bioprocessing of banana waste. Bioresorce Tech., 69:231-239.

KRISTJANSSON, J.K., and STETTER, K.O., 1992. Thermophilic Bacteria.

(J.K.Kristjansson, editör) Thermophilic Bacteria. CRC Pres, London,1-

18s.

KULKARNI, N., SHENDYE, A., RAO, M., 1999. Molecular and biotechnological

aspects of xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 23: 411.456.

KUMAR, B.K., BALAKRISHNAN, H. and RELE, M.V., 2004. Comptibility of

alkaline xylanases from an alkaliphilic Bacillus NCL (87-6-10) with

166

commercial detergents and proteases. J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,31: 83-

87.

KUMAR, G.C., and TAKAGI, H., 1999. Microbial alkaline proteases from a

bioindustrial viewpoint. Biotechnology Advances. 17:561-594.

KUMAR, H.D. and NUSSINOV, R., 2001. How Do Thermophilic Proteins Deal

with Heat? A review. Cellular and Molecular Life Sciences, 58: 1216-

1233.

LAMA, L., CALANDRELLI, V., AGATA, GAMBACORTA, A., NICOLAUS,

B.,2004. Purificaion and characterization of thermostable xylanase and

β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillus thermantarcticus.

Research in Microbiology,155: 283-289.

LEE, S-P., MORIKAWA, M., TAKAGI, M., IMANAKA, T., 1994. Cloning of the

aapT Gene and Characterization of Its product, α-Amylase-Pullulanase

(AapT), from Thermophilic and Alkaliphilic Bacillus sp. Strain XAL601.

Appl.Environ.Microbiol.,60:3764-3773.

LENNETE, E.H., BALLOWS, A., HAUSLER, J.W.Jr.,SHADOMY, J.H., 1985.

Manuel of Clinical Microbiology. Vol 4.USA.1149s.

LI, L., TIAN, H., CHENG,Y., JIANG, Z., YANG,Z., 2006. Purification and

characterization of a thermostable cellulase-free xylanase from the newly

isolated Paecilomyces themophila. Enzyme.Microbiol.Technol.,38: 780-

787.

LI, Y-H., DING,M., WANG, J., XU, G-J., ZHAO, F., 2006. A novel

thermoacidophilic endoglucanas, Ba-EGA, from a new cellulose-

degrading bacterium, Bacillus sp.AC-1. Appl. Microbiol.Biotechnol., 70:

430-436.

LIN, L.L., CHYAU, C.C., HSU, W.H., 1998. Production ad properties of a raw

starch-degrading amylase from the thermophilic and alkalophilic Bacillus

sp. TS-23. Biotechno. Appl. Biohem. 28:61-68.

LOPEZ, C., BLANCO, A. and PASTOR, F.I.J., 1998., Xylanase production by a

new alkali tolerant Bacillus. Biotechnology Letters,20:243-246.

167

LYND , L.R., WEIMER, P.J., van ZYL, W.H., 2002. Microbial cellulose utilization:

fundamentals and biotechnology. Microbiol.Mol.Biol.Rev.,66: 506-577.

MAAT, J., ROZA, M., VERBAKEL, J., STAM, H., daSILRA, M.J.S., EGMOND,

M.R., HAGEMANS, M.L.D., vanGARCOM, R.F.M., HESSING, J.G.M.,

vanDERHONDEL, C.A.M.J.J., vanRPTTERDAM, C., 1992. Xylanases

and their application in bakery. (J.Visser, G.Beldman, M.A.K.

vanSomeren, A.G.J. Voragen, editörler) Xylan and Xylanases. Elsevier,

Amsterdam, 349-360s.

MADERN, D., EBEL, C. and ZACCAI, G., 2000. Halophilic adaptationof

enzymes. Extremophiles 4: 91 –98.

MALHOTRA,R., NOORWEZ, S.M. and SATYANARAYANA,T., 2000.

Production and partial characterization of thermostable and calciun-

independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus

thermooleovorans NP54. Letters in Applied Microbiology, 31: 378-384.

MAMO, G., GASHE, B.A. and GESSESSE, A., 1999. A highly thermostable from a

newly isolated thermophilic Bacillus sp.WN11. Journal of Applied

Microbiology, 86: 557-560.

MAMO, G., HATTI-KAUL, R., MATTIASSON,B., 2006. A thermostable alkaline

active endo-β-1-4-xylanase from Bacillus halodurans S7: Purification and

Characterization. Enzyme.Microb.Technol., 39: 1492-1498.

MANSFIELD, S.D., SADDLER, J.N, and GUBITZ, G.M., 1998. Characterisation of

endoglucanases from the brown rot fungi Gloeophyllum sepiarium and

Gloeophyllum traberium. Enzyme. Microbiol. Biotechnol., 23:133-140.

MARGESIN, R., AND SCHINNER, F., 2005. Potential of halotolerant and

halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles. 5:73-83.

MARQUEZ, M.C., VENTOSA, A., and CORMENZANA, R., 1992. Phenotypic and

chemotaxonomic characterization of Marinococcus halophilus. Syst Appl

Microbiol, 15:63-69.

168

MAWADZA, C., HATTI-KAUL, R., ZVAUYA, R., MATTIASON, B., 2000.

Purification and characterization of cellulases produced by Bacillus

Strain. J. Biotechnol., 83: 177-187.

McTIGUE, M.A., KELLY,C.T., DOYLE, E.M. and FOGARTY, W.M., 1995. The

alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp IMD370.Enzyme Microb.

Technol., 17:570-573.

MENZEL,C., LERCH, T., SCHNEIDER, K., WEIDEMAN, R., TOLLNICK, C.,

KRETYMER, G., SCHEPER, T., SCHUGERT, K., 1998. Application of

biosensors with an electrolyte isolator semiconductor capacitor (EIS-

CAP) transducer for process monitoring. Process Biochemistry, 33: 175-

180.

MILLER, G.L., 1951. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Analytical Chemistry,426-428.

MOREAU, R.A., POWELL, M.J., WHITAKER, B.D., BAILEY, B.A.,

ANDERSON, J.D., 1994. Xylanase treatment of plant cells induces

glycosylation and fatty acylation of photosterols. Physiol.Plant., 91: 575-

580.

MORGAN, F.J. and PRIEST, F.G., 1981. Characterization of a thermostable α-

amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346. J.Appl. Bacteriol., 50:

107-114.

MURASHIMA, K., NISHIMURA, T., NAKAMURA, Y., KOGA, J., MORIYA, T.,

SUMIDA, N., YAGUCHI, T., KONO,T., 2002. Purification and

characterization of new endo-1,4-β-D-glucanases from Rhizopus oryzae.

Enzyme. Microbial Technol., 30: 319-326.

NIEHAUS,F., BERTOLDO,C., KAHLER,M., AND ANTRANIKIAN,G., 1999.

Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application.

App Microbiol Biotechnol, 51:711-729.

ONISHI, H. and SONADO, K., 1979. Purification and some properties of an

extracellular amylase from a moderate halophile, Micrococcus halobius.

Applied and Environmental Microbiology, 38:616-620.

169

OUTTRUP, H and JORGENSEN,S.T., 2002. The Importance of Bacillus species in

the production of industrial enzymes. (R.Berkley editör) Applications and

systems of Bacillus and relatives. Blackwell Science Inc., Malden,

Mass.,206-218.

PERCIVAL ZHANG, Y.H., HIMMEL, M.E., MIELENZ, J.R., 2006. Outlook for

cellulase improvement: Screening and selection strategies.

Biotechnology Advances,24: 452-481.

POMARES, F.P., BAUTISTA,V., FERRER, J., PIRE, C., MARHUENDA-EGAE,

F.C., BONETE,M.J., 2003. α-Amylase activity from the halophilic

archaeon Haloferax mediterranei. Extremophiles,7: 299-306.

POOLE, C.F., 2003. The Esence of Chromatography. Elsevier Science B.V.

Amsterdam, 925s.

PRIEST, F.G., (1977). Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus.

Bacteriol. Rev., 41:711-753.

PULS, J., SCHUSEIL, J., 1993. Chemistry of hemicelluloses: relationship between

hemicellulose structure and enzyme required for

hydrolysis.(COUGHLAN,M.P. ve HAZLEWOOD, G.P. Editorler)

Hemicellulose and hemicellulases . Portland Pres. London. s:1-28.

RANI, S., and NAND, K., 1996. Development of cellulase-free xylanase producing

anaerobic consotria for the ıse of lignocellulosic wastes. Enzyme.

Microb. Technol., 18: 23-28.

RAO, M.B., TANKSALE, A.M. GATHE, M.S., DESHPANDE, W., 1998.

Molecular and Biotechnological aspect of Microbial proteases.

Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3):597-635.

RATANAKHANOKCHAI, K., KYU, K.L., TANTICHAROEN, M., 1999.

Purification and Properties of a Xylan-Binding Endoxylanase from

Alkaliphilic Bacillus sp. Strain K-1. Appl.Environ.Microbiol., 65: 694-

697.

170

REDDY, N.S., NIMMAGADDA, A., and RAO, K.R.S.S., 2003. An overview of the

microbial α-amylase family. African Journal of Biotechnology.

2(12):645-648.

ROBSON, L.M. and CHAMBLISS, G.H., 1984. Characterization of the cellulolytic

activity of a Bacillus isolate. Appl. Environ.Microbiol.,47:1039-1046.

RYAN, S.E., NOLAN,K., THOMPSON,R., GUBITZ,G.M., SAVAGE, A.V.,

TUOHY, M.G., 2003. Purificaiton and characterization of a new low

molecular weight endoxylanase from Penicillium capsulatum.

Enzyme.Microb.Technol., 33: 775-785.

RYU, K., KIM, J., DORDICK, J.S., 1994. Catalytic properties and potential of an

extracellular protease from an extreme halophile. Enzyme. Microb.

Technol.,16:266-275.

SAHA, B.C., 2002. Production,purification and properties of xylanase from a newly

isolated Fusarium proliferatum. Process Biochem., 37: 1279-1284.

SAITO, N., 1973. Thermophilic Extracellular α-amylase from Bacillus

licheniformis. Archieves in Biochemistry and Biophysics, 155:290-298.

SAMBROOK, J. and RUSSELL, D.W.,2001. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

SANDER,I., RAULF-HEIMSOTH, M., VAN KAMPEN, V., BAUR,X., 2000. Is

fungal amylase in bread an allergen? Clinical and Experimental Allergy,

30: 560-565.

SA-PEREIRA, P., MESQUITA, A., DUARTE, J.C., BARROS, M.R.A., COSTA-

FERREIRA,M., 2002. Rapid production of thermostable cellulase-free

xylanase by a strain Bacillus subtilis and its properties.

Enzyme.Microb.Technol.,30: 924-933.

SARIKAYA, E., 1995. α-amilase üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme

parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu.

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi.

SAUL, D.J., WILLIAMS, L.C., GRAYLING, R.A., CHAMLEY, L.W., LOVE,D.R.

and BERGQUIST, P.L., 1990. ceiB, a Gene Coding for a Bifunctional

171

Cellulase from the Extreme Thermophile "Caldocellum saccharolyticum".

Appl.Environ.Microbiol., 56: 3117-3124.

SAXENA, R.K., DUTT, K., AGARWAL, L., NAYYAR, P,. 2007. A highly

thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp.PN5. Bioresource

Tech., 98:260-265.

SCHALLMEY, M., SINGH, A. and WARD, O.P., 2004. Developments in the Use of

Bacillus Species for Industrial Production. Canadian Journal of

Microbiology, 50:1-17.

SCOPES, R.K.,1982. Protein Purification Principles and Practice. Springer-Verlag,

New York.282s.

SHAW, J-F., LIN, F-P., CHEN, S-C. and CHEN, H-C., 1995. Purification and

properties of an extracellular α-amylase fron Thermus sp.

Bot.Bull.Acad.Sin.,36:195-200.

SHIBUYA, I., IIMURA, Y., ISHIKAWA, T., OUCKI, K., MATSUYAMA, A.,

YAMAMOTO,T., 1986. Isolation and characterization of starch utilizing

mutants of Escherichia coli. Agric.Biol.Chem.,50: 875-882.

SIDHU, G.S., SHARMA, P., CHAKRABARTI, T., GUPTA, J.K., 1997. Strain

improvement for the production of a thermostable α-amylase. Enzyme.

Microb. Technol., 21:525-530.

SINGH, J., BATRA, N., SOBTI, R.C., 2001. A highly thermostable, alkaline

CMCase produced by a newly isolated Bacillus sp.VG1. World J.

Microbiol. Biotechnol., 17: 761-765.

SINGH, J., BATRA, N., SOBTI, R.C., 2004. Purification and characterization of

alkaline cellulase produced by a novel isolate, Bacillus sphaericus JS1.

J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 31: 51-56.

SMITH, J.E.,1996. Biotechnology. Chambridge University Pres, Chambridge, 233s.

SODHI, H.K., SHARMA, K., GUPTA, J.K., SONI, S.K., 2005. Production od a

thermostable α-amylase from Bacillus sp. PS-7 by solid state

fermentation and its synergistic use in the hydrolysis of malt starch for

alcohol production.Process Biochem.,40: 525-534.

172

SOUTSCHEK-BAUER, E. and STAUDENBAUER L., 1987. Synthesis and

secretion of a heat stable carboxymethylcellulase from Clostridium

thermocellum in Bacillus subtilis and Bacillus

stearothermophilus.Mol.Gen. Genet., 208: 537-541.

SPRING, S., LUDWIG, W., MARQUEZ, M.C., VENTOSA, A., AND

SCHLEIFER, K.H., 1996. Halobacillus gen. Nov. , with descriptions of

Halobacillus litoralis sp. nov. and Halobacillus trueperi sp. nov., and

transfer of Sporosarcina halophila to Halobacillus halophilus comb. nov.

Int. J Syst Bacteriol. 46:492-496.

SRIVASTAVA, R.A.K., 1987. Purification and chemical characterization of

thermostable amylase produced by Bacillus stearothermophilus. Enzyme.

Microb. Technol., 9: 749-754.

STARK, E., and TETRAULT, P.A., 1951. Isolation bacterial, cell-free, starch

saccharifying enzymes from the medium at 70 C. Journal of Bacteriology,

62: 247-249.

SUBRAMANIYAN, S., and PREMA, P.,2000. Cellulase-free xylanases from

Bacillus and other microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 183:1-7.

SUNNA, A., ANTRANIKIAN, G., 1997. Xylanolytic enzymes from fungi and

bacteria. Crit.Rev. Biotechnol.,17: 39-67.

SZILAGYI, A., ve ZAVODSZKY, P., 2000. Structural differences between

mesophilic, moderately thermophilic and extremely thermophilic protein

subunits: results on a comprehensive survey. Structure, 8: 493-504.

TAHARA, N., YANA, H., YOSHINAGA, F., 1997. Two types of Cellulase Activity

Produced by a cellulose-producing Acetobacter Strain. Journal of

Fermentation and Bioengineering, 83: 389-392.

TANAKA, H., NAKAMURA, T., HAYASHI, S., OHTA,K.,2005. Purification and

properties of an extracellular Endo-1,4-β-Xylanase from Penicillium

citrinum and Characterization of the Encoding Gene. Journal of

Bioscience and Bioengineering, 100: 623-630.

173

TATAR, S., 2007. Termofil Moderately Halofilik Bacillus.sp. Suşlarindan

Amilaz Enzimi Üretimi ve Endüstriyel Kullanim Olanaklarinin

Araştirilması. Ç.Ü. FBE. Yüksek Lisans Tezi.

TEMİZKAN, G. ve ARDA, N., 2004. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler.

Nobel Tıp Kitabevi, İst.345s.

THOMPSON, J. D., HIGGINS, D. G. AND GIBSON, T. J., 1994. ClustalW:

improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment

through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight

matrix choice. Nucleic Acids Res., 22:4673-4680.

TSENG, M-J., YAP,M-N., RATANAKHANOKCHAI, K., KYU, K.L., CHEN, S-T.,

2002. Purification and characterization of two cellulase free xylanase

from an alkaliphilic Bacillus firmus. Enzyme.Mibrob.Technol.,30: 590-

595.

UHLIG, H., 1998. Industrial Enzymes and Their Application. John Wilet and Sons,

Canada. 454s.

VENTOSA, A., NIETO, J.J., and OREN, A., 1998. Biology of moderately

halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:504-544.

VIHINEN, M. and MANTSALA, P., 1990. Characterization of a thermostable

Bacillus stearothermophilus α-amylase. Biotechnol. Appl. Biochem.,12:

427-435.

VIIKARI, L., RANVA, M., KANTELINEN, A., SANDQUİST, J., LINKO,M.,

1986. Bleecing with Enzymes. Third International Conference in

biotechnology in pulp and paper industry.16-19 June, Stockholm, s67-69.

VOGET, S., STEELE, H.L., STREIT, W.R., 2006. Characterization of

metagenome-derived halotolerant cellulase. J Biotechnol 126:26-36.

WAINØ, M. and INGVORSEN, K.,2003. Production of β-xylanase and β-xylosidase

bt the extremely halophilic archaeon Halorhabdus utahensis.

Extremophiles, 7:87-93.

174

WEJSE,P.L., INGVORSEN, K., MORTENSEN, K.K.,2003. Xylanase production by

a novel halophilic bacterium increased 20-fold by response surface

methodology. Enzyme.Microb.Technol., 32: 721-727.

WILSON, K. And GOULDING, K.H., 1986. A Biologist’s Guide to Principles and

Techniques of Practical Biochemistry. Edward Arnold, London.396s.

WISEMAN, A., 1987. Handbook of enzyme biotechnology. Second Edition. Chapter

3. The application of enzymes in industry, p.274-373.

WONG, K.K.Y., TAN, L.U.L., SADLER, J.N., 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanase

in microorganisms: functions and applications. Microbiol.Rev., 52: 305-

317.

WOOD, T.M., 1988. Preparation of crystalline, amorphous and dyed cellulase

substrate. Methods.Enzymol.,166: 19-45.

WOODLEY, J.M., 2000. Advances in Enzyme Technology-UK Contributions.

(Th.scheperi editör). Advances in Biochemical

Engineering/Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, s. 94-

107.

WRIGHT, D.B., BANKS, D.D., LOHMAN, J.R., HILSENBECK, J.L., GLOSS,

L.M.,2002. The effect of salts on the activity and stability of Escherichia

coli and Haloferax volcanii dihydrfolate reductases. J.Mol.Biol.., 323:

327-344.

YANG, V.W., ZHUANG, Z ., ELEGIR, G., and JEFFRIES, T.W.,1995. Alkaline-

active xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp. isolated from

kraft pulp. Journal of Industrial Microbiology, 15: 434-441.

YERNOOL, J-D.B.D., and EVELEİGH, D.E., 1998. Purification, characterization

and molecular analysis of thermostable cellulase CelA and CelB from

Thermotoga neapolitana. Appl.Environ.Microbiol,64:4774-4781.

ZEMAN, N.W. and McCREA, J.M., 1985. Alpha-amylase Production Using a

Recombinant DNA Organism. Cereal Foods World. 30 (1): 777-780.

ZHANG, Q., TSUKAGOSHI, N., MIYASHIRO, S. and UDAKA, S., 1983.

Increased production of α-amylase by Bacillus amyloliquefaciens in the

175

presence of glycine. Applied and Environmental Microbiology,46: 293-

295.

ZVERAVA, E.A., FEDOROVA,T.V., KEVBRIN, V.V., ZHILINA, T.N. and

RABINOVICH,M.L.,2006. Cellulase activity of a haloalkaliphilic

anaerobic bacterium, strain Z-7026. Extremophiles, 10: 53-60.

176

ÖZGEÇMİŞ

1969 yılında Kahramanmaraş İlinde doğdum. 1991 yılında Selçuk

Üniversitesi FEF Biyoloji Bölümünde lisans eğitimimi tamamladıktan sonra 2 yıl

İstanbul Eyüp Lisesinde Öğretmen olarak çalıştım. 1996 yılında Yüksek Lisansımı

The University of Manchester’da tamamladım. 2002 yılında Çukurova

Üniversitesinde Doktora proğramına başladım ve halen Araştırma Görevlisi olarak

çalışmaktayım.

177

EK 1

Nişasta

Bitkiler tarafından fazla glikozun depo edilmiş şekli olan kompleks bir

karbohidrat polimeridir. Polisakkaritler arasında en çok öneme sahip olanıdır. Bazen

bitkilerde yaş ağırlığın %70’ini oluşturabilirler. Genellikle, suda çözünmez granül

formunda yer alırlar. Granüllerin şekli ve büyüklükleri bitki türlerine göre

değişebilir. Suda ısıtıldıklarında, granülü bir arada tutan hidrojen bağları zayıflayarak

şişer ve jelatinize olurlar. Ticari olarak, mısır, buğday, sorgum ve pirinç gibi

bitkilerin tohumlarından yada patates gibi bitkilerinköklerinden elde edilirler.

Nişasta, amiloz ve amilopektin denen iki molekülün karışımından oluşan bir

polisakkarittir. Bu iki molekül farklı yapı ve fiziksel özelliklere sahiptir.

Çizelge Ek 1.1:Amiloz ve Amilopektinin Bazı Özellikleri (Aiyer, 2005).

Özellik Amiloz Amilopektin Basit yapı Temelde lineer Dallanmış

Sıvı solüsyonlarda stabilitesi Kendiliğinden

presipite olabilir

stabil

Polimerizasyon Derecesi (DP) C.103 C.104-C.105

Ortalama Zincir Uzunluğu C.103 C.20-25 β amilaz hidrolizi %87 %54 β amilaz ve dallanmaları parçalayabilen enzim hidrolizi %98 %79

Doğal nişastada bulunmaları %15-25 %75-85

Nişasta n-butanol gibi polar bir solvent ilavesi ile iki bileşenine ayrılabilir.

Çözünmez amiloz yapıları çözünür amilopektin birimlerinden kolayca ayrılabilirler.

Amiloz, α-1,4 glikozid bağları ile bağlanmış D-Glukoz birimlerinden oluşur,

bu yüzden α-amilaz enzimi ile son derece yüksek düzeyde hidroliz olur. Bazı

amilozlar bu enzimlerle tam olarak maltoza kadar parçalanamayabilirler. Binlerce

glukoz molekülünün polimerizasyonu sonucu oluşmuş bu molekül, lineer yapının

sıvı içerisinde kendi üzerine katlanmalar yapması ve amilaz enziminin sıvı ortamda

178

stabil olmaması nedeniyle, presipite olmaları ve hidrojen bağlarının etkisi sonucu

irreversible agregatlar oluştururlar.

Şekil Ek 1.1: Amiloz (Ası,1996)

Amilopektin, nişastanın %75-85’ini oluşturur, moleküler ağırlıkları 107-108

arasında olup yaklaşık α-1,4 D-glukoz bağlanması yapan 20-25 birimde bir dallanma

gösterirler. α-1,6 bağları ile dallanmalarda %4-5 oranında α-1,6-D-Glukozidik

bağlara sahiptirler. Amilopektin kısmen dallanma gösterdiğinden sıvı içerisinde daha

stabil olup agregat oluşturmaz.

Nişastanın gıda endüstrisi dışında kullanıldığı alanların başında kağıt

endüstrisi gelmektedir. Örneğin bir fotokopi kağıdında kullanılan nişasta %8’e kadar

çıkabilmektedir. Ayrıca, kısmen jelatinize edilmiş nişasta karton imalatında oluklu

orta tabakanın dış tabakalara yapıştırılması amacı ile yapıştırıcı olarak yaygın

uygulama alanına sahiptir. Bunların yanısıra, sıcakla eriyen yapıştırıcıların (Hot-melt

glues) yapımı, pul, zarf, kitap ciltleme işlemleri, normal ve suya dayanıklı etiketler,

ağaç tutkalı ve sunta imalatı, kağıt keselerde yapıştırıcı ve katkı maddesi olarak

kullanılmaktadır. Nişasta bu alanların dışında çocuk bezi imalatında, patlayıcı

endüstrisinde bağlama ajanı olarak, otomotiv endüstrisi ve inşaat sektöründe beton

blok bağlayıcılarda, yangına dirençli duvar blokları imalatında, asbest, kil ve kireç

taşı katkı maddesi olarak, kontraplak ve sunta imalatında, ve boya dolgu maddesi

olarak kullanılmaktadır. Metal endüstrisinde kum kalıpların bir arada tutulması,

madencilikte cevher flotasyonu ve sedimentasyonunda, yağlı delik matkapları

çamurunda kullanılmaktadır. Bu alanların dışında, kozmetik ve ilaç endüstrisinde toz

179

pudra yapımı, makyaj malzemelerinde, yüz kremlerinde, sabun üretiminde, tablet

kaplamalarında yada tablet dolgu materyali olarak kullanılmaktadır. Ayrıca nişasta

çürüyebilen (gerid önüşümlü) plastik filmlerde, kuru pillerde, deri cilalama

işlemlerinde de kullanılmaktadır. (Ref: Functional properties of starches).

Şekil Ek 1.2: Amilopektin (Ası, 1996)

180

Ek 2

Selüloz (Cellulose)

Selüloz, doğada en bol bulunan yenilenebilir bir biyopolimer olup yaygın

olarak bitki hücre duvarlarında bulunur. Glikoz birimlerinin β-1,4 glikozidik bağlarla

bağlanmasıyla oluşan polimerlerdir. Nişastadan farklı olarak düz bir zincir şeklinde

olup herhangi bir sarmal yapı göstermez. Selüloz zincirleri hidrojen bağlari ile

bağlanarak bir arada tutulurlar. Bazı durumlarda selüloz neredeyse saf olarak

bulunur. Birçok durumda ise selüloz lifleri hemiselüloz ve lignin gibi diğer yapısal

biyopolimerler arasına katılabilmektedir. Selüloz önemli bir özelliği diğer

polisakkaritlerden farklı olarak kristal yapıda oluşturabilmeleridir. Doğada glikoz

birimleri bir zincir halinde sentezlenirken biyosentez bölgesinde kendiliğinden

birleşerek elementer fibril olarak adlandırılan yaklaşık 30 selüloz zincirinden oluşan

birimlere dönüşür. Bunlar da daha geniş üniteler halinde paketlenerek mikrofibril

denen yapıları oluştururlar. Mikrofibriller ise selüloz fibrillerini oluştururlar.

Hidrojen bağları, zincirleri zincir içi ve zincirler arası bağlarla birbirlerine bağlar ve

sert bir yapı oluşmasını sağlar.

Selülozun kristal tabiatı, atomların bir diğerine göre uygun pozisyonda

bağlanması ile oluşan yapısal bir düzen ile elde edilir. Bu kristal yapı mikrofibrillerin

düzenleri sayesinde enzim yada su gibi küçük moleküllerin girmesini önleyici bir

paketleme şekli oluşturur. Kristal yapıya rağmen selüloz fibrilleri doğada her zaman

saf kristal halde bulunmazlar. Kristal yapı zamanla değişir ve ikincil düzen şekline

(amorf: biçimsiz) dönüşür. Kristal ve amorf bölgelere ilaveten selüloz fibrilleri

dolaşmış yumak veya bükülmüş gibi bir çok düzensizlikler içerebilir.

Saflaştırılmış selülozlar önemli oranda yapısal özelliklerde değişkenlik

gösterirler ve düşük yoğunluk arzederler. Mikrokristal yapıdaki selülozlar nerdeyse

saf olup seyreltik asit uygulamaları ile hemiselüloz ve amorfoz bölgelerinin fibrilden

uzaklaştırılması ile elde edilir. Saf selülozun değişen yapısal kompleksliği ve

çözünmez substratlar ile çalışma zorluğu karboksimetil selüloz (CMC) adı verilen

181

çözünürlüğü yüksek selüloz eterinin kullanımının yaygınlaşmasına neden olmuştur

(Lynd ve ark.2002).

Şekil Ek 2.1. Selüloz, β-D-glukoz polimeri (Ası, 1996).

Selüloz çeşitleri:

Çözünmez (Insoluble) selülozlar

Çözünmez selülozların başında pamuk, filtre kağıdı, bakteriyel selüloz,

mikrokristal selüloz, amorf selüloz gibi saf olarak kabul edilebilecek selülozlar gelir.

Saf olmayan selülozlara örnek olarak da boyanmış selülozlar, α-selüloz, ve ligno-

selülozlar sayılabilir. Selüloz-I olarak tanımlanan doğal selülozların iki farklı kristal

formu vardır. Iα bakteri ve alglerdeki selülozlarda çokça bulunur (Atalla ve

Vanderhart,1984). Iβ ise yüksek bitkilerde bol bulunan türüdür. Selüloz-I çeşitli

işlemlerden geçirildikten sonra diğer kristal formlara (II-IV) da dönüştürülebilir.

Pamuk lifleri selülozu, doğal pamuktan pektin, mumsu ve renk veren

maddelerin uzaklaştırılması sonucu elde edilirler(Wood 1988). Whatman No.1 filtre

kağıdı uzun pamuk lifleri hamurundan yapılır (Dong ve ark.1998). Hidroselüloz

(hydrocellulose) yada avicel olarak adlandırılan mikrokristal selülozlar ise odun

hamurunun hidroklorik asit muamelesi ile amorf selüloz fraksiyonların

uzaklaştırılması ile elde edilir (Fleming ve ark.2001). Avicel exoglukanaz aktivite

tayinleri için iyi bir substrattır. Bir çok araştırmacı avicelaz aktivitesini ekzoglukanaz

aktivitesi ile eşdeğer tutmaktadır (Percival Zhang ve ark, 2006). Bakteriyel

Selülozlar, Acetobacter xylinum(ATCC 23769) pelikülünden hazırlanır. Bakteriyel

mikrokristal selüloz ise bakteriyel selülozdan asit hidrolizi ile amorf selüloz

fraksiyonunun uzaklaştırılması sonucu elde edilir.

182

Amorf selüloz, selülozun mekanik veya kimyasal metotlarla kristal

fraksiyonunun amorf forma dönüştürülmesi ile hazırlanır. Bunlar mekanik olarak

hazırlanmış amorf selülozlar alkali ortamda şişmiş selülozlar ve fosforik asitle

işlenmiş selülozları içerir. Farklı elde edilişlerinden dolayı hidroliz oranlarında da bir

farklılık oluşur.

Rejenere selüloz genellikle insoluble selülozların nitrik asit, sülfirik asit,

amonyaklı kuprik hidroksil, 1-butil-3-metil imidazolium gibi selüloz solventleri ile

sçözünür forma dönüştürülmesi ve bunu takiben fiziksel olarak çözünmez formun

geri kazandırılması sonucu elde edilir. Rejenere amorf selülozlar (RAC) selülaz

aktivite çalışmaları için uygun bir substrattır. Total selülazların hidroliz

kabiliyetlerinin belirlenmesi amacı ile kullanılan ve referans olarak kabul edilen α-

selüloz çok az miktarda hemiselüloz içeren selüloza verilen isimdir.

Holoselüloz, lignini uzaklaştırılmış odunun katı kalıntısı olup, alkali

ekstraksiyon ile hemiselülozun kısmen gideriminden sonra geriye kalan katı α-

selüloz yapısıdır. Holoselülozun, çözünebilen, alkali ekstraksiyon materyalinin

nötralizasyonundan sonra çözünmeyen fraksiyonu β-selüloz, çözünmüş fraksiyonu

ise γ-selüloz adını alır.

Boyanmış selüloz, Remazol Brillant Blue, Reactive orange, Reactive Blue

19, ve floresan boya aminofloressein gibi bazı çeşitli boyalarla selülozun

karıştırılması sonucu elde edilen bir üründür.

Selüloz Türevleri:

Selülozun hidroksil grupları birçok kimyasal bileşik ile kısmen yada tam

olarak reaksiyona girebilir. Selüloz ester ve eterleri çok önemli ticari materyallerdir.

Esterleri arasında film ve fiber oluşturan selüloz asetat ve selüloz triasetat’ın birçok

kullanım alanı vardır. Inorganik ester olan nitroselüloz önceleri bir patlayıcı olarak

kullanılırdı. Selülozun eter türevleri ise etilselüloz, metilselüloz, hidroksipropil

selüloz, karboksimetil selüloz, hidroksipropil metil selüloz, hidroksietil metil selüloz

şeklinde adlandırılırlar.

Etil selüloz, kaplamalarda, mürekkeplerde, kontrollü ilaç salınım

tabletlerinde kullanılan suda çözünmez ticari termoplastikdir.

183

Metil selüloz, soğuk suda çözünebilen ve jel yada şeffaf viskoz solusyon

oluşturabilen hidrofilik selüloz türevidir. Birçok gıda ve kozmetik ürün içerisinde

yoğunlaştırıcı olarak kullanılır, allerjik ya da toksik değildir. Emülsiyon etkisi ile

karışımdaki iki sıvının birbirlerinden ayrılmasını önler.

Hidroksipropil selüloz, hem suda hem de organic çözünürlüğü olan bir

selüloz türevidir. Hidrofilik ve hidrofobik gruplara sahip olmasından dolayı düşük

kritik çözünürlük sıcaklığına sahiptir. Diğer bir ifade ile 45°C nin altında çözünürken

bu sıcaklığın üzerinde çözünmez. Klinik uygulamalarda yapay gözyaşı oluşturma,

gıda katkı maddesi olarak ise kıvam artırıcı ve emülsiyon ajanı şeklinde gıda katkı

maddesi olarak kullanılır.

Karboksimetil selüloz (CMC), omurgayı oluşturan glikoz birimlerinin

hidroksil gruplarının bazılarına karboksimetil gruplarının bağlanması ile oluşan bir

selüloz türevidir. Kloroacetik asit ile selülozun alkali olarak katalizlenen reaksiyonu

ile sentezlenir. Gıda endüstrisinde ve kozmetik sanayinde kullanılır.

Hidroksipropil metil selüloz viskozite düzenleyicisi, jel, köpük ve dolgu

maddesi olarak kullanılır.

Hidroksietil metil selüloz ise selüloz film üretiminde kullanılmaktadır.

184

Ek 3

Ksilan (Xylan)

Ksilan, β-1,4 bağları ile bağlanmış ksilopiranosil birimlerinden oluşan bitki

hücre duvarlarında ana bileşen ve doğadaki en çok bulunan ikinci polisakkarittir.

Ksilan, hemiselülozun yapısında mannan, galaktan ve arabinanın yanısıra ana bileşen

olarak yer alır. Selüloz ve lignin ile beraber hemiselüloz yapısına katılan bir bileşen

olarak bitki hücre duvarlarının ana kompozisyonunu oluştururlar. Hücre duvarı

yapısında bu üç bileşen kovalent ya da non-kovalent bağlarla bir ilişki halindedirler.

Ksilanın ya da hemiselülozun lignin ve selüloz arasına yerleşmesi selülozun

bütünleşmesinin devamı ve selülaz degredasyonuna karşı liflerin korunması

açısından önemlidir (Beg ve ark, 2001).

Ksilan, ksiloz birimlerinin β-1,4 glikozidik bağlarla bağlanması ile oluşan bir

omurgayı içeren kompleks bir polisakkarit olup ana zincir β-Ksilopiranoz (β-

xylopyranose) birimlerinden oluşur. Sert odunlu bitkilerdeki ksilan 0-asetil-4-0-

metilglukuronoksilan (0-acetyl-4-0-methylglucuronoxylan) dır. Bu polisakkarit 70 β-

ksilopiranoz biriminden oluşur ve β-1,4 glikosidik bağlarla bağlıdır. Her 10 ksiloz

biriminde bir ksiloz biriminin 2 numaralı karbonuna bir 4-0-metilglukuronik asit

bağlanmıştır. Sert odunlu ksilanlar yüksek oranda asetilleşmiştir. Örneğin huş ağacı

ksilanı 2 mol ksiloz başına 1 mol asetik asit içerir. Asetilasyon 2 numaralı karbondan

(C-2) daha çok 3 numaralı karbonda (C-3 ) gerçekleşmektedir. Bu asetil grupların

varlığı ksilanın su içinde kısmi çözünmesinden sorumludur. Eğer ksilan alkali

ekstraksiyona maruz bırakılırsa asetil gruplar kolayca yapıdan uzaklaştırılabilir

(Sunna ve Antranikian, 1997). Yumuşak odunlulardaki ksilan ise arabino-4-0-

metilglukuroksilandan oluşur. Sert odunlulardan daha yüksek oranda 4-0-

metilglukuronik asit içeriğine sahiptir. Bunlar 2 numaralı karbon atomunda (C-2)

yerleşmişlerdir. Sert odunlulardakinin aksine yumuşak odunlulardaki ksilan

asetillenmemiştir. Bunun yerine α-L-arabinofuranoz üniteleri ksilozun 3 numaralı

karbon (C-3) atomuna α-1,3 glikozidik bağlarla bağlanmıştır (Puls ve

Schuseil,1993). Bu arabinozil eklentileri ksiloz birimlerinin hemen hemen %12 sinde

görülür (Wong ve ark, 1988). β-D-ksilopiranoz, 4-0-metil -α-D-glukuronik asit ve L-

arabinofuranoz oranı 100:20:13 dür. Ksilanların çoğu ana ve yan zincirlerinde

185

değişen grupları içeren bir heteropolisakkarit olarak bulunur. Ksilanın ana

omurgasındaki yaygın yer alan radikal gruplar asetil, arabinosil ve glukuronisil

birimleridir.

Diğer taraftan, oransal olarak ksiloz birimlerince zengin ksilanlar da vardır ve

bunlar Homoksilan adını alır. Bu tip ksilanlar doğada çok yaygın olmayıp bazı

çimenler, tütün sapları ve tohum kapçıklarından izole edilmişlerdir.

Şekil Ek 3.1: Ksilanaz Yapısı (Kulkarni ve ark,1999)

186

EK-4 İnce Tabaka Kromatografisi Plakalarının Hazırlanması

Şekil Ek 4.1: Cam Plakaların

Yerleştirilmesi Şekil Ek 4.2: Silika Jel karışımının

Hazırlanması

Şekil Ek 4.3:Silika Jel Karışımının

Yayma Aparatına Dökülmesi Şekil Ek 4.4: Silika Jelin Cam Plakalar

Üzerine Yayılması

Şekil Ek 4.5: Kuruyan Plakaların

Magazine Yerleştirilmesi Şekil Ek 4.6: Plakaların Dikey

Pozisyonda Aktivasyon için Fırına Yerleştirilmesi

Şekil Ek 4.7: İnce Tabaka Kromatografisinin Uygulanması

Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ …ph 10.5’da gösterirken, 0.5-3.4m...

Documents