uji sitotoksisitas ekstrak spons laut aaptos...
TRANSCRIPT
Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides
Terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Secara In Vitro
SIDANG TUGAS AKHIR
Hani Tenia Fadjri 1506 100 017
DOSEN PEMBIMBING:
Awik Puji Dyah Nurhayati, S.si, M.Si Prof. Dr. Drs. Sukardiman. Apt. M.Sc.
Latar Belakang
Tiga besar kanker yang melanda wanita Indonesia:
Kanker serviks, Kanker payudara, Kanker colon
(Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002 dalam
Heti, 2008)
Existing condition of antineoplastik:
Kemoterapi: menimbulkan efek samping
Pembedahan : tidak dapat dilakukan jika telah metastesis
Alternatif: Herbal Spons Menghasilkan Metabolit Sekunder
Aaptos suberitoides berpotensi sebagai obat antikanker
aaptamin
(Nurhayati et al, 2008).
Aaptamin (alkaloid)
berpotensi sebagai obat anti
kanker
Uji in vivo Brine Shrimp Lethality Test (BST)
LC50 sebesar 134 ± 36.6 ppm (Nurhayati et al., 2008).
Uji Sitotoksisitas
Potensi Sitotoksik ekstrak spons laut
A. suberitoides.
Coutinho, 2002; Tsukamoto, 2010
Mengetahui aktivitas
Aaptos suberitoides
dalam menghambat
pertumbuhan sel-sel
kanker
BST
(Studi pendahuluan)
Aaptos suberitoides
memiliki senyawa
bioaktif paling potensial
untuk antikanker dengan
nilai LC50 134.1362 ±
36.6114 ppm
Bagaimana mengukur
kemampuan ekstrak
spons Aaptos suberitoides
dalam menghambat
pertumbuhan sel kanker
HeLa
Sitotoksisitas in
vivo
Sitotoksisitas in
vitro
??
Permasalahan
Uji apoptosis sel jumlah sel hidup dan sel yang mengalami apoptosis dimana sel
hidup tampak berwarna hijau sedangkan sel yang mengalami
apoptosis berwarna orange
Manfaat
Sebagai dasar pengembangan dalam upaya pemanfaatan sumber daya hayati laut di Jawa Timur
Sebagai produk farmasi untuk
dasar pengembangan obat antikanker
baru
untuk melakukan evaluasi in vitro toksisitas ekstrak spons laut Aaptosis suberitoides terhadap pertumbuhan
sel kanker serviks (HeLa)
Skema Kerja
4
3
2
1
Pembuatan Medium Kultur (Penumbuh) RPMI 1640
Penentuan Konsentrasi Eksrtrak spons dan cisplatin
Propagasi Sel HeLa
Pemanenan Sel Kanker
Doubling
Time
Uji Sitotoksisitas MTT
Tabel Hasil uji sitotoksisitas ekstrak terhadap sel kanker menggunakan metode MTT
Konsentrasi sampel
(µg/mL) ABSORBANSI
TOTAL RERATA (C ) A-B C-B % mati 1 2 3
7.5 1.092 1.111 1.139 3.342 1.114 0.864 0.709 17.940 15 1.105 1.149 1.085 3.339 1.113 0.708 18.056 30 1.150 1.097 1.071 3.318 1.106 0.701 18.866 60 1.120 1.073 1.064 3.257 1.086 0.681 21.219 120 1.036 1.054 1.021 3.111 1.037 0.632 26.852 240 0.959 1.033 0.926 2.918 0.973 0.568 34.298 480 0.744 0.802 0.755 2.301 0.767 0.362 58.102 960 0.432 0.432 0.433 1.297 0.432 0.027 96.836 1440 0.423 0.431 0.430 1.284 0.428 0.023 97.338 1920 0.502 0.46 0.495 1.457 0.486 0.081 90.664
K.SEL (A) 1.299 1.264 1.244 3.807 1.269
K.MEDIA (B) 0.407 0.405 0.402 1.214 0.405
Tabel Hasil uji sitotoksisitas Cisplatin terhadap
sel kanker menggunakan metode MTT
Konsentrasi
Cisplatin
(µg/mL)
Absorbansi Total Rerata
(C ) A-B C-B % Mati 1 2 3
2 1.254 1.173 1.18 3.607 1.202 1.056 0.915 13.321
4 1.17 1.135 1.107 3.412 1.137 0.850 19.476
8 1.071 1.09 1.036 3.197 1.066 0.779 26.263
16 0.687 0.688 0.654 2.029 0.676 0.389 63.131
K.SEL (A) 1.374 1.335 1.321 4.03 1.343
K.MEDIA (B) 0.264 0.288 0.31 0.862 0.287
Hasil uji doubling time dengan perlakuan ekstrak spons A. suberitoides terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi
Waktu
Inkubasi
(Jam)
Konsentrasi sampel
(µg/mL)
Absorbansi Total Rerata
(C ) A-B C-B % Hidup 1 2 3
24
134 0.823 0.819 0.846 2.488 0.829 0.954 0.501 52.551 67 0.841 0.879 0.852 2.572 0.857 0.529 55.486
33.5 0.953 0.930 0.892 2.775 0.925 0.597 62.579 K.SEL (A) 1.244 1.289 1.313 3.846 1.282
K.MEDIA (B) 0.328 0.329 0.327 0.984 0.328
48
134 0.769 0.725 0.736 2.230 0.743 1.019 0.390 38.306 67 0.924 0.869 0.871 2.664 0.888 0.535 52.502
33.5 0.926 0.888 0.934 2.748 0.916 0.563 55.250 K.SEL (A) 1.346 1.372 1.397 4.115 1.372
K.MEDIA (B) 0.352 0.356 0.350 1.058 0.353
72
134 0.819 0.800 0.814 2.433 0.811 1.128 0.413 36.613 67 0.991 0.990 0.972 2.953 0.984 0.586 51.980
33.5 1.008 0.999 0.965 2.972 0.991 0.593 52.541 K.SEL (A) 1.539 1.524 1.515 4.578 1.526
K.MEDIA (B) 0.394 0.390 0.410 1.194 0.398
Hasil uji doubling time dengan perlakuan cisplatin terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi
Waktu Inkubasi (jam) Konsentrasi
sampel (µg/mL) ABSORBANSI
TOTAL RERATA
(C ) A-B C-B % hidup 1 2 3
24
13.062 0.923 0.883 0.900 2.706 0.902 0.958 0.484 50.522 6.531 0.954 0.927 0.896 2.777 0.926 0.508 52.992
3.2655 0.960 0.917 0.916 2.793 0.931 0.513 53.549 K.SEL (A) 1.378 1.333 1.416 4.127 1.376
K.MEDIA (B) 0.399 0.409 0.446 1.254 0.418
48
13.062 0.852 0.813 0.836 2.501 0.834 0.991 0.497 50.118 6.531 0.890 0.798 0.805 2.493 0.831 0.494 49.849
3.2655 0.837 0.843 0.839 2.519 0.840 0.503 50.723 K.SEL (A) 1.33 1.33 1.323 3.983 1.328
K.MEDIA (B) 0.335 0.329 0.346 1.010 0.337
72
13.062 0.786 0.721 0.682 2.189 0.730 1.052 0.395 37.516 6.531 0.894 0.806 0.855 2.555 0.852 0.517 49.113
3.2655 0.959 0.822 0.832 2.613 0.871 0.536 50.951 K.SEL (A) 1.391 1.393 1.377 4.161 1.387
K.MEDIA (B) 0.33 0.328 0.347 1.005 0.335
Hasil uji doubling time dengan perlakuan DMSO terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi
Waktu
Inkubasi (jam) Persentase DMSO
(%) Absorbansi
TOTAL RERATA
(C ) A-B C-B % hidup 1 2 3
24
0.067 1.269 1.33 1.315 3.914 1.305 0.958 0.887 92.554 0.033 1.294 1.279 1.332 3.905 1.302 0.884 92.241 0.017 1.356 1.324 1.367 4.047 1.349 0.931 97.182
K.SEL (A) 1.378 1.333 1.416 4.127 1.376 K.MEDIA (B) 0.446 0.409 0.399 1.254 0.418
48
0.067 1.217 1.244 1.291 3.752 1.251 0.960 0.914 0.952 0.033 1.241 1.238 1.301 3.780 1.260 0.923 0.961 0.017 1.241 1.278 1.337 3.856 1.285 0.948 0.988
K.SEL (A) 1.293 1.275 1.323 3.891 1.297 K.MEDIA (B) 0.335 0.329 0.346 1.010 0.337
72
0.067 1.255 1.251 1.302 3.808 1.269 1.052 0.934 88.815 0.033 1.303 1.292 1.283 3.878 1.293 0.958 91.033 0.017 1.362 1.381 1.364 4.107 1.369 1.034 98.289
K.SEL (A) 1.391 1.393 1.377 4.161 1.387 K.MEDIA (B) 0.33 0.328 0.347 1.005 0.335
HASIL PENELITIAN
Persentase kematian sel HeLa kemudian dikonversikan ke dalam table probit
dibuat grafik regresi linier antara log konsentrasi sampel uji dengan persen kematian sel, sehingga dapat dihitung LC50
Nilai LC50 pada uji sitotoksisitas dengan metode MTT adalah 133.968 µg/mL.
sesuai dengan pendapat Meyer et al., 1982 yang menyatakan bahwa suatu senyawa bersifat sitotoksik jika mempunyai LC50 lebih kecil dari 1000 µg/mL
kadar DMSO tidak akan berpengaruh terhadap persen kematian sel pada seri kadar yang lain di bawah ekstrak seri ke-8 yaitu dibawah kadar DMSO 0,475 %.
Sebagai kontrol positif digunakan Cisplatin. Cisplatin atau Cisplatinum atau cis diamminedichloroplatinum (II) adalah obat kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum. Cisplatin merupakan pilihan pertama obat yang digunakan dalam terapi karsinome serviks (Rose, 2006).
Grafik Regresi Linier Nilai Probit Ekstrak dan Cisplatin
Sitotoksisitas Cisplatin terhadap Sel Hela
y = 1.734x + 3.065
R2 = 0.9242
0
1
2
3
4
5
6
0.0 0.5 1.0 1.5
log konsentrasi
pro
bit
HeLa
y = 1.2287x + 2.3877
R2 = 0.7825
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
log konsentrasi
pro
bit
cisplatin Ekstrak Spons A. suberitoides Perhitungan LC50 Y = 1,228x + 2,387 5 = 1,228x + 2,387 1.228x = 2,613 X = 2,12785 Antilog 2,12785 = 133,967 LC50 = 133,967 µg/mL
Perhitungan LC50 Y = 1,734x + 3,065 antilog 1,115917 = 5 = 1,734x + 3,065 LC50 = 13,062 µg/mL 1,734x = 1,935 x = 1,115917
Proses Pewarnaan Apoptosis
Integritas membran sel tetap utuh
Interaksi sel dengan ekstrak atau cisplatin selama inkubasi
Terwarnai oleh acridine orange (hijau)
acridine orange dengan gugus kationnya Mampu berinteraksi dengan DNA yang bersifat anionik
Sel hidup Sel mati
Membran sel tidak mampu ditembus oleh ethidium bromide Membran sel mampu ditembus oleh ethidium bromide
Terjadi penurunan integritas membran
Permeabilitas menurun Permeabilitas tetap utuh
Membentuk garam terdisosiasi
Hijau
Inti sel terwarnai
Sel nekrosis Sel apoptosis
Berwarna orange dan bentuk inti sel normal
Inti sel Berwarna orange Terfragmentasi dan
terkondensasi
Mekanisme Kerja Ekstrak Terhadap Sel Kanker
senyawa aaptamin yang terkandung dalam ekstrak di lingkungan sel
restriction point pada fase G1
Pada kanker serviks (sel HeLa) mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7.
E6 akan berikatan dengan p53 untuk mendegradasi p53 sehingga sel tidak mengalami apoptosis
Dengan Pemberian Ekstrak
Protein 21 tidak mengaktifasi kompleks cyclin D/cdk 4,6 sehingga mencegah fosforilasi protein Rb
E7 berikatan dengan pRb yang menyebabkan sel berproliferasi terus-menerus
menginduksi ekspresi dari protein p21 induksi ekspresi protein p21
menahan siklus sel fase G2/M
berperan seperti cyclin/ cdk inhibitor di bawah control gen p53 kerusakan DNA
Perbaikan DNA gen p53 memicu terjadinya apoptosis