uji endotoksin sediaan injeksi intravena natrium klorida
DESCRIPTION
aaaaaaaTRANSCRIPT
-
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
28
UJI ENDOTOKSIN SEDIAAN INJEKSI INTRAVENA NATRIUM KLORIDA DENGAN METODE GEL-CLOT
Insan Sunan Kurniawan Syah, Sohadi Warya, Yessy Christina Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran
ABSTRAK
Endotoksin merupakan bagian kompleks lipopolisakarida membran bakteri Gram negatif yang dapat menyebabkan reaksi pirogenik. Uji Limulus Amebocyte Lysate (LAL) metode gel-clot telah banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan endotoksin dalam sediaan parenteral. Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan kadar endotoksin pada sediaan injeksi natrium klorida 0,9% yang dibuat dengan menggunakan karbon aktif sebagai penjerap endotoksin dan tanpa karbon aktif. LAL yang digunakan adalah Pyrotell Single Test Vial (STV) yang memiliki sensitivitas 0,25 EU/mL. Sebagai pembanding dilakukan pengujian terhadap standar kontrol endotoksin 0,5 EU/mL sebagai kontrol positif dan LAL Reagent Water (LRW) sebagai kontrol negatif. Dari pengujian sampel didapatkan hasil negatif tetapi dengan konsistensi gel yang berbeda. Hal ini membuktikan bahwa karbon aktif berpengaruh terhadap pembebasan endotoksin.
Kata kunci : endotoksin, injeksi natrium klorida, metode gel-clot
ABSTRACT
Endotoxin is part of lipopolysaccharide complex from Gram negative bacteria membran that can cause pyrogenic reaction. The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) gel-clot method assay have been used for detection of endotoxin in parenteral preparation. This research was done to compare endotoxin content of preparations of sodium chloride injection 0,9% made by using activated carbon as endotoxin adsorbent and without activated carbon. LAL which used is Pyrotell Single Test Vial (STV) with sensitivity 0,25 EU/mL. As comparator, the examination to endotoxin control standar 0,5 EU/mL as positive control and LAL Reagent Water (LRW) as negative control was done. From examination samples, was got negative result but with different gel consistency. This showed that activated carbon have influence to Iiberation of endotoxin.
Key words : endotoxin, sodium chloride injection, gel-clot method
-
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009
29
PENDAHULUAN Suplai larutan steril bertakaran besar
pada manusia secara intravena kadangkadang muncul reaksi demam tinggi, yang disertai rasa menggigil, cemas, kesulitan bernafas, lemahnya peredaran darah, nyeri
kepala, dan nyeri bagian tubuh. Pada hipertermi ini mulamula akan terjadi leukopeni (pengurangan jumlah leukosit) dan belakangan menjadi leukositosis (Voigt, 1995).
Salah satu syarat dari sediaan injeksi intravena ialah harus bebas pirogen (Ansel, 1989). Pirogen adalah senyawa molekular tinggi, yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida, yang diproduksi kirakira 5 10% dari masa total bakteri (Voigt, 1995). Pirogen dari satu sediaan dapat dihilangkan dengan cara adsorpsi, diantaranya dengan menggunakan karbon
aktif 0,1 0,3 % b/v. Namun demikian karbon aktif tersebut selain mengadsorpsi
pirogen, juga mengadsorpsi zatzat terkandung dalam larutan itu sendiri (ChemicaCom, 2006).
Untuk menjamin tidak adanya pirogen dalam sediaan injeksi intravena volume besar maka dilakukan uji pirogen. Uji pirogen menggunakan kelinci dilakukan dengan cara menginjeksikan larutan sediaan steril secara intravena, kemudian diukur peningkatan suhu tubuh kelinci
melalui rektal (Departemen Kesehatan RI, 1995).
Metode yang lebih baik adalah uji in vitro yang telah memiliki tingkat
sensitivitas lebih tinggi dari pada uji pirogen kelinci yaitu uji LAL (Limulus Amoebocyte Lysate). Uji ini menggunakan ekstrak cair dari Limulus polyphemus (kepiting ekor tapal kuda) untuk mendeteksi tingkat endotoksin bakterial
dalam sampel. Tiga jenis metode uji endotoksin (metode bekuan gel, metode turbidimetri, metode kromogenik) telah dijelaskan dalam British Pharmacopoeia untuk evaluasi akhir konsentrasi
endotoksin dalam suatu produk steril
(Department of Health, 1980). Metode yang digunakan dalam
penelitian ini adalah metode bekuan gel (Gel-Clot Method). Metode bekuan gel melibatkan penggunaan pembekuan protein yang dipotong pada suatu enzim
pembekuan aktif, dimana bagian tidak larut produk membentuk gel. Walaupun reaksi
keseluruhan belum ditemukan, dapat dimengerti bahwa reaksi pembentukan bekuan diaktivasi oleh enzim tertentu (Joiner, et al., 2002).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan endotoksin yang
masih tersisa dalam sediaan injeksi intravena natrium klorida setelah dibebaskan dengan karbon aktif, menggunakan metode gel-clot.
-
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
30
METODE PENELITIAN Alat-alat yang digunakan dalam uji
endotoksin ini antara lain botol infus, alat gelas yang lazim, inkubator (Memmert), Laminar Air Flow (LAF) cabinet (MinihelicII Zero 0), mikropipet (Finnpipette Campus S69054), otoklaf (MC 03000011), oven (Heraeus RT360), pencampur vortex (VM 300), syringe steril (York), dan timbangan analitik digital (Mettler Toledo).
Bahan-bahan yang digunakan dalam uji endotoksin ini antara lain alkohol 70%
(Nurfarindo), aqua pro injectionum bidestilata bebas pirogen (PT. Ikapharmindo Putramas), indikator pH universal (Merck), karbon aktif (Shirasagi), natrium klorida (Merck), LAL Reagent Water (Associates of Cape Cod Incorporated), Pyrotell Limulus Amebocyte Lysate (Associates of Cape Cod Incorporated), Pyrosol Reconstitution Buffer (Associates of Cape Cod Incorporated), dan Standar Kontrol Endotoksin (Associates of Cape Cod Incorporated). Tahapan kerjanya adalah sebagai berikut : 1. Penyiapan Alat dan Bahan
Seluruh alat yang digunakan dibungkus
menggunakan kertas perkamen kemudian disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121C selama 15 menit. Setelah itu, alat kualitatif yang telah disterilisasi
dimasukan ke dalam oven dengan suhu
250C selama 30 menit atau 200C selama 1 jam. 2. Formulasi
Sediaan yang akan diuji pada penelitian ini adalah injeksi natrium klorida 0,9%. Injeksi natrium klorida dibuat sendiri di laboratorium dengan
menggunakan formula berdasarkan Formularium Nasional edisi II tahun 1978 dimana tiap 100 mL injeksi mengandung natrium klorida sebanyak 0,9 gram. 3. Pembuatan Injeksi Natrium Klorida
Injeksi natrium klorida yang dibuat 2 sediaan, yaitu dengan menggunakan karbon aktif dan tanpa karbon aktif.
Volume yang dibuat untuk masing-masing sediaan adalah 120 mL. a. Pembuatan sediaan injeksi intravena
NaCl 0,9% tanpa karbon aktif. Natrium klorida ditimbang sebanyak 1,08 gram kemudian dilarutkan dalam
sebagian aqua pro injectionum. Larutan ditambahkan aqua pro injectionum hingga mendekati volume akhir lalu cek pH larutan. Larutan
ditambahkan aqua pro injectionum hingga 120 mL dan disaring
menggunakan kertas saring, filtrat
pertama dibuang. Larutan injeksi yang telah dibuat dimasukkan dalam botol infus sebanyak 102 mL, kemudian tutup dan disterilisasi dalam otoklaf 1210C selama 15 menit.
b. Pembuatan sediaan injeksi intravena NaCl 0,9% dengan karbon aktif 0,1%.
-
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009
31
Ditimbang natrium klorida sebanyak 1,134 gram dan karbon aktif sebanyak
0,12 gram. Natrium klorida dilarutkan dalam sebagian aqua pro injectionum kemudian ditambah aqua pro injectionum hingga mendekati volume akhir dan pH larutan dicek. Larutan ditambahkan aqua pro injectionum hingga 120 mL dan ditambahkan karbon aktif kemudian dipanaskan sampai suhu 600 700C sambil diaduk selama 15 menit. Larutan disaring panas-panas menggunakan kertas
saring, filtrat pertama dibuang. Filtrat
yang telah disaring ditampung dalam botol infus sebanyak 102 mL, kemudian tutup dan disterilisasi dalam otoklaf 1210C selama 15 menit.
4. Penyiapan Endotoksin dan LAL a. Penyiapan Endotoksin
Standar kontrol endotoksin yang tersedia adalah 2500 EU/vial. Sebanyak 10 mL LAL Reagent Water dimasukkan ke dalam vial endotoksin sehingga diperoleh endotoksin 250 EU/mL. Kemudian dilakukan
pengenceran endotoksin sebagai berikut :
1. Endotoksin 25 EU/mL Sebanyak 1 mL endotoksin 250 EU/mL ditambah dengan 9 mL LAL Reagent Water (LRW).
2. Endotoksin 2,5 EU/mL
Sebanyak 1 mL endotoksin 25 EU/mL ditambah dengan 9 mL LRW. 3. Endotoksin 0,5 EU/mL
Sebanyak 1 mL endotoksin 2,5 EU/mL ditambah dengan 4 mL LRW.
b. Penyiapan LAL
Pereaksi LAL yang digunakan dalam penelitian ini adalah Pyrotell LAL
Single Test Vial yang hanya dapat digunakan untuk sekali pakai. Sensitivitas dari LAL ini adalah sebesar 0,25 EU/mL. Vial yang berisi LAL dapat langsung digunakan untuk menguji endotoksin dalam sediaan injeksi natrium klorida yang telah dibuat.
5. Prosedur Metode Gel-Clot a. Kontrol positif
Penelitian dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF). Pyrosol Reconstitution Buffer dimasukkan ke dalam larutan endotoksin 0,5 EU/mL sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh pH dengan rentang 6-8 . Kemudian larutan endotoksin yang telah ditambah buffer diambil sebanyak 0,2 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam Pyrotell LAL
Single Test Vial (STV). Campuran dalam vial dikocok menggunakan pencampur vortex selama 1-2 detik, kemudian vial dimasukkan ke dalam
inkubator dan diinkubasi pada suhu 371oC selama 602 menit.
-
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
32
b. Kontrol Negatif
Pyrosol Reconstitution Buffer dimasukkan ke dalam LAL Reagent Water (LRW) sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh pH dengan rentang 6-8 . Kemudian LRW yang telah diberi buffer diambil sebanyak 0,2 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam Pyrotell LAL
Single Test Vial. Campuran dalam vial dikocok menggunakan pencampur vortex selama 1-2 detik, kemudian vial dimasukkan ke dalam inkubator dan
diinkubasi pada suhu 371oC selama 602 menit.
c. Pengujian Sediaan Injeksi Intravena Natrium Klorida 0,9%
Pyrosol Reconstitution Buffer dimasukkan ke dalam sediaan injeksi natrium klorida sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh pH dengan rentang 6-8 . Kemudian larutan uji yang telah ditambah buffer diambil sebanyak 0,2 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam Pyrotell LAL Single Test Vial. Campuran dalam vial dikocok menggunakan pencampur
vortex selama 1-2 detik kemudian vial dimasukkan ke dalam inkubator dan
diinkubasi pada suhu 371oC selama 602 menit. Prosedur ini dilakukan untuk kedua sediaan, yaitu injeksi natrium klorida dengan karbon aktif
dan tanpa karbon aktif.
6. Penafsiran Hasil Setelah proses inkubasi selesai, STV
dikeluarkan dari dalam inkubator. Kemudian diamati apakah di dasar STV tersebut terbentuk gel atau tidak. STV dibalik 180o secara perlahan dan dilihat apakah gel yang terbentuk di dasar STV
jatuh atau tidak.
HASIL PEMBAHASAN 1. Pengujian Endotoksin Kontrol
Positif Dari pengujian standar kontrol
endotoksin 0,5 EU/mL dengan menggunakan LAL Pyrotell Single Test Vial (STV) didapatkan hasil gel yang kompak. Gel yang terbentuk tidak tumpah ketika STV diputar sampai terbalik 180o. Hasil diperlihatkan pada gambar di bawah
ini :
Gambar 1. Hasil Pengujian Endotoksin Kontrol Positif
Seperti yang tertera pada USP, standar kontrol endotoksin yang digunakan untuk
kontrol positif adalah dua kali sensitivitas LAL yang digunakan (2). Sensitivitas ini merupakan batas konsentrasi endotoksin
-
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009
33
yang dapat terdeteksi oleh LAL Pyrotell STV . Menurut Guidance for Industry yang dikeluarkan oleh US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration (FDA), salah satu persyaratan sediaan injeksi volume besar memiliki batas toleransi endotoksin sebesar 0,25 EU/mL. Reaksi positif terjadi karena bakteri Gram negatif (endotoksin dari Escherichia coli) mengkatalisis aktivitas proenzim dalam pereaksi LAL Pyrotell STV. Enzim yang diaktivasi
(koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik pada protein penggumpal (koagulogen) yang terdapat dalam pereaksi LAL menjadi bagian yang larut dan tidak larut (koagulin). Bagian tidak larut ini yang membentuk gel. Pada saat vial dibalikkan tidak boleh ada guncangan karena gel yang terbentuk sangat sensitif dan mudah rusak
sehingga hasil yang seharusnya positif
menjadi negatif. Hasil yang positif menunjukkan bahwa kadar endotoksin yang digunakan lebih besar dari sensitivitas LAL.
2. Pengujian Endotoksin Kontrol Negatif
Dari pengujian LAL Reagent Water (LRW) bebas endotoksin dengan menggunakan STV didapatkan hasil yaitu tidak terbentuknya gel. Larutan langsung tumpah ketika STV diputar sampai terbalik
180o. Hasil diperlihatkan pada gambar di bawah ini :
Gambar 2. Hasil Pengujian Endotoksin Kontrol Negatif
Hasil yang negatif disebabkan karena tidak adanya endotoksin dalam LRW. Hal
tersebut menunjukkan bahwa LRW yang digunakan memenuhi persyaratan untuk digunakan dalam pengujian LAL.
Hasil kontrol positif dan kontrol
negatif digunakan sebagai pembanding hasil pengujian endotoksin terhadap injeksi natrium klorida yang dibuat tanpa karbon aktif dan dengan karbon aktif.
3. Pengujian Endotoksin Injeksi Natrium Klorida 0,9% Tanpa Karbon Aktif
Dari hasil pengujian sampel dengan menggunakan STV didapatkan gel yang
tidak sempurna. Gel yang terbentuk tumpah secara perlahan ketika STV diputar
sampai terbalik 180o.
-
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
34
Gambar 3. Hasil Pengujian Endotoksin Injeksi Natrium
Klorida 0,9% Tanpa Karbon Aktif Dari gambar 3. dapat dilihat hasil yang
negatif tetapi terbentuk gel yang tidak sempurna. Gel yang terbentuk jatuh secara perlahan ketika vial dibalikkan. Hasil tersebut menunjukkan bahwa di dalam larutan uji terdapat endotoksin yang mengaktivasi enzim membentuk gel, tetapi kadar endotoksin dalam larutan uji berada di bawah sensitivitas pirotel. Hasil yang negatif menunjukkan bahwa kadar endotoksin dalam larutan uji kurang dari sensitivitas STV (0,25 EU/mL). 4. Pengujian Endotoksin Injeksi
Natrium Klorida 0,9% dengan Karbon Aktif Dari pengujian sampel dengan
menggunakan STV didapatkan hasil yaitu
tidak terbentuknya gel. Larutan langsung tumpah ketika STV diputar sampai terbalik 180o. Hasil ditunjukkan pada gambar di bawah ini :
Gambar 4. Hasil Pengujian Endotoksin Injeksi Natrium Klorida 0,9% dengan Karbon Aktif
Dari gambar 4. dapat dilihat hasil yang negatif, ditandai dengan tidak terbentuknya gel. Hasil pengujian jatuh secara langsung ketika vial dibalikkan. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kadar endotoksin dalam larutan uji kurang dari sensitivitas STV.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa :
1. Pengujian endotoksin kontrol positif dengan penambahan standar kontrol endotoksin 0,5 EU/mL pada STV membentuk gel yang kompak. Hasil menunjukkan bahwa standar kontrol endotoksin memenuhi persyaratan.
2. Pengujian endotoksin kontrol negatif dengan penambahan LAL Reagent Water (LRW) pada STV tidak membentuk gel. Hasil menunjukkan bahwa dalam LRW tidak mengandung
endotoksin.
-
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009
35
3. Pengujian endotoksin pada injeksi natrium klorida tanpa karbon aktif,
menghasilkan pembentukan gel yang tidak kompak. Hal ini menunjukkan masih terdapat endotoksin dengan konsentrasi yang lebih kecil daripada
sensitivitas STV. 4. Pengujian endotoksin pada injeksi
natrium klorida dengan karbon aktif, tidak menghasilkan pembentukan gel. Hal ini menunjukkan bahwa dalam larutan uji tidak terdapat endotoksin
dan membuktikan efek karbon aktif terhadap pembebasan endotoksin
dalam sediaan yang dibuat.
Saran Pada penelitian selanjutnya disarankan : 1. Penggunaan metode lain yang lebih
baik dalam pembebasan endotoksin.
2. Penggunaan cara pengujian lain dalam mendeteksi endotoksin, seperti uji Neutrophil Chemiluminescence.
DAFTAR PUSTAKA
Akers, M. J. 1994. Parenteral Quality Control. 2nd Edition. New York : Marcel Dekker, Inc. p. 101-147
Ansel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Penerjemah : Farida Ibrahim. Edisi ke-4. Jakarta : UI Press. hal. 399-400
ChemicaCom. 2006. Carbon Based Adsorbent. http:// www.chemica.com/ consultationsery.html. diakses tanggal 30 November 2006
Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi ke-4. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. hal. 300-301, 908-909
Department of Health. 1980. British Pharmacopeia. Volume II. London : Pharmaceutical Press. p. A222 A227
Joiner, T. J., Paul F. K., Thomas C. K., Ph.D. 2002. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. International Journal of Pharmaceutical Compounding. Volume 6. p. 408-409
Lukas, S. 2006. Formulasi Steril. C.V. Yogyakarta : Andi Offset. hal. 11-14, 81-98 Societys Department of Pharmaceutical Sciences. 1994. The Pharmaceutical Codex :
Principles and Practice of Pharmaceutics. 12th Edition. London : Pharmaceutical Press. p. 92-94
Suwandi, U., Drs. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyte Lysate.http://www.kalbefarma.com/files/cdk/files/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.pdf/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.html. diakses tanggal 12 April 2007
United States Pharmacopeial Convention. 2005. The United States Pharmacopeia 28 : The National Formulary 23. Volume III. Twinbrook Parkway : United States Pharmacopeial Convention, Inc. p. 2201
-
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
36
Voigt, R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Edisi ke-5. Penerjemah : Soendani NS dan Mathilda BW. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press. hal. 462 463