uji efek antiproliferatif campuran senyawa...
TRANSCRIPT
UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL
DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE
ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa
CELL LINE)
SKRIPSI
Diajukan Sebagai Tugas Akhir Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far).
OLEH
KIKI ZAKIAH
NIM : 107102001475
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
2011/1432 H
ii
LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI
NAMA : KIKI ZAKIAH
NIM : 107102001475
JUDUL : UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA
EUGENOL DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria
gambier, Roxb) DARI FASE ETIL ASETAT TERHADAP
KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa CELL LINE)
Disetujui oleh :
Pembimbing I Pembimbing II
Nurmeilis, M.Si, apt drg. Laifa Annisa H., Ph.D.
NIP:197404302005012003 NIP : 197804022009012003
Mengetahui,
Ketua Program Studi Farmasi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt
NIP : 1956010619851010001
iii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI
Skripsi dengan Judul
UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL
DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE
ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa
CELL LINE)
Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan dihadapan tim penguji oleh
Kiki Zakiah
NIM: 107102001475
Menyetujui,
Pembimbing:
1. Pembimbing I Nurmeilis, M.Si, Apt. ........................
2. Pembimbing II drg. Laifa Annisa H., PhD ........................
Penguji:
1. Ketua Penguji Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................
2. Anggota Penguji I Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................
3. Anggota Penguji II Ofa Suzanti Bheta, M.Si, Apt. ........................
4. Anggota Penguji III Drs. Ahmad Musir, M.Sc, Apt. ........................
Mengetahui,
Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Prof. Dr (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And
Tanggal lulus : 16 Desember 2011
iv
LEMBAR PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul:
UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL
DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE
ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa
CELL LINE)
Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tiggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkandari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.
Penulis
Kiki Zakiah
107102001475
v
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirrabil ‘alamin, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang
selalu melimpahkan rahmat, karunia, cinta dan kasihNya yang tidak terbatas
kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan
skripsi berjudul “Uji Efek Antiproliferatif Campuran Senyawa Eugenol dan Isolat
Katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dari Fase Etil Asetat Terhadap Kultur
Sel Kanker Serviks (HeLa cell line).
Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Bunda Nia Nurhamidah Romli, Ayah Muzimi Effendi, Sis Fetty Fatihatun N,
Syarief Muiz Abdillah dan Putri Khatami yang selalu memberikan kasih
sayang, doa, semangat dan dukungan baik moril maupun materil sehingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
2. Bapak Prof. Dr. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Bapak. Dr. M. Yanis Musdja M.Sc, Apt, selaku Ketua Jurusan Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
4. Ibu Nurmeilis, M.si, Apt, selaku pembimbing I yang tak bosan mengajarkan
dan membimbing penulis di segala kesempatan.
5. Ibu drg. Laifa Annisa H., Ph.D selaku pembimbing II yang juga telah
membimbing dan berbagi ilmu kepada penulis.
6. Bapak dan Ibu dosen yang tak hanya memberikan ilmu, hingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini, namun juga semangat dan teladan mulia. Semoga
Allah membalas kebaikanmu dengan pahala yang berlipat.
7. Bapak Kusmardi, MSc. yang telah berbaik hati memfasilitasi penulis dalam
pengerjaan penelitian di Laboratorium Patology FKUI-Salemba.
8. Para staf dan karyawan program studi yang telah banyak membantu selama
proses penelitian.
vi
9. Kepada sahabat seperjuangan penelitianku (RESONANSI) , Silfia Windy
Kusumadewi dan Dahlia Sari, Kepada sahabat Farmasi angkatan 2007
khususnya kelas A.
10. Kepada para senior, Ahmed Rizky F, Dea Arditia R, Ahmad Hariri, Raisani
Rusli, Dalilah Qisthina, Purnama Dwi T, dan semua yang tidak bisa
disebutkan satu persatu, terimakasih untuk setiap semangat dan masukan yang
berharga
11. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut
membantu menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini sangat jauh dari
sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat
penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.
Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil
penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi
mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.
Jakarta, Desember 2011
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL i
LEMBAR PERSETUJUAN ii
LEMBAR PENGESAHAN iii
LEMBAR PERNYATAAN iv
KATA PENGANTAR v
DAFTAR ISI vii
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN xi
ABSTRAK xii
ABSTRACT xiii
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang 1
1.2. Perumusan Masalah 4
1.3. Hipotesa 4
1.4. Tujuan Penelitian 4
1.5. Manfaat Penelitian 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Eugenol 5
2.1.1. Sifat Fisika dan kimia 5
2.1.2. Sumber Eugenol 6
2.1.3. Pemanfaatan Eugenol 6
2.2. Tanaman Gambir (Uncaria gambir Roxb.) 7
2.2.1. Klasifikasi Gambir (Uncaria gambir Roxb.) 7
2.2.2. Nama daerah 7
2.2.3. Uraiantanaman 8
2.2.4. Kandungan Kimia 8
2.2.5. ManfaatTumbuhan 8
2.2.6. Efekfarmakologis 9
2.2.7. Katekin 9
2.3. Simplisia 11
2.3.1. PengelolaanSimplisia 11
2.4. EkstrakdanEktraksi 14
2.4.1. Pengertian 14
2.4.2. Cara Pembuatan Ekstrak 15
2.4.3. Metode Ekstraksi 16
2.4.4. Parameter Ekstrak 18
2.5. Kanker 19
2.5.1. PengertianKanker 19
2.5.2. KankerServiks 21
2.6. HeLaCell Line 24
2.7. Antikanker 25
viii
2.7.1. Obatantikanker 25
2.7.2. MekanismeKerjaObatAntikanker 25
2.7.3. GolonganObatAntikanker 26
2.8. Cisplatin 30
2.9. KulturSel 32
2.10. UjiAntiproliferatif 35
2.10.1. MetodePengujianAntiproliferatif 35
2.11. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 36
2.12. PotensiPenelitian 37
2.13. KerangkaKonsepPenelitian 40
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 41
3.2. Alat dan Bahan Penelitian 41
3.2.1. AlatPenelitian 41
3.2.2. BahanPenelitian 42
3.3. Prosedur Penelitian 43
3.3.1. PenyiapanSimplisiaUji 43
3.3.2. IdentifikasiGambir 43
3.3.3. IdentifikasiCemaran Urea 43
3.3.4. Isolasi KatekinGambir 44
3.3.5. PenapisanFitokimia 44
3.3.6. PemeriksaanKatekin 48
3.3.7. SterilisasiAlat 50
3.3.8. PembuatanReagen 51
3.3.9. Persiapan LarutanUji 52
3.3.10. PersiapanKulturHeLaCell Line 53
3.3.11. PemeliharaanKulturHeLaCell Line 55
3.3.12. UjiAntiproliferatif 56
3.3.13. PerhitunganPersentaseKematianSel 57
3.4. Analisa Data 57
3.5. AlurPenelitian 58
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian 59
4.1.1. DeterminasidanSertifikasi 59
4.1.2. KarakteristikSimplisia&Senyawaujicampuran 59
4.1.3. JumlahKepadatanSel 60
4.1.4. UjiEfekAntiproliferatif 60
4.2. Pembahasan 66
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan 72
6.1. Saran 72
DAFTAR PUSTAKA 73
LAMPIRAN 82
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Konfigurasi Komponen Katekin ................................................. 10
Tabel 2. Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran .................. 59
Tabel 3. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 24 jam ................ 60
Tabel 4. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 48 jam ................ 61
Tabel 5. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 72 jam ................ 61
Tabel 6. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 24 jam .............. 61
Tabel 7. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 48 jam .............. 62
Tabel 8. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 72 jam .............. 62
Tabel 9. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia ...................................... 86
Tabel 10. Perhitungan Persentase Kadar Katekin Sampel .......................... 90
Tabel 11. Hasil Perhitungan Konsentrasi Sampel ....................................... 97
Tabel 12. Hasil Perhitungan Konsentrasi Cisplatin .................................... 98
Tabel 13. Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel Tiap Interval Waktu .... 102
Tabel 14. PengujianEfekAntiproliferatifCisplatin per Interval Waktu ....... 105
Tabel 15. PersenProbit ................................................................................ 111
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur Kimia Eugenol .......................................................... 5
Gambar 2. Struktur Dasar Katekin dan Galloyl Group......................... ... 10
Gambar 3. MTT direduksimenjadiFormazan ........................................... 36
Gambar 4. Eugenol ................................................................................... 85
Gambar 5. BongkahGambir...................................................................... 85
Gambar 6. SerbukGambir ............................................................... 85
Gambar 7. HasilIdentifikasi...................................................................... 85
Gambar 8. HasilUjiCemaran Urea ........................................................... 85
Gambar 9. SerbukKatekinSampel ............................................................ 85
Gambar 10. SerbukKatekinStandar ............................................................ 85
Gambar 11. Alat Haemocytometer ............................................................. 107
Gambar 12. Pemetaan Haemocytometer .................................................... 107
Gambar 13 Biology Safety Cabinet ........................................................... 108
Gambar 14. Incubator ................................................................................. 108
Gambar 15. Autoklaf .................................................................................. 108
Gambar 16. Microscope inverted .............................................................. 108
Gambar 17. Mikropipet............................................................................... 108
Gambar 18. Sentrifuge................................................................................ 108
Gambar 19. ELISA reader .......................................................................... 108
Gambar 20. T-Flask .................................................................................... 108
Gambar 21. Spektrometer ........................................................................... 108
Gambar 22. Micro well Plate...................................................................... 108
Gambar 23. Medium DMEM ..................................................................... 109
Gambar 24. DMSO ..................................................................................... 109
Gambar 25. Fetal Bovine Serum ................................................................ 109
Gambar 26. MTT ........................................................................................ 109
Gambar 27. Tripan Blue ............................................................................. 109
Gambar 28. Trypsin EDTA ........................................................................ 109
Gambar 29. Phospate Buffer ...................................................................... 109
Gambar 30. SosiumDuodecyl (SDS) .......................................................... 109
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil Determinasi Gambir ...................................................... 82
Lampiran 2. Sertifikasi Eugenol ................................................................. 83
Lampiran 3. Sertifikat Kemurnian Katekin Standar ................................... 84
Lampiran 4. Eugenol, Gambir dan Katekin ............................................... 85
Lampiran 5. Hasil Pengamatan Fitokimia ................................................... 86
Lampiran 6. Hasil Pengujian Karakteristik Katekin ................................... 87
Lampiran 7. Lanjutan (lampiran 6) ............................................................. 88
Lampiran 8. Hasil Penetapan Kadar Katekin .............................................. 89
Lampiran 9. Skema Proses Pembuatan Katekin Gambir ............................ 91
Lampiran 10. Skema Kerja Kultivasi sel HeLa ............................................ 92
Lampiran11.Skema Kerja Subkultivasi Sel HeLa ........................................ 93
Lampiran12.Uji MTT .................................................................................... 94
Lampiran13.PerhitunganKonsentrasiSampel ................................................ 95
Lampiran14.Lanjutan (lampiran 13)............... .............................................. 96
Lampiran15.Lanjutan (lampiran 13)............................. ................................ 97
Lampiran16.Perhitungan Konsentrasi Cisplatin ........................................... 98
Lampiran17.Perhitungan Kepadatan Sel ....................................................... 99
Lampiran 18. Skema Pemetaan Sumuran 96............................................... 100
Lampiran 19. Perhitungan IC50 Sampel........................................................ 102
Lampiran 20. Perhitungan IC50Cisplatin............................. ......................... 105
Lampiran 21. Pemetaan Haemocytometer................................ ................... 107
Lampiran22. Alat dan Bahan yang digunakan dalam penelitian .................. 108
Lampiran 23. Deskripsi Medium DMEM................................................ ..... 110
Lampiran 24. TabelTransformasiPersen-Probit......................................... .. 111
xii
ABSTRAK
Judul : Uji Efek Antiproliferatif Campuran Senyawa Eugenol dan Isolat Katekin
Gambir (Uncaria gambier Roxb) dari Fase Etil Asetat Terhadap Kultur
Sel Kanker Serviks (HeLa Cell Line)
Penelitian dilakukan untuk mengetahui efek antiproliferatif
campuran katekin gambir (Unicaria gambier, Roxb) dan eugenol terhadap
sel kanker HeLa secara in vitro. Katekin dari gambir (Unicaria gambier,
Roxb) dicampur dengan Eugenol menggunakan DMSO. Uji
antiproliferatif dilakukan melalui metode MTT assay, doubling time. Pada
MTT assay dan doubling time sel kanker HeLa dibedakan menjadi lima
kelompok perlakuan yakni sampel (sel+medium kultur+sampel), kontrol
sel (sel+medium kultur), kontrol positif (sel+medium kultur+cisplatin),
kontrol medium (kultur medium) dan kontrol pelarut (sel+medium
kultur+DMSO) masing-masing seri konsentrasi tiga kali ulangan. Hasil
penelitian efek antiproliferatif ini menunjukkan nilai IC50 masing-masing
interval waktu (24, 48 dan 72 jam) sebesar 372.4 µg/mL, 178.24 µg/mL,
dan 73.45 µg/mL. Nilai IC50 pada 72 jam menunjukkan adanya potensi
sampel sebagai agen kemoprevensi.
Kata kunci : Antiproliferatif, Katekin Gambir (Unicaria gambier, Roxb)
dan Eugenol
xiii
ABSTRACT
Tittle : Antiproliferative Effect Test of Mixed Eugenol and Catechin Isolate
of Uncaria gambier Roxb from Ethyl Acetat Phase on Cervix Cancer
Culture Cell (HeLa Cell Line)
The aim of this research is to know in vitro antiproliferative effect
of mixed catechin of Uncaria gambier Roxb and Eugenol on HeLa cancer
cells. The catechin of Uncaria gambier Roxb and Eugenol was mixed by
DMSO. Antiproliferative effect test was performed by MTT assay,
doubling time methods. Cell was determined by five treatment groups on
the MTT assay and doubling time methods. They were the extract group
(cells + culture medium + test material), cell control group (cells + culture
medium), positive control group (cells + culture medium + cisplatin),
medium control group (cells + culture medium), and solvent control group
(cells + culture medium + DMSO), which was every series has three times
repetition. The result showed that IC50 value of antiproliferative effect test
on each time interval (24, 48 and &2 hour) are 372.4 µg/mL, 178.24
µg/mL, and 73.45 µg/mL. IC50 value on 72 hour showed kemopreventive
agent potency.
Keyword : Antiproliferative, catechin of Uncaria gambier Roxb, Eugenol
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Hingga saat ini, kanker serviks merupakan penyebab kematian terbanyak
akibat penyakit kanker di Negara berkembang. Inisiden dan mortalitas kanker
serviks di dunia menempati urutan kedua setelah kanker payudara. Semetara itu,
di Negara berkembang masih menempati urutan pertama sebagai penyebab
kematian akibat kanker pada wanita usia reproduktif. Diperkirakan setiap tahun
dijumpai sekitar 500.000 penderita baru di seluruh dunia dan umumnya terjadi di
negara berkembang (Desen, 2008). Pada tahun 2008, International Agency for
Research on Cancer (IARC) melaporkan inisiden kanker serviks terjadi sebanyak
530.232 jiwa di dunia dengan angka mortalitas 275.008 jiwa. Di tahun yang
sama, inisiden kanker serviks di Indonesia terjadi sebanyak 16.413 jiwa dengan
mortalitas 7.493 jiwa (Globocan,2008).
Dalam 20 tahun terakhir berbagai usaha telah dilakukan untuk
mengobati penyakit kanker dengan cara kemoterapi dan imunologik. Namun
sayang, sampai sekarang cara tersebut belum memberikan hasil yang efektif, baik
yang diberikan secara tunggal, maupun kombinasi. (Aziz, 2006). Terapi kanker
sendiri ada bermacam-macam. Namun pada umumnya terapi yang diberikan pada
penderita kanker ialah cara sequential, yaitu setelah selesai dengan cara terapi
yang satu, bila perlu diikuti dengan cara terapi yang lain. Jarang bermacam-
macam cara terapi tersebut sekaligus diberikan dalam waktu yang bersamaan.
Umumnya penderita tidak mampu menahan pemberian terapi sekaligus.
2
Pemberian terapi baik operasi, radioterapi atau kemoterapi akan menurunkan
imunitas penderita. (Sukardja, 2000)
Dewasa ini, ekstrak tumbuhan telah lama digunakan dalam pengobatan
penyakit kanker. Uji antiproliferatif menyediakan data permulaan yang penting
untuk membantu dalam pemilihan ekstrak-ekstrak tumbuhan yang berpotensi
sebagai agen antineoplasmik (Cardellina et al. 1999). Proliferasi adalah
pertumbuhan sel kanker yang tak terkendali sehingga berhasil membentuk
kelompok.
Gambir (Uncaria gambier Roxb) adalah tumbuhan yang secara empiris
telah dimanfaatkan tidak hanya sebagai komponen menyirih, namun juga sebagai
obat-obatan. Komponen bioaktif utama pada tanaman gambir adalah flavonoid
(terutama gambiriin), katekin (sekitar 51%), zat penyamak (22-50%), serta
sejumlah alkaloid (seperti gambir, tannin dan turunan dihidro- dan okso-nya)
(Hermawan 2009). Katekin merupakan golongan flavanoid dengan aktivitas
antioksidan yang lebih tinggi daripada antioksidan sintetik (Das, 1994) .
Tingginya antioksidan katekin menunjukkan potensi senyawa antiproliferatif
yang bersifat toksik terhadap sel kanker (Wagner,1985).
Navindra P. Seraam (2003) menuliskan dalam jurnalnya bahwa katekin
teh hijau dapat menghambat proliferasi sel kanker. Pada konsentrasi 50µM;
derivat katekin yakni (–)-gallo-catechin, (–)-epigallocatechin gallate, dan (–)-
gallocatechin gallate berturut-turut menunjukkan persentase penghambatan
terhadap sel kanker payudara sebesar 95%, 100%, dan 97%. Dengan konsentrasi
yang sama, yaitu 50µM, (–)-gallo-catechin dan (–)-gallocatechin gallate
merupakan katekin yang paling efektif melawan sel kanker kolon dengan
3
persentase 85% untuk (–)-gallo-catechin dan 93% untuk (–)-gallocatechin gallate.
Sementara persentase penghambatan pada sel kanker paru-paru adalah 87%
untuk (–)-gallo-catechin dan 67% untuk (–)-gallocatechin gallate.
Pada percobaan lain, senyawa epigallocatechin gallate (EGCG) dan
epicatechin gallate (ECG) menunjukkan efek antiproliferasi pada konsentrasi
100µM. Dibandingkan variabel kontrol, besar hambatan terhadap kultur sel
tumor yang ditunjukkan oleh senyawa EGCG pada 24 jam dan 48 jam berturut-
turut adalah 70.2 ± 1.8% dan 85.6 ± 1.0%. sedangkan nilai hambatan yang
ditunjukkan oleh senyawa ECG pada 24 dan 48 jam berturut-turut adalah 34.8 ±
2.2% dan 69.2 ± 1.1%. (Tsuchiya et. al. 2008)
Selain katekin, senyawa yang terbukti dapat mempengaruhi pertumbuhan
sel kanker adalah eugenol. Eugenol dapat menghambat pertumbuhan tumor
sebesar 24.35% dengan dosis 100 mg/kg; i/p. (Jaganathan, 2010). Eugenol juga
terbukti mempengaruhi pertumbuhan sel kanker hati secara sinifikan. Sel HCT 15
dan HT 29 ditekan oleh eugenol dengan nilai IC50 berturut-turut 300 µM untuk
HTC 15 dan 500 µM untuk HT 29 (Jaganathan, 2010).
Beberapa peresepan pengobatan tradisional yang terdiri dari campuran
beberapa bahan mempunyai khasiat saling menguatkan, meskipun ketika bahan
tersebut berdiri sendiri sudah terbukti memiliki khasiat masing-masing. Ternyata,
perpaduan dua ekstrak herbal atau lebih itu memiliki fungsi, antara lain supaya
komponen-komponennya saling mendukung atau saling mengurangi efek
samping (Sukardiman, 1999).
Berdasarkan hal tersebut di atas, penulis merasa perlu untuk melakukan
penelitian lanjutan yang melibatkan senyawa katekin gambir dan senyawa
4
eugenol. Campuran senyawa katekin dari gambir dan eugenol murni diharapkan
dapat memberikan efek atau aktivitas yang lebih baik dalam merusak atau
menghambat proliferasi sel-sel kanker, khususnya sel kanker HeLa.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah campuran katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol
memiliki efek antiproliferatif terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line) ?
1.3 Hipotesis
Campuran katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol
memiliki efek antiproliferatif terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line)
1.4 Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiproliferatif campuran
katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dan Eugenol terhadap kultur sel kanker
serviks (HeLa cell line)
1.5 Manfaat penelitian
1. Memberikan pengetahuan dan informasi mengenai komponen bahan alam
yang berkhasiat bagi kesehatan khususnya bagi pengobatan kanker.
2. Memberikan informasi dan pengetahuan mengenai antikanker dari katekin
Gambir (Uncaria gambir Roxb) dan Eugenol sehingga penelitian tekait dapat
dilanjutkan.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1.Eugenol (Eugenolum)
2.1.1.Sifat Fisika dan Kimia (Depkes, 1995)
Rumus Kimia :
Nama IUPAC : 4-Alil-2-metoksifenol [97-53-0]
Rumus Struktur : C10H12O2
Berat Molekul : 164,20
Pemerian : Cairan tidak berwarna atau kuning pucat; bau cenkeh
kuat dan menusuk; rasa pedas; tidak memutar bidang
polarisasi. Bila terpapar udara warna menjadi lebih tua
dan mengental.
Kelarutan : Sukar larut dalam air; bercampur dengan etanol,
dengan kloroform, dengan eter dan dengan minyak
lemak. Kelarutan dalam etanol 70% Satu bagian
volume larut dalam 2 bagian volume etanol.
Bobot Jenis : Antara 1,064 dan 1,070
Indeks Bias : Antara 1,540 dan 1,542 pada suhu 200.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.
6
2.1.2.Sumber Eugenol
Eugenol merupakan komponen terbesar yang terkandung dalam
minyak daun cengkeh (49-87%) yang didistilasi uap dari daun pohon
cengkeh (Eugenia caryophyllata Thunberg, famili Myrtaceae) (Anonim,
2008). Di Indonesia, daerah produksi cengkeh terdapat di sekitar
Padang, Bengkulu dan Lampung (di Pulau Sumatera), dekat Minahasa
(di Pulau Sulawesi) dan Ternate, Tidore, Makian, Ambon, Nusa Laut,
Saparua, Amadina, Seram dan Banda (di Kepulauan Maluku). Sebagai
penghasil cengkeh utama di Indonesia adalah Maluku (Guenther, 1990).
Selain terdapat pada cengkeh, eugenol terdapat pula pada pala, kulit
manis, salam dan daun sirih (Manopo, 2008).
2.1.3.Pemanfaatan Eugenol
Eugenol memiliki aroma yang menyegarkan dan pedas seperti
bunga cengkeh kering, sehingga sering menjadi komponen untuk
menyegarkan mulut. Eugenol dimanfaatkan sebagai pengaroma parfum,
makanan dan pengobatan (antiseptik dan anestetik) (Manopo, 2008).
US Food and Administration (FDA) menyetujui penggunaan
eugenol sebagai bahan perasa, analgesic dan semen gigi, pewangi dan
aromaterapi serta pada obat transdermal delivery system. Eugenol juga
diketahui memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, antivirus, antitumor,
antioksidant dan insektisida (Anonim, 2008).
7
2.2 TANAMAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.)
2.2.1 Klasifikasi Tanaman (Haryanto, 2009)
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledone
Ordo : Rubiales
Famili : Rubiaceae
Genus : Uncaria
Spesies : Uncaria gambir Roxb.
Sinonim : Ourouparia gambir Roxb.
Nauclea gambir
2.2.2 Nama Daerah
Sumatera : Gambe, gani (Aceh), kacu (Gayo), sontang (Batak),
gambe (Nias), gambie (Minangkabau), pengilom,
sepelet (Lampung).
Jawa : Gambir (Jawa), ghambhir (Madura).
Kalimantan : Kelare (Dayak), abi (Kayan).
Sulawesi : Gambere (Sangir), gambele (Gorontalo), gambere
(Makassar), gaber (Majene).
Nusatenggara : Tagambe (Bima), gamur (Sumba), gabi (Sawu),
gambe (Flores), nggame (Roti) (Depkes RI, 1989).
Halmahera : Gabi, gagabere (Hariana, 2004).
8
2.2.3 Uraian Tanaman
Gambir berasal dari tumbuhan perdu yang membelit dan
berbatang keras.Tinggi 1-3 cm. Batang tegak, bulat, percabangan
simpodial warna cokelat pucat.Daun tunggal, berhadapan, bentuk elips,
tepi bergerigi, pangkal bulat, ujung meruncing, panjang 8-13 cm. lebar
4-7 cm, warna hijau. Bunga majemuk, bentuk lonceng, di ketiak daun,
panjang lebih kurang 5 cm, mahkota 5 helai berbentuk lonceng,
tongkol-bulat, terdiri dari bunga kecil-kecil yang berwarna putih. Buah
berbentuk bulat telur, panjang lebih kurang 1,5 cm, warna hitam
(Haryanto, 2009 & Mardisiswojo, 1968).
2.2.4 Kandungan Kimia
Senyawa flavonoid katekin (7-33%), asam katekutanat (20-50%)
(Thorpe dan Whiteley, 1921) ; gambir Sumatera Barat memiliki
kandungan katekin terbanyak (40-80%) (Amos,2010)
2.2.5 Manfaat Tumbuhan
Sejak lama gambir digunakan sebagai komponen menyirih
(Nazir, 2000). Manfaat glain gambir antara lain digunakan sebagai
bahan baku shampo (Shamie et al, 2004), perekat kayu lapis dan papan
partikel (Kasim, 2004). Dalam industry tekstil dan batik, gambir
digunakan sebagai bahan baku pewarna yang tahan terhadap matahari
(Risfaheri et al, 1995). Gambir juga digunakan sebagai penyamak kulit
agar tidak terjadi pembusukan serta membuat kulit menjadi lebih renyah
setelah dikeringkan (Bachtiar, 1991; Suherdi et al, 1991).
9
2.2.6 Efek Farmakologis
Ekstrak gambir memiliki daya hambat terhadap bakteri
Streptococcus mutans yang menyebabkan plak pada gigi (Kozai et al,
1995). Khasiat lainnya sebagai obat diare dan disentri serta obat kumur-
kumur pada sakit kerongkongan. Pada industri farmasi gambir
digunakan sebagai bahan baku obat penyakit hati dengan paten catergen
(Suherdi et al,1991; Nazir, 2000). Bahan infuse dari gambir digunakan
untuk penyembuhan gangguan darah (Sukati dan Kusharyono, 2004),
perangsang system saraf autonom (Kusharyono, 2004), sebagai
antimikroba (Rahayuningsih et al, 2004) dan bahan toksisitas terhadap
organ ginjal, hati, dan jantung (Armenia et al,2004)
2.2.7 Katekin
Katekin termasuk golongan flavonoid, merupakan kerabat
tanin terkondensasi dan memiliki banyak gugus fungsi hidroksil
(Robinson, 1995).Katekin berwarna putih yang memiliki jarak lebur 175-
177oC (WHO, 1998).Katekin dapat larut dalam air hangat dan memiliki
titik didih sebesar 254oC (Alamsyah, 2006). Katekin tidak stabil di udara
terbuka dan mudah terurai oleh cahaya serta teroksidasi pada pH
mendekati netral (pH 6,9) dan lebih stabil pada pH lebih rendah (pH 2,8
dan 4,9) (Lucida, 2006). Umumnya komponen yang terkadung didalam
katekin yaitu (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)-
epigallocatechin (EGC), (+)-catechin dan (-)-epigallocatechin gallate
(EGCG) (Hartoyo, 2003), yang memiliki struktur sebagai berikut:
10
Komponen Katekin Konfigurasi R1 R2
(-)-epicatechin (EC) 2S, 3R OH H
(-)-epicatechin gallate (ECG) 2R, 3R GA H
(-)-epigallocatechin (EGC) 2R, 3R OH OH
(+)-catechin 2R, 3S OH H
(-)-epigallocatechin gallate (EGCG) 2R, 3R GA OH
Tabel 1. Konfigurasi Komponen Katekin
Katekin digunakan sebagai obat tukak lambung (Tika et al,
2004) dan dapat menghambat pertumbuhan tumor mamma pada
mencit dengan rasio penghambatan sebesar 57,14% pada pemberian
dosis 800 mg/kgBB/hari (Gunawijaya et al, 1999). Katekin juga
memiliki aktifitas sebagai antimikroba, antioksidan, antiradiasi,
memperkuat pembuluh darah dan melancarkan sekresi air
seni.(Alamsyah, 2006).
Gambar 2. Struktur dasar Katekin dan Galloyl Grup (Seeram et al, 2003)
11
2.3 Simplisia
Simplisia adalah bentuk jamak dari kata simpleks yang berasal dari kata
simple, berarti satu atau sederhana. Istilah simplisia dipakai untuk menyebut
bahan-bahan obat alam yang masih berada dalam wujud aslinya atau belum
mengalami perubahan bentuk. Departemen kesehatan RI membuat batasan
tentang simplisia bahwa simplisia adalah bahan alami yang digunakan untuk
obat dan belum mengalami perubahan proses apapun, dan kecuali dinyatakan
lain umumnya berupa bahan yang telah dikeringkan. Berdasarkan hal itu
maka simplisia dibagi menjadi tiga golongan, yaitu simplisia nabati, simplisia
hewani, dan simplisia pelikan/mineral (Depkes RI, 1979 & Gunawan, 2004).
2.3.1 Pengelolaan Simplisia
a. Sortasi Basah
Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran
atau bahan-bahan asing lainnya dari bahan simplisia. Misalnya
simplisia yang dibuat dari akar suatu tanaman obat, bahan-bahan
asing seperti tanah, kerikil, rumput, batang, daun, akar yang telah
rusak, serta pengotoran lainnya harus dibuang. Tanah mengandung
bermacam-macam mikroba dalam jumlah yang tinggi, oleh karena
itu pembersihan simplisia dari tanah yang terikut dapat mengurangi
jumlah mikroba awal (Gunawan, 2004).
b. Pencucian
Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan
pengotoran lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian
dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air sumur
12
atau air PAM. Bahan simplisia yang mengandung zat yang mudah
larut di dalam air yang mengalir, pencucian hendaknya dilakukan
dalam waktu yang sesingkat mungkin (Gunawan, 2004).
c. Perajangan
Beberapa jenis bahan simplisia perlu mengalami proses
perajangan. Perajangan bahan simplisia dilakukan untuk
mempermudah proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan.
Semakin tipis bahan yang akan dikeringkan, semakin cepat
penguapan air, sehingga mempercepat waktu pengeringan
(Gunawan, 2004).
d. Pengeringan
Tujuan pengeringan ialah untuk mendapatkan simplisia yang
tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang
lebih lama. Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi
enzimatik akan dicegah penurunan mutu atau perusakan simplisia.
Air yang masih tersisa dalam simplisia pada kadar tertentu
dapat merupakan media pertumbuhan kapang dan jasad renik
lainnya. Proses pengeringan sudah dapat menghentikan proses
enzimatik dalam sel bila kadar airnya dapat mencapai kurang dari
10 %. Hal-hal yang perlu diperhatikan selama proses pengeringan
adalah suhu pengeringan, kelembapan udara, aliran udara, waktu
pengeringan, dan luas permukaan bahan (Gunawan, 2004).
13
e. Sortasi Kering
Sortasi setelah pengeringan merupakan tahap akhir pembuatan
simplisia. Tujuan sortasi memisahkan benda-benda asing seperti
bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotoran-
pengotoran lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia
kering. Proses ini dilakukan sebelum simplisia dibungkus untuk
kemudian disimpan. Pada simplisia bentuk rimpang, sering jumlah
akar yang melekat pada rimpang terlampau besar dan harus dibuang.
Demikian pula adanya partikel-partikel pasir, besi dan benda-benda
tanah lain yang tertinggal harus dibuang sebelum simplisia
dibungkus (Depkes RI, 1999).
f. Penyimpanan
Setelah tahap pengeringan dan sortasi kering selesai maka
simplisia perlu ditempatkan dalam suatu wadah tersendiri agar tidak
saling bercampur antara simplsia satu dengan lainnya. Selanjutnya,
wadah-wadah yang berisi simpilisia disimpan dalam rak pada
gudang penyimpanan. Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi
pengepakan dan penyimpanan simplisia adalah cahaya, oksigen atau
sirkulasi udara, reaksi kimia yang terjadi antara kandungan aktif
tanarnan dengan wadah, penyerapan air, kemungkinan terjadinya
proses dehidrasi, pengotoran atau pencemaran, baik yang
diakibatkan oleh serangga, kapang atau lainnya (Gunawan, 2004).
Untuk persyaratan wadah yang akan digunakan sebagai
pembungkus simplisia adalah harus inert, artinya tidak mudah
14
bereaksi dengan bahan lain, tidak beracun, mampu melindungi
bahan simplisia dari cemaran mikroba, kotoran, serangga,
penguapan kandungan aktif serta dari pengaruh cahaya, oksigen dan
uap air (Gunawan, 2004).
2.4 Ekstrak dan Ekstraksi
2.4.1 Pengertian Ekstrak dan Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan cair yang diperoleh dengan mengekstraksi
zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan
pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut
diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukakn sedemikian
sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995).
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat
larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut
cair. Simplisia yang akan diekstrak mengandung senyawa aktif yang
dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut dan mempunyai struktur
kimia yang berbeda-beda yang dapat mempengaruhi kelarutan dan
stabilitas senyawa-senyawa tersebut terhadap suhu, udara, cahaya, dan
logam berat (Depkes RI, 2000).
Sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih
berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang
maksimum dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang
tidak diinginkan.
15
2.4.2 Cara Pembuatan Ekstrak
Proses ekstraksi (pembuatan ekstrak) terdiri atas beberapa tahap, yaitu:
1. Pembuatan serbuk
Proses awal pembuatan ekstrak adalah tahapan pembuatan serbuk
simplisia yang kering (penyerbukan). Dari simplisia dibuat serbuk
simplisia dengan peralatan tertentu sampai derajat kehalusan
tertentu.
2. Cairan pelarut
Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari
adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses
dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, keamanan.
3. Separasi dan pemurnian
Proses-proses pada tahapan ini adalah pengendapan, pemisahan dua
cairan tak campur, sentrifugasi, dekantasi, dan filtrasi.
4. Pemekatan / penguapan (vaporasi dan evaporasi)
Pemekatan berarti peningkatan jumlah partikel solute (senyawa
terlarut) secara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kondisi
kering, ekstrak hanya menjadi kental/pekat.
5. Pengeringan ekstrak
Pengeringan berarti menghilangkan pelarut dari bahan sehingga
menghasilkan serbuk, masa kering-rapuh, tergantung proses dan
peralatan yang digunakan.
16
6. Rendemen
Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang diperoleh
dengan simplisia awal (Depkes RI, 2000).
2.4.3 Metode Ekstraksi
Ada dua cara ekstraksi, yaitu :
a. Cara dingin
1) Cara maserasi
Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan
menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau
pengadukan pada temperatur ruang (kamar). Remaserasi berarti
dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan
penyaringan maserat pertama, dan seterusnya.
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol,
air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan
maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang
digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan
kerugian dari maserasi adalah pengerjaannya lama dan
penyariannya kurang sempurna.
2) Perkolasi
Perkolasi adalah ekstrak dengan pelarut yang selalu baru sampai
sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruang.
17
b. Cara panas
1) Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik
didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang
relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Biasanya
dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5
kali sehingga terbentuk proses ekstraksi sempurna.
2) Soklet
Soklet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang baru, secara
umum dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi
kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya
pendingin balik.
3) Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinyu)
pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan yaitu
secara umum pada temperature 40-50°C.
4) Infus
Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur
penangas air mendidih (96-98°C) selama waktu tertentu (15-20
menit).
5) Dekok
Dekok adalah infuspada waktu yang lebih lama(>30°C) dan
temperatur sampai titik didih air (Depkes RI, 2000).
18
2.4.4 Parameter Ekstrak
Parameter non spesifik ekstrak terdiri dari:
a. Susut pengeringan
Susut pengeringan adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan
pada temperatur 105oC selama 30 menit atau sampai berat konstan,
yang dinyatakan sebagai nilai persen (%). Tujuannya untuk
memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa
yang hilang pada proses pengeringan. Nilai untuk susut pengeringan
jika tidak dinyatakan lain adalah kurang dari 10 %.
b. Kadar air
Kadar air adalah pengukuran kandungan air yang berada di dalam
bahan. Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal (rentang)
tentang besarnya kandungan air di dalam bahan. Nilai untuk kadar
air sesuai dengan yang tertera dalam monografi.
c. Kadar abu
Untuk penentuan kadar abu, bahan dipanaskan pada temperatur
dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap
sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya
adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral
internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai
terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang
tertera dalam monografi (Depkes RI,2000 ).
19
2.5 Kanker
2.5.1 Pengertian Kanker
Kanker atau neoplasma merupakan massa jaringan abnormal
dengan pertumbuhan berlebihan, tidak berkoordinasi dengan
pertumbuhan jaringan normal, dan tetap tumbuh secara berlebihan setelah
stimulus yang menimbulkan perubahan tersebut berhenti (Robbins dan
Kumar, 1995). Sel kanker akan menyusup ke jaringan sekitarnya
(invasif), lalu bermetastasis ke tempat yang lebih jauh melalui pembuluh
darah dan getah bening (Dalimartha, 2001). Sifat umum dari kanker
adalah sebagai berikut :
1. Pertumbuhan berlebihan umumnya membentuk tumor.
2. Gangguan diferensasi dari sel dan jaringan mirip jaringan mudigah.
3. Bersifat invasif, mampu tumbuh di jaringan di dekatnya (perbedaan
pokok dengan jaringan normal)
4. Bersifat metastatik, menyebar ke tempat lain dan menyebabkan
pertumbuhan baru;
5. Memiliki acquired heredity, yaitu keturunan sel kanker juga dapat
menimbulkan kanker.
6. Pergeseran metabolisme ke arah pembentukan makromolekul dari
nukleosida dan asam amino dan peningkatan katabolisme karbohidrat
untuk energi sel. (Farmakologi dan terapi ed. 2 FKUI 1980)
Kanker dibedakan menurut jaringan tempatnya berasal yaitu
adenoma (benjolan maligne pada kelenjar), limfoma (kanker pada
kelenjar limfe), sarkoma (kanker dari pembuluh darah, jaringan ikat, otot
20
atau tulang), leukimia (kanker yang berhubungan dengan produksi
leukosit abnormal), myeloma (kanker pada sumsum tulang), carcinoma
(kanker pada kelenjar) dan melanoma (kanker pada kulit) (Tjay, 2002).
Penyebab yang dapat merangsang pembentukan kanker,
diantaranya (Dalimartha, 2001):
a. Senyawa kimia (karsinogen), seperti zat pewarna, pengawet, merkuri,
dll.
b. Faktor fisika, misalnya radioterapi agresif (radiasi sinar pengion).
c. Virus, contoh: virus hepatitis B dan C penyebab hepatis kronis,
Humam Papilloma Virus (HPV) penyebab kanker serviks, dll.
d. Hormon, pemberian hormon tertentu secara berlebihan dapat
menimbulkan kanker seperti payudara, rahim, indung telur dan
prostat.
e. Faktor genetis, dapat terjadi apabila individu memiliki gen rusak yang
diwariskan secara genetis dari orang tuanya.
Kanker dapat terjadi melalui beberapa tahapan, yaitu (Miller,
2008):
Fase inisiasi, terjadi kerusakan secara langsung dalam bentuk
terjadinya mutasi pada DNA dalam sel. Kerusakan akan terbawa pada
sel anak yang dihasilkan dari pembelahan oleh sel-sel.
Fase promosi, terjadi perkembangbiakan pada sel yang rusak, hal ini
terjadi ketika sel-sel yang mengalami mutasi itu terkena zat
karsinogen yang mendorong terjadinya pembelahan secara cepat.
21
Fase progresi, gen-gen pertumbuhan yang diaktivasi oleh kerusakan
DNA mengakibatkan mitose dipercepat dan pertumbuhan liar dari sel-
sel ganas. Tumor menjadi manifes.
Pengobatan kanker dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu
pembedahan, radioterapi, kemoterapi, imunoterapi, pengobatan dengan
hormon serta tumbuhan obat, simplisia dari binatang dan mineral lainnya
(Dalimartha, 2001).
2.5.2 Kanker Serviks
Penyakit ini berawal dari infeksi virus yang merangsang
perubahan perilaku sel epitel serviks.Sel kanker serviks pada awalnya
berasal dari epitel serviks yang mengalami mutasi genetik sehingga
mengubah perilakunya.Sel yang bermutasi ini melakukan pembelahan
sel yang tidak terkendali, immortal dan menginvasi jaringan stroma di
bawahnya. Keadaan yang menyebabkan mutasi genetik yang tidak
dapat diperbaiki akan menyebabkan terjadinya pertumbuhan kanker
ini. (Desen, 2008)
Faktor risiko yang merupakan pencetus kanker serviks, antara
lain (Rasjidi, 2007):
d. Infeksi Human Papilloma Virus (HPV), yang termasuk
golongan papovavirus yaitu virus DNA bersifat mutagen
memiliki ukuran 55 nm. Tipe HPV antara lain 16, 18, 31, 33,
35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 69, diperkirakan masih banyak
beberapa tipe lain. Di Indonesia tipe virus risiko tinggi
22
penyebab kanker adalah tipe 16, 18 dan 52. Tipe ini
menimbulkan lesi rata dan tidak terlihat sedangkan tipe risiko
rendah menimbulkan pertumbuhan seperti jengger ayam pada
tipe HPV 6 dan 11 (Aziz, 2006).
e. Berganti-ganti mitra seks dan usia saat melakukan hubungan
seks yang pertama dibawah umur 15 tahun.
f. Merokok, asap rokok bersifat karsinogen dan mutagen.
g. Defisiensi terhadap asam folat, vitamin C, E, beta karoten
dihubungkan dengan risiko kanker serviks.
1. Gejala dan Tanda Kanker Serviks (Buku Acuan Nasional
Onkologi Ginekologi, 2006)
Tanda dini kanker serviks tidak spesifik seperti adanya
sekret vagina yang agak banyak dan kadang-kadang dengan
bercak pendarahan.Umumnya tanda yang sangat minimal ini
sering diabaikan oleh penderita.
Tanda yang lebih klasik adalah pendarahan bercak yang
berulang, atau pendarahan bercak setelah bersetubuh atau
membersihkan vagina.Dengan makin tumbuhnya penyakit, tanda
menjadi semakin jelas.Pendarahan menjadi semakin banyak, lebih
sering, dan berlangsung lebih lama. Juga dapat dijumpai sekret
vagina yang berbau terutama dengan massa nekrosis lanjut.
Nekrosis terjadi karena pertumbuhan tumor yang cepat tidak
diimbangi pertumbuhan pembuluh darah (angiogenesis) agar
23
mendapat aliran darah yang cukup.Nekrosis ini menimbulkan bau
yang tidak sedap dan reaksi peradangan non spesifik.
Pada stadium lanjut ketika tumor telah menyebar ke luar
dari serviks dan melibatkan jaringan di rongga pelvis dapat
dijumpai tanda lain seperti nyeri yang menjalar ke pinggul atau
kaki. Hal ini menandakan keterlibatan ureter, dinding panggul,
atau nervus skiatik.Beberapa penderita mengeluhkan nyeri
berkemih, hematuria, perdarahan rektum sampai sulit berkemih
dan buang air besar.Penyebaran ke kelenjar getah bening tungkai
bawah dapat menimbulkan oedema tungkai bawah, atau terjadi
uremia bila telah terjadi penyumbatan kedua ureter.
2.Terapi
Secara umum jenis terapi yang dapat diberikan bergantung
pada usia dan keadaan umum penderita, luasnya penyebaran, dan
komplikasi lain yang menyertai. Untuk ini, diperlukan
pemeriksaan fisik yang seksama.Juga diperlukan kerjasama yang
baik antara ginekologi onkologi dengan radioterapi dan patologi
anatomi.
Pada umumnya kasus stadium lanjut dipilih pengobatan
radiasi yang diberikan secara intrakaviter dan eksternal,
sedangkan stadium awal dapat diobati melalui pembedahan atau
radiasi.
24
Terapi tunggal baik radiasi atau operasi merupakan pilihan
bila kanker serviks dapat didiagnosis dalam stadium dini.
2.6 HeLaCell Line
Sel HeLa ini berasal dari tumor ganas serviks milik Henrietta Lacks. Sel
ini telah digunakan di laboratorium di seluruh dunia tak terhitung
jumlahnya. Sel tersebut telah membantu penemuan beberapa penelitian.
Kutipan ilmiah di US National Library of Medicine menunjukkan bahwa ada
sekitar 61.911 studi yang telah menggunakan sel ini. sel HeLa telah menjadi
komponen berharga dalam memahami penyakit pada tingkat molekul
khususnya model pemahaman kanker invitro. Selain itu, sel ini telah berperan
dalam penyaringan obat anti-kanker. Sebagai contoh, sel ini digunakan untuk
menyebarkan virus polio yang akhirnya mengarah pada penemuan dan
pengembangan vaksin polio. Saat ini strategi tersebut digunakan dalam
berbagai laboratorium di seluruh dunia untuk pengembangan vaksin.
Sel HeLa adalah sel kanker leher rahim akibat infeksi Human
Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan sel
leher rahim normal. Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui
mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 dan E7 terbukti
dapat menyebabkan sifat imortal pada kultur primer keratinosit manusia,
namun sel yang imortal ini tidak bersifat tumorigenik hingga suatu proses
genetik terjadi. Jadi, viral onkogen tersebut tidak secara langsung menginduksi
pembentukan tumor, tetapi menginduksi serangkaian proses yang pada
akhirnya dapat menyebabkan sifat kanker (Goodwin dan DiMaio, 2000).
25
Sel HeLa merupakan kategori cell line atau sel lestari, yaitu kultur sel
yang berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara mekanis dan
atau enzimatis menjadi suspensi sel. Suspensi tersebut kemudian dibiakkan
menjadi satu lapisan jaringan (monolayer) diatas permukaan yang keras (botol,
tabung, cawan) atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh. Monolayer
tersebut kemudian dapat diperbanyak lagi sesudah melalui proses pemisahan
sel secara enzimatis dan diencerkan dengan media penumbuh. Apabila di
subkultur terus menerus maka dihasilkan sel lestari (Malole, 1990).
2.7 Antikanker
2.7.1 Obat Antikanker
Obat antikanker merupakan senyawa kemoterapetik untuk
pengobatan tumor yang membahayakan dan diharapkan memiliki
toksisitas selektif dalam menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel
jaringan normal. Terapi dikatakan berhasil apabila mematikan sel tumor
yang ganas dan tidak mengganggu sel normal yang berproliferasi
(Departemen Farmakologi dan Terapeutik, 2007; Siswandono, 2000)
2.7.2 Mekanisme Kerja Obat Antikanker (Siswandono, 2000; Departemen
Farnakologi dan Terapeutik, 2007)
Antikanker bekerja berdasarkan gangguan pada salah satu proses
sel yang esensial, dengan cara mempengaruhi metabolisme asam nukleat
terutama DNA atau biosintesis protein . Sel memiliki siklus kehidupan
yang terdiri dari beberapa fase, antara lain:
26
1. Fase mitosis (M), terjadi pembelahan sel aktif. Replikasi kromosom
terpisah menjadi dua inti anak sel yang berlangsung selama 1 jam.
Pada fase ini terjadi dua alternatif yaitu:
a. Menuju fase G1 dan memulai proses proliferasi.
b. Masuk ke fase istirahat (Go), kemampuan sel untuk berproliferasi
hilang dan sel meninggalkan siklus secara tidak terpulihkan.
2. Fase post mitotik (G1), terjadi sintesis RNA dan protein. Pada fase
akhir terjadi sintesis RNA yang optimum. Fase ini umumnya terjadi
kurang lebih 5 jam.
3. Fase sintetik (S), terjadi replikasi DNA dengan bantuan DNA-
polimerase yang menghasilkan DNA baru, sehingga rantai tunggal
DNA menjadi rantai ganda. Fase ini terjadi selama 7 jam.
4. Fase post sintetik (G2), terjadi bila sel telah menjadi tetraploid dan
mengandung dua DNA, kemudian sintesis RNA dan protein
dilanjutkan. Fase ini terjadi selama 3 jam. Selanjutnya sel kembali ke
fase mitotik.
2.7.3 Golongan Obat Antikanker
a. Senyawa Pengalkilasi
Senyawa pengalkilasi membentuk senyawa kationik antara
yang tidak stabil, diikuti pemecahan cincin membentuk ion
karbonium reaktif yang akan bereaksi melalui reaksi alkilasi
sehingga terjadi cross-linking (saling mengikat) antara rantai-rantai
DNA di dalam inti sel. Akibatnya proses pembentukan sel terganggu
sehingga pertumbuhan sel kanker terhambat. Senyawa ini untuk
27
pengobatan limfosarkoma, penyakit Hodgkin, leukimia limfositik
dan mieloma. Contoh senyawa pengalkilasi: mekloretamin,
klorambusil, siklosfosfamid, bisulfan, dan karmustin (Tjay, 2002;
Siswandono, 2000).
b. Antimetabolit
Antimetabolit menghambat asam folat, purin, pirimidin dan
asam amino, serta jalur nukleosida pirimidin pada sintesis DNA sel
kanker. Replikasi DNA dapat dihambat secara langsung maupun
tidak langsung yang menyebabkan sel tidak berkembang biak dan
mengalami kematian (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).
Berdasarkan sifat antagonismenya, golongan ini terdiri dari
empat kelompok yaitu (Siswandono, 2000; Tjay, 2002):
1) Antagonis Pirmidin
Obat golongan ini mengalami anabolisme menjadi senyawa
aktif secara in vivo, sehingga dapat mempengaruhi sintesis DNA
pada fase awal yang menyebabkan kekosongan asam timidilat
akibatnya sel mengalami kematian. Contoh: 5-fluorourasil,
sitarabin, tegafur dan floksuridin.
2) Antagonis Purin
Antagonis purin menjadi aktif setelah mengalami
anabolisme menjadi nukleotida dan terkadang menjadi turunan
difosfat atau trifosfat. Contoh: 6-merkaptopurin, azatioprin dan
tioguanin.
28
3) Antagonis Asam Folat
Pada golongan ini obat bekerja tidak khas dengan
menghambat secara bersaing dihidrofolat reduktase (enzim yang
mengkatalisis reduksi asam dihidrofolat menjadi asam
tetrahidrofolat). Antagonis asam folat mengikat enzim tersebut
sehingga terjadi hambatan tak terpulihkan. Penghambatan enzim
dihidrofolat reduktase menyebabkan hambatan sintesis DNA,
RNA dan protein. Antagonis asam folat menghambat timidilat
sintetase sehingga menyebabkan kematian sel karena kekurangan
timin. Contoh: aminopterin, metotreksat dan ketotreksat.
4) Antagonis Asam Amino
Antagonis asam amino menghambat beberapa proses
metabolik yang memerlukan glutamin sebagai kofaktor.
Aktivitas antikanker disebabkan oleh kemampuan menghambat
fosforibosil formilglisinamida ribonukleotida menjadi
fosmilglisinamidin ribonukleotida. Contoh: azaserin dan 6-
diazo-5-okso-L-norleusin (DON).
c. Antikanker Produk Alam
Senyawa antikanker ini dihasilkan dari alam dan memiliki
khasiat sebagai antikanker. Obat antikanker golongan ini terbagi
menjadi (Siswandono, 2000; Tjay, 2002):
1) Antibiotika Antikanker
Efek samping berupa sitotoksik tinggi dari antibiotika yang
dikembangkan sebagai senyawa antibakteri, kemudian dievaluasi
29
dan dikembangkan menjadi obat antikanker. Antibiotika
antikanker sukar diabsorpsi pada saluran cerna sehingga diberikan
melalui parenteral. Contoh: mitomisin, daktinomisin,
doksurubisin, dan bleomisin.
2) Antikanker Produk Tanaman
Obat-obat antikanker golongan ini bekerja dengan mengikat
tubuli dan menghambat pertumbuhan komponen mikrotubuli
pada kumparan mitosis sehiggga metafase berhenti. Alkaloid
vinca bekerja pada fase M, vinkristin memiliki kemampuan
penetrasi ke dalam sel kanker yang lebih baik dibanding
vinblastin. Contoh: vinblastin, vinkristin, dan podophyllotoksin
(seperti etoposida).
3) Antikanker Produk Rekayasa Genetika
Obat yang termasuk dalam golongan ini yaitu interferon α-
2a (Roferon-A) dan interferon α-2b (Intron-A) yang mengandung
165 asam amino, dihasilkan melalui teknologi rekombinan DNA
menggunakan rekayasa genetik pada strain E.coli. contoh lainnya:
antineoplaston dan avaron.
d. Hormon
Hormon androgen, progestin, estrogen dan adrenokortikoid
mengikat secara khas reseptor pada sitoplasma dan mengubah
struktur reseptor. Bentuk kompleks hormon-reseptor menuju inti,
berinteraksi dengan sisi aseptor sehingga mempengaruhi proses
transkripsi (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).
30
e. Golongan Lain-lain
Sitostatika lainnya yang digunakan berupa enzim
asparaginase, senyawa-senyawa platina berupa sisplatin dan
karboplatin, hidroksiurea, procarbazin dan topotecan yang
menghambat enzim topoisimerase-1, yang terlibat pada replikasi
DNA. Kompleksnya dengan DNA distabilkan, menimbulkan cacat
dan matinya sel (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).
2.8 Cisplatin (Farmakologi dan terapi 2008)
Cisplatin merupakan obat kanker golongan platinum.Cisplatin juga
merupakan metal inorganik.Karena toksisitas cisplastin yang mempunyai
sitotoksisitas sinergik dengan radiasi dan obat kemoterapi lain (Mary dan
Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
Obat ini ditemukan secara kebetulan melalui observasi bahwa komplek
platinum menghambat pembelahan Escherichia coli.Golongan obat ini
membunuh sel pada semua siklus pertumbuhannya, menghambat biosintesis
DNA dan berikatan dengan DNA membentuk ikatan silang (cross
linking).Tempat ikatan utama adalah N7 pada guanin, namun juga terbentuk
ikatan kovalen dengan adenin dan sitosin.Cisplatin terutama efektif untuk
tumor padat seperti karsinoma paru (sel sekil dan sel non kecil), kanker
esofagus, gaster, leher dan kepala, genito urinaria (testis, ovarium, buli–
buli).Cisplatin dalam kombinasi dengan vinblastin dan23 bleomisin, atau
etoposid dan bleomisin dapat memberi hasil yang kuratif untuk tumor
testis.(Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
31
Karena toksisitas cisplastin yang mempunyai sitotoksisitas sinergik
dengan radiasi dan obat kemoterapi lain (Mary dan Pamela, 2001).
1). Mekanisme kerja:
Mekanisme kerja sama dengan alkilator. Golongan obat ini
membunuh sel pada semua siklus pertumbuhannya, menghambat biosintesis
DNA dan berikatan dengan DNA membentuk ikatan silang (cross linking).
Sitotoksisitas dapat terjadi pada setiap tahap pengembangan siklus sel, tetapi
sel yang paling peka adalah fase G1 dan S. Tempat ikatan utama adalah N7
pada guanin, namun juga terbentuk ikatan kovalen dengan adenin dan sitosin.
Pada lingkungan plasma yang tinggi klorida, cisplastin menetapkan
sebagai jenis netral, yang masuk sel dan terikat pada N’ guanine DNA,
membentuk crosslink inter- dan intra- strand. Lesi sitotoksik yang
menghambat sintesis DNA dan RNA (Mary dan Pamela, 2001).
2). Farmakokinetik
Cisplatin dan Karboplatin diberikan IV dalam cairan garam, obat-obat
ini dapat juga diberikan interperitonial untuk kanker ovarium.Lebih dari 90%
cisplatin diikat oleh serum protein.Konsentrasi tertinggi ditemukan dalam
hati, ginjal, usus, sel-sel testis dan ovarium, tetapi sedikit yang dapat masuk
kedalam cairan serebrospinal (CSS).Ginjal merupakan saluran ekstraksi yang
utama. Efek samping dari cisplatin antara lain muntah yang hebat dan
persisten terjadi 1 jam setelah 24 pemberian cisplatin dan dapat berlangsung
sampai 5 hari (Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi,
2008).
32
3). Penggunaan dalam terapi
Cispaltin banyak digunakan untuk pengobatan tumor padat seperti
metastasis karsinoma testis dikombinasikan dengan vinblastin dan bleomisin,
karinoma ovarium kombinasi dengan siklofosfamid, atau tunggal untuk
karsinoma kanndung kemih (Mary dan Pamela, 2001).
4). Efek samping
Muntah yang hebat dan persisten terjadi 1 jam setelah pemberian
cisplatin dan dapat berlangsung sampai 5 hari. Premedikasi dengan
antiemetik biasanya dapat menolong.Toksisitas terbatas yang paling sering
adalah nefrotoksisitas yang tergantung dosis, menyangkut tubulus renalis
kontortus distal dan tubulus renalis rektus.Kedaan ini diperburuk oleh hidrasi
hebat dan diuresis (Mary dan Pamela, 2001).
Efek samping utama cisplat in adalah nefrotoksisitas.Hidrasi yang
cukup dengan garam fisiologis atau manitol penting untuk mengurangi
nefrotoksisitas.Selain itu, cisplatin juga menyebabkan neurotoksisitas perifer
yang irreversibel (Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
2.9 Kultur Sel (Malole, 1990; Freshney,1992)
Kultur sel berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara
mekanis atau enzimatis menjadi suspensi sel kemudian dibiakan menjadi satu
lapisan jaringan (monolayer) diatas permukaan keras (botol, tabung dan cawan)
atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh.Monolayer dapat
33
diperbanyak dan diencerkan pada media penumbuh disebut teknik subkultur
(pasase). Subkultur yang dilakukan terus-menerus akan dihasilkan sel lestari
dengan sifat meningkatnya jumlah sel, memiliki daya tumbuh tinggi, sel-sel
tersebut seragam dan mengalami perubahan fenotip atau transformasi.
Kultur sel memerlukan adanya pergantian medium secara berkala yang
diikuti subkultur jika sel-sel berproliferasi, intervalnya berbeda-beda sesuai
jenis sel yang tergantung pada kecepatan pertumbuhan dan metabolisme sel.
Sel disimpan dalam inkubator pada lingkungan ber CO2 dengan suhu 37oC.
Persediaan sel manusia dan hewan yang akan dibiakan dalam kultur,
disimpan beku dalam nitrogen cair. Selama proses penyimpanan ini digunakan
larutan dimetil sulfoksida (DMSO) sebagai agen krioprotektan bersama
medium untuk mengawetkan sel pada suhu dibawah -70°C. DMSO juga
memiliki kemampuan untuk berpenetrasi kedalam sel dan membekukan cairan
sel tanpa menyebabkan terbentuknya kristal es.
Subkultur bertujuan untuk memperbanyak kultur sel, selain itu juga
untuk mempertahankan kelangsungan hidup sel karena labu kultur yang telah
penuh dengan sel akan menghambat pertumbuhan sel itu sendiri.Pengaruh
lingkungan kultur meliputi:
1. Kondisi alami substrat yang terdiri dari:
a. Substrat
Kebanyakan sel yang dikultur invitro tumbuh sebagai kultur selapis
pada substrat buatan. Labu ukur kultur jaringan (tissue kultur flask)
34
terbuat dari plastik polistiren yang telah diolah dengan radiasi sinar
gamma, dengan zat kimia atau dengan pengisian muatan listrik untuk
menghasilkan permukaan yang bermuatan sehingga mudah terbasahi.
b. pH
kebanyakan sel turunan akan tumbuh baik pada pH 7,4 walaupun pH
optimum untuk pertumbuhan sel bervariasi antara beberapa jenis sel.
c. Dapar (buffer)
Dapar ditambahkan kedalam medium untuk mempertahankan pH.
Dapar natrium bikarbonat paling sering digunakan karena toksisitasnya
rendah, murah dan memberikan nutrisi bagi kultur sel.
2. Komposisi medium
Komposisi medium sangat beragam, mulai dari asam amino esensial,
vitamin dan garam sampai dengan senyawa yang kompleks
3. Penyusunan fase lag gas (dalam inkubator)
Meliputi oksigen dan karbondioksida.
4. Suhu inkubasi
Suhu yang biasa digunakan untuk kebanyakan sel turunan adalah 37°C,
yang dekat dengan suhu tubuh manusia.
35
2.10 UJI ANTIPROLIFERATIF
Proliferasi adalah pertumbuhan sel kanker yang tak terkendali sehingga
berhasil membentuk kelompok. Aktivitas antiproliferasi terhadap suatu sel dan
harga IC50 ditetapkan melalui uji sitotoksik dan pengamatan kinetika
proliferasi dengan metode MTT (Utami, Dwi. 2007)
Adanya kemampuan bertahan hidup diartikan sebagai tidak hilangnya
kemampuan metabolik atau proliferasi dan dapat diukur dari pertambahan
jumlah sel, peningkatan jumlah protein atau DNA yang disintesis. Uji
antiproliferatif merupakan salah satu metode untuk mengetahui pertumbuhan
sel diukur dari persamaan regresi linear yang dibuat dari slope sehingga
menggambarkan kinetika proliferasi sel. Uji ini didasarkan pada uji
sitotoksisitas. Jumlah sel yang bertahan hidup pada uji sitotoksisitas ditetapkan
dengan beberapa cara yang didasarkan pada parameter kerusakan membran
meliputi perhitungan sel yang mengambil (uptake) atau tidak mengambil bahan
pewarna seperti biru tripan (Freshney, 1987; Malole, 1990).
2.10.1 Metode Pengujian Antiproliferatif
Metode pengujian antiproliferatif dilakukan dengan
mengghunakan metode reduksi pewarna tetrazolium, menggunakan
garam tetrazolium (MTT) yang merupakan singkatan dari (3–[4,5–
dimethylthiazol–2Yi]–2,5–diphenyl tetrazolium bromide) yaitu
metode penghitungan sel hidup dengan pewarnaan (kolorimetri)
untuk menghitung jumlah sel hidup berdasarkan reduksi oleh enzim
suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari garam tetrazolium
(MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal formazan
36
berwarna ungu. Sel didistribusikan ke dalam sumuran dan diinkubasi,
masing-masing sumuran ditambahkan 10 μL MTT. Kemudian
diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37oC. Sel yang hidup akan
bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu (Freimoser et al,
1999, Sieuwerts, 1995).
2.11 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
ELISA merupakan alat uji serologis yang digunakan untuk menemukan
antigen tunggal atau antibodi dalam cairan biologis dan penetapan kadar
imunosorben taut-enzim. Uji ini dibagi menjadi dua jenis yaitu competitive
assay yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim
dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi, antibodi kedua
akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator (Baratawidjaya, 2004).
Gambar 3. MTT direduksi menjadi Formazan
37
2.12 Potensi Penelitian
Penelitian-penelitian terdahulu membuktikan adanya potensi yang
baik dari senyawa katekin maupun eugenol.Baik secara umum, maupun
secara khusus, yang dalam hal ini adalah penghambatan sel-sel kanker.
katekin telah teruji memiliki efek antiinflamasi dengan dosis
pemberian 100 dan 200 mg/KgBB pada marmut (Arundina et al, 2003). Rasio
penghambatan pertumbuhan tumor mamma dicapai katekin hingga 57.14%
dengan dosis 800 mg/kgBB/hari (Gunawijaya e.t al., 1999). Aktivitas katekin
sebagai antioksidan yang diujikan pada suhu 400, 50
0 dan 60
0C masing-
masing menunjukkan rasio penghambatan sebesar 37,55%, 36,51% dan
29,67% (Hukmah, 2007).
Aktivitas katekin sebagai antivirus ditunjukkan oleh derivatisasinya
yaitu epigallokatekin galat (EGCG), epikatekin galat (ECG) dan
epigallokatekin (EGC) yang masing-masing senyawa memiliki nilai EC50
sebesar 22-28 µM, 309-318 µM dan 22-40 µM (Min Song et al, 2005).
Epigalokatekin galat (EGCG) memiliki aktivitas sebagai antifungi yang
diujikan pada Candida albicans dengan persentase penghambatan sebesar
90% pada konsentrasi 2000 mg/L pada pH 6, 500-1000 mg/L pada pH 6,5
dan 15,6-250 mg/L pada pH 7 (Hirasawa and Takada, 2004). Penelitian yang
dilakukan oleh Sadava et. al., (2007) menunjukkan bahwa EGCG mampu
mereduksi aktivitas telomerase SCLC (Small-cell Lung Carcinoma) sebesar
50-60% pada konsentrasi IC50 32,1 ppm. Penelitian lainnya oleh
menunjukkan bahwa katekin hidrat mampu menghambat proliferasi sel MCF-
38
7 (kanker payudara) yang dikultur selama 48 jam pada konsentrasi 300 µg/ml
sebesar 52,95% (Alshatwi, 2010).
Eugenol dilaporkan dapat menginduksi apoptosis pada sel melanoma
manusia (G361) hingga 50% dalam masa inkubasi selama 24 jam dan 100%
dalam masa inkubasi 72 jam (Kim, 2006). Uji antiproliferatif eugenol
terhadap sel melanoma malignant manusia (WM1205Lu) mengindikasikan
bahwa eugenol dapat menginduksi apoptosis sel WM1205Lu, (Ghosh, 2005).
Penelitian aktivitas sitotoksik dari pencampuran beberapa komponen
minyak essensial dengan perbandingan 1:1 dan konsentrasi masing-masing
komponen 50 μg/mLyang diujikan pada sel MCF-7 (sel kanker payudara)
menunjukkan persen kematian sel eugenol ataupun campuran
eugenol:berberapa komponen minyak esensial sebesar < 50%, kecuali pada
campuran eugenol:citral yang menunjukkan persen kematian sebesar 90%
(Wright, 2007)
Efek antioksidant dari eugenol telah dibandingkan dengan beberapa
senyawa fenol lainnya, yaitu 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol; p,p’-biphenol; 2-
allyl-6-methylphenol; honokiol; magnolol; caffeic acid; p-ethylphenol dan
guaiacol. Berdasarkan hubungan struktur-aktivitas, aktivitas antioksidant
senyawa fenol yang dihasilkan 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol p,p’-biphenol
> eugenol > 2-allyl-6-methylphenol > honokiol > magnolol > caffeic acid >
p-ethylphenol > guaiacol. Electron Spin Resonance Spin mendeteksi bahwa
component fenol dengan substitusi alyl pada cincin aromatic mengikat
Superoksida (O2-) dan hanya eugenol yang mengikat hydroxyl radicals
39
sehingga dapat berperan dalam menghentikan reaksi ikatan radikal bebas
(Ogata, 1997). Kemampuan antiradikal dari minyak esensial Cinnamomum
zelanycum, dengan komponen eugenol 89.1% memiliki aktivitas antiradikal
efek dari minyak esensial lebih tinggi dari butylated hydroxyl toluene (BHT)
(SC50= 7 mg/L) (Dongmo, 2007).
Eugenol juga banyak digunakan dalam kepentingan kedokteran gigi.
Salah satu pengujian dilakukan untuk mengetahui pengaruh penambahan
eugenol dalam semen temporer. Evaluasi membuktikan eugenol mengurangi
kekuatan ikatan padasemen temporer (Wazzan, 1997).
40
2.13 KERANGKA KONSEP PENELITIAN
Potensi tanaman gambir
(Unicaria gambier)
Senyawa Katekin
Pemanfaatan secara
empris :
- sebagai komponen
menyirih
- obat luka bakar
(Malaysia)
- obat sakit kepala
(Kalimantan)
- dsb
Potensi katekin sebagai antikanker
ditunjukkan oleh aktivitas derivatnya:
EGCG mereduksi 50-60% aktivitas
telomerase SCLC (Small-cell Lung
Carcinoma) dengan IC50 32.1 ppm (Sadava
et al., 2007), katekin hidrat (300 µg/mL)
menghambat proliferasi sel MCF-7 (kanker
payudara) sebesar 52.95% (Alshatwi,
2010). EGCG memiliki nilai IC50 sebesar
12.51 ppm dan 21.96 ppm untuk
menghambat proliferasi sel kanker serviks
yaitu sel CaSki dan sel HeLa (Qiao et al.,
2009)
Pemanfaatan ilmiah :
- Bahan baku dalam
pembuatan obat-
obatan antihepatitis
B, antidiare (Dharma,
1985).
- penghambat
pembentuk plak gigi
(Kozai et al. 1995;
Nazir 2000)
- antimikroba, dan
antinematoda (Alen,
Bakhtiar, dan
Noviantri 2004)
- dsb
Uji Efek antiproliferatif
Analisa IC50 probit
Senyawa Eugenol
Pemanfaatan senyawa eugenol:
- menghambat pertumbuhan
tumor (Jaganathan, 2010)
- menekan pertumbuhan sel
kanker hati (Jaganathan,
2010)
Perpaduan dua ekstrak herbal
atau lebih memiliki fungsi,
antara lain supaya komponen-
komponennya saling
mendukung atau saling
mengurangi efek samping.
(Sukardiman, 1999)
41
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1Waktu dan Tempat Penelitian
3.1.1Waktu Penelitian
Penelitian ini berlangsung mulai daribulan Mei hingga Oktober 2011.
3.1.2 Tempat Penelitian
Pembuatan sampel uji dan uji antiproliferatif dilakukan di
Laboratorium FKIK UIN dan Laboratorium Departemen Patologi dan
Anatomi FKUI Salemba.
3.2Alat dan Bahan
3.2.1 Alat Penelitian
T-flask, Biological Safety Cabinet , Microplate 96 sumuran,
Haemocytometer, Inkubator CO2, Mikroskop inverted, ELISA reader,
Timbangan analitik, pisau, spatula, kertas karton, blender, erlenmeyer,
gelas ukur, beker glass, labu ukur, evaporator, kertas saring, kapas,
corong, spatula, kain, corong pisah, cawan penguap, vial, lemari es,
oven, autoklaf, timbangan analitik, , sentrifuge, sentrifuge tube 15 dan
50 ml, Laminer Air Flow cabinet (LAF), tangki nitrogen cair, ,
Cryogenic vials, mikro pipet, pipet tips, pipet tips 5 ml, Syringe 200
CC, syringe filter (Corning), vortex, tabung conocal, , tabung falcon,
hot plate HP-3000 (Lab Companion), kulkas 4 dan -20oC, kulkas -
80oC, pipet tetes, tabung reaksi, ruang asam, hot plate, porselen,
kamera digital.
42
3.2.2 Bahan yang Digunakan
a. Sampel Uji
Sampel uji yang digunakan dalam uji antiproliferasi ini adalah
Eugenol dan Katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dalam fase etil
asetat yang telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Litbang LIPI
Bogor, Cibinong.
b. Sel Uji
Pada uji antiproliferatif ini, sel uji yang digunakan adalah sel
HeLa yang diperoleh dari stok Fakultas Kedokteran Hewan Institut
Pertanian Bogor – Bogor yang merupakan Pasase 3.
c. Bahan Kimia yang Digunakan
Aquadest, kloroform, etil asetat, etanol 70%, HCl, dragendorf,
meyer, serbuk Mg, amil alkohol, FeCl3, pereaksi Stiasny (Formaldehid
30% : HCl pekat = 2 : 1), Na asetat, NaOH, pereaksi Liebermann-
Buchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat), eter,
ammonia (NH4OH) 10%, media sel DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle's Medium) (Sigma), Phosphate Buffered Salina (PBS),
Penicillin-streptomisin (Pen-Strep), Fetal Bovine Serum (FBS)
(Sigma), Trypsin EDTA 5% (Sigma), MTT [3-(4,5 dimetiltiazol-2-yI)-
2,5 difenil tetrazolium bromide] (Sigma), Trypan Blue (Sigma),
Sodium Duodecyl Sulphate (SDS) (Sigma), DMSO (Dimetil
Sulfoksida) (Sigma), dan Cisplatin®.
43
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyiapan Simplisia Uji
Penyiapan gambir yaitu dengan cara membersihkannya dari
pengotor, gambir yang digunakan yaitu berupa bongkahan yang
diperoleh dari Payakumbuh Padang Sumatera Barat. Bongkahan gambir
kemudian dihaluskan sampai menjadi serbuk. Serbuk gambir tersebut
diidentifikasi dan dilakukan pemeriksaan kadar urea untuk mengetahui
kadar urea yang terkandung didalamnya.
3.3.2 Identifikasi Gambir
1. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes asam sulfat P warna
coklat merah
2. 2 mg serbuk gambir ditambahkan asam sulfat 10 N warna coklat
muda
3. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes Na hidroksida 5% dalam
etanol warna coklat merah
4. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes ammonia 25% warna
coklat merah
5. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes larutan FeCl3 5% coklat
kehitaman (Depkes RI, 1989).
3.3.3 Identifikasi Cemaran Urea
100 mg serbuk gambir dilarutkan dalam 1 ml air, ditambahkan 1
ml asam nitrat P terbentuk endapan hablur putih (Sirait, 1995).
44
3.3.4 Isolasi Katekin Gambir
Sebanyak 500 gram serbuk gambir diekstraksi dengan pelarut air
pada temperatur mendidih 90-960C selama 15-20 menit sambil diaduk.
Selanjutnya, infusa disaring dalam keadaan panas menggunakan corong
yang dilapisi dengan kertas saring (DepKes, 1986). Residu dibilas
kembali dengan air panas (900C) dan disaring hingga jernih. Filtrat
dipartisi dengan etil asetat dengan perbandingan filtrat:etil asetat yaitu
1:½ kemudian ditambahkan dengan NaCl hingga jenuh. Fase air
dipartisi kembali dengan etil asetat. Proses ini dilakukan hingga lima
kali, kemudian fase air dibuang dan fase etil asetat yang diperoleh
dikumpulkan untuk dievaporasi hingga kental, kemudian diberi air
dingin, diambil endapannya dan dikeringkan menggunakan oven pada
suhu 70oC, lalu dilakukan penetapan kadar katekin yang dibandingkan
dengan katekin standar, penetapan kadar air dan kadar abu, uji jarak
lebur dan penghitungan rendemen katekin total serta uji penapisan
fitokimia.
3.3.5 Penapisan Fitokimia
Pemeriksaan kandungan golongan senyawa kimia dari serbuk
ekstrak air gambir (Unicaria gambir) yang dilakukan antara lain ialah
ujialkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid, glikosida, steroid,
triterpenoid,dan kumarin.
1) Alkaloid
Sebanyak 2 gram serbuk simplisia kemudian dilembabkan
dengan 5ml ammonia 30%, digerus dalam mortir, selanjutnya
45
ditambahkan 20 mlkloroform dean digerus kembali dengan kuat.
Campuran tersebut disaringdengan menggunakan kertas saring.
Filtrat berupa larutan organik diambil(larutan A). Sebanyak 10 ml
larutan A diambil kemudian diekstraksi dengan10 ml larutan HCl 1 :
10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambillarutan bagian
atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes padakertas
saring dan disemprot atau ditetesi dengan pereaksi
Dragendorf,terbentuk warna merah/jingga pada kertas saring
menunjukkan adanyasenyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam dua
tabung reaksi, kemudianditambahkan masing–masing pereaksi
Dragendorf dan Mayer, terbentukendapan merah bata dengan
pereaksi Dragendorf dan endapan putih denganpereksi Mayer
menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid(Fransworth, 1969).
2) Glikosida
5 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam etanol 80%
demudiandisaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan di atas
hot plate. Filtratkering dicuci dengan n-heksana sampai larutan n-
heksana bening (pigmenhilang). Panaskan residu yang bebas lemak
(untuk menghilangkan sisa n-heksana). Kemudian ditambahkan
FeCl3 sebanyak 3 ml, lalu aduk sampaihomogen. Larutan kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudianditambahkan H2SO4
pekat (melalui dinding tabung reaksi), lalu didiamkan37beberapa
saat. Terbentuk warna merah menjadi cuklat kemudian
46
menjadibiru/lembayung menunjukkan adanya glikosida (Guevara et
al, 1985).
3) Saponin
Ditimbang 0,5 gram serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam
tabungreaksi, kemudian ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan
dan kemudiankocok kuat-kuat selama 10 detik. (jika zat yang
diperiksa berupa sediaancair, encerkan 1 mL sediaan yang diperiksa
dengan 10 mL air dan kocok kuat-kuat selama 10 menit); sehingga
terbentuk buih yang mantap selama tidakkurang dari 10 menit,
setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetesasam klorida 2
N, buih tidak hilang (Fransworth, 1969).
4) Flavonoid
2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air panas,
didihkanselama 5 menit. Setelah 5 menit, saring dengan kertas
saring, diperolehfiltrat yang akan digunakan sebagai larutan
percobaan. Kedalam 5 mL larutanpercobaan (dalam tabung reaksi),
ditambahkan serbuk atau lempengmagnesium secukupnya dan 1 mL
HCl pekat, tambahkan 5 mL amilalkohol,dikocok dengan kuat,
biarkan hingga memisah, terbentuk warna dalamlarutan amilalkohol
menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Fransworth,1969).
5) Tanin
2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air, didihkan
selama 15 menit, dinginkan dan disaring dengan kertas saring dan
filtrat dibagi duabagian. Kedalam filtrat pertama ditambahkan Ferri
47
(III) klorida 1%,terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman
menunjukkan adanya senyawa golongan tanin. Kedalam filtrat yang
kedua ditambahkan 15 mlpereaksi Stiasny (Formaldehid 30% : HCl
pekat = 2:1), dipanaskan di ataspenangas air, terbentuk endapan
warna merah muda menunjukkan adanyatanin katekuat. Selanjutnya
endapan disaring, filtrat dijanuhkan dengannatrium asetat,
ditambahkan beberapa tetes larutan Ferri (III) klorida 1%,terbentuk
warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat (Fransworth,1969).
6) Kuinon
2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas,
didihkanselama 5 menit. Setelah 5 menit, saring dengan kertas
saring, diperolehfiltrat yang akan digunakan sebagai larutan
percobaan. Di dalam tabungreaksi, filtrat ditambahkan dengan
beberapa tetes larutan NaOH 1 N,terbentuk warna merah
menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon (Fransworth, 1969).
7) Steroid dan Triterpenoid
1 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama
2 jam (dalam wadah dengan penutup rapat), disaring dan diambil
filtratnya. 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap
hingga diperolehresidu/sisa. Kedalam residu tersebut ditambahkan 2
tetes asam asetatanhidrat dan 1 tetes asam sufat pekat (pereaksi
Libermann-Buchard),terbentuk warna hijau atau merah menunjukkan
adanya senyawa golongansteroid atau triterpenoid (Fransworth,
1969).
48
8) Kumarin
2 gram simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi (volume 20
mL) ditambahkan 10 mL pelarut kloroform dan pasang corong (yang
diberilapisan kapas yang telah dibasahi air) pada mulut tabung.
Selanjutnyapanaskan selama 20 menit di antas penangas air dan
dinginkan, kemudiansaring dengan kertas saring. Filtrat di dalam
cawan penguap diuapkansampai kering, sisa ditambahkan air panas
sebanyak 10 mL, dinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan 1,5 mllarutan amonia (NH4OH) 10%,
amati di bawah sinar ultraviolet padapanjang gelombang 365 nm,
maka terjadi fluoresensi warna biru atau hijau,menunjukkan adanya
golongan kumarin (Fransworth, 1969).
3.3.6 Pemeriksaan Katekin
a. Penetapan Kadar Katekin
Sebanyak 50 mg katekin standar ditimbang dan dilarutkan
dalam etil asetat hingga 50 ml (konsentrasi 1 mg/ml). Dari larutan
induk diencerkan hingga menjadi 0,04 mg/ml. Diukur panjang
gelombang 279 nm dengan spektrofotometer UV.
Dari larutan induk diatas dibuat larutan katekin standar dengan
berbagai konsentrasi dalam etil asetat: 0.02 mg/mL, 0,03 mg/mL,
0,04 mg/mL, 0,05 mg/mL dan 0,06 mg/mL. Kemudian diukur
seserapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang
279 nm dan dibuat kurva kalibrasi serta menghitung persamaan
regresi.
49
Penetapan kadar katekin sampel dengan cara sebanyak 50 mg
katekinditimbang dan dilarutkan dalam etil asetat hingga 50 ml, lalu
dibuat larutan katekinmenggunakan etil asetat dengan berbagai
konsentrasi, yaitu 0,02 mg/mL, 0,03 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,05
mg/mL, dan 0,06 mg/mL. Kemudian diukur serapannya dengan
spektrofotometri UV pada panjang gelombang 279 nm. Kadar
katekin dalam larutan dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi
(Lucida et al, 2007).
b. Kadar Abu
Sebanyak 1 gram katekinditimbang dan dimasukkan ke dalam
cawan porselen. Katekin dipijar dengan pembakar bunsen selama
kira-kira 1 jam dan disempurnakan pemijarannya dengan
menempatkan bahan dalam tanur suhu tinggi pada 900o ± 20
oC
sampai diperoleh abu berwarna abu-abu. Didinginkan dalam
desikator, ditimbang serta dicatat pengurangan beratnya. Dihitung
kadar abu dari pengurangan berat yang didapat (DepKes, 2000).
c. Kadar air
Sebanyak 1 gram sample katekin ditimbang, kemudian
ditempatkan didalam cawan porslen yang diketahui beratnya dan
dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 5 jam. Kemudian
didinginkan dalam desikator hingga mencapai suhu kamar dan
ditimbang. Dilakukan pemanasan kembali selama 30 menit dan
didinginkan dalam desikator. Pemanasan selama 30 menit,
pendinginan dan penimbangan dilakukan beberapa kali sampai
50
pengurangan berat antara dua penimbangan berturut-turut lebih kecil
dari 0,001 g. Kadar air dihitung dari pengurangan yang didapat
(Depkes, 2000).
d. Uji Jarak Lebur
Menempatkan sejumlah katekin ke dalam tabung kapiler lalu
dipanaskan dalam tangas udara atau tangas cair kemudian suhu
dicatat pada saat zat melebur dan pada saat semua dimana semua zat
melebur. Dengan demikian jarak lebur dicatat sebagai jarak antara
suhu permulaan dan suhu akhir peleburan yang sempurna. Laju
pemanasan alat diatur sekitar 10oC per menit, ketika mencapai suhu
165-170oC diatur kembali hingga kenaikannya sekitar 1
oC per menit
(DepKes, 1979). Jarak lebur katekin pada literatur ialah 175-177oC
(WHO, 1998).
e. Rendemen Katekin
Rendemen katekin dihitung dengan membandingkan berat
awal serbuk dengan berat akhir katekin yang dihasilkan.
Rendemen = % kemurnian x Bobot serbuk katekin
Bobot serbuk gambir di ekstraksi
3.3.7. Sterilisasi Alat
Bahan-bahan seperti media kultur dan reagen-reagen harus
dalam keadaan steril. Sterilisasi dilakukan secara aseptis di dalam
LAF(Laminar Air Flow) dengan metode filtrasi karena mengandung
komponenyang tidak tahan pemanasan. Sterilisasi ini bertujian untuk
menghindariterjadinya kontaminasi dari bakteri atau pengotor lain
51
seperti debu yangakan merusak validitas hasil penelitian. Filter yang
umumnya digunakanadalah filter MF-Milipore tipe GS dengan ukuran
pori 0,2 µm.
Alat–alat gelas yang akan digunakan dicuci bersih
kemudiandikeringkan, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan
disterilkan dalamautoklaf pada suhu 121oC, tekanan 15 lb, selama 15
menit.
3.3.8 Pembuatan Reagen
a. Pembuatan Medium DMEM berserum
Sebanyak 500 ml medium DMEM berserum ditambahkan
50ml FBS 10% dan penstrep (Penisilin-Streptomisin) sebanyak 5
ml, kemudian dihomogenkan. Selanjutnya larutan medium DMEM
berserum disaring dengan syringe filter 0.2 µm membrane non
pyrogenic dan disimpan pada suhu -4oC
b. Pembuatan Larutan PBS (Phosfhat Buffer Saline)
Larutan PBS dibuat dengan cara menimbang dinatrium
hydrogen fosfat (Na2HPO4) sebanyak 1,081 gram, kemudian
ditambahkan 0,106 gram kalium fosfat (KH2PO4); 4,025 gram
natrium klorida (NaCl), dan 0,102 gram kalium klorida (KCl).
Selanjutnya dilarutkan dalam aquadest steril hingga 500 ml.
Stabilkan larutan pada pH 7,2 dengan menggunakan pH meter
kemudian disterilkan dengan autoklaf dan disimpan pada suhu
kamar.
52
c. Pembuatan Larutan SDS (Sodium Dedocyl Sulfat) 10 % b/v
Menimbang SDS sebanyak 10 gram kemudian dilarutkan
dalam 90 mlaquadest steril dan 10 ml HCl 0.01 N, kemudian diaduk
sampai larut.
d. Pembuatan Larutan MTT (3 – [4,5 – dimethylthiazol – 2Yi] – 2,5
– diphenyl tetrazolium bromide)
Untuk pengamatan proliferatif sel secara kolorimetri, 5 mg
MTT dilarutkan dalam 1 ml PBS dan difilter agar steril. Kemudian
MTT diberikan sebanyak 10 µL per 100 µL medium pada tiap-tiap
sumuran (Mosmann, 1983).
Pada penelitian ini, Larutan MTT dibuat dengan cara
melarutkan serbuk MTT sebanyak 1 gram dalam 40 ml PBS steril.
Tiap sumuran diberi larutan MTT tersebut sebanyak 10 µl.
3.3.9 Persiapan Larutan Uji
a. Suspensi Campuran Katekin Gambir (Uncara gambier Roxb.)
dan Eugenol.
Sebanyak masing-masing 125 mgkatekin dan eugenol
ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikro tube dan dilarutkan
dalam 5000µl DMSO 99 %, sentrifuge sampai homogen. Larutan ini
dijadikan larutaninduk dengan konsentrasi 50000 µg/mL (larutan
induk 1), diambil 50 μl laluditambahkan media DMEM sebanyak
450 µl untukmemperoleh larutan dengan konsentrasi 5000 µg/mL
(larutan induk 2), kemudian larutan uji dengan seri 3.125; 6.25;
53
17.5; 25; 50; 100; dan 200 µg/mL dibuat dengan mengencerkan
beberapa μl dari larutan induk 2.
b. Kontrol Cisplatin
Sediaan cisplatin 10 mg/20 ml (500 µg/mL) sebagai larutan
indukdimasukkan dalam mikrotube, kemudian dibuat pengenceran
denganmemipet beberapa μl dari larutan induk, agar diperoleh lima
konsentrasiyaitu 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, dan 9 µg/mL.
c. Kontrol DMSO (kontrol negatif)
DMSO yang digunakan merupakan DMSO pro Analysis.
3.3.10 Persiapan Kultur HeLaCell Line
a. Aktivasi sel HeLa (Thawing Kultur Sel)
1. Mengeluarkan tabung yang berisi HeLa cell line dari tangki
wadah berisi dry ice bersuhu -800C , kemudiandicairkan dalam
waterbath 37oC sampai gumpalan di dalam vial mencair.
2. Didalam LAF, HeLacell line diambil seluruhnya dengan
menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabungsentrifuge
kemudianditambahkan 7 ml medium DMEM
kemudiandisentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit.
3. Supernatan yangdiperoleh kemudian dipisahkan sedangkan pellet
diresuspensikan denganmenggunakan 5 ml PBS,selanjutnya
disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm.
4.Supernatan kemudian dipisahkan dan pellet yang dihasilkan
diresuspensi dengan 3 ml DMEM berserum, kemudian
dimasukkan ke dalam T-flaskyang telah berisi 7 ml DMEM
54
berserum lalu diinkubasi pada suhu 37oCdalam inkubator CO2
5% selama 24 jam hingga sel menutupi permukaan cell culture
dish dengan tingkat kepadatan 95%.
b. Pembuatan dan Pengembangan sel HeLa (Subkultivasi)
1. T-Flask yang telah diinkubasi selama 1 hari dikeluarkan dari
inkubator.
2. Media di dalam T-Flask dibuang kemudian dicuci dengan 15 ml
PBS sebanyak 2kali. Kemudian PBS dibuang dan ditambahkan
tripsinyang telah diencerkan dengan PBS sebanyak 5,8 ml (400
µl Tripsin + 5400 µlPBS = 5,8 ml).
3. Sel diinkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2dengan suhu
37oC (selama diinkubasi tutup T-Flask dilonggarkan). Setelah 3
menit, dishdikeluarkan dari inkubator CO2 kemudian diketuk-
ketuk horizontal dindingT-Flaskbagian luar dengan
menggunakan telapak tangan agar sel terlepasdari dinding T-
Flask. Sel kemudian diperiksamenggunakan
mikroskopinverted.
4. T-Flask dipindahkan dalam LAF kabinet kemudian didalam T-
Flaskditambahkan DMEM sebanyak 1000 luntuk
menonaktifkan tripsin, kemudian dihomogenkan.
5. Larutan seldipindahkan ke dalam tabung centrifuge tube, lalu
disentrifuge dengankecepatan 4000 rpm selama 5 menit.
6 .Kemudian supernatan dipisahkan dandiganti dengan medium
DMEM berserum sebanyak 7ml, lalu dihomogenkan kembali
55
dengan pipetsehingga sel menyebar ke seluruh media; untuk
selanjutnya dimasukkan ke dalam T-Flask dan diinkubasi
dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam.
7. 10 µl dari larutan sel tersebut dipipet, kemudian ditambahkan
10 µl Tripan blue. Selanjutnya, jumlah sel dihitung
menggunakan Haemocytometer. Syaratjumlah sel dalam setiap
sumuran adalah 5 x 103.
8. Sel dihitung dari keempat bidang besar pada sudut seluruh
permukaan yang terbagi. Penghitungan dimulai dari sisi kiri
atas kemudian ke kanan, turun ke bawah dan dari kanan ke kiri.
Cara tersebut dilakukan pada keempat bidang besar. Sel yang
menyinggung garis batas sebelah kiri atau atas harus dihitung.
Sebaliknya, sel yang menyinggung garis batas sebelah kanan
atau bawah tidak dihitung. Jumlah sel per ml dapatdihitung
dengan rumus:
Σ 𝑆𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙 = 𝑛
4× 𝑃 × 104
n =Σ sel dalam keempat bidang besar
4 =Σ bilik hemositometer yang dihitung
P =Faktor pengenceran
3.3.11 Pemeliharaan Kultur HeLa cell line
Pemeriksaan sel dilakukan setiap hari dengan
menggunakanmikroskop, pemeriksaan ini bertujuan untuk memeriksa
kemungkinan terjadipencemaran oleh bakteri atau jamur. Apabila
56
medium kultur telah berubahwarna maka diganti dengan medium
DMEMberserum yang baru.
3.3.12 Uji Antiproliferatif
Uji antiproliferatif ini menggunakan plat kultur jaringan 96
sumuran sebagai media uji. Padasetiap sumuran pelat kultur jaringan
dimasukkan suspensi sel dalammedium DMEM sampai 100 µL.
Suspensi tersebutdiinkubasi dalam inkubator CO25% selama 24, 48,
dan 72 jam pada suhu 37oC. Ke dalammasing–masing sumuran
tersebut ditambahkan 100 µl larutan uji (campuran katekin gambir dan
eugenol), kontrol DMSO (kontrol negatif), kontrol Cisplatin®
(kontrol positif) dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Pada
sumuran yang berbeda dimasukkan 200µl DMEM sebagai blanko.
lalu diinkubasi dalam inkubator CO2 370C selama 24,48 dan 72 jam.
Sel hasil inkubasi masing-masing interval waktu (24, 48, dan 72 jam)
kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop. Setelah
pengamatan, medium pada masing-masing sumuran tersebut dibuang,
Selanjutnya 100 µl campuran DMEM berserum+MTT ditambahkan
ke dalam tiap-tiap sumur, untuk kemudian diinkubasi selama 4jam
pada suhu 37oC di dalam inkubator CO25%.
Setelah diinkubasi, sel diamati di bawah mikroskop, untuk
dilihat Kristal formazan ungu yang terbentuk. Kemudian ditambahkan
5 µl SDS 10%, dihomogenkan, dan disimpan dalam wadah gelap
selama ± 16 jam pada suhu kamar. Masing-masing sumur pada pelat
57
kultur jaringan tersebutdibaca dengan menggunakan ELISA reader
pada panjang gelombang 630nm.
3.3.13 Perhitungan Persentase Kematian Sel
Pada metode MTT, persentase kematian sel merupakan selisih
absorbansi kontrol dengan absorbansi sampel dibagi absorbansi
kontrol dikalikan 100%. Masing–masing absorbansi telah dikoreksi
dengan absorbansi dari senyawa uji saja tiap kadar. Perhitungan
kematian sel dengan menggunakan metode MTT menggunakan rumus
sebagai berikut :
% kematian sel = Serapan kontrol negatif sel − Serapan uji
Serapan kontrol negatif sel× 100%
3.4 Analisa Data
Hasil perhitungan jumlah sel yang hidup digunakan untuk menentukan
persentase kematian sel yang dipakai untuk menghitung hargaIC50 dengan
analisa probit. Dari data ini dibuat regresi linier hubunganantara logaritma
konsentrasi sebagai X dengan probit sebagai Y. Nilai IC50diperoleh dengan cara
memasukkan nilai 5 sebagai probit ke dalampersamaan regresi linier, kemudian
hasil substitusi, lalu dibuat antilogaritmanya. Persentase kematian yang dibuat
ke dalam angka probitdigambarkan hubungannya dengan logaritma konsentrasi.
Selanjutnyaditarik garis lurus yang paling baik melalui titik–titik yang
ada(berdasarkan penglihatan) dan konsentrasi pada garis ini yang menyatakan50
% kematian (probit -5). Antilog titik ini disebut IC50.
58
Ekstrak air gambir / bongkah
gambir (Unicaria gambir)
Reekstraksi Infusa
(98-100oC)
Partisi dengan Etil
Asetat
Penapisan
fitokimia
Fase air dipartisi
kembali dengan etil
asetat
Fase air
dibuang
Katekin
Uji antiproliferatif
dengan metode MTT % penghambatan
Menghitung kepadatan
sel dengan
Haemocytometer
Subkultivasi
Thawing
Cell line HeLa
Fase etil asetat
dikumpulkan
Eugenol Suspensi campuran
Analisa data IC50
Dibilas dengan air dingin,
endapan diambil
3. 5 Alur penelitian
59
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
4.1.1 Determinasi dan Sertifikasi
Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman gambir yang
digunakan dalam penelitian ini adalah Uncaria gambier, Roxb.. yang
tergolong suku Rubiaceae. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.
Adapun Eugenol yang digunakan sebagai campuran senyawa uji telah
disertifikasi sebagai Eugenol for synthesis oleh Merck. Sertifikasi Eugenol
dapat dilihat pada lampiran 2.
4.1.2 Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran
Tabel 2. Hasil Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran
Kar
akte
rist
ik
Serbuk katekin Eugenol Campuran
katekin dan
Eugenol Syarat* Standar
Sampel
Syarat ** Sampel
Pemerian
a. Bentuk Serbuk Serbuk Serbuk Cair Cair Cair
b. Warna Putih-
Kuning
kecoklatan
Kuning Putih
kekuningan
Bening
kekuningan
Bening
kekuningan
Bening
kekuningan
c. Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas
d. Rasa khelat khelat Khelat Pedas Pedas Pedas-pahit
Kelarutan Tidak larut
air
Tidak larut
air
Tidak larut
air
Tidak larut
air, Mudah
larut
dengan
DMSO
Jarak lebur 175-177oC 174-177
oC 174-177
oC - - -
Spektrum
UV 279 nm 292 nm 292 nm
- - -
Kadar Abu Maks 7% 0.053% 0.062% - - -
60
Kadar Air Maks 7 % 0.047% 0.044% - - -
Rendemen Min 40% - 49.30% - - -
Kemurnian 100% 93.32% 79.73% 100% 99.9% -
Berat jenis - - - 1.064 -
1.070
1.065 -
*The Merck Index.2006; WHO.1998; SNI gambir 01-3391-2000
** Farmakope Indonesia Ed. IV
4.1.3 Jumlah Kepadatan Sel
Perhitungan jumlah kepadatan sel dilakukan dengan menggunakan
Haemocytometer. Sel yang telah diinkubasi ditambahkan tripanblue dengan
pengenceran 10x kemudian dilihat di bawah mikroskop. Syarat jumlah
kepadatan sel yang digunakan dalam tiap sumuran dalam penelitian ini adalah
5 x 103 sel/mL. Adapun jumlah kepadatan sel yang diperoleh ialah 1.51 x 10
6
sel/mL. Maka, jumlah suspensi sel yang harus dipipetkan dalam tiap sumuran
adalah sebanyak 3.31 µL/sumuran kemudian ditambahkan medium DMEM
berserum ad 100 µL. Perhitungan kepadatan sel dapat dilihat pada lampiran
17 .
4.1.4 Uji Efek Antiproliferatif
a. Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir (Uncaria
gambier Roxb) dan Eugenol terhadap sel HeLa
Tabel 3. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir
(Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 24 jam
Kons
[µg/
mL]
Rata-
rata
Abs.
DMSO
Std.
dev.
Rata-
rata
Abs.
Sampel
Std.
dev.
%
Hidup
%
Inhibisi
Log
kons.
Probit IC50
3.125 0.463 0.039 0.430 0.104 92.87 7.13 0.495 3.5316
372.4
μg/ mL
6.25 0.472 0.029 0.404 0.015 85.59 14.41 0.796 3.9375
12.5 0.477 0.045 0.440 0.003 84.28 15.72 1.097 3.9931
25 0.466 0.007 0.352 0.043 74.55 25.45 1.398 4.3380
50 0.458 0.025 0.334 0.012 72.93 27.07 1.669 4.3872
100 0.451 0.004 0.314 0.030 69.62 30.38 2 4.4842
200 0.448 0.018 0.242 0.086 54.02 45.98 2.301 4.8970
61
Tabel 4. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir
(Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 48 jam
Kons
[µg/
mL]
Rata-
rata
Abs.
DMSO
Std.
dev.
Rata-
rata
Abs.
Sampel
Std.
dev.
%
Hidup
%
Inhibisi
Log
kons
Probit IC50
3.125 0.358 0.050 0.320 0.097 89.39 10.61 0.495 3.7519
178.24
μg/ mL
6.25 0.444 0.176 0.316 0.031 71.17 28.83 0.796 4.4408
12.5 0.427 0.136 0.295 0.006 70.53 29.47 1.097 4.4583
25 0.365 0.079 0.247 0.095 67.67 32.33 1.398 4.5407
50 0.328 0.003 0.216 0.015 65.85 34.15 1.669 4.5903
100 0.335 0.012 0.186 0.029 55.52 44.48 2 4.8592
200 0.331 0.017 0.164 0.035 49.55 50.45 2.301 5.0100
Tabel 5. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir
(Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 72 jam
Kons
[µg/
mL ]
Rata-
rata
Abs.
DMSO
Std.
dev.
Rata-
rata
Abs.
Sampel
Std.
dev.
%
Hidup
%
Inhibisi
Log
kons
Probit IC50
3.125 0.349 0.119 0.294 0.025 84.24 15.76 0.495 3.9931
73.45
μg/ mL
6.25 0.301 0.037 0.213 0.038 70.76 29.24 0.796 4.4524
12.5 0.281 0.072 0.192 0.060 68.33 31.67 1.097 4.5230
25 0.263 0.011 0.164 0.012 62.36 37.64 1.398 4.6480
50 0.259 0.019 0.141 0.009 54.45 45.55 1.669 4.8870
100 0.251 0.027 0.121 0.070 48.21 51.79 2 5.0426
200 0.247 0.019 0.092 0.047 38.17 61.83 2.301 5.3002
Perhitungan IC menggunakan persamaan: Y = a + bx (lampiran 19 )
b. Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding (Cisplatin) terhadap
sel HeLa
Tabel 6. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding
(Cisplatin) 24 jam
Kons
[µg/ mL
]
Rata-rata
Abs.
sampel
Rata-rata
Abs
Blangko
Std.
dev.
%
Hidup
%
Inhibisi
Log
kons.
Probit IC50
1.5 0.302
0.479
0.073 63.05 36.95 0.176 4.6681
4.305
μg/
mL
3 0.279 0.067 58.25 41.75 0.447 4.7930
4.5 0.387 0.013 51.98 48.02 0.653 4.9408
6 0.225 0.045 46.97 53.03 0.778 5.0753
7.5 0.197 0.058 41.13 58.87 0.875 5.2250
9 0.166 0.079 34.66 65.34 0.954 5.3934
62
Tabel 7. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding
(Cisplatin) 48 jam
Kons
[µg/ mL
]
Rata-
rata
Abs.
sampel
Rata-rata
Abs
Blangko
Std.
dev.
%
Hidup
%
Inhibisi
Log
konsent
rasi
Probit IC50
1.5 0.296
0.513
0.045 57.70 42.30 0.176 4.8058
2.904
μg/
mL
3 0.257 0.055 50.10 49.90 0.447 4.9975
4.5 0.247 0.046 48.15 51.85 0.653 5.0476
6 0.217 0.002 42.30 57.70 0.778 5.1942
7.5 0.179 0.026 34.88 65.12 0.875 5.3880
9 0.119 0.026 23.2 76.80 0.954 5.7323
Tabel 8.Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding
(Cisplatin) 72 jam
Kons
[µg/
mL]
Rata-
rata
Abs.
sampel
Rata-rata
Abs
Blangko
Std.
dev.
%
Hidup
%
Inhibisi
Log
konsen
trasi
Probit IC50
1.5 0.255
0.542
0.044 47.05 52.95 0.176 5.0753
1.626
μg/
mL
3 0.215 0.051 39.67 60.33 0.447 5.2611
4.5 0.198 0.020 36.53 63.47 0.653 5.3451
6 0.144 0.022 29.89 70.11 0.778 5.5273
7.5 0.101 0.004 18.63 81.37 0.875 5.8927
9 0.087 0.086 16.05 83.95 0.954 5.9945
Perhitungan IC menggunakan persamaan: Y = a + bx (lampiran 20)
63
A. Grafik Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi
1. Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi Sampel
Grafik 1. Hubungan antara % hidup dengan waktu inkubasi sampel
2. Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi Cisplatin
Grafik 2. Hubungan antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
24 jam 48 jam 72 jam
% H
idu
p
Waktu inkubasi
Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi
3.125 µg/mL
6.25 µg/mL
12.5 µg/mL
25 µg/mL
50 µg/mL
100 µg/mL
200 µg/mL
linier 3.125 µg/mL
linier 6.25 µg/mL
linier 12.5 µg/mL
linier 25 µg/mL
linier 50 µg/mL
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
24 jam 48 jam 72 jam
%H
idu
p
Hubungan Antara Waktu Inkubasi Terhadap
%Hidup
1.5 µg/mL
3 µg/mL
4.5 µg/mL
6 µg/mL
7.5 µg/mL
9 µg/mL
linier 1.5 µg/mL
linier 3 µg/mL
linier 4.5 µg/mL
64
B. Grafik Hubungan Antara % Hidup dengan IC50
1. Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 Sampel
Grafik 3. Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50
2. Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 Cisplatin
Grafik 4. Hubungan Waktu Inkubasi terhadap IC50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
24 jam 48 jam 72 jam
IC5
0(p
pm
)Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50
IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier, Roxb.) dan Eugenol
0
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
24 jam 48 jam 72 jam
IC5
0(p
pm
)
Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50
IC50 Cisplatin
65
C. Grafik Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit
1. Hubungan Antara % Hidup dengan Probit Sampel
Grafik 5. Hubungan antara Log Konsentrasi dengan Probit
2. Hubungan Antara % Hidup dengan Probit Cisplatin
Grafik 6. Hubungan antara Log Konsentrasi dengan Probit
-
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
0,796 1,097 1,398 1,699 2 2,301
Pro
bit
Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit
24 Jam
48 Jam
72 Jam
-
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
7,000
0,477 0,653 0,778 0,875 0,954
Pro
bit
Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit
24 Jam
48 Jam
72 Jam
66
4.2 Pembahasan
Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol
digunakan untuk uji antiproliferatif karena masing-masing komponen memiliki
aktivitas sitotoksik berdasarkan penelitian-penelitian sebelumnya. Dikatakan
bahwa derivat katekin yakni senyawa EGCG dan ECG menunjukkan efek
antiproliferasi pada konsentrasi 100µM (Tsuchiya et. al. 2008) dan Eugenol
dapat menghambat pertumbuhan tumor sebesar 24.35% dengan dosis 100 mg/kg;
i/p. (Jaganathan, 2010). Sehingga diharapkan senyawa campuran ini memiliki
hasil yang lebih baik dalam penghambatan sel kanker.
Uji sitotoksistas dan antiproliferatif dengan kultur sel saat ini
digunakan karena berbagai alasan. Diantaranya dengan menggunakanan kultur
sel, mekanisme toksisitas biokimia dapat dikerjakan dengan lebih efektif karena
kondisi lingkungan sel mudah dikontrol. Pengembangan metode invitro sebagai
alternatif pengganti uji dengan menggunakan hewan uji mempunyai relevansi
yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi suatu obat pada
manusia.
Uji efek antiproliferatif pada penelitian ini menggunakan sel HeLa. Sel
ini bersifat immortal dan sangat agresif sehingga mudah untuk dikultivasi tetapi
sel ini mudah menginvasi kultur sel lain (Doyle dan Griffiths, 2000). Dibanding
sel tumor lainnya, proliferasi sel ini sangat cepat dan abnormal. Sifat immortal
yang dimiliki sel ini diduga akibat peran dari enzim telomerase saat proses
pembelahan diri.
67
Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media
yang digunakan adalah media DMEM berserum. Di dalamnya terkandung nutrisi
yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam
anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon
yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein
transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai
kofaktor enzim (Freshney, 1986). Inkubasi sel yang dilakukan pada penelitian ini
menggunakan inkubator CO2 5%. Hal tersebut dikarenakan pada konsentrasi
tersebut, buffer pada medium dapat berinteraksi dengan CO2 sehingga
meningkatkan konsentrasi ion hidroksil yang dapat menstabilkan pH menjadi pH
normal yaitu 7,4. Jika pH di dalam medium terjadi penurunan maka dapat
memperlambat pertumbuhan sel dan memperpanjang proses produksi (Malole,
1990).
Penghitungan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer.
Proses penghitungan ini memakai pewarnaan biru tripan (trypan blue) yang
diencerkan 100x. Jumlah sel dihitung dibawah mikroskop. Sel hidup terlihat
sebagai bulatan bening dengan bintik biru inti sel ditengah bulatan, sedangkan sel
mati terlihat sebagai bercak biru pekat yang bentuknya tidak teratur. Selanjutnya
dihitung persentase penghambatan zat uji terhadap pertumbuhan sel.
Cisplatin dipakai sebagai kontrol positif karena cisplatin merupakan
obat terpilih kanker yang telah banyak digunakan pada pengobatan penyakit ini.
Sitotoksisitas pemberian cisplatin dapat terjadi pada setiap tahap pengembangan
siklus sel, khususnya ketika sel berada pada fase G1 dan S , sedangkan
antikanker produk tanaman bekerja dengan memblokade mitosis. Kromosom
68
akan terpecah-pecah, menyebar atau berkelompok. Kromosom tidak mampu
membagi dan memisah dengan benar akan menyebabkan sel menjadi mati dan
perkembangan berhenti pada stadium metafase (Wahyudi 2009).
Konsentrasi Cisplatin yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1,5
µg/mL; 3 µg/mL; 4,5 µg/mL; 6 µg/mL; 7,5 µg/mL dan 9 µg/mL. Konsentrasi ini
mengacu pada konsentrasi IC50 Cisplatin terhadap HeLa cell line yang
sebelumnya diteliti yakni 0,66 ppm (2.2 µM )-12,6 ppm (42 µM) (Minagawa,
1999).
Pengujian aktivitas ini sel uji atau ekstrak dilarutkan dengan DMSO.
Karena DMSO bersifat bipolar, sehingga dapat melarutkan ekstrak lebih
sempurna bila dibandingkan dengan metanol atau pelarut lain. DMSO juga
diperlukan sel sebagai cryoprotektan dalam proses cryopreservasi (Malole,
1990). Konsentrasi DMSO yang digunakan sama dengan konsentrasi sampel uji.
DMSO digunakan sebagai kontrol dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya
pengaruh DMSO terhadap pertumbuhan sel. Konsentrasi DMSO yang digunakan
harus ≤ 0.5%.
Pengujian antiproliferatif dilakukan dengan mengghunakan metode
reduksi pewarna tetrazolium (MTT) / (3–[4,5–dimethylthiazol–2Yi]–2,5–diphenyl
tetrazolium bromide) . Sel hidup dapat diketahui jumlahnya berdasarkan hasil
reaksi reduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari
garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal
formazan berwarna ungu
69
Hasil yang diperoleh dari pembacaan Elisa Reader berupa nilai
absorbansi dari tiap sumuran yang telah diberi bahan uji sesuai kelompok
perlakuan. Nilai absorbansi selanjutnya digunakan untuk mengukur pertumbuhan
sel kanker serviks HeLa pada waktu inkubasi berikutnya.
Uji doubling time merupakan metode untuk mengetahui pertumbuhan
sel diukur dari persamaan regresi linier yang dibuat dari slope sehingga
menggambarkan kinetika proliferasi sel. Langkah kerja uji ini menggunakan
Metode MTT assay dengan waktu inkubasi 24, 48 dan 72 jam.
Hasil pengamatan untuk uji proliferasi doubling time menunjukkan
bahwa persentase kehidupan sel kanker pada inkubasi 24 jam kelompok
perlakuan sampel campuran terendah, yakni 3.125 µg/mL cukup besar;
mencapai angka 92.87 % sel hidup. Selanjutnya pertumbuhan sel tampak terus
mengalami penurunan seiring bertambah besarnya konsentrasi, sampai pada
kadar 200 µg/mL, persentase sel yang hidup mencapai 54.02%.
Pada inkubasi 48 jam terlihat perbedaan yang cukup jelas antara
masing-masing konsentrasi sampel uji. Pada konsentrasi 3.125 µg/mL,
persentase sel hidup turun menjadi 89.39%, lebih rendah 3.48% dari pengamatan
24 jam . Sementara pada konsentrasi 200 µg/mL, persentase kehidupan sel
menjadi 49.55%. Pada inkubasi 72 jam juga terlihat penurunan antar perlakuan
konsentrasi. Adanya kematian sel menunjukkan bahwa sampel (campuran
katekin gambir dengan eugenol) telah berinteraksi untuk menghambat
pertumbuhan sel HeLa.
70
Pengamatan kontrol sel yang menunjukkan adanya penurunan jumlah
sel setelah inkubasi dan perbandingan perlakuan sampel dengan kontrol
menunjukkan bahwa pada kontrol sel, masih ada aktifitas proliferasi pada sel
HeLa karena tidak ada yang menghambat. Sampel campuran katekin gambir
(Uncaria gambier, Roxb) menjadi faktor utama penghambat proliferasi sel
HeLa. Namun, adanya penurunan sel hidup pada kelompok kontrol inkubasi
maing-masing waktu dapat disebabkan karena jumlah sel yang terlalu banyak dan
sumber nutrisi yang tersedia semakin lama semakin menipis. Akibatnya sel
kanker HeLa kekurangan sumber nutrisi dan akhirnya sebagian sel mengalami
kematian.
Data doubling time selanjutnya dibuat profil hubungan antara
prosentase sel hidup dan waktu inkubasi. Slope dari persamaan ini
menggambarkan kinetika pertumbuhan sel HeLa dengan perlakuan sampel uji
(Grafik 1) dan cisplatin (Grafik 2).
Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan
proliferasi sel 50 % dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap
sel. Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel
(Meiyanto, 2002). Nilai IC50 menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai
sitostatik. Semakin besar harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik.
Pada penelitian ini sampel campuran katekin gambir (Uncaria gambier Roxb)
memiliki IC50 73.45 μg/mL (inkubasi 72 jam). Sementara pada sampel katekin
gambir sendiri (tanpa campuran), IC50 yang diperoleh pada inkubasi 72 jam
adalah 73.96 dan bernilai 144,880 µg/mL pada Eugenol.
71
Menurut garis panduan American National Cancer Institute (ANCI)
suatu ekstrak dikatakan mempunyai efek antiproliferasi yang signifikan apabila
nilai IC50 yang diperoleh ≤ 20 μg/mL. Adapun menurut Meiyanto et al. (2008)
Nilai IC50 dibawah 100 μg/mL menunjukkan adanya potensi ekstrak uji sebagai
agen kemoprevensi Dengan demikian campuran katekin gambir (Uncaria
gambier Roxb) dan eugenol dapat dikatakan berpotensi sebagai agen
kemoprevensi.
72
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Perlu dilakukan pemurnian katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dari
sampel.
2. Campuran senyawa eugenol dan isolat katekin gambir (Uncaria gambier
Roxb) dari fase etil asetat mempunyai aktivitas antiproliferatif (mampu
menghambat pertumbuhan sel kanker serviks/ HeLa cell line)
3. IC50 yang diperoleh dari sampel campuran ini pada masing-masing waktu
inkubasi 24, 48, dan 72 jam berturut-turut adalah 372.4 ppm, 178.24 ppm,
dan 73.45 ppm.
4. Pada inkubasi 72 jam dengan IC50 73.45 μg/mL, sampel campuran ini
berpotensi sebagai agen kemoprevensi.
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengeni senyawa campuran
katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dengan Eugenol menggunakan sel
kanker lain atau sel yang sama dengan kombinasi senyawa campuran yang
berbeda.
73
DAFTAR PUSTAKA
Agoes, A. 1994. Catatan Kuliah Farmakologi I Laboratorium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Sriwijaya. Jakarta: EGC
Agoes, Goeswin. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung: ITB
Alamsyah, A.N. 2006. Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau. Jakarta : penerbit
Agrimedia Pustaka
Alshatwi, Ali A,. 2010. Catechin Hydrate Suppresses MCF-7 Proliferation Through
TP53/Caspase-Mediated Apoptosis. Journal of experimental and Clinical
Cancer Research, 29:167, doi:10.1186/1756-9966-29-167. Diambil dari:
http://www.jeccr.com/content/29/1/167 diakses pada tanggal 30 Maret 2011
Amos. 2010. Kandungan Katekin Gambir Setra Produksi di Indonesia. Diambil dari:
http://www.bsn.or.id diakses pada tanggal 30 November 2011
Amos, I. Zainuddin., A. Triputranto dan B. Rusmandana. 2000. Peralatan
Pengolahan Gambir. Jakarta: Majalah BPPT
Anonim. Rendang tahan tengik berkat gambir. . Koran Jakarta. . 8 Mei 2011
Ansel, H.C. 1989. Pengatar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi 4. Jakarta: UI Press
Aparicio, Xochitl -Fernandez. 2006. Chemopreventive Activity of Polyphenolics from
Black Jamapa Bean (Phaseolus vulgaris L.) on HeLa and HaCaT Cells.
Journal of agricultural and food chemistry. (J. Agric. Food Chem. 2006, 54,
2116−2122)
Armenia, A., Siregar dan H. Arifin. 2004. Toksisitas Ekstrak Gambir (Uncaria
gambir Roxb) terhadap Organ Ginjal, Hati dan Jantung Mencit. Padang:
Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8
Sepetember 2004
Arundina, Ira., Soebagyo, Retno L., dan Setyari Y, Wisnu. 2003. Efek Antiinflamasi
Catechin Pada Marmut dengan Metode Pembentukan Oedema yang
Diinduksi Suspensi Karagenik. Laporan Penelitian Lembaga Penelitian
Universitas Airlangga.
ATCC. 2011. HeLa Cell. Diambil dari: http://www.atcc.org diakses pada tanggal 30
November 2011
Aziz, M.Farid. 2006. Onkologi Ginekologi Buku Acuan Nasional. Jakarta : Yayasan
Bina Pustaka Sarwana Prawirohardjo
74
Bachtiar, A. 1991. Manfaat Tanaman Gambir. Makalah Penataran Petani dan
Pedagang Pengumpul Gambir di Kecamatan Pangakalan Kab. 50 Kota, 29-
30 November 1991. Padang: FMIPA Unand
Baratawidjaya. 2004. Imunologi Dasar Edisi ke-6. Jakarta : Balai Penerbit Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia.
Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI. 1995. Penapisan Farmakologi, Pengujian
Fitokimia dan Pengujian Klinik Pengembangan dan Pemanfaatan Obat
Bahan Alam. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI
Burkill, I.H. 1935. Dictionary of The Economic Product of Malay Peninsula. Kuala
Lumpur: Goverment of Malaysia and Singapore, PP 2196-2204
Cardellina II, J.H., Fuller, R.W., Gamble, W.R., Westergaard, C., Boswell, J.,
Munro, M.H.G. ,Currens, M. & Boyd, M.R., 1999. Evolving strategies for the
selection, dereplication and prioritization of antitumor and HIV-inhibitory
natural products extract. Dlm. Bohlin, L. & Bruhn, J.G. (pnyt.). Biossay
methods in natural product research and development. Dordrecht: Kluwer
Academic Publishers.
Cho, S.J, H.L. Valerie, S.H. Wu-Sing, K.Y. Sing, J.P. Pereira, and S.H Goh. 1998.
Novel Cytotoxic Polyprenilaterd Xanthones From Garcinia gaundichaudii
(Guttifeae), Tetrahedron, 54 (10915-10924).
Dalimartha, Setiawan. 2007. Deteksi dini kanker 7 simplisia antikanker. Jakarta :
Dirjen POM. Departemen kesehatan RI.
Dalimartha, Setiawan. 2001. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker.
Jakarta: Penebar Swadaya
Das, D.K. 1994. Naturally Occuring Flavonoids: Structure, Chemistry and High
Performance Chromatography Methods for Seperation and
Characterization. Methods in Enzymology, 234: 410-412
Departemen Kesehatan RI. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta: Dirjen
POM Departemen Kesehatan RI
Departemen Keseharan Repubik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia
Departemen Kesehatan RI. 1986. Sediaan Galenik. Jakarta: Badan Pengawasan Obat
dan Makanan
Departemen Kesehatan RI. 1989. Materia Medika Indonesia Jilid V. Jakarta: DepKes
RI
75
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum
Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan
Makanan. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional.
Departemen Farmakologi dan Terapeutik. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi V.
Jakarta: Fakultas Kedokteran
Desen, wan. 2008. Buku ajar onkologi klinis Edisi 2. Jakarta : Balai penerbit FKUI.
Dongmo, piere M. Jazet, et. Al,. 2007. Chemical Composition, Antiradical and
Antifungal Activities of Essential Oil of the Leaves of Cinnamomum
zelanycum Blume from Cameroon. Natural Product Communications I. 2
(12): 1287-1290
Eskinazi, Daniel. 1999. Botanical Medicine. United States of America : Mary Ann
Liebert Inc. Publisher
Errol, Norwitz dan John Schorge. 2007. At a Glance Obstetri dan Ginekologi.
Jakarta: EGC
Farnsworth, N.R. 1969. Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal
Pharmaceutical Science. 55 (3): 255-276
Fitrya dan Lenny Anwar. 2009. Uji Aktivitas Antikanker Secara In Vitro dengan Sel
Murine P-388 Senyawa Flavonoid dari Fraksi Etilasetat Akar Tumbuhan
Tunjuk Langit (Helmynthostachis zeylanica (Linn) Hook). Jurnal Penelitian
Sains Vol.12, No.1(C), (12106).
Freismoser, Florian M., Claude A. Jakob, Markus Aebi and Urs Tuor. 1999. The
MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide]
Assay Is a Fast and Reliable Method for Colorimetric Determination of
Fungal Cell Densities. Applied and Environmental Microbiology, p.3727-
3729. Vol 65, No.8. Diambil dari: http://aem.asm.org diakses pada tanggal
20 April 2011
Freimoser, Florian M. 1999. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is a Fast and Reliable Method for
Colorimetric Determination of Fungal Cell Densities. American Society for
Microbiology. All Rights Reserved.
Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture, A Practical Approach, 1st Ed.
Washington D.C : Oxford University Press.
Freshney, RI.. 1992. Animal cell culture practical approach. Second edition. Oxford
New York : Oxford University Press.
76
Ghosh, Rita et. al., 2005. Eugenol causes melanoma growth suppression through
inhibition of E2F1 activity. JBC Papers in Press. Published on January 18,
2005 as Manuscript M411429200
Globocan. 2008. Diambil dari: http://globocan.iarc.fr diakses pada tanggal 30
November 2011
Goodwin, E.C., DiMaio, D., 2000, Repression of human papillomavirus oncogenes
in Hela cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant
tumor suppressor pathways, Biochemistry, Vol.97, no.23.
Guevara BQ. 1985. Phytocemical microbiological and pharmacology cell screening
of the medicinal plants. Research Center University of Santo Thomas,
Philipines
Gunawan, 2004. Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta : Departemen Kesehatan
Republik Indonesia
Gunawijaya, F.A., Gandasentana R., dan Wahyudi K. 1999. Efek Pemberian Katekin
Teh Hijau Pada Pertumbuhan Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain GR.
Majalah Ilmu Fakultas Kedokteran Usakti Vol.18, No.2. Hal: 61-67
Hadad, E.A., N.R. Ahmadi, M. Herman, H. Supriadi dan A.M Hasibuan. 2007.
Teknologi Budidaya dan Pengolahan Hasil Gambir. Diambil dari:
http://balittri.litbang.go.id diakses pada tanggal 22 April 2011
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Bandung : Penerbit ITB
Hartoyo, A. 2003. Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit
Kanisius
Haryanto, Sugeng. 2009. Ensiklopedi Tanaman Obat Indonesia. Yogyakarta: Pallmal
Hasanah, Uswatun. 2006. Uji sitotoksitas Ekstrak Etanol Biji Mimba (Azadirachta
Indica A. Juss) terhadap sel HeLa secara in vitro. Skripsi. FMIPA.
UHAMKA
Hayani, Eni. 2003. Analisis kadan catechin dari gambir dengan berbagai metode.
Bulletin teknik pertanian Vol. 8 No. 1
Hirasawa, Masatomo., and Takada, Kazuko. 2004. Multiple Effects of Green Tea
Catechin on The Antifungal Activity of Antimycotics Against Candida
Albicans. Journal of Antimicrobial Chemotheraphy 53, 225-229. Diambil
dari: www.jac.oxfordjournals.org diakses pada tanggal 22 Juni 2011.
Hutapea & JR. 1991. Inventaris tanaman obat Indonesia. Jilid I. Jakarta :
Departemen Kesehatan Republik Indonesia
77
Hukmah, Sho’irotul. 2007. Skripsi: Aktivitas Antioksidan Katekin dari Teh Hijau
(Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast))Hasil Ekstraksi dengan
Variasi Pelarut dan Suhu. Malang: Jurusan Kimia Fakultas Sains dan
Teknologi Universitas Islam Negeri Malang.
Jaganathan, 2010. Effect of Honey and Eugenol on Ehrlich Ascites and Solid
Carcinoma. Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2010,
Article ID 989163. Hindawi Publishing Corporation
Jaganathan, Savarana Kumar. 2010. Apoptotic effect of eugenol in human colon
cancer cell lines. Cell Biology International Immediate Publication.
Published on 02 Nov 2010 as manuscript CBI20100118
Karsono. 2009. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: Interna Publishing
Kasim, A. 2004. Peluang dan Tantangan Pemanfaatan Gambir Sebagai Bahan Baku
Perekat Pada Industi Kayu Lapis dan Papan Partikel. Padang: Seminar
Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8
Sepetember 2004
Katzung, Betram G. 2001. Farmakologi Dasar dan Klinik. Buku 3 edisi 8. Jakarta :
Penerbit Salemba Medikamalole, M.B.M. 1990. Kultur sel dan jaringan
hewan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral
Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian
Bogor
Kim, Gyoo Cheon, dkk. 2006. Caspases-dependent Apoptosis in Human Melanoma
Cell by Eugenol. The Korean Journal Anatomy. Hal 245-253.
Kozai, K., M. Soto, M. Yamaguchi, N. Nagasaka and S. Pradopo. 1995. Potential of
Gambir as an Inhibitor of Dental Plaque Formation. Dent, 5 Vol. 28 No.3,
95-96
Kusharyono. 2004. Efek Infus Gambir (Uncaria gambir Roxb) yang Diperoleh dari
Pasar terhadap Sistem Syaraf Otonom Mencit Jantan. Padang: Seminar
Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8
Sepetember 2004
Lucida, H. 2006. Determination of The Ionization Constants and The Stability of
Catechin from Gambir (Uncaria gambir Roxb). Padang: ASOPMS 12
International Conference
Lucida, Henny., Amri Bakhtiar dan Wina Astari Putri. 2007. Formulasi Sediaan
Antiseptik Mulut dari Katekin Gambir. Padang: FMIPA Universitas Andalas.
Jurnal Sains Teknogi Farmasi 12 (1). Diambil dari: http://farmasi.unand.acid
diakses pada tanggal 30 november 2011
78
Malole, MBM. 1990. Kultur Sel dan Jaringan Hewan. Bogor: Institut Pertanian
Bogor
Manopo, J. L. 2008. Isolasi Eugenol dari Bunga Cengkeh. Skripsi. Ambon:
Universitas Kristen Ambon.
Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
Meiyanto, Edi., Ratna Asmah Susidarti, Sri Handayani dan Fitria Rahmi. 2008.
Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat
Proliferasi dan Memacu Apoptosis Sel MCF-7. Majalah Farmasi Indonesia,
19(1), 12-19.
Miller, Gregg. 2008. Pencegahan dan Pengobatan Penyakit Kanker. Jakarta: PT.
Pustakaraya
Min Song, Jae., Kwang Hee Lee, and Baik Lin Seong. 2005. Antiviral Effect of
Catechins in Green Tea on Influenza Virus. Antiviral Research Vol.68, 66-
74. Diambil dari: www.sciencedirect.com pada tanggal 24 Mei 2011
Minagawa, Yukihisa., Junzo Kigawa, Hiroaki Itamochi, Yasunobu Kanamori,
Muneaki Shimada, Masakuni Takahashi and Naoki Terakawa. 1999.
Cisplatin-resistant HeLa Cells are Resistant to Apoptosis via p53-dependent
and –independent pathways. Jpn. J. Cancer Res. 90. 1373-1379
Mosmann, Tim. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:
Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal
oflmmunologicalMethods, 65 (1983) 55-63 55 Elsevier
Muchtar, Hendri., Yusmeiarti dan Gustri Yeni. 2008. Pengaruh Jenis Absorban
Dalam Proses Isolasi Katechin Gambir. Jurnal Riset Industri Vol.2, No.1:
14-23
Nafrialdi & Gan, Sulistia. 1995. Farmakologi & terapi edisi IV. Jakarta : FKUI
Nazir, M. 2000. Gambir: Budidaya, Pengolahan dan Prospek Diverifikasinya.
Padang: Yayasan Hutanku
Nugroho, Agung Endro. 2009. Efek sitotoksik dan antiproliferasi dari gamavuton-0
pada kultur sel leukemia basofilik tikus. Majalah farmasi Indonesia
Ogata, Masahiro, et. Al. 1997. Antioxidant Activity f Magnolol, Honokiol, and
Related Phenolic Coumpounds. JAOCS. 74: 557-562
P. Seraam, Navindra. 2003. Inhibition of Proliferation of Human Cancer Cells and
Cyclooxygenase Enzymes by Anthocyanidins and Catechins.
79
Parameter Umum Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, 2000; Buku panduan
Teknologi Ekstrak,
Prijono, J. 1988. Pengujian Insektisida. Bogor : Fakultas Pertanian IPB
Qiao, Yanyan., Jinyan cao, Liangqun Xie and Xiaolin Shi. 2009. Cell Growth
Inhibition and Gene Expression Regulation by (-)-Epigallocatechin-3-
Gallate in Human Cervical Cancer Cells. Arch Pharm Res Vol 32, No 9,
Radde, Ingeborg C. 1999. Farmakologi Terapi dan Pediatri Edisi II. Jakarta :
Hipokrates.
Rahayuningsih, C., T.E. Basjir dan Y. Warastuti. 2004. Uji Ekstrak Daun Gambir
(Uncaria gambir Roxb) Awet Radiasi terhadap Kemampuannya Sebagai
Anti Mikroba. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat,
Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004
Rasjidi, Imam. 2007. Panduan Penatalaksanaan Kanker Ginekologi Berdasarkan
Evidence Base. Jakarta : EGC
Risfaheri dan L. Yanti. 1993. Pengaruh Ketuaan dan Penanganan Daun Sebelum
Pengempaan terhadap Rendemen dan Mutu Gambir. Buletin Penelitian
Rempah dan Obat 8 (1): 46-51
Robbins dan Kumar. 1999. Buku Ajar Patologi I Edisi IV. Jakarta
Robinson, T. 1995. Kandungan Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi. Diterjemahkan
oleh Prof. Dr. Kosasih Padmawirata. Bandung: ITB
Ruddon, Raymond W. 2007. Cancer Biology Fourth Edition NewYork : Oxford
University Press
Sadava, David., Elizabeth Whitlock, and Susan E. Kane,. 2007. The Green Tea
Polyphenol, Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Telomerase and Induces
Apoptosis in Drug-Resistant Lung Cancer Cells. Biochemical and
Biophysical Research Communications 360 (2007), 233-237. Diambil dari:
http://www.sciencedirect.com diakses pada tanggal 29 April 2011
Sait, S., A. Sudibyo dan E.H. Loebis. 1987. Penelitian Pengolahan Getah Gambir.
Balai Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian Bogor: Proyek
Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian.
Seeram, P. Navindra., Yanjun Zhang and Muraleedharan G. Nair. 2003. Inhibition of
Proliferative of Human Cancer Cell and Cyclooxigenase Enzymes by
Anthocyanidins and Catechins. Nutrition and Cancer, 46 (1): 101-106.
80
Diambil dari: http://www.encognitive.com diakses pada tanggal 29 April
2011
Shanie, M., V. Hosiana dan A. Bakhtiar. 2004. Formulasi Shampo Gambir Murni.
Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI.
Tanggal 7-8 Sepetember 2004
Sieuwerts, Anieta M. 1995. The MTT Tetrazolium Salt Assay Scrutinized: How to
Use this Assay Reliably to Measure Metabolic Activity of Cell Cultures in
vitro for the Assessment of Growth Characteristics, IC50-Values and Cell
Survival. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33:813-823
Sigma. 2011. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Formulations. Diambil
dari: http://www.sigmaaldrich.com diakses pada tanggal 01 Oktober 2011
Siswandono dan Bambang Soekarjo. 2000. Kimia Medisinal Edisi II. Surabaya:
Universitas Airlangga press
Sudjarwo, Sri Agus. 2004. Protective Effect of Catechin on Endothelial Cell in
Hypercholesterolemia. Journal kedokteran Trisakti, Vol.23, No. 1: 1-5.
Diambil dari: http://isjd.pdii.lipi.go.id diakses pada tanggal 25 Mei 2011.
Suherdi, A., Denian dan H. Syamsu. 1991. Budidaya dan Pasca Panen Gambir serta
Permasalahannya. Biro Bina Pengembangan. Sarana Perekonomian, Dati I
Sumbar, Padang
Sukati, K., dan Kusharyono. 2004. Efek Infus Gambir (Uncaria gambir Roxb) yang
Diperoleh dari Pasar terhadap Parameter Onset dan Durasi Waktu Tidur
Tiopental Pada Mencit Jantan. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan
Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004
Sukardiman. 1999. Paduan Senyawa Aktif Kunyit dan Sambiloto Sebagai Antikanker.
Surabaya: Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
Sukardja, I Dewa Gede. 2000.Onkologi Klinik edisi 2. Surabaya : Airlangga
University Press
Tedjo, Aryo., Dondin Sajuthi dan Latifah K. Darusman. 2005. Aktivitas
Kemoprevensi Ekstrak Temu Mangga. Jurnal Kesehatan, Vol.9, No.2 : 57-62
The Merck Index. 2006. An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 14th
ed. Merck and Co Inc, Pathway W.J.USA.
Thorpe, J.F., and Whiteley M.A. 1921. Thorpe’s Dictionary of Applied Chemistry,
Fourth Edition, Vol.II. London: Longman, Green and Co, 434-438
81
Tika, F.H., H. Mukhtar dan A. Bakhtiar. 2004. Efek Katekin dari Gambir terhadap
Tukak Lambung Tikus Putih Betina. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan
Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004
Tjay. 2007. Obat-obat penting. Jakarta : Elex Media Komputindo
Tsuchiya, Hironori., Toshiyuki Tanaka and Motohiko Nagayama. 2008.
Antiproliferative Effects Assosiated with Membrane Lipid Interaction of
Green Tea Catechins. Journal of Health Science 54 (5): 576-580. Diambil
dari: http://jhs.pharm.or.ip diakses pada tanggal 29 April 2011
Utami, Dwi. 2007. Sintesis senyawa Kalkon dan turunannya serta uji antiproliferasi
terhadap sel HeLa. Thesis. Universitas Gadjah Mada
Wagner, H. 1985. Immunostimulants from Medicinal Plants. In Advances in Chines
Medicinal Material Research (Eds.) H.M Chang; H.w. Yeung; W.W. Tso
and A. Koo. World Scintific Publ. Co. Singapura: 159-170
Wazzan, Khalid A. Al, Ali A. Al_ Harbi dan Ihab A. Hammad. 1997. The effect of
Eugenol-Containing Temporary Cemment on The Bond Strength of Two
Resin Composite Core Materials to Dentin. Journal of Prostodhontic. 6 (1):
37-42
Wattemberg LW. 1992. Inhibition of Carcinogenesis by Minor Dietary Constituents.
Cancer Res. 52: 2085-2087
WHO. 1998. Quality Control of Methods for Medicinal Plants Material.
Switzerland: Geneva
Yoshino et al. 1996. Antimicrobial Activity of Tea Extracts on Cariogenic Bacterium
(Streptococcus mutans). J. Food hyg. Soc. Japan Vol. 37, No.2: 104-108.
Diambil dari: http://rms1.agsearch.agropedia.affrc.go diakses pada tanggal
22 Mei 2011.
Zwavelling, A., R.J. Van Zonneveld dan A. Schaberg. 1985. Onkologi. Jakarta: Balai
Pustaka
82
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil Determinasi Gambir
83
Lampiran2. Sertifikasi Eugenol
84
Lampiran 3. Sertifikat Kemurnian Katekin Standar
85
Gambar 5. Bongkah
Gambir (Uncaria
gambier Roxb)
Gambar 4. Eugenol
Lampiran 4. Eugenol, Gambir(Uncaria gambier Roxb), dan Katekin
Gambar 6.
Serbuk Gambir
Gambar 7.
Hasil Identifikasi
Gambir
Gambar 8. Hasil
Uji Cemaran Urea
Gambar 9.
Serbuk Katekin
Sampel
Gambar 10.
Serbuk Katekin
Standar
86
Lampiran 5. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia
a. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia Serbuk Gambir
Tabel 9. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia Serbuk Gambir
Golongan Hasil Pengamatan
1. Flavonoid + Filtrat ditambahkan serbuk Zn, HCl P,
amilalkohol,dikocok kuat, didiamkan hingga
memisah. Hasilnya terbentuk warna coklat dalam
amilalkohol.
2. Tanin + Pada filtrat terbentuk warna hijau tua setelah
diteteskan FeCl3 1%.
3. Alkaloid + 1. Pada filtrat terbentuk endapan merah bata setelah
ditambahkan pereaksi Dragendorf.
2. Terbentuk endapan putih pada filtrat setelah
diteteskan pereaksi Meyer.
4. Saponin + Pada filtrat terbentuk buih setelah dikocok kuat dan
buih tetap stabil setelah ditaeteskan HCl 2N
5. Kuinon + Terbentuk warna merah pada filtrat setelah diteteskan
peraksi NaOH 1N
6. Steroid dan
Triterpenoid
- Tidak adanya perubahan warna pada residu setelah
penambahan pereaksi asam asetat anhidrat dan asam
sulfat pekat.
7. Minyak
Atsiri
- Tidak adanya bau aromatis pada residu yang telah
diuapkan.
87
Lampiran 6. Hasil Pengujian Karakteristik Katekin
a. Penetapan Kadar Air
- Berat botol kosong sebelum dikeringkan = 24.5662 gram
- Berat botol kosong setelah dikeringkan = 24.5592 gram
- Berat botol + katekin sebelum dikeringkan (W0) = 25.5644 gram
- Berat botol + katekin setelah dikeringkan (W1) = 25.5532 gram
Susut pengeringan = 𝑊0−𝑊1
𝑊0 𝑥 100%
= 25.5644−25.5532
25.5644 𝑥 100%
= 0.044%
Maka, susut pengeringan katekin adalah sebesar 0.044%
b. Penetapan Kadar Abu
- Berat cawan kosong sebelum dikeringkan = 19.0531 gram
- Berat cawan kosong setelah dikeringkan = 19.0379 gram
- Berat cawan + katekin sebelum dikeringkan (W0) = 20.0400 gram
- Berat cawan + katekin setelah dikeringkan (W1) = 20.0259 gram
Kadar abu = 𝑊0−𝑊1
𝑊0 𝑥 100%
= 20.0400 −20.0259
20.0400 𝑥 100%
= 0.070%
Maka, kadar abu katekin adalah 0.070%
88
Lampiran 7. Lanjutan
c. Penetapan Rendemen
- Bobot serbuk katekin yang diperoleh = 309.37 gram
- Bobot serbuk gambir yang diekstraksi = 500.29 gram
Rendemen = % kemurnian x Bobot serbuk katekin
Bobot serbuk gambir di ekstraksi
= 79.73% x 309.37
500.29 = 49.30 %
Maka, persentase rendemen katekin adalah 49.30 %
89
Lampiran 8. Hasil Penetapan Kadar Katekin
1. Hasil Absorbansi standar katekin
Berdasarkan data absorbansi dan konsentrasi standar katekin di atas, diperoleh
nilai :
A = -0,0274 B = 3,1757R = 0,9514
Perhitungan konsentrasi standar : y = a + bx
1. 0,013 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0127
2. 0,045 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0228
3. 0,088 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0363
4. 0,152 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0565
5. 0,173 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0631
2. Hasil absorbansi katekin sampel
90
Perhitungan konsentrasi sampel : y = a + bx
1. 0,002 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 9,2578 x 10-3
2. 0,035 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0196
3. 0,067 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0297
4. 0,108 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0426
5. 0,138 = -0,0274 + 3,1757 x
x = 0,0521
Tabel 10. Perhitungan Persentase Kadar Katekin Sampel
No Konsentrasi
standar
Konsentrasi
sampel
Persentase kadar (%)
1 0,0127 9,2578 x 10-3
9,2578 x 10-3
/ 0,0127 = 72,90
2 0,0228 0,0196 0,0196 / 0,0228 = 85,96
3 0,0363 0,0297 0,0297 /0,0363 = 81,82
4 0,0565 0,0426 0,0426 / 0,0565 = 75,40
5 0,0631 0,0521 0,0521 / 0,0631 = 82,57
𝑋 = 72.89% + 85.96% + 81.82% + 75.40% + 82.57%
5= 79.73%
91
Lampiran 9. Skema Proses Pembuatan Katekin Gambir (Uncaria gambierRoxb)
Bongkahan Gambir
(Uncaria gambier Roxb)
Di tumbuk halus hingga menjadi serbuk
Serbuk di re-ekstraksi infusa dengan pelarut
aquades pada 90-960C selama 15-20 menit
Ekstrak gambir
Partisi dengan etil asetat (filtrat:etil asetat = 1:½), ditambahkan NaCl hingga
jenuh dilakukan hingga 5 kali
Fase air
dipisahkan
Fase etil asetat
dikumpulkan
Dipekatkan dengan
rotary evaporator
pada suhu 500C
Serbuk
katekin
gambir
Dipartisi kembali dengan etil
asetat (berulang-ulang)
Ekstrak kental dilarutkan
dalam air dingin bagian tidak
larut (Katekin)
Disaring dengan
kertas saring
Dikeringkan
dengan oven
50oC
Penetapan kadar
katekin
Sortasi kering dan
penggilingan
Peyaringan
Fase air
dibuang
Uji efek antiproliferatif
92
Lampiran 10.Skema Kerja Kultivasi Sel HeLa
Thawing di water bath pada suhu 370C
Pindahkan sel ke Flask yang sudah
berisi medium. (Sebelum larutan dalam
cryo vial mencair semua )
Media Kultur + 10% FBS
Inkubasi pada inkubator (suhu 370C,
CO2 5%) hingga sel menempel pada
dasar flask (± 4-24 jam)
Sel diamati jika sel sudah menempel,
buang medium, cuci dengan PBS 1X (1-
2x), lalu ganti dengan medium baru.
Setelah itu sel diamati lagi dengan
mikroskop
Inkubasi pada inkubator (suhu
370C, CO2 5%) hingga sel mencapai
kerapatan 70-80%
Sel disubkultur apabila kerapatan
mencapai 70-80% dari permukaan flask
Sel dalam cryo vial
93
Lampiran 11.Skema Kerja Subkultivasi Sel HeLa
Sel HeLa hasil kultivasi didalam T-flask
Sel diamati , buang medium, cuci dengan PBS 1X
(1-2x), Menambahkan Trypsin EDTA 400 µL +
PBS 5400 µL
Inkubasi dalam inkubator (suhu 370C, CO2 5%)
selama ± 3 menit
Tambahkan medium kultur DMEM berserum
(900 µL)
Centrifuge 1000 rpm ± 5 menit
Endapan disimpan dalam
cryo vial
Endapan
dimasukkan
kedalam cuvet
Endapan dimasukkan ke
T-flask ,dikultur kembali
Kerapatan sel dihitung dengan Haemocytometer dibawah
mikroskop inverted
+ Trypan blue 50 µL
Rasio sel 5x103 sel/100 µL
Didekantasi, endapan diambil
94
Lampiran 12. Uji MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yI]-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide)
Suspensi sel dalam DMEM berserum dimasukkan
ke dalam tiap sumuran sebanyak 100 µL
+ 100 µL perlakuan dimasukkan
ke dalam tiap sumuran
Diinkubasi dalam inkubator CO2 pada
suhu 37oC selama 24, 48 dan 72 jam
Hasil inkubasi sel dalam sumuran
ditambahkan 10 µL MTT
Diinkubasi dalam inkubator CO2
pada suhu 37oC selama 4 jam
Hasil inkubasi sel dalam sumuran
Sel dihitung dengan ELISA
reader pada panjang gelombang
490 dan 630 nm
+ 50 µL SDS 10% ke dalam tiap
sumuran dan diinkubasi dalam
ruang gelap selama 16 jam
95
Lampiran 13.Perhitungan Konsentrasi Sampel (Campuran Katekin dan Eugenol)
- Sebanyak masing-masing 125 mg katekin dan eugenol ditimbang dan
dimasukkan ke dalam mikro tube. (total : 250 mg)
- Ditambahkan 5000 µL DMSO 99.9% disentrifuge
250 𝑚𝑔
5 𝑚𝐿 =
250000 µ𝑔
5000 µ𝐿
= 50 µ𝑔/µ𝐿
= 50000 µ𝑔/𝑚𝐿
= 50000 µg/mL (larutan induk 1)
- Larutan induk 1 diencerkan hingga 10 kali
Rumus pengenceran pada masing-masing konsentrasi
𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2
Keterangan : V1 = Volume yang digunakan (µL)
N1 = Konsentrasi larutan induk (µg/mL)
V2 = Total volume larutan yang dibuat (µL)
N2 = Konsentrasi larutan sampel (µg/mL)
Maka:
𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2
V1 x 50000 µg/mL = 10000 µL x 5000 µg/mL
V1 = 10000 𝜇𝐿×5000 µg /mL
50000 µg /mL
V1 = 1000 µL + aquadest ad 10000 µL
96
Lampiran 14. Lanjutan
Sebanyak 1000 µL larutan induk 1 dipipet lalu diencerkan dengan penambahan
aquadest hingga 10000 µL
Contoh perhitungan pengenceran dari larutan induk 2
- Pembuatan konsentrasi 200 µg/mL
𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2
V1 x 5000 µg/mL = 1500 µL x 200 µg/mL
V1 = 1500 µ𝐿 × 200 µg /mL
5000 µg /mL
V1 = 60 µL
50000 µg/mL (larutan induk
1)
1000 µL larutan induk 1 dipipet
+ aquadest sebanyak 10000 µL
5000 µg/mL (larutan induk 2)
97
Lampiran 15.Lanjutan
Tabel 11. Hasil Perhitungan Konsentrasi Sampel
(*) : Pengenceran dilakukan menggunakan konsentrasi 100 µg/mL sebagai larutan
induk.
Konsentrasi
Larutan Induk
(N1)
( µg/mL )
Konsentrasi
Larutan Sampel
(N2)
( µg/mL )
Volume yang
Digunakan
(V1)
(µL)
Total volume
Larutan yang Dibuat
(V2)
(µL)
5000
200 60
1500
100 30
50 15
25 37.5*
12.5 187.5*
6.25 93.8*
3.125 46.88*
98
Lampiran 16.Perhitungan Konsentrasi Cisplatin
Larutan induk I = 500 µg/mL (10 mg/20 mL)
Larutan induk II (50 µg/mL) =5000 𝜇𝐿 ×50 µg /mL
500 µg /mL = 500 𝜇𝐿 +aq. ad 5000 µL
Volume Cisplatin yang akan dibuat tiap konsentrasi = 1000 µL
Contoh perhitungan konsentrasi Cisplatin:
- Pembuatan konsentrasi 3 µg/mL
𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2
V1 x 50 µg/mL = 1000 µL x 3 µg/mL
V1 = 1000 𝜇𝐿×3 µg/mL
50 µg/mL
V1 = 60 µL + aquadest ad 1000 µL
Konsentrasi
Larutan Induk
(N1)
(µg/mL)
Konsentrasi
Larutan Sampel
(N2)
(µg/mL)
Volume yang
Digunakan
(V1)
(µL)
Total volume
Larutan yang Dibuat
(V2)
(µL)
50
1.5 30
1000
3 60
4.5 90
6 120
7.5 150
18-9 180
Tabel 12. Hasil Perhitungan Konsentrasi Cisplatin
99
Lampiran 17.Perhitungan Kepadatan Sel
Kepadatan sel dihitung menggunakan Haemocytometer dengan cara
menghitung 25 bilik kecil pada Haemocytometer.
Maka, 151 x 104 = 1.51 x 10
6 sel/mL
Artinya: didalam 1 mL mengandung sel sebanyak 1.51 x 106 sel
Syarat jumlah sel dalam setiap sumuran adalah 5 x 103 sel
Maka: Σ sel x V sel yang diambil = syarat sel/sumuranx V yang dibuat
1.51 x 106 sel/mL x V = 5 x 10
3 sel/sumuran x 1000 µL
V = 5 ×103sel /sumuran ×1000 μL
1.51×106sel /mL
= 3.31 µL sel HeLa/sumuran
Jumlah sumuran yang digunakan adalah sebanyak 90 sumuran
Maka:
Σ sel/sumuran x Σ sumuran yang digunakan = 3.31 µL sel x 90 sumuran
= 297.9 µL sel ≈ 298 µL sel
Jumlah DMEM berserum =100 μL/sumuran x 90 sumuran = 9000 μL = 9 mL
Maka didalam tabung conical steril berisi:
298 µL sel + DMEM berserum ad 9 mL
Kemudian dipipetkan sebanyak 100 μL ke dalam masing-masing sumuran.
100
Lampiran 18.Skema Pemetaan Pada Sumuran 96
Keterangan Gambar:
Kontrol (-)
Sumuran A1, 2, 3 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.4%
Sumuran A4, 5, 6 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.2%
Sumuran A7, 8, 9 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.1%
Sumuran A10, 11, 12 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.05%
Sumuran B1,C1,D1 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.025%
Sumuran E1,F1,G1 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.0125%
Sumuran B12,C12,D12 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.00625%
Sumuran E12,F12,G12 : 200 µL DMEM berserum
Sumuran H1, 2, 3, 4, 5, 6 : suspensi sel + DMEM berserum (blanko)
Kontrol (+)
Sumuran B9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 1.5 µg/mL
Sumuran C9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 3 µg/mL
Sumuran D9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 4.5 µg/mL
101
Lanjutan
Sumuran E9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 6 µg/mL
Sumuran F9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 7.5 µg/mL
Sumuran G9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 9 µg/mL
Sampel (Katekin + Eugenol)
Sumuran E2, F2,G2 : suspensi sel+ sampel konsentrasi 3.125 µg/mL
Sumuran E3,F3,G3 : suspensi sel+ sampel konsentrasi 6.25 µg/mL
Sumuran E4, F4,G4 : suspensi sel+ sampel konsentrasi 12.5 µg/mL
Sumuran E5, F5,G5 : suspensi sel + sampel konsentrasi 25 µg/mL
Sumuran E6, F6,G6 : suspensi sel + sampel konsentrasi 50 µg/mL
Sumuran E7, F7,G7 : suspensi sel + sampel konsentrasi 100 µg/mL
Sumuran E8, F8,G8 : suspensi sel + sampel konsentrasi 200 µg/mL
102
Lampiran 19. Perhitungan dan Grafik IC50 campuran katekin gambir dan Eugenol
terhadap HeLa Cell Line
DMSO Campuran Katekin
Gambir dan Eugenol %
Hidup
%
Inhibisi
Log
Kons Probit Kons
(%) Data 𝑥
Kons
(µg/
mL)
Data 𝑥
24 Jam
0.00625 0.497 0.427 0.420 0.463 3.125 0.547 0.397 0.347 0.430 92.87 7.13 0.495 3.5316
0.0125 0.438 0.487 0.491 0.472 6.25 0.420 0.403 0.390 0.404 85.59 14.41 0.796 3.9375
0.025 0.425 0.499 0.507 0.477 12.5 0.442 0.437 0.327 0.402 84.28 15.72 1.097 3.9931
0.05 0.471 0.469 0.457 0.464 25 0.400 0.343 0.314 0.352 74.55 25.45 1.398 4.3380
0.1 0.429 0.467 0.478 0.458 50 0.348 0.324 0.331 0.334 72.93 27.07 1.669 4.3872
0.2 0.446 0.453 0.454 0.451 100 0.346 0.310 0.285 0.314 69.62 30.38 2 4.4842
0.4 0.427 0.461 0.456 0.448 200 0.317 0.262 0.148 0.242 54.02 45.98 2.301 4.8970
4 8 J a m
0.00625 0.366 0.304 0.403 0.358 3.125 0.391 0.360 0.208 0.320 89.39 10.61 0.495 3.7519
0.0125 0.250 0.484 0.597 0.444 6.25 0.350 0.312 0.287 0.316 71.17 28.83 0.796 4.4408
0.025 0.529 0.480 0.272 0.427 12.5 0.300 0.296 0.288 0.295 70.53 29.47 1.097 4.4583
0.05 0.456 0.332 0.307 0.365 25 0.346 0.156 0.239 0.247 67.67 32.33 1.398 4.5407
0.1 0.327 0.332 0.326 0.328 50 0.234 0.209 0.205 0.216 65.85 34.15 1.669 4.5903
0.2 0.343 0.321 0.341 0.335 100 0.218 0.180 0.161 0.186 55.52 44.48 2 4.8592
0.4 0.314 0.349 0.330 0.331 200 0.200 0.162 0.130 0.164 49.55 50.45 2.301 5.0100
7 2 Jam
0.00625 0.285 0.275 0.487 0.349 3.125 0.320 0.293 0.269 0.294 84.24 15.76 0.495 3.9931
0.0125 0.340 0.297 0.266 0.301 6.25 0.257 0.195 0.187 0.213 70.76 29.24 0.796 4.4524
0.025 0.247 0.364 0.232 0.281 12.5 0.260 0.171 0.145 0.192 68.33 31.67 1.097 4.5230
0.05 0.253 0.261 0.275 0.263 25 0.172 0.170 0.150 0.164 62.36 37.64 1.398 4.6840
0.1 0.274 0.246 0.257 0.259 50 0.150 0.141 0.132 0.141 54.45 45.55 1.669 4.8870
0.2 0.282 0.228 0.243 0.251 100 0.201 0.095 0.067 0.121 48.21 51.79 2 5.0426
0.4 0.231 0.242 0.226 0.247 200 0.139 0.092 0.044 0.092 38.17 61.83 2.301 5.3002
Tabel 13. Data Hasil Efek Antiproliferatif Eugenol dengan Katekin
terhadap Sel HeLa dalam Interval Waktu Inkubasi
103
Contoh perhitungan % Inhibisi dan % Hidup Konsentrasi 3.125 µg/mL Pada
24 Jam:
%Inhibisi = AbsDMSO − AbsSampel
AbsDMSO× 100%
= 0.463−0.430
0.463× 100%
= 7.13%
%Hidup = 100% - 7.13% = 92.87%
D. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb)
dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 24 Jam
a = 3.298 Maka: y = a + bx
b = 0.662 y = 3.298 + 0.662x
r = 0.973 5 = 3.298 + 0.662x
x = 2.571
IC50 = Antilog x
= Antilog 2.571
= 372.4 µg/mL
E. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb)
dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 48 Jam
a = 3.735 Maka: y = a + bx
b = 0.562 y = 3.735 + 0.562x
r = 0.914 5 = 3.735 + 0.562x
x = 2.251
IC50 = Antilog x
= Antilog 2.251
= 178.24 µg/mL
104
F. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb)
dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 72 Jam
a = 3.791 Maka: y = a + bx
b = 0.648 y = 3.791 + 0.648x
r = 0.983 5 = 3.791 + 0.648x
x = 1.866
IC50 = Antilog x
= Antilog 1.866
= 73.45 µg/mL
105
Lampiran 20. Perhitungan dan Grafik IC50 Cisplatin terhadap HeLa Cell Line
Medium
dan Sel
Cisplatin %
Hidup
%
Inhibisi
Log
konsentrasi Probit Konsentrasi
(µg/mL) Data 𝑋
24 Jam 1.5 0.387 0.264 0.256 0.302 63.05 36.95 0.176 4.6681
0.423
0.451
0.563
3 0.279 0.373 0.241 0.279 58.25 41.75 0.447 4.7930
4.5 0.234 0.258 0.255 0.378 51.98 48.02 0.653 4.9408
6 0.273 0.182 0.219 0.225 46.97 53.03 0.778 5.0753
𝑥 =
0.479
7.5 0.256 0.194 0.140 0.197 41.13 58.87 0.875 5.2250
9 0.230 0.071 0.159 0.166 34.66 65.34 0.954 5.3934
48 Jam 1.5 0.338 0.303 0.247 0.296 57.70 42.30 0.176 4.8058
0.482
0.521
0.536
3 0.232 0.219 0.321 0.257 50.1 49.90 0.447 4.9975
4.5 0.217 0.224 0.300 0.247 48.15 51.85 0.653 5.0476
6 0.220 0.217 0.215 0.217 42.30 57.70 0.778 5.1942
𝑥 =
0.513
7.5 0.161 0.210 0.166 0.179 34.88 65.12 0.875 5.3880
9 0.128 0.140 0.090 0.119 23.2 76.80 0.954 5.7323
72 Jam 1.5 0.204 0.288 0.272 0.255 47.05 52.95 0.176 5.0753
0.557
0.528
0.541
3 0.261 0.160 0.223 0.215 39.67 60.33 0.447 5.2611
4.5 0.192 0.221 0.181 0.198 36.53 63.47 0.653 5.3451
6 0.167 0.141 0.123 0.144 29.89 70.11 0.778 5.5273
𝑥 =
0.542
7.5 0.105 0.096 0.103 0.101 18.63 81.37 0.875 5.8927
9 0.081 0.085 0.094 0.087 16.05 83.95 0.954 5.9945
Tabel 14. Data Hasil Efek Antiproliferatif Cisplatin terhadap Sel HeLa
dalam Interval Waktu Inkubasi
Contoh perhitungan % Inhibisi dan % Hidup Konsentrasi 1.5 µg/mL Pada 24
Jam:
%Inhibisi = AbsBlanko − AbsCisplatin
AbsBlanko× 100%
= 0.479−0.302
0.479× 100% = 36.95%
%Hidup = 100% - 36.95%= 63.05%
106
G. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 24 Jam
a = 4.429 Maka: y = a + bx
b = 0.900 y = 4.429 + 0.900x
r = 0.957 5 = 4.429 + 0.900x
x = 0.634
IC50 = Antilog x
= Antilog 0.634
= 4.305 µg/mL
H. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 48 Jam
a = 4.525 Maka: y = a + bx
b = 1.026 y = 4.525 + 1.026x
r = 0.900 5 = 4.525 + 1.026x
x = 0.463
IC50 = Antilog x
= Antilog 0.463
= 2.904 µg/mL
I. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 72 Jam
a = 4.753 Maka: y = a + bx
b = 1.169 y = 4.753 + 1.169x
r = 0.927 5 = 4.753 + 1.169x
x = 0.211
IC50 = Antilog x
= Antilog 0.211
= 1.626 µg/mL
107
Lampiran 21. Haemocytometer
Gambar 11. Alat Haemocytometer
Gambar 12. Pemetaan Haemocytometer
108
Lampiran 22.Alat dan Bahan yang Digunakan Dalam Penelitian
A. Alat
Gambar 13.
Biology Safety
Cabinet
Gambar 14.
Inkubator CO2
Gambar 16.
Mikroskop
Inverteed
Gambar 15.
Autoklaf
Gambar 17.
Micropipet
Gambar 18.
Sentrifuge
Gambar 19.
ELISA reader
Gambar 20.
T-flask
Gambar 22.
Microwell
Plate 96
Gambar 21.
Spektrometer UV
109
B. Bahan
Gambar 23.
Medium DMEM
Gambar 24.
DMSO
Gambar 25.
Fetal Bovine Serum
Gambar 28.
TRYPSIN EDTA
Gambar 26.
MTT
Gambar 27.
Tripan Blue
Gambar 30. Sodium
Dodecyl Sulfate
Gambar 29.
Phosphate Buffer
Saline
110
Lampiran 23. Deskripsi Medium DMEM
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media
PRODUCT DESCRIPTION
A basal medium consisting of vitamins, amino acids, salts, glucose and a pH indicator. It contains no
proteins or growth promoting
agents.
BRANDSIGMA®
Component D5796
[1x] g/L
Inorganic Salts
Calcium Chloride 0.2
Ferric Nitrate • 9H2O 0.0001
Magnesium Sulfate (anhydrous) 0.09767
Potassium Chloride 0.4
Sodium Bicarbonate 3.7
Sodium Chloride 6.4
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) 0.109
Amino Acids
L-Arginine • HCl 0.084
L-Cystine • 2HCl 0.0626
L-Glutamine 0.584
Glycine 0.03
L-Histidine • HCl • H2O 0.042
L-Isoleucine 0.105
L-Leucine 0.105
L-Lysine • HCl 0.146
L-Methionine 0.03
L-Phenylalanine 0.066
L-Serine 0.042
L-Threonine 0.095
L-Tryptophan 0.016
L-Tyrosine • 2Na • 2H2O 0.10379
L-Valine 0.094
Vitamins
Choline Chloride 0.004
Folic Acid 0.004
myo-Inositol 0.0072
Niacinamide 0.004
D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0.004
Pyridoxal • HCl —
Pyridoxine • HCl 0.004
Riboflavin 0.0004
Thiamine • HCl 0.004
Other
D-Glucose 4.5
HEPES —
Phenol Red • Na 0.0159
Pyruvic Acid • Na —
Add
Glucose —
L-Glutamine —
Sodium Bicarbonate —
111
Lampiran 24.Transformasi Persen – Probit
% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
0 0.0 1.0098 2.1218 2.2522 2.3479 2.4242 2.4879 2.5427 2.5914 2.6344
1 2.6737 2.7096 2.7429 2.7738 2.8027 2.8299 2.8556 2.8799 2.3031 2.9251
2 2.9463 2.9665 2.9859 3.0646 3.0226 3.0400 3.0569 3.0732 3.0896 3.1043
3 3.1192 3.1337 3.1478 3.1616 3.1750 3.1881 3.2009 3.2134 3.2256 3.2376
4 3.2493 3.2608 3.2721 3.2831 3.2940 3.3046 3.3151 3.3253 3.3354 3.3454
5 3.3351 3.3648 3.3742 3.3836 3.3028 3.4018 3.4107 3.4105 3.4282 3.4368
6 3.4452 3.4536 3.4618 3.4699 3.4780 3.4850 3.4037 3.5015 3.5091 3.5167
7 3.5242 3.5316 3.5380 3.5462 3.5534 3.5605 3.5675 3.5745 3.5813 3.5882
8 3.5949 3.6016 3.6083 3.6148 3.6213 3.0278 3.0342 3.6405 3.6408 3.0531
9 3.6692 3.6654 3.6715 3.6775 3.6835 3.6894 3.6053 3.7012 3.7070 3.7127
10 3.7184 3.7241 3.7298 3.7354 3.7409 3.7464 3.7519 3.7574 3.7028 3.7681
11 3.7735 3.7784 3.7840 3.7893 3.7945 3.7996 3.8048 3.8099 3.8150 3.8200
12 3.8250 3.8300 3.8350 3.8399 3.8448 3.8497 3.8545 3.8503 3.8641 3.8089
13 3.8736 3.8783 3.8830 3.8877 3.8923 3.8069 3.9015 3.9061 3.9107 3.9152
14 3.9197 3.9242 3.9286 3.9331 3.9375 3.0419 3.9463 3.9506 3.9550 3.9593
15 3.9636 3.9678 3.9721 3.9763 3.8900 3.0848 3.0890 3.9931 3.9973 4.0014
16 4.0055 4.0096 4.0137 4.0178 4.0218 4.0259 4.0299 4.0339 4.0379 4.0410
17 4.0458 4.0408 4.0537 4.0576 4.001 5 4.0654 4.0693 4.0731 4.0770 4.0808
18 4.0846 4.0884 4.0922 4.0960 4.0998 4.1035 4.1073 4.1110 4.1147 4.1184
19 4.1221 4.1258 4.1295 4.1331 4.1367 4.1404 4.1440 4.1476 4.1512 4.1548
20 4.1684 4.1019 4.1035 4.1690 4.1726 4.1761 4.1796 4.1831 4.1866 4.1901
21 4.1936 4 1970 4.2005 4.2039 4.2074 4,2108 4.2142 4.2176 4.2210 4.2244
22 4.2278 4.2312 4.2345 4.2379 4.2412 4.2446 4.2479 4.2512 4.2546 4.2579
23 4.2612 4.2644 4.2677 4.2710 4.2743 4.2775 4.2808 4.2840 4.2872 4.2905
24 4.2937 4.2969 4.3001 4.3033 4.3065 4.3097 4.3129 4.3160 4.3192 4.3224
112
Lampiran 25.Lanjutan
% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
25 4 3255 4.3287 4.3318 4.3349 4.3380 4.3412 4.3443 4.3474 4.3505 4.3536
26 4.3567 4.3597 4.3628 4.3659 4.3689 4.3720 4.3750 4.3781 4.3811 4.3842
27 4.3872 4.3902 4.3932 4.3962 4.3992 4.4022 4.4052 4.4082 4.4112 4.4142
28 4.4172 4.4201 4.4231 4.4260 4.4290 4.4319 4.4349 4.4378 4.4408 4.4437
29 4.4466 4.4405 4.4524 4.4554 4.4583 4.4612 4.4041 4.4670 4.4698 4.4727
30 4.4756 4.4785 4.4813 4.4842 4.4871 4.4899 4.4928 4.4956 4.4985 4.5013
31 4.5041 4.5070 4.5098 4.5126 4.5155 4.5183 4.5211 4.5230 4.5267 4.5295
32 4.5323 4.5351 4.5370 4.5407 4.5435 4.5462 4.5490 4.5518 4.5546 4.5573
33 4 .5601 4.5628 4.5656 4.5684 4.5711 4.5739 4.5766 4.5793 4.5821 4.5848
34 4.5875 4.5903 4.5930 4.5957 4.6984 4.6011 4.6039 4.0066 4.6093 4.6120
35 4.6147 4.6174 4.6201 4.6228 4.6255 4.6281 4.6308 4.6335 4.6362 4.6389
36 4.6415 4.6442 4.6469 4.6495 4.6522 4.6549 4.6575 4.6602 4.6628 4.6655
37 4.6681 4.0708 4.6734 4.6761 4.0787 4.0814 4.0840 4.0806 4.6893 4.6919
38 4.6945 4.6971 4.6998 4.7024 4.7050 4.7078 4.7102 4.7120 4.7155 4.7181
39 4.7207 4.7233 4.7259 4.7285 4.7311 4.7337 4.7363 4.7389 4.7415 4.7441
40 4.7467 4.7402 4.7518 4.7544 4.7570 4.7696 4.7622 4.7647 4.7673 4.7699
41 4.7725 4.7750 4.7776 4.7802 4.7827 4.7853 4.7870 4.7904 4.7930 4.7955
42 4.7981 4.8007 4.8032 4.8058 4.8083 4.8109 4.8134 4.8160 4.8185 4.8211
41 4.8230 4.8202 4.8287 4.8313 4.8338 4.8363 4.8389 4.8414 4.8440 4.8465
44 4.8490 4.8516 4.8541 4.8566 4.8592 4.8617 4.8642 4.8668 4.8093 4.8718
45 4.8743 4.8769 4.8704 4 8819 4.8844 4.8870 4.8805 4.8920 4.8945 4.8970
46 4.8996 4.9021 4.9046 4.9971 4.9996 4.9122 4.9147 4.9172 4.9197 4.0222
47 4.9247 4.9272 4.9298 4.9323 4.9318 4.9373 4.9308 4.9423 4.9448 4.9473
48 4.9408 4.0524 4.9549 4.9574 4.9599 4.9624 4.9649 4.9674 4.9699 4.9724
49 4.9740 4.9774 4.9799 4.9825 4.9850 4.0876 4.9900 4.9925 4.9950 4.9975
113
Lampiran 25.Lanjutan
% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
50 5.0000 5.0025 5.0050 5.0075 5.0100 5.0125 5.1050 5.0175 5.0201 5.0226
51 5.0251 5.0276 5.0301 5.0326 5.0351 5.0376 5.0401 5.0426 5.0451 5.0476
52 5.0502 5.0527 5.0552 5.0577 5.0602 5.0627 5.0652 5.0677 5.0702 5.0728
53 5.0753 5.0778 5.0803 5.0828 5.0853 5.0878 5.0904 5.0929 5.0954 5.0279
54 5.1004 5.1036 5.1055 5.1080 5.1105 5.1196 5.1156 5.1181 5.1206 5.1231
55 5.1257 5.1282 5.1307 5.1332 5.1313 5.1383 5.1408 5.1434 5.1459 5.1484
56 5.1510 5.1535 5.1560 5.1586 5.1614 5.1637 5.1662 5.1687 5.1713 5.1738
57 5.1764 5.1789 5.1815 5.1840 5.1866 5.1801 5.1917 5.1942 5.1968 5.1993
58 5.2019 5.2045 5.2070 5.2096 5.2121 5.2147 5.2173 5.2198 5.2224 5.2250
59 5.2275 5.2301 5.2327 5.2353 5.2378 5.2404 5.2430 5.2468 5.2482 5.2508
60 5.2533 5.3359 5.2585 5.2611 5.2637 5.2663 5.2689 5.2715 5.2741 5.2767
61 5.2793 5.3819 5.2845 5.2871 5.2808 5.2024 5.2050 5.2976 5.3002 5.3029
62 5.3055 5.3081 5.3107 5.3134 5.3160 5.3186 5.3213 5.3239 5.3266 5.3202
63 5.3319 5.3345 5.3372 5.3398 5.3425 5.3451 5.3478 5.3505 5.3531 5.3658
64 5.3585 5.3811 5.3638 5.3665 5.3692 5.3719 5.3745 5.3772 5.3799 5.3826
65 5.3853 5.3880 5.8007 5.3934 5.3961 5.3980 5.4016 5.4043 5.4070 5.4097
66 5.4125 5.4152 5.4170 5.4207 5.4234 5.4261 5.4289 5.4316 5.4344 5.4372
61 5.4399 5.4427 5.4454 5.4482 5.4510 5.4538 5.4565 5.4593 5.4621 5.4649
68 5.4677 5.4705 5.4733 5.4761 5.4780 5.4817 5.4845 5.4874 5.4002 5.4930
69 5.4959 5.4987 5.5015 5.5044 5.5072 5.5101 5.5129 5.5158 5.5187 5.3215
70 5.5244 5.3273 5.5302 5.5830 5.5350 5.5388 5.5417 5.5446 5.5476 5.6505
71 5.5534 5.5503 5.3502 5.5622 5.5651 5.5681 5.5710 5.5740 5.5760 5.5799
72 5.5828 5.5858 5.0888 5.5918 5.5948 5.5978 5.0003 5.0038 5.0008 5.6098
73 5.6128 5.6158 5.0189 5.6219 5.6250 5.6280 5.6311 5.0341 5.6372 5.6403
74 5.6435 5.6464 5.0405 5.6926 5.6557 5.6588 5.6620 5.6651 5.6682 5.6713
114
Lampiran 25.Lanjutan
% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
75 5.6745 5.6776 5.0808 5.6840 5.6871 5.6903 5.6935 5.6967 5.6998 5.7031
76 5.7083 5.7095 5.7128 5.7160 5.7102 5.7225 5.7257 5.7200 5.7323 5.7356
77 5.7388 5.7424 5.7454 5.7488 5.7521 5.7554 5.7508 5.7621 5.7699 5.7688
78 5.7722 5.7756 5.7796 5.7824 5.7858 5.7892 5.7926 5.7961 5.7995 6.8030
79 5.8834 5.8299 5.8134 5.8169 5.8204 5.8239 5.8274 5.8310 5.8215 6.0381
80 5.8416 5.5452 5.8188 5.8524 5.8560 5.8596 5.8633 5.8669 5.8705 6.8742
8I 5.8779 5.8516 5.8853 5.8890 5.8927 5.8905 5.9002 5.9040 5.9078 5.9116
82 5.9154 5.9192 5.9230 5.9269 5.9307 5.9346 5.9386 5.9424 5.9463 5.9502
83 5.9542 5.9581 5.9624 5.9661 5.9701 5.9741 5.9782 5.9822 5.6863 5.9904
84 5.9945 5.9986 6.0027 6.0069 6.0110 6.0152 6.0194 6.0237 6.0279 6.0222
85 6.0364 6.0407 6.0450 6.0494 6.0537 6.0581 6.0625 6.0069 6.0714 6.0758
86 6.0803 6.0818 6.0893 6.0939 6.0985 6.1031 6.1077 6.1123 6.1170 6.1217
87 6.1264 6.1311 6.1359 6.1407 6.1455 6.1503 6.1552 6.1601 6.1050 6.1700
88 6.1750 6.1800 6.1856 6.1101 6.1952 6.2004 6.2055 6.2107 6.2160 6.2212
89 6.2205 6.2319 6.2372 6.2426 6.2481 6.2536 6.2591 6.2646 6.2702 6.2750
90 6.2816 6.2813 6.2936 6.2988 6.3047 6.3106 6.3165 6.3225 6.3285 6.3346
91 6.3408 6.3469 6.8532 6.3595 6.3658 6.3722 6.3787 6.3852 6.3917 6.3984
92 6.4031 6.4118 6.4187 6.4255 6.4325 6.4395 6.4466 6.4538 6.4611 6.4684
93 6.4758 6.4833 6.4909 6.4985 6.5063 6.5141 6.5220 6.5301 6.5382 6.5464
94 6.8548 6.5632 6.5718 6.5805 6.5893 6.5982 6.6078 6.6164 6.6258 6.6352
95 6.6449 6.6546 6.6646 6.6747 6.6849 6.6954 6.7060 6.7169 6.7279 6.7302
97 100 101 102 105 106 109 110 113 116
96 6.7507 6.7624 6.7784 6.7806 6.7991 6.8119 6.8260 6.8084 6.8522 6.8063
117 120 122 125 128 131 134 138 141 145
97 6.8808 6.8957 6.9110 6.9268 6.9431 6.9600 6.9774 6.9254 7.0141 7.0335
140 153 158 103 169 174 180 187 194 202
115
Lampiran 25.Lanjutan
% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
98.0 7.6537 7.0556 7.0579 7.0660 7.0621 7.0612 7.0663 7.0684 7.9706 7.0727
98.1 7.6749 7.0770 7.0792 7.0814 7.0836 7.0858 7.0880 7 0992 7.0924 7.0947
98.2 7.0969 7.0992 7.1015 7.1038 7.1061 7.1084 7.1107 7.1130 7.1154 7.1177
98.3 7.1204 7.1224 7.1248 7.1272 7.1297 7.1321 7.1345 7.1370 7.1364 7.1419
98.4 7.1444 7.1469 7.1494 7.1520 7.1545 7.1571 7.1996 7.1622 7.1648 7.1675
98.5 7.1701 7.1727 7.1754 7.1781 7.1808 7.1835 7.1862 7.1890 7.1917 7.1945
98.6 7.1973 7.2001 7.2029 7.2058 7.2086 7.2115 7.2144 7.2173 7.2203 7.2232
98.7 7.2262 7.2292 7.2322 7.2353 7.2383 7.24 14 7.2445 7.2476 7.2508 7.2539
98.8 7.2374 7.2663 7.2636 7.2668 7.2701 7.2734 7.2768 7.2801 7.2835 7.2869
98.9 7.2904 7.2938 7.2973 7.3009 7.3044 7.3080 7.3116 7.3152 7.3189 7.3226
99.0 7.3263 7.3301 7.3339 7.3378 7.3416 7.3455 7.3495 7.3935 7.3575 7.3615
99.1 7.3656 7.3698 7.3739 7.3781 7.3824 7.3867 7.3911 7.3954 7.3099 7.4044
99.2 7.4059 7.4135 7.4181 7.4228 7.4276 7.4324 7.4372 7.4422 7.5474 7.4522
99.3 7. 4373 7.4624 7.4677 7.4730 7.4783 7.4838 7.4893 7.4040 7.5006 7.5063
99.4 7.5121 7.5181 7.5241 7.5302 7.5364 7.5427 7.5401 7.5550 7.5622 7.5690
99.5 7.5758 7.5828 7.5890 7.5972 7.6045 7.6121 7.6107 7.0276 7.6356 7.6437
99.6 7.6521 7.6606 7.6693 7.6783 7.0874 7.6968 7.7065 7.7104 7.7260 7.7370
99.7 7.7478 7.7589 7.7703 7.7822 7.7944 7.8070 7.8202 7.8338 7.8480 7.8027
99.8 7.8782 7.8043 7.9112 7.9299 7.9478 7.9677 7.9889 8.0115 8.0357 8.0618
99.9 8.0902 8.1214 8.1550 8.1847 8.2380 7.2905 8.3528 8.4316 8.5401 8.7190
Tabel 16. Transformasi Persen – Probit