Überexpression von s-adenosylhomocysteinhydrolase in...

Überexpression von s-Adenosylhomocysteinhydrolase in

Epstein-Barr-Virus-positiven Burkitt-Lymphomzellen

Von der Medizinischen Fakultät

der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Medizin

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Claudine Maret

aus

Paderborn

Berichter: Herr Universitätsprofessor

Dr. med. Klaus Ritter

Herr Universitätsprofessor

Dr. med. Johann Lorenzen

Tag der mündlichen Prüfung: 19. Dezember 2003

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

2

Inhaltsangabe 1. Einleitung ...................................................................................................................... 4

1.1. Das Epstein-Barr -Virus ............................................................................................ 4 1.2 Strategien zur Bekämpfung EBV-assozierter Tumore.............................................. 7 1.3 Problemstellung......................................................................................................... 8

2. Material und Methoden ..................................................................................................... 9 2.1 Material ..................................................................................................................... 9

2.1.1 Instrumente........................................................................................................ 9 2.1.2 Zellinien ............................................................................................................ 9

2.1.2.1 Zellinie Raji................................................................................................. 10 2.1.2.2 Zellinie B95-8 ............................................................................................. 10

2.1.3 Primer .............................................................................................................. 10 2.1.4 Antikörper ....................................................................................................... 11 2.1.5 Kits und Chemikalien....................................................................................... 11

2.2 Methoden................................................................................................................. 13 2.2.1 Kulturtechniken............................................................................................... 13

2.2.1.1 Kultivierung von Bakterien......................................................................... 13 2.2.1.2 Kultivierung von eukaryontischen Zellen ................................................... 14 2.2.1.3 Zellzählung.................................................................................................. 15

2.2.2 Methoden rekombinanter DNA-Technologie ................................................. 16 2.2.2.1 Plasmidpräparation aus Bakterienzellen ..................................................... 16 2.2.2.2 Nukleinsäurepräparation aus eukaryontischen Zellen................................. 16 2.2.2.3 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA........................................ 17 2.2.2.4 Spaltung der DNA mit DNase I .................................................................. 17 2.2.2.5 DNA-Präzipitation ...................................................................................... 17 2.2.2.6 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen............................................. 18 2.2.2.7 Synthese von cDNA .................................................................................... 19 2.2.2.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).............................................................. 19 2.2.2.9 PCR mit dem Light-Cycler ......................................................................... 22 2.2.2.10 Sequenzieren von DNA............................................................................ 24 2.2.2.11 Agarose-Gelelektrophorese..................................................................... 26 2.2.2.12 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY in eukaryontischen Zellen............................................................................................................................ 27 2.2.2.13 DNA Transfektion durch Elektroporation................................................ 28

2.2.3 Immunologische Methoden............................................................................. 29 2.2.3.1 Bestimmung der DNA-Syntheserate ........................................................... 29 2.2.3.2 Immunfluoreszenz-Test (IFT) ..................................................................... 29 2.2.3.3 Proteinisolierung aus eukaryontischen Zellen............................................. 31 2.2.3.4 Western Blot................................................................................................ 31 2.2.3.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................ 32 2.2.3.4.2 Elektroblot ................................................................................................ 35 2.2.3.4.3 Färbung der Proteine mit Ponceau S ........................................................ 36 2.2.3.4.4 Immunblot ................................................................................................ 36 2.2.3.5 Durchflußzytometrie ................................................................................... 37

3. Ergebnisteil...................................................................................................................... 40 3.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY ................................................ 40

3.1.1 Amplifikation von AHCY durch RT-PCR...................................................... 40 3.1.2 Darstellung des Expressionsvektors................................................................ 41

3.1.2.1 Konstruktion des Donorvektors .................................................................. 41

3

3.1.2.2 Transformation von E.coli PIR 1-Zellen mit dem pUni/V5-His-TOPO-Vektor........................................................................................................... 41

3.1.3 TOPO-Cloning-Reaktion in E.coli TOP 10-Zellen mit dem pcDNA3.1-E-Vektor ............................................................................................................... 44

3.2 Überexpression von AHCY in eukaryontischen Zellen.......................................... 46 3.2.1 Transfektion von Raji-Zellen mit pcDNA3.1-AHCY..................................... 46

3.2.1.2.1 Etablierung einer semiquantitativen PCR mit AHCY und GAPDH........ 48 3.2.2 Nachweis der Überexpression von AHCY...................................................... 50 3.2.3 Nachweis der AHCY-Überexpression auf Proteinebene ................................ 51 3.2.4 Zellwachstum nach Transfektion mit pcDNA3.1 und -AHCY....................... 53 3.2.5 BrdU-Test........................................................................................................ 54 3.2.6 Immunfluoreszenztest ..................................................................................... 55 3.2.7 BZLF1 / BHRF1-PCR..................................................................................... 56 3.2.8 Facs Scan......................................................................................................... 58 3.2.9 Versuche mit dem Light Cycler ...................................................................... 59

4. Diskussion ....................................................................................................................... 61 4.1 Klonierung von AHCY in einen Expressionsvektor ............................................... 61 4.2 Transfektion/Expression von pcDNA3.1-AHCY in Raji-Zellen ............................ 62 4.3 Effekte der AHCY-Überexpression in Raji-Zellen................................................. 63

5 Ausblick .......................................................................................................................... 72 6 Zusammenfassung........................................................................................................... 73 7 Referenzen....................................................................................................................... 74 8 Abkürzungen ................................................................................................................... 84

4

1. Einleitung

1.1. Das Epstein-Barr -Virus

Im Jahre 1964 entdeckten Anthony Epstein und Yvonne Barr elektronenmikroskopisch im

Zytoplasma von B–Lymphozyten, die aus den Biopsien eines Burkitt-Lymphoms stammten,

Partikel, die morphologisch den bekannten Herpes-Viren ähnelten. Im Labor von Gertrude

und Werner Henle zeigte eine Nukleinsäureanalyse, daß es sich um ein bis dahin nicht

bekanntes Herpes-Virus handelte. Das Virus wurde nach den Entdeckern Epstein-Barr-Virus

(EBV) genannt (Henle, 1968).

Bei dem EBV handelt es sich um ein humanes Herpesvirus, das der Subfamilie

Gammaherpesvirinae, Gattung der Lymphocryptoviren, zuzuordnen ist. Es hat einen Partikel-

durchmesser von 120-200 nm und besitzt ein Genom von ca. 170 kb.

Im Inneren des Viruspartikels befindet sich ein Proteincore, das mit dem doppelsträngigen

linearen DNA-Genom assoziiert ist. Diese Struktur ist von einem ikosaedrischen Capsid

umgeben, das aus mehreren Virusstrukturproteinen besteht. Das Capsid wird von einer

Hüllmembran umgeben, die sich von der inneren Kernmembran ableitet. Zwischen beiden

Strukturen befindet sich das Tegument, das verschiedene regulatorisch aktive Proteine enthält.

Verschiedene EBV-Isolate zeigen im Genom unterschiedliche Deletionen und Variationen, es

läßt sich jedoch eine Grundstruktur bestimmen: 5 singuläre Bereiche (U1-U5, unique regions)

sind durch 4 interne (IR1-IR4, internal repeats) und terminale repetitive Sequenzen (TR,

terminal repeats) voneinander getrennt. Die terminalen Wiederholungssequenzen an den

Enden des linearen Genoms sind für die Zirkularisierung des viralen Genoms im

Latenzstadium und bei der Aktivierung von Bedeutung (Oka, 1985).

Im Viruspartikel liegt die doppelsträngige EBV-DNA linear vor, im Kern von infizierten

Zellen ist die virale DNA über die TR-Sequenzen ringförmig geschlossen. Das Genom

besteht aus ca. 80-100 offenen Leserastern, die eine gleich hohe Anzahl von Proteinen

vermuten lassen (Baer et.al., 1984). Mehr als 50 RNA-Polymerase II-Promotoren wurden

identifiziert (Oka, 1984). Obwohl von nur etwa 30 Genen die Funktion bekannt ist. Die

meisten der bislang charakterisierten Genprodukte sind für den lytischen Zyklus relevant. In

latent infizierten Zellinien wurden bisher 11 exprimierte EBV-Gene identifiziert, die für zwei

nicht translatierte RNA`s (EBV-encoded RNA`s, EBER`s), sechs EBV-nukleäre Antigene

(EBNA1, -2, -3A, -3B, -3C und –LP) und drei latente Membranproteine (LMP1, -2A, -2B)

kodieren (Kieff und Liebowitz,1990).

Abb. 1: Vereinfachte Darstellun

Die Infektion mit dem E

Speichel stellt die Haup

`kissing disease`. Das V

lytischer Zyklus ablaufen

Die Primärinfektion mit E

entwickelt sich in etwa 50

selbstlimitierenden Autoi

Virusinfektion führt zur

über 40 Jahren sind Virus

Durch epidemiologische

Untersuchungen läßt sich

Tumorerkrankungen asso

Lymphom (10 Fälle pro

Lytischer Zyklus in Bsetzung von Viren in

Freisetzung von Vireinfektion von B-Zelle

Lytische Infektion voEpithelzellen

Infektiöse Viren im S

Orale Aufnahme von EBV meist durch Speichelkontakt

Infektion von Epithelzellen und B-Lymphozyten

g des Verl

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tinfektion

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kann, die

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Infektion zirkulierender B-Zellen

aufes der EBV-Infektio

lgt durch die Sch

squelle dar, daher

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aber auch Ort der l

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rankung (Hallee

gen Persistenz des

nette et al., 1990).

Infektionsexper

aß das EBV eine

, wie z.B. mit

Kinder in Zentr

. Frei-webe

Transformation und Immortalisierung

Nach 30-60 Bei
Reaktivierung
5

n beim Menschen

leimhaut des Naso-Pharyngealraumes.

die anglo-amerikanische Bezeichnung

n (siehe Abb.1), in denen sowohl ein

ebenslang latenten Persistenz sind.

meist inapparent. Im jugendlichen Alter

ild der infektiösen Mononukleose, einer

et al., 1974; Ritter et al., 1994). Die

Virus. Mehr als 90% aller Menschen

imente an Primaten und in-vitro-

transformierende Potenz besitzt und mit

dem endemisch auftretenden Burkitt-

al-Afrika und Papua-Neuguinea), dem

Aufrechterhaltung der latenten Infektion

Zyklen der Zellteilung Aktivierung

Ausbildung von Lymphomen

6

Nasopharynx-Karzinom (10 Fälle pro 100.000 Personen in Südchina und Südostasien) und

dem Hodgkin-Lymphom (1,5 Fälle pro 100.000 Menschen).

Vom Epstein-Barr-Virus gibt es zwei unterschiedliche Subtypen, Typ A und Typ B, die sich

in verschiedenen Genen unterscheiden, wie z. B. EBNA-2, EBNA-3a, EBNA-3b und EBNA-

3c (Sample et al., 1990). Der EBV-Typ A immortalisiert B-Zellen wesentlich effizienter als

der Typ B (Rickinson et al., 1987). Einige Untersuchungen weisen daraufhin, daß das EBV-

Typ B nur in immungeschwächten Populationen eine Transformation der B-Zellen

hervorrufen kann (Shibata et al., 1993; Royle et al., 1991).

Die EBV-Subtypen zeigen ein unterschiedlich epidemiologisches Verhalten. Die Prävalenz

von Typ A ist in westlichen Ländern und Brasilien häufig (Chen et al., 1996; Kyaw et al.,

1992), der Typ B dagegen wird regelmäßig in Äquatorialafrika gefunden (Young et al., 1987).

Die Transformation von Zellen erfolgt im Stadium der Viruslatenz. Es werden drei Formen

der EBV-Latenz anhand des Genexpressionsmuster unterschieden (Masucci und Ernberg,

1994):

- Latenz 1: Expression von EBNA1, EBER 1, -2 (z.B. Zellen des Burkitt-

Lymphoms (BL))

- Latenz 2: Expression von EBNA1, EBER1, -2, LMP1, -2A, -2B (z.B. Zellen des

Nasopharynx-Karzinoms (NPC))

- Latenz 3: Expression aller 11 latenten Gene (z.B. EBV-infizierte Zellinien)

Aus dem Stadium der Latenz kann das Virus spontan in den lytischen Zyklus eintreten oder

es kann durch externe Stimuli induziert werden, wie z.B. durch Anti-Immunglobulin-

Antikörper, 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA), Basenanaloga oder spezifische

Ganglioside (Rodrigez et al., 2001, Schaade et al., 1999). Bei der Reaktivierung des lytischen

EBV-Zyklus spielt die Proteinkinase C (PKC) eine zentrale Rolle. Diese Serin/Threonin-

Kinase, die an Proliferations- und Differenzierungsvorgängen beteiligt ist, vermittelt die

lytische Reaktivierung nach Stimulation mit z.B. TPA oder anti-Immunglobulin-Antikörpern.

Die aktivierte PKC kann die Transkription des „immediate early“-Gens BZLF1 induzieren,

ein zentraler Schalter des lytischen Zyklus, und mit dem assozierten Protein Zta interagieren.

Zta bindet an den lytischen Replikationsursprung des EBV, wodurch eine Interaktion

zwischen dieser Bindungsstelle und dem viralen DNA-Polymerase/ Helicase/ Primase-

Komplex möglich wird. Dies ist Voraussetzung für die Virusreplikation. Ferner dient das Zta-

Protein als Transkriptionsfaktor für Promotoren zellulärer und viraler Gene, die

7

Konsensussequenzen für die Bindung des Faktors AP-1 enthalten (Farrell et al., 1989, Speck

et al., 1997).

In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, daß mit dem Gangliosid LM1 stimulierte Burkitt-

Lymphom-Zellen der Linie Raji eine Aktivierung des lytischen Zyklus, eine

Wachstumshemmung und Aspekte der Zelldifferenzierung aufwiesen. Dem liegen komplexe

Veränderungen im Genexpressionsmuster zugrunde ( Schaade et al., 1999).

Durch ‚differential-display-RT-PCR‘ und ‚suppression-subtractice-hybridisation-PCR‘

wurden 35 Gene identifiziert, deren Expression nach LM1-Behandlung moduliert wurde

(Schaade et al., 2000, Kleines et al., 2000). Dazu gehört unter anderem das Gen für S-

Adenosylhomocystein-Hydrolase (AHCY). Das zelluläre Enzym AHCY spielt eine

entscheidende Rolle bei Transmethylierungsreaktionen und kontrolliert die Replikation

verschiedener Viren. Vermutlich ist es auch an der EBV-Replikation beteiligt.

In Mammalia-Zellen ist AHCY das einzig bekannte Enzym, daß die Hydrolyse von S-

Adenosylhomocystein (AdoHcy) zu Homocystein und Adenosin katalysiert.

Die Aktivität aller S-Adenosylmethionin(AdoMet)-abhängigen Methyltransferasen ist

abhängig von der Höhe des intrazellulären AdoHcy-Spiegels. Dieses Molekül wirkt als

Produktinhibitor und wird durch das Enzym AHCY kontrolliert. Solche Transmethylierungs-

reaktionen kommen im gesamten Organismus vor. AHCY kann daher als genereller Regulator

biologischer Transmethylierungsprozesse angesehen werden (Turner et al., 2001).

Da Inhibitoren der AHCY antivirale (z.B. CMV, Rabiesvirus, RS-Virus), antiparasitäre

(Leishmania (Leishmaniasis), Plasmodium (Malaria), Trypanosomen (Afrikanische

Schlafkrankheit)) und auch anti-arthritische und immunsuppressive Eigenschaften besitzen,

ist das Enzym zum Gegenstand intensiver pharmakologischer Forschung geworden.

1.2 Strategien zur Bekämpfung EBV-assozierter Tumore Bisherige Strategien in der Therapie EBV-assozierter Tumore bestehen je nach Tumorstadium

aus Operation, Radio- und/oder Polychemotherapie,. Die Chemotherapie mit kurativer

Zielsetzung wird beim Hodgkin-Lymphom nach dem COPP- (Cyclophosphamid, Vincristin,

Procarbazin und Prednison) bzw. nach dem BEACOPP-Schema (s. COPP-Therapeutika plus

Etoposid) durchgeführt. Die Chemotherapie ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden,

da auch gesunde Zellen geschädigt werden können. Es besteht im besten Fall eine relative

Spezifität für die Tumorzellen. Als mögliche Nebenwirkungen können die Myelosuppression,

8

Stomatitis, Enterokolitis, Übelkeit, Erbrechen und die Toxizität für Herz, Lunge, Nieren,

Nervensystem erwähnt.

Eine neue Strategie im Kampf gegen EBV-assozierte Tumore zielt darauf ab, virushaltige

Tumorzellen, durch die Induktion des lytischen Zyklus und der anschließenden Lyse dieser

Zellen bei der Freisetzung von Virionen, in Anwesenheit antiviraler Chemotherapeutika zu

vernichten (Gutierrez et al., 1996, Westphal et al., 1999). Bisher wurde die lytische

Reaktivierung in vitro und in vivo durch externe Stimuli wie Bestrahlung, Butyrate oder durch

Überexpression von Induktoren des lytischen Zyklus, wie BZLF1, erreicht. In Anwesenheit

von antiviralen Substanzen, wie Ganciclovir, wurden so entartete Zellen effizient zerstört,

ohne eine Virusfreisetzung auszulösen.

Die Kombination aus geeigneten Induktoren des lytischen Zyklus und bewährten antiviralen

Chemotherapeutika dürfte ein vielversprechender Ansatz zur Therapie EBV-assozierter

Tumore sein. Ein kürzlich neu entdeckter Induktor des lytischen Zyklus ist das Gangliosid

LM1.

1.3 Problemstellung In früheren Untersuchungen war gezeigt worden, daß die aus dem Burkitt-Lymphom

stammende Zellinie Raji nach Stimulierung mit dem körpereigenen Gangliosid LM1 eine

Aktivierung des lytischen Zyklus, eine Wachstumshemmung, Zelldifferenzierung und

komplexe Veränderungen im Genexpressionsmuster aufwies. Bei einem der induzierten Gene

handelt es sich um S-Adenosylhomocystein-Hydrolase (AHCY), einem Schlüsselenzym der

Transmethylierungsreaktion.

Ziel dieser Arbeit ist es, die Funktion des Genes AHCY zu charakterisieren und die

Wirkungsweise auf die EBV-Latenz in Raji-Zellen zu untersuchen.

Hierzu mußten folgende Aufgaben gelöst werden:

- Klonierung des AHCY in den humanen Expressionsvektor pcDNA3.1 und Transfektion

des Konstruktes in die Zellinie Raji

- Überexpressionsnachweis auf Transkript- und Proteinebene mittels PCR, RT-PCR und

Western Blot

- Analyse der Transfektionseffekte (Zellwachstumsüberprüfungen, Immunfluoreszenztest

(IFT), Untersuchung verschiedener Oberflächenmarker, differenzielle Genexpression)

9

2. Material und Methoden

2.1 Material 2.1.1 Instrumente

- BioDoc Analyze (Kamera) - Biometra, Göttingen

- CASY 1, Zellzähler - Schärfe-System, Reutlingen

- Tischzentrifuge 5451C, 5403 - Eppendorf, Hamburg

- Zentrifuge RC 5C Plus - Sorvall, Bad Homburg

- Gene Quant II (Photometer) - Pharmacia Biotech, Freiburg

- Light-Cycler - Roche, Mannheim

- Microplate Scanning Spectrometer (Power Wave 200) - Bio-Tek Instruments, USA

- Speed Vac, concentrator 5301 - Eppendorf, Hamburg

- Thermocycler UNO II - Biometra, Göttingen

- Thermomixer 5436 - Eppendorf, Hamburg

- Transphor electrophoresis unit - Hoefer, San Francisco, USA

- FACSCalibur - Becton Dickenson, Heidelberg

- Gene PulserTM - Bio Rad, München

2.1.2 Zellinien

- Raji (Stamm ATCC) - ATTC, USA

- Raji (Stamm ATCC, Göttingen) - Universität Göttingen

Abt. Med. Mikrobiologie

nach freundlicher

Zurverfügungstellung

- B95-8 (Miller & Lipman, 1973) - ATTC, USA

10

2.1.2.1 Zellinie Raji

Zellen der Zellinie Raji ist es aufgrund einer Deletion im BHLF2-Gen für das virale

Capsidantigen nicht möglich einen kompletten lytischen Zyklus zu durchlaufen (Decaussin,

1995). Bei der Reaktivierung des EBV werden verschiedene frühe Genprodukte wie Early

Antigen, EBNA1, BZLF1 und BHRF1 gebildet; es kommt jedoch nicht zur Produktion und

Freisetzung intakter Virionen. An der Zelloberfläche wird der EBV-Rezeptor CD21

exprimiert. Die Kultivierung erfolgt unter den unter 2.2.1.2 beschriebenen Bedingungen.

2.1.2.2 Zellinie B95-8

Die Zellinie B95-8 entstand nach Infektion von B-Lymphozyten aus Schimpansen. Sie tragen

den EBV-Rezeptor CD 21 auf der Zelloberfläche und sie sind in der Lage einen kompletten

lytischen Zyklus zu durchlaufen und funktionsfähige Virionen freizusetzen. Die Kultivierung

erfolgt unter den unter 2.2.1.2 beschriebenen Bedingungen.

2.1.3 Primer

- AHCY-3’ ges. (20pmol/µl) 19mer -5´-c act acc gct act gag agc- 3´

- AHCY-5’ ges. (20pmol/µl) 18mer -5´-gcc gcc agc atg tct gac- 3´

- Amp 3 (20pmol/µl) 18mer -5´-gaa ctg gat ctc aac agc- 3´

- Amp 5 (20pmol/µl) 19mer -5´-gct aga gta agt agt tcg c- 3´

- BHRF-A (20pmol/µl) 20mer -5´-ttc tct tgc tgc tag ctc ca- 3´

- BHRF-B (20pmol/µl) 25mer -5´-tac gca tta gag acc act ttg agc c- 3´

- BZLF 3´ (20pmol/µl) 20mer -5´-ggc agc agc cac ctc acg gt- 3´

- BZLF 5´(20pmol/µl) 20mer -5´-ttc cac agc ctg cac cac tg- 3´

- GapDH-A (20pmol/µl) 24mer -5´-cgg agt caa cgg att tgg tcg tat- 3´

- GapDH-B (20pmol/µl) 24mer -5´-agc ctt ctc cat ggt ggt gaa gac- 3´

11

2.1.4 Antikörper

- Anti-EA-D (R3), Quelle: Maus (monklonal) - ABI, Columbia,USA

- Anti-Maus-Ig, FITC-gekoppelt, Kaninchen (polyklonal) - DAKO, Glostrup, DK

- Anti-EBNA 1 (monoklonal) - ABI, Columbia,USA

- Anti C3, FITC-gekoppelt, Ziege (monoklonal) - ICN Biomedicals, USA

- Anti-AHCY, Maus (monoklonal) - Dr. Hershfield, NC, USA

- Anti-Maus-Ig-HRP, Kaninchen (monoklonal) - DAKO, Glostrup, DK

2.1.5 Kits und Chemikalien

- 100bp-DNA -Marker (Fragmentgröße 0-3.000 bp) - MBI Fermentas, St. Leon.

- 1kb-DNA-Marker (Fragmentgröße 250 bp-10.000 bp) - MBI Fermentas, St Leon.

- 1M H2SO4 - Merck, Darmstadt

- β-Mercaptoethanol - Merck, Darmstadt

- ABI Prism BigDye Terminator Ready Reaction Kit - Perkin Elmer, Weiterstadt

- Agarose - Sigma, Deisenhofen

- Ammoniumpersulfat - Sigma, Deisenhofen

- Anorganische Salze - Sigma, Deisenhofen

- Cell Proliferation ELISA (BrdU-Test) - Roche, Mannheim

- DEPC - Sigma, Deisenhofen

- Dithiothreitol (DTT) - Sigma, Deisenhofen

- EchoTM-Adapted Expression Vector (pcDNA3.1-E) - Invitrogen,Groningen, NL

- EchoTM-Cloning System (pUni/V5-His TOPO) - Invitrogen,Groningen, NL

- Ethanol - Merck, Darmstadt

- Ethidiumbromid - Sigma, Deisenhofen

- Evans Blue - Sigma, Deisenhofen

12

- Fetales Kälber Serum (FKS) - Sigma, Deisenhofen

- First-Strand cDNA synthesis Kit - Am. Pharmacia, Freiburg

- Gel blot Papier (GB002, GB003) - Schleicher&Schuell,

- Glycin - Sigma, Deisenhofen

- High Pure Plasmid Isolation Kit - Roche, Mannheim

- Isopropanol - Sigma, Deisenhofen

- Meerschweinchen Komplement C3D - ICN Biomedicals, USA

- L-Glutamine (200mM) - Sigma, Deisenhofen

- Methanol - Merck, Darmstadt

- N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED) - Serva, Heidelberg

- Nicht-essentialle Aminosäuren (100x) - Biochrom KG, Berlin

- Nonidet P-40 - Sigma, Deisenhofen

- PCR-Gefäße - Sartorius, Göttingen

- Penicillin-(200mM)-Streptomycin (1mg/ml)-Lösung - Sigma, Deisenhofen

- Performance Optimized Polymer 6´(POPTM-6) - Perkin Elmer, Weiterstadt

- Wasserstoffperoxid (H2O2) - Merck, Darmstadt

- Pipettenspitzen (1µl – 1000µl) - Eppendorf, Hamburg

- Ponceau S - Serva, Heidelberg

- QIAamp Blood Kit - Qiagen, Hilden

- QIAamp DNA Mini Kit - Qiagen, Hilden

- Qiagen Plasmid Maxi Kit - Qiagen, Hilden

- Qiagen Plasmid Purification Mini Kit - Qiagen, Hilden

- Restriktionsenzyme & Puffer - MBI Fermentas, St. Leon.

- RNase Inhibitor - Roche, Mannheim

- RNeasy Mini Kit - Qiagen, Hilden

- RPMI-1640 Medium - Sigma, Deisenhofen

Dassel

13

- Sartolab P-Filter, 0,2µm Porengröße - Sartorius, Göttingen

- Sodiumdodecyl sulfat (SDS) - Sigma, Deisenhofen

- Taq DNA Polymerase - Qiagen, Hilden

- Tris base - Sigma, Deisenhofen

- Tween 20 - Sigma, Deisenhofen

- Zellkulturflasche (25 u. 75 qcm) - Greiner, Frickenhausen

2.2 Methoden

2.2.1 Kulturtechniken

Eine Bakterien- oder Zellkultur dient zur Vermehrung von Bakterien oder Zellen in einem

geeigneten Nährmedium.

Um optimale Wachstumsbedingungen zu schaffen, müssen organische Energiequellen und

Mineralien vorhanden sein. Je nach Art des Organismus muß das Nährmedium einen

bestimmten Gehalt an Sauerstoff und Kohlendioxid haben. Ein definierter pH-Wert ist

ebenfalls unerlässlich. Im allgemeinen wurden Kulturen bei 37 °C und Zellkulturen mit einer

5% CO2-Atmosphäre inkubiert.

Nährmedien können flüssig sein oder durch einen Gehalt von 1,5 – 2% Agarose eine feste

Konsistenz aufweisen.

Prokaryontische und eukaryontische Zellen werden unter unterschiedlichen Bedingungen

kultiviert.

2.2.1.1 Kultivierung von Bakterien

Die Mikroorganismen wurden bei 37 °C unter Schütteln in flüssigem Nährmedium kultiviert

oder in Petri-Schalen auf Nährmedium, das durch 1,5 % Agarose verfestigt wurde.

Für die Kultivierung von E. coli wurde das Luria-Bertani (LB)-Medium verwendet:

14

LB-Medium: NaCl 1,0 % (w/v)

Pepton 1,0 % (w/v)

Hefeextrakt 0,5 % (w/v) in Aqua bidest.

Nach Autoklavierung des Nährmediums können zum Zweck der Selektion Antibiotika

zugegeben werden:

Ampicillin Endkonzentration: 50µg/ml

2.2.1.2 Kultivierung von eukaryontischen Zellen

Zellen der Zellinien B95-8 und Raji wurden in 50 ml oder 200 ml Kulturgefäßen (Greiner)

kultiviert. Das Kulturvolumen betrug 15 bzw. 50 ml. Bei größeren Volumina ist keine

optimale Sauerstoff- und CO2-Versorgung gewährleistet. Die Anzucht erfolgte bei 37 °C in

5 %iger CO2-Atmosphäre in supplementiertem RPMI-1640-Medium (Sigma). Zweimal pro

Woche wurden die Zellen mit frischem Medium versorgt. Dabei wurde immer die Hälfte des

Volumens in den Flaschen ausgetauscht.

FKS wurde mit Sartolab P-Filtern steril filtriert und 30 Minuten bei 56 °C hitzeinaktiviert,

bevor es zu dem RPMI-Medium gegeben wurde.

Zusätze für RPMI-1640:

10 % Fetales Kälber Serum (FKS)

2 % Antibiotika [Penicillin –Streptomycin-Lösung]

2 % L-Glutamin

0,2 % Nicht-essentielle Aminosäuren

Zur Kryokonservierung wurden 15 ml einer drei bis vier Tage alten Zellkultur bei 400 g für

10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 1 ml

Einfriermedium A vorsichtig resuspendiert. 1 ml Einfriermedium B wurde hinzugefügt. Der

Ansatz wurde vorsichtig durchmischt und in 2-ml-Einfrierröhrchen überführt. Die Röhrchen

wurden über 24 h langsam auf –70 °C abgekühlt und anschließend in Behältern mit

flüssigem Stickstoff (-180 °C) gelagert.

15

Lösung A (für zehn Kryo-Gefäße):

RPMI-1640 7,5 ml

FKS 2,5 ml

Lösung B (für zehn Kryo-Gefäße):

RPMI-1640 5,5 ml

FKS 2,5 ml

DMSO 2,0 ml

Um Mammalia-Zellen wieder in Kultur zu nehmen, wurden die Einfrierröhrchen in einem 37

°C-Wasserbad aufgetaut bis nur noch ein kleines Stückchen Eis übrig war. Dann wurden die

Röhrchen zur Vermeidung einer Kontamination kurz in Ethanol (70 %ig) getaucht und

anschließend unter der Sterilbank geöffnet. Der Inhalt wurde in 10 ml vorgewärmtes,

supplementiertes RPMI-1640-Medium überführt. Der Anteil des fetalen Kälberserums wurde

auf 20 % erhöht, um den gestressten Zellen das Wachstum zu erleichtern.

Die Kultur wurde bei 200 g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4 ml

supplementiertem Medium resuspendiert. Nach erneuter Pelletierung wurden die Zellen in 10

ml supplementiertem Medium aufgenommen, in Kulturflaschen überführt und im Brutschrank

kultiviert.

2.2.1.3 Zellzählung

Für die Zellzählung wurde der Zellzähler CASY1 (Schärfe-System) verwendet. Das Gerät

misst mittels einer 150 µm Kapillare den Widerstand der durchfließenden Lösung. Der

Widerstand am Meßpunkt ist vom Volumen und dem phyiologischen Zustand der Zellen

abhängig. Der Messbereich wurde so gewählt, daß Verfälschungen durch Fremdpartikel

weitgehend ausgeschlossen werden konnten. Lebende Zellen der Zellinien B95-8 und Raji

sind zwischen 8-20 µm groß. Die Messung erfaßt die Lebendzellzahl, da die abgestorbenen

Zellen eine vergleichsweise geringe Widerstandsänderung verursachen. 50 µl der zu

quantifizierenden Zellsuspension wurden in 10 ml isotoner Salzlösung (CASYton, Schärfe-

System) verdünnt und gemessen.

16

2.2.2 Methoden rekombinanter DNA-Technologie

2.2.2.1 Plasmidpräparation aus Bakterienzellen

Für eine schnelle Isolierung kleinerer Plasmid-DNA-Mengen (bis zu 10 µg) war eine

Minipräparation ausreichend, bei größeren Plasmid-DNA-Mengen war eine Maxipräparation

erforderlich.

Bei beiden Verfahren erfolgte die Auflösung der Zellwände durch alkalische Lyse. Das Lysat

wurde mit RNase A behandelt, um die RNA abzubauen und die Zellreste, wie auch die

chromosomale DNA, wurden ausgefällt.

Die Minipräparation wurde durchgeführt wie in der Gebrauchsanleitung des High Pure

Plasmid Isolation Kit (Roche) beschrieben. Der Überstand wurde auf eine Nukleinsäure-

bindende Säule transferiert, an die Nukleinsäuren in Gegenwart von Puffern mit hoher

Salzkonzentration binden. Nach einigen Waschschritten, die nötig sind, um die Salze,

Proteine, RNA und andere zelluläre Kontaminationen zu eliminieren, kann die Plasmid-DNA

mit einem Puffer von geringer Salzkonzentration eluiert werden.

Zur Plasmid-Maxipräparation wurden Säulen der Firma Qiagen verwendet. Hier wurde die

aufgeschlossene Zellsuspension in einer gering konzentrierten Salzlösung an eine Säule

gebunden. RNA, Proteine und die Zellreste wurden mit hoch konzentriertem Salzpuffer

eluiert. Anschließend wurde die DNA durch Zugabe eines Eluationspuffers gewonnen.

2.2.2.2 Nukleinsäurepräparation aus eukaryontischen Zellen

Zur Isolation der Gesamt-DNA eukaryontischer Zellen wurde das QIAamp Blood Kit

(Qiagen) verwendet, zur Isolierung der Gesamt-RNA das RNeasy Mini Kit (Qiagen).

Nach der Zellyse wurde die DNA an eine Säule gebunden. Verschiedene Waschschritte

eliminierten Proteine und RNA. Anschließend konnte die DNA mit Wasser eluiert werden.

Die Durchführung folgte den Herstellerempfehlungen.

Für die RNA-Isolierung wurden 106 der zu untersuchenden Zellen zunächst zentrifugiert. Das

Pellet wurde in einen Puffer resuspendiert, der ß-Mercaptoethanol enthielt, um die RNasen zu

inhibieren. Zur Zellyse wurden die Zellen auf eine QIAshredder Säule (Qiagen) aufgebracht.

Anschließend wurde das Zellysat auf eine Nukleinsäure-bindende Säule transferiert. Nach

einigen Waschschritten zur Eliminierung von DNA und Verunreinigungen konnte die RNA

mit DEPC Wasser eluiert werden. Um Kontaminationen mit RNasen zu vermeiden, wurden

17

die ganze Zeit über auch hier Handschuhe getragen und doppelt autoklavierte Pipettenspitzen

verwendet. Es wurde nach Herstellerangaben gearbeitet.

2.2.2.3 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA

Die Messung der DNA- und RNA-Konzentrationen erfolgte photometrisch (Pharmacia

Biotech) bei 260 nm.

Eine Extinktion von 1,0 entsprach einer DNA- Konzentration von 50 µg/ml oder einer RNA-

Konzentration von 40 µg/ml.

2.2.2.4 Spaltung der DNA mit DNase I

Nach der RNA-Isolierung verbleibt immer noch eine kleiner Rest DNA im Eluat, der die

Probe bei weiteren Analysen z.B. RT-PCR stören könnte. Um diese DNA zu spalten, wurde

die Probe in Gegenwart von DNase inkubiert.

DNase I ist eine Doppelstrang-spezifische Endonuklease. Nach Zugabe von DNase I und

DNase-Puffer, gemäß dem unten stehenden Pipettierschema, wurde die Probe 45 Minuten bei

37 °C inkubiert; im Anschluß daran wurde das Enzym 10 Minuten bei 95 °C denaturiert.

Pipettierschema:

RNase Inhibitor 2 µl

10x DNase Puffer 4 µl

DNase (1:10) 2 µl

RNase freies Wasser 2 µl

Probe 30 µl

2.2.2.5 DNA-Präzipitation

Zur Reinigung, Konzentrierung und/oder Umpufferung wurde eine DNA-Fällung durch-

geführt.

Dazu wurde die DNA-Lösung mit 0,1 Volumen 3M Na-Acetat-Lösung und 2 Volumen

eiskaltem absoluten Ethanol gemischt. Nach einer 20 minütigen Inkubationszeit bei –20 °C

18

wird die gefällte DNA bei 13000 rpm für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand

wird dekantiert und das Pellet mit Ethanol (70 %ig) gewaschen. Es folgt eine Zentrifugation

für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Pellet in TE-Puffer

resuspendiert.

TE-Puffer:

Tris 1 M 10 ml

Na2EDTA 0,5 M 2 ml

Aqua bidest. ad 1000 ml

2.2.2.6 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen

Zur Identifizierung kann DNA mit Restriktions-Endonukleasen verdaut werden.

Restriktions-Endonukleasen erkennen eine spezifische Basensequenz von vier bis acht Basen

Länge in doppelsträngiger DNA und schneiden sie an einer definierten Stelle innerhalb dieser

Konsensussequenz. Die resultierenden Fragmente haben eine vorhersagbare Größe.

Für einen analytischen Verdau wurde ein Standard-Reaktions-Mix erstellt und 1 Stunde bei

37 °C inkubiert. Die Analyse erfolgte durch Agarose-Gelelektrophorese.

Standard Reaktionsmix:

DNA (200 ng-1µg) x µl

10x Puffer 1 µl

Restriktionsenzyme (10U/µl) 1 µl

Aqua bidest. ad 10 µl

Verwendete Restriktionsenzyme/-Puffer:

Bam H1 MBI Fermentas

Xho I MBI Fermentas

Roter Puffer (10 x) MBI Fermentas

Xho I Puffer (10 x) MBI Fermentas

19

2.2.2.7 Synthese von cDNA

Zur Durchführung der PCR von RNA-haltigen Proben muß die RNA zunächst in cDNA

umgeschrieben werden. Die Reverse Transkriptase katalysiert diese Reaktion.

Die Reverse Transkriptase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, synthetisiert einen

homologen DNA-Strang. Zu Beginn der Reaktion bindet ein Primer an die RNA. Dabei

handelte es sich entweder um einen Oligo d(T)-Primer, der an den Poly-A-Schwanz der

eukaryontischen RNA bindet oder um einen Zufallsprimer [pd(N)6], dessen Hexanukleotide

an komplementäre Basensequenzen binden. Für PCR-Reaktionen, die ein Produkt

amplifizieren, das größer als 400 bp ist, wurde die cDNA-Synthese mit Oligo d(T)-Primern

durchgeführt, bei kleineren Produkten mit [pd(N)6]-Primern.

Zunächst wurde die RNA für 10 Minuten bei 65 °C denaturiert. Danach wurde ein Reaktions-

Mix hinzugefügt, der aus den unten angegebenen Komponenten bestand. Die reverse

Transkription (First Strand cDNA Reaction Mix, Pharmacia) lief innerhalb von 1 Stunde bei

37 °C ab.

Reaktionsmix:

Reverse Transkriptase + dNTP 11 µl

Primer 1 µl

DTT (Dithiothreitol) 1 µl

RNA 20 µl

2.2.2.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR bietet eine schnelle und zuverlässige Methode ein spezifisches DNA-Fragment bis

zu einer Größe von 20 kb zu amplifizieren.

Die DNA-Probe wurde mit Taq-DNA-Polymerase, dNTPs und zwei Oligonukleotid-Primern

versetzt, die das gewünschte DNA-Fragment flankieren.

In jedem Zyklus wurden die beiden DNA-Stränge durch Hitze voneinander gelöst, die Primer

banden an die komplementären Positionen in den DNA-Strängen und die DNA-Polymerase

katalysierte die Synthese des komplementären Stranges. Der Gebrauch von hitzebeständiger

DNA-Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, ersparte die Notwendigkeit nach jedem

20

Denaturierungsschritt wieder neue Polymerase hinzuzufügen. Jeder einzelne PCR-Zykus

verdoppelte die Anzahl der DNA-Stränge. 20 Zyklen der PCR-Amplifikation erhöhen mit

hoher Spezifität die Anzahl der Zielsequenz um den Faktor 106.

Für die PCR wurde das Taq DNA Polymerase Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers

verwendet. Alle PCR Reaktionen hatten ein Endvolumen von 50 µl. Die Zusammensetzung

entsprach dem unten aufgeführten Pipettierschema. Die Reaktion wurde in einem

Thermocycler (Biometra) mit heizbarem Deckel (105 °C) durchgeführt.

Pipettierschema:

2,5 mM dNTP 10 µl

10x PCR-Puffer 5 µl

Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl

5´-Primer (20pmol/µl) 1 µl

3´-Primer (20pmol/µl) 1 µl

DNA (~ 100ng) x µl

Aqua bidest ad 50 µl

Thermocycler-Bedingungen für spezifische PCR-Reaktionen:

1. Adenosylhomocystein-Hydrolase-PCR

Das AHCY-Gen kodiert für ein Produkt, das in in-vivo für Methylierungsprozesse

verantwortlich ist.

1. 2min 94°C

2. 1min 94°C

3. 45s 56°C

4. 2min 72°C

5. 7min 72°C

6. ∞ 4°C

35 Zyklen

21

2. Glycerinaldehyd-3-phospatdehydrogenase-PCR

GAPDH ist ein Standard-Gen, das in jeder eukaryontischen Zelle gleichmäßig exprimiert

wird. Seine Expression wird zur Normalisierung der Expression anderer Gene verwendet.

1. 2min 94°C

2. 1min 94°C

3. 45s 56°C

4. 1min 72°C

5. 7min 72°C

6. ∞ 4°C

2. ß-Lactamase-Gen-PCR

Das ß-Lactamase-Gen (Ampicillinresistenz-Gen) ist Teil verschiedener Vektoren. Ist es in der

isolierten DNA vorhanden, dient es als Bestätigung für eine erfolgreiche Transfektion einer

Zelle mit einem Vektor.

1. 2min 94°C

2. 1min 94°C

3. 45s 56°C

4. 1min 72°C

5. 7min 72°C

6. ∞ 4°C

3. BZLF1-PCR

Das BZLF1-Gen, ein Gen des EBV-Genoms, wird während der viralen Latenz nicht

exprimiert. Der Nachweis seiner Expression ist ein Zeichen für die Reaktivierung des Virus

und den Übergang in den lytischen Zyklus.

1. 2min 94°C

2. 1min 94°C

3. 1min 57°C

4. 1min 72°C

5. 7min 72°C

6. ∞ 4°C

35 Zyklen

35 Zyklen

40 Zyklen

22

4. BHRF1-PCR

Ein EBV-kodiertes Gen, das während viralen Latenz als lytisches Transkript inaktiv bleibt.

Der Nachweis seiner Expression ist ein Zeichen für die Virus-Reaktivierung.

1. 2min 94°C

2. 1min 94°C

3. 30s 55°C

4. 1min 72°C

5. 7min 72°C

6. ∞ 4°C

5. Semiquantitative AHCY-/GAPDH-PCR

Nach der „Primerdropping“-Methode wurde die GAPDH-Expression nachgewiesen. Zur

Durchführung siehe bitte Wong,1994.

Die AHCY-Primer lagen bereits bei Beginn der PCR in der Lösung, zu Beginn des Zyklus 4

wurde pro PCR-Gefäß 1 µl GAPDH-Primer A und 1 µl GAPDH-Primer B (jeweils 20

pmol/µl) hinzugefügt.

1. 2min 94°C

2. 1min 94°C

3. 45s 56°C

4. 2min 72°C

5. 7min 72°C

6. ∞ 4°C

2.2.2.9 PCR mit dem Light-Cycler

Der Light-Cycler besteht aus zwei Komponenten: der Cycler-Komponente und der

Fluorimeter-Komponente. Diese beiden Teile arbeiten zusammen, um Anwendungen wie

Produktanalyse, Quantifizierung und Mutationsanalyse zu vereinfachen. Anders als bei einem

normalen PCR-Gerät, dessen Zyklen mehrere Stunden brauchen, benötigt die Amplifikation

im Light-Cycler nur etwa 30 Minuten.

Die Reaktionen fanden in einer Glaskapillare statt. Ihr optimiertes Oberflächen-Volumen-

Verhältnis garantierte sehr schnelle Temperaturanpassungen innerhalb des Reaktions-

gemisches. Im Ergebnis bedeutete dies, daß ein Zyklus ungefähr 30-45 sec dauerte.

40 Zyklen

28 Zyklen

23

SYBR Green I ist eine Substanz, die spezifisch an doppelsträngige DNA bindet und

fluoresziert. Sie ermöglichte eine Quantifizierung des Amplifikats. Um das Amplifikat zu

charakterisieren, wurde nach dem Amplifikationsprozeß eine Schmelzpunktanalyse

durchgeführt. Der Schmelzpunkt ist für jedes PCR-Produkt charakteristisch.

Für die Amplifikation von DNA im Light-Cycler wurde der Light-Cycler Fast Start DNA

Master SYBR Green I Kit (Roche) benutzt. Dieses Kit beinhaltete einen gebrauchsfertigen

Schnellstart-Reaktions-Mix mit Schnellstart-Taq-Polymerase und doppelstrang-DNA-

spezifische SYBR Green I –Lösung für die Markierung des Amplifikats.

Die Schnellstart-Taq-Polymerase ist eine modifizierte Form der hitzestabilen Taq-DNA-

Polymerase, die bei Raumtemperatur inaktiv ist, da temperatursensitive Antikörper das

Zentrum des Enzyms blockieren. Das modifizierte Enzym wurde durch Denaturierung der

Antikörper bei hohen Temperaturen aktiviert.

Der Master Mix wurde mit den DNA-Proben gemischt und in Light-Cycler-Kapillaren

überführt, die mit einem Stopfen verschlossen wurden. Die Proben wurden für 30 Sekunden

bei 2000 rpm (Eppendorf, Labfuge) zentrifugiert, bevor sie in den Rotor des Light Cycler-

Instrumentes gesetzt wurden.

In dieser Untersuchung wurden folgende Primer eingesetzt: LFA1 3’ und -5’, RAI 3’ und -5’,

L6/TAX 3’ und –5’, G(S)α 3’ und –5’, PUF 3’ und -5’, TOB 3’ und -5’, MCH4 3’ und -5’,

TRAF3 3’ und -5’ und SOD1 3’ und -5’. Diese Primer wurden aufgrund früherer

Erkenntnisse gewählt, wobei das Gangliosid LM1 die Transkription der genannten Gene in

Lymphomzellen modulierte (Schaade et al., 1999).

Die gewählten Annealingtemperaturen ergeben sich aus folgender Formel (Thein & Wallace,

1986):

Annealing-Temperatur [°C]: Tm= 2°C (Anzahl der [A+T]) + 4°C (Anzahl der [G+C])

Mastermix:

SYBR Green I 2 µl

5´-Primer (10 pmol/µl) 1 µl

3´-Primer (10 pmol/µl) 1 µl

MgCl2 0,8 µl (= 2 mM Endkonzentration)

Template DNA x µl

Steriles Wasser ad 20 µl

24

40 Zyklen

Bei der GAPDH-PCR mußte die MgCl2-Konzentration auf 1,6 µl (=3 mM Endkonzentration)

adaptiert werden.

Light-Cycler-Bedingungen:

1. 10 min 95°C Aktivierung der Taq-Pol.

2. 0 s 95°C Denaturierung von DNA

3. 10 s 55-58 °C Primer-abhängige Annealingtemperatur

4. 13-59 s 72°C Produkt-abhängige Elongationszeit

5. 0 s 95°C

6. 10 s 65°C Beginn der Schmelzkurve

7. 0 s 95°C Temperatur steigt in 0,2°C Schritten bis 95°C

8. 1 min 40°C Kühlphase

2.2.2.10 Sequenzieren von DNA

Zur eindeutigen Identifizierung eines amplifizierten DNA-Fragmentes ist eine DNA-

Sequenzierung geeignet.

Zu Beginn vervielfältigt das Enzym DNA-Polymerase die komplementären Kopien der DNA,

die sequenziert werden sollen. Diese DNA wird als Ausgangsstrang gebraucht. Die DNA-

Polymerase vereint vier Deoxynukleotid-Triphosphate (dNTP´s), dATP, dCTP, dGTP und

dTTP zu einem komplementären Polynukleotid-Strang, der sich in 5´-3´-Richtung verlängert.

Der Startpunkt ist die freie 3´-OH-Position des Primers. Des weiteren wird ein wenig 2´,3´-

Dideoxynukleosid-Triphosphat (ddNTP) von jeder Base hinzugefügt. Wird die Dideoxy-Base

in die sich verlängernde Polynukleotid-Kette eingebaut, anstelle des korrespondierenden

Deoxynukleotids, kommt es zum Kettenabbruch. Es wird nur wenig ddNTP eingesetzt, so daß

durch statistischen Kettenabbruch an jeder Basenposition eine ganzen Reihe unterschiedlich

langer Ketten gebildet werden. Für die spezifische Detektion ist jedes der 4 ddNTP´s kovalent

an ein unterschiedlich fluoreszierenden Chromophor gekoppelt.

Die Fragmente wurden entsprechend ihren Längen in der Gel-Elektrophorese aufgetrennt und

die endständige Base wurde über ihr charakteristisches Fuoreszenzspektrum identifiziert.

25

Für die Sequenzierung wurde das ABI Prism BigDye Terminator Ready Reaction Kit

verwendet. Die Sequenz-Reaktion wurde im Performance Optimised Polymer 6´(POPTM-6)

im ABI-Prism Sequencer (310 Genetic Analyser) aufgetrennt.

Terminator Ready Reaktionsmix:

- A-Terminator markiert mit dichloro[R6G]

- C-Terminator markiert mit dichloro[ROX]

- G-Terminator markiert mit dichloro[R110]

- T-Terminator markiert mit dichloro[TAMRA]

- Desoxynucleosid Triphosphat (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)

- Taq-DNA Polymerase, MgCl2, Tris/HCl-Puffer, pH 9,0

Reaktionsmix:

Terminator Ready Reaktionsmix 8 µl

Sequenzierungsprimer [3´ or 5´] (3,2 pmol/µl) 1 µl

Doppelsträngige DNA (200-500 ng) x µl

Deionisiertes Wasser ad 20 µl

Thermocycler Bedinungen:

1. 2 min 96°C

2. 30 s 96°C

3. 15 s 50°C

4. 4 min 60°C

Nach der Reaktion wurde das Produkt über Nacht gefällt (s. 2.2.2.5), entsprechend der

Hersteller-Empfehlung, um überschüssige Nuleotid-Lösungen zu entfernen. Anschließend

wurde 20 Minuten bei 14000 rpm (Eppendorf, Labfuge) zentrifugiert, gefolgt von einem

Waschschritt mit 70 %igem Ethanol und einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 Minuten,

14000 rpm). Das Produkt wurde für 10 Minuten bei 30 °C im Speed Vac getrocknet und in

24 µl Template Suppression Reagent (TSR) resuspendiert. Anschließend wurden die Proben

gevortext, dann 10 Minuten bei 95 °C denaturiert und sofort auf Eis gekühlt.

25 Zyklen

A

2

D

M

D

e

N

d

G

D

d

l

U

o

s

1

v

A

M

k

u

e

D

u

Terminator Rhodamine Farbstoff Farbe im ABI Prism Elektropherogramm

ddATP dR6G grün

ddCTP dROX rot

ddGTP dR110 blau

ddTTP dTAMRA schwarz

26

bb. 2: Verwendete 2´,3´-Dideoxynukleosid-Triphosphate mit spezifischem Chromophor

.2.2.11 Agarose-Gelelektrophorese

ie Elektrophorese, d.h. die gerichtete Bewegung von Ionen im elektrischen Feld, ist eine

ethode zur Trennung biologischer Moleküle. Agarosegele haben eine definierte

urchlässigkeit für Moleküle. Die molekulare Auftrennung geschieht durch Gelfiltration in

inem elektrischen Feld.

ach einer DNA-Spaltung oder einer PCR ist es wichtig, die resultierende Fragment-Größe

er DNA zu bestimmen. Für Fragment-Längen zwischen 1 – 15 kb wurden 0,8 %ige TAE-

ele verwendet, für kleinere Fragmente wurden 1,5 %ige TBE-Gele verwendet.

oppelsträngige DNA wurde durch planare, aromatische Kationen sichtbar gemacht, wie z.B.

as Ethidium-Ion, das in die α-Helix der DNA interkaliert und unter UV-Licht sichtbar

euchtet.

m Gele herzustellen, wurden 4 bzw. 7,5 g Agarose abgewogen und in 500 ml 1 x TAE-

der 0,5 x TBE-Puffer suspendiert. In einer Mikrowelle wurde die Suspension gekocht bis

ich die Agarose vollständig gelöst hat. Vor der Zugabe von Ethidium-Bromid (Stammlösung

0 mg/ml) mußte die Agarose-Lösung auf 65 °C abkühlen. Es wurde eine Endkonzentration

on 0,1 µg/ml Ethidium-Bromid-Gel eingestellt.

nschließend wurde das flüssige Gel in eine Gelkammer mit Kamm gegossen. Nach 15

inuten war Gel soweit ausgehärtet, daß es in die Elektrophorese-Kammer gegeben werden

onnte, die entsprechend dem Gel mit 1 x TAE oder 0,5 x TBE-Puffer befüllt war. Die

nterschiedlichen Puffer optimierten das Laufverhalten und die Auftrennung der DNA im

lektrischen Feld.

ie Proben und ein DNA-Marker wurden im Verhältnis 1:10 mit 10 x Blau-Marker gemischt

nd in die Taschen des Gels pipettiert. Die Elektrophorese lief bei Raumtemperatur mit einer

Spannung von 5 Volt/cm Elektrodenabstand bis eine gute Auftrennung erreicht wurde. Im

Anschluß an die Elektrophorese wurde das Gel zur Dokumentation unter UV-Licht

fotografiert.

1x TAE-Puffer (Tris-Acetat/EDTA):

Tris 40 mM

Essigsäure 40 mM

EDTA 1 mM

0,5x TBE-Puffer (Tris-Borat/EDTA):

Tris 45 mM

Borsäure 45 mM

EDTA 1 mM

10x Blaumarker: Ficoll 10 % (w/v)

Bromphenolblau 0,25 % (w/v)

Xylemcyanol 0,25 % (w/v)

EDTA 0,25 M

2.2.2.12 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY in eukaryontischen Zellen

Die Klonierung wurde mit Hilfe des EchoTM-Cloning-Systems (Invitrogen) durchgeführt.

Dieses System basiert auf dem Univector-Plasmid-Fusion-System (UPS), das schnell und

einfach das interessante Gen mit einem Akkzeptorvektor rekombiniert. Es wird eine

einschrittige Klonierungsstrategie genutzt, um das PCR-Produkt in einen entsprechenden

Plasmidvektor einzusetzen, aus dem damit der Donorvektor entsteht (s.Abb.3).

Abb. 3: EchoTM Clonin

27

g System (Cre-lox seiten-spezifische Rekombination)

28

Zur Konstruktion des Expressionsvektors wurden 4 µl des AHCY-PCR-Produktes aus der

präparativen PCR in das Echo-Cloning-System entsprechend der Herstellerangaben

eingesetzt.

Zunächst wurde durch Ligation des AHCY-PCR-Produkts in den Vektor pUni/V5-His-TOPO

der Donorvektor pUni-AHCY konstruiert und in E.coli PIR1 selektiert. Der durch Plasmid-

Minipräparation hergestellte Vektor pUni-AHCY wurde mit dem Akzeptorvektor pcDNA3.1-

E in Gegenwart von Cre-Rekombinase inkubiert. Über die Cre-lox-Sequenzen, die auf Donor-

und Akzeptor-Vektor vorhanden sind, kam es zur sequenzspezifischen Rekombination

zwischen beiden Vektoren und es entstand der Fusionsvektor pcDNA-AHCY, bei dem das

AHCY-Gen unter die Kontrolle eukaryontischer Promotor-Sequenzen geriet, die auf dem

Akzeptorvektor kodiert waren. Die Selektion des erfolgreich fusionierten Plasmids pcDNA-

AHCY geschah nach Transfektion von E.coli-TOP 10-Zellen auf Kanamycin-haltigem

Nährboden: Der Donorvektor allein konnte aufgrund seines ungeeigneten

Replikationsursprungs nicht in E.coli-TOP 10 repliziert werden. Der Akzeptorvektor wies

keine Kanamycin-Resistenz auf. Bakterien, die diesen Vektor enthalten, werden ausselektiert.

Nur der Vektor pcDNA-AHCY wies nach der Fusion von Donor- und Akzeptorvektor einen

geeigneten Replikationsursprung und eine Kanamycin-Resistenz auf und konnte so selektiert

werden.

2.2.2.13 DNA Transfektion durch Elektroporation

Bei der Elektroporation werden eukaryontische Zellen kurzen elektrischen Impulsen

ausgesetzt. Diese elektrischen Impulse führen zu nanometergroßen Poren in der

Plasmamembran. Die DNA diffundiert direkt durch diese Poren in das Zellcytoplasma. Diese

Methode ist sehr effektiv und kann sowohl für transiente als auch für stabile Transfektionen

genutzt werden.

Für diesen Vorgang wurden 107 Zellen 10 Minuten bei 1600 rpm (Heraeus Christ, Labfuge)

zentrifugiert. Nach zwei Waschschritten mit je 10 ml PBS (s. 2.2.3.2) wurde das Pellet in 500

µl PBS resuspendiert und mit 20 µl DNA vermischt und in eine Elektroporationsküvette

(Elektrodenabstand 0,4 cm) überführt. Die Probe wurde eisgekühlt.

Das Elektroporationgerät wurde auf 625 V/cm Elektrodenabstand und 500 µF eingestellt, die

Küvette wurde zwischen die Elektroden plaziert und der Impuls ausgelöst. Nach dem

elektrischen Impuls wurde die Küvette schnell mit 1 ml vorgewärmten Medium (RPMI 1640

mit Zusätzen, s.2.2.1.2) versetzt. Nach 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden

29

die Zellen in Zellkulturflaschen überführt und es wurde mehr Medium (maximal 18 ml)

zugefügt. Anschließend wurde bei 37 °C inkubiert.

2.2.3 Immunologische Methoden

2.2.3.1 Bestimmung der DNA-Syntheserate

Die Zellvermehrung ist mit der Replikation genomischer DNA verbunden, so daß die DNA-

Neusynthese als Parameter für die Zellproliferation und auch für die Regulation der DNA-

Synthese verwendet werden kann.

Um die DNA-Syntheserate zu bestimmen, wurde ein Cell Proliferation ELISA verwendet.

Das Verfahren beruht auf dem Einbau von 5-Bromo-2´-Deoxyuridin (BrdU) in die

genomische DNA sich teilender Zellen. Das BrdU kann immunologisch detektiert werden.

Die 1 x 105 Raji-Zellen/Mikrotiterplattenvertiefung wurden für 2 Stunden mit einer BrdU-

Lösung versetzt. BrdU wurde statt Thymidin in die neu synthetisierte DNA eingebaut. Dann

wurde das Medium entfernt, die Zellen fixiert und die DNA wurde durch Zugabe einer

Fixierungs- und einer Denaturierungslösung in einem Schritt denaturiert. Ein Anti-BrdU-

POD-Antikörper mit Substrat wurde hinzugefügt, der das eingebaute BrdU band. Diese

Reaktion wurde mit einer Stopplösung versetzt. Das Reaktionsprodukt wurde durch eine

Absorptionsmessung mit einem Spektrophotometer (Modell: Scanning Multiwell, BioTek

Instruments) bei 430 nm quantifiziert. Alle Arbeitsschritte wurden entsprechend der

Herstellerangaben durchgeführt.

2.2.3.2 Immunfluoreszenz-Test (IFT)

Immunfluoreszenz-Teste sind für den mikroskopischen Nachweis von Antigenen in

histologischen und zytologischen Präparaten oder von Antikörpern in Seren gut geeignet.

Beim direkten IFT werden Zellen auf einem Objektträger (OT) fixiert und mit einem

Antikörper überschichtet, der an das gesuchte Antigen bindet. Durch Fluoreszenzmarkierung

können die Immunkomplexe mit dem Fuoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Dieses Verfahren wurde zum Nachweis des frühen Antigens “early antigen” (EA) eingesetzt.

Zunächst wurde mit einem Anti-EA-Antikörper (Maus) inkubiert, der dann im nächsten

30

Schritt mit dem fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-Antikörper (Kaninchen) sichtbar gemacht

wurde.

Zunächst wurden 105 Zellen der zu untersuchenden Raji-Population gewonnen und durch

Zentrifugation bei 1600 rpm für 10 Minuten präpariert. Nach zwei Waschschritten mit PBS,

wobei die Zellen in jeweils 1 ml PBS aufgenommen, leicht geschüttelt und erneut

zentrifugiert worden sind, wurde das Pellet in 100-200 µl PBS resuspendiert. Die

Zellsuspension wurde auf absolut fettfreie OT pipettiert, wobei die Zelldichte unter dem

Mikroskop kontrolliert wurde. Die Zellen sollten dicht aneinander liegen, aber nicht

überlappen. Die OT wurden mindestens 30 Minuten luftgetrocknet. Vorgekühltes Aceton

diente der Fixierung der Zellen auf dem OT. Nach 10 Minuten bei –20 °C wurden die OT bei

Raumtemperatur vollständig luftgetrocknet.

Der 1. AK, der gegen das gesuchte Antigen gerichtet war, wurde im Verhältnis 1:500 in PBS

verdünnt. 10 µl dieser Antikörperlösung wurden in jede OT-Öffnung pipettiert. Es folgte eine

30 minütige Inkubationszeit in einer feuchten Kammer bei 37 °C. Anschließend wurden die

OT dreimal mit PBS gewaschen, wobei die OT aufrecht in ein PBS-gefülltes Gefäß gegeben

und 5 Minuten leicht geschüttelt wurden. Die OT wurden durch Absaugen der überschüssigen

Flüssigkeit mit Saugpapier leicht getrocknet.

Der 2. AK, der gegen den primären Antikörper gerichtet war, war fluoreszenzmarkiert. Er

wurde geeignet in PBS verdünnt und 10 µl dieser Antikörperlösung pro OT-Öffnung

aufgetragen. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer. Es

schlossen sich drei weitere Waschschritte an (s.o.), im letzten Waschschritt wurden 50 µl

eines Kontrastmittels (Evans Blue) hinzugefügt.

Anschließend wurden die OT mit Anti-Fading-Lösung und einem Deckglas bedeckt. Die OT

liessen sich für mehrere Tage bei –20 °C aufbewahren.

Early Antigen:

1. Anti-EA-D (R3), Maus 1:500 in PBS

2. Anti-Maus IgG-FITC, Kaninchen 1:20 in PBS

PBS:

NaCl (w/v) 8 g

KCl (w/v) 0,2 g

31

Na2HPO4 (w/v) 1,44 g

KH2PO4 (w/v) 0,24 g

Aqua bidest. ad 1000 ml (pH 7,4)

Anti-FadingLösung:

p-Phenyldiamin 0,1% (w/v) 100 mg

Glycerin 90% (v/v) 90 ml

PBS (pH 7,2) 10% (v/v) 10 ml

Bicarbonat Puffer (pH 9,0), 0,5 M ad pH 8,0

2.2.3.3 Proteinisolierung aus eukaryontischen Zellen

Es wurden 1 x 106 Raji-Zellen zentrifugiert und 2 x mit PBS gewaschen (5000 rpm, 15

Minuten , Eppendorf-Zentrifuge 5415 C).

Dem Zellpellet wurden 100 µl Lysispuffer hinzugefügt, anschließend wurden die Zellen

resuspendiert. Es folgten 3 Einfrierzyklen (-70 °C/ Raumtemperatur). Vollständig

desintegriert wurde das Zellysat im Ultraschallbad für 10 Minuten. Anschließend wurde der

Zelldebris durch Zentrifugation (14000 rpm, 5 Minuten) abgetrennt und der Überstand bei

–20 °C gelagert.

Lysispuffer:

Harnstoff 9,5 M 28,53 g

Nonidet P-40 2 % (w/v) 1 ml

β-Mercaptoethanol 5 % (w/v) 2,5 ml

Aqua bidest ad 50 ml

2.2.3.4 Western Blot

Mit dem Blot (Towbin et al, 1979) werden Gel-elektrophoretisch aufgetrennte Antigene von

einem Gel auf eine Trägermembran transferiert und dort fixiert. Proteine von Interesse können

anschließend nachgewiesen werden.

Die zu untersuchenden Proben wurden in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (s.

2.2.3.4.1) aufgetrennt und auf eine Trägermembran transferiert. Die Membran wird

32

anschließend mit einem unmarkiertem Antikörper versetzt, der spezifisch ist für das

Zielprotein. Der so gebundene Antikörper wird durch einen zweiten Meerrettich-Peroxidase-

markierten Antikörper (s. 2.2.3.2) sichtbar gemacht.

2.2.3.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Das Polyacrylamid-Gel (PAGE) polymerisiert durch eine radikal-induzierte Reaktion von

Acrylamid und N,N´-Methylenbisacrylamid. Die freien Radikale entstehen durch den

chemischen Zerfall von Ammoniumpersulfat. Der Gellösung wurde N,N,N´,N´-

Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugefügt, um die freien Radikale zu stabilisieren.

Die physikalischen Gegebenheiten des Gels und seine Porengröße werden durch die Menge

des Polyacrylamides und durch das Mengenverhältnis der Komponenten zueinander

bestimmt.

Ammoniumpersulfat wurde bei –20 °C gelagert und durfte erst kurz vor Gebrauch aufgetaut

werden. Alle anderen Lösungen waren sterilfiltriert bei 4 °C lagerbar.

Folgenden Lösungen wurden benötigt:

Acrylamidstammlösung:

Acrylamid (2x) 30 % (w/v)

Bisacrylamid (2x) 0,8 % (w/v)

Trenngelpuffer:

Tris/HCl (pH 8,8) 1,5 M

SDS 0,4 % (w/v)

Sammelpuffer:

Tris/HCl (pH 6,8) 0,5 M

SDS 0,4 % (w/v)

Ammoniumpersulfat:

Ammoniumpersulfat 10 % (w/v) [aliquotiert bei –20°C gelagert]

Probenpuffer (denat. 2x):

Tris/HCl (pH 6,8) 125 mM 514 g

SDS 4 % (w/v) 0,4 g

Glycerin 20 % (v/v) 2 ml

β-Mercaptoethanol 10 % (v/v) 1 ml

Bromphenol Blau 0,03 % (w/v) 0,008 g

DTT 10 % (w/v)


Elektrophoresepuffer (10x):

Tris 0,25 M 60,55 g

Glycin 1,9 M 285,27 g

SDS 1 % (w/v) 20 g


Für die Auftrennung denaturierter Proteine wurde ein 13 %iges Polyacrylamid (PAA) -Gel

verwendet.

Sammelgel: 5 % (w/v) Polyacrylamid

2,5 ml Acrylamid Stammlösung

3,75 ml Sammelpuffer (4x)

8,7 ml Aqua bidest

15 µl TEMED

100 µl Bromphenolblau

75 µl Ammoniumpersulfat

Trenngel:

5% (6 Gele, 0,75mm) Polyacrylamid

2,5 ml

3,75 ml

8,7 ml

15 µl

100 µl

Acrylamid Stammlösung

Sammelpuffer (4x)

Aqua bidest.

TEMED

Bromphenolblau

75 µl Ammoniumpersulfat

13% (6 Gele, 0,75mm)

Polyacryamid

16 ml

9,4ml

11,65 ml

30 µl

50 µl

250 µl

Acrylamid-Stammlösung

Trenngelpuffer (4x)

Aqua bidest.

TEMED

Bromphenolblau (1%(w/v))

33

Ammoniumpersulfat

Abb. 4: Gelkammer

Die Trenngelmischung wurde unter leichte

Wasserstrahlpumpe entgast, bis keine Luftbläsc

durch Zugabe von Ammoniumpersulfat der Poly

wurde in die Gelkammer gegossen. Die Oberfläc

überschichtet, um einen Luftabschluß zu erreichen

Methanollösung konnte nach ca. 30 Minuten abg

cm bei einer Schichtdicke von 0,75 mm.

Die Sammelgellösung wurde ebenfalls entga

zugegeben wurde, wurde das Gel auf das po

sprechende Gelkamm wurde eingesteckt. Nach

beendet und die fertigen Gele konnten aus de

längerfristige Aufbewahrung wurden die Gele i

Austrocknung zu verhindern und bei 4 °C gelagert

Die Gele wurden vorsichtig mit Wasser abgewasc

in die Elektrophoresekammer eingesetzt. Die Ano

1 x Elektrophoresepuffer befüllt. Die Kämme wurd

Die zu analysierende Proteinlösung wurde aus Ra

mechanischen Zerstörung der Zellen wurde das L

mit SDS-Probenpuffer gemischt, dem vorher no

worden war. Diese Mischung wurde für 10 Minu

mit einer Hamilton-Spritze auf das Gel aufgetrage

Vorderplatte
Rückplatt
34

m Schwenken 2 Minuten mit einer

hen mehr aufstiegen. Anschließend wurde

merisierungsprozeß gestartet. Das Gemisch

he des Gels wurde mit 20%igem Methanol

und eine glatte Oberfläche zu erhalten. Die

egossen werden. Die Gelgröße betrug 7 x 9

st. Nachdem das Ammoniumpersulfat

lymerisierte Trenngel gegossen. Der ent-

ca. 20 Minuten war die Polymerisation

m Behälter genommen werden. Für eine

n feuchtes Papier eingeschlagen, um eine

.

hen, um Gelrückstände abzulösen und dann

den- und die Kathodenkammer wurden mit

en vorsichtig entfernt.

ji-Zellen aufgereinigt (s. 2.2.3.3). Nach der

ysat sowie ein entsprechender Marker 1:1

ch 10 % Dithiothreithol (DTT) zugesetzt

ten bei 95 °C erwärmt. Die Proben wurden

n. Die Elektrophorese lief mit 20 mA/Gel.

Kamm

Spacer

Die Elektrophorese war beendet, wenn die Bromphenolblaufront aus dem unteren Rand des

Gels austrat. Die Glasplatte wurde vorsichtig mit einem Sklapell abgelöst und die

Abstandhalter entfernt. Das Gel konnte nun weiterverarbeitet werden (s.2.2.3.4.2).

2.2.3.4.2 Elektroblot

Nach der SDS-PAGE (s.2.2.3.4.1) wurden die Proteine mittels eines elektrophoretischen

Transfers vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran überführt. Dafür wurde das Gel so

plaziert, daß die eine Gelseite direkten Kontakt mit dem Nitrocellulose-Membran hat. Oben

und unten (im Sandwich-Verfahren, s. Abb. 5) waren Gel und Membran von Whatman 3MM-

Papier, 2 grobporösen Schaumstoffstücken und einer Plastikhalterung umschlossen. Um ein

Überhitzen zu vermeiden, sowie auch Luftblasen zwischen Gel und Membran, wurde alles

Elektrophorese-Puffer überschichtet (external, Haake K 15).

Das Konstrukt wurde in den Elektrophorese-Behälter gesetzt, der mit Standard-Platin-

Elektroden und Triglycerin-Elektrophorese-Puffer (pH 8,3) versehen ist. Die Nitrocellulose

(NC)-Membran wird dabei in Richtung der Anode eingesetzt. Über Nacht wandern die

Proteine im elektrischen Feld bei 20 V und 400 mA zur Anode und bleiben an der

Blotmembran haften.

Blot Puffer:

Tris 25 mM (w/v) 12,1 g

Glycin 192 mM (w/v) 57,7 g

Methanol 10 % (w/v) 400 ml


Anode

Schaumstoff

Whatman 3MM-Papier

Nitrocellu-lose Filter

KathodeSchaumstoff-matte

Whatman 3MM-Papier

Gel

Abb.5: Schematische

Darstellung einer Elektro-

bloteinrichtung

35

36

2.2.3.4.3 Färbung der Proteine mit Ponceau S

Die Protein-Färbung mit Ponceau S-Lösung (Serva, 0,2% Ponceau S in 3%

Trichloressigsäure) wird benutzt, um Proteine auf der Nitocellulose-Membran (NC) sichtbar

zu machen. Die Ponceau S-Markierung ist reversibel und kann unter fließendem Wasser

abgewaschen werden. Diese Substanz stört weder die Antikörperbindung, noch die Funktion

der Meerrettich-Peroxidase beim anschließenden Immunblot.

Für die Proteinfärbung mit Ponceau S sollte die NC-Membran feucht sein und für 2-3

Minuten unter leichtem Schütteln in der Lösung inkubiert werden. Sobald die Proteinbanden

sichtbar wurden, wurde die Färbung durch kurzes Waschen mit Wasser gestoppt. Um mit den

immunologischen Verfahren fortzufahren, sollte das Ponceau-Rot durch Waschen unter

fließendem Wasser entfernt werden.

2.2.3.4.4 Immunblot

Zur Hintergrundabsättigung wurde die Membran für 30 Minuten unter leichtem Schütteln in

ein Bad aus PBS mit 10 % FKS gelegt. Anschließend wurde sie für 1 Stunde mit dem

primären Antikörper inkubiert, der gegen das Zielprotein gerichtet war (Anti-AHCY, 1:10000

in PBS mit 10 % FKS). Die Inkubation fand in einer Petrischale statt und wurde unter

leichtem Schütteln durchgeführt. Im Anschluß wurde die Membran herausgenommen und 3 x

für je 5 Minuten mit Waschpuffer gewaschen.

Im nächsten Inkubationschritt wurde ein POD-markierter Antikörper (AK) hinzugefügt. Der

erste Antikörper stammt aus Mäusen, so daß als zweiter Antikörper ein polyklonaler

Kaninchen Anti-Maus-Antikörper verwendet wurde. Die Verdünnung des 2. AK in PBS- mit

10 % FKS betrug 1:1000. Die Inkubation dauerte 1 Stunde und wurde unter leichtem

Schütteln durchgeführt. Es schlossen sich 3 weitere Waschschritte an.

Die Meerrettich-Peroxidase, die an den zweiten Antikörper gebunden war, katalysierte eine

Reaktion, in der das farblose POD-Substrat zu einer farbigen Substanz reduziert wurde, die

das Protein von Interesse lokalisierte. Sobald Banden erkennbar wurden, wurde die Reaktion

mit Wasser gestoppt. Die Membran wurde getrocknet und das Ergebnis dokumentiert.

Waschpuffer:

Tween 20 0,05 % (v/v) 5 ml

PBS ad 1000 ml

37

PBS-:

KH2PO4 [0,2M] 2 mM (v/v) 10 ml

Na2HPO4 [0,2M] 9 mM (v/v) 45 ml

NaCl 180 mM (w(v) 10,52 g

Aqua bidest ad 1000 ml (pH 7,2)

PBS: s. 2.2.3.2

POD-Substrat:

Diaminobenzidinhydrochlorid 2 % (w/v) 2 g

Wasserstoffperoxid (3%) (v/v) 200 µl

PBS- ad 100 ml

2 g Diaminobenzidinhydrochlorid wurden in 100 ml PBS- gelöst und als Stammlösung bei

–20 °C gelagert (in Aliqots zu je 1 ml). Ein Aliqot wurde vor Gebrauch aufgetaut und mit 100

ml PBS- verdünnt. Zur Herstellung einer Gebrauchslösung wurde dieser Verdünnung 200 µl 3

%iges Wasserstoffperoxid hinzugefügt. Die Lösung war einige Tage bei 4 °C stabil.

2.2.3.5 Durchflußzytometrie

Die Durchflußzytometrie wurde mit einem FACSCalibur-Analysen-Gerät (Becton

Dickenson) durchgeführt. Sie dient zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf

Grundlage von Fluoreszenz und Streulichteigenschaften.

Das FACS-Gerät besteht aus einem Flüssigkeitssystem und einem optischen System. Durch

das unter Druck stehende Flüssigkeitssystem werden die Zellen mittels eines Trägerstroms

mit konstanter Geschwindigkeit einzeln an einem Laser vorbeigeführt. Das auftreffende Licht

wird dabei nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut. Der größte Teil wird entlang des

einfallenden Lichtstrahls gestreut und wird daher als Vorwärtsstreulicht (forward scatter =

FSC) bezeichnet. Da kleine Zellen Licht weniger streuen, stellt das Vorwärtsstreulicht in

erster Linie ein Maß für die Zellgröße dar. Das im rechten Winkel zum einfallenden Licht

gestreute Licht hängt hauptsächlich von der Granularität der Zellen ab und wird als

Seitwärtsstreulicht (side scatter = SSC) bezeichnet.

Darüber hinaus kann der Laser an Antikörper gebundene Chromogene zur Aussendung von

Lichtquanten anregen. Diese werden verstärkt, in elektrische Impulse umgewandelt und von

38

Sensoren detektiert. Dazu werden an verschiedene Oberflächenmoleküle der Zellen

spezifischen Antikörper gebunden, die mit verschiedenen Fluoreszenzstoffen markiert sind.

Dabei erlaubt der hier verwendete FACSCalibur durch einen zusätzlichen Argonlaser eine

gleichzeitige Analyse von vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen. Die Ergebnisse können

mit Hilfe der Software CellQuest entweder einzeln im Histogramm oder gegeneinander im

DotPlot aufgetragen werden.

Für diese Analyse wurden mit pcDNA3.1-AHCY-infizierte Raji-Zellen, Positiv- und

Negativkontrolle 5 Minuten bei 1300 rpm (Eppendorf Zentrifuge 5415C, Rotor F-45-18-11)

zentrifugiert. Das Pellet wurde in 600 µl sterilfiltriertem PBS aufgenommen. In drei FACS-

Analysenröhrchen wurden die Antikörper vorgelegt. Dazu wurden jeweils 200µl der in PBS

aufgenommenen Zellen gegeben. Nach Vortexen wurde der Ansatz für 15 Minuten bei

Raumtemperatur im Dunkeln zur Antikörperbindung inkubiert. Zum Entfernen der

ungebundenen Antikörper wurde dem Ansatz anschließend 2 ml sterilfiltriertes PBS

zugegeben, der Ansatz wurde 5 Minuten bei 1300 rpm (Heraeus Sepatech Megafuge 1.0,

Rotor BS4402/A) zentrifugiert und das Pellet in 200 µl sterilfiltriertes PBS aufgenommen.

Eine Lagerung bis zur Analyse erfolgte maximal 12 Stunden bei 4 °C im Dunkeln.

Die Auswahl der zu untersuchenden Oberflächenantigene ergab sich aus Voruntersuchungen,

bei denen normale B-Lymphozyten mit dem EBV infiziert worden waren und so eine

Primärinfektion ausgelöst wurde. Dabei wiesen folgende Oberflächenantigene (s. Abb. 6) eine

verstärkte Aktivität auf (Schaade et al., 1999).

Abb. 6: In der FACS-Analyse untersuchte Oberflächenantigene und ihre Funktion

Oberflächenantigen Funktion

CD11a CD19 CD21 CD23 CD30 CD40 CD44 CD54 CD58

1) Barclay et al., 1997; 2) Lotz5) Imai und Tsujisaki, Prow; 6

Interzelluläre Adhäsion und Kostimulation B-Zellmarker, Komponente des Signaltrans-duktionskomplexes CD19/21/81/leu-13 1) B-Zellmarker, Rezeptor für die Komplement-komponente C3d und EBV Entzündungsfördernde Funktion, bindet die Integrinekomplexe CD11b/18 und CD11c/18 1) Interaktion mit CD153, kostimuliert T-Zellproli- feration2), involviert in T-Zell-vermittelte Apoptose2)

Involviert in Wachstum, Differenzierung und Isotypen-"switchung"3)

Involviert in Bindung an Endothelzellen, induziert Cytokinausschüttung und T-Zellaktivierung, evtl. involviert in Tumormetastasierung4) Interaktion mit CD11a/18 oder CD11b/18, führt zu Immunreaktionen und/oder Entzündungen5) Aktivator von Killerzellen, bindet CD2 6)

39

e, Prow; 3) Gordon et al., Prow; 4) Liao und Pratel, Prow; ) Takeuchi, Prow

3. Ergebnisteil

3.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY

3.1.1 Amplifikation von AHCY durch RT-PCR

In einem ersten Schritt wurde aus RNA von Raji-Zellen die AHCY-Sequenz mittels RT-PCR

amplifiziert. Aus 10 ml einer gut bewachsenen Raji-Zellkultur (ca. 107 Zellen) wurde RNA

isoliert (s.2.2.2.2). Die RNA wurde mit dem pd(N)6–Zufallsprimer in cDNA umgeschrieben

(s. 2.2.2.7). Es folgte eine PCR, bei der AHCY mit den Primern AHCY 5‘ und AHCY 3‘ (s.

2.1.3) amplifiziert wurde (s. 2.2.2.8). Bei der anschließenden Elektrophorese (s. 2.2.2.11)

wurde das PCR-Produkt auf ein 0,8 %iges TAE-Gel aufgetragen und ca. 45 Minuten bei 75

mA aufgetrennt.

Abbildung 7 zeigt die

der AHCY hat eine

Kontroll-DNA-Leiter

Zellen erfolgreich die

1 2 3 4 5

1420 bp

40

Abb.7: AHCY-RT-PCR aus Raji-Zellen

1. Spur: 3 µl Reaktion a

2. Spur: 3µl Parallelreaktion b

3. Spur: Negativkontrolle (Wasser als Template)

4. Spur: 1 kb-Leiter

5. Spur: 100 bp-Leiter

erfolgreiche Amplifikation des Gens AHCYaus Raji-Zellen. Das Gen

Größe von 1420 bp (s. Spur 1), was durch Vergleich mit dem 1 kb-

(s. Spur 4) bestätigt wurde. Das bedeutet, daß in der RNA von Raji-

Gensequenz von AHCY nachgewiesen und präpariert werden konnte.

1636 bp

500 bp

41

3.1.2 Darstellung des Expressionsvektors

3.1.2.1 Konstruktion des Donorvektors

Die Probe mit dem amplifizierten AHCY-Gen wurde in das EchoTM Cloning System

eingesetzt (s.2.2.2.12). Dieser Schritt dient dazu die vorliegende DNA mit Donorvektor, dem

Vektor pUni/V5-His-TOPOR, zu ligieren.

4 µl des PCR-Produktes werden dabei eingesetzt. Der erfolgreich hergestellte Donorvektor

besitzt eine Größe von 2,3 kb (laut Herstellerangaben) plus 1,4 kb des eingeführten AHCY-

Gens.

3.1.2.2 Transformation von E.coli PIR 1-Zellen mit dem pUni/V5-His-TOPO-Vektor

Der darzustellende Donorvektor, pUni/V5-His-TOPOR, mit einem innenliegenden

Kanamycin-Resistenz-Gen, wurde in E.coli-Zellen des Stammes PIR 1 transformiert (s.

2.2.2.12). Dieser Stamm besitzt das mutante 116 pir-Allel, das die Anzahl der Plasmidkopien

auf 250 Kopien/Zelle anhebt.

Selektiert wurde auf LB-Platten mit 50 µl/ml Kanamycin. Es wurden ca. 20 Kolonien pro LB-

Platte festgestellt. Anschließend erfolgte die DNA-Isolierung (s. 2.2.2.2) der selektierten

Kolonien. Die gereinigte DNA wurde nacheinander mit zwei Restriktions-Enzymen

geschnitten, da die verwendeten Enzyme bei verschiedenen Pufferbedingungen optimal

arbeiten. Zunächst wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH1 (s.2.2.2.6) an Position

511 bp der AHCY-Gensequenz geschnitten. G/gatcc lautet die Basensequenz, die von diesem

Enzym erkannt wird. Vor dem zweiten Endonuklease-Verdau mit Xho I wurde eine Ethanol-

Fällung durchgeführt (s.2.2.2.5). Das zweite Enzym ist Xho I, das im Roten Puffer arbeitet.

Das Enzym schneidet nicht in der AHCY-Sequenz, sondern innerhalb der Erkennungssequenz

an Position 2245 bp und linearisiert damit das Konstrukt.

Spur 1: Klon 1 Spur 5: Kl

Spur 2: Klon 2 Spur 6: Kl

Spur 3: Klon 4 Spur 7: 10

Spur 4: Klon 11 Spur 8: Ne

Die Proben wurden auf ein 0,8 %iges TAE-Ge

der Orientierung des AHCY-Gens im

Elektrophorese eine Bande von 500 bp oder v

entsprach dem gesuchten Produkt. Zusätzlich e

13000 bp. Die Produkte der Klone 11 und 14

positiv (s.Abb.8), was an den Plasmidresten

Orientierung im Vektor. Klon 1 erschien als re

Die Klone 2, 4, und 13 wiesen jeweils eine 800

Dieses Ergebnis wurde durch die Sequenzierun

erhaltene Sequenz wurde mit einer Sequenz-D

Klone 1, 11 und 14. In Abb.9 ist der ents

dargestellt. Aufgrund der Homologie wurde d

Gensequenz identifiziert.

1 2 3 4 5 6 7 8

Abb. 8: Elektrophorese nach Spaltung mit den

Restriktionsenzymen BamH1 und Xho I

o

o

0

g

l

p

o

r

z

i

e

g

a

p

i

Plasmidreste

800 bp

500 bp

42

n 13

n 14

bp-Leiter

ativkontrolle (Wasser als Template)

aufgetragen. Aufgrund der Schnittstellen und

Uni/V5-His-TOPO-Vektor wurde in der

n 800 bp Größe erwartet. Die 500 bp-Bande

schienen die Reste des Plasmids in Höhe von

lagen auf Höhe der 500 bp und waren damit

u erkennen ist. Das Gen besitzt die richtige

ner Vektor pUni/V5-His-TOPOR ohne Insert.

r- Bande auf.

des Genproduktes (s. 2.2.2.10) bestätigt. Die

tenbank verglichen. Sequenziert wurden die

rechende Homologievergleich mit Klon 14

e Sequenz der Klone 11 und 14 als AHCY-

43

Query: 142 tgccgccagcatgtctgacaaactgccctacaaagtcgccgacatcggcctggctgcctg 201 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 38 tgccgccagcatgtctgacaaactgccctacaaagtcgccgacatcggcctggctgcctg 97 Query: 202 gggacgcaaggccctggacattgctgagaacgagatgccgggcctgatgcgtatgcggga 261 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 98 gggacgcaaggccctggacattgctgagaacgagatgccgggcctgatgcgtatgcggga 157 Query: 262 gcggtactcggcctccaagccactgaagggcgcccgcatcgctggctgcctgcacatgac 321 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 158 gcggtactcggcctccaagccactgaagggcgcccgcatcgctggctgcctgcacatgac 217 Query: 322 cgtggagacggccgtcctcattgagaccctcgtcaccctgggtgctgaggtgcaagtggt 381 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct: 218 cgtggagacggccgtcctcattgagaccctcgtcaccctgggtgctgaggtgc-agtggt 276 Query: 382 ccagctgcaacatcttctccacccaggaccatgcggcggctgccattgccaaggctggca 441 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 277 ccagctgcaacatcttctccacccaggaccatgcggcggctgccattgccaaggctggca 336 Query: 442 ttccggtgtatgcctggaagggcgaaacggacgaggagt-cctgtggtgcattgagcaga 500 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct: 337 ttccggtgtatgcctggaagggcgaaacggacgaggagtacctgtggtgcattgagcaga 396 Query: 501 ccctg-actt-aaggac-ggcccct-aacatgattctggac-acgggggc 545 ||||| |||| |||||| ||||||| ||||||||||||||| |||||||| Sbjct: 397 ccctgtacttcaaggacgggcccctcaacatgattctggacgacgggggc 446 Abb. 9: Homologievergleich des AHCY mit der Sequenz-Datenbank

44

Die obere Reihe der Abb. 9 zeigt die von der Datenbank (NCBI-BLAST) angegebene

Sequenz des AHCY, die untere Reihe zeigt das Ergebnis der Sequenzierung des Klons 14 im

Vergleich. Es lies sich eine 98 %ige Übereinstimmung feststellen. Der Homologievergleich

zeigt in sieben Positionen eine Nichtübereinstimmung der Nuleotide, die aber keinen Einfluß

auf die Aminosäuresequenz hatten, weshalb mit dieser Probe weitergearbeitet wurde.

Aufgrund der Homologie wurde die Sequenz der Klone 14 und 11 eindeutig als AHCY-

Gensequenz identifiziert. Klon 1 erschien als leerer pUni/V5-His-TOPO-Vektor und diente in

den folgenden Experimenten als Negativkontrolle.

Die Maxi-Präparation (s. 2.2.2.1) von Klon 1 und 14 erbrachte die Plasmid-DNA mit der die

nachfolgende Rekombination und Transformation durchgeführt wurde. Die daraus ebenfalls

hergestellten Glycerin-Stabs (s.2.2.1.2) lagern dauerhaft bei –70 °C.

3.1.3 TOPO-Cloning-Reaktion in E.coli TOP 10-Zellen mit dem pcDNA3.1-E-Vektor

Der eindeutig identifizierte Klon pUni/V5-His-TOPO-AHCY wurde in den Expressionsvektor

pcDNA3.1-E-EchoTM-Adapted-Expression-Vector (s. 2.2.2.12) einkloniert. Donor- und

Akzeptorvektor bilden durch die Cre-lox seitenspezifische Rekombination ein Fusionsplasmid

(10729 bp), das in E.coli-Zellen des Stammes TOP 10 transfiziert wurde.

Die erfolgreiche Rekombination wurde durch die Kanamycin-Resistenz bestätigt. Der

Donorvektor wird durch den für E.coli TOP 10 ungeeigneten Replikationsursprung

ausselektiert.

Es folgte eine DNA-Isolierung (s. 2.2.2.2) und eine Spaltung mit dem Restriktions-Enzym

der Endonuklease SspI (s.2.2.2.6). Dieses Enzym schneidet das Fusionsplasmid am bla-

Promotor (Promotor für Ampicillin-Resistenz) und linearisiert die Plasmid-DNA. Ein

positiver Klon ließe eine einzelne Bande bei ca. 12000 bp erwarten. Über eine Agarose-Gel-

Elektrophorese (s. 2.2.2.11) ließen sich die Proben isolieren, die eine erfolgreiche

Rekombination/ Transformation gezeigt haben.

45

Spur 1-10: Proben

Spur 11: 1 kb-Leiter

Spur 12: Negativkontolle

Die Darstellung einer einzelnen Bande bei 12000 bp in Abb. 10 zeigt, daß das Restriktions-

Enzym das Fusionsplasmid linearisiert hat. Bei dem auf 0,8 %igem TBE-Gel aufgetragenen

Proben waren die Klone in den Spuren 1, 4, 5, 7 und 9 positiv.

Von einem der positiven Klone (Probe 4) und von einem reinen pcDNA3.1-E-Vektor wurde

eine Maxi-Präparation (s.2.2.2.1) durchgeführt, um mit der aufgereingten Plasmid-DNA

weitere Versuche durchzuführen. Die daraus angefertigten Glycerin-Stabs lagern bei –70 °C.

Abb. 10: Restriktions-Enzym-Verdau des Vektors pcDNA3.1 /-AHCY mit SspI

positive Bande

Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

12 000 bp

2036 bp

3.2 Überexpression von AHCY in eukaryontischen Zellen 3.2.1 Transfektion von Raji-Zellen mit pcDNA3.1-AHCY

Durch die Elektroporation (s. 2.2.2.13) diffundiert die zugegebene DNA in die durch die

elektrischen Impulse geschaffenen Poren der Zellmembran von Raji-Zellen.

Zum Nachweis der erfolgreichen Transfektion von Raji-Zellen mit dem Plasmidvektor, wurde

das auf dem pcDNA3.1-Vektor liegende ß-Lactamase-Gen (Ampicillin-Resistenzgen, Basen

10594-10692 des komplementären Stranges) nachgewiesen. Dies erforderte nach der

Elektroporation zunächst eine DNA-Isolierung (s. 2.2.2.2) und anschließend eine PCR mit ß-

Lactamase-Primern (s. 2.2.2.8). Aufgetragen wurde das PCR-Produkt auf ein 1,5 %iges TBE-

Gel. Das Ampicillin-Resistenzgen besitzt eine Größe von 420 bp und läßt in der Höhe eine

Bande erwarten.

Abb. 11: ß-Lactamase-PCR nach erfolgter Elektroporation

Deutlich sichtbar z

des Ampicillin-Re

werden, daß die T

AHCY-ligierten V

500 bp

1 2 3 4 5 6 7 8

Spur 1: Klon 1 pcDNA3.1-AHCY



Spur 4: Klon 4 pcDNA3.1



Spur 7: Negativkontrolle ohne DNA-Zugabe

46

eigt Abb. 11 in allen Proben eine Bande bei 420 bp, womit ein Fragment

sistenzgens ß-Lactamase nachgewiesen wurde. Damit konnte gezeigt

ransfektion des pcDNA3.1-Vektors in die Raji-Zellen, sowohl mit dem

ektor als auch mit dem Kontrollvektor erfolgreich war.

Um zu prüfen, ob durch die Transfektion mit dem pcDNA3.1-AHCY-Vektor eine AHCY-

Expression stattfindet, wurde eine RNA-Isolierung durchgeführt (s. 2.2.2.2). Anschließend

folgte eine cDNA-Synthese (s. 2.2.2.7), und es wurde ein DNaseI-Verdau (s. 2.2.2.4)

angeschlossen. Die DNaseI-Spaltung dient der Eliminierung kontaminierender DNA-Reste,

die bei anschließender PCR stören würden. Die PCR-Produkte der AHCY-PCR (s. 2.2.2.8)

wurden auf ein 1,5 %iges TAE-Gel aufgetragen. Es wird eine durch die AHCY-Größe

bedingte Bandengröße von 1400 bp erwartet.

Wie in Abb. 12 zu e

mit dem pcDNA3.1

pcDNA3.1-Kontroll

prüfung wurde eine

1 2 3 4 5

500 bp

47

rkennen ist, wurde das AHCY-Gen exprimiert. In Spur 3 zeigt die Probe

-AHCY-Vektor eine stärkere Bande als die Probe in Spur 4 mit dem

vektor. Dies könnte der Hinweis auf eine Überexpression sein. Zur Über-

semiquantitative PCR durchgeführt.

Spur 1: 1 kb-Marker

Spur 2: 100 bp-Marker

Spur 3: Probe mit pcDNA3.1-AHCY-Vektor

Spur 4: Probe mit pcDNA3.1-Vektor

Spur 5: Negativkontrolle mit H2O

1400 bp

Abb. 12: AHCY-PCR nach

Elektroporation mit pcDNA3.1/-AHCY

48

3.2.1.2.1 Etablierung einer semiquantitativen PCR mit AHCY und GAPDH

Zum Nachweis einer Überexpression des AHCY-Gens in pcDNA3.1-AHCY-transfizierten

Raji-Zellen, wurde GAPDH, ein “Housekeeping”-Gen das regelmäßig in Säugetier-Zellen

vorkommt und gleichmäßig während des Zellzyklus exprimiert wird, als Standard für die

AHCY-Expression verwendet. Hierzu wurde zunächst der Thermocycler-Zyklus gewählt, bei

dem im exponentiellen Anstieg eine meßbare Zunahme des AHCY-PCR-Produktes auftrat (s.

2.2.2.8).

Abb. 13: Nachweis der AHCY-Expression

Die PCR wurde über 30 Zyklen durchgeführt. Bei Zyklus 22, 24, 26, 28 und 30 (von links

nach rechts auf der Abb. 13) wurde eine Probe entnommen und auf einem 1,5%igen TAE-Gel

aufgetragen. In der obenstehenden Abbildung wird ersichtlich, daß es zu einem

kontinuierlichen Anstieg von AHCY-DNA kommt.

Spur 1: AHCY-Expression nach Zyklus 22





1 2 3 4 5 6

2036 bp 1018 bp

49

In einem weiteren Schritt wurde eine konkurrierende PCR mit den Primern für AHCY und

GAPDH durchgeführt (s. 2.2.2.8).

Spur 1: AHCY-Primer: 28 Zyklen, GAPDH: 24 Zyklen





Spur 6: Negativkontrolle

Spur 7: 1 kb-Marker

Die Produkte wurden auf ein 2%iges TAE-Gel aufgetragen.

Die AHCY-Primer durchliefen in allen Proben 28 PCR-Zyklen, wie in Versuch zu Abb. 13

ermittelt, während die GAPDH-Primer, wie in Abb. 14 dargestellt, jeweils 2 PCR-

Zykuslängen weniger durchliefen. Die Bandenstärke zeigte, daß bei GAPDH-Zyklus 22

ähnliche Signalintensitäten der PCR-Produkte von AHCY und GAPDH vorlagen. Somit

wurden Zyklus-Bedingunen gefunden, in denen beide Produkte im exponentiellen Bereich

lagen. Für AHCY waren 28 Zyklen und für GAPDH 22 Zyklen erforderlich.

AHCY-Bande bei 1420 bp

GAPDH-Bande bei 306 bp

1 2 3 4 5 6 7

Abb. 14: PCR mit Primern für AHCY und GAPDH zur Kalibrierung der PCR-Bedingungen für eine semiquantitative AHCY-PCR

2036 bp

517 bp

3.2.2 Nachweis der Überexpression von AHCY

Vorraussetzung für die nachfolgenden Untersuchungen war die Überexpression des AHCY-

Gens.

Nach Elektroporation (s. 2.2.2.13), RNA-Isolierung (s. 2.2.2.2), cDNA-Synthese (s. 2.2.2.7)

und DNaseI-Verdau (s. 2.2.2.4) folgte eine semiquantitative PCR (s. 2.2.2.8) des AHCY-Gens

gegen GAPDH als Referenz.

Abb. 15: Nachweis der Überexpression von AHCY mit GAPDH als Referenzbande

Die PC

Überex

im Ve

untersu

Kontro

Grunda

läßt sic

den ges

Daß es

und 4.

kontinu

AHCY-Bande

GAPDH-Bande

1 2 3 4 5 6 7 8

2036 bp

517 bp

Spur 1: Probe 1 pcDNA3.1-AHCY Spur 5: Probe 3 pcDNA3.1-AHCY

Spur 2: Probe 1 pcDNA3.1 Spur 6: Probe 3 pcDNA3.1

Spur 3: Probe 2 pcDNA3.1-AHCY Spur 7: Negativkontrolle mit H2O

Spur 4: Probe 2 pcDNA3.1 Spur 8: 1 kb-Marker

R-Produkte wurden a

pression von AHCY i

rgleich zu den Zelle

chten Parallelansätze

llansätzen wurde ebe

ktivität entspricht. Al

h die GAPDH-Bande

amten Zellzyklus expr

sich vermutlich um ei

Tag nach Elektropo

ierlich abnahm. Die P

50

uf ein 2%iges TAE-Gel aufgetragen. In Abb. 15 ist die starke

n Zellen dargestellt, die mit pcDNA-AHCY transfiziert wurden,

n, die mit dem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die drei

wiesen eine wesentlich verstärkte AHCY-Expression auf. In den

nfalls AHCY exprimiert, aber nur sehr schwach, wie es der

s Referenz und zur Vergleichbarkeit der Proben untereinander,

heranziehen, da dieses “Housekeeping”-Gen gleichmäßig über

imiert wird.

ne transiente Transfektion handelte, zeigten Kontrollen des 1., 2.

ration, die darauf hinwiesen, daß die AHCY-Überexpression

roben wurden auf ein 2%iges TAE-Gel aufgetragen (s. Abb. 16).

51

Es erfolgte am 1., 2. und 4. Tag nach Elektroporation eine RNA-Isolierung (s. 2.2.2.2),

cDNA-Synthese (s. 2.2.2.7), DNaseI-Verdau (s. 2.2.2.4) und eine semiquantitative

AHCY/GAPDH-PCR (s. 2.2.2.8).

Abb. 16: AHCY-Expression nach 1., 2. und 4. Tag

Spur 1: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 1. Tag



Spur 4: Probe mit pcDNA3.1 4. Tag

Spur 5: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 1. Tag 1:10 verdünnt



Spur 8 : Probe mit pcDNA3.1 4. Tag 1:10 verdünnt

Spur 9: 1 kb-Marker

Die Abbildung 16 zeigt die Abnahme der AHCY-Expression vom 1. bis zum 4. Tag. GAPDH

ist nur schwach zu erkennen. Die abnehmende Expression im Verlaufe mehrerer Tage ließ

sich in weiteren Versuchen bestätigen. Das Ergebnis zeigt eine transiente Expression an.

3.2.3 Nachweis der AHCY-Überexpression auf Proteinebene

Am 1. Tag nach Transfektion mit pcDNA3.1 /-AHCY wurden die Proteine aus den Raji-

Zellen isoliert (s. 2.2.3.3). Die Proteine wurden mittels SDS-Page aufgetrennt und auf eine

Nitrocellulose-Membran transferiert. Mit der Ponceau S-Färbung (s. 2.2.3.4.3) wurden die

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2036 bp 1018 bp

Proteine auf der Membran sichtbar dargestellt. Es folgte die Immundarstellung (s. 2.2.3.4.4)

von AHCY mit spezifischen Antikörpern (vgl. Abb 17).

In Abb.17 wurden die Proben in zwei parallelen Ansätzen mit pcDNA3.1-AHCY

abwechselnd mit den pcDNA3.1-Proben aufgetragen. Spur 5 stellt eine Kontrolle gegen nicht-

transfizierte Raji-Zellen dar und Spur 6 zeigt einen Protein-Rainbow-Marker.

Es ließ sich z

quantitativ m

Protein AHC

Marker bestä

Die AHCY-Ü

Translation

Zellverhalten

da es sich u

Tagen nicht m

Abb.17: Immunblot mit Darstellung des AHCY-Proteins

AHCY-Protein mit 47,6 kDa

1 2 3 4 5 6

220 kDa

45 kDa

Spur 1: Probe 1 pcDNA3.1-AHCY Spur 4: Probe 2 pcDNA3.1

Spur 5: Kontrolle mit nativen

Raji-Zellen

Spur 6: Molekularmassen-

Marker

Spur 2: Probe 1 pcDNA3.1

Spur 3: Probe 2 pcDNa3.1-AHCY

52

eigen, daß in Probe 1 und 2 die mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Raji-Zellen

ehr AHCY-Protein gebildet haben als die pcDNA3.1-Zellen. Das menschliche

Y besitzt eine Größe von 47,660 kDa, dessen Bandenhöhe durch den farbigen

tigt wurde.

berexpression bewirkt offenbar eine deutliche Steigerung der Transkription und

des AHCY-Proteins. Wie es sich mit der Transkription/Translation und dem

über längere Zeit verhält, kann zu diesem Zeitpunkt noch nicht gesagt werden,

m einen vorübergehenden Transfektionseffekt handelt, der schon nach wenigen

ehr meßbar war.

3.2.4 Zellwachstum nach Transfektion mit pcDNA3.1 und -AHCY

Die Anzahl der Zellen wurde am 1., 2., 4. und 8. Tag nach Elektroporation gemessen

(s.2.2.3.1).

Bei der Auswertung dieser Ergebnisse zeigte sich, daß die Raji-Zellen, in die der Vektor

pcDNA3.1-AHCY transfiziert worden war, sich innerhalb der ersten 48 Stunden kaum

veränderten (Faktor 1,15), in den folgenden 48 Stunden veranderthalbfachten bis

verdoppelten sich die Zellen (Faktor 1,21-1,95) und blieben dann relativ gleich bis zum 8.Tag

(Faktor 0,94).

Die Zellen, in die nur der Kontrollvektor pcDNA3.1 transfiziert worden war, zeigte in allen

Versuchen ein sehr ähnliches Wachstumsverhalten (s. Abb.18). Innerhalb der ersten 48

Stunden blieb die Zellzahl annähernd gleich, nach weiteren 48 Stunden verdoppelt sie sich

fast (Faktor 1,93) und bleibt bis zum 8. Tag fast gleich.

Die Ergebnisse sind zur Verdeutlichung in Abb.18 dargestellt.

Ab

Ergebnis der Zellzählung nach Transfektion

00

05

05

05

05

05

05

05

05

05

06

Zellz

ahl SAH transfizierte Zellen

Vektor transfizierte Zellen

0.E+

1.E+

2.E+

3.E+

4.E+

5.E+

6.E+

7.E+

8.E+

9.E+

1.E+1x106

9x105

8x105

7x105

6x105

5x105

4x105

3x105

2x105

1x105

0

53

b. 18: Ergebnis der Zellzählung nach Transfektion

1.T ag 1.T ag 2.T ag 2.T ag 4.T ag 4.T ag 8.T ag 8.T ag

Tage nach Trans fe k tion

54

3.2.5 BrdU-Test

Am 2. und am 4. Tag wurde die Zellproliferation durch Bestimmung der DNA-

Neusyntheserate untersucht.

Abbildung 19 veranschaulicht die DNA-Syntheserate der transfizierten Zellen.

Tage nach Transfektion2 2 4 4

DN

A-Sy

nthe

sera

te /R

el.E

inhe

iten

0,0

0,1

0,2

Schwarz dargestellt ist die Syntheserate der pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Raji-Zellen am

2. und am 4.Tag nach Transfektion. Hellgrau unterlegt ist die DNA-Syntheserate der

pcDNA3.1-transfizierten Kontrollen zum gleichen Zeitpunkt.

Die DNA-Syntheserate der mit AHCY transfizierten Zellen war am 2.Tag mit 0,175 (rel.

Einheiten) um den Faktor 2,2 höher als bei den pcDNA3.1-transfizierten Zellen, fiel dann bis

zum 4.Tag auf 0,35, in den Bereich der Kontrollzellen ab.

Die Überexpression des AHCY-Gens induzierte eine kurzfristige, starke DNA-Synthese, die

jedoch am 4. Tag auf ein Viertel abfiel. Dieser Effekt konnte zeitlich nicht weiter verfolgt

werden, da es sich um eine transiente Transfektion handelte, deren Aktivität am 4.Tag nicht

mehr meßbar war (s. 3.2.2).

Abb. 19: Zellproliferationsmessung

55

3.2.6 Immunfluoreszenztest

Mittels des Immunfluoreszenztest (IFT) wurde untersucht, welche Auswirkungen die AHCY-

Überexpression auf die Latenz des EBV hat. Der Versuch wurde wie unter 2.2.3.2 am 1., 2.

und 4. Tag nach Transfektion durchgeführt. Die Auswertung erfolgte anschließend durch

Zählen der fluoreszierenden, EA-positiven Zellen (s. Abb 21).

Die Ergebnisse sind in Abb. 21 dargestellt.

Es wurde die Expression des EBV Early-Antigen (EA) untersucht (s. Abb.20). Am 1. Tag

nach Transfektion zeigten die AHCY-transfizierten Raji-Zellen eine um den Faktor 2,7

stärkere EA-Expression als die Vektor-transfizierten Zellen (p= 0,003). Am 2. Tag betrug der

Faktor 2,1 (p= 0,03) und am 4. Tag 2,44 (p= 0,0005).

Es läßt sich feststellen, daß die AHCY-Überexpression Raji-Zellen zu einer verstärkten EA-

Expression anregt. Dieser Effekt geht zeitlich sogar noch über die nachweisbare AHCY-Gen-

Überexpressionsphase (1.und 2. Tag nach Transfektion) hinaus, da am 4. Tag ebenfalls noch

eine verstärkte EA-Expression festzustellen ist.

Die Immunfluoreszenzuntersuchungen sind in Abb. 21 dargestellt.

Abb. 20: Nachweis der EA-Expression in AHCY-transfizierten Zellen und Kontrollzellen

Tage nach Transfektion0 1 1 2 2 4 4

EA-p

ositi

ve Z

elle

n / 1

0000

0 Ze

llen

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90unbehandelte Raji-ZellenSAH-transfizierte ZellenVektor-transfizierte Zellen

56

3.2.7 BZLF1 / BHRF1-PCR

Am 1., 2. und 4. Tag nach Transfektion mit pcDNA3.1/-AHCY wurde aus Raji-Zellen RNA

isoliert, ein DNaseI-Verdau und eine cDNA-Synthese durchgeführt, um im Anschluß daran

zwei verschiedene PCR-Produkte nachzuweisen. Die eine PCR erfolgte mit BZLF1-Primern

(s. 2.2.2.8), die andere mit BHRF1-Primern (s. 2.2.2.8). Beide Gene sind an der Reaktivierung

des lytischen Zyklus von EBV beteiligt.

1.Tag EA (pcDNA3.1-AHCY) EA (pcDNA3.1)

2. Tag EA (pcDNA3.1-AHCY) EA (pcDNA3.1)

EA Negativkontrolle (Raji) EA Positivkontrolle (B 95-8)

Abb. 21: Expression von EA in Raji-Zellen, die mit pcDNA3.1 oder pcDNA3.1-AHCY transfiziert wurden

Es wurden BZLF1-Fragmente mit 182 bp Größe erwartet, als Positivkontrolle dienten B95-8-

Zellen, die sowohl BZLF1 als auch BHRF1 kontinuierlich exprimierten. Als Negativkontrolle

wurden unbehandelte Raji-Zellen verwendet.

Im Ergebnis lies sich in einer Spur auf Höhe von 182 bp eine BZLF1-Bande nachweisen. Es

handelte sich dabei um eine mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierte Probe. Die anderen

pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Proben, alle Proben mit transfiziertem Kontrollvektor und

die Negativkontrolle wiesen keine Banden auf. Die Positivkontrolle zeigte, wie zu erwarten,

ebenfalls eine Bande bei 182 bp (nicht dargestellt).

Das Ergebnis der PCR mit BHRF1-Primern am 1. Tag nach Transfektion ist übereinstimmend

mit dem Ergebnis der BZLF1-PCR. Eine Probe mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen

zeigte eine BHRF1-Bande bei 211 bp, während alle weiteren Proben keine Bande aufwiesen.

Die positiven Proben beider PCR’s wurden erneut auf ein 2 %iges TBE-Gel aufgetragen, das

in Abb. 22 dargestellt ist.

Spur 1: 100 bp-Leiter Spur 3: positive B

Spur 2: positive BZLF1-Probe (182 bp) Spur 4: Negativko

Am 1. Tag nach Transfektion konnte in beiden Fällen die E

des BHRF1-Gens nachgewiesen werden. Die Reaktivierung d

die Überexpression des AHCY am 2. und 4. Tag nach Tra

dieser Gene nicht nachweisbar.

1 2 3 4

500 bp

100 bp
Abb.22:
positive BZLF1- und BHRF1-Proben

57

HRF1-Probe (211 bp)

ntrolle

xpression des BZLF1-Gens und

es lytischen EBV-Zyklus durch

nsfektion war eine Expression

58

3.2.8 Facs Scan

Der Versuch wurde durchgeführt wie unter 2.2.3.5 beschrieben.

Die mit pcDNA3.1/-AHCY-transfizierten Raji-Zellen wurden auf die Oberflächenmarker

CD11a, CD19, CD21, CD23, CD30, CD40, CD44, CD54, CD58 und HLA-DR untersucht

(Funktion unter 2.2.3.5 beschrieben).

Abb. 23:

Darstellung der FACS Scan-Ergebnisse nach Transfektion mit pcDNA3.1/-AHCY mit

Expression der Merkmale CD19, CD21, CD40 und CD58

Der schwarz hinterlegte Teil der Facs-Histogramme in Abb. 23 zeigt die pcDNA3.1-AHCY

transfizierten Zellen, der hellgrau hinterlegte Teil die pcDNA3.1-transfizierten Zellen.

Bei vier Oberflächenmarkern ließen sich Veränderungen bei Transfektion mit pcDNA3.1-

AHCY und pcDNA3.1 feststellen. Es handelt sich dabei, um CD19, CD21, CD40 und CD58,

die in allen vier Fällen einen Anstieg der Expression nach AHCY-Überexpression zeigten.

Der Anstieg der Oberflächenmerkmale ist ein Zeichen für Aktivierungsvorg

der Zelle. Die weiteren Oberflächenmarker, die untersucht wurden, zeig

änderung in ihrer Expression.

3.2.9 Versuche mit dem Light Cycler

Mit dem Light Cycler-Instrument (s. 2.2.2.9) wurde die Analyse der differentie

Genaktivität durchgeführt. Untersucht wurden folgende Gene:

- LFA1 (ein Leukozytenadhäsionsprotein)

- L6/TAX (60S ribosomales Protein L6)

- RAI (ein plazentarer Ribonukleaseinhibitor)

- G(S)α (ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein)

- PUF (Nukleosid-diphosphat-kinase 3)

- TOB (Protein der Zellzykluskontrolle)

- MCH4 (apoptotische Cystein-Protease)

- TRAF3 (CD40-assozierter Faktor)

- SOD1 (Cu/Zn Superoxid-dismutase)

Oberflächenmarker Probe (Anzahl) Kontrolle (Anzahl) Signifikanz

CD19

CD21

CD40

CD58

255,4 +/- 39,1 112,7 +/- 13,1

237,3 +/- 34,7 114,5 +/- 13,7

360,1 +/- 79,7 183,0 +/- 29,9

236,6 +/- 43,7 119,0 +/- 12,2

< 0,005

< 0,005

ä

te

ll

< 0,01

< 0,01

59

nge innerhalb

n keine Ver-

en

60

Die Gene wurden nach ihrer möglichen Rolle in der EBV-modulierten Zelltransformation

ausgewählt. In früheren Vesuchen zeigten sich diese Gene aktivierbar durch Gangliosid LM1-

Behandlung (Kleines, 2000).

Es ließ sich in mehrfach wiederholten Untersuchungen in keinem dieser Fälle Veränderungen

der Genaktivität nachgeweisen, was darauf hinweist, daß die AHCY-Überexpression zu dem

untersuchten Zeitpunkt keine Induktion bei den genannten Genen auslöst. Möglicherweise

sind sie an der Reaktivierung des EBV-Zyklus nicht beteiligt oder es sind weitere Faktoren

nötig, um sie zu induzieren.

61

4. Diskussion

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Herpes-Virus und bekannt als der Erreger der

infektiösen Mononukleose. Über die Schleimhaut des Naso-Pharyngealraumes gelangt das

Virus in den Körper und infiziert u.a. B-Lymphozyten, in denen es lebenslang persistiert

(Gutierrez et al., 1997).

Das EBV-Virus wird mit einigen Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht, wie dem

Burkitt-Lymphom, dem Nasopharynx-Karzinom und dem Hodgkin-Lymphom (Hanto et al.,

1983; Hamilton-Dutoit et al., 1991). Zudem wurde das EBV-Genom in den Kernen von reifen

T-Zell-Lymphomen nachgewiesen (Tokunaga et al., 1993). Die Initiation der Zell-

transformation geschieht aus dem Stadium der Viruslatenz.

Äußere Faktoren wie die Applikation von 10-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA),

Anti-IgM-Antikörper oder dem Gangliosid IV3NeuAc-nLcOse4Cer (LM1) können das

Wiedereintreten in den lytischen Zyklus bewirken. Die Behandlung mit LM1 zeigte zudem

eine Wachstumshemmung und Differenzierungsaspekte (Schaade et al., 1999). Die

Untersuchung der Genexpressionsmuster von 24 ausgewählten Genen zeigte Veränderungen.

Eines davon war das Gen für S-Adenosylhomocystein-Hydrolase (AHCY).

In der vorliegenden Arbeit werden die Effekte der Überexpression von AHCY in Burkitt-

Lymphom-Zellen der Zellinie Raji untersucht.

4.1 Klonierung von AHCY in einen Expressionsvektor

Das EchoTM Cloning System basiert auf einem Plasmid-Fusions-System, das schnell und

einfach das zu untersuchende Gen in einen Akzeptorvektor rekombiniert. Der Vorteil dieser

Methode liegt in dem Cre-lox seitenspezifischen Rekombinationssystem des Bakteriophagen

P1 (Abremski et al., 1983; Sternberg et al., 1981). Ein Donorvektor mit ligiertem Gen von

Interesse fusioniert in gerichteter Rekombination mit einem Akzeptorvektor, woraus ein

Expressionsvektor entsteht, der das „Insert“ in gerichteter Orientierung unter Kontrolle der

eukaryontischen Promotorsequenz bringt.

Ein frisches A-tail PCR-Produkt (AHCY) wurde in den Donorvektor pUni/V5-His-TOPO

kloniert. Die Transfektion dieses Vektors erfolgte in E. coli-Zellen des Stammes PIR1. Die

entstandenen Klone wurden auf Antibiotika-haltigen Nährmedien selektiert und über

62

Sequenzierung identifiziert. Das Sequenzierungsergebnis wurde mit einer Sequenz-Datenbank

verglichen und es zeigte sich im Homologievergleich eine 98 %ige Übereinstimmung mit der

bekannten AHCY-Sequenz. Dieser Donorvektor fusionierte in einem weiteren Schritt mit

dem Akzeptorvektor pcDNA3.1-E. E.coli-Zellen des Stammes TOP10 wurden mit dem ent-

standenen Expressionsvektor pcDNA3.1-AHCY transfiziert.

Als Alternative zur Sequenzierung wäre auch ein Restriktionsenzym-Verdau mit

unterschiedlichen Enzymen möglich. Dabei würde das gewünschte Konstrukt an mehreren

bekannten Positionen geschnitten, so daß in einer anschließenden Agarose-Gel-

Elektrophorese ein für das Produkt spezifisches Bandenmuster erkennbar wäre. Der Vorteil

der Sequenzierungsmethode liegt in der schnellen, einfachen Verarbeitung der Proben und der

Möglichkeit dabei gleichzeitig Mutationen oder Veränderungen innerhalb des Gens und

dessen Relevanz festzustellen.

Um die Effekte der AHCY-Überexpression zu untersuchen, wurde der Vektor in Raji-Zellen

transfiziert. Als Negativkontrolle diente der Vektor pcDNA3.1-E ohne innenliegendes

Genprodukt.

4.2 Transfektion/Expression von pcDNA3.1-AHCY in Raji-Zellen Der Vektor pcDNA3.1-AHCY wurde für Überexpressionsuntersuchungen in Raji-Zellen

transfiziert. Kontrollzellen wurden mit pcDNA3.1 als leerem Vektor behandelt. Die Methode

der Wahl war die Elektroporation bei der durch einen elektrischen Impuls die Zellmembran

durchlässig wird und die vorliegende DNA hineindiffundieren kann. Die Elektroporation ist

relativ aggressiv für die Zellen, fast 1/3 der Zellen überleben diese Behandlung nicht

(Maniatis et al., 1989). Eine weitere Transfektionsmethode wird durch das SuperFectTM

System angeboten. Hierbei wird das Gen von Interesse in ein Liposom eingebracht, das in

einem weiteren Schritt mit der Zellmembran der zu transfizierenden Zelle fusioniert. Dabei

gelangt das entsprechende Gen in die Zelle. Diese Methode ist verglichen mit der

Elektroporation genauso effizient; sie hat sogar den Vorteil für die Zellen weniger aggressiv

zu sein (Maniatis et al., 1989). Desweiteren muß insgesamt weniger DNA eingesetzt werden

als es bei der Elektroporation der Fall ist. Der Nachteil der SuperFect-Methode liegt darin,

daß hierbei um den Faktor 10 weniger Zellen transfiziert werden und das Material für die

anschließenden Versuche nicht ausreichte. Die folgenden Transfektionen wurden deshalb mit

der Elektroporationsmethode durchgeführt.

63

Einen Tag nach der Transfektion wurde durch Amplifikation des Ampicillin-Resistenz-Gens,

das auf dem Vektor verankert ist, die gelungene pcDNA3.1-Aufnahme überprüft. Die

erfolgreiche Transfektion konnte nach allen Elektroporationen gezeigt werden.

Die AHCY-Überexpression konnte in den ersten Tagen nachgewiesen werden, wobei die

deutlichste Überexpression am 1. Tag zu verzeichnen war, die dann zum 2. und noch mehr

zum 4. Tag hin abfiel. Dies ist beweisend für eine transiente Transfektion. Die Ursache für

diese transiente Transfektion liegt darin, daß der transfizierte Vektor von den Raji-Zellen

nicht amplifiziert werden kann und sich somit nach wenigen Zellteilungen verliert. Mit einem

Vektor, der sich als Insert in das Genom der Zielzelle integriert, wäre es möglich eine stabile

Zellinie zu züchten und mit ihr längerfristige Überexpressionseffekte zu untersuchen.

Mit der verstärkten Expression des AHCY-Gens ging eine verstärkte Transkription/

Translation des AHCY-Proteins einher. Gezeigt werden konnte dies im Western Blot, wobei

hier ebenfalls am 1. posttransfektionalem Tag der deutlichste Effekt erkennbar war. Die

pcDNA3.1-AHCY-Banden des 1. Tages waren wesentlich stärker als die der Kontrollgruppe

(pcDNA3.1). Bereits am 2. Tag ließ sich dies nicht mehr eindeutig nachweisen. Darüber ob es

sich hierbei um ein funktionstüchtiges Protein handelt bzw. welche Auswirkungen dies auf

den Zellmetabolismus hat, kann hier nicht beantwortet werden. In Anbetracht der Tatsache,

daß es sich hier um eine nur kurzfristige, transiente Transfektion handelt, müssen die

Untersuchungen der Effekte der AHCY-Überexpression ihren Schwerpunkt auf den ersten

Tag nach der Transfektion legen.

4.3 Effekte der AHCY-Überexpression in Raji-Zellen

Während bei der Behandlung mit dem Gangliosid LM1 eine Wachstumshemmung und

Differenzierungsvorgänge zu beobachten waren (Schaade et al., 1999), ließen sich in dieser

Untersuchung keine signifikanten Wachstumsunterschiede feststellen zwischen pcDNA3.1-

AHCY-transfizierten Zellen und denen der Kontrollgruppe. Bis zum 2. Tag blieb die Zellzahl

in beiden Gruppen annähernd gleich, um sich bis zum 4. Tag fast zu verdoppeln. Bis zum 8.

Tag läßt sich nur noch ein leichter Anstieg der Zellzahl beider Populationen verzeichnen. Die

Elektroporation ist eine zellschädigende Methode der Transfektion, die Zellen sind starkem

Streß ausgesetzt. Die transfizierten Zellen müssen sich nach der Elektroporation zunächst

einmal erholen, was erklärt, warum sie bis zum 2. Tag kaum wachsen. Eine Veränderung

64

durch die AHCY-Überexpression ließ sich in Bezug auf das Zellwachstum nicht feststellen,

da sich beide untersuchte Zellpopulationen nicht signifikant voneinander unterschieden.

Anders sieht es aus bei der Untersuchung der DNA-Syntheserate der transfizierten Zellen. Die

mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen zeigten am 2. Tag nach Transfektion eine 2,3 x

höhere DNA-Syntheserate als die Kontrollgruppe. Dieser Effekt sank bis zum 4. Tag stark ab,

bei den pcDNA-AHCY-transfizierten Zellen auf 20 % des Wertes vom 2. Tag und damit lag

die Syntheserate noch unter der der Kontrollgruppe. Die Kontrollgruppe selbst fiel in ihrer

DNA-Syntheserate ebenfalls vom 2. auf den 4. Tag auf 60 % des Vorwertes.

Es ist denkbar, daß die durch die Elektroporation „gestressten“ Zellen sich bis zum 2. Tag

erholt haben, um dann erstmal überschießend DNA zu synthetisieren, was den Abfall am 4.

Tag erklären würde. Die DNA-Syntheserate korreliert zeitlich mit dem AHCY-

Überexpressionseffekt, jedoch nicht mit der Raji-Zellwachstumsrate. Die Überexpression

induziert kurzfristig eine starke DNA-Synthese, wobei in zukünftigen Arbeiten zu prüfen

wäre, welche Abschnitte der DNA synthetisiert werden oder ob davon das gesamte Genom

betroffen ist. Dieser Effekt der starken DNA-Synthese hat zumindest bis zum 4. Tag nach

Transfektion keinen Effekt auf das Zellwachstum.

Eines der Gene, dessen verändertes Expressionmuster untersucht wurde, ist das BZLF1-Gen.

Es gehört zu der Familie der AP1-Transkriptionsfaktoren und spielt eine zentrale Rolle bei

der Reaktivierung des lytischen Zyklus. Seine Expression initiert in latent infizierten B-Zellen

den Übergang aus der Latenz in die aktive Phase mit lytischer Virusvermehrung (Speck et al.,

1997). BZLF1 ist eines der ersten Gene, die im Reaktivierungsprozeß des EBV

transkriptionell aktiviert werden (Sinclair et al., 1992). Eine Darstellung der Abläufe zum

Aktivierungsprozeß findet sich in Abb. 24.

Bei der Untersuchung im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich eine gesteigerte Transkription des

BZLF1-Gens am 1. Tag nach der Transfektion. An den folgenden Tagen war dieser Effekt

mittels PCR nicht mehr nachweisbar. Wahrscheinlich war der Überexpressionseffekt von

AHCY am 1. Tag groß genug, BZLF1 zu aktivieren. Als die Überexpression dann abfiel, sank

die BZLF1-Aktivierung ebenfalls und ließ sich nicht mehr nachweisen.

Ein weiteres Gen, dessen Expressionsveränderungen untersucht wurden, ist das lytische

Transkript des BHRF1-Gens. Als ein strukturelles und funktionelles Homolog des Anti-

Apoptose-Proteins Bcl-2 moduliert BHRF1 den Zellzykus und schützt z.B. die durch

Bestrahlung geschädigte Zellen vor der Apoptose (Huang et al., 1999). Das BHRF1-Gen wird

sowohl in der EBV-Latenzphase als auch in der lytischen Replikation exprimiert. Das

65

BHRF1-Transkript des lytischen Zyklus kann spezifisch durch PCR nachgewiesen werden,

was für die Untersuchung vorteilhaft ist (Austin et al., 1988; Marchini et al., 1991).

Nach AHCY-Überexpression ließ sich am 1. Tag nach Transfektion eine BHRF1-Expression

nachweisen, nicht jedoch an einem der darauf folgenden Tage (s. 3.2.6). Die Ergebnisse der

BHRF1-Expression sind praktisch mit denen der BZLF1-Expression identisch.

Sowohl die BZLF1- als auch die BHRF1-Transkription zeigte einen ähnlichen Effekt wie die

AHCY-Überexpression selbst. Am 1. posttransfektionalem Tag war die AHCY-Über-

expression am stärksten, fiel vom 2. auf den 4. Tag nach Transfektion so deutlich ab, daß eine

Überexpression nicht mehr nachweisbar war. Die Transkriptionen der Gene BZLF1 und

BHRF1 spiegeln dieses Ergebnis wider. Nur eine kontinuierlichere Stimulationszeit, also

länger als 1-2 Tage, könnte zu einer kontinuierlichen Expression führen.

Wird das EBV aktiviert und tritt in den lytischen Zellzyklus ein, werden eine Reihe EBV-

spezifischer Antigene gebildet (Epstein et al., 1979). Dazu gehört u.a. das ‚early antigen‘

(EA), das für die Replikation des Virus benötigt wird (Epstein et al., 1979). Es ist eines der

ersten Antigene, die im Reaktivierungsprozeß aktiviert werden.

Für diese Untersuchung wurde ein Immunfluoreszenztest durchgeführt. Spezifische

Antikörper gegen EA wurden eingesetzt, als Positivkontrolle dienten B95-8-Zellen. Es zeigte

sich, daß am 1.Tag nach Transfektion die Rate der EA-positiven Raji-Zellen bei den

pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen 2,7 x höher lag als die mit pcDNA3.1-transfizierten

Kontrollen. Am 2. Tag gab es ebenfalls eine hohe Expression der pcDNA3.1-AHCY-

transfizierten Zellen (Faktor 2,1), am 4.Tag lag der Faktor bei 2,4.

Der AHCY-Überexpressionseffekt zeigt eine EBV-Aktivierung, die offensichtlich über die

Expressionszeit hinausging, denn EA wurde nach Abfall der AHCY-Expression weiterhin

verstärkt exprimiert.

Zusammenfassend läßt sich festgestellen, daß eine AHCY-Überexpression zu einer

Aktivierung des BZLF1-Gens, BHRF1-Gens und zu einer verstärkten EA-Synthese führt.

Diese Ergebnisse belegen den Eintritt des EBV in den lytischen Zyklus.

In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß monozytäre Zellen einen

Wachstumsstopp bei immortalisierten Zellen auslösen kann (Ritter et al., 1986). Das

Gangliosid IV3NeuAC-nLcOse4Cer wurde als Auslöser dieses Effektes identifiziert.

Desweiteren wurde gezeigt, daß durch Stimulation von EBV-positiven B-Zell-

Lymphomzellen mit diesem Gangliosid der lytische EBV-Zyklus induziert wurde, erkennbar

66

am Ansteigen der lytischen EBV-Antigene und der Freisetzung von EBV-Genom (Schaade et

al., 1999). Für eine Gangliosid-Beteiligung sprechen auch Ergebnisse über das Gangliosid

GM2. Es verursacht eine Wachstumshemmung durch Inhibierung des Platelet-derived-

growth-(PDG-)-Faktors (Wu et al., 1999).

Bislang wurde die Überführung aus der viralen EBV-Latenz in den Replikationszyklus durch

Aktivierung des lytischen Zyklus hauptsächlich durch Induktion mit 10-O-

Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) oder Ig M-Antikörper untersucht. Dabei wurde

gezeigt, daß die Proteinkinase C (PKC) für das extrazelluläre Signal benötigt wird (Davies et

al., 1991; Bister K et al., 1979). So lassen sich die mit TPA-behandelten Zellen bei

gleichzeitiger Anwesenheit eines PKC-Inhibitors nicht in den lytischen Zyklus überführen

(Hayashi et al., 1992).

Ein Ziel bei der Untersuchung der AHCY-Signalkaskade ist das den lytischen Zyklus

induzierende virale Gen BZLF1. Es korreliert in seinem Auftreten mit der Aktivierung der

PKC (Baumann et al., 1998; Daibata et al., 1994). Es wird vermutet, daß PKC eine

Schlüsselrolle in dieser Signalkaskade zufällt, da sie die meisten Transkriptionsfaktoren

induziert, die den BZLF1-Promotor im Zuge der Virusreaktivierung aktivieren (Speck et al.,

1997).

In der Studie der Gangliosid IV3NeuAC-nLcOse4Cer-behandelten Lymphomzellen (Schaade

et al., 2000) wurde eine erhöhte Transkription des Gens für S-Adenosyhomocystein-

Hydrolase (AHCY) gefunden. Weitere Gene, die verstärkt exprimiert wurden, waren die Gene

für Phospholipase A2 (PLA2) und für ein Thioredoxin-Homolog.

AHCY kommt eine Schlüsselrolle in Methylierungsprozessen zu. Hauptsächlich S-

Adenosylmethionin ist der Donor für Methylgruppen in Transmethylierungsreaktionen

(Mertens et al., 1983). In dieser Reaktion wird S-Adenosylmethionin zu S-

Adenosylhomocystein umgesetzt, dem Substrat des Enzyms AHCY.

In weiteren Untersuchungen wurde festgestellt, daß AHCY-Inhibitoren die Virusreplikation

von verschiedenen Viren, wie beispielsweise dem Cytomegalievirus, verhindern (Snoeck et

al., 1993), denn zur Reifung der viralen mRNA ist die 5‘-Methylierung durch AHCY

unerläßlich (De Clerq et al., 1990; Montgomery et al., 1982). Wird die Aktivität der AHCY

durch Inhibitoren verhindert, steigt die Konzentration von S-Adenosylhomocystein an und die

5‘-Methylierung von viraler mRNA wird verhindert, was sich sowohl negativ auf die

Translation viraler Transkripte als auch auf die virale Enzymaktivität auswirkt.

Es kann vermutet werden, daß ein erhöhter intrazellulärer AHCY-Spiegel eine erhöhte Rate

an Transmethylierungsreaktionen und viralen 5‘-Methylierungen bedingt. Dadurch würde die

67

Translation der EBV-wichtigen Proteine, wie z.B. BZLF1, dem Hauptfaktor für den

Übergang von viraler Latenz zum produktiven lytischen Zyklus, gefördert (Schaade et al.,

2000).

Zusätzlich katalysiert AHCY die Reaktion von Phosphatidylethanolamin zu

Phosphatidylcholin, dem Substrat der PLA2. Eine erhöhte PLA2-Transkription wurde

ebenfalls in der Untersuchung der Gangliosid-behandelten Lymphomzellen gefunden. Dieses

Enzym ist Teil einer PKC-vermittelten Signalkaskade.

Aus den genannten Erkenntnissen ergab sich folgende schematische Arbeitshypothese, die

dieser Arbeit zugrunde liegt:

Abb. 24: Darstellung der Arbeitshypothese (AHCY: S-Adenosylhomocystein-Hydrolase; PLA2: Phospholipase

A2; PKC: Proteinkinase C; EBV: Epstein-Barr Virus Genom; CDS: kodierende Sequenz; Prom: Promotor

Region; EBV-kodierendes Gen BZLF1; Sp1/Sp3: Transkriptionsfaktoren), (Schaade et al., 2000)

Es scheint für AHCY verschiedene Wege zu geben, den lytischen EBV-Zyklus zu

reaktivieren. Zum einen scheint die Möglichkeit zu bestehen, daß AHCY direkt die

Virusreaktivierung durch Aktivierung des Methylierungssystems anregt, zum anderen gibt es

den indirekten Weg der PKC-Aktivierung über die Phospholipase A2.

In der vorliegenden Arbeit konnte durch AHCY-Überexpression eindeutig nachgewiesen

werden, daß es zu einer verstärkten Expression der Gene BZLF1 und BHRF1 kommt. Ebenso

Phosphatidylethanolamin

Phosphatidylcholin

Arachidonsäure

PKC

Methylierung

AHCY

PLA2

1 2

1: Methylierung des 5‘-Endes2: Phophorylierung

Sp1/Sp3

EBV

CDS Prom

BZLF1

68

belegen die Ergebnisse des Immunfluoreszenztests den Übergang von der viralen Latenz in

den lytischen Zyklus des EBV. Diese Ergebnisse bestärken die Wahrscheinlichkeit der

Arbeitshypothese.

PKC ist zusätzlich an Differenzierungsprozessen beteiligt (Dekker et al., 1994; Mischak et al.,

1993). Bei der Untersuchung zur differentiellen Genaktivität wurden die Gene ausgewählt,

die sich in früheren Studien durch das Gangliosid LM1 aktivierbar gezeigt hatten (s.3.2.8). Es

stellte sich heraus, daß unter dieser Versuchsreihe keine veränderte Aktivität der untersuchten

Gene feststellbar war, was zum einen daran liegen könnte, daß der AHCY-

Überexpressionszeitraum zu kurz war, um diese Genaktivitäten zu modulieren oder daß

weitere Faktoren dafür nötig sind, die noch nicht bekannt sind. Denkbar ist ebenfalls, daß –

bezugnehmend auf auf die schematische Arbeitshypothese – der direkte Weg der BZLF1-

Aktivierung über das Methylierungssystem eingeschlagen wurde, ohne daß die Signalkaskade

über PKC genutzt wurde. Damit wäre erklärbar, warum sich die Genaktivität nach

Gangliosidbehandlung (mit Aktivierung der PKC) verändert hat, nicht aber nach alleiniger

AHCY-Überexpression.

In der Durchflußzytometrie wurden die pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen auf eine

Expressionsveränderung von spezifischen Oberflächen- oder CD-Markern (cluster of

differentiation) untersucht. Die Funktion verschiedener untersuchter CD-Marker liegt in der

Zell-Zell-Erkennung und als Kofaktor oder Rezeptor innerhalb von Signalkaskaden (Barclay

et al., 1997).

Es konnte gezeigt werden, daß sich verschiedene Oberflächenfaktoren, die Marker CD19,

CD21, CD40 und CD 58, am 7. Tag nach Transfektion und AHCY-Überexpression anders

verhielten als die der Kontrollgruppe.

Das Oberflächenantigen CD19 ist ein Differenzierungsmarker der B-Zell-Reihe und reguliert

die Antigen-Rezeptor-Signaltransduktion in reifen B-Zellen. In frühere Studien war

nachgewiesen worden, daß Zellen des Multiplen Myeloms die Fähigkeit zur CD19-

Expression verloren haben (Ishikawa et al., 2002).

Der Anstieg des CD19-Oberflächenmarkers bei EBV-reaktiven Zellen, wird interpretiert als

eine zelluläre Antwort auf die Reaktivierung des Virus in seiner Funktion als Teil des

Antigen-Rezeptor-Signaltransduktionssystems.

Bei CD21 handelt es sich um ein Glykoprotein der Zellmembranen reifer B-Zellen, an den

natürlicherweise die Komponenten iC3b und C3d des Komplementsystems binden (Cooper et

al., 1990). Das Epstein-Barr-Virus nutzt den CD21-Rezeptor um sich Zutritt zu den B-Zellen

69

zu verschaffen. Das virale Glykoprotein gp350 bindet an den CD21-Rezeptor, die

Komplementkomponente C3d imitierend (Barclay et al., 1997). Weitere virale Glykoproteine,

gH, gL und gp42, werden anschließend für die Penetration durch die Zellmembran benötigt

(Molesworth et al., 2000). Es wurde nachgewiesen, daß CD21 für das EBV nicht unbedingt

notwendig ist, um Lymphozyten oder epitheliale Zellen zu infizieren. Es scheint zusätzliche

zelluläre Moleküle zu geben, die dem Virus Zutritt in die Zelle verschaffen können (Janz et

al., 2000).

Auffällig ist, daß in EBV-positiven Tumoren kein CD21 auf der Zelloberfläche nachgewiesen

werden konnte (Kim et al., 1998; Burogs et al., 2000). Der Verlust des Membranrezeptors

könnte eine immunphänotypische Eigenschaft in der Veränderung zu neoplastischen Zellen

sein, womit eine Ähnlichkeit zu CD19, das auf Zellen des Multiplen Myeloms ebenfalls nicht

nachzuweisen ist, besteht.

Eine weitere Erklärung für den CD21-Verlust bei EBV-positven Tumorzellen ist, daß die

Zellen die CD21-Expression herunterregeln, um eine Mehrfachinfektion zu vermeiden.

Im Rahmen dieser Untersuchung war eine verstärkte CD21-Expression bei den pcDNA3.1-

AHCY transfizierten Zellen auffällig. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu der

Untersuchung, in der Gangliosid LM1-behandelte Raji-Zellen in den lytischen Zyklus

übertraten und die CD21-Expression reduziert wurde (Schaade et al., 1999). Nachdem sich

das Verwechseln von Proben- und Kontrollgefäßen als unwahrscheinlich herausgestellte

durch weitere Untersuchungen, die mit den gleichen Kontrollzellen durchgeführt worden

waren, liegt die Möglichkeit nahe, daß es bei der AHCY-Überexpression einen weiteren Weg

der EBV-Aktivierung gibt, z.B. die mögliche direkte Methylierung des BZLF1-Promotors,

während bei der Gangliosid-Stimulation der Signalweg über die Proteinkinase C lief. Es

könnte in weiteren Versuchen, die sich an diese Arbeit anschließen, untersucht werden, ob die

PKC und PLA2 nach AHCY-Überexpression ebenfalls verstärkt exprimiert werden.

Zu beachten bleibt die Tatsache, daß der Versuch der Durchflußzytometrie 7 Tage nach der

Transfektion durchgeführt wurde, also zu einem Zeitpunkt, an dem die AHCY-

Überexpression schon lange nicht mehr nachweisbar war. Diese Überexpression war bereits

am 4. postransfektionalem Tag in der semiquantitativen PCR nicht mehr erkennbar. Es ist

denkbar, daß CD21 unmittelbar nach Wiedereintritt in den lytischen Zyklus vermindert

exprimiert wurde, sich dieser Effekt über die Zeit aber aufgehoben hat, möglicherweise im

Sinne einer überschießenden Gegenreaktion, in der viel CD21 gebildet wurde.

CD40 gehört zu der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNF-R)-Familie, die eine wichtige

Rolle bei der T-Zell-vermittelten B-Lymphozyten-Aktivierung spielt. Die CD40-

70

Signalkaskade, z.B. die Bindung an TNF1-assozierte Faktoren (TRAF’s) und zusätzliche

Signalproteine, führt zu einer Aktivierung von Kinasen und Transkritionsfaktoren (Bishop et

al., 2001). Auch Einflüsse auf Proliferation und Immunglobulin-„switching“ gehört zu seinen

Funktionen. In Anbetracht der Erkenntnisse, daß die CD40-CD40-Liganden-Interaktion für

eine normale zelluläre Immunantwort nötig ist, um eine T-Zell-vermittelte Aktivierung von

Monozyten/Makrophagen, eine proinflammatorische Zytokinproduktion und Leuko-

zytenextravasation anzuregen (Netea et al., 2002), scheinen die Ergebnisse der vorliegenden

Arbeit schlüssig, in der nachgewiesen wurde, daß CD40 nach EBV-Reaktivierung verstärkt

auf den Zelloberflächen vorlag. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch, daß es Studien

gibt, die zeigen konnten, daß eine verstärkte CD40-Expression selbst über eine eigene CD40-

Signalkaskade zu einer EBV-Reaktivierung führen kann. Es gibt offenbar verschiedene Wege

das EBV wieder in seinen lytischen Zyklus zu überführen, sie alle münden jedoch in der

Aktivierung des BZLF1-Gens (Fukuda et al., 2000).

Der Oberflächenmarker CD58 nimmt durch seine Bindung an CD2 die Funktion eines

Adhäsionsmoleküls ein, das sich auf benachbarten Zellen befindet. Mit ihrer Bindung stellen

sie eine ideale Distanz her für die Rezeptor-Liganden-Reaktion der zytotoxischen T-Zellen

(Tibaldi et al., 2002).

In dem Versuch der vorliegenden Arbeit zeigte sich, daß in der Zellpopulation mit

vorangegangener AHCY-Überexpression mehr CD58 auf den Zellen zu finden war als in der

Kontrollpopulation. Bei den Zellen dieses Versuchs handelt es sich um Raji-Zellen, einem

EBV-positivem Stamm aus Burkitt-Lymphomzellen, von denen bekannt ist, daß die CD58-

Expression herunterregelt ist (Griffin et al., 1992; Busson et al., 1992).

Die Ergebnisse dieser Arbeit korrelieren insofern zu früheren Veröffentlichungen als daß nach

EBV-Infektion B-Zellen zunächst einmal vermehrt CD58 bilden (Calender et al, 1990). Selbst

die relativ kurze AHCY-Überexpressionszeit scheint ausgereicht zu haben, um die Zellen auf

Infektionsschutz des Gesamtorganismus einzustellen. Mit einem erhöhten Level an CD58 gibt

es verstärkt die Möglichkeit von zytotoxischen T-Zellen eliminiert zu werden und damit die

Infektion einzudämmen.

Zusammenfassend kann eine AHCY-Überexpression auf Transkriptions- und Proteinebene

nachgewiesen werden. Als Folge wird das BZLF1-Gen aktiviert und die EA-Synthese

induziert. Das beweist, daß eine AHCY-Überexpression zur Reaktivierung des lytischen

EBV-Zyklus führt. Verschiedene Oberflächenmerkmale werden im Zuge des

Reaktivierungsprozesses in ihrer Expression moduliert. Dies zeigt eine fortschreitende

71

Differenzierung der Zellen an. Diese Differenzierung dürfte für die Virusreaktivierung eine

Voraussetzung sein.

72

5 Ausblick

Die Transfektion war nur transient. Es ist wichtig herauszufinden, welche Wirkung eine

anhaltende AHCY-Überexpression entfaltet. Ein Ziel zukünftiger Arbeiten wird es sein die

Erkenntnisse der intrazellulären Signalprozesse und Effekte auch auf andere Zellsysteme zu

übertragen.

Neue Therapieansätze könnten darauf zielen latent virusinfizierte, maligne Zellen durch

Virusreaktivierung abzutöten. Dazu müssen nicht-toxische Wege gefunden werden, den

lytischen Zyklus zu reaktivieren. Endogene Ganglioside könnte diese Substanz sein.

73

6 Zusammenfassung Das Ziel der Arbeit war es, die Wirkung der Überexpression von s-Adenosylhomocystein-

Hydrolase (AHCY) auf EBV-genomhaltige-Burkitt-Lymphomzellen der Linie Raji zu

untersuchen. Dabei stand die morphologische und funktionelle Charakterisierung im

Vordergrund der Untersuchungen.

Das AHCY-Genprodukt wurde mit Hilfe der RT-PCR amplifiziert und in einem Zweischritt-

System in den humanen Expressionsvektor pcDNA3.1-E kloniert. Die erfolgreiche

Transformation in E.coli TOP10-Zellen wurde durch Wachstum auf Selektivmedien überprüft

und das Insert durch Sequenzierung identifiziert.

Die Raji-Zellen wurden durch Elektroporation mit dem Konstrukt transfiziert. Der Erfolg

wurde durch die Amplifikation des ß-Lactamase-Gens auf dem Expressionsvektor getestet.

Die erfolgreiche Überexpression des AHCY-Gens wurde auf Transkript- und Proteinebene

mittels semiquantitativer PCR und Western Blot nachgewiesen.

Als Ergebnis der Überexpression wurden folgende Effekte gemessen:

- Anstieg des frühen Epstein-Barr-Virus-Antigens „early antigen“ (EA), gemessen

im Immunfluoreszenztest über die AHCY-Überexpressionszeit hinaus;

- Nachweis von BZLF1- und BHRF1- (lytisches Transkript) Genprodukten am 2. Tag

nach Transfektion;

- Anstieg der DNA-Neusynthese am 2. Tag nach Transfektion;

- unverändertes Wachstumsverhaltens im Vergleich zu den Kontrollzellen;

- veränderte Expression von Oberflächenmarkern mit signifikantem Anstieg der

Antigene der CD19, CD21, CD40 und CD 58;

- keine Aktivitätsveränderung der untersuchten Gene gemessen mittels differentieller

Genanalyse.

Die neu gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg, die zur Aktivierung des latent

persistierenden EBV notwendige Reaktionsfolge aufzuklären. Dies ist ein wichtiger Schritt

zur Therapie EBV-assozierter Tumore.

74

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84

8 Abkürzungen - A. bidest. Aqua bidestilled

- A. dest. Aqua destilled

- AHCY S-Adenosylhomocystein-Hydrolase

- AK Antikörper

- bp Basenpaare

- BrdU 5-Bromo-2‘-Deoxyuridin

- cDNA copy Desoxyribonukleinsäure

- Da Dalton

- DNA Desoxyribonukleinsäure

- DNase Desoxyribonuklease

- DTT Dithiothreithol

- E.coli Escherichia coli

- EA Early antigen

- EBV Epstein-Barr-Virus

- FKS fetales Kälberserum

- IFT Immunfluoreszenztest

- kb Kilobasen

- LB-Medium Luria-Bertani-Medium

- mRNA messenger RNA

- NC-Membran Nitrozellulose-Membran

- ori Origin of replication

- OT Objektträger

- PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

- PBS Phosphat buffered saline

- PCR Polymerase Chain Reaction

- PKC Proteinkinase C

- PLA2 Phospholipase 2

- RNA Ribonukleinsäure

- RNase Ribonukleinase

- rpm rotations per minute

- RT Raumtemperatur

- RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR

85

- SDS Sodiumdodecylsulfat

- TAE Trisacetat-EDTA

- TBE Trisborat-EDTA

- TEMED Tetramethylethylendiamin

- TSR Template Suppression Reagent

- U Unit

- UV ultraviolett

86

Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich ganz besonders und sehr herzlich bei Herrn Prof. Dr. K.

Ritter bedanken, der mir die Möglichkeit und sehr gute Bedingungen geschaffen hat diese

Arbeit zu erstellen.

Bei Dr. Michael Kleines bedanke ich mich für die gute Betreuung und die konstruktiven

Anregungen zur Korrektur meiner geschriebenen Kapitel.

Dank gebührt auch all den Kolleginnen und Kollegen, mit denen ich zusammen gearbeitet

habe. Die Zeit im Labor hat mir sehr viel Freude gemacht und es ist schön festzustellen, daß

gute Freundschaften dabei entstanden sind. Namentlich erwähnen möchte ich Antje Pätz. Sie

brachte mir mit viel Geduld u.a. die Tricks und Tücken von Computern näher, ohne sie läge

die vorliegende Arbeit nicht in der Form vor.

Name: Claudine Maret

Geburtsdatum: 15.05.72

Geburtsort: Paderborn

Curriculum vitae

Schulbildung

1978 – 82 Stephanus-Grundschule in Paderborn

1982 – 83 Realschule Am Niesenteich

1983 – 88 Realschule Schloß Neuhaus

1988 – 91 Pelizaeus-Gymnasium in Paderborn

Studium

87

1991 – 92 Studium der Biologie an der GHS Kassel

1992 – 94 Studium der Chemie an der GHS Paderborn

1994 – 96 Studium der Humanmedizin als „Externe“ an der RWTH Aachen

1996 – 98 Studium der Medizin an der Universität Ulm

1998 – 03 Studium der Medizin an der RWTH Aachen

Überexpression von s-adenosylhomocysteinhydrolase in...

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